Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Гудков Сергей Владимирович
МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПОД ВЛИЯНИЕМ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ИХ ГЕНОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ
03.01.02. - биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Пущино - 2012
Работа выполнена в Лаборатории изотопных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук и в Пущинском государственном естественно-научном институте.
Научный консультант: доктор химических наук, профессор Брусков Вадим Иванович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Воейков Владимир Леонидович зам. зав. кафедрой биоорганической химии биологического факультета МГУ, Москва доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович зав. лабораторией внутриклеточной сигнализации ИБК РАН, Пущино доктор биологических наук Орлов Николай Яковлевич зав. лабораторией функциональной биофизики белка ИТЭБ РАН, Пущино
Ведущая организация: Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Пущино
Защита диссертации состоится л 19 сентября 2012 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г.
Пущино, ул. Институтская, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу:
142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.
Автореферат разослан л______ _______________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук Ланина Н.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Среди веществ, присутствующих в любом организме, включая человека, вода преобладает. При этом необходимо ее постоянное поступление и обновление. Вода в биологических объектах представляет собой сложную систему, содержащую растворенные в ней атмосферные газы, различные ионы и другие компоненты, среди которых важная роль принадлежит активным формам кислорода (АФК). По современным представлениям, АФК в биологических системах являются как повреждающими, так и сигнальными агентами. При этом биологические объекты являются вторичными сенсорами образования АФК в водной среде. Вероятно, именно вода является основным первичным сенсором, а АФК - первичными медиаторами при воздействии на организм различных физических факторов. В настоящее время обстоятельно изучено образование АФК в воде при воздействии на нее таких физических факторов, как ионизирующие и ультрафиолетовое излучения.
Увеличение внутриклеточной концентрации АФК выше уровня антиоксидантной защиты вызывает локислительный стресс, который сопровождается негативными для жизнедеятельности клеток процессами, такими как перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков и нуклеиновых кислот [Зенков и др., 2001].
Окислительные повреждения ДНК связаны с такими процессами, как мутагенез [Cheng et al., 1992], канцерогенез [Olinski et al., 2002], старение и ряд связанных с ним болезней пожилого возраста [Beckman and Ames, 1997]. Значительная часть (60Ц80 %) повреждений ДНК, вызванных радиацией, формируется за счет АФК, образованных при радиолизе воды [Газиев, 1999]. Повреждения молекул ДНК являются одной из основных причин пострадиационной гибели животных [Ярмоненко, Вайсон, 2004].
С другой стороны, АФК играют в организме млекопитающих важную сигнальнорегуляторную роль [Saalu, 2010]. Установлено, что клетки млекопитающих обладают по крайней мере одним О2--сенсором и двумя типами Н2О2-сенсоров, направленных на адаптацию организма к окислительному стрессу [Hernandez-Garcia et al., 2010].
Инициация и развитие окислительного стресса в основном изучены для радиационноиндуцированных процессов, ряда болезней и патологических состояний. Однако первичные мишени и физико-химические механизмы генерации АФК под действием многих физических факторов, возможность инициации окислительного стресса низкоинтенсивными физическими факторами, а также их вклад в поддержание уже развившегося окислительного стресса остаются малоизученными. Выяснение фундаментальных физико-химических механизмов возникновения окислительного стресса под действием физических факторов позволит разработать новые методы его коррекции и предотвращения патологических последствий в организме животных и человека. В связи с этим, исследование физико-химических механизмов лежащих в основе окислительного стресса, а также изучение возможности его коррекции, представляют собой новую актуальную научную проблему.
Цель и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении физикохимических механизмов генерации АФК в воде и водных растворах при воздействии таких физических факторов, как тепло, видимый свет, лазерные и рентгеновское излучения.
В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
1. Установить физико-химические механизмы образования активных форм кислорода в воде и водных растворах при воздействии тепла, видимого света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм). Оценить способность влияния ряда биологически значимых анионов на этот процесс.
2. Исследовать возможность образования окислительных повреждений ДНК под действием тепла, видимого света и лазерных излучений (632,8; 1264 нм) в полосах поглощения молекулярного кислорода.
3. Исследовать процессы люминесценции воды после воздействия на нее ряда неионизирующих излучений.
4. Исследовать образование долгоживущих радикалов белка под действием ионизирующего излучения и образование активных форм кислорода в водных растворах при воздействии долгоживущих радикалов белка и аминокислот.
5. Исследовать развитие окислительного стресса в организме экспериментальных животных при воздействии долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением.
6. Исследовать антирадикальные свойства гидратированного фуллерена С60 и ряда природных пуриновых соединений.
Положения, выносимые на защиту. 1). Физико-химический механизм образования активных форм кислорода в воде и водных растворах под действием тепла, света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм). 2). При воздействии на водные растворы белков иоинзирующего излучения происходит образование долгоживущих радикалов белков с временами полужизни несколько часов, способных повреждать структуру ДНК и приводить к генерации активных форм кислорода. 3). Тепло, видимый свет и лазерные излучения (632,8; 1264 нм) низких интенсивностей могут приводить к развитию ряда повреждений биомакромолекул, сходных с повреждениями, образующимися при окислительном стрессе. 4). Гидратированный фуллерен С60, ряд природных пуриновых нуклеозидов и их производных проявляют существенные антирадикальные свойства in vitro и препятствуют развитию последствий радиационно-индуцированных повреждений в организме млекопитающих.
Научная новизна. Установлено, что при воздействии ряда неионизирующих физических факторов (тепла, света, видимых и инфракрасных лазерных излучений, а также электромагнитного излучения крайне высоких частот с большой пиковой мощностью) в воде, насыщенной атмосферным воздухом, происходит образование АФК. Показано, что образование АФК в воде под действием видимого и инфракрасного излучений происходит только пpи воздействии излучения c длинами волн, cоответcтвующими макcимумам поглощения молекуляpного киcлоpода.
Интенсивность образования наиболее долгоживущей АФК - перекиси водорода - в воде при воздействии исследуемых физических факторов зависит от рН и концентрации растворенного кислорода. Выявлен физико-химический механизм образования АФК в воде под действием тепла, света, лазерных излучений (632,8;
1264 нм). Пусковым этапом для этого процесса является переход кислорода из триплетного в синглетное состояние. Синглетный кислород восстанавливается до супероксид-анион радикала, протонированная форма которого дисмутирует с образованим перекиси водорода. Выявлено влияние биологически значимых анионов как доноров электронов в процессе образования перекиси водорода и гидроксильных радикалов под действием тепла. Воздействия на воду исследуемых неионизирующих излучений индуцируют в ней возникновение люминесценции. Выделены три фазы процесса люминесценции водных растворов: период индукции, период возникновения и нарастания свечения раствора, период колебательных изменений свечения воды с периодами 5 и 19 мин. Запуск автоколебаний люминесценции связан с возбуждением растворенного в воде молекулярного кислорода. Установлено, что перекись водорода, СОД, каталаза и азид натрия в существенной мере влияют на процесс люминесценции воды. При воздействии тепла, видимого света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм) на растворы ДНК in vitro происходит образование повреждений ДНК.
Предложен новый подход, позволяющий регистрировать возникновение долгоживущих радикалов белка при воздействии ионизирующей радиации в дозах не более 20 Гр. Показано, что при действии на белковый раствор ионизирующей радиации образуется два типа радикалов: с периодом полужизни в диапазоне нескольких десятков минут и с периодом полужизни несколько часов. Показано, что долгоживущие радикалы белков и аминокислот способны к генерации перекиси водорода в водных растворах. Установлен физико-химический механизм образования перекиси водорода в растворе под воздействием долгоживущих радикалов белка.
Показано, что долгоживущие радикалы белков способны приводить к окислительному повреждению ДНК in vitro и in vivo. Впервые показаны возможные проявления генотоксических свойств долгоживущих радикалов белка in vivo при нахождении их в кровяном русле и желудочно-кишечном тракте млекопитающих.
Впервые установлено, что гидратированные фуллерены значительно уменьшают радиационно-химический выход гидроксильных радикалов in vitro. Показан нестехиометрический характер антирадикальных свойств фуллерена. Данный препарат фуллеренов in vitro и in vivo эффективно предотвращает радиационно-индуцированное образование повреждений ДНК. Показано, что гидратированные фуллерены проявляют радиопротекторные свойства при введении их самцам мышей за 1 ч до тотального облучения рентгеновским излучением в летальной дозе. Установлено, что гидратированные фуллерены уменьшают тяжесть радиационно-индуцированных повреждений сосудов в легких, перикардии и тонком кишечнике.
Установлено, что ряд пуриновых соединений являются эффективными природными антиоксидантами. Они, особенно гуанозин и инозин, значительно уменьшают количество АФК, образующихся при воздействии ионизирующей радиации и тепла in vitro. Показано, что природные пуриновые соединения in vitro и in vivo эффективно предотвращают образование повреждений ДНК под воздействием ионизирующих излучений. Установлено, что данные соединения способны эффективно элиминировать радиационно-индуцированные долгоживущие радикалы белков. Природные пуриновые соединения проявляют радиационно-модифицирующие свойства при воздействии летальных и сублетальных доз ионизирующего излучения, причем наиболее существенный эффект наблюдается при введении их животным вскоре после облучения. Модифицирующий эффект природных пуриновых соединений при введении животным после воздействия ионизирующей радиации проявляется в результате их цитопротекторного действия и сопровождается снижением тяжести радиационно-индуцированной лейко-, тромбопении, нормализацией эритропоэза и более быстрым восстановлением повреждений ДНК.
Научно-практическая ценность. Впервые установлено, что первичной мишенью при воздействии тепла, видимого света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм) и электромагнитного излучения крайне высоких частот с большой пиковой мощностью является растворенный в водной фазе кислород. Установлены физико-химические механизмы и закономерности генерации АФК под действием перечисленных выше физических факторов. Пусковым механизмом образования активных форм кислорода в воде и водных растворах при воздействии тепла, видимого света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм) является переход кислорода из триплетного в синглетное состояние.
Синглетный кислород в свою очередь может восстанавливаться до супероксид-анион радикала, протонированная форма которого дисмутирует с образованием перекиси водорода. Впервые установлен феномен люминеценции воды после воздействия на нее перечисленных выше физических факторов. Полученные результаты восполняют пробел в понимании физико-химических механизмов лежащих в основе воздействия различных физических факторов, применяемых при физиотерапевтических процедурах, широко используемых в практической медицине. Полученные данные можно использовать в курсах лекций, посвященных образованию активных форм кислорода, окислительного стресса и воздействию неионизирующих излучений на биологические объекты. Полученные результаты открывают новые перспективы для дальнейших фундаментальных исследований в области радиационной биофизики и исследований свободно-радикальных состояний в биологии.
Разработан ряд способов модификации повреждающих последствий окислительного стресса. Полученные результаты могут быть использованы для оптимизации условий при терапии лучевой болезни, при радиотерапии онкологическиx заболеваний, для защиты профессионалов, имеющих дело с повышенными радиационными нагрузками, в ситуациях устранения радиационных аварий, для экипажей современных авиалайнеров, летающих на больших высотах (в условиях повышенного радиационного фона), для предотвращения патологических последствий воздействия ионизирующего излучения для населения при медицинских обследованиях с использованием рентгеновского излучения, а также в случае проведения террористических актов с использованием радиоактивных материалов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 6Ц14-й конференциях молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2002Ц2011), на VIЦIX Международных симпозиумах Биологические механизмы старения (Харьков, 2004, 2006, 2008, 2010), на Международной конференции Высокоинтенсивные физические факторы в биологии, медицине, сельском хозяйстве и экологии (Саров, 2004), на Международной научно-технической конференции Медэлектроника.
Средства медицинской электроники и новые медицинские технологии (Минск, 2004), на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на конференции Фундаментальные науки - медицине (Москва, 2004), на Съездах по радиационным исследованиям (Москва, 2006, 2010), на Всероссийских конференциях Биоантиоксидант (Москва, 2006, 2010), конференции Медицинская биоинженерия - 2007 (Пущино, 2007), на Международной конференции Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии (Санкт-Петербург, 2008, 2011), на Международной конференции Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем (Минск, 2008), на Международной конференции Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии (Днепропетровск, 2008), на XIЦX международных конференциях Человек и Космос (Днепропетровск, 2009Ц2010), на VIIIЦIX Конференциях, посвященных дню космонавтики (Москва, 2009Ц2010), на V Международном конгрессе Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине (Санкт-Петербург, 2009), на международной конференции RusnanotechТ09 (Москва, 2009), на конференции Экспериментальная и теоретическая биофизика (Пущино, 2009Ц2011), на международной конференции Нанобиофизика: Фундаментальные и прикладные аспекты (Харьков, 2009), на III Всероссийском конгрессе Симбиоз-Россия 2010 (Нижний Новгород, 2010), на III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии Медицинская физика - 2010 (Москва, 2010), на Международной научной конференции Психофизиологические и висцеральные функции в норме и патологии (Киев, 2010), на Международной конференции Современные проблемы радиобиологии (Гомель, 2010Ц2011).
Материалы конференций опубликованы в виде тезисов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 100 работ, из них монографии; 19 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ; 8 рецензируемых статей сборниках и 71 тезис докладов.
Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Минобразования (РФ Е00-6.0-293), РФФИ (00-04-48124, 03-04-49210-а, 04-04-97283р2004-наукоград_а, 07-04-00406-а, 10-04-00800-а, 10-04-00949-а), Фонда содействия отечественной науке (2005), Фундаментальные науки - медицине (2004), Президента РФ (МК-104.2010.4.), Гос. контракт (№ 24.431.10.0.).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 270 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (3 главы), методической части, изложения полученных результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов, списка цитируемой литературы (737 источников). Работа иллюстрирована 77 рисунками и содержит 23 таблицы.
Список принятых сокращений. АФК - активные формы кислорода, ККК - кумарин-3карбоновая кислота, 7-ОН-ККК - 7-гидроксикумарин-3-карбоновая кислота, ПХЭ - полихроматофильные эритроциты, МЯ - микроядра, НХЭ - нормохроматофильные эритроциты, ФУД - фактор уменьшения дозы, Guo - гуанозин, Ino - инозин, Xao - ксантозин, Caf - кофеин, ГНЛ - гелий-неоновый лазер, ИКЛ - инфракрасный лазер, ДЖРБ - долгоживущие радикалы белка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Определение концентрации перекиси водорода в водных растворах осуществляли с помощью высокочувствительного метода усиленной хемилюминесценции в системе люминоЦ4-йодофеноЦпероксидаза хрена [Bruskov et al., 2002]. Регистрацию величины хемилюминесценции осуществляли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика Бета-1 (СССР), работающего в режиме счета одиночных фотонов или хемилюминометра Биотокс 7АМ (Россия).
Определение продукции гидроксильных радикалов осуществляли с помощью их реакции с ККК, продукт гидроксилирования которой - 7-ОН-ККК - является удобным флуоресцентным зондом для определения образования этих радикалов [Черников, Брусков, 2002]. Флуоресценцию 7-ОН-ККК измеряли на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Австралия) с ex = 400 нм, em = 450 нм.
Иммуноферментный анализ. Для количественного определения 8-оксогуанина в ДНК использовали иммуноферментный анализ с применением моноклональных антител, специфичных к 8-оксогуанину [Брусков и др., 1999; Bruskov et al., 2002].
Определение продуктов депуринизации и урацила в ДНК. Для выделения урацила из ДНК использовали урацил-ДНК-гликозилазу. Разделение ДНК, урацила и продуктов депуринизации проводили с помощью жидкостной колоночной хроматографии с использованием сефадекса LH-20 [Gudkov et al., 2006]. Концентрацию урацила и продуктов депуринизации определяли на спектрофотометре Cary 100 (Австралия).
Измерение индуцированной рентгеновским излучением люминесценции белковых растворов проводили с помощью хемилюминометра Биотокс 7АМ (Россия).
Облучение растворов рентгеновским излучением проводили в стеклянных безкалиевых флаконах. Измерение всех образцов проводилось не менее чем в течение 30 с [Гудков и др., 2007; Гудков и др., 2010].
Измерение интенсивности люминесценции воды проводили с помощью хемилюминометра Биотокс 7АМ (Россия) в импульсном режиме [Брусков и др., 2009]. Измерения проводили в режиме реального времени с интервалом записи данных 1 сек [Gudkov et al., 2011]. В ряде экспериментов между флаконом с водой и ФЭУ хемилюминометра ставили оптические фильтры.
Определение концентрации растворенного в воде кислорода проводили с помощью оксиметрического электрода ДКТП 02.4 на приборе Эксперт-001 (Эконикс, Россия).
Изменение концентрации кислорода в воде проводили путем барботирования кислородом или аргоном в течении 20 мин [Гудков и др., 2010].
Микроядерный тест. Величину цитогенетических повреждений определяли по появлению ПХЭ, содержащих МЯ. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 24 ч после облучения в дозе 1,5 Гр. Гистологические препараты готовили и окрашивали по стандартной методике [Гудков и др., 2006] с модифицированным растворением клеточного материала [Assadullina et al., 2010].
Щелочной вариант метода комета-тест. Повреждения ДНК в клетках выявляли с помощью щелочного варианта комета-теста путем определения процента ДНК в хвосте кометы [Gudkov et al., 2009]. Электрофорез проводили при 4оС в течение 20 мин при напряженности электрического поля 2 В/см.
Тест на выживаемость. Выживаемость самцов аутбредных мышей Kv:SHK массой 28Ц 31 г в возрасте 10 недель после воздействия ионизирующего излучения определяли ежедневно в течение 30 суток. Контролем служили две группы мышей, инъецированных изотоническим раствором и облученные в той же дозе или не подвергавшихся облучению [Gudkov et al., 2006].
Некропсия проводилась, как это описано в [Gudkov et al., 2009].
Подсчет форменных элементов крови. В группе из 10 животных у пяти мышей, отобранных случайным образом, подсчитывалось количество форменных элементов периферической крови, затем результаты усреднялись для этих пяти животных.
В конце эксперимента, если число выживших мышей в группе было меньше пяти, кровь для подсчета забиралась у всех оставшихся животных. Образцы периферической крови брались из хвостовой вены. Все экспериментальные процедуры были подробно описаны в [Gudkov et al., 2009].
Анализ экспериментальных данных проводили с помощью бестрендового флуктационного и вейвлет-анализов, как это описано в [Gudkov et al., 2011].
Статистический анализ. Средние значения в экспериментальных группах сравнивали с контрольной группой, используя U-критерий теста МаннаЦУитни или непарный tкритерий Стьюдента. В экспериментах на выживание различия между группами сравнивались по точному критерию Фишера. При р < 0,05 разница считалась статистически значимой.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Образование АФК в воде и водных растворах при воздействии неионизурующих физических факторов 1.1. Образование активных форм кислорода в воде при воздействии тепла и повреждение ими ДНК. Ранее в нашей лаборатории показано, что под действием тепла в воде и водных растворах происходит образование АФК. Для объяснения этого процесса предложена следующая последовательность реакций: О2 О2 О2- HО2 Н2О2 ОH [Брусков и др., 2001; Брусков и др., 2002; Bruskov et al., 2002].
Более детальное исследование показало, что процессы образования АФК в воде не равновесны и вероятно происходят по типу химического осциллятора. На рис. показано, что кинетика образования Н2О2 в чистой бидистиллированной воде под действием тепла носит сложный характер [Смирнова и др., 2005]. Для такого поведения реакции необходимо существование механизма разложения Н2О2 при накоплении ее до определенного уровня. Таким механизмом могло бы быть цепное разложение Н2О2 [Панченков, 1974] по схеме: Н2О2 + eaq- ОН + ОН-, Н2О2 + ОН НО2 + Н2О, Н2О2 + НО2 ОН + Н2О + О2. Широко известны химические осцилляторы на основе перекиси водорода и йодат-ионов, детально исследованные ранее [Фарроу, 1998].
При реакции двух кислородных радикалов друг с другом выделяется энергия в виде квантов света [Кудряшов, 2004]. На рис.2 представлено влияние тепла на интенсивность собственной люминесценции воды. Вода, подвергнутая воздействию тепла имеет более интенсивную люминесценцию, которая после завершения нагрева со временем уменьшается и имеет квазиколебательный характер. Полученные данные также подтверждают, что процессы взаимодействия АФК в воде не равновесны.
Рис.1. Кинетика образования Н2О2 в чистой бидистиллированной воде при нагревании (40С - до разделения, 37С - после) (M m, n = 3Ц4).
Одним из важных этапов образования АФК под действием тепла является одноэлектронное восстановление кислорода. Принято считать, что 0 10 20 30 40 донорами электронов в биологических Время, ч системах являются преимущественно катионы металлов переменной валентности, такие как железо и медь [Меньщикова и др., 2006]. В воде, насыщенной атмосферными газами, в качестве донора электронов могут выступать некоторые биологически значимые анионы. В табл. 1 представлена зависимость влияния ряда биологически значимых анионов на процесс образования перекиси водорода и гидроксильных радикалов под действием тепла.
Рис. 2. Влияние нагревания на собственную люминесценцию воды. Люминесценция воды, подвергнутой воздействию температуры 37С в течение 4 часов (1), люминесценция воды, находившейся при комнатной температуре 20С (2).
Установлено, что сукцинат-, ацетат- анионы приводят к уменьшению образования Н2О2 и ОН-радикалов под действием тепла. Бикарбонат- и нитританионы под действием тепла наоборот, 0 1 2 3 4 увеличивают продукцию Н2О2 и ОНВремя, ч радикалов. Хлорид-анион в исследуемой концентрации существенно не влияет на образование АФК под действием тепла.
Известно, что бикарбонат-анион способен к одноэлектронному окислению, проявляя свойства восстановителя с образованием бикарбонат-радикала [Shafirovich et al., 2001].
Нитрит-анион также способен окисляться с образованием нитрит-радикала [Mcllivin and Altabet, 2005]. Данные свойства вероятно и позволяют этим соединениям быть донорами электронов в водных растворах.
[H O ], нМ люминесценции, имп/с В качестве сенсора образования в среде донора электронов был использован реактив Эллмана (ДТНБ), который представляет димер, при восстановлении которого образуются два оптически активных мономера (ТНБ). При прогревании образцов воды, содержащих ДТНБ, в течении 20 мин при температуре 50С, происходит увеличение поглощения растворов в области 412 нм, обусловленное восстановлением ДТНБ в ТНБ.
Установлено, что бикарбонат-анион проявлял существенную восстановительную активность, увеличивая восстановление ДТНБ более чем в 2 раза, меньшую активность проявляли хлорид и нитрит анионы. Сукцинат и ацетат анионы в существенной мере не влияли на восстановление ДТНБ.
Таблица 1. Влияние присутствия биологически значимых анионов в концентрации 1 мМ на образование перекиси Воздействие К** [7-ОН-ККК], К** [Н2О2], водорода и гидроксильных нМ**** нМ*** радикалов в воде под Контроль 12,4 0,9 0,67 0,07 действием тепла (M m, n = Сукцинат-анион 0,4 0,7 3,* - p < 0,05). ** - К - 4,5 0,9* 0,46 0,04* относительное изменение Ацетат-анион 0,3 0,4,2 0,3* 0,36 0,02* величины в присутствии и Хлорид-анион 1,1 1,13,5 0,9 0,67 0,в отсутствие изучаемого Бикарбонат-анион 1,3 1,16,6 1,8* 1,28 0,12* агента; *** - 40С, 4 ч. **** Нитрит-анион 1,3 2,16,0 0,9* 1,70 0,15* - 80С, 2 ч.
Выше показано, что генерации АФК может происходить под действием тепла, причем при наличии в среде ряда анионов, более интенсивно. У человека и животных наблюдаются крайне различные концентрации анионов в разных органах и тканях.
В плазме крови и других биологических жидкостях чаще всего встречаются хлорид- и бикарбонат-анионы. Однако плазма крови, как и другие биологические жидкости, достаточно сложная для работы и интерпретации результатов система, так как содержит большое количество органических соединений. В качестве модельной системы использовалась морская вода, которая, как и плазма крови, по большей части состоит из хлорид- и бикарбонат-анионов [Браун и Лемей, 1983]. Большим удобством при работе с морской водой является тот факт, что металлы переменной валентности в ее составе находятся в своих высших степенях окисления [Хорн, 1972], содержание их редокс-активных форм невелико. Например, концентрация катиона Fe2+ в морской воде составляет менее 1 нМ [Zafiriou, 1990], поэтому участие ионов металлов переменной валентности в качестве доноров электронов маловероятно.
Таблица 2. Влияние присутствия хлорид- и бикарбонат-анионов на образование в воде под действием тепла перекиси водорода (40С, 150 мин), гидроксильных радикалов (80С, 2 ч) и восстановительных эквивалентов (50С, 20 мин) (M m, n = 3,* - p < 0,05) К** [7-ОН-ККК], нМ К** К** Воздействие [Н2О2], нМ [ТНБ] 105, М Контроль 5,8 0,2 1,9 0,2 0,09 0,01 Морская вода 46,5 2,3* 8,0 3,9 0,3 2,1 1,62 0,09* 18,NaCl 0,53 М 14,3 1,7* 2,5 4, 0,40 0,03* NaHCO3 2,33 мМ 15,2 2,9* 2,6 7, 0,64 0,02* NaCl 0,53 М + 36,5 2,6* 6,3 23, 2,12 0,03* NaHCO3 2,33 мМ ** - К - относительное изменение величины в присутствии и в отсутствие изучаемого агента.
Полученные результаты по влиянию морской воды и ее отдельных анионов на образование перекиси водорода под действием тепла представлены в табл. 2 [Брусков и др., 2003]. В морской воде образование Н2О2 под действием тепла происходит в восемь раз более эффективно по сравнению с контролем. В присутствии хлорид- и бикарбонат-анионов наблюдается увеличение продукции перекиси водорода примерно в 2,5 раза, тогда как их совместное действие приводит к сверхаддитивному усилению эффекта до величины, составляющей 80% от образования Н2О2 в морской воде.
Исследованы восстановительные свойства отдельных компонентов морской воды. В морской воде восстановление ДТНБ до ТНБ происходит в 18 раз более эффективно по сравнению с контролем (табл 2.). Присутствие в нагреваемых образцах водного раствора ДТНБ как хлорид-, так и бикарбонат-аниона приводит к более интенсивному (в 4Ц7 раз) восстановлению ДТНБ до ТНБ по сравнению с контрольными пробами, не содержащими неорганических анионов (табл 2.). Совместное действие хлорид и бикарбонат анионов имеет при этом сверхаддитивный характер. Исследована генерация гидроксильных радикалов под действием тепла в морской воде. Из табл. видно, что в морской воде, наблюдается существенное (в 2 раза) увеличение продукции гидроксильных радикалов. В литературе встречаются косвенные данные, согласующиеся с полученными результатами. Так показано, что хлорид анион защищал ДНК in vitro от деструктивного воздействия ионизирующего излучения [Ward and Kuo, 1970]. Установлено, что автоокисление Fe+2 в растворе NaCl происходит значительно медленнее, чем в ряде неорганических и органических буферов [Welch et al., 2002].
Рис. 3. Изменение содержания 8оксогуанина в ДНК при воздействии тепла (37С) (M m, n = 4,* - p < 0,05).
Результаты, представленные на рисунке, получены совместно со Смирновой В.С.
* - достоверно отличается относительно точки с нулевой абсциссой (Р<0,05); ** - ординаты точек достоверно отличаются друг от друга в выделенном интервале (P<0,05).
Ранее в нашей лаборатории было показано, что под действием высоких температур (65Ц85C) в ДНК происходит образование 8оксогуанина - ключевого биомаркера окислительных повреждений нуклеиновых кислот, опосредованное АФК [Bruskov et al., 2002]. С помощью иммуноферментного анализа определено содержание 8-оксогуанина в ДНК после воздействия на нее физиологических температур (рис.3). Содержание 8-оксогуанина со временем изменяется сложным образом [Смирнова и др., 2011]. Полученные результаты косвенно подтверждаются литературными данными: показан осциллирующий характер образования 8-оксогуанина при окислении ДНК в реакции Фентона при 37С [White et al., 2003]. Воздействие тепла (37С) на ДНК не приводит к увеличению количества 8оксогуанина в ДНК, как при действии высоких температур (65Ц85C). Такое изменение количества 8-оксогуанина в ДНК при воздействии тепла (37С) не может быть вызвано депуринизацией модифицированного основания, так как данная модификация приводит не к ослаблению, а к повышению устойчивости гликозидной связи [Черников и др., 1996]. Поскольку 8-оксогуанин имеет более низкий окислительновосстановительный потенциал, чем природные основания, он в большей степени подвержен дальнейшему окислению [Doddridge et al., 1998], и есть все основания полагать, что под действием тепла (37С) происходит дальнейшее окисление 8оксогуанина до таких продуктов, как оксазолон, циануровая кислота, гуанидиногидантоин и спироиминодигидантоин [Hazra et al., 2001; Смирнова и др., 2005]. Таким образом можно заключить, что при воздействии температуры 37С скорость доокисления 8-оксогуанина сопоставима со скоростью окисления нативных гуанинов ДНК.
Процессы депуринизации и дезаминирования цитозина под действием тепла были известны ранее [Frederico et al., 1990; Lindahl, 1993] и объяснялись авторами как разрыв химических связей вызванных тепловой флуктуацией. В данном исследовании впервые показано, что скорость образования продуктов депуринизации, урацила и 8оксогуанина в ДНК под действием тепла зависят от концентрации кислорода (табл. 3).
Так при дополнительном насыщении кислородом раствора ДНК уровень индуцированных теплом повреждений увеличивается в 1,5Ц2 раза (табл. 3). Продувка раствора ДНК перед прогреванием азотом или аргоном приводит к почти двукратному уменьшению концентрации кислорода в растворе и ингибирует процесс образования повреждений ДНК (табл. 3). Наличие кислородного эффекта продемонстрировано впервые и является доказательством того, что образование продуктов депуринизации, урацила и 8-оксогуанина, происходит в ДНК за счет АФК, образующихся в водном растворе под действием тепла [Черников и др., 2007].
Таблица 3. Влияние газа, насыщающего раствор ДНК в фосфатном буфере (1мМ, рН 6,8), на образование модифицированных азотистых оснований и депуринизацию при нагревании раствора (M m, n = 3,* - Содержание Константа скорости p < 0,05). ** - Раствор повреждённого освобождения дополнительно насыщали Образец основания, пмоль/мкг основания из ДНК (k газом барботированием в ДНК 107), с-8-ОГ 1 Урацил 2 Гуанин3 Аденин3 течение 30 мин (2 л/мин).
1 - 70C, 24 ч; - 80C, Контроль 9,08 0,86 7,02 0,0,66 0,09 11,8 0,24 ч; - 80C, 4 ч.
О2 ** 13,43 1,96* 11,42 1,75* 1,35 0,36* 18,7 1,0* Результаты частично N2 ** - Ц 0,13 0,07* 7,9 0,8* получены совместно с Ar ** 0,06 0,05* - 7,30 0,19* 3,31 0,14* Черниковым А.В.
1.2. Образование АФК в воде при воздействии электромагнитного излучения крайне высоких частот с большой пиковой мощностью. Методом усиленной хемилюминесценции показано, что при воздействии импульсного электромагнитного излучения крайне высоких частот (ЭМИ КВЧ) с большой пиковой мощностью (37 ГГц, 20 кВт, 400 нс, 500 Гц) на фосфатный буфер (1 мМ, рН 6,8), в нем наблюдается образование Н2О2 [Гапеев и др., 2004]. Данные, приведенные в этой главе, получены совместно с Гудковой О.Ю., Гапеевым А.Б., Чемерисом Н.К. (ИБК РАН). Количество образующейся Н2О2 линейно зависит от времени воздействия, скорость образования Н2О2 при данных параметрах воздействия приблизительно равна 1,2 10-11 моль л-1 с-1. Скорость образовавшейся Н2О2 под действием ЭМИ КВЧ заданных характеристик близка к скорости образования полученной при воздействии на воду импульсного электромагнитного излучения сверхвысоких частот [Вакс и др., 1994]. Установлено, что при воздействии ЭМИ КВЧ происходит увеличение температуры раствора. Чтобы выяснить вклад нагрева буфера в образование Н2О2 под действием облучения, были смоделированы условия нагрева буфера в термостате. Установлено, что за 10 мин нагревания буфера в термостате при уровне нагревания, соответствующему облучению образцов ЭМИ КВЧ, в растворе образуется 0,8 нМ Н2О2 (15% от ЭМИ КВЧ). Таким образом, в образовании Н2О2 при воздействии ЭМИ КВЧ принимает участие не только тепловое воздействие, но и дополнительные механизмы. В результате воздействия на воду акустических колебаний могут происходить сдвиговые деформации ассоциированных структур воды, которые сопровождаются разрывами водородных и, возможно, ковалентных химических связей. ЭМИ КВЧ не проникает через слой желатина толщиной 1,5 см, однако возбуждает в нем акустические импульсы, распространяющиеся через желатин в буфер. Слой желатина также препятствует нагреву фосфатного буфера. Установлено, что облучение буфера через слой желатина приводит к образованию в буфере Н2О2, причем только при наличии плотного акустического контакта между желатином и буфером (~75% от ЭМИ КВЧ). Таким образом, можно предположить, что образование Н2О2 при воздействии ЭМИ КВЧ на водные растворы является результатом суммарного влияния тепла и возбуждаемых термоакустических колебаний. Для выяснения механизмов образования перекиси водорода в водных растворах под действием ЭМИ КВЧ было исследовано влияние концентрации кислорода на процесс генерации Н2О2. Показано, что при насыщении облучаемого буфера азотом продукция Н2О2 уменьшается более чем в 1,5 раза. При добавлении в облучаемый буфер гуанозина (лперехватчика синглетного кислорода), наблюдается более чем в 2 раза менее интенсивное образование Н2О2. Таким образом, установлено, что образование перекиси водорода в процессе облучения ЭМИ КВЧ обусловлено активацией растворенного в буфере кислорода. Результаты эксперимента с гуанозином позволяют предположить, что цепь реакций, ведущих к образованию перекиси водорода в облучаемом буфере, включает стадию образования синглетного кислорода [Гудкова и др., 2005].
1.3. Образование АФК в воде при воздействии видимого света. Установлено, что при 5-часовой экспозиции воды на солнечном свету образуется 50Ц200 нМ Н2О2.
В солнечную погоду образование Н2О2 происходит в 2Ц4 раза более эффективно, чем пасмурные дни при рассеянном солнечном свете [Гудков и др., 2010]. При воздействии солнечного света в течение трех часов и более иногда наблюдаются тенденции к квазиколебательному изменению концентрации перекиси водорода. Важно отметить, что в стеклянной посуде, которая не пропускает ультрафиолетовое излучение, также наблюдается образование Н2О2 под действием естественного освещения, однако приблизительно вдвое менее интенсивное, чем в кварцевой посуде.
Рис. 4. Кинетика образования Н2О2 в бидистиллированной воде при воздействии видимого света (M m, n = 3). 1 - Образцы воды, подвергнутые воздействию света. 2 - Контрольные образцы без освещения.
Под действием искусственного источника света (энеpгетичеcкая оcвещенноcть 83,3 Вт/м2) происходит образование Н2О2 (рис. 4). Как и в случае с естественным солнечным 0 1 2 3 4 светом, за первые два часа освещения Время, ч происходит быстрое накопление Н2О2 в воде, достигающее величины около 15 нМ, при ее исходной концентрации около 4 нМ, тогда как за последующие 3 ч освещения концентрация перекиси водорода остается практически неизменной, увеличиваясь в пределах 1Ц2 нМ. Таким образом, при искусственном освещении наблюдается на порядок меньший эффект, однако [Н О ], нМ стандартные условия освещения позволяют получать хорошо воспроизводимые результаты вне зависимости от метеорологической обстановки. Поэтому дальнейшее исследование физико-химических механизмов образования Н2О2 под воздействием света проводили с использованием искусственного источника света [Гудков и др., 2012].
Таблица 4. Влияние различных веществ на образование перекиси водорода в воде под действием света (83,3 Вт/м2, 120 мин) (M m, n = 3,* - p < 0,05). ** - В указанной концентрации азид натрия не оказывал заметного ингибирующего влияния на активность пероксидазы счетного раствора. *** - К - Воздействие [Н2О2], нМ К*** относительное изменение величины Н2ОКонтроль 1,10,2 0,в присутствии и в отсутствие изучаемого агента.
О2**** 1,18,4 0,**** - Раствор дополнительно насыщали газом Ar**** 0,5,3 0,с помощью барботирования в течение 30 мин D2O (25%) 1,18,2 1,2** (2 л/мин) непосредственно перед воздействием.
Азид (0,1мкМ)* 0,3,5 0,3** СОД (10-3 ед./мл) 1,15,1 0,9** Для ионизации одной молекулы воды (Н2О Тирон (100 нМ) 0,0,0 0,0** Н2О+ + e) требуется около 20 эВ [Ward, Этанол (1 М) 0,6,1 0,3** 1988]. Энергия кванта света в видимой D-маннит (200 мМ) 0,4 0,1** > 0,области составляет 2Ц3 эВ, то есть ионизация Менадион (2мкМ) 6,66,4 2,3** воды под действием видимого света не возможна [Кудряшов, 2004]. Однако, энергии квантов видимой области спектра достаточно для перехода растворенного кислорода из триплетного в синглетное состояние (эта энергия равна около 1 эВ) [Miller et. al., 1990]. Показано, что образование Н2О2 в воде под действием света происходит только пpи облучении образцов c длинами волн, cоответcтвующими макcимумам поглощения молекуляpного киcлоpода (477, 577, 630 нм) [Гудков и др., 2012].
Рис.5. Схема совокупности реакций, происходящих при образовании Н2О2 под действием света. hv - означает действие света.
Исследовано образование Н2О2 в воде под действием света в зависимости от концентрации растворенного в воде кислорода, присутствие ловушки синглетного кислорода и дейтерированной воды (табл 4). Показано наличие кислородного эффекта. В D2O существенно увеличивается время жизни синглетного кислорода, что приводит к увеличению интенсивности генерации Н2О2 под действием света. Такой перехватчик синглетного кислорода, как азид натрия, уменьшает концентрацию синглетного кислорода, что приводит к ингибированию процесса образования Н2О2 (табл. 4). При добавлении СОД наблюдается более интенсивное образование Н2О2 в результате усиления дисмутации супероксид-анион радикалов. При использовании спиновой ловушки тирона наблюдается уменьшение количества образовавшейся Н2О2, что также указывает на участие супероксид-анион радикала в процессе образования перекиси водорода под действием света (табл. 4). Перехватчики гидроксильных радикалов (D-маннит и этанол) также существенно уменьшают количество образующейся Н2О2. Эффективный акцептор электронов менадион, наоборот, существенно увеличивает уровень образования Н2О2 (табл. 4). Показано, что образование Н2О2 под действием света зависит от рН среды и увеличивается при ее щелочных значениях.
Иcxодя из полученных результатов, можно предположить, что химические реакции, приводящие к образованию H2O2, протекают по следующей схеме (рис. 5). Пуcковым этапом обpазования АФК в воде под дейcтвием cвета является пеpеxод pаcтвоpенного в ней киcлоpода из тpиплетного в cинглетное cоcтояние. Этот пеpеxод оcущеcтвляетcя под воздейcтвием квантов света, с длинами волн, cоответcтвующими полоcам поглощения молекуляpного киcлоpода [Гудков и др., 2012]. Затем cинглетный киcлоpод воccтанавливаетcя до cупеpокcид-анион pадикала, пpотониpованная фоpма котоpого диcмутиpует c обpазованием пеpекиcи водоpода и cинглетного киcлоpода.
Электронные механизмы активации молекулярного кислорода, позволяющие преодолеть спиновые запреты, рассмотрены в работе [Минаев, 2007]. Для pеализации этого пpоцеccа необxодимо наличие в воде cоединений воccтановительной пpиpоды, являющиxcя доноpами электpонов. Извеcтно, что под дейcтвием квантов cвета некотоpые анионы пеpеxодят в возбужденное cоcтояние и затем диccоцииpуют c обpазованием электpон-pадикальной паpы: cольватиpованного электpона и pадикала.
В чистой воде такими cоединениями могут быть пpиcутcтвующие в наcыщенном воздуxом водном pаcтвоpе бикаpбонат-анионы, гидpокcил-анионы и атомы водоpода [Фомин и др., 1964; Клоcc, 1988; Бpуcков и др., 2002; Брусков и др., 2003; Гудков и др., 2010]. Показано, что под действием видимого света происходит образование ключевого биомаркера окислительного повреждения ДНК - 8-оксогуанина.
1.4. Образование активных форм кислорода в воде при воздействии излучения гелий-неонового лазера (ГНЛ) (632,8 нм). Выше было показано, что под воздействием тепла и света в водных растворах, насыщенных воздухом, происходит образование активных форм кислорода. С помощью метода усиленной хемилюминесценции исследовано влияние излучения ГНЛ на генерацию H2O2 в воде.
Показано, что в течение первых 30 мин после облучения происходит накопление H2Oприблизительно до 15 нМ, затем происходит дальнейшее увеличение средней концентрации H2O2 до величины приблизительно в 25 нМ.
Таблица 5. Влияние различных веществ на образование перекиси водорода в бидистиллированной воде под действием Воздействие [Н2О2], нМ К*** излучения ГНЛ в течение 5 мин (M m, n = 3,* - p Контроль 1,5,1 0,< 0,05). ** - В указанной концентрации азид D2O (25%) 1,6,3 0,3* натрия не оказывал заметного ингибирующего Азид (0,1мкМ)** 0,1,8 0,4* влияния на активность пероксидазы счетного Гуанозин (1 мМ) 0,1,3 0,4* раствора *** К - относительное изменение величины Н2ОСОД (10-3 ед./мл) 1,6,9 0,5* в присутствии и в отсутствие изучаемого агента.
Тирон (100 нМ) 0,3,1 0,3* **** - Раствор дополнительно насыщали газом О2**** 2,13,8 1,6* с помощью барботирования в течение 30 мин Ar**** 0,2,5 0,5* (2 л/мин) непосредственно перед воздействием.
С помощью высокоспецифичного флуоресцентного зонда для гидроксильных радикалов ККК установлено, что при воздействии лазерного излучения в воде происходит образование гидроксильных радикалов. В течение первых 30 мин после облучения образуется около 6 нМ ОН-радикалов. К концу второго часа после облучения происходит дальнейшее образование ОН-радикалов до величины 10Ц12 нМ.
Показано, что при воздействии на воду лазерного излучения с длинной волны 650 нм, соответствующей минимуму поглощения молекулярного кислорода, образование АФК не наблюдается. Влияние D2О, азида натрия и гуанозина на образование Н2О2 под действием излучения ГНЛ указывает на участие синглетного кислорода в этом процессе (табл. 5).
Участие супероксид-анион радикалов в процессе образования Н2О2 в воде при воздействии ГНЛ-излучения показано с помощью СОД и спиновой ловушки тирона. Насыщение воды кислородом приводит к существенному увеличению продукции Н2О2, а аргоном - к её резкому уменьшению (табл. 5). В целом полученные результаты можно также обобщить с помощью схемы (рис. 5).
Рис. 6. Влияние длительности воздействия облучения ГНЛ на люминесценцию воды.
Воздействие на воду лазером в течение мин (1), 5 мин (2), 3 мин (3) и 1 мин (4).
юминесценция воды без облучения (5).
Рис. 7. Основные типы автоколебаний люминесценции воды, индуцированные излучением ГНЛ в течение 5 мин.
Нерегулярные колебания люминесценции воды (1), колебания типа пакета импульсов (2), колебания люминесценции воды типа регулярные пики (3).
Рис. 8. Влияние на колебательный процесс люминесценции воды каталазы (1), СОД (2) и азида натрия (3) после воздействия лазерного излучения в течение 5 мин.
Момент внесения этих веществ показан стрелками.
На рис. 6 представлены результаты измерений люминесценции воды, облученной ГНЛ в течение 1; 3; 5 и мин. Без воздействия ГНЛ и для облученной в течение 1 мин воды, люминесценция существенно не изменяется на протяжении 6 ч. При облучении лазером воды в течении 3 мин (Рис. 6, 3), наблюдается длительный инкубационный период, составляющий 1,5 - 2,5 ч. После него в течение примерно получаса происходит нарастание люминесценции, а затем наступает колебательный процесс ее изменения [Брусков и др., 2009]. Для облученной лазером в течение 5 мин воды характерен более короткий инкубационный период возникновения люминесценции, составляющий 30Ц60 мин после облучения (Рис. 6, 2). Фаза возникновения и нарастания свечения длится 20Ц40 мин, с последующим переходом процесса в колебательное состояние. При облучении лазером воды в течении 15 мин (Рис. 6, 1), инкубационный период после облучения отсутствует, сразу после облучения наблюдается колебательное изменение интенсивности люминесценции воды.
На рис 7. изображены характерные результаты измерения люминесценции воды облученной лазером в течение 5 мин. Они отражают три основные типа изменений люминесценции: нерегулярные колебания, колебания типа пакета импульсов и типа регулярных пиков. В 42 экспериментах из 60 (70% от общего количества) присутствовали нерегулярные изменений люминесценции (Рис. 7, 1), в них отсутствует четкая периодичность и наблюдается разнообразие амплитуд колебаний. Колебания типа пакета импульсов (Рис. 7, 2) встречаются более редко (18% от общего количества). Они характеризуются квазирегулярными изменениями люминесценции, близкими по величине амплитудами и состоят из характерных пиков с несколькими максимумами (от 2 до 4). Регулярные отдельные пики (Рис. 7, 3) встречаются еще более редко (12% от общего количества экспериментов). Они характеризуются четко выраженными максимуми с близкими по величине амплитудами.
Для выявления участия АФК, индуцируемых ГНЛ-излучением, в колебательном процессе хемилюминесценции воды использовали: супероксиддисмутазу (СОД), катализирующую восстановление супероксид-аниона до Н2О2 и молекулярного кислорода; каталазу, катализирующую реакцию восстановления Н2О2 до Н2О и О2, а также азид натрия как тушитель синглетного кислорода. Влияние внесения СОД, каталазы и азида натрия после воздействия лазерного излучения на люминесценцию воды представлено на рис. 8. Добавление каталазы после воздействия ГНЛ-излучения приводит к уменьшению средней интенсивности люминесценции и амплитуды колебаний. После этого наблюдается тенденция к увеличению интенсивности люминесценции, а через 2Ц3 ч средний уровень люминесценции достигает величины, наблюдаемой до внесения фермента (Рис. 8, 1). При добавлении СОД в течение 1Ц1,5 ч происходит уменьшение величины люминесценции и амплитуды колебаний, после чего наблюдается тенденция к увеличению интенсивности люминесценции с увеличением периода колебаний (Рис. 8, 2). Добавление азида натрия приводит к существенному уменьшению величины люминесценции. Такое состояние сохраняется несколько часов без заметных изменений интенсивности люминесценции (Рис. 8, 3). Полученные результаты свидетельствуют об участии в данном процессе cупеpокcид-анион pадикалов, Н2О2 и синглетного кислорода [Брусков и др., 2009].
Рис. 9. Влияние добавок перекиси водорода (100 нМ) на процесс собственной люминесценции воды при облучении ГНЛ в течение 5 мин. Перекись водорода добавляли к воде до воздействия излучения ГНЛ (1) и после (2). Контролем служили пробы воды, облученные в течение 5 мин без добавок перекиси водорода (3).
Для выяснения роли перекиси водорода в люминесценции исследовано влияние ее добавок к воде в концентрации 100 нМ до и после облучения ГНЛ (Рис. 9). Наблюдаемые при этом эффекты коренным образом отличаются друг от друга. При добавлении Н2О2 до действия ГНЛ-излучения происходит весьма интенсивная люминесценция (550 имп/с), которая затухает в течение 3 ч, после чего возникает нерегулярный колебательный режим. При добавлении Н2О2 после облучения общий характер процесса был приблизительно такой же, как и без добавок Н2О2 (Рис. 6, 7). Однако в целом, он характеризовался более интенсивной люминесценцией в фазе ее увеличения. Эти данные могут свидетельствовать о том, что свечение происходит в результате фотолиза перекиси водорода согласно реакции: 2 Н2О2 + h 2 Н2О + О2, тогда как добавление Н2Опосле воздействия лазера сопровождается ее распадом без свечения в результате реакции: Н2О2 + е ОН + ОН. Предполагается, что образовавшиеся под действием ГНЛ-излучения АФК могут повреждать ДНК и приводит к образованию в ней ключевого биомаркера окислительного повреждения ДНК - 8-оксогуанина.
Установлена зависимость образования 8-оксогуанина в ДНК от времени воздействия ГНЛ, которая близка к линейной. При воздействии на раствор ДНК in vitro ГНЛ в течение 1 мин образуется такое же количество 8-оксогуанина, как и при воздействии рентгеновского излучения в дозе 0,1 Гр. При воздействии на раствор ДНК лазерным излучением с длиной волны 650 нм, соответствующей минимуму поглощения молекулярного кислорода, образования 8-оксогуанина не происходит. [Гудков и др., 2012].
1.5. Образование АФК в воде при воздействии инфракрасного лазерного (ИКЛ) излучения (1264 нм). Энергия ИК-кванта около 1 эВ достаточна для перевода молекулы кислорода в низшее синглетное состояние электронного возбуждения [Miller et. al., 1990]. Выше показано, что после кратковременного облучения ГНЛ милливаттной мощности в воде наблюдалась продолжительная люминесценция, имеющая автоколебательный характер. Длина волны ГНЛ 632,8 нм соответствует полосе поглощения димолей молекулярного кислорода. Однако энергия этого фотона достаточна и для возбуждения органических примесей, которые гипотетически могут присутствовать в водных образцах в следовых количествах и участвовать в инициации данного процесса. Для исключения такой возможности использовано облучение с длиной волны 1264 нм, которая отвечает максимуму в спектре действия, фотоиндуцированного светокислородного эффекта, в интервале 1,25Ц1,30 мкм [Zakharov and Ivanov, 1999]. В воде, экспонированной к 1264 нм излучению, происходит образование Н2О2. Концентрация Н2О2 через 5 мин после лазерного воздействия увеличивается, в течение последующего часа концентрация Н2Осущественно не изменяется. Затем, с 1 по 3 ч наблюдается дальнейшее увеличение средней концентрации H2O2 до величины приблизительно 15 нМ, и до примерно 18 нМ с 5 до 6 ч [Гудков и др., 2012].
Таблица 6. Влияние различных веществ на образование перекиси водорода в бидистиллированной воде под воздействием Воздействие [Н2О2], нМ К** лазерного излучения (1264 нм) в течение Контроль 2,0 0,2 1,0 мин. (M m, n = 3,* - p < 0,05). ** - К - относительные изменения концентрации Н2ОAr**** 0,0,2 0,1* под влиянием изучаемого агента. *** - В О2**** 2,5,4 0,7* указанной концентрации азид натрия не D2O (25%) 2,4,2 0,8* оказывал заметного ингибирующего влияния Азид Na (0,1мкМ)*** 0,0,8 0,2* на активность пероксидазы. **** - Вода СОД (10-3 ед./мл) 2,4,4 0,8* насыщалась в течение 15 мин газом перед Тирон (100 нМ) 0,1,0 0,4* воздействием путем барботирования.
Показано, что в образце с повышенным в 2,6 раза содержанием О2 концентрация Н2Оувеличивается в 2,7 раза (табл 6). При насыщении воды аргоном образование Н2Оуменьшается. Добавление 25% D2О увеличило образование Н2О2 в два раза.
Присутствие перехватчиков синглетного кислорода - азида натрия и супероксид-анион радикалов - тирона препятствует продукции Н2О2 под воздействием ИКЛ-излучения (табл. 6). При добавлении СОД наблюдается образование Н2О2 более чем в два раза интенсивнее в результате усиления дисмутации супероксид-анион радикалов (табл. 6).
Полученные результаты, как и ранее, при воздействии света и излучения ГНЛ, можно обобщить с помощью схемы (рис. 5).
С помощью иммуноферментного анализа определено содержание 8-оксогуанина в ДНК после воздействия на нее ИКЛ-излучения. Установлено, при воздействии на раствор ДНК in vitro инфракрасным лазером происходит образование 8-оксигуанина.
После 5 мин экспозиции образца бидистиллированной воды к 5 мВт излучению ИКЛ наблюдается задержанная во времени люминесценция (рис. 10). В течение 1,5Ц2,5 ч влияние облучения никак не проявляется: интенсивность люминесценции не превышает уровень фона. Затем происходит увеличение люминесценции, и за 20Ц 40 мин она существенно увеличивается с последующим переходом в режим автоколебаний (рис. 10, вкладки 1,2). Процесс продолжается 16Ц22 ч, после чего интенсивность люминесценции уменьшается до контрольных значений. Таким образом, после воздействия ИКЛ-излучения, как и при воздействии ГНЛ, наблюдаются три последовательных стадии: 1) латентный период, 2) возникновение и нарастание свечения, 3) квазипериодические автоколебания свечения. Без воздействия лазерного излучения (контроль) люминесценция воды существенно не изменяется на протяжении 6 и более часов (n=10). Типичная для контрольных образцов запись представлена на рис. 10 слева от стрелки [Gudkov et al., 2011].
Рис. 10. Влияние ИКЛизлучения на интенсивность люминесценции воды.
Представлен репрезентативный опыт.
Воздействие ИКЛ (=1264 нм, мощность 5 мВт) на воду происходило в течение 5 мин, момент воздействия обозначен вертикальной стрелкой.
Слева от стрелки приведена стандартная контрольная запись люминесценции воды, не подвергавшейся воздействию лазерного облучения. Белой линией на основном графике представлена макроструктура сигнала, как интегральная интенсивность люминесценции воды. На вкладке 1 представлена микроструктура изменения люминесценция воды. На вкладке 2 представлена интегральная интенсивность люминесценции воды с врезки 1.
Полученные численные данные анализировали с помощью метода бестрендового флуктуационного анализа. Временные ряды, соответствующие участку квазипериодического режима, в каждом из 16 экспериментов с воздействием ИКЛ содержали от 8973 до 21614 значений. При этом величина Н (показатель Хёрста) составлял 0,820,06. Для контрольных результатов (n=10) Н=0,510,01; такой показатель характерен для случайного процесса. Для записей люминесценции воды после воздействия светодиодом 975 нм показатель Хёрста также был близок к значению, характерному для случайного процесса. Для проверки того факта, что высокий показатель Хёрста связан именно с последовательностью флуктуаций сигналов, а не с распределением их амплитуд, проанализирован случайно перемешанный сигнал - Н=0,500,01 - случайный процесс.
1 3 Рис. 11. Локализация гармоник в исследуемых временных рядах интенсивности люминесценции воды. Представлены карты вейвлет-коэффициентов. Оси ординат - масштабный коэффициент, характеризующий длины волн, выделяемых при анализе. Оси абсцисс - параметр сдвига, определяющий пространственную локализацию гармоники. Шкала градаций серого, расположенная справа от графиков, характеризует величину модуля комплексного вейвлет-коэффициента. 1 - карта вейвлет-коэффициентов, характерная для случайного сигнала (перемешанные данные и данные, полученные в контрольных экспериментах). 2 - карта вейвлет-коэффициентов модельного сигнала (y=sin(2x/l1)+sin(2x/l2), где l1=250; l2=1250). 3,4 - карта вейвлет-коэффициентов, характерная для временных рядов интенсивности люминесценции воды после воздействия лазера (1264 нм).
Для выявления во временных рядах выделенных частот наиболее адекватным является метод комплексного вейвлет-преобразования. При проверке адекватности применения вейвлет-анализа для выявления выделенных частот в сигнале использовали модельный сигнал, содержащий две выделенных частоты, отличных друг от друга. На рис.11(2) показана карта вейвлет-коэффициентов для модельного сигнала (две выделенные частоты отличаются в пять раз). На вейвлет-карте наблюдаются две устойчивые линии.
В результате анализа перемешанных данных (в том числе модельного сигнала) и данных, полученных в контрольных экспериментах, не удается выявить выделенные частоты (рис. 11(1)).
В 7 из 16 экспериментов с ИКЛ (44%) устойчивые колебания наблюдались на протяжении всего эксперимента (рис. 11(4)). Среди них в трех случаях наблюдались колебания с периодами около 300 и 1150 с, тогда как в остальных случаях на протяжении всего эксперимента преобладал один из них. В девяти экспериментах (56%) регистрировался нестационарный колебательный режим, причем примерно в половине случаев был выражен только один из указанных периодов. Кроме того, наблюдается тренд в изменении периода колебательного режима. Как показано на рис.
11(3), период одного колебательного режима, около 1150 с, несколько увеличивается на протяжении эксперимента, а другой период (в начале эксперимента около 500 с) заметно уменьшается вплоть до 300 с. Период 1150 с хорошо согласуется с периодом 18 мин в относительном содержании орто- и пара- спин-изомеров в парах воды, ранее определенным в работе [Morre et. al., 2008].
Для проверки предположения о том, что запуск автоколебаний связан с возбуждением растворенного кислорода, концентрация кислорода в воде была снижена до 50 мкМ по сравнению с равновесным значением 270Ц280 мкМ. После воздействия ИКЛизлучения на такую деоксигенированную воду не происходит заметного повышения интенсивности люминесценции над обычным фоновым значением при регистрации в течение шести и более часов. После насыщения дегазированной воды атмосферным воздухом воздействие ИКЛ вновь инициирует последовательное возникновение всех трех характерных фаз люминесценции, как на рис. 10. Облучение воды лазером с длиной волны 975 нм - вне полосы поглощения молекулярного кислорода не вызывает ни фазы нарастания свечения, ни автоколебаний, несмотря на десятикратное увеличение мощности данного излучения по сравнению с используемым выше излучением ИКЛ.
Рис. 12. Влияние ИКЛ излучения (5 мин) на интенсивность люминесценции воды.
Представлен репрезентативный опыт.
Белой линией на основном графике представлена макроструктура сигнала как интегральная интенсивность люминесценции воды. 1 - данные, полученные в присутствии между ФЭУ и исследуемым образцом синего фильтра.
2 - данные, полученные в присутствии между ФЭУ и исследуемым образцом красного фильтра.
Поскольку свечение димолей синглетного кислорода происходит в красной области спектра, а для радикальных процессов характерно свечение в синей области видимого спектра, использовали синий и красный светофильтры. При детектировании световых квантов через красный оптический светофильтр, фазы 2 и обычно присутствующие после воздействия ИКЛ, не наблюдаются и величина сигнала соответствует фоновому уровню. При использовании синего светофильтра картина люминесценции выглядит как в отсутствие светофильтра [Gudkov et al., 2011]. Таким образом, показано, что в основе индуцированной лазерным излучение 1264 нм люминесценции лежат радикальные процессы. Известно, что очищенная вода может люминесцировать в УФ- и сине-зеленой области спектра под непрерывным воздействием ионизирующей радиации [Quickenden et. al., 1971] или ультрафиолета [Lobyshev et. al., 1999], однако сообщенные ранее эффекты наблюдаются только в результате непрерывного воздействия излучений и исчезают при его выключении.
Явление индуцированной излучением лазеров люминесценции, принципиально отличается от ранее известных процессов [Gudkov et al., 2011].
1.6. Механизмы образования АФК при воздействии неионизурующих физических факторов. Таким образом, необходимым этапом для образования Н2О2 под действием исследуемых неионизирующих факторов является переход кислорода в синглетное состояние. В результате присоединения электрона к синглетному кислороду образуются супероксид-анион радикалы, дисмутация протонированных форм которых приводит к образованию Н2О2. При этом кинетика реакции образования Н2О2 может иметь весьма сложный характер. Кроме синглетного кислорода, другим наиболее существенным акцептором гидратированного электрона в воде и водных растворах являются протоны Н+ в реакции: 2 Н+ + 2 eaq- = 2Н = Н2. Ранее установлено, что фотовозбужденное состояние анионов может приводить к процессу диссоциации с образованием электрон-радикальной пары - гидратированного электрона и радикала [Grossweiner et al., 1963]. Показано, что целый ряд анионов, таких как Cl-, Br-, I-, OH-, PO42-, CO32-, продуцируют гидратированный электрон при флеш-фотолизе [Swenson et al., 1963]. Поскольку вещество при данной температуре обладает тепловым электромагнитным излучением, аналогичным излучению абсолютно черного тела, во всем спектре электромагнитных частот [Яворский и Детлаф, 1990; Dunbar and McMahon, 1998], можно полагать, что тепловое воздействие, подобно квантам света, также приводит к аналогичному процессу. Радикалы, в свою очередь, рекомбинируют с образованием молекулярных форм или, если присутствует ряд различных радикалов, то с дополнительным образованием их перекрестных форм. Таким образом, анионы могут выступать в роли восстановителя за счет реакции образования электронрадикальных пар и последующей рекомбинации радикалов. Причем перекрестная рекомбинация радикалов от разных анионов может быть причиной синергического сверхаддитивного эффекта.
Полученные результаты позволяют полагать, что образование радикальных продуктов под действием неионизирующих излучений носит универсальный характер и на качественном уровне сходно с действием ультрафиолетового и ионизирующего излучений. Сходство действия неионизирующих и ионизирующего излучений на воду включает наличие кислородного эффекта. Термолиз и фотолиз воды приводит к тем же радикалам и молекулярным продуктам, что и радиолиз. Поэтому гипертермия с учетом ее особенностей может в ряде случаев рассматриваться как модель окислительного стресса, аналогичного действию ионизирующей радиации [Гудков и др., 2012]. Следует отметить, что образование ионов ОН- и Н+, сопровождается разрывом ковалентной связи в воде, причем данный процесс зависит от температуры [КонстантыЕ, 1965]. Увеличение степени диссоциации воды и растворенных в ней анионов с увеличением температуры должно способствовать протеканию реакции образования радикальной пары.
Термолиз воды с физических позиций может быть объяснен следующим образом.
Тепловое электромагнитное излучение, согласно формуле Планка для испускательной способности абсолютно черного тела, наряду с усредненными энергиями порядка kТ содержит малые количества высокоэнергетических квантов, намного превышающих величины kТ. Поскольку таких квантов мало, эти высокоэнергетические процессы, способные приводить к разрыву ковалентных связей, происходят медленно. Кроме того, необходимы весьма чувствительные методы для обнаружения продуктов таких реакций. Данная концепция также позволяет объяснить переход под действием тепла кислорода из триплетного состояния в синглетное, так как кислород имеет ряд широких линий поглощения в видимой (477, 577, 630, 760 нм) и инфракрасной (1063, 1263 нм) областях спектра.
Твердо установлено существование физико-химического механизма трансформации энергий слабых воздействий в высокоэнергетические процессы с помощью газовых пузырьков (бабстонов) в воде при кавитации, обусловленной действием ультразвука [Didenko, 2000]. Природные воды содержат в своем составе значительное количество микропузырьков растворенного воздуха диаметром порядка 1Ц30 мкм [Бондаренко и Гак, 1984], что обусловлено гидрофобностью растворенных газов в такой полярной жидкости, как вода. При кавитации в газовых пузырьках растворенного в воде воздуха происходит концентрирование энергии ультразвукового поля на несколько порядков величины и преобразование ее в видимое или УФ-излучение. При этом газовые пузырьки являются сенсорами и преобразователями - усилителями и трансформаторами - энергии ультразвукового поля в энергию электромагнитного поля.
Нестабильность воздушных пузырьков проявляется путем первоначального расширения, а затем быстрого сжатия взрывного характера - коллапса, сопровождающегося резким повышением давления и температуры внутри пузырька.
При этом, помимо излучения фотонов, газовый пузырек является микрореактором, в котором происходит образование радикальных продуктов, таких как гидроксильные радикалы [Didenko and Suslick, 2002]. Можно полагать, что небольшая часть естественных газовых микропузырьков в растворах способна к аналогичному схлопыванию под действием тепла или света, причем пусковым процессом может являться вызывающий локальное электронное возмущение переход кислорода в синглетное состояние, что приводит к образованию тех же радикальных и молекулярных продуктов в растворе, которые возникают под действием ионизирующего излучения. Для кавитационных процессов характерны следующие признаки:
1. Преобразование энергии низкой плотности в энергию высокой плотности, как основной критерий кавитации.
2. Образование в воде и водных растворах АФК (перекиси водорода, гидроксильных радикалов и других радикальных продуктов).
Как показано выше, АФК образуются при действии на воду и водные растворы тепла, света, электромагнитного излучения крайне высоких частот. Кроме этого наблюдается преобразование энергии низкой плотности в энергию высокой плотности (рис. 12).
Возможные биологические последствия генерации АФК могут быть существенны и многообразны. Прежде всего, это процессы вызванные внутриклеточным окислительным стрессом - повышенной продукцией АФК, связанные со многими патофизиологическими последствиями для организма [Зенков и др., 2001], в том числе с процессом старения [Finkel and Holbrook, 2000]. Процесс тепловой генерации АФК является новым веским доводом в пользу свободно-радикальной теории старения [Finkel and Holbrook, 2000], поскольку у пойкилотермных организмов температура окружающей среды является наиболее существенным фактором, определяющим продолжительность жизни.
2. Продление окислительного стресса долгоживущими радикалами белка, индуцированными рентгеновским излучением. Значительная часть повреждений биополимеров в клетке, вызванных окислительным стрессом, образуются за счет короткоживущих радикалов. Времена их полужизни составляют доли секунд. Впервые существование радикалов белков и аминокислот показано Л.А. Блюменфельдом в 1957 году с помощью метода ЭПР [Блюменфельд, Калмансон, 1957]. Позднее показано, что при воздействии ионизирующего излучения наряду с короткоживущими АФК, возникающими при радиолизе воды, образуются и долгоживущие скрытые повреждения белков [цит. по Эйдус, 1979]. Методом ЭПР была установлена их радикальная природа [цит. по Каюшин и др., 1976]. Позднее было показано, что при воздействии на водные растворы альбумина гамма-лучами образуются радикалы белков с временами полужизни при комнатной температуре более 20 ч [Yoshimura et al, 1993]. Радикалы белков с часовыми временами полужизни стали называть долгоживущими радикалами белков (ДЖРБ). Ранее в работах, связанных с исследованием образования и количественной оценкой концентрации ДЖРБ, использовался метод ЭПР-спектроскопии. Этот метод непосредственно регистрирует радикалы, однако его низкая чувствительность позволяет обнаружить образование долгоживущих радикалов белка только при очень высоких дозах ионизирующей радиации порядка 1Ц5 кГр. Другим эффективным и чувствительным способом определения свободнорадикальных реакций является подход, основанный на регистрации энергии в виде квантов света, образующихся при взаимодействии радикалов [Кудряшов, 2004]. Для обнаружения и исследования долгоживущих радикалов белка использован метод измерения люминесценции белковых растворов, индуцированных ионизирующей радиацией. Наиболее удобным белком для исследования ДЖРБ является бычий сывороточный альбумин (БСА) [Gebicki, Gebicki, 1993; Ostdal et al., 2002]. Показано, что зависимость интенсивности люминесценции от концентрации БСА носит колоколообразный характер. Максимальная величина люминесценции при дозе облучения 10 Гр наблюдалась при концентрации 1 г/л.
Данная концентрация БСА использовалась для дальнейших исследований.
Установлено, что величина интенсивности люминесценции белковых растворов линейно зависит от поглощенной дозы рентгеновского излучения в диапазоне 0Ц50 Гр (рис. 13, вкладка).
Рис. 13. Интенсивность люминесценции 40раствора БСА (1 г/л) при различных 5030временных инкубациях после воздействия рентгеновского облучения. Фоновые 2040значения хемилюминесценции вычтены 10из полученных результатов (M m, n = 3,* 3000 - p < 0,05). Вкладка: Зависимость 0 5 10 20 интенсивности люминесценции белкового Доза, Гр раствора от дозы рентгеновского 20излучения. (M m, n = 3).
10 Гр 20 Гр 10На рис. 13 представлено изменение интенсивности люминесценции раствора облученного БСА при 30 60 120 180 240 3различных временах Время, мин пострадиационных инкубаций.
Кривые, отражающие изменение интенсивности люминесценции во времени, имеют два различных участка. Первый участок быстрого снижения интенсивности продолжается до 1 ч после облучения. На втором участке (после 1 ч) изменения менее выражены, интенсивность люминесценции практически линейно зависит от времени.
Такой вид кривой, по-видимому, объясняется тем, что в растворе параллельно присутствуют два типа радикальных форм белка: с временем полужизни в диапазоне нескольких десятков минут и, соответственно, нескольких часов. Вероятно, большее количество радикалов белка с минутным полупериодом жизни элиминируется в течение 1 ч после облучения. По истечении этого времени остаются долгоживущие радикалы с временем полужизни около 3Ц4 ч.
Проведенные выше эксперименты не позволяют выяснить роль структуры белка в образовании ДЖРБ. Для исследования этой роли проведено сравнение долгоживущих радикалов, индуцированных рентгеновским облучением, для раствора казеина и его гидролизата с эквимолярной смесью аминокислот. Рентгеновское облучение этих Люминесценция, cpm Люминесценция, cpm растворов в дозе 50 Гр приводило к уменьшению поглощения растворов при 280 нм на 20Ц40% для казеина и для его гидролизата через трое суток, свидетельствуя о частичном разрушении триптофана. При исследовании кинетики уменьшения люминесценции гидролизата казеина при облучении в дозе 50 Гр было обнаружено существование долгоживущих радикалов с временем полужизни около 3,5 ч. При этом интенсивность люминесценции в облученном гидролизате казеина была приблизительно в 5 раз выше, чем в казеине. Полученные для гидролизата казеина данные свидетельствовали об образовании долгоживущих радикалов в растворе, состоящем из смеси аминокислот. Поэтому была исследована возможность образования долгоживущих радикалов в растворе отдельных облученных аминокислот.
Исследованы следующие аминокислоты: Gly, Cys, Arg, Met, Pro, Ser, Thr, Phe, Leu, Ile, Val. По величине индуцированной рентгеновским излучением люминесценции эти аминокислоты можно разделить на три группы. Группа 1 - Cys, крайне слабо люминесцирующая аминокислота. Группа 2 - умеренно люминесцирующие аминокислоты (Arg, Met, Pro, Gly, Phe). Группа 3 - обладающие наиболее интенсивной люминесценцией (гидроксил-содержащие аминокислоты (Ser, Thr) и аминокислоты с наиболее массивными алифатическими группами (Leu, Ile, Val)). Для всех исследованных аминокислот наблюдалась линейная зависимость люминесценции от поглощенной дозы ионизирующего излучения. При этом величина индуцированной люминесценции аминокислот уменьшалась с течением времени. Времена полужизни ДЖР аминокислот при концентрациях 1Ц30 мМ были следующими: Phe около 2Цч; Pro около 4Ц5 ч; Arg, Thr, Val около 5Ц6 ч; Met, Ser, Ile, Leu около 6 ч.
0 10 20 30 Доза, Гр Рис. 14. Зависимость образования Н2О10 Гр 20 Гр молекулами БСА (1 г/л) от дозы 30 Гр рентгеновского излучения. Фоновые 50 Гр значения перекиси водорода вычтены из полученных результатов. Вкладка:
Зависимость образования перекиси 0 1 2 водорода от дозы рентгеновского Время, ч излучения поглощенной белком (M m, n = 3).
Приведенные выше результаты, полученные при исследовании казеина, его гидролизата и свободных аминокислот, свидетельствуют о том, что способностью образовывать долгоживущие радикалы обладают сами аминокислоты, входящие в состав белка. Поскольку интенсивность люминесценции гидролизата казеина в несколько раз превышает интенсивность люминесценции этого белка, можно полагать, что пространственная структура белка защищает значительную часть аминокислот, вероятно, входящих в интерьер белковой макромолекулы, от воздействия рентгеновского излучения, окисляются преимущественно аминокислоты, находящиеся на поверхности белка. Об этом могут свидетельствовать и данные, полученные методом ЭПР, о значительном увеличении количества свободных радикалов при облучении денатурированного белка [Блюменфельд и Калмансон, 1958].
Ранее высказывалось предположение о том, что долгоживущие радикалы белка могут быть посредниками в развитии окислительного стресса на уровнях клеток и организма [H O ], нM [H O ], нM [Ostdal et al., 2002], однако механизм данного процесса оставался не ясным. В качестве рабочей гипотезы было предположено, что продление окислительного стресса под действием долгоживущих радикалов белка может быть связано со способностью ДЖРБ к генерации АФК. Для проверки этой гипотезы исследована способность облученного БСА к генерации перекиси водорода в течение пострадиационного периода (рис.14).
При экстраполяции полученной экспоненциальной зависимости в нулевую точку видно, что 1 г БСА, облученный в дозе 10 Гр, генерирует 9 нМ. Таким образом, 1 г белка, растворенный в 1 литре и облученный в дозе 1 Гр, способен образовать около 1 нм перекиси водорода. Учитывая, что концентрация белка в клетке в 150 раз, а в плазме крови в среднем 50Ц80 раз больше, чем используемая нами, можно предположить, что генерация Н2О2 за счет долгоживущих радикалов белка in vivo будет происходить длительное время с большей эффективностью.
Таблица 7. Влияние Воздействие [O2], мкМ К** [Н2О2], нМ различных условий на Контроль 270 5,1 0, образование Н2О2 в СОД (10Ц3 ед./мл) 270 6,8 0,4* 1,водных растворах под воздействием БСА, Тирон (100 нМ) 270 0,7 0,4* 0,предварительно Барботирование Ar (15 мин) 130 2,4 0,1* 0,облученного в дозе Барботирование О2 (15 мин) 475 6,6 0,2* 1,Гр (M m, n = 3,* - p < Азид натрия (100 мкМ) 270 3,6 0,3* 0,0,05).
Гуанозин (1 мМ) 270 1,4 0,2 0, ** - К - относительное изменения концентрации Н2О2 под влиянием изучаемого агента.
Для выяснения механизма образования Н2О2 в растворе под воздействием ДЖРБ было исследовано влияние различных факторов на этот процесс (табл. 7). Установлено, что генерация Н2О2 под воздействием ДЖРБ зависит от концентрации растворенного кислорода. В дополнительно насыщенной кислородом воде генерация Н2О2 на 30% выше, чем в контроле, а при насыщении аргоном - на 50% ниже. С помощью СОД показано участие супероксид-анион радикалов в образовании Н2О2 в воде при воздействии ДЖРБ. СОД увеличивает концентрацию Н2О2 на 30%. Добавление тирона уменьшает концентрацию Н2О2 на 90%. Эти результат показывают, что образование Н2О2 в воде под влиянием ДЖРБ происходит с участием кислород-зависимых радикальных реакций. Добавление азида натрия, специфичной для синглетного кислорода ловушки, на 30% уменьшает генерацию Н2О2 под действием ДЖРБ.
Добавление гуанозина, также уменьшает генерацию Н2О2 под воздействием ДЖРБ на 70%. Полученные результаты можно обобщить с помощью следующей схемы последовательных реакций образования Н2О2 под действием ДЖРБ.
ЦNHЦRСHЦCOЦ ЦNHЦRСЦCOЦ + Н Н + 1О2 НО2; НО2 + НО2 Н2О2 + 1ОВ результате воздействия рентгеновского излучения на белковую молекулу происходит отщепление радикала водорода от -углеродных атомов полипептидной цепи. Образование -углеродного радикала в БСА показано методом ЭПР [Davies et al., 1995]. Радикал водорода, реагируя с растворенным в воде кислородом в синглетном состоянии, продуцирует гидроперекисный радикал. Дальнейшая дисмутация этих радикалов приводит к образованию Н2О2. Наряду с этим, существует еще один возможный путь образования Н2О2 [Stadtman, 1993]:
ЦNHЦRСЦCOЦ + О2 ЦNHЦRСOOЦCOЦ;
ЦNHЦRСOOЦCOЦ ЦN=RСЦCOЦ + НО2;
НО2 + НО2 Н2О2 + 1ОРеакция -углеродного радикала с кислородом приведет к формированию алкилпероксильного радикала. Быстрая внутримолекулярная элиминация пероксильных радикалов при -углеродном атоме приводит к генерации гидроперекисного радикала в растворе [Stadtman, 1993]. Образование Н2О2 в этом случае также будет продуктом дисмутации этих радикалов.
Чтобы выяснить возможную роль отдельных аминокислот в составе облученного белка в генерации Н2О2, была исследована способность различных облученных рентгеновскими лучами аминокислот к генерации перекиси водорода. Аминокислоты по способности к генерации Н2О2 можно разделить на три группы: 1) не способные к ее генерации (Cys); 2) аминокислоты, вызывающие генерацию умеренных количеств перекиси водорода (Gly, Phe, Arg, Met, Pro, Thr); 3) аминокислоты, приводящие к наибольшей продукции перекиси водорода (Ile, His, Val, Leu, Ser). Величина генерации Н2О2 была наибольшей для Leu, Ile и Val.
Методом иммуноферментного анализа исследовано влияние облученного рентгеновскими лучами овальбумина на образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro.
Инкубация ДНК с облученным в дозе 7 Гр раствором овальбумина (1%) приводит к образованию в ДНК 2,7 молекул 8-оксогуанина на каждые 105 гуанинов ДНК [Гудков и др., 2007].
Ранее, в экспериментах с клеточными культурами, установлено, что долгоживущие радикалы белков вызывают мутации и приводят к трансформации клеток [Koyama et al., 1998; Kumagai et al., 2002]. Однако влияние долгоживущих радикалов белка in vivo на организменном уровне ранее не исследовалось. Было изучено влияние облученного крысиного сывороточного альбумина при внутривенном введении его самцам крыс на образование микроядер (МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) их костного мозга. С помощью микроядерного теста показано, что введение облученного крысиного сывороточного альбумина приводит к образованию микроядер в этих клетках. Таким образом, впервые получено подтверждение наличия генотоксического действия ДЖРБ in vivo [Карп и др., 2010]. Также оценено изменение содержания ПХЭ с МЯ в красном костном мозге мышей при скармливании им облученного в дозе 100Гр обезжиренного и обезвоженного творога. При экстраполяции данных получается, что пероральное потребление облученного в дозе 100 Гр творога в течение суток сопоставимо с тотальным облучением в дозе около 0,1 Гр. Полученные данные позволяют предполагать, что ДЖРА, наряду с ДЖРБ, могут способствовать длительному протеканию окислительного стресса и оказывать влияние на процесс развития радиационного поражения в организме млекопитающих. При введении в организм животных ряда природных антиоксидантов вскоре после введения ДЖРБ наблюдается существенно меньшее повреждение ДНК, вызванное этими радикалами.
3. Антирадикальные и радиопротекторные свойства гидратированного фуллерена С60. В работе изучали эффекты химически немодифицированного гидратированного фуллерена С60, водные растворы которого содержат как единичные молекулы С60, так и их лабильные наноразмерные кластеры (3Ц36 нм). В химическом отношении данный препарат фуллерена представляет собой высокогидрофильный и устойчивый донорноакцепторный комплекс С60 с молекулами воды - C60 (H2O)n, где n = 22Ц24 [Andrievsky et al., 2002]. Влияние фуллеренов на генерацию ОН-радикалов, индуцированных рентгеновским излучением, исследовали с помощью специфической ловушки ОНрадикалов кумарин-3-карбоновой кислоты. Как показано на рис. 15, фуллерены существенно снижают генерацию ОН-радикалов под действием рентгеновского излучения в концентрационно-зависимой форме. Антирадикальный эффект наблюдается при концентрациях фуллеренов 10-11Ц10-6 моль/л. Наблюдается линейная зависимость генерации ОН-радикалов от поглощенной дозы. Радиационно-химический выход (G) образования ОН-радикалов в воде равен 2,4 молекулы на 100 эВ поглощенной энергии, что соответствует полученным ранее данным [Ward, 1984].
Фуллерены во всех концентрациях уменьшали радиационно-химический выход ОНрадикалов. Наиболее существенный антирадикальный эффект фуллерены проявляют при концентрациях не менее 10-8 моль/л. Установлено, что количество образующейся Н2О2, как в присутствии, так и в отсутствие фуллерена, линейно зависит от поглощенной дозы рентгеновского излучения. Наблюдается статистически достоверное уменьшение индуцированного излучением образования Н2О2 на 20Ц35% в диапазоне концентраций фуллерена 0,1Ц1,0 мкмоль/л.
контроль 80 Рис. 15. Влияние фуллеренов 10-6 моль/л * 10-7 моль/л в концентрациях 10-13Ц10-6 моль/л на ** 60 10-8 моль/л ** 10-9 моль/л образование в воде гидроксильных 10-10 моль/л 40 *** 10-11 моль/л *** радикалов под действием 10-12 моль/л 10-13 моль/л рентгеновского излучения в дозах 1, 3, *** 10-1310-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 5, 7 Гр. Вкладка: Влияние фуллеренов Концентрация фуллерена, моль/л в концентрациях 10-13Ц10-6 моль/л на образование в воде гидроксильных радикалов под действием рентгеновского излучения в дозе 7 Гр.
(M m, n = 3,* - p < 0.05, ** - p < 0.01, 0 1 3 5 *** - p < 0.001).
Доза, Гр На рис. 16 показано влияние фуллеренов на образование 8-оксогуанина в водном растворе ДНК под действием различных доз рентгеновского излучения. Показано, что количество образующегося в ДНК 8-оксогуанина как в присутствии, так и в отсутствие фуллерена линейно зависит от поглощенной дозы рентгеновского излучения.
Наблюдается статистически достоверное (p<0,05) уменьшение образования в ДНК 8оксогуанина на 35Ц50% в диапазоне концентраций фуллерена 0,1Ц1,0 мкмоль/л.
Показано, что фуллерены способны к элиминации радикалов БСА, образовавшихся при воздействии рентгеновского излучения в дозе 10 Гр. В присутствии фуллеренов скорость нейтрализации ДЖРБ в 1,4 и 2,2 раза выше при концентрациях 0,1 и 1,0 мкмоль/л соответственно. Таким образом, в экспериментах in vitro фуллерены проявляли существенные антиоксидантные/антирадикальные свойства при концентрациях 0,1 и 1,0 мкмоль/л. В исследованиях in vivo использовались близкие концентрации фуллеренов соответствующие 0,1 и 1,0 мг/кг массы тела [Гудков и др., 2009].
Рис. 16. Влияние фуллерена * 4 в концентрации 10-9Ц10-6 моль/л на * образование 8-оксогуанина в ДНК in 10-9 10-8 10-7 10-Концентрация фуллеренов, моль/л vitro под воздействием рентгеновского излучения. Вкладка: Влияние фуллеренов в концентрациях 10-9Ц10-Контроль моль/л на образование 8-оксогуанина в С60 1 мкмоль/л С60 0,1 мкмоль/л ДНК под действием рентгеновского С60 10 нмоль/л С60 1 нмоль/л 0 1 3 5 Доза, Гр 7-OH-ККК, нM 7-OH-ККК, нM 8-оксогуанин на 10 dGuo в ДНК 8-оксогуанин на 10 dGuo в ДНК излучения в дозе 7 Гр (M m, n = 3,* - p < 0,05).
Влияние фуллерена, введенного интраперитонеально мышам в дозах 0,1 и 1,0 мкг/кг, на выживаемость животных, облученных рентгеновским излучением в летальной дозе 7 Гр представлено на рис. 17. Среднее время жизни облученных контрольных мышей составляло 5 дней, максимальное достигало 12 дней. При введении фуллерена в дозе 0,1 мкг/г до облучения средняя продолжительность жизни животных возрастала до дней, максимальная - до 23 дней. Наиболее выраженный радиопротекторный эффект фуллерена наблюдается при введении в дозе 1 мкг/г. В этом случае 15% животных доживали до 30 суток после облучения. В группах облученных животных, получивших фуллерены, наблюдалась меньшая потеря веса, чем у контрольных облученных мышей.
Рис. 17. Выживаемость мышей при 1,Воздействие Время после облучения, сут (мг/кг) 0 5 10 20 30 внутрибрюшинном введении Контроль 0 Гр 0 +5.2 +9.1 +16.2 +24.фуллерена (0,1 или 1,0 мкг/г) за 1 час Контроль 7 Гр 0 -12.9 -32.0 0,С60 (0.1) 7 Гр 0 -11.1 -28.2 -28.1 до тотального облучения С60 (1) 7 Гр 0 -11.3 -21.4 -16.5 -2.рентгеновскими лучами животных в дозе 7 Гр (мощность дозы 1 Гр/мин).
0,Достоверность отличий кривых Контроль (n=40) C60 0.1 мг/кг (n=30) выживания сравнивали с помощью 0,4 C60 1 мг/кг (n=30) критерия Фишера. Вкладка:
Изменения массы тела животных Критерий Фишера 0, p=0.после воздействия рентгеновского излучения в дозе 7 Гр.
0,Известно, что система 0 5 10 15 20 25 Время, сут кроветворения является одной из наиболее чувствительных к радиации. Метод микроядерного теста является удобным средством для оценки эффективности защиты от цитогенетических повреждений, таких как ПХЭ-содержащие МЯ в костном мозге. Установлено, что после тотального облучения животных процент ПХЭ с МЯ увеличился в 9 раз от 0,47% при отсутствии воздействия до 4,81 % при 1,5 Гр. При введении фуллеренов животным в концентрации 0,1 и 1,0 мг/кг количество ПХЭ с МЯ после облучения уменьшается в среднем на 30 % и 50 % соответственно. Таким образом, установлено, что фуллерены защищают клетки костного мозга от цитогенетических повреждений, вызванных ионизирующим излучением.
Показано, что гидратированная форма химически не модифицированного фуллерена С60 проявляет существенные антиоксидантные и антирадикальные свойства.
Безусловно, самым интересным является способность фуллерена нейтрализовывать ОН-радикалы. Очевидное классическое предположение состоит в том, что фуллерен может реагировать с ОН-радикалами за счет наличия двойных связей в структуре.
В молекуле фуллерена С60 содержится 30 двойных связей, то есть одна молекула фуллерена может теоретически нейтрализовать 60 ОН-радикалов. Полученные результаты позволяют предполагать проявление фуллереном каталитических свойств [Batinic-Haberle et al., 2010], так как в сильно разведенных растворах (10-11Ц10-9 моль/л) каждая молекула фуллерена, согласно расчетам, нейтрализует по несколько тысяч ОНрадикалов [Andrievsky et al., 2009].
4. Влияние пуриновых соединений на образование АФК в водных растворах, их радиозащитные и модифицирующие свойства 4.1. Влияние пуриновых соединений на образование АФК в водных растворах in vitro при воздействии ионизирующего излучения и тепла. Исследовано влияние Вероятность выживаемости пуриновых соединений на генерацию Н2О2 в фосфатном буфере при воздействии рентгеновского излучения. Зависимость образовавшейся Н2О2 от дозы рентгеновского излучения близка к линейной, как в присутствии, так и в отсутствие соединений. Guo и Ino при концентрациях (0,02Ц1,0 мМ) проявляют существенный защитный эффект (рис.
18). В целом наблюдается зависимость выраженности антиоксидантного эффекта от концентрации. При концентрации 0,02 мМ наблюдается уменьшение образовавшегося количества перекиси водорода более чем на 33%.
Рис. 18. Концентрационная зависимость влияния гуанозина и инозина на генерацию перекиси водорода в фосфатном буфере (1 мМ, рН 7,4) при воздействии рентгеновского излучения в дозе 1 Гр. Вкладка: Влияние гуанозина и инозина (1 мМ) на генерацию Н2О2 в фосфатном буфере (1 мМ, рН 7,4) при воздействии рентгеновского излучения.
(M m, n = 4,* - p < 0.05) Guo и Ino существенно уменьшают радиационно-индуцированную генерацию ОН-радикалов. Количество ОН-радикалов, образовавшихся в фосфатном буфере под воздействием рентгеновского излучения в присутствии и в отсутствие нуклеозидов, линейно зависит от дозы. Ранее было показано, что при воздействии на воду и водные растворы тепла образуется перекись водорода [Брусков и др., 2003]. Исследовано влияние нуклеозидов на генерацию АФК в фосфатном буфере под действием тепла. Guo и Ino эффективно уменьшают концентрацию АФК в образцах (примерно на 70 % по отношению к контролю) и уровень восстановления ДТНБ (табл. 8) [Gudkov et al., 2006].
Таблица 8. Влияние пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов (1 мМ) на генерацию перекиси водорода, гидроксильных радикалов и восстановительных эквивалентов в фосфатном буфере (1 мМ, рН 6,8) под действием тепла (M m, n = 3Ц6,* - p < 0.05).
- 40C, 200 мин, Вещество [Н2О2], нМ1 К4 К4 [ТНБ], мкМ3 К4 [ОН], нМ - 80C, 120 мин, Контроль 1,0 25,6 1,6 1,0 0,88 0,07 1,3,2 0, - 60C, 30 мин.
Guo 0,3 7,0 0,9* 0,3 0,64 0,03* 0,1,1 0,2* - К - отношение Ino 0,3 9,6 1,0* 0,4 0,60 0,04* 0,0,9 0,2* изменений регистрируемых величин в присутствии и в отсутствие изучаемых агентов.
Кроме Guo и Ino исследовались антиоксидантные свойства Ado, Thd, Cyd, Urd, Xao, ГМФ, ИМФ и кофеина [Gudkov et al., 2006; Asadullina et al., 2010; Асадуллина и др., 2011; Asadullina et al., 2012]. Показано, что из всех исследуемых соединений наиболее эффективными являются Guo и Ino. Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что Guo и Ino, проявляют существенные антиоксидантные свойства, уменьшая количество Н2О2 и ОН-радикалов, образующихся при воздействии ионизирующей радиации и тепла.
4.2. Влияние пуриновых соединений на образование повреждений ДНК и белков под действием ионизирующего излучения и тепла. Количество 8-оксогуанина, образовавшегося в ДНК под воздействием ионизирующей радиации в присутствии и в отсутствие нуклеозидов, линейно зависит от дозы (рис. 19). Исследовано влияние различных концентраций (0,02Ц1,0мМ) Guo и Ino на образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro при воздействии ионизирующего излучения. Guo и Ino уменьшали количество образовавшегося при воздействии рентгеновского облучения 8-оксогуанина в интервале концентраций 0,02Ц1,0 мМ. При концентрации 0,02 мМ наблюдается уменьшение образовавшегося количества 8-оксогуанина более чем на 20%.
Исследовано влияние нуклеозидов на дезаминирование цитозина в ДНК под действием тепла (80С, 24 ч). Guo и Ino в концентрации 1 мМ оказывали существенный защитный эффект, снижая количество образовавшегося урацила относительно контроля примерно на 70%. Исследовано влияние различных концентраций Guo, Ino и витамина С на элиминацию долгоживущих радикалов в растворе овальбумина образовавшихся под действием рентгеновского излучения в дозе 7 Гр. Guo, Ino (0,01Ц1,0 мМ) и витамин С (0,1Ц1,0 мМ) приводят к элиминации долгоживущих радикалов, эффективность уменьшается в ряду Guo > Ino > витамин C [Гудков и др., 2006; Гудков и др., 2007].
Рис. 19. Влияние Guo и Ino на образование 8-оксогуанина в ДНК спермы лосося in vitro под воздействием рентгеновской радиации.
Вкладка: Влияние Guo и Ino нуклеозидов (мМ) на образование 8-оксогуанина в ДНК спермы лосося in vitro под воздействием ионизирующей радиации. Фоновые значения 8-оксогуанина вычтены из полученных результатов (M m, n = 3,* - p < 0,05).
Кроме Guo и Ino исследовались Ado, Thd, Cyd, Urd, Xao, ГМФ, ИМФ и кофеин.
Показано, что из всех исследуемых соединений наиболее эффективными являются Guo и Ino [Gudkov et al., 2006; Asadullina et al., 2010; Asadullina et al., 2012].
4.3. Радиозащитные и радиационно-модифицирующие свойства пуриновых соединений. Поскольку гуанозин и инозин проявили существенные антиоксидантные, ДНК-протекторные свойства и эффективно нейтрализовывали ДЖРБ, исследовались их радиозащитные и модифицирующие свойства. Исследовано, влияние Guo и Ino на выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении этих нуклеозидов до или после воздействия рентгеновского излучения в 1Контроль дозе 7 Гр (рис. 20).
Ino за 15 мин до Ino через 15 мин после Рис. 20. Влияние Guo и Ino на 80 Guo за 15 мин до Guo через 15 мин после выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении этих нуклеозидов до или после воздействия P<0,рентгеновского излучения в дозе 7 Гр.
P<0,Данные представлены, как среднее значение 7 независимых экспериментов, которых каждая группа состояла из 10 животных.
Контрольные мыши (7 Гр) имели 0 5 10 15 20 25 среднюю продолжительность жизни Время после воздействия радиации, сут около 5 сут после облучения и максимальную 12 сут. При введении Guo и Ino мышам до облучения средняя продолжительность выживания после облучения увеличивалась до 9 и 11 сут, Выживаемость, % а максимальная увеличивалась до 16 и 20 сут соответственно. Однако наиболее значительный радиопротекторный эффект наблюдался, когда Ino и Guo вводили после облучения. В этом случае приблизительно 50 и 40% животных оставались живыми в течение 30 сут после облучения при введении Guo и Ino соответственно. При введении Xao, Caf, ИМФ и ГМФ через 15 мин после облучения приблизительно 30%, 45%, 50% и 35% животных оставались живыми в течение 30 сут, при 100 % гибели в контрольной группе облученных животных. Эффективность радиационномодифицирующего влияния нуклеозидов при введении их через 3, 5 и 8 ч после воздействия ионизирующей радиации последовательно уменьшается [Gudkov et al., 2006; Gudkov et al., 2009; Asadullina et al., 2010; Asadullina et al., 2012].
4.4. Возможные механизмы защитного действия гуанозина и инозина при введении их после воздействия ионизирующего излучения. Для объяснения защитного действия этих пуриновых соединений при введении их после воздействия ионизирующего излучения было предложено несколько гипотез в основе которых лежали предположения о комплексном характере их действия, а именно активации процессов репарации, пострадиационного восстановления и элиминации агентов, вызывающих дополнительные повреждения. Вероятно, активация процессов репарации может быть связана с воздействием этих соединений на некоторые пуриновые рецепторы (аденозиновые рецепторы А2а и А3) [Gomez et al., 2003; Ohta, Sitkovsky, 2011], на процессы, связанные с сигнально-регуляторной ролью АФК в клетках [Мазурик 2005; Hernandez-Garcia et al., 2010], путем ингибирования PARP [Burkle, 2001], непосредственного влияния на нуклеотидный клеточный пул, рибонуклеотидредуктазу [Pulatova et al., 1999] и т.п.
Основной причиной летального исхода при тотальном облучении мышей Kv:SHK в дозах 0Ц10 Гр является костномозговой синдром. Исследовано влияние Guo и Ino на количество лейкоцитов в периферической крови мышей при внутрибрюшинном введении им нуклеозидов через 15 мин после воздействия тотального рентгеновского облучения в дозе 7 Гр. Вплоть до шестых суток после воздействия ионизирующего излучения во всех группах мышей регистрировалось уменьшение количества лейкоцитов. К шестому дню в контрольной группе животных количество лейкоцитов уменьшалось более чем на 98%, в группах подвергшихся воздействию Guo и Ino - примерно на 96% по отношению к не облученному контролю. В дальнейшем, количество лейкоцитов у облученных в дозе 7 Гр контрольных мышей существенно не изменялось до момента наступления смерти. У животных, получавших нуклеозиды после воздействия радиации, лейкопения менее выражена по сравнению с контролем.
С 10-го дня количество лейкоцитов в периферической крови животных, получивших нуклеозиды после воздействия радиации, начинает увеличиваться и достигает к 15-му дню порядка 10% от нормы.
Изменение содержания гранулоцитов в периферической крови мышей в значительной степени сходно с изменением количества лейкоцитов, хотя количество гранулоцитов в периферической крови облученных мышей получавших нуклеозиды к 15 суткам составляло около 20Ц30% от их изначального количества.
У облученных мышей, не получавших и получавших Ino и Guo, наблюдается резкое уменьшение количества тромбоцитов в периферической крови к 8 сут, уменьшение составляет относительно начального уровня около 11, 21 и 35% соответственно (Рис.
21). К 15 суткам количество тромбоцитов в периферической крови облученных мышей, получавших Guo и Ino, составляло по сравнению с интактными животными до 19 и 15% соответственно. Количество эритроцитов в периферической крови облученных мышей, не получивших нуклеозиды к 6 сут, было около 71012 л-1, что примерно на 20% меньше чем в норме. У облученных мышей, получивших нуклеозиды, регистрировались менее значительные изменения. Таким образом, в крови животных, получивших Guo и Ino, через 15 мин после воздействия рентгеновского облучения обнаруживается большее количество лейкоцитов, гранулоцитов, тробоцитов и эритроцитов. Это обусловлено, вероятно, способностью данных нуклеозидов стимулировать репарационные процессы в гемопоэтических тканях и вызывать в них усиление пролиферации.
2* * * Рис. 21. Влияние Guo и Ino на количество 2тромбоцитов в периферической крови 7 Гр 7 Гр + Guo мышей при внутрибрюшинном введении им 7 Гр + Ino 1нуклеозидов через 15 мин после 0 Гр воздействия тотального рентгеновского 1облучения в дозе 7 Гр (M m, n = 2Ц5,* - p * * < 0,05) * * С помощью микроядерного теста показано, что после облучения 0 5 10 животных в дозе 1,5 Гр процент ПХЭ с Время, сут МЯ увеличивается в 9 раз. При введении Guo и Ino через 15 мин после этого воздействия, количество ПХЭ содержащих МЯ уменьшается в среднем на 50% и 40% соответственно. Установлено, что отношение числа ПХЭ к числу нормохроматофильных эритроцитов (НХЭ) в контроле близко к единице. При воздействии рентгеновского излучения в дозе 1,5 Гр количество ПХЭ относительно НХЭ уменьшается на 40 %. При введении нуклеозидов через 15 мин после воздействия ионизирующего излучения установлено, что Ino уменьшает соотношение ПХЭ/НХЭ лишь на 10%, а Guo полностью нормализует эритропоэз. МЯ в основном образуются из хромосомных фрагментов, не вошедших в дочерние ядра во время клеточного деления [Schmid, 1975]. Поскольку причиной хромосомной фрагментации являются разрывы сахаро-фосфатных цепей, предпринята попытка определить степень влияния Guo и Ino на формирование разрывов ДНК и образование щелочелабильных сайтов при введении нуклеозидов после воздействия ионизирующей радиации. Методом комета-тест установлено, что введение Guo и Ino облученным животным или при добавлении их к клеточной суспензии после воздействия рентгеновского излучения уменьшает количество повреждений ДНК лейкоцитов мышей и приводит к более быстрому восстановлению структуры ДНК.
Результаты облучения суспензии клеток крови и тотального облучения животных существенно не отличаются. Это свидетельствует о том, что механизмы защитного действия Guo и Ino в лейкоцитах мыши, по-видимому, реализуются на клеточном уровне и не связаны активацией восстановительных процессов в других системах на организменном уровне.
Возможно, что нуклеозиды могут влиять на сигнальные пути клеток через изменение концентрации некоторых активных форм кислорода (АФК). Установлено, что добавление Guo и Ino к водным растворам через 15 мин после облучения достоверно уменьшает концентрацию Н2О2. Кроме сигнальной функции, Н2О2 может оказывать повреждающее действие на биомолекулы, в том числе на ДНК. Поэтому исследовано влияние Guo и Ino на образование повреждений в ДНК лейкоцитов мышей при добавлении после воздействия перекиси водорода на суспензию клеток крови методом комета-тест. Добавление перекиси водорода (0,6 мкМ) действительно вызывает некоторые повреждение ДНК. При этом нуклеозиды уменьшают уровень поврежденности ДНК. Таким образом, молекулярные -тромбоциты (x 10 л ) механизмы ответственные за модифицирующее действие Guo и Ino комплексные: 1) влияют на скорость репарации ДНК, 2) участвуют в элиминации ДЖРБ и Н2О2.
Хотя в терапии гемоэтического синдрома в последние годы были достигнуты определенные успехи, количество методов лечения до сих пор остается ограниченным.
Показано, что некоторые гемопоэтические факторы, такие как цитокины, являются эффективными радиозащитными и модифицирующими препаратами при введении в организм как до, так и после воздействия ионизирующей радиации [Neta, 1988].
Колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF) защищал различных животных от радиационных повреждений при ведении через 24 ч после воздействия ионизирующей радиации [Maisin, 1998]. В медицинской практике G-CSF используют для ускоренного восстановления количества нейтрофилов до нормального при радиационном миелотоксикозе [Waselenko et. al., 2004]. Для спасения/лечения жертв радиационной катастрофы рекомендуется введение G-CSF в дозе 5 мкг/кг при первой возможности и каждый следующий день до полной нормализации количества нейтрофилов в периферической крови [Waselenko et. al., 2004]. Однако цитокиновая терапия имеет ряд недостатков. G-CSF, крайне дорогостоящий препарат с умеренным фактором уменьшения дозы (около 1,3), может быть токсичен при систематическом приеме, кроме того вызывает ряд побочных и непредвиденных эффектов [Metcalf, 2008]. Также пока неизвестно об отдаленных эффектах приема G-CSF, учитывая, что G-CSF может стимулировать рост ряда опухолей [Metcalf 2008]. Инозин и гуанозин имеют сопоставимый с G-CSF фактор уменьшения дозы, однако гораздо более дешевые, химически стабильные и лучше переносимые. Для человека инозин считается нетоксичным в дозе более 10 г на кг живого веса [Hasko et al. 2004]. Кроме того, инозин под коммерческим названием Рибоксин допущен и широко используется в медицинской практике как кардио- и гепатопротектор, а с недавнего времени еще и как радиопротектор. Отмеченные качества делают Guo и Ino хорошими защитными и митигаторными агентами для клинического использования, однако, необходимость введения их вскоре после воздействия радиации ограничивает возможность их применения при радиационных авариях.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты, изложенные в диссертационной работе, можно разделить на две части.
В первой части представлены результаты экспериментальных исследований процессов генерации активных форм кислорода под действием физических факторов. Данные получены, в основном, с применением оригинальных высокочувствительных методов.
Установлена принципиальная возможность образования активных форм кислорода в воде, насыщенной атмосферными газами под действием неионизирующих физических факторов. Исследован физико-химический механизм этого процесса. Показана общность процессов, происходящих в простых системах при воздействии неионизирующих физических факторов различной природы, таких как видимый свет, тепло, видимое и инфракрасное лазерные излучения, а также импульсное электромагнитное излучение крайне высоких частот с большой пиковой мощностью.
Кроме того, в работе установлено, что различные неионизирующие физические факторы могут приводить к тем же последствиям для биомакромолекул, что и ионизирующие излучения. При исследовании долгоживущих радикалов белка выявлен новый механизм аккумуляции энергии ионизирующего излучения. Во второй части диссертационной работы изложены результаты, касающиеся нейтрализации активных форм кислорода с помощью природных соединений, а также возможности применения данных соединений для коррекции окислительного стресса и элиминации его пагубных последствий. Следует отметить, что установленные в диссертационной работе закономерности и физико-химические механизмы являются основой нового направления в радиационной биофизике.
ВЫВОДЫ 1. При воздействии тепла, видимого света, излучений ГНЛ, ИКЛ и электромагнитного излучения крайне высоких частот с большой пиковой мощностью в воде насыщенной атмосферным воздухом происходит образование активных форм кислорода. Пусковым этапом этого процесса является переход кислорода из триплетного в синглетное состояние.
Синглетный кислород восстанавливается до супероксид-анион радикала, протонированная форма которого дисмутирует с образованим перекиси водорода. Показано, что образование Н2О2 в воде под действием видимого и инфракрасного излучений происходит только пpи облучении длинами волн, cоответcтвующих полосам поглощения молекуляpного киcлоpода. Ряд биологически значимых анионов в воде, насыщенной атмосферными газами, могут выступать в качестве доноров электронов.
2. При воздействии тепла, видимого света, лазерных излучений (632,8; 1264 нм) на растворы ДНК in vitro происходит образование окислительных повреждений ДНК, причем образование этих повреждений ДНК опосредовано генерацией АФК.
3. Тепло, видимый свет, лазерные излучения c длинами волн, cоответcтвующими полосам поглощения молекуляpного киcлоpода, индуцируют в воде возникновение люминесценции в сине-зеленой области спектра, интенсивность которой периодично изменяется во времени. Запуск автоколебаний люминесценции водных растворов обусловлен возбуждением растворенного молекулярного кислорода и процессами радикальной природы.
4. При воздействии на водные растворы белков ионизирующего излучения наблюдается образование долгоживущих радикалов белков с временами полужизни несколько часов.
Установлено, что долгоживущие радикалы белков могут длительное время осуществлять генерацию активных форм кислорода. Для протекания данного процесса в водных растворах необходимо наличие молекулярного кислорода.
5. Показано, что долгоживущие радикалы белков, индуцированные рентгеновским излучением, приводят к образованию окислительных повреждений ДНК in vitro. При введении долгоживущих радикалов белков в организм животного наблюдается образование микроядер в клетках костного мозга.
6. Установлено, что гидратированный фуллерен С60, ряд природных пуриновых нуклеозидов и их производных проявляют существенные антирадикальные свойства.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Монографии 1 Гудков С.В., Брусков В.И. Гуанозин и инозин (рибоксин). Антиоксидантные и радиозащитные свойства. Saarbrcken. Lambert Academic Pulishing. 2011.
177 c.
2 Смирнова В.С., Гудков С.В., Брусков В.И. 8-оксогуанин и продукты его окисления. Образование в ДНК in vitro под действием тепла, ионов уранила и гамма-излучения. Saarbrcken. Lambert Academic Pulishing. 2011. 152 c.
Статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора наук 3 Гудков С.В., Гудкова О.Ю., Штаркман И.Н., Гапеев А.Б., Чемерис Н.К., Брусков В.И. Гуанозин и инозин как природные генопротекторы для клеток крови мышей при воздействии рентгеноского излучения. // Радиац. биология.
Радиоэкология. 2006. Т. 46. №. 6. С. 713Ц718.
4 Гудков С.В., Штаркман И.Н., Черников А.В., Усачева А.М., Брусков В.И.
Гуанозин и инозин (рибоксин) элиминируют долгоживущие белковые радикалы, образующиеся при воздействии рентгеновского излучения. // ДАН.
2007. том. 413. №. 2. c. 264Ц267.
5 Черников А.В., Гудков С.В., Штаркман И.Н., Брусков В.И. Кислородный эффект при тепловых повреждениях ДНК. // Биофизика. 2007. Т. 52, выпуск 2, с. 244Ц26 Штаркман И.Н., Гудков С.В., Черников А.В., Брусков В.И. Образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах Lаминокислот при воздействии рентгеновского излучения и тепла. // Биофизика. 2008а. том. 53. выпуск 1, с. 5Ц7 Штаркман И.Н., Гудков С.В., Черников А.В., Брусков В.И. Влияние аминокислот на образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов в воде и 8-оксогуанина в ДНК при воздействии рентгеновского излучения. // Биохимия. 2008б. том. 73. выпуск 4, с. 576Ц58 Мирошников А.И., Гудков С.В., Брусков В.И. Механизмы образования и биологическая роль перекиси водорода в электрохимически активированных растворах // Вода. Химия и Экология. 2008. №3. с. 31Ц9 Gudkov S.V., Gudkova O.Y., Chernikov A.V., Bruskov V.I. Protection of mice against X-ray injuries by the post-irradiation administration of guanosine and inosine. // Int. J. Radiat. Biol. 2009. Vol. 85. №2. P. 116Ц125.
10 Брусков В.И., Гудков С.В., Чалкин С.Ф., Смирнова Е.Г., Ягужинский Л.С.
Автоколебательный процесс люминесценции воды, индуцированный лазерным облучением. // ДАН. 2009. том. 425, №6, с. 827Ц829.
11 Andrievsky G.V., Bruskov V.I., Tykhomyrov A.A., Gudkov S.V. Peculiarities of the antioxidant and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene nanostuctures in vitro and in vivo. // Free Radic. Biol. Med. 2009. Vol. 47. №6, P. 786Ц793.
12 Гудков С.В., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Черников А.В., Карп О.Э., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы белка, индуцируемые рентгеновским облучением, являются источником активных форм кислорода в водной среде // ДАН. 2010. том. 430, №1, c. 123Ц1 13 Гудков С.В., Гармаш С.А., Карп О.Э., Смирнова В.С., Черников А.В., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы аминокислот, индуцируемые рентгеновским излучением, являются источником образования перекиси водорода в водной среде. // Биофизика. 2010. том. 55, выпуск 4, с. 588Ц593.
14 Карп О.Э., Гудков С.В., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Черников А.В., Брусков В.И. Генотоксическое действие in vivo долгоживущих радикалов белка, индуцируемых рентгеновским облучением. // ДАН. 2010. том. 434, № 3, с. 412Ц415.
15 Гудков С.В., Смирнова В.С., Брусков В.И. Образование перекиси водорода в воде при воздействии видимого света. // Вода. Химия и Экология. 2010. № 8, с. 40Ц16 Asadullina N.R., Usacheva A.M., Smirnova V.S., Gudkov S.V. Antioxidative and radiation modulating properties of guanosine-5Т-monophosphate. // Nucleot.
Nucleos. and Nucl. Acids. 2010. Vol. 29. P. 786Ц799.
17 Gudkov S.V., Bruskov V.I., Astashev M.E., Chernikov A.V., Yaguzhinsky L.S., Zakharov S.D. Oxygen-dependent auto-oscillations of water luminescence triggered by the 1264 nm radiation. // J. Phys. Chem. B. 2011. Vol. 115 № 23, P.
7693Ц7698.
18 Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Антиоксидантные свойства ксантозина при воздействии рентгеновского излучения. // Фундаментальные исследования. 2011. № 10, с. 22Ц25.
19 Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Кофеин модифицирует эффекты рентгеновского излучения при воздействии на мышей после облучения, проявляя радиозащитные свойства. // ДАН. 2012. том. 442, № 3, с. 22Ц25.
20 Asadullina N.R., Usacheva A.M., Gudkov S.V. Protection of mice against X-ray injuries by the post-irradiation administration of inosine-5Т-monophosphate. // J.
Radiat. Res. 2012. Vol. 53. № 2. P. 211Ц216.
21 Гудков С.В., Карп О.Э., Гармаш С.А., Иванов В.Е., Черников А.В., Манохин А.А., Асташев М.Е., Ягужинский Л.С., Брусков В.И. Образование активных форм кислорода в воде под воздействием видимого и инфракрасного излучения в полосах поглощения молекулярого кислорода. // Биофизика.
2012. том. 57, выпуск 1, с. 5Ц13.
Cтатьи в рецензируемых журналах и сборниках 22 Gudkov S., Shtarkman I., Asadullina N., Garmash S., Karp O., Andrievsky G., Nedzvetsky V., Tykhomyrov A. DNA-protective and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene. // Phys. of Alive. 2009. Vol. 17. P.82Ц23 Gudkov S.V. The antioxidant and radioprotective properties of hydrated Cfullerene nanostuctures. // Nanotech. 2009. p. 452Ц453.
24 Гудков С.В., Асадуллина Н.Р., Карп О.Э., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Брусков В.И. Антиоксидантные и радиозащитные свойства некоторых природных пуриновых соединений. // Вестник Российской военномедицинской академии. 2008. Т.23. №3. пр.1. с. 211.
25 Гудков С.В., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Ассадулина Н.Р., Гармаш С.А., Черников А.В., Брусков В.И. Использование рибоксина (инозина) после рентгеновского облучения для защиты клеток крови мышей. // Нижегородский медицинский журнал. 2008. №4. с. 18Ц26 Штаркман И.Н., Гудков С.В., Черников А.В., Брусков В.И. Образование долгоживущих радикалов белка под воздействием рентгеновского излучения и их генотоксическое действие. // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. Т.23. №3. пр.1. с. 149Ц127 Штаркман И.Н., Гудков С.В., Гармаш С.А., Карп О.Э., Черников А.В., Брусков В.И. Долгоживущие радикалы белков, индуцированные рентгеновским излучением, как источники образования активных форм кислорода. Материалы международной научной конференции Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. Белоруссия. Минск. 25Ц27 июня 2008 г., Мн.:БГУИР. с. 147Ц149.
28 Гудков С.В., Гапеев А.Б., Бережнов А.В., Карп О.Э., Гармаш С.А., Брусков В.И. Сочетанное действие рентгеновского излучения и видимого/инфракрасного излучения в полосах поглощения молекулярного кислорода. Радиация и Чернобыль: Наука и практика. Белорусь. Гомель. 13Ц 14 октября 2011 г. с.38Ц40.
29 Гармаш С.А., Карп О.Э., Смирнова В.С., Гудков С.В. Прооксидантные свойства ионов уранила, индуцированные видимым светом // Известия Национальной академии наук Белоруси. Серия биологическая. 2012. ч.3.
с.44Ц46.
Более 70 тезисов докладов.