Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

РЕДКОЗУБОВ

Сергей Владимирович

МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
И БЕЗОПАСНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НЕФТЕЗАГРЯЗНЁННЫХ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ставрополь - 2011

Работа выполнена в
ФГБОУ ВПО Волгоградский государственный технический университет.

Научный руководитель:	доктор медицинских наук Самыгин Виктор Михайлович.
Официальные оппоненты:	доктор биологических наук, профессор Дмитриев Анатолий Федорович; доктор биологических наук, доцент Назарько Марина Дмитриевна.
Ведущая организация:	ФГБОУ ВПО Северо-Кавказский государственный технический университет.

Защита диссертации состоится 8 февраля 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета при ДМ 212.256.09 в Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2. комн. 506.

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан 16 декабря 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета        Ржепаковский И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Не снижающиеся темпы мировой добычи и потребления нефти приводят к увеличению экологической нагрузки, оказываемой нефтесодержащими промышленными отходами на окружающую среду. Объем нефти, ежегодно попадающей в биосферу Земли, оценивается в десятки миллионов тонн (Миркин М.Б., Наумова Л.Г., 2001). Нефть является источником высокотоксичных веществ. Так, смоло-асфальтеновая фракция нефти содержит полициклические ароматические углеводороды, обладающие выраженным мутагенным, канцерогенным и кариотоксическим эффектом, т.е. они ядовиты для всех эукариотичесиких организмов.

Разрушение нефтяной платформы в Мексиканском заливе в апреле 2010 года и последовавший за этим разлив нефти стали крупнейшей техногенной катастрофой в истории нефтедобывающей отрасли. Последние данные спутникового наблюдения за Атлантикой свидетельствуют о том, что эта катастрофа повлияла даже на скорость и направление течения Гольфстрим (Zangari G., 2010). Этот случай как нельзя лучше доказывает, что, несмотря на технический прогресс и предпринимаемые меры промышленной безопасности, вопросы эффективного очищения экосистемы от массированных нефтяных загрязнений остаются весьма актуальными.

При подобного рода глобальных нефтезагрязнениях экосистем невозможно осуществить очистку технологическими методами путем переработки загрязненного материала в системе очистных сооружений. В таких случаях самым доступным способом очистки является биодеградация нефти с помощью микроорганизмов-нефтедеструкторов in suti.

Все предлагаемые стратегии биоочистки in suti можно разделить на две больших группы: либо ликвидация загрязнения на месте путем стимулирования нефтедеструктивных свойств автохтонной (аборигенной) микрофлоры биоценоза, либо внесением бактерий-нефтедеструкторов с установленной активностью (Вельков В.В., 1995).

Биоремедиация экосистем в обоих случаях потенциально более экологична и менее затратна, чем любые химические или физические методы ремедиации (Singh A., 2009). Иногда биоремедиация вообще является единственно возможным методом ликвидации загрязнения ввиду его массовости или удаленности места экологической катастрофы от технических средств и сооружений. И тогда решающим обстоятельством в пользу выбора стимулирования автохтонной микрофлоры является уровень ее адаптации к абиотическим факторам внешней среды, в которых осуществляется утилизация загрязнителя. Консистенция и водный потенциал среды, доступность кислорода, температурный и световой режимы, взаимодействие с сопутствующими биологическими видами и т.д., все это заставляет сделать выбор в пользу стимулирования автохтонной микрофлоры как наиболее приспособленной к сложившимся условиям окружающей среды (Рубцова С.И., Егоров В.Н., 2004; Миронов О.Г., 2002).

Одним из принципиальных моментов использования микроорганизмов в качестве биологических нефтедеструкторов является их санитарно-эпидемическая и экологическая безопасность (Соловьёв В.И. и др., 2001). Такие семейства бактерий, как Bacillaceae, Pseudomonadaceae, Nocardiaceae, а также дрожжи рода Candida, включают как виды, способные к активной нефтедеструкции, так и возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (Holmes А., 1998; Weinstock D.M., 2002).

К настоящему времени известно множество микроорганизмов различных таксономических групп, обладающих нефтедеструктирующей способностью, а также созданных на их основе биологических препаратов. Однако химический состав нефти и нефтепродуктов, составляющих субстанцию загрязнителя, неодинаков. В связи с этим, спектр действия препаратов в отношении определённого круга углеводородов, как правило, ограничен. Поэтому работы по выявлению новых микроорганизмов-нефтедеструкторов, изучение их биологических свойств и, в первую очередь, их способность к ассимиляции различных углеводородных субстратов, остаются актуальным.

Целью диссертационной работы явилось изучение микроорганизмов, составляющих автохтонную микрофлору Жирновского шламохранилища, их безопасности и метаболической активности в процессе утилизации нефтешлама.

Основные задачи исследования:

1. Выделить микроорганизмы из различных нефтезагрязненных объектов внешней среды на территории деятельности ТПП Волгограднефтегаз ОАО РИТЭК (группа ЛУКОЙЛ) в Жирновском районе Волгоградской области и определить степень их вирулентности на лабораторных животных.
2. Оценить углеводородокисляющую активности индивидуальных штаммов и ассоциированных форм выделенных микроорганизмов в зависимости от объекта выделения.
3. Определить таксономическую принадлежность наиболее активных штаммов-нефтедеструкторов на основе изучения культуральных, тинкториальных и биохимических свойств.
4. Исследовать экспериментально-аналитическими методами закономерности роста и метаболическую активность бактерий при глубинном культивировании в синтетической среде с углеводородными субстратами.
5. Разработать средства и методы получения микробной биомассы при глубинном аппаратном культивировании в условиях биологической и экологической безопасности.

Научная новизна:

1. Впервые выделены и исследованы микроорганизмы, составляющие автохтонную микрофлору Жирновского шламохранилища, определена углеводородокисляющая активность отдельных культур и ассоциированных форм микроорганизмов в отношении нефтяного шлама.
2. Определены основные параметры роста, ассимилирующая активность и способность к биосинтезу белка у бактерий в зависимости от содержания нефтешлама в синтетической среде в условиях глубинного культивирования. Установлено таксономическое положение выделенных микроорганизмов, обладающих наибольшей углеводородокисляющей активностью.
3. Разработана новая модель лабораторной установки со встроенной системой бактериологического контроля и защиты окружающей среды от ферментационных выбросов, обеспечивающая биологическую и экологическую безопасность процессов глубинного культивирования микроорганизмов различной степени патогенности.

Теоретическая и практическая значимость. Подтверждена пригодность метода определения биомассы бактерий по Стикланду (Sticland L.H., 1951) для оценки углеводородокисляющей способности штаммов и консорциума бактерий-нефтедеструкторов на средах, содержащих нефтепродукты. При этом материал, полученный после обработки культуральной жидкости хлороформом, может быть использован для гравиметрического определения массы утилизированного нефтешлама в качестве дополнительного параметра. Выделенные культуры могут быть использованы для утилизации нефтешламов с высоким содержанием смоло-асфальтеновой фракции. Штаммы бактерий рода Rhodococcus безопасны и применяются в учебном процессе при подготовке студентов химико-технологического факультета Волгоградского государственного технического университета по курсу Основы микробиологии. По материалам диссертационной работы изданы учебно-методические указания Определение параметров роста в процессе культивирования бактерий (в соавторстве с проф. В.М. Самыгиным и проф. И.В. Владимцевой), которые используются в Волгоградском государственном техническом университете на лабораторных занятиях по курсу Рост и культивирование биообъектов. Сконструированная с участием автора лабораторная установка для культивирования микроорганизмов легла в основу методических указаний МУ 1.3.2411-08 Биологическая безопасность при глубинном аппаратном культивировании микроорганизмов I-II групп патогенности, утвержденных Руководителем Федеральной службы в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко, 28.07.2008 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Из нефтезагрязненного грунта, нефтешлама и шламовой воды Жирновского шламохранилища выделены гетеротрофные микроорганизмы, обладающие различной нефтедеструктивной активностью в отношении нефтяного шлама и его смоло-асфальтеновой фракции. В их числе обнаружены микроорганизмы, не обладающие собственной углеводородокисляющей активностью, но способные интенсифицировать процессы нефтедеструкции в составе консорциума.
2. Представители автохтонной микрофлоры Жирновского шламохранилища, обладающие наиболее выраженной нефтедеструктивной активностью, принадлежат к бактериям рода Rhodococcus. Микроорганизмы, представляющие санитарно-эпидемическую опасность для человека и животных, среди выделенных штаммов не обнаружены.
3. Определены основные ростовые параметры выделенных бактерий: коэффициент насыщения и максимальная скорость роста, а также ассимилирующая активность и способность к биосинтезу белка в условиях глубинного культивирования на синтетических средах с нефтепродуктами путем расчета метаболического и экономического коэффициентов.
4. Разработанная лабораторная установка для глубинного культивирования микроорганизмов, оснащенная эффективными средствами защиты окружающей среды, позволяет выращивать микроорганизмы в условиях биологической безопасности.
5. Предлагаемая система встроенного импинджерного контроля отработанного воздуха в установке для культивирования микроорганизмов является более надёжным диагностическим средством и выгодно отличается от импакторного метода.

Апробация. Материалы диссертации представлены на XII-ой Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской обл. (Волгоград, 2007); 14-ой Пущинской школе-конференции молодых учёных Биология - наука XXI века (Пущино, 2010); Международной заочной научно-практической конференции Актуальные проблемы естественных наук (Тамбов, 2010); III-й Международной научно-практической конференции Современные проблемы качества окружающей среды (Тамбов, 2010), ХV-ой Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 3 статьи в периодических изданиях из Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 180 литературных источников, из которых 95 зарубежные. Работа изложена на 127 печатных страницах машинописного текста, включает 33 рисунка, 10 таблиц и приложение.

Материалы и методы

Исследования по нефтедеструкции проводили с гетеротрофными микроорганизмами, выделенными из нефтезагрязненных объектов внешней среды на территории шламохранилища Жирновского ТПП Волгограднефтегаз ОАО РИТЭК. При определении бактериальных аэрозолей в отработанном воздухе использовали индикаторные штаммы Serratia marcescens 9 и Yersinia pestis ЕВ-НИИЭГ из коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Качество питательных сред при анализе на колиформные виды определяли с помощью типового штамма Escherichia coli АТСС 25922.

Для выделения микроорганизмов из внешней среды использовали полноценные питательные среды: нутриент-агар и триптиказо-соевый агар фирмы "Difco" (США). При изучении углеводородокисляющей активности использовали синтетическую минеральную среду М9 (Теппер Е.З., 1979) и среду Раймонда (Кузнецов С.И., Дубинина Г.А., 1989) с добавлением в качестве единственного источника органического углерода и энергии жирновского нефтешлама или смоло-асфальтеновой фракции (САФ) того же нефтешлама. При определении основных биохимических свойств выделенных бактерий использовали системы индикаторные бумажные (СИБ №2) для дифференциации энтеробактерий производства ФГУП НПО Микроген. Испытания по разложению целлюлозы и хитина осуществляли на среде Виноградского (Звягинцев Д.Г., 1991).

Способность культур использовать циклогексанол и амиды карбоновых кислот исследовали на среде Мюнца (Квасников Е.Л., Клюшникова Т.М., 1981).

Для окраски мазков применяли наборы готовых реактивов производства ЗАО НИЦФ г. Санкт-Петербург. Морфологию клеток изучали с помощью микроскопа Микмед-2 с иммерсионным объективом 90. Для визуального исследования структуры колоний использовали микроскоп стереоскопический МБС-10. Фотографирование микропрепаратов в мазке и колоний микроорганизмов осуществлялось с помощью микрофотонасадки МФН-11 со встроенным фотоаппаратом Зенит-122 на цветную фотопленку Kodak Gold Ultra 400, а также на цифровую фотокамеру Nikon CoolPix L10 путем съемки непосредственно через окуляр.

Питательной средой для выращивания микроорганизмов в установке для глубинного культивирования служил бульон Хоттингера (рН 7,0 - 7,2) с содержанием аминного азота 120 мг % и добавлением 1 % галактозы.

При оценке углеводородокисляющей способности бактерии выращивали в колбах объемом 100 мл с ватно-марлевыми пробками или в лабораторном ферментере LKB-1607 Polyferm (Швеция).

Исследования на патогенность проводили на беспородных белых мышах. Принадлежность выделенного дрожжевого штамма к патогенным грибкам рода Candida определяли в тесте на ростовые трубочки (Clinical Microbiology Procedures Handbook, 1996).

Концентрацию белка в культуральной жидкости определяли методом фотоэлектроколориметрии при длине волны 540 нм с применением биуретового реактива, входящего в набор ОЛЬВЕКС-диагностикум для определения общего белка (Sticland L. H., 1951).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Отбор проб и выделение чистых культур

В результате высева проб, отобранных на Жирновском шламохранилище на полноценные питательные среды было выделено 12 штаммов гетеротрофных микроорганизмов, из которых 11 определены как бактерии и 1 как дрожжевая культура. Дифференцировку культур осуществляли по форме образуемых колоний и клеточной морфологии после окраски по Граму.

Определение степени патогенности микроорганизмов

Уровень опасности выделенных микроорганизмов исследовали путём постановки биологических проб на белых беспородных мышах весом 18 - 20 г, которым подкожно в область паха вводили двухсуточные суспензии микроорганизмов (109 м.к/мл) в объёме 0,2 мл. На каждый штамм брали по 4 особи. Мышей наблюдали в течение 14 суток.

Гибели подопытных мышей не отмечено за исключением единственной особи, павшей на 8-е сутки после инъекции культурой Н1d. При вскрытии павшей мыши, посеве материала из её внутренних органов на агаровые среды и последующей микроскопии мазков обнаружены грамотрицательные палочки и грамположительные кокки.

В ходе дальнейшем исследовании выделенных из мыши бактерий, установлено, что грамотрицательная культура образует на среде Эндо с металлическим блеском, ферментирует глюкозу и лактозу до кислоты и газа, не образует сероводород, но образует индол и обладает активной подвижностью. На основании полученных результатов культура идентифицирована как E. coli.

Грамположительная кокковая культура формирует на желточно-солевом агаре непигментированные колонии, обладает лецитиназой и каталазой, гемолизирует эритроциты человека и коагулирует кроличью плазму в разведении 1:4. На основе полученных результатов культуру идентифицировали как Staphylococcus spp. Штамм Н1d, которым проводили инфицирование мыши, из срезов внутренних органов не высевался.

С целью дополнительной проверки дрожжевой культуры (штамм Н8а) на наличие патогенных свойств использовали тест на ростовые трубочки. Испытуемую культуру переносили в пробирку с сывороткой крови крупного рогатого скота в разведении 1:1 и инкубировали в термостате при 35С в течение 3 часов. Препарат микроскопировали без окраски на предмет образования ростовых трубочек, характерных для патогенных дрожжей рода Candida. В результате обнаруживали только одиночные клетки и гроздья почкующихся клеток. Клетки, выбрасывающие ростовые трубочки, обнаружены не были.

Для выявления среди выделенных штаммов бактерий группы кишечной палочки определяли биохимические свойства с помощью тестового набора СИБ №2, предназначенный для дифференциации энтеробактерий, а также: подвижность на полужидком агаре, рост на среде МакКонки, способность разлагать сахара на агаре Клиглера. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Основные биохимические свойства выделенных культур

Код штамма	Рост на агаре МакКонки	Глюкоза	актоза	Оксидаза	Утилизация цитрата	Утилизация малоната	Утилизация сорбита	Утилизация инозита	-галактозидаза	Фенилаланин-дезаминаза	Уреаза	изин-декарбоксилаза	Орнитин-декарбоксилаза	Фогес-Проскауэра	Индоло-образование	Образование H2S	Подвижность
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18
Н1а	Нет	-	-	+	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Н1b	Нет	-	-	+	-	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Н1c	Нет	-	-	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Н1d	Нет	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
H2a	Нет	-	-	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-
H2b	Нет	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
H4a	Есть	к*	-	+	+	-	+	+	+	-	-	+	+	+	-	-	-
H5a	Есть	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-
H6a	Есть	кг*	-	+	-	-	+	+	+	-	-	+	+	+	-	-	-
H6b	Есть	кг*	-	+	-	-	+	+	+	-	-	+	+	+	-	-	-
H6c	Нет	-	+	-	-	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	+

*- к - кислота; кг - кислота и газ

Как видно из таблицы 1, среди выделенных штаммов не оказалось микроорганизмов, способных образовывать сероводород и индол, что свидетельствует об отсутствии среди них гнилостной микрофлоры. Большинство штаммов не росло на элективной среде МакКонки, предназначенной для бактерий кишечной группы. Штаммы, растущие на этой среде, проявляли вариабельность окраски по Граму, но хорошо окрашивались по методу Циля-Нильсена, что свидетельствует о наличии кислотоустойчивых свойств клеточной стенки и не характерно для бактерий кишечной группы. Кроме того, штаммы, растущие на агаре МакКонки, не ферментировали лактозу.

На основании приведённых свойств был сделан вывод об отсутствии среди выделенных культур колиформных бактерий. По итогам испытаний на безопасность все выделенные из природных объектов штаммы микроорганизмов не проявляли патогенных свойств в опытах in vivo (а дрожжевая культура и in vitro) и колиформные бактерии выявлены не были. С учётом данных обстоятельств, все выделенные культуры были признаны безопасными.

Оценка способности микроорганизмов к росту на средах
с углеводородами нефти

В серии опытов культуры исследовали на способность роста в средах с нативным нефтешламом и САФ. Исследование проводили на агаризованных средах, содержащих по 0,5 % каждого из субстратов. Нефтешлам вносили в плотную минеральную среду в виде раствора в бензоле (Мельников А.Д., Карасева Э.В., 2005). Засеянные чашки инкубировали при комнатной температуре в течение 3-х суток. Результаты опытов оценивали по системе л+ - наличие роста, Ц - отсутствие роста. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты исследования роста выделенных микроорганизмов
на углеводородных средах

№ пробы	Объект отбора проб	Обозначение штамма	Рост на нефтешламе	Рост на САФ
Н1	Шламовая вода. Карта № 1	Н1а	+	+
		Н1b	+	+
		Н1c	-	-
		Н1d	-	-
Н2	Поверхностный нефтешлам. Карта № 4	H2a	+	+
		H2b	-	-
Н3	Нефтезагрязненный грунт поверхностный	Роста не отмечено
Н4	Нефтезагрязненный грунт глубинный (25-40 см)	H4a	+	+
Н5	Дождевая вода на поверхности нефтешлама. Карта № 1	H5a	+	-
Н6	Нефтезагрязненный грунт глубинный (5-10 см)	H6a	+	+
		H6b	+	+
		H6c	-	-
Н7	Поверхностный нефтешлам. Карта № 1	Проба не исследована
Н8	Дождевая вода на поверхности нефтешлама. Карта № 4	H8a (дрожжи)	+	-

Большинство выделенных микроорганизмов формировали колонии на среде с нефтепродуктами, т.е. обладали способностью ассимилировать углеводородные субстраты. Причём 8 из 12 штаммов (67 %) росли в среде с любым из двух углеводородных субстратов, тогда как САФ оказались способны утилизировать только 6 культур.

Среди микроорганизмов, выделенных из шламовой и дождевой воды, штаммы Н1а и Н1b росли в присутствии любого из двух углеводородных субстратов, Н5а и Н8а росли только на нефтешламе, а штаммы Н1с, Н1d давали рост только на нутриент-агаре. Из 4-х бактериальных культур, выделенных из нефтезагрязнённого грунта, один штамм (Н6с) формировал колонии на комплексной среде, а три других (Н4а, Н6а, Н6b) - на всех испытуемых средах. В пробе поверхностного нефтешлама штамм Н2а ассимилировал углеводороды нефти, а штамм Н2b такой способностью не обладал.

Таким образом, в результате предварительных исследований установлены 6 штаммов микроорганизмов, способных расти на средах, содержащих смоло-асфальтеновую фракцию нефти: Н1а, Н1b, Н2а, Н4а, Н6а и Н6b. Эти шесть штаммов, а также консорциум из четырех микроорганизмов, выделенных из шламовой воды: Н1а, Н1b, Н1с и Н1d были отобраны для количественной оценки углеводородокисляющей активности.

Характеристика роста микроорганизмов, выделенных из различных

объектов, в синтетической среде с нефтешламом

Количественное определение углеводородокисляющей активности микроорганизмов проводили в среде Раймонда. Исследуемые микроорганизмы засевали в колбы с 50 мл среды из расчёта 105 м.к./мл. Колбы инкубировали на качалке с частотой 120 качаний в минуту при комнатной температуре (25С) в течение 35 суток, еженедельно анализируя по одной пробе, в которой определяли концентрацию белка и количество неассимилированного субстрата.

Глубину деструкции определяли гравиметрически по массовой доле остаточного нефтешлама, экстрагируемой хлороформом (без учёта нерастворимых в хлороформе веществ). Исходным принимали среднеарифметическое значение, полученное по результатам анализа пяти контрольных колб. Результаты опытов представлены в виде графиков на рисунках 1, 3, 5.

Среди монокультур наиболее выраженной биодеструкцией нефтяного шлама обладали штаммы, выделенные из внутришламовой воды (Н1а и Н1b) и поверхностного нефтешлама (Н2а). Эти микроорганизмы в течение 5 недель утилизировали субстрат не менее чем на 16,7 % (рисунки 1 и 3). Штаммы, выделенные из нефтезагрязнённого грунта (Н4а, Н6а, Н6b), обладали несколько меньшей активностью и за тот же период ассимилировали до 14 % использованного в опытах нефтешлама (рисунок 5).

Из всех исследованных биообъектов наибольшей нефтедеструкцией обладал консорциум микроорганизмов, для которого конечная концентрация нефтешлама за пять недель инкубирования снижалась более чем на 24 %.

Глубину утилизации субстрата определяли по изменению содержания в культуральной жидкости общего белка, который синтезируется в минерально-солевой среде во время роста углеводородокисляющих микроорганизмов.

Результаты определения концентрации белка в культуральной жидкости в процессе роста бактерий представлены на рисунках 2, 4, 6.

Рис. 1 - Утилизация нефтешлама микроорганизмами внутришламовой воды	Рис. 2 - Накопление белка в среде микроорганизмами внутришламовой воды
Рис. 3 - Утилизация нефтешлама микроорганизмами поверхностного нефтешлама	Рис. 4 - Накопление белка в среде микроорганизмами нефтешлама
Рис. 5 - Утилизация нефтешлама микроорганизмами нефтезагрязненного грунта	Рис. 6 - Накопление белка в среде микроорганизмами нефтезагрязненного грунта

Содержание белка, продуцируемого культурами Н1а, Н1b и Н2а, спустя 5 недель выращивания в минерально-солевой среде составило 4,2 - 4,4 г/л (рисунки 2 и 4). При выращивании консорциума микроорганизмов количество белка увеличивалось и достигало 5,8 г/л. Микроорганизмы, выделенные из нефтезагрязнённого грунта, синтезировали белок в количестве, не превышавшем 4 г/л (рисунок 6).

На основании результатов культивирования рассчитывали эффективность превращения субстрата в микробную биомассу, т.е. экономический коэффициент (Y) и метаболическую активность культур по отношению к нефтешламу, т.е. метаболический коэффициент (q) (Перт С. Дж., 1978). Полученные значения ростовых коэффициентов представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Значения экономического и метаболического коэффициентов для выделенных штаммов при культивировании на нефтешламе

Обозначение штаммов	Экономический коэффициент, (Y)	Метаболический коэффициент, (q)
Н1а	0,282	1,510
Н1b	0,272	1,497
Консорциум	0,255	1,649
H2a	0,289	1,674
H4a	0,344	1,559
H6a	0,334	1,606
H6b	0,348	1,627

Как видно из таблицы 3, индивидуальные культуры Н1а, Н1b, H2a, имеют экономический коэффициент ниже 0,3; в то время как значения Y для индивидуальных культур H4a, H6a и H6b значительно выше 0,3. При культивировании консорциума микроорганизмов на нефтешламе экономический коэффициент минимален и составляет 0,255.

Максимальным метаболической активностью обладала культура H2a (q = 1,674). Консорциум микроорганизмов также проявил высокую метаболическую активность в отношении нефтешлама (q = 1,649). Согласно рассчитанным значениям, у консорциума микроорганизмов был установлен высокий метаболический коэффициент при инкубировании на нефтешламе и минимальный экономический коэффициент, что свидетельствует о крайне высокой активности культуры в отношении нативного нефтешлама, но при этом консорциум утилизировал этот субстрат с минимальной анаболической эффективностью.

Идентификация наиболее активных штаммов-нефтедеструкторов

Поскольку штаммы Н1а, Н1b и Н2а проявили себя как наиболее активные нефтедеструкторы и в дальнейшем могли представить практический интерес, было решено осуществить их идентификацию. Все три указанные культуры обладали сходной морфологической структурой. При росте на комплексных питательных средах они формировали сухие колонии с ребристой поверхностью. Колонии были непигментированными, при низких концентрациях питательных веществ образовывали субстратный, но не воздушный мицелий. Клетки по Граму окрашивались вариабельно, при микроскопии мазков просматривались псевдомицелиальные структуры в виде удлинённых гиф, со временем распадающиеся на более мелкие кокковые формы. При микроскопии колоний под большим увеличением можно было различать специфические пучки выступающего псевдомицелия - синнемы, характерные для нокардиоподобных микроорганизмов. По характеру метаболизма указанные микроорганизмы определены как облигатные аэробы, активно растущие на крахмало-аммиачном агаре, способные утилизировать циклогексанол, бензойную и салициловую кислоты в качестве единственного источника углерода, формамид в качестве источника азота и ацетамид в качестве источника углерода и азота. Штаммы не разлагали целлюлозу и хитин, но гидролизовали крахмал.

На основании перечисленных признаков, а также выявленных биохимических свойств, представленных в таблице 1, штаммы Н1а, Н1b и Н2а были отнесены к роду Rhodococcus (Определитель бактерий Берджи, 1997).

Метаболическая активность бактерий при аппаратном культивировании
в среде с различным содержанием субстрата

Для определения кинетических параметров роста микроорганизмов при утилизации нефтешлама в качестве единственного источника органического углерода и энергии был выбран консорциум штаммов Н1а, Н1b, Н1с и Н1d.

Целью исследования на данном этапе было определение максимальной скорости роста (rmax) и коэффициента насыщения (Ks), являющихся константами уравнения Моно:

r = rmaxS/(S+Ks)

где r - удельная скорость роста, S - концентрация субстрата.

В ходе исследования был применен метод периодического культивирования в лабораторном ферментере при различных концентрациях лимитирующего субстрата.

Бактерии выращивали при концентрации нефтешлама 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; и 1,6 % по объему. Для компенсирования лаг-фазы инокуляцию производили культурой, находящейся в стадии логарифмического роста, для чего микроорганизмы предварительно подращивали в аналогичных условиях.

Степень деструкции определяли через каждые 6 часов по оптической плотности культуральной жидкости (рисунок 7). После отбора пробу выдерживали один час в холодильник при 4С для удаления остатков нефтешлама и измеряли оптическую плотности при длине волны 540 нм.

Для математического анализа был выбран диапазон данных от 0 до 78 часов, поскольку в пределах этого диапазона рост культуры не показывал признаков перехода в стационарную фазу при любой концентрации субстрата.

Для определения удельной скорости роста культуры при заданной концентрации субстрата строили график в системе координат {LN(Dt/D0); t}. Тангенс угла наклона полученной линейной функции должен быть численно равен значению удельной скорости роста r (Перт С.Дж., 1978). Однако при построении такой функции на основании полученных экспериментальных данных зависимость оказалась нелинейной (рисунок 8).

инейный характер функции сохранялся только первые 12 часов, далее график функции отклонялся вниз, что свидетельствовало о замедлении скорости роста. Для определения удельной скорости роста (r) консорциума культур необходимо было аппроксимировать график функции до некой прямой.

Аппроксимация ряда взятых экспериментальных значений до прямой осуществлялась с помощью функции Линия тренда электронных таблиц Microsoft Excel 2003 (рисунок 9).

Поскольку множитель m в уравнении полученной аппроксимирующей прямой y = mx + b равен тангенсу угла наклона прямой относительно оси абсцисс, его принимали числено равным искомому значению r. Полученные значения r в зависимости от концентрации субстрата представлены в таблице 4.

Рис. 7 - Изменение оптической плотности (D) в ходе инкубировании консорциума при различных концентрациях нефтешлама		Рис. 8 - Зависимость значения переменной LN(Dt/D0) от времени культивирования

Рис. 9 - Результаты аппроксимации зависимости переменной LN(Dt/D0) от времени культивирования

Таблица 4 - Удельная скорость размножения микроорганизмов в консорциуме в зависимости от концентрации нефтешлама

Концентрация нефтешлама (S),% по объему	1,6	0,8	0,4	0,2	0,1
Удельная скорость размножения (r), час-1	0,0588	0,0581	0,0544	0,0416	0,0333

Для нахождения значений констант уравнения Моно использовали расчетный метод Эйзенталя и Корниш-Боудена (Корниш-Боуден Э., 1979). Согласно теории метода, прямые, проходящие через точки с координатами {-S, 0} и {0, r} должны пересекаться в одной точке, координата которой по оси абсцисс соответствует значению KS, а по оси ординат - значению rmax. Для построения графика использовался калькулятор Microsoft Math 2007.

При построении линейных графиков было получено десять точек пересечения. Координаты всех полученных точек пересечения представлены в таблице 5 в порядке возрастания значений.

Результат определяли путем интерполяции между медиальными значениями ряда полученных значений с округлением до третьего знака после запятой. Итоговые значения соответствовали: KS = 0,091 об % и rmax = 0,062 час-1.

Таблица 5 - Координаты полученных точек пересечения
на графике Эйзенталя и Корниш-Боудена

Координаты по оси абсцисс (соответствует KS):	0,019	0,045	0,059	0,066	0,086	0,095	0,101	0,107	0,122	0,177
Координаты по оси ординат (соответствует rmax):	0,055	0,060	0,061	0,062	0,062	0,062	0,065	0,067	0,069	0,079

Конструирование установки для глубинного культивирования патогенов
в условиях пониженного давления

Существующие в настоящее время серийные установки для глубинного культивирования микроорганизмов не всегда соответствуют требованиям биологической безопасности и защиты окружающей среды от попадания бактериологических аэрозолей, которые непременно образуются в результате активной аэрации бульонной культуры.

Для решения данной проблемы была разработана лабораторная установка, в которой, в отличие от ранее предложенных моделей, выращивание бактерий происходит в культуральном сосуде при более низком, по сравнению с атмосферным, давлении. Внесение инокулята и отбор проб биологического материала в процессе и по окончании работы осуществляется за счет создаваемой разницы давления между культуральным сосудом и окружающим пространством. Это обеспечивается благодаря оснащению установки вакуумным насосом, клапанами трубопроводов и системой очистки отработанного воздуха, барботируемого через ёмкости с дезинфицирующим раствором. Однако, использование подобного принципа лишь отчасти решало проблему биологической угрозы, хотя существенно снижало вероятность ферментационных выбросов за пределы установки. При проверке бактериальной обсеменённости отработанного воздуха в процессе культивирования индикаторного штамма S. marcescens 9 между системой очистки установки и выходным фильтром бокса биологической безопасности были поочередно подключены два контролирующих прибора - импактор и импинджер. В результате в обоих случаях удавалось обнаруживать клетки индикаторной культуры, хотя с различной степенью эффективностью (таблица 6).

Абсорбция бактериальных аэрозолей путем прокачки воздуха через встроенный импинджер выгодно отличалась от принудительного осаждения микроорганизмов из прокачиваемого воздуха на поверхность плотной питательной среды в импакторе. Как видно из таблицы 6, абсорбционный импинджерный метод надежно позволял обнаруживать бактерии в пробах воздуха, когда концентрация клеток в бульонной культуре составляла 108 м.кл./мл. При этом время отбора пробы воздуха не превышало 30 мин. В случаях, когда концентрация бульонной культуры достигала (0,8-1,0)109 м.кл./мл, ограничение времени отбора проб до десяти минут не наносило ущерба точности определения.

Для инактивации бактериальных аэрозолей в установке были апробированы табельные дезинфицирующие средства - хлорамин, перекись водорода и формалин, которыми заполняли очистную систему. Рекомендуемые и более высокие концентрации хлорамина или перекиси водорода к желаемому результату не приводили (таблица 7). Из трёх испытанных средств лишь 10 % раствор формалина обладал выраженным дезинфицирующим эффектом, который наблюдался во всех случаях независимо от фазы развития культуры, продолжительности отбора проб воздуха и концентрации бактериальной суспензии.

Таблица 6 - Результаты бактериологического контроля проб отработанного
воздуха, исследованных различными методами, в процессе роста
глубинной культуры S. marcescens

Фазы развития глубинной культуры	Продолжительность культивирования, ч.	Концентрация биомассы (м.кл./мл)	Количество исследованных проб	Методы и продолжительность отбора проб
				импакторный			импинджерный
				10 мин.	30 мин.	2 ч.	10 мин.	30 мин.	2 ч.
аг-фаза	2	108	7	14,3*	28,7	42,9	85,7	100	100
Начало логарифмического роста	6	(0,8-1,0) 109	4	25	25	50	100	100	100
Начало стационарной фазы	18Е20	(5-8)109	4	50	75	100	100	100	100

* - число проб (в %), в которых обнаружена индикаторная культура.

Таблица 7 - Эффективность инактивации бактериальных аэрозолей в установке для культивирования микроорганизмов при выращивании S. marcescens

Продолжительность барботирования воздуха через среду	Объем прокаченного воздуха, л	Испытуемый дезинфектант
		хлорамин, %			перекись водорода, %			формалин, %
		3	6	10	3	6	10	3	6	10
10 мин.	10	100*	100	75	100	75	75	100	25	0
30 мин.	30	100	100	75	100	75	75	100	25	0
2 ч.	120	100	100	100	100	100	100	100	50	0
18-20 ч.	1080-1200	-	-	-	-	-	-	-	-	0

* - число проб (в %), в которых обнаружена индикаторная культура; (Ц) - исследования не проводились.

При этом содержание формальдегида в очистной системе в ходе культивирования практически не изменялось. Результаты испытаний установки подтвердили, что использование ферментеров, помещенных в бокс безопасности и оснащенных вакуумным насосом, герметичными клапанами трубопроводов, а также системой очистки отработанного воздуха, состоящей из последовательно соединенных емкостей с 10 % раствором формалина, обеспечивало высокую степень биологической безопасности при глубинном выращивании микроорганизмов различной степени патогенности.

ВЫВОДЫ

1. При бактериологическом исследовании нефтезагрязненых природных объектов, расположенных на территории Жирновского отделения ТПП Волгограднефтегаз ОАО РИТЭК, выделено 12 штаммов микроорганизмов, 8 из которых давали рост в синтетической среде с нефтяным шламом. Наиболее выраженная нефтедеструктирующая активность наблюдалась у выделенного из шламовой воды консорциума, состоявшего из 4-х микроорганизмов, 2 из которых индивидуальной углеводородокисляющей способностью не обладали.

2. На основании культуральных, тинкториальных и биохимических свойств наиболее активные штаммы-нефтедеструкторы идентифицированы как бактерии рода Rhodococcus. Все выделенные штаммы микроорганизмов, несмотря на высокие инфицирующие дозы, не проявляли вирулентных свойств в отношении экспериментальных лабораторных животных.

3. Исследования углеводородокисляющей активности микроорганизмов в отношении нефтешлама показали, что наиболее высокая удельная скорость потребления этого субстрата наблюдалась у штамма Н2а (q = 1,674) и консорциума микроорганизмов (q = 1,649). При этом наиболее активные культуры-нефтедеструкторы проявили низкую эффективность превращения субстрата в биомассу (Y > 0,3). Расчетно-экспериментальными методами определены константы уравнения Моно для консорциума выделенных микроорганизмов при росте на нефтешламе, составляющие: KS = 0,091 об % и rmax = 0,062 час-1.

4. В процессе культивирования выделенных штаммов на средах с нефтешламом, обнаружено, что конечное содержание белка при глубинном культивировании родококков, выделенных из шламовой воды и нефтяного шлама, примерно одинаково и составляет 4,2 4,4 г/л. У консорциума микроорганизмов этот показатель достигал 5,8 г/л, тогда как прочие бактерии синтезировали белок в количестве, не превышавшем 4 г/л.

5. С учетом культуральных свойств родококков, способных формировать в жидкой среде фрагменты псевдомицелия, метод определения концентрации белка с биуретовым реактивом оказался более точным и надёжным методом определения метаболической активности по сравнению с подсчетом КОЕ.

6. Разработана лабораторная установка для глубинного культивирования микроорганизмов при пониженном (относительно атмосферного) давлении в культуральном сосуде за счет оснащения вакуумным насосом, и системой очистки отработанного воздуха, барботируемого через ёмкости с дезинфицирующим раствором. Установлено, что встроенная система импинджерного контроля качества обеззараживания отработанного воздуха более эффективна по сравнению с импакторным методом.

7. Из табельных средств, использованных для инактивации бактериальных аэрозолей в установке, лишь 10 % раствор формалина обладал выраженным дезинфицирующим эффектом, который проявлялся независимо от фазы развития глубинной культуры, продолжительности отбора проб воздуха и концентрации бактериальной суспензии в бульоне.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выделенные микроорганизмы могут быть использованы на территории деятельности ТПП Волгограднефтегаз ОАО РИТЭК для утилизации нефтяного шлама методом биоремедиации.

2. Апробированный метод определения содержания белка с биуретовым реактивом может быть рекомендован для внедрения в практику при оценке метаболической активности углеводородокисляющих микроорганизмов.

3. Разработанная с участие автора модель установки для глубинного культивирования может применяться для выращивания патогенных микроорганизмов в условиях биологической и эпидемической безопасности.

4. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в качестве научного и практического материала при составлении учебных пособий, чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий студентов по дисциплинам: микробиология, биотехнология, экология.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Редкозубов, С.В. Перспективы утилизации нефтешлама методом биоремедиации в рамках Жирновского НГДУ / С.В. Редкозубов // XII региональная конференция молодых исследователей Волгоградской области: Тез. докл. - Волгоград, 2008. - C. 13-15.
2. Самыгин, В.М. Конструкция установки для глубинного культивирования аэробных патогенов / В.М. Самыгин, И.В. Владимцева, Т.А. Гришкина, А.Ю. Александров, С.В. Редкозубов // Биотехнология. Ц 2008. Ц № 2. Ц C. 65-68.
3. Самыгин, В.М. Бактериологический контроль воздушной среды в установках для культивирования микроорганизмов / В.М. Самыгин, Т.А. Гришкина, Л.К. Жога, А.Ю. Александров, С.В. Редкозубов, Тхи Нгок Минь Нгуен // Экологические системы и приборы. - 2009. - № 8. - C. 12-16.
4. Самыгин, В.М. Биологическая безопасность при глубинном аппаратном культивировании микроорганизмов I-II групп патогенности : методические указания МУ 1.3.2411-08 / В.М. Самыгин, В.В. Алексеев, А.В. Липницкий, Е.В. Прохватилова, Т.А. Гришкина, Л.К. Жога, А.Ю. Александров, С.В. Редкозубов, С.А. Еремин, Д.А. Щербаков, А.К. Никифоров, В.В. Кутырев, И.В. Борисевич, И.В. Дармов, С.Л. Кузнецов, А.С. Кучеренко, К.И. Гурин, В.М. Бакулин, В.М. Щур, В.И. Полищук // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ: Реферат. сб. / Под ред. чл.-корр. РАМН, докт. мед. наук, проф. В.В. Кутырева. - Саратов: ОАО Приволжское издательство, 2009. - 60 с.
5. Самыгин, В.М. Система защиты окружающей среды от бактериальных аэрозолей в установках для культивирования микроорганизмов / В.М. Самыгин, Т.А. Гришкина, Л.К. Жога, А.Ю. Александров, С.В. Редкозубов, Тхи Нгок Минь Нгуен // Проблемы особо опасных инфекций. Ц 2009. Ц № 100. Ц C. 22-26.
6. Редкозубов, С.В. Ландшафтно-экологическая характеристика углеводородокисляющих микроорганизмов Жирновского шламохранилища / С.В. Редкозубов // Биология. Наука XXI века: Сб. тез. 14 междунар. Пущинской школы-конференции молодых учёных. - Пущино, 2010. - Т. 2. - C. 257.
7. Редкозубов, С.В. Перспективы утилизации нефтешлама методом биоремедиации в рамках Жирновского ЦДНГ / С.В. Редкозубов // Актуальные проблемы естественных наук: Матер. междунар. заочной науч.-практ. конф. - Тамбов, 2010. - C. 141-147.
8. Редкозубов, С.В. Углеводородокисляющая активность и эпидемиологическая безопасность аборигенной микрофлоры Жирновского шламохранилища / С.В. Редкозубов // Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред: Матер. III междунар. науч.-практ. конф. - Тамбов, 2010. - C. 66-68.
9. Редкозубов, С.В. Перспективы применения аборигенной микрофлоры Жирновского шламохранилища для утилизации нефтешламов / С.В. Редкозубов // Вестник Волгоградского государственного университета. Серия 3. Экономика. Экология. Ц 2010. Ц № 2. Ц C. 221-228.
10. Редкозубов, С.В. Характеристика кинетических параметров роста аборигенной микрофлоры, выделенной из нефтешламовой воды / С.В. Редкозубов, О.В. Редкозубов // Водоочистка, Водоподготовка, Водоснабжение. - 2011. - № 2. - С. 18-23.
11. Редкозубов, С.В. Определение кинетических параметров роста аборигенной микрофлоры Жирновского шламохранилища при утилизации нефтешлама / С.В. Редкозубов, О.В. Редкозубов // XV региональная конференция молодых исследователей Волгоградской обл.: Тез. докл. - Волгоград, 2011. - C. 9-11.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии