Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Сеник Светлана Викторовна
Мембранные липиды в формировании морфогенетического ответа у базидиальных грибов
03.01.02 - Физиология и биохимия растений 03.02.12 - Микология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук.
Научный кандидат биологических наук руководитель Котлова Екатерина Робертовна Официальные доктор биологических наук оппоненты: Терёшина Вера Михайловна кандидат биологических наук Емельянов Владислав Владимирович Ведущая ФГБУН Казанский институт организация: биохимии и биофизики КазН - Российской академии наук
Защита состоится 19 декабря 2012 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 002.211.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботанический институт им. В. Л. Комарова Российской академии наук по адресу:
197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 2. Тел. (812) 34637-42, факс (812) 346-36-43.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук.
Автореферат разослан 19 ноября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук О.С. Юдина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования.
Способность к морфогенезу - одно из фундаментальных свойств живых организмов, проявляющееся в образовании одно- или многоклеточных структур определенной формы. У высших грибов морфогенез представляет собой образование разнообразных по размеру и форме клеток (от сферических дрожжеподобных до высокополяризованных клеток мицелия), а также организацию из них сложных нетканевых структур (плодовых тел, склероциев и др.).
Неотъемлемым свойством клеток, участвующих в морфогенетическом ответе, является способность к дифференцировке - приобретению морфологической и функциональной специализации.
Процессы дифференцировки грибных клеток затрагивают изменения типа роста (диморфизм), формы клеток, паттерна ветвления и септирования гиф, химического состава цитоплазмы, органелл, клеточной стенки и мембран. Морфологическое разнообразие клеток у представителей разных таксонов грибов изучено достаточно подробно (Stalpers, 1978; Clemenon, 2004), в то время как молекулярнофизиологические основы дифференцировки исследованы на ограниченном круге модельных объектов, большинство из которых составляют дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans, мицелиальные грибы Neurospora crassa, Aspergillus spp. и др.
аскомицеты (Moore, 1998; Boyce, Andrianopoulos, 2006).
Данные о молекулярных механизмах, лежащих в основе клеточной дифференцировки и морфогенеза у базидиальных грибов, фрагментарны. При этом в литературе имеются лишь отдельные сведения об участии липидов в регуляции этих процессов. В частности, получены данные о взаимосвязи состава мембранных фосфолипидов и процессов, связанных с физиологией грибных спор (экзогенный и эндогенный покой, прорастание), формированием плодовых тел (Михайлова и др., 1993; Феофилова и др., 1998, 2004;
Sakai, Kajiwara, 2004, 2005; Терёшина и др., 2007). Выявлены морфогенные свойства отдельных молекулярных видов сфинголипидов, высказано предположение о зависимости состава этой группы липидов от интенсивности ростовых процессов и степени цитодифференцировки (Kawai, 1983, 1989; Котлова и др., 2009). При этом до сих пор остается неисследованным участие мембранных липидов в образовании специализированных клеток и анаморф, не сформулировано целостное представление о функционировании всего комплекса липид-зависимых регуляторных систем в процессе развития грибов.
Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выявление взаимосвязи процессов синтеза определенных классов мембранных липидов и основных этапов развития базидиальных грибов. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1) на примере нескольких модельных видов проследить, как меняется состав и содержание мембранных липидов в ходе развития поверхностных культур базидиальных грибов;
2) выявить универсальные изменения липидного компонента мембран, происходящие на определенных этапах морфогенеза базидиомицетов;
3) установить изменения в составе и содержании мембранных липидов, возникающие в условиях нарушения развития грибных культур, вызванного дефицитом элементов минерального питания;
4) оценить биоэффекторные (морфогенные) свойства отдельных классов и молекулярных видов липидов (с использованием специфических ингибиторов синтеза и экзогенных липидов, введенных в среду культивирования).
Научная новизна. В работе использован оригинальный подход к изучению роли липидов в морфогенезе базидиомицетов, заключающийся в комплексном исследовании динамики их состава в процессе нормального и нарушенного развития поверхностных культур грибов, изучении участия экзогенных липидов и ингибиторов их синтеза в формировании морфогенетического ответа.
Получены новые сведения о составе мембранных фосфо-, сфинго- и бетаиновых липидов у имеющих прикладное значение базидиомицетов Flammulina velutipes, Pholiota highlandensis, Schizophyllum commune, а также ранее не изученного в этом плане Abortiporus biennis.
На основании результатов исследования изменения соотношения двух основных классов мембранных фосфолипидов, фосфатидилхолинов (ФХ) и фосфатидилэтаноламинов (ФЭ) в онтогенезе четырех видов базидиомицетов выдвинута гипотеза об обратной зависимости между относительным содержанием ФХ и степенью клеточной дифференцировки.
Впервые показано, что недостаток элементов питания в поверхностных культурах базидиомицетов может сопровождаться индукцией синтеза липидов бетаинового типа. Накопление бетаиновых липидов происходит на фоне появления монилиоидных гиф и подавления плодообразования.
Получены новые сведения о зависимости биоэффекторных свойств гликоцерамидов (ГЦер) от их структуры.
Практическая значимость результатов.
Изучение эндогенных механизмов регуляции роста и морфогенеза грибов открывает пути к развитию способов управления скоростью роста и направлением развития патогенных и аллергенных грибов, грибов-биодеструкторов памятников архитектуры и библиотечных фондов, экономически важных культур съедобных грибов и грибов-продуцентов ценных вторичных соединений, а также редких охраняемых видов и грибов, используемых в биодеградации ксенобиотиков. Результаты исследования способствуют расширению представлений о биоэффекторных свойствах липидных молекул, которые могут быть востребованы для разработки подходов к управлению процессами роста и развития грибов посредством модификации их метаболизма.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 48-й, 50-й и 52-й Международных конференциях по фундаментальным исследованиям липидов ICBL (Финляндия, Турку, 2007; Германия, Регенсбург, 2009; Польша Варшава, 2011), рабочем совещании Microbial Lipids, From Genomics to Lipidomics FEBS (Австрия, Вена, 2010), 7 Конгрессе по липидомике Lipidomics congress: Lipids in All States (Франция, Англет-Биарритц, 2010), II и III съездах микологов России (Москва, 2010, 2012), III Международном симпозиуме Клеточная сигнализация у растений (Казань, 2011), 7 Международной конференции Mushroom Biology and Mushroom Products (Франция, Аркашон, 2011), Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (Санкт-Петербург, 2012), Международной Ботанической Конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012).
Связь работы с научными программами. Работа проводилась в рамках исследований по плану НИР лаборатории биохимии грибов БИН РАН, поддержана грантами РФФИ (№ 09-04-01634а, 11-0401704а, 12-04-31213) и грантами Федеральной целевой программы Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 - 2013 годы (ГК № П1167, П1373).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, заключения и списка литературы, включающего 614 наименований. Работа изложена на 195 страницах, содержит 9 таблиц и 54 рисунка.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Объекты исследования. В качестве объектов исследования были использованы 4 штамма из Коллекции Культур базидиомицетов Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН: Flammulina velutipes LE BIN 1483 (Physalacriaceae), Pholiota highlandensis LE BIN 11(Strophariaceae), Schizophyllum commune LE BIN 15(Schizophyllaceae), принадлежащие к пор. Agaricales, и Abortiporus biennis LE BIN 055 (Meruliaceae), относящийся к пор. Polyporales.
Выбранные штаммы характеризуются равномерным ростом в условиях поверхностной культуры, относительно четкой сменой стадий жизненного цикла, стабильным образованием плодовых тел в ответ на внешний стимул (освещение).
Постановка эксперимента. Культуры выращивали в чашках Петри на агаризованной среде. Культивирование проводили в течение 14 сут (A. biennis - 6 сут) при 25С в термостате в темноте, затем в климатической камере (Sanyo MLR-351H, Япония) с температурой 20С. Культивирование в камере проводили в темноте и, параллельно, при освещении 2000 к (световой режим 12:12).
В большинстве экспериментов (изменение состава липидов в онтогенезе, опыты с ингибиторами и экзогенными липидами) культуры выращивали на агаризованной среде на основе неохмеленного сусла производства Василеостровской пивоварни (Россия) (сусло, разведенное до 4 по Баллингу - 1 л, агар - 15 г). В одном из экспериментов (изменение состава липидов F. velutipes в процессе нарушенного развития) использовали среды, приготовленные на основе солодовых (мальц) экстрактов Biokar Diagnostics (Франция) и Fluka (Германия) (мальц-экстракт - 15 г/л, агар - 20 г/л), а также концентрата сусла Senson (Финляндия) (солодовый экстракт Maltax 10, разведенный до 4 по Баллингу - 1 л, агар - 15 г). Для анализа липидов и изучения морфологических характеристик использовали 7 - 35 сут (F. velutipes), 7 - 39 сут (P.
highlandensis), 5 - 28 сут (S. commune) 3 - 11 сут (A. biennis) вегетативный мицелий, а также мицелий с плодовыми телами (F.
velutipes) и отделенные от мицелия плодовые тела (P. highlandensis, S.
commune, A. biennis).
В экспериментах с экзогенными липидами использовали ФХ (тип XVI-E, Sigma, Германия) и гликоцерамиды (ГЦер), в т.ч.
выделенные из плодовых тел базидиомицета P. nameko, корней проростков пшеницы, а также коммерческий препарат, полученный из бычьего мозга (Sigma, Германия). Молекулярный состав ГЦер установлен методом ESI-MS/MS на масс-спектрометре 7-Т LTQ FT Thermo (Германия). Липиды вводили в среду в виде растворов в этаноле (ГЦер) или метаноле (ФХ), в контрольные варианты вносили соответствующее количество растворителя.
В экспериментах с ингибиторами синтеза сфинголипидов культуры выдерживали в темноте при 25 С в течение 7 - 14 сут. На 3и, 6-е и 12-е сут мицелий опрыскивали водными растворами ингибиторов, в т.ч. 30 М мириоцином (Sigma, Германия), 50 М фумонизином В1, (Sigma, Германия) и 100 М 1-фенил-2деканоиламино-3-морфолино-1-пропанолом (PDMP) (Sigma, Германия). Ингибиторы синтеза ФХ фарнезол, клофибрат и безафибрат (Sigma, Германия) вводили в среду в виде растворов в DMSO в концентрациях 200M и 1mM.
Экстракция, разделение и идентификация липидов. Липиды экстрагировали изопропанолом, затем смесью изопропанолхлороформ (1:1) (Nichols, 1963). Индивидуальные компоненты липидов анализировали методом двумерной ТСХ на стеклянных пластинах (Merck, Германия) в системе растворителей:
хлороформ/метанол/вода (65:25:4 по объему) - первое направление и хлороформ/ацетон/метанол/уксусная кислота/вода (50:20:10:10:5 по объему) - второе направление (Benning et al., 1995). Индивидуальные классы липидов идентифицировали, используя стандартные свидетели и реагенты на функциональные группы (Новицкая, 1972; Кейтс, 1975).
Анализ содержания индивидуальных классов липидов.
Количество индивидуальных классов глицеро- и сфинголипидов определяли на денситометре ДенСкан (Ленхром, Россия).
Хроматограммы анализировали в режиме линейной аппроксимации по калибровочным кривым, используя ФХ (Sigma, Германия) и бычьи цереброзиды (Larodan, Швеция) в качестве стандартов.
Анализ жирных кислот. ЖК липидов анализировали методом ГЖХ-МС в виде метиловых эфиров, которые получали путем гидролиза липидов с 2.5% H2SO4 в метаноле при 70С в течение часов (Conconi et al., 1996). В рутинных исследованиях использовали хроматограф Кристалл 5000.1 (Россия) с капиллярной колонкой HP-(30 м x 0.32 мм x 0.25 мкм). Температурный режим термостата: 3 мин при 170С, затем линейное повышение до 220С со скоростью 4С/мин. Температура испарителя - 250С, детектора - 230С. Газноситель - азот. Содержание ЖК в пробе рассчитывали по площади пиков с помощью программы Хроматэк-Аналитик 1 (Россия).
ЖК идентифицировали, сравнивая время удерживания полученных пиков со стандартами, а также по масс-спектрам, полученным на газо-жидкостном хроматографе Agilent 6850 (США) с квадрупольным масс-спектрометром 5975С в качестве детектора.
Капиллярная колонка Supelco Omega Wax 250 (США) (30 м 0.25 мм 0.25мкм), температура испарителя - 250С, детектора - 250С, деление потока - 1:20, скорость газа-носителя (гелий) - 1.0 мл/мин, температурный режим термостата - 170С с повышением до 220С со скоростью 4С/мин.
Для идентификации ЖК использовали масс-спектрометрическую библиотеку NIST и значения времен удерживания, которые сопоставляли с имеющимися свидетелями (Sigma, США).
Анализ молекулярных видов липидов. Состав молекулярных видов ГЦер, ФХ и ДГТС определяли по значению m/z с помощью времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом и электрораспылительным источником ионов (ESI-TOF) ВПМС МХ5310. Спектры получали в режиме положительных ионов, в диапазоне 150Ц2000 m/z. Распыляющее напряжение на капилляре - 3.кВ, температура десольвирующего газа - 50. Образцы растворяли в смеси метанол-ацетонитрил-муравьиная кислота (49 : 49 : 2). Объем пробы 10Ц50 мкл, скорость подачи пробы 1Ц5 мкл/мин.
Статистическую обработку материалов проводили в программах Microsoft Excel 2007 и Origin 6.1. Полученные данные выражали в виде М mM, где М - средняя арифметическая, mM - ошибка средней арифметической. Степень корреляции оценивали по значению коэффициента Пирсона. Достоверность различий между контролем и опытом оценивали по критерию Стьюдента при доверительном уровне Р1=95%. Количество независимых биологических повторностей - 3- 5.
Результаты и обсуждение Глава 1. Изменение состава мембранных липидов в процессе роста и развития поверхностных культур базидиомицетов 1.1. Интенсивность роста и особенности морфологии поверхностных культур базидиомицетов в процессе развития Для выявления зависимости состава мембранных липидов базидиомицетов от стадий их развития, характеризующихся появлением определенных типов клеток и/или клеточных структур, было исследовано несколько видов грибов, отличавшихся интенсивностью роста в культуре, наличием тех или иных типов дифференцированных клеток, особенностями развития плодовых тел.
Развитие F. velutipes и P. highlandensis (до созревания плодовых тел) длилось 35 - 39 сут (рис. 1 А, Б). Активная дифференцировка гиф начиналась после 14 сут (в культурах F. velutipes образовывались дейтероплазматические зернистые гифы, а в клетках P. highlandensis появлялись многочисленные вакуоли и развивались вздутия) (рис. 2). У F. velutipes появление анаморф (конидии) было отмечено преимущественно на начальных этапах развития. У P. highlandensis анаморфы (хламидоспоры) образовывались только на поздних стадиях (28Ц35 сут). Культуры S. commune и A. biennis отличались ускоренным ростом и/или развитием - созревание плодовых тел завершалось к 28 сут и 11 сут, соответственно (рис. 1 В, Г). К 14 сут в культурах S. commune происходила дифференцировка вегетативных гиф (образование шипообразных выростов). Морфология вегетативных гиф A. biennis менялась незначительно, развитие культуры шло в направлении массового образования хламидоспор (рис. 2).
А Б 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,02 0,0,02 0,0,0,0,0,0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35 Возраст культур, сут 0,0,В Г 0,6 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35 Рис. 1. Кривые роста поверхностных культур базидиомицетов. A - F.
velutipes, Б - P. highlandensis, В - S. commune, Г - A. biennis. - развитие в темноте, - развитие в условиях освещения. - стадия развития вегетативного мицелия, - стадия образования плодовых тел.
Масса мицелия, г Масса мицелия, г 1 F. velutipes 1 - 7 сут: тонкостенные гиалиновые гифы, артроконидии 2 - 28 сут:
толстостенные и дейтероплазматические гифы, артроконидии 3 P. highlandensis 3 - 7 сут:
тонкостенные гиалиновые гифы 4 - 28 сут:
вакуолизиованные гифы, хламидоспоры, гифы с вздутиями 5 S. commune 5 - 5 сут:
тонкостенные гиалиновые гифы 6 - 14 сут:
гифы с шипообразными выростами 7 A. biennis 7 - 3 сут:
тонкостенные гиалиновые гифы 8 - 11 сут:
терминальные хламидоспоры, собранные в грозди Рис. 2. Изменение микроморфологии базидиомицетов в ходе роста и развития культур (без освещения). 1-2 - фазовый контраст, 3-8 - дифференциально-интерференционный контраст (DIC), масштаб Ц10 m.
1.2. Состав и содержание индивидуальных классов липидов Основные мембранные липиды изученных видов грибов были представлены ФХ и ФЭ. Значительно меньше содержалось фосфатидилсеринов (ФС), фосфатидилинозитов (ФИ), дифосфатидилглицеринов (ДФГ), фосфатидных кислот (ФК) и ГЦер, на отдельных стадиях онтогенеза в следовых количествах присутствовали лизо-ФХ (рис.3).
По мере развития вегетативного мицелия количество индивидуальных классов липидов у F. velutipes и P. highlandensis менялось незначительно, в то время как у S. commune и A. biennis, отличавшихся наиболее интенсивным ростом в культуре, на начальных этапах онтогенеза было зарегистрировано резкое уменьшение содержания ФХ и/или ФЭ. При этом во всех культурах, за исключением A. biennis, в процессе развития культур происходило снижение соотношения ФХ/ФЭ. Максимальное значение этого индекса наблюдалось в 7 сут культурах F. velutipes, характеризовавшихся отсутствием дифференцированных вегетативных гиф и активным конидиогенезом, к 28 сут (стадия массового образования специализированных клеток) это соотношение снижалось более чем в раза. Развитие культур P. highlandensis, отличавшихся сравнительно невысокими темпами цитодифференцировки, сопровождалось меньшим снижением значения ФХ/ФЭ. В культурах S. commune резкое снижение значения ФХ/ФЭ зарегистрировано на самых ранних этапах развития - к 14 сут индекс ФХ/ФЭ уменьшился вдвое. Интересно, что у этого вида цитодифференцировка также отмечена на ранних стадиях развития (на сут в массовом количестве появлялись дифференцированные гифы с шипообразными выростами). В культурах A. biennis, морфогенез которых шел не в направлении дифференцировки вегетативных гиф, а по пути массового образования хламидоспор, индекс ФХ/ФЭ не снижался.
Таким образом, полученные данные демонстрируют существование физиологически обусловленной взаимосвязи между индексом ФХ/ФЭ и степенью дифференцировки гиф.
Сравнительный анализ липидов мицелия и плодовых тел также выявил некоторые закономерности. Как правило, по сравнению с мицелием, в плодовых телах содержалось большее количество липидов.
Кроме того, в исследованных видах на фоне снижения относительного содержания минорных липидов возрастала пропорция ФХ, ФЭ и ФС.
Усиление аккумуляции ФС в ходе плодообразования может быть связано с участием липидов этого класса в апоптозе, который является частью морфогенетической программы развития плодового тела (Phillips et al., 2003; Fedorova et al., 2005).
А Б 14 М+ПР М М М+ПТ М М 4 0 7 14 28 28 18 16 М М М М М ПТ М 14 12 10 8 6 4 3 2 4 6 0 7 14 28 39 28 39 2,1 2 М М М М М ПТ 1,5 М 1,5 0,0,0 5 14 21 21 28 2 10 9 8 М М М ПТ 7 6 5 3 4 6 3 6 11 Возраст культуры, сут Рис. 3. Изменение содержания основных мембранных глицеро- и сфинголипидов в ходе роста и развития поверхностных культур F. velutipes (1), P. highlandensis (2), S. commune (3) и A. biennis (4) в темноте (А) и на свету (Б). 1 - ФХ, 2 - ФЭ, 3 - ФК, 4 - ДФГ, 5 - ФС, 6 - ФИ, 7 - ГЦер. М - мицелий, ПР - примордии, ПТ - плодовые тела.
Содержание липидов, мг/г сухой массы.
Относительное содержание ГЦер в ходе вегетативного развития не менялось, однако, у F. velutpes и A. biennis, возрастало на стадии образования плодовых тел.
1.3. Состав жирных кислот Исследование состава ЖК основных фосфолипидов - ФХ и ФЭ - у 4-х видов базидиомицетов показало, что эти соединения этерифицированы преимущественно пальмитиновой (С16:0), стеариновой (С18:0), олеиновой (С18:19) и линолевой (С18:29,12) кислотами. В меньшем количестве присутствуют -линоленовая (С18:39,12,15), С15:0 и С16:1 кислоты. У F. velitipes и P. highlandensis обнаружены также С12:0, С14:0 и С17:0 ЖК. В некоторых культурах А Б другие F. velutipes другие С16:С16:А - мицелий (7 сут) С18:С18:С18:Б - мицелий с плодовыми С18:С18:1 телами (35 сут) С18:С18:С18:другие другие С18:3 С16:С18:3 С16:P. highlandensis С18:А - мицелий (7 сут) С18:С18:1 Б - плодовые тела (39 сут) С18:С18:С18:другие другие S. commune С16:0 С18:3 С16:С18:С18:С18:А - мицелий (5 сут) Б - плодовые тела (28 сут) С18:1 С18:С18:2 С18:С16:другие другие A. biennis С16:0 С18:С18:С18:С18:С18:0 А - мицелий (3 сут) Б - плодовые тела (11 сут) С18:С18:С18:Рис. 4. Состав ЖК фосфатидилхолинов базидиомицетов.
идентифицированы длинноцепочечные арахиновая (P. highlandensis, A. biennis) и бегеновая ЖК (F. velutipes, P. highlandensis). У F. velitipes выявлена достаточно редкая для грибов С16:29,12 кислота. Состав ЖК F. velitipes и S. commune характеризовался более высоким относительным содержанием -линоленовой кислоты в составе ФХ - 4Ц8% от суммы ЖК. Фосфолипиды A. biennis отличались максимальным относительным содержанием С18:2 кислоты (до 90%).
Развитие культур грибов сопровождалось модификациями в составе ЖК. В частности, образование плодовых тел коррелировало с увеличением степени ненасыщености за счет увеличения относительного содержания С18:2, иногда С18:1 (ФЭ P. highlandensis) и С18:3 (ФХ и ФЭ F. velutipes) кислот (рис. 4). В ходе развития поверхностной культуры S. commune наблюдалось изменение соотношения изомеров С18:1 кислоты.
Интересно, что в молекулах ФХ у изученных базидиомицетов соотношение С16/С18 ЖК, как правило, было вдвое ниже, чем в молекулах ФЭ, что может быть следствием преимущественного синтеза ФХ и ФЭ у этих видов по пути Кеннеди (в этом случае ферменты, катализирующие присоединение ЦДФ-холина и ЦДФэтаноламина к диацилглицеринам (ДАГ), могут отличаться специфичностью по отношению к различным молекулярным видам ДАГ, в т. ч. этерифицированным С16 или С18 кислотами).
1.4. Молекулярный состав сфинголипидов (на примере F. velutipes) Процесс дифференцировки вегетативных клеток мицелия F.
velutipes происходил на фоне модификаций молекулярного состава ГЦер. На начальных стадиях роста поверхностной культуры F. velutipes синтезировались ГЦер, содержащие в качестве сфингоидного основания эпоксидированный метилсфингодиенин (d18:1 8,4-epoxy,9-Met). По мере роста и специализации клеток мицелия во фракции ГЦер начинали доминировать молекулярные виды с обычным для базидиомицетов метилсфингодиенином (d18:2 8,4,9-Met) (табл. 1).
Глава. 2. Изменения в составе мембранных липидов в процессе нарушенного развития поверхностных культур F.
velutipes (дефицит элементов минерального питания) В процессе подбора оптимальных условий для поверхностного культивирования F. velutipes было обнаружено, что на агаризованной среде на основе солодового (мальц) экстракта Biokar Diagnostics происходит образование монилиоидных гиф, нехарактерных для культур данного штамма, выращенных на сусло-агаре, и не развиваются плодовые тела. Была поставлена задача - выяснить, сопутствуют ли атипичной макро- и микроморфологии культуры какие-либо изменения в составе мембранных липидов.
Табл. 1. Особенности распределения молекулярных видов ГЦер (% от суммы) в поверхностных культурах F. velutipes Возраст культуры, сут [M+Na]+ 7 14 28 Сфингоидное мицелий + мицелий + m/z основание/ЖК мицелий примор- плодовые дии тела 736 d18:18,4-epoxy,9-Met/14:1-ОН 3.1 - 5.8 2.738 d18:18,4-epoxy,9-Met/14:0-ОН 11.7 0.9 10.6 14.750 d18:2 8,4,9-Met/16:0-ОН 12.7 20.8 34.3 31.760 d18:2 8,4,9-Met/18:0.0 25.8 4.5 9.762 d18:2 8,4,9-Met/18:10.7 - 36.3 13.766 d18:1 8,4-epoxy, 9-Met/16:0-ОН 53.7 49.8 2.4 20.778 d18:2 8,4,9-Met/18:0-ОН 5.1 - 4.0 4.794 d18:1 8,4-epoxy,9-Met/18:0-ОН 2.9 2.7 2.2 3.А Б Рис. 5. Мицелий поверхностной культуры F. velutipes на стадии 9 (А), и 39 (Б) сут (нарушенное развитие). Условия культивирования: среда мальцагар Biokar Diagnostics, 15С, без освещения. Микрофотографии сделаны в режиме DIC.
Культуры выращивали на среде, приготовленной на основе солодового экстракта Biokar Diagnostics, а также, для сравнения, на средах с мальц-экстрактом Fluka, концентратом сусла Senson и неохмеленным суслом производства Василеостровской пивоварни.
Сравнительный анализ состава этих сред показал, что мальцэкстракты по сравнению с сусловыми средами содержат в два раза меньше азота и фосфора, а также уступают по количеству калия, магния, железа, микроэлементов и углеводов.
Культуры F. velutipes, выращенные на бедных средах (мальцагары), отличались более низкими темпами накопления биомассы и меньшей плотностью воздушного мицелия. Для них было характерно появление монилиоидных гиф на поздних этапах развития (рис. 5) и отсутствие базидиом. Эти изменения сопровождались индукцией синтеза липидов бетаинового типа диацилглицерилтриметилгомосеринов (ДГТС), наличие которых нехарактерно для F. velutipes.
На среде, приготовленной на основе мальц-экстракта Biokar Diagnostics, накопление ДГТС оказалось более существенным и происходило на более ранних стадиях развития. Анализ изменений состава и содержания липидов в онтогенезе F. velutipes, культивируемой на этой среде, выявил, что параллельно с постепенным накоплением ДГТС происходят изменения в содержании фосфолипидов, в т.ч. значительное (в 2 раза) снижение относительного содержания ФХ (рис. 6), что косвенно свидетельствует о компенсаторных отношениях ФХ и ДГТС.
3 9 15 21 Возраст культуры, сут Рис. 6. Изменение содержания основных мембранных глицеро и-, сфинголипидов в ходе нарушенного развития поверхностной культуры F.
velutipes. Условия культивирования: среда мальц-агар Biokar Diagnostics, 15С, без освещения. с.м. - сухая масса. 1 - ФХ, 2 - ФЭ, 3 - ДГТС, 4 - ФК, - ФС, 6 - ФИ, 7 - ДФГ, 8 - ГЦер.
Содержание липидов, мг/г с.м.
Сходство структур и физико-химических свойств этих двух классов липидов, в т. ч. близкие значения температур фазового перехода и вязкости, позволили выдвинуть гипотезу о функциональной взаимозаменяемости ФХ и ДГТС в мембране (Sato, Murata, 1997). По данным ESI+MS анализа, ФХ F. velutipes на 30Ц50% были представлены 18:2/18:2 молекулярным видом, тогда как преобладающим молекулярным видом ДГТС являлся 16:0/18:2 (40Ц50%). В ходе развития культуры состав ЖК фосфо- и бетаиновых липидов принципиально не менялся, за исключением линоленовой кислоты, относительное содержание которой в ФХ и ФЭ постепенно уменьшалось.
Исследована зависимость образования ДГТС от факторов внешней среды (температуры, освещения). Установлено, что наиболее активная аккумуляция ДГТС происходит при температуре 15С в отсутствии света.
Глава 3. Рост, морфогенез и состав липидов F. velutipes в условиях модифицированного метаболизма сфинголипидов 3.1. Действие ингибиторов синтеза сфинголипидов С целью выяснения роли ГЦер в регуляции роста и развития базидиальных грибов были проведены исследования действия ингибиторов их синтеза, в т.ч. мириоцина, фумонизина и 1-фенил-2деканоиламино-3-морфолино-1-пропанола (PDMP). Мириоцин блокирует конденсацию пальмитоил-КоА и серина, т.е. первую реакцию пути биоситеза ГЦер, приводя к истощению всех классов сфинголипидов, образующихся de novo. Фумонизин B1 ингибирует работу сфинганин-N-ацилтрансферазы, катализирующей перенос ацильной группы на молекулу сфинганина (Desai et al., 2002). PDMP блокирует последнюю реакцию биосинтеза ГЦер - присоединение глюкозы к церамиду (Kobayashi et al., 2006).
Все использованные ингибиторы синтеза ГЦер подавляли интенсивность роста культур (рис. 7). На стадии 7 сут мицелий, обработанный мириоцином или фумонизином, становился более рыхлым по сравнению с плотным однородным мицелиальным матом в контроле. Области с паутинообразным воздушным мицелием чередовались с лизированными участками. На среде с PDMP рост тормозился в меньшей степени, но после 30 сут культивирования в колониях снижалась интенсивность образования плодовых тел.
Под воздействием мириоцина в культуре появлялись дифференцированные толстостенные гифы с нерегулярными перегородками (рис. 7.2 Д), а также усиливалась степень агрегации гиф: появлялись различные сплетения, косички и пучки (рис. 7.А, Б, В, Г). Обработка культур фумонизином способствовала усиленному ветвлению апикальных частей гиф, появлению вздутий (рис. 7.3 А), а также возникновению косичек (рис. 7.3 Б). Кроме того, был зарегистрирован необычный способ конидиогенеза:
образование конидий путём фрагментации не специализированных конидиогенных гиф, а крупных вегетативных дикариотических гиф (рис. 7.3 В, Г). Культуры, обработанные PDMP, были сопоставимы с контрольными за исключением более высокого уровня конидиогенеза.
1 2 3 Рис. 7. Морфология колоний и микроморфология вегетативного мицелия поверхностных культур базидиального гриба F. velutipes (возраст культур - 7 сут). 1 - контроль, 2 - 30M мириоцин, 3 - 50M фумонизин, 4 - 100М PDMP. Микрофотографии сделаны в режиме DIC, масштаб - 10 m.
Анализ состава фосфо- и сфинголипидов после обработки культур F.
velutipes ингибиторами выявил не только ожидаемые изменения во фракции общих ГЦер, но и изменения в содержании фосфолипидов, подтверждая существование перекрёстных взаимодействий между этими двумя группами липидов (рис. 8). В культурах, обработанных мириоцином, на стадии 7 сут зарегистрировано снижение концентрации всех фосфолипидов. На стадии 14 сут содержание фосфолипидов восстанавливалось. При этом в составе ГЦер 7 сут культур, обработанных мириоцином, соотношение молекулярных форм с m/z 7и 766 значительно увеличивалось, становясь сопоставимым с ГЦер культур, находящихся на стадии торможения ростовой активности и усиления дифференцировки клеток. При обработке культур фумонизином в течение 7 сут содержание ФХ уменьшалось вдвое, а к сут происходило двукратное увеличение содержания ФХ и ФЭ. PDMP к 14 сут в 4 раза повышал соотношение ФХ/ФЭ.
А Б 10 ФХ ФЭ ФК ДФГ ФИ+ФС ГЦер ФХ ФЭ ФК ДФГ ФИ+ФС ГЦер Рис. 8. Эффект ингибиторов синтеза ГЦер на содержание фосфолипидов и ГЦер в 7 сут (А) и 14 сут (Б) культурах F. velutipes.
1 - контроль, 2 - 30 M мириоцин, 3 - 50 M фумонизин, 4 - 100 M PDMP.
3.2. Действие экзогенных ГЦер Известно, что функциональная активность ГЦер напрямую зависит от их структуры - длины цепи, количества и положения двойных связей в сфингоидном основании и жирной кислоте (Kawai, Ikeda, 1983; Дятловицкая, 1998; Pinto, 2002). Для выяснения роли структурных особенностей ГЦер в проявлении определенной физиологической активности было изучено влияние смесей молекулярных видов ГЦер, выделенных из грибов (плодовые тела Pholiota nameko), растений (корни пшеницы) и тканей животных (бычий мозг) на рост и развитие F.velutipes. Анализ их состава, проведенный методом ESI+MS/MS, показал, что грибные ГЦер на 97% представлены одним молекулярным видом, содержащим d18:24,8,9Met/16:0(ОН) церамид. ГЦер, выделенные из растительных и животных тканей, оказались гетерогенными. Смесь ГЦер пшеницы состояла из соединений, содержащих d18:2 с 16:0(ОН) или 18:0(ОН) (30%), d18:2 с длинноцепочечными гидрокси-кислотами С20 и Сряда (25%), t18:1 с 24:0(ОН) или 24:1(ОН) (35%). Смесь ГЦер, выделенных из бычьего мозга, была представлена соединениями, содержащими d18:1 с 14:0(ОН) или 18:0(ОН) (37%), d18:1 с длинноцепочечными гидрокси-кислотами С20 и С24 ряда (39%), t18:с 14:0(ОН) или 18:0(ОН) (24%).
Показано, что избыток ГЦер, выделенных из плодовых тел P.
nameko и содержащих 9-метил-сфингадиенин (d18:24,8,9Met) в качестве Содержание липидов, г/г с.м.
сфингоидного основания, способен тормозить рост культур, ускорять дифференцировку клеток и развитие плодовых тел.
После 8 сут культивирования на средах с добавлением ГЦер (мкг/мл) рост колоний F.velutipes на среде с грибными и растительными ГЦер заметно подавлялся, в то время как ГЦер, выделенные из животных тканей, практически не влияли на интенсивность роста мицелия. В культурах с растительными ГЦер было выявлено образование спиралеобразных гиф. Другие ГЦер каких-либо морфологических изменений не вызывали. Синусоидальный рост гиф был зарегистрирован у Candida albicans в ответ на изменение плотности среды и недостаток питательных веществ (Brand et al., 2009). Было показано, что эта морфогенетическая реакция опосредуется работой сигнальных систем, включающих активацию Са+-транспортеров. Более подробно механизмы, лежащие в основе спирального роста, не изучались. Известно только, что к ротации кончика гифы приводит регулярное круговое перемещение апикального центра Spitzenkorper (Gooday, 1993).
Ни в одном из экспериментов ожидаемого накопления эндогенных ГЦер зарегистрировано не было. При этом ГЦер, выделенные из корней пшеницы, вызывали увеличение содержания ФХ, в то время как ГЦер, выделенные из бычьего мозга, напротив, снижали количество липидов этого класса.
Сопоставление полученных результатов (влияние на рост, морфологию и состав липидов F.velutipes) с данными по молекулярному составу смесей экзогенных ГЦер позволяет заключить, что в определении морфогенных свойств принципиальное значение имеет длина цепи ЖК. Очевидно, наибольшей активностью обладают ГЦер с гидрокси-кислотами средней длины. Степень ненасыщенности сфингоидного основания также влияет на свойства ГЦер: молекулы с d18:2 основанием оказались более активными по сравнению с соединениями, содержащими d18:1. Значение количества гидроксильных групп в сфингоидных основаниях пока оценить невозможно, т.к. смеси ГЦер растений и животных содержали сопоставимые количества молекулярных видов с ди- и тригидроксиоснованиями. Существенное значение, по-видимому, имеет также наличие метильного радикала в составе сфингоидного основания.
Глава 4. Рост, морфогенез и состав липидов F. velutipes в условиях модифицированного метаболизма ФХ 4.1. Действие ингибиторов синтеза ФХ на рост, морфогенез и состав мембранных липидов Flammulina velutipes Метаболизм ФХ у грибов подробно изучен на S. cerevisiae, синтезирующем ФХ в реакциях последовательного трехступенчатого метилирования ФЭ. Специальных исследований, направленных на изучение путей синтеза ФХ и ФЭ у базидиомицетов, не проводилось.
В связи с этим в экспериментах, связанных с воздействиями на метаболизм ФХ, были выбраны ингибиторы ферментов, катализирующих образование ФХ в реакциях метилирования ФЭ (путь метилирования), в т.ч. безафибрат и клофибрат (NishimakiMogami et al., 1996), а также фарнезол - ингибитор реакции с участием ЦДФ-холина (путь Кеннеди) (Joo, Jetten, 2010).
Введение в среду культивирования безафибрата и клофибрата, ингибирующих метилтрасферазные реакции, не влияло на интенсивность роста колонии и морфологию мицелия. В культурах, выращенных на среде с 200 M фарнезолом, ингибитором ЦДФхолин:ДАГ-холин-фосфотрансферазы, наблюдалось значительное снижение скорости роста F. velutipes, а 1mM фарнезол практически полностью останавливал рост колонии. Однако торможение ростовых процессов в этих культурах не сопровождалось усилением дифференцировки клеток. В мицелии, выращенном на средах с этим ингибитором, содержалось такое же количество специализированных клеток, как и в контроле. Отличительной особенностью этих культур являлось развитие многочисленных синусоидально изогнутых вегетативных гиалиновых гиф (рис. 9).
1 Рис. 9. Морфология культур F. velutipes в условиях действия ингибиторов синтеза ФХ. 1 - контроль (0,1 % этанола), 2 - фарнезол (200 M).
Микрофотографии сделаны в режиме фазового контраста, масштаб - 10 m.
Анализ состава липидов F. velutipes при воздействии ингибиторов не выявил изменений в содержании ФХ и других фосфолипидов. По-видимому, в условиях ингибирования одного из путей синтеза ФХ происходит компенсаторное усиление работы другого альтернативного пути биосинтеза.
4.2. Действие экзогенных ФХ Как было показано, преобладающими молекулярными видами ФХ F. velutipes, а также многих других видов базидиоицетов, являются 18:2/18:2, 16:0/18:2. Введение в среду экзогенных ФХ (в концентрации 20 мг/л), выделенных из тканей животных и представленных преимущественно нехарактерным для базидиальных грибов молекулярным видом 16:0/18:1, ингибировало рост мицелия F.
velutipes на ранних этапах развития культуры (рис. 10), а на поздних этапах усиливало пигментацию колонии. В 7 сут культурах, выращенных в присутствии экзогенных ФХ, происходило уменьшение диаметра гиф до 1.3 - 2.2 мкм, часто наблюдающееся у данного штамма при старении культуры, а также образовывались синусоидально изогнутые гифы, что свидетельствует о нарушении их ориентации в пространстве и/или полярного роста.
1 Рис. 10. Морфология культур F.velutipes, выращенных на среде с экзогенными ФХ (7 сут, без света). 1 - контроль, 2 - ФХ. Микрофотографии сделаны в режиме DIC, масштаб - 10 м.
Таким образом, культуры, выращенные на средах с экзогенными ФХ с нетипичным для F. velutipes молекулярным составом, имели ряд черт стареющей культуры (низкая скорость роста, утоньшение гиф, отклонения в процессах полярного роста), но при этом в них не образовывались дифференцированные клетки (пустые толстостенные гифы, гифы с частыми перегородками), характерные для данного штамма на поздних этапах развития. Иными словами, внесение экзогенных ФХ приводило к торможению роста без усиления процессов клеточной дифференцировки. Интересно, что эта морфогенетичекая реакция сопровождалась двукратным увеличением соотношения ФХ/ФЭ, что ещё раз подтверждает существование связи высоких значений ФХ с недифференцированным состоянием клетки (рис.11).
25 А Б контроль 20 ФХ 15 10 5 0 ФХ ФЭ ФК КЛ ФС ФИ ГЦер ДАГ СЖК ТАГ Ст Рис. 11. Изменение содержания полярных (А) и нейтральных (Б) мембранных липидов в 7 сут мицелии F. velutipes при культивировании на средах с экзогенными ФХ. ДАГ - диацилглицерины, СЖК - свободные жирные кислоты, ТАГ - триглицериды, СТ - стерины.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ЖК - жирные кислоты ФГ - фосфатидилглицерины ГЦер - гликоцерамиды ФИ - фосфатидилинозиты ДАГ - диацилглицерины ФК - фосфатидные кислоты ДГТС - диацилглицерил- ФС - фосфатидилсерины триметилгомосерины ФХ - фосфатидилхолины ДФГ - дифосфатидилглицерины ФЭ - фосфатидилэтаноламины ТАГ - триацилглицерины Содержание липидов, мг/г с. м.
ВЫВОДЫ 1. Развитие поверхностных культур базидиальных грибов Flammulina velutipes, Pholiota highlandensis, Schizophyllum commune и Abortiporus biennis сопровождается изменениями состава мембранных липидов. Взаимосвязь липидного состава и морфологии грибов прослеживается на стадиях усиления процессов дифференцировки (накопление специализированных вегетативных клеток и анаморф) и образования плодовых тел.
2. Среди универсальных реакций фосфолипидного обмена, характерных для нескольких видов базидиомицетов, можно выделить следующие: 1) по мере дифференцировки клеток в культурах снижается значение индекса ФХ/ФЭ; 2) при формировании плодовых тел возрастает суммарное содержание ФХ, ФЭ и ФС на фоне уменьшения концентрации минорных липидов (ФК, ДФГ, ФИ), при этом увеличивается концентрация молекулярных видов ФХ и ФЭ, этерифицированных С18:29,12 и С18:29,12,15 кислотами.
3. Нарушение развития культуры Flammulina velutipes, вызванное недостатком элементов минерального питания, сопровождается индукцией синтеза липидов бетаинового типа (ДГТС). Накопление ДГТС наблюдается на фоне появления монилиоидных гиф и подавления образования плодовых тел.
4. В процессе дифференцировки поверхностной культуры F.
velutipes происходят изменения в составе молекулярных видов сфинголипидов. Наблюдается снижение относительного содержания ГЦер с d18:14,8-эпокси,9-метил сфингоидным основанием и увеличение пропорции ГЦер с d18:24,8,9-метил.
5. Ингибирование начальных этапов синтеза сфинголипидов приводит к нарушениям монополярного роста, усилению ветвления и образованию необычных агрегаций грибных гиф; ингибирование реакции гликозилирования свободных церамидов замедляет образование плодовых тел и усиливает конидиогенез.
6. Биоэффекторные свойства ГЦер зависят от структуры их гидрофобной части, в т.ч. степени ненасыщенности сфингоидного основания, длины и степени гидроксилирования ЖК.
7. Нарушения метаболизма ФХ сопровождаются изменениями интенсивности роста колонии F. velutipes. При этом ингибирование синтеза ФХ de novo (путь метилирования) не приводит к каким-либо изменениям, в то время как ингибирование реакции с участием ЦДФхолина (путь Кеннеди) вызывает торможение ростовых процессов и изменение направления роста клеток (образование спиральных гиф) без усиления их дифференцировки. Снижение интенсивности роста грибной колонии происходит также при внесении смеси экзогенных ФХ нетипичного для грибов молекулярного состава (с преобладанием 16:0/18:1).
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1. Котлова Е.Р., Сеник С.В., Кюхер Т., Шаварда А.Л., Кияшко А.А., Псурцева Н.В., Зубарев Р.А. Изменения в составе мембранных глицеро- и сфинголипидов в ходе развития поверхностной культуры Flammulina velutipes // Микробиология. Т.78., №2. 2009. С. 226-235.
2. Сеник С.В., Новиков А.В., Котлова Е.Р.. Структурное разнообразие гликоцерамидов в плодовых телах базидиальных грибов // Растительные ресурсы. Т.47, вып. 4. 2011. С. 131-140.
3. Senik S.V., Kotlova E.R., Psurtseva N.V., Novikov A.V., Khanin V.A., Shavarda A.L. Effect of exogenous sphingolipids on growth and metabolism in surface cultures of basidial fungi // Proceedings of the 7th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products (ICMBMP7) 2011. P. 96-102.
4. Сеник С.В., Котлова Е.Р., Новиков А.В., Шаварда А.Л., Псурцева Н.В. Образование диацилглицерилтриметилгомосеринов в поверхностной культуре базидиомицета Flammulina velutipes // Микробиология. 2012. Т. 81, № 5. С. 578-586.
Тезисы конференций 1. Kotlova E.R., Senik S.V., Kcher T., Shavarda A.L., Sinyutina N.F., Psurtseva N.V., Zubarev R.A. Glycosylceramides from Flammulina velutipes:
variety of molecular species, metabolism and involvement in fungal differentiation // Chemistry and Physics of Lipids. V. 149. 2007. P.S82.
2. Kotlova E.R., Senik S.V., Sinyutina N.F., Kcher T., Shavarda A.L., Novikov A.V., Psurtseva N.V., Zubarev R.A. The sphingolipid synthesis inhibitors affect phospholipid turnover in the basidial fungus Flammulina velutipes // Abstracts of XV Congress of European Mycologists, September 16 - 21, 2007. Saint-Petersburg, 2007. P. 95-3. Котлова Е.Р., Сеник С.В., Кияшко А.А., Шаварда А.Л. К вопросу о действии ингибиторов синтеза гликоцерамидов на рост, морфологические характеристики и липидный состав грибов // Современная микология в России. Т. 2.; Материалы 2-го съезда микологов России. М.;
Национальная академия микологии. 2008. С. 153-154.
4. Senik S.V., Kotlova E.R., Kiyashko A.A., Shavarda A.L., Artemenko K.A., Zubarev R.A. Sphingolipid synthesis inhibitors affect growth, morphology and metabolism of basidial fungus Flammulina velutipes // Chemistry and Physics of Lipids. V.160. 2009. P.30.
5. Сеник С.В., Котлова Е.Р., Кияшко А.А., Новиков А.В. Динамика изменений липидного компонента мембран в процессе морфогенеза базидиальных грибов // Иммунология, Аллергология, Инфектология.
№1. 2010. С.37-38.
6. Senik S.V., Kotlova E.R., Kiyashko A.A., Shavarda A.L., Novikov A.V.
Characterization of basidial fungus Flammulina velutipes subjected to inhibition of sphingolipid pathway: growth, morphology, and metabolic profile // Book of abstracts. FEBS Workshop Microbial Lipids. 13-15 May 2010, Vienna, Austria. P. 65.
7. Senik S.V., Kotlova E.R., Shavarda A.L., Novikov A.V. Biosynthesis of diacylglyceryltrimethylhomoserines in basidial fungi depends on chemical composition of the growth medium // Book of abstracts. 7th Lipidomics Congress Lipids in all states. 3 - 6 October 2010, Anglet - Biarritz, France.
P. 105.
8. Сеник С.В., Котлова Е.Р., Новиков А.В., Шаварда А.Л. Экзогенные гликоцерамиды в регуляции роста и развития базидиальных грибов // Тезисы докладов. Третий Международный Симпозиум Клеточная сигнализация у растений. 26 июня - 1 июля 2011, Казань, Россия. С.
171-172.
9. Senik S.V., Kotlova E.R., Novikov A.V., Novikov A.V., Shavarda A.L.
Growth regulation activity of glycosylceramides and their metabolites in basidial fungus Flammulina velutipes // Chemistry and Physics of Lipids. V.
164, Supplement 1, 2011, P. S33. Abstracts from the 52nd International Conference on the Bioscience of Lipids (Poland).
10. Сеник С.В., Котлова Е.Р. Влияние минерального питания на образование бетаиновых липидов у агарикоидных базидиомицетов // Современная микология сегодня. Т.3. Тезисы докладов третьего съезда микологов России. Москва, 2012. С. 85-86.
11. Сеник С.В., Котлова Е.Р., Богомолова Е.В., Кирцидели И.Ю.
Бетаиновые липиды у аско- и базидиомицетов: разнообразие и особенности регуляции // Сборник тезисов II(X) Международной Ботанической Конференции молодых ученых. Санкт-Петербург, 11 - ноября 2012. С. 69.
Подписано в печать л19 ноября 2012 г. Формат 60x84/Бумага офсетная. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 3110.
Типография Восстания - 1 191036, Санкт-Петербург, ул. Восстания, д.