Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
КОЛОТЬЕВА НАТАЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА
МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ В ИЗУЧЕНИИ ОСОБЕННОСТЕЙ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
03.01.04 - Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва 2012
Работа выполнена в ГБОУ ВПО Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научные руководители:
заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Гильмиярова Фрида Насыровна кандидат биологических наук Рыскина Елена Анатольевна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет имени В.И.Разумовского Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Бородулин Владимир Борисович доктор биологических наук, профессор заведующий отделом биохимии животной клетки НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Муронец Владимир Израилевич
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится л____ _____________ 2012 г. в 14.00 на заседании Диссертационного совета Д.212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г.
Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, Медицинский факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.
Автореферат разослан л____ ______________2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор Е.В. Лукашева ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Начавшееся тысячелетие для медицины можно обозначить как время поиска новых путей повышения качества жизни и здоровья человека с использованием новых технологий протеомики и метаболомики. Интенсивно развивающееся медико-биологическое направление наномедицины, возникшее на стыке ряда перспективных наук, требует фундаментального подхода к решению лечебно-диагностических и валеологических задач. Имеющиеся на сегодняшний день в арсенале медицинской науки высокотехнологичные методы исследования позволяют получить информацию о состоянии базовых метаболических путей в организме. Однако практически отсутствует система данных для индивидуализации молекулярных основ метаболизма, факторах эндогенной природы, определяющих физиологический уровень обмена и специфику индивидуальной реакции. Одним из таких параметров, на наш взгляд, является генетически детерминированный признак - группа крови, определяющий особенности клеточного состава, показателей метаболизма, молекулярную основу развития различной патологии (Тананян А.О., 2001; Гармонов С.Ю. с соавт., 2004; Гильмиярова Ф.Н. с соавт., 2007, Lomenick B., 2010). В настоящее время актуально дальнейшее более детальное изучение структурнофункциональных характеристик отдельных антигенов, ответственных за каждую группу крови. Современные представления о структуре и топографии антигенов А,В,Н позволяют объяснить их высокую иммуногенность, роль в формировании иммунного ответа (Сахаров Р.С., 2001; Оловникова Н.И.; 2001, Донсков С.И., 2001; Smolarek D. et al., 2008; Eiji Hosoi, 2008;). В этом плане перспективным является исследование антигенов и антител АВ0 системы в качестве объектов межмолекулярных, в том числе белок-белковых взаимодействий. Известно, что последние во многом определяются наличием микроокружения, создаваемого промежуточными продуктами обмена, так называемыми малыми молекулами, играющими значительную роль в поддержании метаболического баланса (Никитина В.С. с соавт., 2000;
Павлюченко И.И., 2003; Титов В.Н., 2010; Petry, J.J., Hadley S.K., 2001; Лимаде-Фариа А., 2012). Интересным представляется использование естественных интермедиатов в качестве метаболических зондов, возможно влияющих на функциональные группы антигенов и вызывающих их дальнейшие конформационные перестройки, реализующиеся в изменении характера антиген-антительных взаимоотношений. С одной стороны это пополнит сведения об особенностях строения изучаемых антигенов, с другой - раскроет новые молекулярные механизмы белкового взаимодействия, что в дальнейшем будет содействовать более глубокому пониманию регуляции процессов рецепции, межмолекулярного узнавания, способствовать индивидуальному подходу к трактовке результатов иммуноферментного, электрохемилюминесцентного методов исследования.
Настоящее исследование выполнено в рамках Федеральных программ:
Х Взаимодействие биологически активных веществ растительного и животного происхождения с системами жизнеобеспечения организма с учетом биологической вариабельности метаболизма, ассоциированной с групповой принадлежностью крови (номер гос. регистрации 0120.809698) Х Новые возможности индивидуализации донозологической диагностики и оптимизации лечебных мероприятий с учетом молекулярно-генетических особенностей организма и алиментарных факторов (номер гос. регистрации 0120.0 809697) Цель настоящего исследования заключается в изучении влияния пирувата на белок-белковые взаимодействия.
Задачи:
1. Оценить специфику метаболизма, обусловленную групповой принадлежностью крови по системе АВ0, определив в сыворотке крови показатели углеводного обмена (содержание глюкозы, пирувата, лактата, активность лактатдегидрогеназы, амилазы), а также уровень инсулина и кортизола.
2. Охарактеризовать спектр биологической активности ключевого интермедиата метаболизма Ч пирувата с помощью компьютерной программы Prediction of Activity Spectra for substances: Complex & Training и Pharma Expert.
3. Используя пируват в качестве метаболического зонда, изучить процессы межбелкового взаимодействия в различных модельных экспериментах с гликопротеинами АВ0-системы.
4. Изучить влияние пирувата на естественные и моноклональные антитела в процессах белок-белкового взаимодействия.
5. Визуализировать межмолекулярные взаимодействия и антиген-антительные комплексы в условиях влияния пирувата, используя методы флуоресцентного зондирования и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Получен блок новых данных, раскрывающих биологическую вариабельность показателей углеводного обмена и его регуляторов, обусловленную групповой принадлежностью крови. Так, у пациентов 0(I) группы глюкоза является активно метаболизирующимся соединением: при самом низком ее содержании в крови относительно других групп наблюдается минимальный уровень инсулина, высокая амилолитическая активность, максимальная концентрации пирувата и лактата, что, вероятно, обусловлено интенсивно протекающими процессами распада гликогена и анаэробного катаболизма. Для обладателей А(II) группы крови характерно наибольшее содержание инсулина и кортизола в сыворотке крови, что, очевидно, вызвано усиленным синтезом данных регуляторов-антагонистов с целью поддержания метаболического баланса. У обследуемых с В(III) группой крови наблюдается самая высокое содержание пирувата и лактата, наибольшая активность лактатдегидрогеназы, низкая амилолитическая активность и минимальное содержание кортизола, что свидетельствует о поддержании концентрации глюкозы в крови посредством интенсивно протекающего процесса гликолиза. Метаболический профиль лиц с АВ (IV) группой крови характеризуется самым высоким содержанием глюкозы на фоне низкой амилолитической и лактатдегидрогеназной активности, повышенного относительно значений в генеральной совокупности уровня кортизола, что вероятно, говорит о преобладании анаболических процессов.
При анализе полученных данных установлено, что колебания концентрации пирувата в крови лиц с различной групповой принадлежностью минимальные, несмотря на выраженные отклонения показателей содержания глюкозы и лактата. Исследование соотношения лактат/пируват выявило значительно более низкую концентрацию в крови пирувата по сравнению с содержанием лактата у обладателей всех четырех групп крови, что позволяет рассматривать пируват не только как интегральный метаболит, но и регуляторную, сигнальную молекулу, стабильность концентрации которой необходима для межмолекулярных взаимоотношений.
Впервые при изучении биологической активности пирувата с помощью компьютерной системы Prediction of Activity Spectra for substances: Complex & Training и Pharma Expert выявлен широкий спектр его возможных биологических эффектов. Пируват может выступать регулятором обмена липидов, цито- и гемопротектором, оказывать антитоксическое, гиперхолестеролемическое, противовоспалительное, обезболивающее, фибринолитическое, антинейротоксическое действие, а также проявлять свойства модулятора иммунных реакций.
Новыми являются сведения об особенностях межмолекулярного взаимодействия антигенов и антител системы АВ0 при влиянии на них пирувата. Показано, что при добавлении пирувата взаимодействие антигенов А и В носит различный характер. Время наступления агглютинации гликопротеинов с детерминантой N-ацетилгалактозамин (антиген А) возрастало после инкубации с пируватом более значительно, чем гликопротеины с детерминантой D-галактоза (антиген В), что очевидно обусловлено имеющимися различиями в их химической структуре.
В экспериментах с изогемагглютининами выявлено, что пируват не оказывает влияния на анти-А антитела В(III) группы и вызывает увеличение степени агглютинации эритроцитов А(II) группы крови, что вероятно, связано с его модифицирующим влиянием на конформацию антител, способствующим более быстрому узнаванию их антигенными детерминантами В-антигена.
Показано также, что пируват ускоряет время образование антиген-антительных комплексов моноклональных антител с антигенами А и В.
Впервые с целью количественной оценки результатов взаимодействия антигенов и антител при введении малых молекул в систему использован метод проточной цитофлуориметрии. Выявлено разнонаправленное действие пирувата на экспрессию антигенных детерминант. Количество образующихся иммунных комплексов увеличивалось в образцах А(II) группы, уменьшалось Ч в В(III) и АВ (IV) группах крови.
Новыми являются результаты, полученные в ходе визуализации антигенантительных комплексов под влияниям биорегуляторов, в частности, пирувата.
Установлено не только изменение размера агглютинатов, но и уменьшение их количества. Возможно, это обусловлено стерическими изменениями антигенных детерминант в условиях действия высоко реакционноспособного пирувата, что снижает степень авидности антител, общую стабильность комплекса, вызывая в итоге его разрушение.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты исследования имеют теоретическое и практическое значение. В фундаментальном отношении разработана новая методология экспериментов in vitro - предложена наглядная молекулярная модель для изучения межбелковых взаимодействий. Использование естественных интермедиатов эндогенного происхождения в качестве молекулярных зондов позволяет выяснить не только биологические эффекты данных соединений, но и характер регулируемых ими молекулярных взаимоотношений. Данная модель может быть рекомендована для тестирования широкого спектра веществ, обладающих биологической и фармакологической активностью.
В прикладном отношении полученные данные о влиянии пирувата на характер антиген-антительного взаимодействия, лежащего в основе иммуноферментного и электрохемилюминесцентного анализа, важны при интерпретации результатов лабораторных исследований, что диктует необходимость оценки индивидуального метаболического статуса пациента.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Особенности углеводного обмена, ассоциированные с групповой принадлежностью крови по системе АВ0. Наименьшее содержание глюкозы и инсулина, наибольшая амилолитическая активность, высокое содержание пирувата и лактата в крови обследованных с 0(I) группой крови. Наибольшее содержание инсулина и кортизола, низкая концентрация лактата у обладателей A(II) группы. Максимальная лактатдегидрогеназная и минимальная амилолитическая активности, наибольшее содержание пирувата и лактата у лиц с B(III) группой крови. Самый высокий уровень глюкозы при низкой амилолитической и лактатдегидрогеназной активности, наименьшее содержание лактата и пирувата у обследованных с AB(IV) группой крови.
2. Широкий спектр биологических эффектов пирувата, установленный с помощью компьютерной программы Prediction of Activity Spectra for substances: Complex & Training и Pharma Expert, ключевыми из которых являются антитоксическое, гиперхолестеролемическое, противовоспалительное, обезболивающее, фибринолитическое, цито- и гемопротекторное, иммуномодулирующее действия.
3. Способность пирувата участвовать в процессах межбелковых взаимоотношений, оказывая разнонаправленное влияние на взаимодействие антигенов и антител системы АВ0. Более быстрое узнавание естественных антител антигенными детерминантами В-антигена, что выражается в увеличении степени агглютинации. Ускорение образования антигенантительных комплексов моноклональных антител с антигенами А и В.
4. Использование методов проточной цитофлуориметрии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии для визуализации межмолекулярных взаимодействий в условиях влияния биологически активных веществ эндогенного происхождения.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований были представлены на 73 итоговой студенческой научной конференции, посвященной 75-летию клиник СамГМУ (Самара, 2005); 64 итоговой студенческой научной конференции с международным участием (Москва, 2006); 74 итоговой студенческой научной конференции Человек и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты российской науки (Самара, 2006); 71 итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием Вопросы теоретической и практической медицины (Уфа, 2006); международной всероссийской конференции студентов и молодых ученых Пироговские чтения (Москва, 2007, 2009); всероссийской итоговой студенческой научной конференции Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты (Самара, 2007, 2008, 2009); XV Форуме Национальные дни лабораторной медицины РоссииЦ2011 (Москва, 2011); Международной конференции Инновационные технологии, модернизация, качество, доступность и безопасность лекарственных средств в системе здравоохранения современной России. Щкола формирования принципов здорового образа жизни (Москва, 2011); II международной научнопрактической конференции Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика (Новосибирск, 2011); Всероссийской конференции с международным участием Молодые ученые - медицине (Самара, 2011);
Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований (Омск, 2011); XVII Всероссийской научно-практической конференции Молодые ученые в медицине, 86-я Всероссийская научная конференция памяти член-корреспондента АН РТ, прфессора И.Г. Салихова (Казань, 2012); Международной Интернет-конференции Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии (Казань, 2012); журналах Клиническая лабораторная диагностика (Москва, 2011); альманахе Жизнь плюс наука. Интернациализация и инновации (Самара, 2011); Медицинский альманах (Н.Новгород, 2012), совместном заседании Самарского отделения Всероссийского биохимического общества, кафедр общей, бионеорганической и биоорганической химии и фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ (Самара, 2012).
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ. Результаты диссертационного исследования используются в работе клиникодиагностической лаборатории клиник СамГМУ ГБОУ ВПО Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ; в учебном процессе на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ, на кафедре биохимии ГБОУ ВПО Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ.
Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2010611397 от 17 февраля 2012 г.
Заявки на патент Способ определения антигенов эритроцитов (№2012108863/20(013302) от 07.03.2012), Способ оценки действия биологически активных веществ на антиген-антительное взаимодействие (№ 2012115145 (022873) от 16.04.2012), Способ оценки антиген-антительных комплексов системы АВ0 (№ 2012133378 от 03.08.2012).
Данная работа выполнена при поддержке Губернского гранта в области науки и техники Способ визуализации антиген-антительного взаимодействия методом конфокальной микроскопии.
ПУБЛИКАЦИИ Всего опубликовано 19 работ, из них по теме диссертации 16, свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ, 5 работ - в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию объектов и методов исследования, трех глав собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.
Диссертация изложена на 156 страницах, иллюстрирована 28 рисунками, содержит 22 таблицы. В работе использовано 237 источников, из них 1отечественных и 110 зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Исследования проводились на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России.
Под наблюдением находилось 446 лиц, их клиническое состояние подтверждалось отсутствием обострения хронических соматических и стоматологических заболеваний, а также латентных социально значимых вирусных инфекций, из них мужчин - 142 человек, женщин - 304 человека, средний возраст которых составил 26,8 1,4 лет. Распределение по групповой принадлежности крови оказалось следующим: лиц с О(I) группой крови - 29,6%, с А(II) группой крови - 31,8%, с В(III) группой крови - 24,3%, с АВ(IV) группой крови - 14,3%. Материалом для исследования служила кровь, которую получали из локтевой вены путем венопункции в пробирки для взятия крови фирмы VACUTANER (США).
Всем обследованным проводилось определение группы крови с использованием ЭРИТРОТЕСТ - Цоликлонов Анти-А, Анти-В диагностических жидких методом прямой агглютинации на плоскости.
Агглютинация подсчитывалась по W. Marsh (Marsh W.L., 1972) с индикацией степени агглютинации (бальная оценка интенсивности агглютинации - pt).
Определение группы крови также проводилось на автоматическом анализаторе для проведения иммуногематологических исследований Хемос СП II фирмы BIO-Rad с использованием реактивов TransClone Anti-AB01 (A), TransClone Anti-AB02 (B), TransClone Anti-AB03 (AB) (BIO-Rad, США).
В качестве контроля брали среднее значение времени (в секундах) и степени агглютинации антигенов А и В (по шкале) II, III, IV групп крови с моноклональными антителами. Для изучения биологического действия малых молекул на агглютиногены А, В, изоагглютинины анти-А и анти-В группы крови по системе АВ0 и моноклональные антитела анти-А и анти-В перед постановкой реакции гемагглютинации эритроциты инкубировали с раствором пирувата в конечной концентрации 2 мМ.
Всем обследованным в крови определяли содержание пировиноградной кислоты, активность лактатдегидрогеназы, -амилазы. Исследования проводили на автоматическом биохимическом анализаторе Hitachi - 902 фирмы Roche-Diagnostics, производства Японии с помощью набора реактивов фирмы Roche-Diagnostics (Швейцария). Контроль качества при выполнении исследований осуществляли с использованием контрольной сыворотки "Precinorm", "Precipat", фирмы Roche-Diagnostics, (Швейцария).
Содержание молочной кислоты и глюкозы проводили на анализаторе BIOSEN C_line фирмы EKF-diagnostic, GmbH.
Исследования содержания кортизола и инсулина проводили на автоматическом иммунохемилюминисцентном анализаторе Elecsys 2010 фирмы Roche-Diagnostics (Япония), с помощью набора реактивов фирмы Roche Diagnostics (Германия), твердофазным двухступенчатым sandwich - вариантом проведения анализа.
Визуализация белок-белковых комплексов проводилась при помощи экспериментального стенда, который реализован на базе конфокального оптического микроскопа Olympus IX 71 (лOlympus, Япония), конфокального сканирующего блока и лазерного комбайна (фирма ANDOR) (кафедра радиотехнических устройств ФГБОУ ВПО Самарский государственный аэрокосмический университет имени академика С.П. Королева); на проточном цитофлуориметре FACS Calibur компании Beckton Dickinson (США), с использованием специфичных моноклональных конъюгированных антител Blood group A antigen (Z2A), Blood group B antigen (89-F), меченными флуоресцеинизотиоционатом (FITC) фирмы Santa Cruz biotechnology, Inc.
(США) Компьютерное прогнозирование спектра биологической активности пирувата проводили с помощью компьютерной системы Prediction of Activity Spectra for Substances: Complex & Training учитывая структурную формулу соединения с использованием единообразного описания химической структуры и универсального математического алгоритма установления зависимости структура - активность (лаборатория структурно-функционального конструирования лекарств Института биомедицинской химии им. В.Н.
Ореховича РАМН).
Статистический анализ данных проводили в среде статистического пакета прикладных программ SPSS 12.0 и в программе MS EXCEL 2007. Полученные данные были описаны с использованием таких статистических характеристик как медиана (Ме), средняя арифметическая (М), стандартная ошибка от средней арифметической (m), максимум и минимум, 95% интервал. Для оценки формы распределения исследуемых показателей использовался графический метод (визуальная оценка гистограмм распределения), оценивались показатели скошенности и крутизны, отражающие асимметрию распределения, тесты на нормальность с помощью критерия Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилиефорса и Шапиро-Уилки. Для сравнения здоровых лиц по группам крови применялся однофакторный дисперсионный анализ. Поскольку формы распределения признаков часто отличались от нормальной, а также наблюдались различные величины дисперсий, к которым чувствителен классический дисперсионный анализ, также использовался его непараметрический аналог Ч анализ Краскела - Уолллиса (Платонов А.Е., 2000; Реброва, 2002). Если дисперсионный анализ выявлял статистически значимые различия, проводили второй этап статистического анализа, так называемые апостериорные тесты. В настоящем исследовании применялся критерий Даннета, как один из менее чувствительных к различиям дисперсий в сравниваемых группах. Для показателей, имеющих значительные выбросы, при которых некорректно применять классический ANOVA, использовался тест Манна-Уитни (для парных сравнений) с поправкой Бонферони (Боровиков В., 2001; Реброва, 2002). Критическое значение уровня значимости принимали равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В настоящее время практически отсутствует фактическая база данных, раскрывающих биологическую вариабельность показателей углеводного обмена и его регуляторов, обусловленную групповой принадлежностью крови.
В крови практически здоровых лиц определяли содержание глюкозы, пирувата и лактата, активность лактатдегидрогеназы и амилазы, а также оценивали содержание основных регуляторов углеводного обмена инсулина и кортизола в сыворотке крови (табл.1).
При наличии 0(I) группы крови установлены следующие особенности углеводного обмена. Глюкоза служит активно метаболизирующимся соединением: медиана ниже генеральной совокупности и уровня при других группах крови. При этом амилолитический распад гликогена является реальным поставщиком этого метаболита, что характеризуется высокой активностью амилазы в крови обследованных. Активный вклад в этот процесс вносит анаэробный путь катаболизма, о чем свидетельствует наибольшее содержание пирувата и лактата в крови обследованных (наибольшая медиана по сравнению с другими группами крови и генеральной совокупностью), характерно самое низкое содержание инсулина в крови.
Для обладателей A(II) группы крови характерно наибольшее содержание, как гипогликемического гормона инсулина, так и его антагониста, гормона кортизола (наибольшее среднее значение показателей по сравнению с другими группами крови и генеральной совокупностью). Установлено наименьшее содержание конечного метаболита анаэробного окисления глюкозы молочной кислоты.
У лиц B(III) группы крови определяются характерные тенденции в показателях углеводного обмена: установлена наибольшая лактатдегидрогеназная и наименьшая амилолитическая активности. В то же время обнаружено наибольшее содержание конечных метаболитов гликолиза пирувата и лактата, наименьшее содержание глюкокортикоидного гормона кортизола. Выявлено наибольшее содержание пировиноградной кислоты в крови клинически здоровых обследованных мужчин, что совпадает в целом с данными генеральной совокупности.
По специфике приведенных показателей у обследованных с AB(IV) группой крови выявлен самый высокий уровень глюкозы при низкой амилолитической и лактатдегидрогеназной активности, что может говорить о преобладании анаболических процессов. Установлено наименьшее содержание лактата и пирувата.
Таблица Показатели углеводного обмена в сыворотке крови клинически здоровых доноров 0(I) - АВ(IV) групп крови Группа крови Генерал.
Показатели 0(I) A(II) B(III) AB(IV) совокупность Мm 4,310,08 4,410,10 4,420,11 4,660,17* 4,420,Глюкоза Me 4,21 4,30 4,31 4,50 4,(ммоль/л) SD 0,38 0,66 0,34 0,78 0,Лактатдегид Мm 364,22 384,44 393,79 377,82 379,81 рогеназа 18,12 13,01 18,41 16,40 8,(Е/л) Me 342,50 376,00 372,00 368,00 366,SD 86,83 78,72 102,69 75,84 87,Лактат Мm 2,260,15 2,020,12 2,270,14 2,010,18 2,150,(ммоль/л) Me 2,10 1,74 2,29 1,85 1,SD 0,91 0,72 0,77 0,97 0,Пируват Мm 0,053 0,050 0,053 0,047 0,051 (ммоль/л) 0,002 0,0017 0,0019 0,0022 0,0Me 0,052 0,048 0,052 0,046 0,0SD 0,012 0,009 0,007 0,008 0,0Лактат / Мm 44,34 40,69 44,04 42,42 42,78 пируват 3,07 2,01 2,83 2,94 1,Me 38,65 39,95 45,26 40,39 39,SD 19,32 12,98 15,41 13,59 15,Амилаза Мm 68,81 64,39 60,83 60,53 64,31 (Е/л) 3,67 3,68 4,20 5,63 2,Me 66,50 65,00 63,00 70,00 65,SD 21,83 25,30 23,86 26,07 23,Кортизол Мm 447,06 473,95 431,49 464,97 454,83 (ммоль/л) 44,16 41,52 40,64 36,85 21,Me 418,80 472,20 391,30 420,00 426,SD 173,58 286,67 221,50 171,46 230,Инсулин Мm 10,16 13,82 12,47 10,85 12,04 (мкЕ/мл) 1,45 2,74 2,79 2,14 1,Me 7,24 8,06 8,28 9,61 8,SD 6,92 9,24 10,77 8,77 8,* - р I-IV = 0,Интересными являются данные о содержании пирувата в крови клинически здоровых лиц в зависимости от полового признака. Оценка результатов содержания пирувата показала, что у мужчин наибольшее содержание пирувата в крови с B(III) группой крови, наименьшее содержание с AB(IV) группой (табл. 2).
Таблица Содержание пирувата (ммоль/л) в сыворотке крови клинически здоровых мужчин 0(I) - АВ(IV) групп крови Группа крови Мm Me Q1 - Q0(I) 0,0550,004* 0,056 0,045Ц0,0A(II) 0,0510,004 0,047 0,039Ц0,0B(III) 0,0600,007* 0,056 0,050Ц0,0AB(IV) 0,0410,002 0,042 0,035Ц0,0* - р I-IV = 0,02, * - р III-IV = 0,0Таким образом, колебания пирувата в крови практически здоровых лиц с различными группами по системе АВ0 незначительные, несмотря на относительно высокие колебания показателей глюкозы и лактата. Большая роль принадлежит интермедиатам, вступающим, возможно, в параметаболические взаимодействия, создавая тем самым определенное микроокружение крупных молекул-регуляторов. В этом плане представляет интерес изучение полного спектра биологической активности пирувата, принимающего участие в регуляции метаболизма в физиологических условиях. Решить поставленную задачу позволила нам компьютерная система Prediction of Activity Spectra for Substances (PASS C&T) и программа интерпретации результатов Pharma Expert.
При анализе результатов у пирувата существует вероятность наличия 2фармакологических эффектов из 384 возможного и 1578 механизмов их реализации из 2242. Определено 35 из 41 возможных побочных и токсических эффектов, 56 метаболически опосредованных действий.
Стимулятор лейкопоэза Ингибитор энтеропептидазы Ингибитор тромбоцитопоэза Стимулятор секреции инсулина Гемопротекторный 0,0,Липотропный Антитоксический 0,Гиперхолестеролемический Антагонист апоптоза 0,Регулятор обмена липидов Антигипоксический Фибринолитик Антиканцерогенный Противовоспалительный Антидот Противовирусный Обезболивающий Антинейротоксический Иммуномодулятор Рис.1. Прогнозируемый спектр биологической активности пирувата Обращает на себя внимание наличие способности у пирувата выступать регулятором метаболизма липидов, цитопротектором, стимулировать эритропоэз и лейкопоэз, ингибировать тромбоцитопоэз, вызывать гемопротекторный эффект, оказывать антигипоксическое, антитоксическое, действие и другие (рис.1). Данная особенность позволяет предположить реализацию перечисленных эффектов за счет имеющейся в составе карбоксильной группировки производных карбоновых кислот ОН-группы. Как известно, в карбоновых кислотах гидроксильная группа выполняет роль заместителя. В результате такие соединения способны выступать в реакции нуклеофильного замещения.
Важными являются данные о способности участия пирувата в антиоксидантной защите практически всех клеток, так или иначе находящихся в контакте с кислородом. Так, являясь ингибитором каталазы и ингибитором супероксиддисмутазы, пируват замедляет или даже прекращает процесс защиты организма человека от постоянно образующихся высокотоксичных кислородных радикалов. Участвуя в процессе тканевого дыхания, пируват ингибирует L- и D- формы лактатдегидрогеназы цитохрома.
Таблица Возможные молекулярные механизмы действия пирувата Молекулярный механизм действия Ра Рi Ингибитор ацилглицеролипазы 0,855 0,0Ингибитор оксалоацетатдекарбоксилазы 0,848 0,0Ингибитор кислой фосфатазы 0,847 0,0Ингибитор пируватдегидрогеназы 0,827 0,0Ингибитор L-лактат дегидрогеназы (цитохрома) 0,818 0,0Ингибитор D-лактат дегидрогеназы (цитохрома) 0,808 0,0Ингибитор супероксиддисмутазы 0,805 0,0Ингибитор глюкозооксидазы 0,794 0,0Ингибитор каталазы 0,781 0,0Модулятор цитокинов 0,720 0,0Антагонист нейротрансмиттера 0,699 0,0Антагонист интегрина 0,680 0,0Агонист нейротрофического фактора 0,670 0,0Окислитель 0,602 0,0Ингибитор пируваткиназы 0,540 0,0Ингибитор алкогольдегидрогеназы 0,499 0,0Приведенные данные свидетельствуют о том, что пирувату присущи различные механизмы влияния на активность факторов, регулирующих внутри- и межклеточные взаимодействия. Указывается участие пирувата в белковом, липидном и углеводном обменах. Так, он является окислителем, ингибитором глюкозооксидазы, ингибитором многоферментного пируватдегидрогеназного комплекса, ингибитором оксалоацетатдекарбоксилазы, ингибитором ацилглицеролипазы, регулятором обмена липидов, оказывая гиперхолестеролемический и липотропный эффекты.
Создатели программы PASS отмечают, что высокая вероятность какоголибо эффекта необязательно говорит о том, что этот эффект присущ данному соединению (Филимонов Д.А. с соавт., 2006, Poroikov V. et al., 2001). Мы лишь предполагаем его наличие, поэтому необходимо экспериментальное подтверждение или исключение этих эффектов.
Уникальные свойства и регуляторная способность естественного интермедиата пирувата, участие данного соединения в различных процессах, направленных на поддержание физиологического уровня обмена, позволили нам предположить возможность его влияния на один из ключевых механизмов организма - белок-белковое взаимодействие.
Белок-белковое узнавание - ключевой молекулярный механизм реализации сигнальной информации в живых организмах. Процесс распознавания молекулярных объектов лежит в основе взаимодействия эндогенных и экзогенных соединений с рецепторами, в т.ч. гормонами, ферментами и субстратами, лекарственными препаратами и др. Использование молекулярных зондов с применением малых молекул раскрывает перспективы воздействия на эти процессы, в том числе коррекцию нарушенных метаболических процессов.
В этом плане эритроцит в его естественном окружении, с большим количеством встроенных в его мембрану антигенов представляет собой прекрасную модель для исследования. Мы решили обратиться к белкам, выполняющим рецепторную функцию и участвующим в реакции узнавания. Такими белками являются групповые гликолипиды системы АВ0, которые можно визуализировать на поверхности мембраны эритроцита с помощью реакции антиген-антитело. Таким образом, следующим этапом нашего исследования является изучение влияния пирувата на антигены А и В, естественные изогемагглютинины и моноклональные антитела.
Контроль антиген А (II) антиген В (III) антиген А (IV) антиген В (IV) 0 2 4 6 Время наступления агглютинации (сек.) Рис.2. Влияние пирувата на антигены АВ0 системы В условиях in vitro у эритроцитов А(II) группы крови при добавлении пировиноградной кислоты, время начала агглютинации увеличилось по сравнению с контролем, а у В(III) группы крови увеличилось незначительно, то есть пировиноградная кислота слабее влияет на антиген-антительную реакцию эритроцитов В(III) группы крови с анти-В антителами (рис.2).
При оценке агглютинации антигенов А и В эритроцитов АВ(IV) группы крови время агглютинации возросло на 23%, а степень агглютинации слабее, чем в контрольных образцах. Существенно снижается полнота взаимодействия, процесс преципитации белковых комплексов. При этом нивелируется специфика, характерная для анти-А и анти-В антигенов. Гликопротеиновые компоненты антигенов, участвующие в процессе взаимодействия антигена с антителами менее интенсивно образуют комплексы.
После взаимодействия пирувата с изогемагглютининами анти-В А (II) группы крови степень агглютинации увеличилась на 20% по сравнению с контролем. Степень агглютинации не изменилась при взаимодействии стандартных эритроцитов В (III) группы крови с анти-А антителами проинкубированным с пируватом. Показано, что действие пирувата на систему цельной крови, возможно, оказывает модифицирующее влияние на иммуноглобулины плазмы, способствующее более быстрому узнаванию антител антигенными детерминантами В-антигена и вступают во взаимодействие аналогично контрольным образцам с А-антигеном.
Взаимодействие эритроцитов А(II) группы крови с моноклональными антителами, проинкубированными с пируватом уменьшилось на 22% по сравнению с контрольным временем. Время агглютинации анти-В моноклональных антител с эритроцитами В(III) группы сократилось. При взаимодействии анти-А и анти-В моноклональных антител, предварительно проинкубированных с пируватом, с эритроцитами АВ(IV) группы крови время взаимодействия с антигенами А и В увеличилось (рис.3).
Контроль Анти-А (II) Анти-В (III) Анти-А (IV) Анти-В (IV) Рис. 3. Влияние пирувата на моноклональные антитела ( сек.) Время наступления агглютинации Исходя из полученных данных, можно предположить, что инкубация с пируватом приводит к конформационным перестройкам моноклональных антител, которые варьируют от небольших сдвигов боковых цепей аминокислотных остатков до глобальных перестроек в третичной и четвертичной структуре Fab-фрагментов молекулы иммуноглобулина.
Таким образом, при исследовании образцов крови в условиях добавления пирувата антигены, естественные и моноклональные антитела по-разному вступают во взаимодействие. Вероятно, это происходит из-за различия в строении А и В антигенов. Несмотря на то, что антигены групп крови системы АВ0 близки между собой по строению и содержат общий структурный компонент - вещество Н, групповую антигенную специфичность определяют терминальные сахара, располагающиеся на концах углеводородных цепей.
Различие между А и В антигенами заключается в том, что у Nацетилгалактозамина (А-антигена) в позиции С2 располагается наиболее реакционноспособный NHCOCH3, а у Д-галактозы (В-антиген) в этой позиции находится ОН - группа. Специфичность взаимодействия антигенов с антителами определяется особенностями строения поверхностной структуры антигенов - наличием различных химических групп, их пространственным расположением (Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г., 2000; Малинка М.К., Петриев В.М., Подгородниченко В.К., 2007). Возможно, высоко реакционноспособная молекула пирувата взаимодействует с детерминантными группами антигенов А и В, изменяя и модифицируя их специфичность. Данное явление, несомненно, отражается на процессах взаимодействия его с антителами. Стерические, электростатические изменения иммуноглобулинов, обусловленные взаимодействием функциональных групп белка с пируватом, так изменяют макромолекулу белков, что это приводит к полноте агглютинации.
1111контроль 1пируват 111Ag A II Ag B III Ag A IV Ag B IV антигены АВ0 системы Рис.4. Показатели экспрессии антигенов А и В группы крови по системе АВ0 до и после инкубации с пируватом Экспрессия антигенов Впервые с целью количественной оценки результатов взаимодействия антигенов и антител при введении малых молекул в систему использован метод проточной цитофлуориметрии (рис.4). Выявлено разнонаправленное действие пирувата на экспрессию антигенных детерминант. Количество образующихся иммунных комплексов увеличивалось в образцах А(II) группы, уменьшалось Ч в В(III) и АВ (IV) группах крови. Следующим этапом нашего исследования является визуализация комплексов антиген-антитело с использованием флуоресцентных зондов с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
а б в г Рис.5. Диаграммы пространственного распределения интенсивностей флуоресценции FITC в комплексах антиген - антитело (а) контрольные эритроциты A(II) группы крови; (б) эритроциты А(II) группы крови после инкубации с пируватом; (в) контрольные эритроциты В(III) группы крови; (г) эритроциты В(III) группы крови после инкубации с пируватом Анализ данных пространственного распределения интенсивности флуоресценции свечения флуорохрома в комплексах антиген - антитело (рис.5) свидетельствует об уменьшении пиков флуоресценции в эритроцитах А(II) и В(III) группы крови после инкубации с пируватом по сравнению с контрольными эритроцитами. Пируват, по-видимому, конкурирует за активные реакционноспособные группы антигенов А и В с моноклональными антителами, меченными флуоресцеинизотиоцианатом, что отражается на изменении конформационной структуры белковой молекулы, а также способности антигенов образовывать комплексы антиген-антитело.
ВЫВОДЫ:
1. Выявлены группоспецифические особенности углеводного обмена лиц с 0(I) - АВ(IV) группами крови. Для обследованных 0(I) группы крови характерно наименьшее содержание глюкозы и инсулина, наибольшая амилолитическая активность, высокое содержание пирувата и лактата в крови; для лиц A(II) группы - наибольший уровень инсулина и кортизола, низкое содержание лактата; для пациентов с B(III) группой - максимальная лактатдегидрогеназная и минимальная амилолитическая активность, наибольшее содержание пирувата и лактата; для обследованных AB(IV) группы - самый высокий уровень глюкозы, низкая амилолитическая и лактатдегидрогеназная активность, наименьшее содержание лактата и пирувата в крови.
2. С использованием компьютерной системы PASS: C&T и Pharma Expert охарактеризованы возможные биологические эффекты пирувата.
Установлена способность пирувата оказывать антитоксическое, гиперхолестеролемическое, противовоспалительное, обезболивающее, фибринолитическое, цито- и гемопротекторное, иммуномодулирующее действия.
3. Показано, что пируват изменяет сродство гликопротеина с детерминантой N-ацетилгалактозамин (антиген А) к антителу более интенсивно по сравнению с гликопротеином с детерминантой D-галактоза (антиген В), что выражается в уменьшении способности образовывать комплексы антигенантитело, снижении степени и увеличении времени начала агглютинации.
4. Выявлено модифицирующее влияние пирувата на иммуноглобулины плазмы крови. Показано более быстрое узнавание естественных антител антигенными детерминантами В-антигена, что выражается в увеличении степени агглютинации. Установлено ускорение образования комплексов анти-А и анти-В моноклональных антител с антигенами, обусловленное, вероятно, конформационными изменениями в молекулах иммуноглобулинов.
5. Разнонаправленное действие пирувата на экспрессию антигенов нашло свое подтверждение при оценке результатов белок-белкового взаимодействия методом проточной цитофлуориметрии, которая показала изменение количества образующихся иммунных комплексов. Визуализация антигенантительных комплексов с помощью конфокальной микроскопии при введении в систему пирувата позволила выявить изменение размера и количества агглютинатов, что подтверждает возможность использования малых молекул с целью изучения белок-белковых взаимодействий.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:
1. При оценке метаболического статуса пациента учитывать генетически детерминированный фактор - АВ0-групповую принадлежность крови, с которой ассоциированы особенности обмена.
2. Рекомендуется включить в перечень показателей биохимического анализа определение в крови содержания пирувата, который влияет на взаимодействие белков, для оценки риска развития патологии.
3. При постановке чувствительных высокотехнологичных методов (иммуноферментный, иммунофлуоресцентный, полимеразная цепная реакция) учитывать возможные искажения результатов анализа в крови при повышенном уровне минорных компонентов метаболизма.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ 1. Бортникова, Н.А. Влияние этанола на активность ферментов мозга / Н.А.
Бортникова // Вестник РГМУ. - Москва. - 2007. - № 2 (55) - с. 22. Бортникова, Н.А. Этанол как модулятор активности ферментов мозга / Н.А. Бортникова, З.Ж. Махмутова // Сборник материалов I Всероссийской 75 итоговой студенческой научной конференции Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты - Самара, 2007. - С. 3. Бортникова, Н.А. Влияние силистронга на окислительновосстановительный метаболизм лимфоцитов / Н.А. Бортникова, Н.Т.
Аюпова // Сборник материалов II Всероссийской 76 итоговой студенческой научной конференции Студенческая наука и медицина XXI века:
традиции, инновации и приоритеты. - Самара. - 2008. - С. 31.
4. Бортникова, Н.А. Изучение экспрессии генов под воздействием ингибитора рецепторов эпидермального фактора роста канертиниба в условиях in vitro / Н.А. Бортникова // Вестник РГМУ. - Москва. - 2009. - № 3 - с. 25. Колотьева, Н.А. Модифицирующее влияние малых молекул на белоклигандное взаимодействие / Н.А. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С.
Нефедова, Е.А. Рыскина, А.А. Епифанова, К.И. Колесова, О.А. Долгова // Тезисы II международной научно-практической конференции Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика. - Новосибирск. - 2011. - с. 26. Гильмиярова, Ф.Н. Прогнозируемая биологическая активность антигенных детерминант АВ0 системы крови / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Н.А. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, Е.А. Рыскина, А.А.
Епифанова, А.В. Бабичев // Альманах Жизнь плюс наука.
Интернализация и инновации. - Вып. 7. Самара: ООО Книга. - 2011. - с.
24-28.
7. Гильмиярова, Ф.Н. Метаболическое зондирование и компьютерное моделирование в изучении структурно-функциональных особенностей антигенов Н, А, В / Ф.Н. Гильмиярова, Е.А. Рыскина, В.М. Радомская, Н.А.
Бортникова, Е.А. Гамзова, А.А. Епифанова, Ю.В. Мякишева // Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований: материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине. - Омск: Изд-во ОмГМА. - 2011. - с. 74-8. Гильмиярова, Ф.Н. Отличительные признаки антигенов системы АВ0 - основа индивидуального ответа на различные стимулы / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Рыскина, Н.А. Бортникова, Е.А. Гамзова, А.А.
Епифанова // Клиническая лабораторная диагностика. - Москва. - 2011.
- № 10. - с.9. Колотьева, Н.А. Влияние лактата на антиген-антительное взаимодействие / Н.А. Колотьева // Материалы докладов Всероссийской конференции с международным участием Молодые ученые - медицине. - Самара. - 2011. - с. 208-210. Шахнович, Е.А. Группоспецифические особенности лигандного взаимодействия под влиянием силистронга / Е.А. Шахнович, Н.А.
Колотьева, Н.С. Нефедова, Е.А. Рыскина, А.А. Епифанова, О.И.
Мелешкина, О.А. Долгова, Е.И. Кобзева // Здоровье и образование в XXI веке. Инновационные технологии, модернизация, качество, доступность и безопасность лекарственных средств в системе здравоохранения современной России. Школа формирования принципов здорового образа жизни. - Москва.: РУДН. - 2011. - с. 510-511. Гильмиярова, Ф.Н. Метаболический профиль 0(I) - AB(IV) групп крови / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, Н.А.
Колотьева, Е.А. Рыскина, А.А. Епифанова // Медицинский альманах. - Н.Новгород. - 2012. - № 1 (20) - с.174 - 178.
12. Колотьева, Н.А. Роль малых молекул в реализации белок-белковых взаимодействий / Н.А. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.С. Нефедова, Е.И.
Кобозева, Е.Д. Волков, Е.А. Рыскина // Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии: сборник трудов II Международной Интернетконференции. - Казань: изд-во Казанский университет. - 2012. - с.152113. Колотьева, Н.А. Прогнозирование спектра биологической активности пирувата / Н.А. Колотьева, И.А. Савельев, Е.И. Кобозева // Материалы докладов XVII Всероссийской научно-практической конференции Молодые ученые в медицине, 86-я Всероссийская научная конференция памяти член-корреспондента АН РТ, профессора И.Г. Салихова. - Казань. - 2012.
14. Гильмиярова, Ф.Н. Оценка полиморфизма АВ0- и резус- систем крови доноров / Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, О.А. Гусякова, А.А.
Епифанова, Е.А. Рыскина, И.Ф. Сидорова, Е.А. Шахнович, Н.А. Колотьева, Н.С. Нефедова, О.А. Николаева, А.А. Чудинова, Е.И. Кобозева // XVI Международная научная конференция Здоровье семьи в XXI веке Будапешт (Венгрия). - 2012. - с. 70-15. Гильмиярова, Ф.Н. Оценка иммуногенетических особенностей донорской крови / Ф.Н. Гильмиярова, Е.А. Шахнович, Н.А. Колотьева, Н.С. Нефедова, И.Ф. Сидорова, А.А. Епифанова, Н.И. Гергель // Клиническая лабораторная диагностика. - Москва. - 2012. - № 9. - с. 16. Мурский, С.И. Программа для импорта данных, полученных с биохимического анализатора COBAS INTEGRA 400 Plus / С.И. Мурский, О.А. Гусякова, И.А. Зубова, Е.Е. Воронкова, Н.А. Бортникова, Е.С.
ипатова, Е.А. Рыскина и др. // Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2010611397 от 17 февраля 2012 г.
Малые молекулы в изучении особенностей белок-белковых взаимодействий Колотьева Наталия Александровна (Россия) В данной работе было проведено изучение влияния пирувата на белокбелковое взаимодействие. Получен блок новых данных, раскрывающих биологическую вариабельность показателей углеводного обмена и его регуляторов, обусловленную групповой принадлежностью крови. Получены сведения о возможной биологической активности пирувата, обусловленной его химической структурой.
Выявлено, что пируват оказывает разнонаправленное влияние на взаимодействие антигенов и антител системы АВ0, вызывая увеличение времени наступления и уменьшение степени агглютинации эритроцитов, ускорение образования антиген-антительных комплексов моноклональных антител с антигенами А и В.
Впервые с целью количественной оценки и визуализации результатов взаимодействия антигенов и антител при введении малых молекул в систему использован метод проточной цитофлуориметрии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Выявлено разнонаправленное действие пирувата на экспрессию антигенных детерминант, изменение размера агглютинатов, уменьшение их количества.
Small molecules in research of protein-protein interactions Nataliya Koloteva (Russia) In this work the influence of pyruvate on protein - protein interaction was studied. The block of the new data opening biological variability of indexes of carbohydrate metabolism and its regulators, caused by AB0 blood group accessory was received. Evidences of the possible biological effects of pyruvate caused by its chemical structure were obtained.
It was revealed that pyruvate shows multidirectional influence on interaction of antigens and antibodies of AB0 system, increasing the time of approach and decreasing the extent of agglutination of erythrocytes, formation acceleration of antigen-antibody complexes of monoclonal antibodies with antigens A and B.
For the first time for the purpose of the quantitative assessment and visualization of results of interaction of antigens and antibodies at injection of small molecules in system the method of a Flow Cytofluorometry and a Laser Scanning Confocal Microscopy was used. Multidirectional action of a pyruvate on an expression of an antigen determinant, a dimensional change of agglutinates, decrease of their quantity was revealed.
КОЛОТЬЕВА НАТАЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ В ИЗУЧЕНИИ ОСОБЕННОСТЕЙ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Подписано в печать 19 октября 2012 г. Тираж 100 экз. Заказ № 7Отпечатано на ризографе. Формат 60х85/Объем 1,5 услов.печ.л. Уч.-изд.л. 1,Типография Клиник Самарского государственного медицинского университета 443089, г. Самара, пр. Карла Маркса, 165 б.