Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

На правах рукописи

Афанасьева Ольга Ильинична

ИПОПРОТЕИД(а) И ПОЛИМОРФИЗМ АПОБЕЛКА(а) КАК ФАКТОРЫ РИСКА АТЕРОСКЛЕРОЗА И ЕГО ОСЛОЖНЕНИЙ

03.01.04. - Биохимия 14.01.06 - Кардиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА - 2011

Работа выполнена в лаборатории проблем атеросклероза института экспериментальной кардиологии и отделе проблем атеросклероза института клинической кардиологии ФГУ РК НПК МЗ и СР РФ.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, Покровский Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ланкин Вадим Зиновьевич доктор медицинских наук, профессор Денисенко Александр Дорофеевич доктор медицинских наук, профессор Аронов Давид Меерович

Ведущая организация: Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Защита состоится л14 сентября 2011 года в 13.30 на заседании специализированного совета Д 208.073.01 по присуждению ученой степени доктора наук при РКНПК МЗ РФ (121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д.15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ.

Автореферат разослан л____ _________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н. В.Е.Синицын История вопроса и актуальность проблемы. Согласно современным представлениям атеросклероз рассматривается как полигенное заболевание, связанное с хроническим очаговым поражением крупных и средних артерий в результате отложения и накопления в интиме артерий атерогенных липопротеидов, сопровождающееся структурно-клеточными изменениями и разрастанием соединительной ткани с образованием фиброзных бляшек в сосудистой стенке. Атеросклероз является основной причиной сердечнососудистых заболеваний (ССЗ), лидирующих в структуре смертности и нетрудоспособности населения, как в России, так и за рубежом. Согласно липидной гипотезе атеросклероза [Аничков 1905], высокий уровень холестерина апоВ содержащих липопротеидов, приводит к возникновению и развитию атеросклеротического поражения артериального русла. Дислипопротеидемия является ключевым фактором риска развития атеросклеротического процесса не только в нативных коронарных артериях (КА), но и в аутовенозных шунтах [Lie et al 1977]. Несмотря на успехи современной медикаментозной терапии, более чем у половины больных ишемической болезнью сердца (ИБС) сохраняется остаточный риск сердечно-сосудистых осложнений (ССО) [Chapman et al 2010].

Поиск и определение роли новых факторов риска возникновения и развития атеросклероза, целью предотвращения ССО, является актуальной задачей современных научных исследований. Липопротеид(а) [Лп(а)] представляет собой сложный надмолекулярный комплекс, состоящий из ЛНП подобной частицы, у которой молекула белка апоВ100 связана дисульфидной связью с молекулой апобелка(а) [апо(а)]. Апо(а) встречается только у человека и высших приматов и обладает высокой гомологией с основным проферментом фибринолитической системы - плазминогеном [McLean et al 1987]. Подобно молекуле плазминогена, апо(а) состоит из крингл-доменов, но в структуре апо(а) имеется только сигнальный и неактивный протеазный домены, V крингл, а также множество повторов IV крингла. Ген апо(а) кодирует 10 различных типов IV крингла (K IV), отличающихся аминокислотной последовательностью. Количество повторов IV крингла 2-го типа (K IV2) варьируется от 3 до 40, остальные типы K IV присутствуют в молекуле апо(а) в единственном числе [Koschinsky et al 1990].

Несмотря на открытие Лп(а) более 40 лет назад его физиологическое значение, а также механизм участия в атерогенезе остаются не ясны. Благодаря особенностям своей структуры, Лп(а) может являться связующим звеном в процессах тромбо- и атерогенеза. Также не решен вопрос о клинической значимости данного липопротеида и не найдены способы его эффективной коррекции. Наличие полиморфизма Лп(а), генетическая детерминированность и значимые этнические различия в распределении Лп(а), а также остающийся открытым вопрос о роли Лп(а) как причинного фактора риска атеросклероза определяют актуальность изучения роли изоформ апо(а) в развитии атеросклероза и, в частности, ИБС, в сравнении с классическими факторами риска и концентрацией Лп(а) [Erque et al 2010]. Вместе с тем, разработка методов эффективной коррекции уровня Лп(а) позволит оценить роль частицы Лп(а) в развитии атеросклероза и улучшить прогноз больных ИБС. Согласно Консенсусу экспертов Европейского общества по атеросклерозу, дальнейшие усилия на международном уровне должны быть направлены на оценку в различных этнических группах атеротромботического риска, обусловленного частицей Лп(а), с одной стороны, и апо(а), с другой стороны [Nordestgaard et al 2010].

Представленная работа посвящена решению этой актуальной проблемы - изучению роли Лп(а) и полиморфизма апо(а) как факторов риска атеросклероза и разработке методов коррекции повышенной концентрации Лп(а).

Целью работы явилось определение значимости концентрации Лп(а) и полиморфизма апобелка(а) как независимых факторов риска атеросклероза и его осложнений.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать препаративные методы выделения Лп(а) из плазмы крови человека и специфических антител к Лп(а), отвечающих поставленным в работе методическим задачам - получению антигена для иммунизации, созданию аффинных сорбентов, разработке иммунохимических методов исследования Лп(а).

2. На основе полученных препаратов разработать методы определения концентрации Лп(а) и изоформ апо(а).

3. Изучить распределение изоформ апо(а) и концентрации Лп(а) у здоровых доноров и больных с ССЗ.

4. Исследовать связь Лп(а) с традиционными факторами риска атеросклероза.

5. Оценить влияние полиморфизма апо(а) и концентрации Лп(а) на прогноз больных ИБС.

6. Разработать специфический иммуносорбент и исследовать клиническую эффективность экстракорпоральных методов снижения концентрации Лп(а) с использованием оригинальных сорбционных технологий.

Научная новизна: Впервые определена значимость полиморфизма апо(а) в возникновении атеросклероза различных локализаций независимо от других факторов риска и концентрации Лп(а), что позволяет говорить о достоверно большей атерогенности частиц Лп(а), содержащих низкомолекулярные (НМ) изоформы апо(а). Впервые показана связь НМ изоформ апо(а) и концентрации Лп(а) с развитием окклюзий аутовенозных шунтов после операций реваскуляризации миокарда. Показана прогностическая значимость концентрации Лп(а) и изоформ апо(а) у больных ИБС. Разработаны новые оригинальные методы снижения концентрации Лп(а) в плазме крови человека с использованием сорбционных технологий и показана их клиническая эффективность. Впервые в эспериментах in vitro и ex vivo проведено сравнение экстракорпоральных методов удаления Лп(а) из плазмы крови человека. Разработанный специфический иммуносорбент к Лп(а) обладает высокой эффективностью и способен удалять Лп(а) не оказывая влияния на другие компоненты плазмы крови человека.

Впервые описан алгоритм, позволяющий оптимизировать проведение процедур терапевтического афереза липидов в зависимости от индивидуального липидного профиля пациента. Разработан лабораторный прототип отечественной тестсистемы для определения концентрации Лп(а) в плазме/сыворотке крови человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана методологическая платформа препаративного выделения Лп(а) и высокоспецифических поликлональных антител к Лп(а), а также определения концентрации Лп(а) и изоформ апо(а) в плазме или сыворотке крови человека.

Создан лабораторный прототип отечественной тест-системы для определения концентрации Лп(а) с высокой чувствительностью и воспроизводимостью тестов.

2. Подтверждена обратная связь между концентрацией Лп(а) и размером изоформы апо(а) (r=0,57, p<0,0001), независимо от наличия или отсутствия атеросклероза. Показано, что концентрация Лп(а)30 мг/дл и низкомолекулярные изоформы апо(а) встречаются у больных с атеросклеротическими поражениями различных сосудистых бассейнов в 1,5 - 2,0 раза чаще, чем у лиц без атеросклероза и здоровых доноров.

3. Полиморфизм апо(а) определяет участие Лп(а) в процессе атерогенеза, независимо от других факторов риска и концентрации Лп(а), а также определяет преждевременное развитие ИБС.

4. Наличие НМ изоформ апо(а) является предиктором наличия, тяжести и распространенности атеросклеротических поражений в коронарных, сонных, периферических артериях, а также мультифокального атеросклероза, независимо от других факторов риска и концентрации Лп(а).

5. Показана независимая связь НМ изоформ апо(а) и концентрации Лп(а) с неблагоприятным прогнозом у больных ИБС и развитием окклюзий аутовенозных шунтов после операции реваскуляризации миокарда.

6. С использованием оригинальных сорбционных технологий разработан метод коррекции Лп(а), позволяющий с высокой эффективностью и безопасностью удалять Лп(а) из плазмы крови человека.

Научно-практическая значимость работы. Показана большая атерогенность частиц Лп(а) содержащих низкомолекулярные изоформы апо(а). Наличие НМ изоформ апо(а) является фактором риска атеросклероза коронарных, сонных и артерий нижних конечностей, независимо от других факторов риска и концентрации Лп(а). Определена значимость полимофизма апо(а) и концентрации Лп(а) для развития ИБС у лиц молодого и среднего возраста.

Показана достоверная связь повышенного уровня Лп(а) с риском развития различных клинических форм атеросклеротических поражений, а также с риском окклюзии венозных шунтов после проведения операции аорто-коронарного шунтирования. Использование колонок Лп(а) Липопако впервые в мировой практике позволило получить данные о клинической эффективности специфического удаления Лп(а) у больных ИБС с повышенной концентрацией Лп(а), и на их основании продемонстрировать непосредственное участие частиц Лп(а) в формировании атеросклеротических поражений.

Разработан метод количественного определения Лп(а) в плазме/сыворотке человека. Разработанные методики определения концентрации Лп(а) и изоформ апо(а) в плазме и сыворотке крови внедрены в научно-практическую работу ФГУ РКНПК МЗ СР и РФ. Препаративные методы выделения Лп(а) и специфических Ат к Лп(а) используются при производстве колонок Лп(а) Липопако.

Иммуносорбционные колонки Лп(а) Липопако рекомендованы к применению и используются в лечебно-профилактических учреждениях России и Европейского сообщества для специфического удаления Лп(а) из плазмы крови человека для лечения больных ИБС с повышенной концентрацией Лп(а) (регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05784 и EC Certificate № 080061 QS/NB/a).

Апробация работы: По материалам диссертации опубликовано 100 печатных работ, из них 69 в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.

Различные разделы работы с 1993 года были широко представлены и обсуждены на многих отечественных и международных симпозиумах, конференциях и конгрессах, в том числе: Симпозиуме Липопротеиды и атеросклероз (СанктПетербург 1995); 4,11,13 конференциях Московского Общества гемафереза (Москва 1996, 2003, 2005); 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза (Москва 1999); II Конгрессе ассоциации кардиологов СНГ (Бишкек 1999); Симпозиуме Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза ассоциации кардиологов СНГ (Москва 2000); 8 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва 2002); Российском национальном конгрессе кардиологов (Санкт-Петербург 2002, Москва 2006, 2009, 2010);

Конференции Терапевтический аферез - итоги и перспективы (Санкт-Петербург 2003); Научно-практической конференции Актуальные вопросы экстракорпоральной терапии (Москва 2007); X,XI,XII,XIII,XV International Symposium on Atherosclerosis (Монреаль 1994, Париж 1997, Стокгольм 2000, Киото 2003, Бостон 2009); 73, 74, 75, 76, 78 Конгрессах European Atherosclerosis Society (Утрехт 1995, Зальцбург 2002, Прага 2005, Хельсинки 2007, Гамбург 2010); 5,7 Int. Symposium Multiple Risk Factors in Cardiological Disease (Венеция, 1999, 2008); International Congress on Heart Disease (Вашингтон 1999);10,11,12,13,14 и объединенном с DGTI Конгрессах European Society for Haemapheresis (Вена 1995, Дижон 1997, Мальмо 1999, Рива дел Гарда 2001, Прага 2003, Дюссельдорф 2008), 9 Dresden Lipid Symposium (Дрезден1997); Конгрессе European Society for Artificial Organs (Вена 1995); International Society for Apheresis (Киото 1996, Саарбрукен 1999, Нэшвилл 2003, Росток 2005);

XIII,XIV Int. Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism (Флоренция 1998, Нью-Йорк 2001); 5,6,7,9 Конгрессах World Apheresis Association (Хьюстон 1994, Флоренция 1996, Париж 2002, Майями 2004), объединенном конгрессе WAAISFA (Буйнос-Айрес 2009).

Апробация докторской диссертации состоялась на заседании Ученого Совета ИЭК ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ 12 апреля 2011 г.

Структура работы: диссертация состоит из семи разделов: введения; обзора литературы, посвященного рассмотрению широкого круга вопросов, связанных с изучением структуры Лп(а) и возможной роли его в атерогенезе, связи Лп(а) с ССЗ, а также методов коррекции Лп(а), материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение липопротеидов (ЛП) и Лп(а) плазмы крови человека проводили по модифицированной методике, основанной на дифференциальном ультрацентрифугировании в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли NaBr [Афанасьева О.И. 1992].

Иммунизация животных-доноров для получения антител (Ат) включала первичную иммунизацию увеличивающейся дозой антигена с последующей реиммунизацией. Для получения моноспецифических Ат к Лп(а) антисыворотку истощали на сорбенте с иммобилизованными липопротеидами низкой плотности (ЛНП) [Адамова И.Ю. 1990], контролируя эффективность истощения по содержанию Ат к апоВ100 методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

Аффинные сорбенты с иммобилизованными на агарозную матрицу ЛП и Ат получали согласно описанному ранее способу [Афанасьева 1991, 1993, Pokrovsky 1992].

Чистоту белковых препаратов и Лп(а) тестировали методами электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях, в геле агарозы, иммуноэлектрофорезом, и радиальной иммунодиффузией. Специфичность выделенных Ат исследовали методами: ИФА, иммуноблотинга, двойной радиальной иммунодиффузии.

Концентрацию параметров липидного спектра (общий холестерин (ОХС), ХС ЛНП, ХС липопротеидов высокой плотности (ЛВП), триглицеридов (ТГ)), а также апобелков АI и В100, определяли ферментативным и иммунотурбидиметрическим методами с использованием коммерческих наборов Biocon и Boehringer Mannheim (Германия), Витал Диагностик (Россия).

Показатели фибринолиза у больных были измерены методом ИФА с использованием наборов компании Technoclone (Австрия) в лаб. атеротромбоза (рук. - проф. Панченко Е.П.).

В исследование клинической значимости полиморфизма апо(а) и концентрации Лп(а) в развитии атеросклероза были включены 100 здоровых доноров и 8пациентов в возрасте от 21 до 84 лет, которые прошли стационарное или амбулаторное обследование в отделе проблем атеросклероза НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова (рук. - член. корр. РАМН, проф. Кухарчук В.В.) с 1993 по 2010 г, и имеющие данные инструментального исследования коронарных и/или сонных и/или артерий нижних конечностей (НК).

Из исследования исключались больные с наличием острого инфаркта миокарда (ИМ) или нестабильной стенокардией; перенесшие оперативные вмешательства менее чем за 1 месяц до исследования; с выраженной дисфункцией печени, почек и щитовидной железы; хронической сердечной недостаточностью III-IV функционального класса (ФК) согласно классификации NYHA. Кроме того, исключали больных, которые в момент исследования принимали гормональные препараты, некоторые липотропные средства (никотиновая кислота, фибраты, омега-3 ненасыщенные жирные кислоты) и больных, которым проводили экстракорпоральные методы лечения ввиду их возможного влияния на уровень Лп(а).

Коронароангиография (КАГ) была выполнена у 562 больных. Ультразвуковое дуплексное сканирование сонных артерий (СА) было проведено 584 пациентам, сосудов НК - 588 пациентам (отдел новых методов диагностики и исследований, рук. - проф. Рогоза А.Н.). Инвазивные процедуры выполнялись в лаб.

рентгенологии и ангиологии (рук. - проф. Савченко А.П.) и лаб. рентгеноэндоваскулярных методов лечения (рук.- проф. Самко А.Н.).

Коронарный атеросклероз верифицировали при наличии стеноза >50% по диаметру в одной или более из магистральных артерий. Тяжесть поражения выражали в количестве сосудов, имеющих гемодинамически значимые (>50%) стенозы. Степень уменьшения просвета 15 основных сегментов КА рассчитывали в соответствии с рекомендациями Американской Ассоциации сердца.

Распространенность атеросклеротического поражения КА выражали как индекс стенозов, рассчитанный как сумма баллов по 15 сегментам. Толщина комплекса интима-медия (ТИМ) общих сонных артерий считалась в пределах нормы при нахождении ее в диапазоне 0,9-1,3 мм. При выявлении утолщения стенки сосуда > 20% по диаметру диагностировали атеросклеротические бляшки.

Гемодинамически значимым считалось уменьшение просвета (диаметра) сосуда на 50% и более. Диагноз перемежающая хромота (ПХ) I-III функционального класса по классификации Фонтена ставился при наличии клиники ПХ, подтвержденной положительным результатом тредмил-теста, и ультразвуковой допплерографией сосудов НК.

Изучение связи Лп(а) с окклюзией аутовенозных шунтов было проведено совместно с отделом сердечно-сосудистой хирургии (рук. - акад. РАМН, проф.

Акчурин Р.С.) на группе 102 мужчин в возрасте от 28 до 68 лет (52,3 8,6) с ИБС после операции КШ и с появлением болевых симптомов в течении 1-го года после операции (среднее время 5,3 3,0 месяцев). Критерии исключения были аналогичны описанным выше. Всем больным была выполнена шунтография методом электронно-лучевой томографии в отделе томографии (рук. - акад.

РАМН Терновой С.К.) В исследование клинической эффективности Лп(а) афереза были включены больные ИБС, верифицированной данными КАГ, уровнем Лп(а) более 60 мг/дл, ОХС не более 6,5 ммоль/л, ХС ЛНП не более 4,1 ммоль/л. Процедуры Лп(а) афереза проводили в отделе гемодиализа и плазмафереза (рук. - член. корр.

РАМН, проф. Кухарчук В.В.), в клинике ОБП УДП РФ (рук. Чебышев А.А.) и отделении кардиологии с центром экстракорпоральных методов лечения клиники МЕДСИ (рук. - проф. Коновалов Г.А.), а также в клинике Люденшайда (Германия).

Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью пакетов прикладных статистических программ STATISTICA (v.8.0) и Med Calc 9.3.1.0.

При сравнении показателей между группами использовали критерий t Стьюдента или Вилкоксона. Для сравнения частотных данных в группах применяли критерий Пирсона и точный критерий Фишера. Корреляционный анализ по Спирмену и Пирсену, а также множественный регрессионный анализ использовали при изучении связи между исследуемыми параметрами. Для сравнения значимости влияния различных факторов риска на течение атеросклероза рассчитывали отношение шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал (ДИ). Метод кривых операционных характеристик использовали для определения порогового уровня Лп(а) и изоформ апо(а) как диагностических показателей наличия атеросклероза различных сосудистых бассейнов. При анализе выживаемости применяли метод Каплана-Мейера; лог-ранговый тест использовали при сравнении кривых.

Пороговый уровень статистической значимости был принят <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1. Разработка препаративных методов выделения Лп(а) и получения антител к Лп(а).

1.1. Разработка методов выделения Лп(а). В нашей работе препарат Лп(а) использовался в качестве антигена для иммунизации животных-доноров, лиганда для приготовления аффинных колонок, а также калибратора при разработке количественных методов определения Лп(а).

Исследование флотации Лп(а) показало, что наличие апо(а) сдвигает границы плавучей плотности Лп(а) в интервал, перекрывающий диапазоны флотации ЛВП и ЛНП. Также незначительное количество апо(а) присутствует в свободном виде в плотности более 1,21 г/см3 и во фракции липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП). Вследствие содержания Лп(а) в плазме значительно меньшем, чем ЛНП, мы модифицировали с целью масштабирования метод, основанный на дифференциальном ультрацентрифугировании плазмы крови человека в градиенте нейтральной соли NaBr, а затем разработали методы, позволившие снять ограничения по количеству получаемых препаратов [Афанасьева О.И. и соавт. 1992]. Наиболее перспективным для выделения препаративных количеств Лп(а) являлся метод с использованием иммуносорбента специфичного к Лп(а) [Афанасьева О.И. и соавт. 1991]. Такой способ был лишен недостатков, присущих методам, включающим стадию ультрацентрифугирования и позволял варьировать количество выделяемого препарата в зависимости от конкретной задачи.

Характеристика выделенных препаратов показала, что образцы Лп(а) получаемые как методом двухступенчатого ультрацентрифугирования с последующей гельфильтрацией, так и при помощи аффинной хроматографии, представляют собой высокоочищенный Лп(а), обладающие характерной для этой частицы электрофоретической подвижностью и практически не содержат примесей липопротеидов других классов и белков плазмы крови человека (рис.1.).

1.2. Разработка препаративных методов получения специфических антител барана к Лп(а) человека. Особенности структуры апо(а) и частицы Лп(а), такие как высокая гомология апо(а) с плазминогеном, конформационные изменения в апо(а) при восстановлении дисульфидных связей внутри крингловых структур при использовании SH реагентов, наличие в частице Лп(а) двух апобелков - апоВ100 и апо(а), связанных между собой ковалентной дисульфидной связью по остаткам цистеинoв [Brunner et al 1993, Callow et al 1995], определяют основные направления в выборе методов получения специфических Ат к Лп(а).

В качестве антигена для получения антисыворотки использовали препарат Лп(а), выделенный методом двухступенчатого ультрацентрифугирования в градиенте нейтральной соли NaBr с последующей гель-фильтрацией. В результате получали антисыворотку, специфичную к двум апобелкам - апо(а) и апоВ100.

Рисунок 1 - Характеристика препаратов Лп(а), выделенных методом двухступенчатого ультрацентифугирования с последующей гель-фильтрацией и методом аффинной хроматографии из плазмы крови человека.

(а) Электрофорез в 0,5% геле агарозы. 1 - ЛОНП, 2 - ЛНП, 3 - ЛВП, 4- Лп(а).

(б) Результаты аналитического ультрацентрифугирования. Скорость вращения ротора 340об/мин, плотность растворителя (NaBr) - 1,090 г/см3, температура 20о С. Снимок сделан через 180 мин после достижения максимальной скорости вращения ротора.

(в) Электрофорез в денатурирующих условиях препарата Лп(а), выделенного методом дифференциального ультрацентифугирования и гель-фильтрации. Линейный градиент 3-15% полиакриламидного геля (ПААГ), 1% SDS, в лунку внесено 2-5 мкг белка. 1- Лп(а) без обработки SH-реагентом, 2- белки-маркеры; 3 - препарат Лп(а), после обработки SH реагентом.

г) Электрофорез в денатурирующих условиях препарата Лп(а), выделенного методом аффинной хроматографии. Линейный градиент 3-15% полиакриламидного геля (ПААГ), 1% SDS, в лунку внесено 2-5 мкг белка. 1- белки-маркеры; 2 - препарат Лп(а) без обработки SH реагентом.

Для выделения Ат, специфичных к Лп(а), были исследованы 4 подхода: метод 1 - выделение фракции иммуноглобулинов (Ig) из истощенной антисыворотки с использованием сульфатного фракционирования с последующей ионно-обменной хроматографией [Адамова и соавт. 1990], метод 2 - только с использованием сульфатного фракционирования, метод 3 - с использованием аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованными Лп(а) (рис. 2) и метод 4 - с использованием хроматографии на сорбенте с иммобилизованными антиидиотипическими Ат к Лп(а).

а б Рисунок 2 - Схема выделения, разработанная для получения препаративных количеств специфических Ат к Лп(а) и характеристика Ат. а - схема препаративного метода выделения специфических Ат к Лп(а), б - кривые титрования препарата Ат методом ИФА.

На плашки иммобилизованы Лп(а) - 5 мкг в лунку, ЛНП - 1 мкг белка апоВ100 и плазминоген по 5 мкг белка в лунку. в - электрофореграмма препарата Ат против Лп(а). Электрофорез в условиях восстановления дисульфидных связей. Линейный градиент 5-15% ПААГ, 1% SDS, в лунку внесено 10 мкг белка в условиях восстановления дисульфидных связей. 1- препарат Ат, 2- белки-маркеры;

Три способа получения специфических Ат к Лп(а) основаны на выделении Ат из сыворотки, истощенной по Ат к апоВ100. Ат к апоВ100 удаляли методом колоночной хроматографии на сорбенте с иммобилизованными ЛНП, полученными из плазмы пациентов, не содержащих Лп(а). Ряд авторов для истощения антисыворотки по Ат к апоВ100 проводят преципитацию Ат, добавляя 0,5 - 1,0 мг белка ЛНП на 1 мл антисыворотки 6-кратно [Alberts et al 1974].

Предложенное нами использование аффинной хроматографии на ЛНП-агарозе было предпочтительнее, поскольку позволяло избежать постоянного выделения препаративных количеств ЛНП, не содержащих примеси Лп(а) за счет многократного использования аффинного сорбента [Адамова И.Ю. 1990].

Специфичность полученной антисыворотки контролировали методом разработанного ИФА после каждого цикла истощения. Для полного истощения антисыворотки по Ат к апоВ100 проводили многократное истощение на ЛНПагарозе, необходимое вследствие различий в иммунореактивности апоВ100, входящих в состав Лп(а) и ЛНП.

Метод 1 позволял получить высокоочищенный препарат иммуноглобулинов G (IgG) с выходом не более 70% и вносил незначительные ограничения по количеству получаемого препарата Ат за счет стадии ионно-обменной хроматографии. Разработанный метод 2 доказал возможность получения очищенных препаратов Ат барана с использованием только двухступенчатого фракционирования насыщенным раствором сульфата аммония. Такая схема выделения Ат полностью снимала любые ограничения для масштабирования процесса получения Ат, сохраняя высокое качество выделяемых препаратов.

Единственным недостатком было присутствие в препарате неспецифических Ig барана. Удельное содержание специфических Ат к Лп(а) варьировалось от 30 до 50%, в зависимости от серии сыворотки и индивидуальных особенностей иммунного ответа животного - донора. Метод 3, основанный на выделении специфических Ат с использованием аффинной хроматографии истощенной по Ат к апоВ100 антисыворотки или сульфатной фракции на сорбенте с иммобилизованным Лп(а), позволил получить высокоочищенный препарат Ат, специфичных только к апо(а) (рис. 2б и 2в).

Изменение иммунореактивности апо(а) вследствие конформационных изменений за счет восстановления внутрицепочечных дисульфидных связей в крингловых доменах при обработке SH-реагентами ограничивало использование апо(а) в качестве антигена. В рамках метода 4 предположили, что использование антиидиотипических Ат позволит разработать одностадийный препаративный метод для выделения специфических Ат к апо(а). Использование антиидиотипических Ат дает возможность воспроизводить антигенные детерминанты (эпитопы) тех антигенов, которые невозможно на данный момент воссоздать с помощью генной инженерии. Антиидиотипические Ig барана к апо(а) человека, были получены иммунизацией животного-донора высокоочищенным препаратом моноспецифических Ат к Лп(а) той же видовой специфичности.

Основным преимуществом данной схемы выделения Ат являлось отсутствие стадии истощения антисыворотки по антителам к апоВ100. Количество анти-Лп(а) Ат, получаемых из 1 мл сыворотки при использовании методов 1, 3 и 4 составили 2,51,0, 0,5 0,2 и 0,3 0,1 мг белка, соответственно. Удельная активность таких Ат, равная величине оптического сигнала (о.е.) деленная на количество белка Ig (мг) варьировала в несколько раз (рис.3). Максимальная иммунохимическая активность регистрировалась у Ат, полученных методом аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованными Лп(а).

Таким образом, нами были разработаны несколько препаративных методов для получения высокоспецифичных Ат к Лп(а) не обладающих перекрестным взаимодействием с апобелками В100 и АI, а также другими компонентами плазмы крови человека.

Рисунок 3 - Удельная активность анти-Лп(а) Ат, полученных разработанными 16методами.

14(1) аффинной хроматографией истощенной антисыворотки на 12Лп(а)-агарозе - (метод 3), 10(2) - сульфатным фракциони8рованием истощенной антисыворотки с последующей 6ионообменной хроматографией 4(метод 1), (3) - аффинной 2хроматографией антисыворотки на сорбенте с препарат 1 препарат 2 препарат 3 отр.

иммобилизованными антиконтроль идиотипическими Ат к Лп(а) (метод 4), отрицательный контроль - IgG барана, не подвергавшегося иммунизации.

Вывод: разработаны оригинальные препаративные методы выделения Лп(а) и моноспецифических поликлональных антител барана против Лп(а) человека.

Глава 2. Разработка методов определения концентрации Лп(а) и изоформ апо(а) в плазме или сыворотке крови человека.

2.1. Разработка методов определения концентрации Лп(а) в плазме и сыворотке крови человека. В процессе проведения исследования с использованием полученных поликлональных (Пк) Ат к Лп(а), а также моноклональных (Мк) Ат к апоВ100 были разработаны три метода количественного определения Лп(а): радиальной иммунодиффузии по Манчини (РИД), и два метода ИФА (рис.4).

Рисунок 4 - Схема твердофазного ИФА для количественного определения Лп(а) в плазме или сыворотке крови человека. (а) - на плашке в качестве сорбирующих ПкАт к Лп(а) ланти-Лп(а) в качестве проявляющих - МкАт к апоВ100 лантиапоВ100), конъюгированные с пероксидазой.

(б) - на плашке в качестве сорбирующих и проявляющих Ат - моноспецифические ПкАт к Лп(а).

(о.е./мг белка) Удельная активность Ат к апо(а) Характеристики воспроизводимости (таб.1) и линейности методов РИД и ИФА, показали, что метод ИФА позволяет с более высокой точностью и воспроизводимостью измерять концентрацию Лп(а) в интервале от 2 до 200 мг/дл.

Наличие различного количества идентичных эпитопов в молекулах апо(а) в зависимости от количества повторов IV крингла типа 2 (K IV2), составляют основную сложность при разработке методов с использованием МкАт [Marcovina et al 1995]. ПкАт, в силу многообразия Ат к различным эпитопам, менее чувствительны к гетерогенности апо(а). Для проверки чувствительности разработанного сэндвич-ИФА с ПкАт к размеру апо(а) изоформы, использовали дизайн ИФА, принцип которого впервые описан Dac (1989), с использованием в качестве детектирующих, Ат специфичных к апоВ100 (рис. 4а ). Данный метод позволяет определять только апо(а), входящий в состав липопротеидного комплекса Лп(а), и практически не чувствителен к различиям в количестве повторов K IV2 апо(а). Регрессионный анализ двух методов ИФА (таб.2) доказал нечувствительность разработанного метода к размерам изоформ апо(а).

Таблица 1. Точность и воспроизводимость разработанных методов РИД и ИФА.

РИД ИФА Номер Концентрация Коэффициент Номер Концентрация Коэффициент образца Лп(а), мг/мл вариации,% образца Лп(а), мг/мл вариации,% Внутри плашки (n=3) Внутри плашки (n=6) 1 12,5 3,11,2 1,4 5 5,7 0,2 5,9 4,38,6 2,3 6 52,6 2,3 6,2 3,55,6 3,5 7 101,3 3,4 3,5 7,115,6 4,0 8 189,5 13,Между опытами (n=37) Между опытами (n=9) 1 31,5 14,11,2 3,5 5 5,4 0,2 19,3 9,40,8 7,9 6 50,3 4,3 16,2 7,56,8 9,2 7 110,2 8,4 11,6 10,111,1 12,9 8 177,5 18,n=количество опытов (в каждом опыте образцы измерены в трех параллелях).

Следует подчеркнуть, что в зависимости от фирмы-производителя диагностикума, условий хранения стандартов в диагностическом наборе и принципа, используемого в иммунологическом методе, результаты определения Лп(а) в одних и тех же образцах могут варьировать в очень широком диапазоне.

Процесс стандартизации референсных образцов для методов количественного определения Лп(а) ведется в мировой практике с 2000 года [Marcovina 2000]. Для приготовления калибровочных образцов мы использовали препарат Лп(а), содержащий несколько изоформ апо(а), первоначально в качестве референсного материала был использован стандарт Лп(а) фирмы Иммуно (Австрия).

Сравнительный анализ разработанных методов как между собой, так и с рядом коммерческих и лабораторных наборов для количественного определения Лп(а) позволял делать вывод о высокой точности и воспроизводимости получаемых данных (таблица 2).

Таблица 2. Сравнение разработанного метода сендвич ИФА с ПкАт к Лп(а) с коммерческими и лабораторными аналогами.

Аналог, использованный для Коэффициент Проявляющие и Уравнение сравнения корреляции детектирующие антитела регрессии (разработчик/ (95% ДИ), p производитель) 1 ПкАт барана против 0,98 (0,97-0,98), РИД (лаб. прототип) y=0,457+0,96х Лп(а) человека p<0.02 ИФА (Институт ПкАт кролика против 0,98 (0,95-0,99), генетики человека, Лп(а) и МкАт мыши y=-2,8+0,95x. p<0,00Инсбрук Австрия) против апо(а) 3 ИФА TintElisa ПкАт козы и МкАт 0,99 (0,96-0,99), Lp(a),лBiopool, y=3,8+1,00x, мыши против Лп(а) p<0,0Швеция 4 ИФА Progen ПкАт и Fab фрагменты 0,93 (0,89-0,96), Biotechnik GmbH, y=7,4+0,79x ПкАт козы против Лп(а) р<0,00Германия 2.2. Разработка метода фенотипирования апо(а). Предположение о том, что изоформы с низкой молекулярной массой апо(а) являются более атерогенными, тем самым влияя на свойства всей липопротеидной частицы, а также отсутствие коммерческих наборов для оценки полиморфизма апо(а), диктовали необходимость разработки метода фенотипирования Лп(а). За основу была взята методика, основанная на электрофоретическом разделении Лп(а) плазмы крови человека, предложенная проф. Utermann.

Совместная работа c институтом генетики Университета г. Инсбрук позволила провести фенотипирование ряда образцов, которые были использованы в качестве референсных для последующей разработки собственного метода. В отличии от описанного метода [Kraft et al 1988] в качестве детектирующих Ат были использованы аффинно-очищенные ПкАт барана к апо(а) человека, коньюгированные с пероксидазой. Сравнение результатов иммуноблотинга с использованием аффинно-очищеннных ПкАт и МкАт 1А2 (любезно представленных проф. Utermann, Инсбрук, Австрия), показало преимущество ПкАт для фенотипирования апо(а). Чувствительность метода составляла 4 мг/дл Лп(а). Для проведения последующего анализа, также как и в ряде других исследований, проводилось дихотомическое деление изоформ на низко- и высокомолекулярные изоформы. К низкомолекулярным изоформам (НМ) относили апо(а) с подвижностью S2 и более, к высокомолекулярным (ВМ) - с подвижностью S3 и менее (рис. 5а).

Таким образом был модифицирован и внедрен в научно-практическую деятельность лаборатории метод фенотипирования апо(а) (рис. 5 б), позволивший определять изоформы апо(а) в плазме (сыворотке) крови человека с высокой чувствительностью и воспроизводимостью. Сопоставление классификаций по подвижности, количеству повторов K IV2 и молекулярной массе апо(а) приведены на рисунке 5 в.

Рисунок 5 - Фенотипирование апо(а) методом SDS электрофореза в ПААГе с последующим иммуноблотингом. Разделяющий гель 6,6%, в качестве детектирующих Ат использованы аффинноочищенные ПкАт барана к апо(а) человека, коньюгированные с пероксидазой. а - классификация изоформ апо(а) по электрофоретической подвижности, б Цтипичный пример фенотипирования образцов плазмы крови пациентов с ИБС, в - сопоставление классификации изоформ по подвижности, количеству повторов K IVи молекулярной массе апо(а).

Вывод: Разработаны методы, позволяющие с высокой точностью и воспроизводимостью определять концентрацию Лп(а) и изоформы апо(а).

Глава 3. Распределение изоформ апо(а) и концентрации Лп(а) у здоровых доноров и больных ССЗ.

Для исследования значимости Лп(а) и полиморфизма апо(а) было проведено определение концентрации Лп(а) и фенотипирование апо(а) у 100 здоровых доноров и 817 обследованных пациентов у 717 из которых был верифицирован атеросклероз хотя бы в одном из трех сосудистых бассейнов - коронарном, каротидном или периферическом. Исследование концентрации Лп(а) у больных атеросклерозом (n=717) и здоровых доноров (п=100) показало, что более чем у 70% здоровых доноров уровень Лп(а) не превышал принятую границу нормы - мг/дл [НЛп(а)], тогда как концентрация свыше 30 мг/дл - гипер Лп(а) - [ГЛп(а)] достоверно чаще встречалась у пациентов с атеросклеротическими поражениями (рис. 6) Фенотипирование образцов сыворотки здоровых доноров, больных ССЗ с атеросклерозом и без атеросклероза показало, что НМ апо(а) в 60% случаев встечались у больных, имеющих атеросклеротическое поражение различных сосудистых бассейнов. Тогда как ВМ апо(а) встречались более чем у 70% здоровых доноров и пациентов без атеросклероза. Интересно, что мы не обнаружили достоверных различий в распределении концентрации Лп(а) и фенотипа апо(а) у мужчин и женщин в исследуемой группе пациентов.

Коэффициент корреляции между размером мажорной изоформы апо(а) и концентрацией в плазме варьировал от 0,54-0,58 p<0,0001, независимо от наличия или отсутствия заболевания.

% Концентрация Лп(а) мг/дл а б Рисунок 6 - Распределение концентрации Лп(а) у (a) здоровых доноров (n=100) и (б) больных с атеросклерозом (n=717). Пунктирная линия показывает кривую нормального распределения концентрации Лп(а).

Вывод: У больных с верифицированным атеросклерозом ГЛп(а) и НМ апо(а) встречаются в 2 раза чаще, чем у здоровых лиц и больных ССЗ без атеросклероза.

Глава 4. Связь полиморфизма апо(а) и концентрации Лп(а) с атеросклерозом различных локализаций.

В общей группе обследованных больных, включенных в исследование, максимальная связь с манифестацией атеросклероза хотя бы в одном из сосудистых бассейнов была обнаружена для НМ апо(а) (ОШ=3,2 (95% ДИ 1,85,6), p<0,0001), по сравнению с концентрацией Лп(а) (ОШ=2,9 (1,6-5,5) p<0,0001), мужским полом (ОШ=2,6 (1,6-4,1), p<0,0001), нарушением липидного обмена (ОШ=1,8 (1,0-3,0), p<0,005) и другими факторами риска. Проведенный корреляционный анализ показал отсутствие связи как концентрации Лп(а), так и полиморфизма апо(а) с классическими факторами риска атеросклероза и показателями липидного спектра.

Для определения связи полиморфизма апо(а) с атеросклерозом, вне зависимости от концентрации Лп(а), все больные были разделены на 4 группы в соответствии с концентрацией Лп(а) - НЛп(а) и ГЛп(а) и экспрессируемой изоформой апо(а) - ВМ и НМ апо(а). Больные (n=104), у которых ввиду низкого уровня или отсутствия апо(а) невозможно было определить изоформу апо(а), так называемый нулевой фенотип, были исключены из исследования. Между группами не было достоверных различий в распределении факторов риска и показателей липидного спектра (табл.3). Необходимо подчеркнуть, что различия в концентрации ХС ЛНП после расчета коррегированного уровня ХС ЛНП корр, учитывающего ХС, входящий в состав Лп(а), нивелировались.

Анализ степени выраженности атеросклеротического процесса по группам больных показал, что поражения двух и трех сосудистых бассейнов достоверно чаще встречались в группе больных с НМ апо(а) на фоне ГЛп(а), чем у больных с ВМ апо(а) и НЛп(а) (43 и 55% vs 30 и 12%, p=0,005, соответственно). У больных с ССЗ, но без атеросклеротического поражения любого из сосудистых бассейнов в 67% случаях наблюдалось сочетание НЛп(а) и ВМ апо(а).

Таблица 3. Клинические характеристики обследованных пациентов в зависимости от концентрации Лп(а) и изоформ апо(а).

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа НЛп(а) и ГЛп(а) и НЛп(а) и ГЛп(а) и ВМ апо(а) ВМ апо(а) НМ апо(а) НМ апо(а) n=287 n=101 n=71 n=2Пол (% ж) 93 (32%) 28 (28%) 17 (24%) 66 (26%) Возраст, лет 55,010,0 55,010,3 56,39,9 53,39,0* АГ 155 (54%) 54 (53%) 42(59%) 149(59%) Курение 122 (42%) 50 (50%) 37 (52%) 126 (50%) Ожирение 80 (28%) 18 (18%) 11 (15%) 53 (21%) Семейный анамнез 97 (34%) 38 (38%) 29 (41%) 107 (42%) Сахарный диабет 41 (14%) 11 (11%) 6 (8%) 18 (7%) Гиперлипидемия 237 (83%) 84 (83%) 64 (90%) 213 (84%) ОХС, ммоль/л 6,31,4 6,41,3 6,71,3 6,61,4* ТГ, ммоль/л 2,21,2 2,10,9 2,31,1 2,11,ХС ЛВП, ммоль/л 1,30,4 1,30,4 1,20,3 1,20,ХС ЛНП, ммоль/л 4,11,2 4,31,3 4,31,2 4,51,2* ХС ЛНПк, ммоль/л 4,01,2 3,91,3 4,21,2 3,81,Фибриноген, г/л 3,41,0 3,81,1* 2,80,8* 3,30,* р< 0,05 в сравнении с группой 1.

Следует обратить внимание, что ИБС в группе больных с ГЛп(а) и НМ апо(а) (группа 4) манифестировала в среднем на 4 года раньше, чем у пациентов с ВМ апо(а), как у мужчин, так и у женщин. Доля больных с ИБС в возрасте до 45 лет была в два раза выше в группе пациентов с НМ апо(а) и ГЛп(а), чем у больных с ВМ апо(а) и НЛп(а) (рис. 7).

Рисунок 7 - Доля пациентов с развитием ИБС до 45 лет в зависимости от концентрации Лп(а) и изоформ апо(а).

Статистический критерий 2= 8,23, p=0,037.

ВМ ВМ НМ НМ апо(а) и апо(а) и апо(а) и апо(а) и НЛп(а) ГЛп(а) НЛп(а) ГЛп(а) Доля пациентов (%) 4.1. Связь концентрации Лп(а) с атеросклерозом коронарных артерий.

Больных с данными КАГ было 562 человека, у 59 пациентов было выявлено отсутствие коронарного атеросклероза. НМ апо(а), так же как и ГЛп(а) встречались у половины больных с документированным атеросклерозом КА (49% и 47%, соответственно).

В ходе проведенного корреляционного анализа по Спирмену показана прямая связь между концентрацией Лп(а) (r=0,13, p<0,005 и r=0,15, p<0,005), размером изоформы апо(а) (r=0,17, p<0,005 и r=0,18, p<0,005), наличием НМ апо(а) (r=0,22, p<0,0001 и r=0,16, p<0,0001) и сочетанием ГЛп(а) и НМ апо(а) (r=0,21, p<0,0001 и r=0,18, p<0,0001) со степенью выраженности коронарного атеросклероза, оцениваемого по количеству магистральных артерий, имеющих гемодинамически значимые стенозы и по индексу стенозов [Gensini 1978], соответственно. Анализ данных КАГ в группах больных, стратифицированных в соответствии с концентрацией Лп(а) и полиморфизмом апо(а) показал, что поражения КА встречаются в 3 раза чаще в группе 3 - у больных с НМ апо(а) и НЛп(а) (рис.8.) Рисунок 8 - Отношение шансов 0 5 10 атеросклероза КА в группах больных Отношение шансов в зависимости от концентрации Лп(а) и фенотипа апо(а).

Следует обратить внимание, что по данным множественного регрессионного анализа, концентрация Лп(а) без включения в анализ фенотипа апо(а) (=0,17, p<0,005) является независимым предиктором наличия и тяжести атеросклеротического поражения КА наряду с полом (=0,23, p<0,001), возрастом (=0,17, p<0,005), наследственной предрасположенностью (=0,14, p<0,05) и гиперлипидемией (=0,10, p<0,05). При включении в статистическую модель фенотипа апо(а) с поправкой на традиционные факторы риска только НМ апо(а) (=0,20, p<0,001) наряду с гиперлипидемией (=0,20, p<0,0001) и полом (=0,14, p<0,05), но не концентрация Лп(а), оказывались независимыми факторами риска атеросклероза КА. Интересным представляется то, что при включении в модель множественной регрессии фенотипа апо(а) фактор наследственной предрасположенности теряет свою значимость как предиктор тяжести поражения КА. Наличие у пациента НМ апо(а) (=0,22, p<0,0001), в большей степени, чем ГЛп(а) (=0,14, p<0,05) наряду с полом (=0,22, p<0,0001) являлись независимым предиктором распространенности атеросклеротических поражений КА., выраженной в индексе стенозов. При этом у включенных больных доля НМ апо(а) и частота ГЛп(а) увеличивалась пропорционально распространенности поражения (рис.9).

больных Группы обследованных Окклюзии КА также были связаны с наличием у больных НМ апо(а) на фоне ГЛп(а) ОШ=1,82 (1,08-3,06), p<0,05, при этом только НМ апо(а) являлись значимым предиктором наличия окклюзий (=0,19, p<0,001). Таким образом, мы продемонстрировали значимую, независимую от традиционных факторов риска, связь Лп(а) с коронарным атеросклерозом у обследованных больных при наличии НМ апо(а).

Рисунок 9 - Встречаемость НМ апо(а) и ГЛп(а) в подгруппах больных, стратифицированных в зависимости от распространенности атеросклеротических 60 0-поражений КА, выраженной в индексе стенозов (2 = 20,10-p<0,0005 для НМ апо(а), и 2=22,>p<0,0005 для ГЛп(а)) Был проведен анализ связи Лп(а) с ангиографически ГЛп(а) НМ апо(а) подтвержденным коронарным атеросклерозом и тяжестью ИБС в подгруппе больных без нарушения липидного обмена (n=96). Показано, что концентрация Лп(а) и фенотип апо(а) достоверно ассоциируются с поражением магистральных артерий и выраженностью стенокардии ИБС (таб. 4). Многофакторный регрессионный анализ продемонстрировал, что только наличие НМ апо(а) (=0,42, р=0,002) являлось предиктором поражения КА в группе обследованных больных без гиперхолестеринемии, концентрация Лп(а), как фактор риска, теряла значимость при введении в модель фенотипа апо(а) (=0,31, р=0,281).

Таблица 4. Корреляционный анализ по Спирмену связи ангиографически подтвержденного поражения КА, ИМ в анамнезе и тяжести ИБС с классическими факторами риска в подгруппе больных без нарушения липидного обмена (n=96).

Тяжесть коронарного Функциональный атеросклероза по ИМ в анамнезе класс стенокардии кол-ву пораженных артерий Пол 0,24* 0,35** -0,Возраст 0,11 -0,19 0,Курение 0,27 0,40 0,Артериальная гипертония 0,24 -0,09 0,Сахарный диабет 2 типа 0,01 -0,03 0,Лп(а) 30 мг/дл 0,23* 0,30* 0,35* Концентрация Лп(а) 0,35* 0,25* 0,34* НМ апо(а) 0,37* 0,32* 0,42* НМ апо(а) и ГЛп(а) 0,38* 0,33* 0,40* *p<0,005,** p<0,0Встречаемость (%) 4.2. Полиморфизм апо(а) и осложнения коронарного атеросклероза. В общей группе обследованных, пациенты с ГЛп(а) переносили ИМ в 2,5 раза чаще, чем больные с НЛп(а) (ОШ=2,46(1,86-3,29) р<0,0001). Присутствие НМ изоформ апо(а) вне зависимости от концентрации Лп(а) было достоверно связано с наличием ИМ в анамнезе (ОШ=3,02 (1,77-5,16), р<0,0001 при НЛп(а) и ОШ=3,(2,36-4,78), р<0,0001 при ГЛп(а) (рис. 10) По данным множественного регрессионного анализа фенотип апо(а) (=0,20, р<0,005) и ГЛп(а) (=0,20, р<0,005) являлись предикторами ИМ в анамнезе наряду с такими классическими факторами риска как пол (=0,29, р<0,0001) и курение (=0,30, р<0,0001).

Рисунок 10 - Отношение шансов ИМ в анамнезе в группах обследованных больных, стратифицированных в зависимости от концентрации Лп(а) и изоформы апо(а).

Интересно отметить, что связь НМ апо(а) с количеством перенесенных ИМ у больных молодого возраста (I квартиль распределения - младше 48 лет) 1 2 3 4 5 была достоверно более выражена Отношение шансов (r=0,25, р<0,0001), чем у больных в возрасте после 60 лет (IV квартиль распределения - после 61 года) (r=0,14, р<0,05). Подобные результаты были получены и в отношении выраженности стенокардии (r=0,41, p<0,0001 и r=0,20, р<0,01, соответственно).

По всей видимости, прямая связь наличия ИМ с концентрацией Лп(а) реализуется за счет тромбогенного потенциала Лп(а), обусловленного высокой гомологией апо(а) и плазминогена. Для изучения лизин-связывающей активности Лп(а) в зависимости от изоформы апо(а), нами был разработан метод ИФА, с использованием L-лизина и ПкАт к Лп(а). В опытах in virto было показано, что лизин-связывающая способность Лп(а) в плазме крови незначительно зависит от изоформы апо(а), однако коррелирует с концентрацией Лп(а) (r=0,69, p<0,0001). У 164 мужчин, страдающих ИБС (средний возраст 54,76,3 лет) концентрация Лп(а) демонстрировала связь с концентрацией комплекса ТАП-ИАП (r=0,16, p=0,05).

Также отмечена достоверная корреляция между концентрацией комплекса ПАП с концентрацией Лп(а) (r=0,20, p<0,05), размером изоформы апо(а) (r=0,21, p<0,05), наличием НМ апо(а) (r=0,27, p<0,05), и сочетанием ГЛп(а) и НМ апо(а).

Множественный регрессионный анализ подтвердил наличие незначительной независимой и достоверной связи концентрации Лп(а) с концентрацией ПАП (=0,20 p<0,05) и ТАП-ИАП (=0,16 p<0,05), вне зависимости от изоформы апо(а).

Полученные данные позволили предположить, что концентрация Лп(а) в большей больных Группы обследованных степени, чем полиморфизм апо(а) может рассматриваться как фактор риска атеротромботических осложнений атеросклероза.

4.3. Связь Лп(а) с атеросклерозом сонных артерий. Атеросклероз СА в обследованной группе пациентов был выявлен у 527 пациентов (375 мужчин и 152 женщины). Стратификация больных в соответствии с тяжестью поражения СА в подгруппы с увеличением ТИМ, стенозами от 20 до 50%, и более 50% показали, что только гемодинамически значимые поражения СА (более 50%) связаны с достоверным увеличением концентрации Лп(а), а также с НМ апо(а) (рис. 11.). Результаты однофакторного и многофакторного регрессионного анализа демонстрировали связь концентрации Лп(а) и возраста с наличием и тяжестью атеросклеротического поражения СА у обследованных пациентов.

Рисунок 11 - Концентрация Лп(а) и наличие НМ апо(а) в зависимости от тяжести поражения СА. Данные по концентрации Лп(а) представлены как среднее стандартная ошибка среднего.

Различия были статистически значимы только в группе с поражением СА более 50%, как относительно группы с увеличением ТИМ (р<0,00001), так и с поражением артерий от 20 до 50% (p=0,0001).

Достоверность различий для наличия НМ апо(а) 2 =10,45 р=0,0056.

Учитывая, что большинство больных имели поражения КА, а также полученные данные о связи НМ апо(а) с коронарным атеросклерозом, мы выделили для анализа подгруппу пациентов без признаков поражения КА и ИБС (n=160). Обращает на себя внимание, что в данной подгруппе не встречалось гемодинамически значимых поражений СА (более 50% стенозов). При проведении корреляционного анализа была показана прямая связь тяжести поражений СА с возрастом (r=0,29, p<0,0001) и обратная с фенотипом апо(а) (r=-0,19, p<0,05), т.е. наличие НМ апо(а) было связано с начальными атеросклеротическими изменениями СА у больных без ИБС.

Можно предположить, что наличие НМ апо(а) является предиктором субклинического атеросклероза в СА, и способствует прогрессированию коронарного атеросклероза. На наш взгляд, полученные результаты обратной связи НМ с развитием атеросклероза в СА в группе больных без ИБС, подтверждают значимость НМ апо(а) как предиктора раннего атеросклеротического поражения, согласуясь с известным феноменом отсроченного поражения СА, относительно других сосудистых бассейнов при развитии атеросклероза.

4.4. Связь Лп(а) с поражением периферических артерий. Поражение артерий НК и перемежающая хромота (ПХ) различной степени тяжести была диагностирована у 37 пациентов (7 женщин и 30 мужчин, возраст 59,98,3).

Большинство больных (32, 89%) имели ИБС и поражение СА, у 24 (67%) в анамнезе была ИБС. Группу контроля составили больные без атеросклероза, а также больные с атеросклерозом, но без повреждения сосудов НК (546 человек).

Отношение шансов для больных с ПХ, имеющих НМ апо(а), было в среднем в 3 раза выше относительно больных с ВМ и НЛп(а), как при НЛп(а), так и при ГЛп(а) (ОШ=3,30 (1,15-9,44) и 2,70 (1,20-6,07), соответственно). Необходимо отметить, что наличие ВМ апо(а) при ГЛп(а) достоверно не увеличивало риск периферического атеросклероза (ОШ=1,41 (0,43-4,57)).

4.5.Связь Лп(а) с мультифокальным атеросклерозом у больных ИБС. Для исследования влияния Лп(а) на поражение всех трех сосудистых бассейнов из общей группы обследованных больных были выделены подгруппа (n=198) с документально подтвержденным сочетанным поражением коронарного и каротидного сосудистых бассейнов и подгруппа с поражением всех трех сосудистых бассейнов (n=22). Подгруппы больных были сопоставимы по основным факторам риска, но среди больных с мультифокальным атеросклерозом было несколько больше курильщиков (82% и 56%, p=0,068). ГЛп(а) отмечалась незначительно чаще у больных с мультифокальным атеросклерозом - 55% и 41% (p=0,189). НМ апо(а) встречались у 73% больных с поражением всех трех сосудистых бассейнов, в отличие от больных с поражением только коронарного и каротидного бассейнов - 42% (p<0,05). Следует отметить, что по данным корреляционного анализа наряду с курением (r=0,20 p<0,05) с поражением сосудов НК были связаны наличие НМ апо(а) (r=0,17 p<0,05) и размер экспрессируемой изформы апо(а) (r=0,20 p<0,05). В исследуемой подгруппе больных такие факторы риска как пол, возраст, сахарный диабет, показатели липидного спектра и уровень фибриногена, достоверно не были связаны с наличием мультифокального атеросклероза. В модели множественной регрессии при введении поправки на пол, возраст, курение и концентрацию Лп(а) только курение (=0,20, p=0,0003) и полиморфизм апо(а) (=0,19, р=0,01) оказались независимо связаны с поражением сосудов НК. При анализе, проведенном в подгруппе курильщиков, только размер экспрессируемой изоформы апо(а) был связан с наличием атеросклеротического процесса во всех трех сосудистых бассейнах (=0,27, р<0,001).

Анализ связи полиморфизма апо(а) в группах пациентов, стратифицированных по возрасту, показал, что наличие НМ апо(а) наиболее тесно связано с развитием мультифокального атеросклероза именно в молодом возрасте (r=0,41, p<0,00для больных моложе 50 лет). Доля пациентов с НМ апо(а) увеличивается обратно пропорционально возрасту больных с мультифокальным атеросклерозом, достигая максимума у больных моложе 50 лет (рис. 12).

Рисунок 12 - Частота встречаемости НМ апо(а) у больных с мультифокальным атеросклерозом в различных возрастных группах.

(достоверность различий 2 = 17,9 р<0,0005).

В нашем исследовании средний возраст больных составил 55 лет, что на 1015 лет меньше возраста, при котором выявляется наибольшая распространенность мультифокального атеросклероза [Чернявский А.М. 2006].

По данным многофакторного анализа в подгруппе больных до 55 лет НМ апо(а) (=0,28, p<0,01) являлись более значимым фактором риска периферического атеросклероза, чем наличие курения (=0,22, р=0,067). В старшей возрастной группе (55 лет) значимость НМ апо(а) (=0,11, р>0,1) как фактора риска мультифокального атеросклероза по сравнению с курением (=0,19, р<0,05) нивелировалась. Полученные нами результаты согласуются с данными, описанными итальянскими учеными, не обнаружившими достоверной связи концентрации Лп(а) с ПХ у больных старше 65 лет (средний возраст 746 лет) [PantoniL, etal 2001]. Таким образом, было показано, что наличие НМ апо(а) связано с атеросклеротическим поражением всех трех сосудистых бассейнов в исследуемой группе больных ИБС.

Вывод: присутствие НМ изоформ апо(а) независимо от традиционных факторов риска, а также концентрации Лп(а) связано с наличием и тяжестью поражений коронарных, сонных и периферических артерий, а также мультифокального атеросклероза у больных ИБС, особенно в молодом и среднем возрасте.

Глава 5. Исследование влияния полиморфизма апо(а) и концентрации Лп(а) на прогноз больных ИБС.

5.1. Лп(а) и полиморфизм апо(а) у больных после операции коронарного шунтирования (КШ). Окклюзия аутовенозных шунтов как в раннем послеоперационном периоде, так и спустя несколько лет, представляет одну из основных осложнений операции. В исследование были включены 102 мужчины после операции КШ. Окклюзии одного или более аутовенозных шунтов были обнаружены у 66 пациентов. Больные в группах с проходимыми и окклюзированными аутовенозными шунтами не отличались по классическим факторам риска и показателям липидного спектра. В группе с проходимыми аутовенозными шунтами было больше больных, получающих гиполипидемическую терапию статинами в послеоперационном периоде ((42%) и 12 (18%), p<0,05). Уровень Лп(а) был достоверно выше в группе больных с окклюзированными аутовенозными шунтами и составлял 4241 (медиана 24) и 2429 (медиана 12) мг/дл (р<0,001), соответственно.

Количество пациентов с окклюзированными аутовенозными шунтами было выше при ГЛп(а), чем в группе с НЛп(а) (82% и 54%, соответственно р<0,01). Не было обнаружено значимых различий в концентрации Лп(а) при сравнении групп с различным числом окклюзированных аутовенозных трансплантатов. Однако наблюдалось нарастание частоты НМ апо(а) при увеличении количества пораженных трансплантатов (рис. 13).

При сравнении липидного спектра крови 35 больных с проходимыми аутовенозными шунтами и окклюзией одного или более шунтов через 3 года после КШ было выявлено достоверное отличие в отношении Лп(а) (1614 и 34мг/дл) и ХС ЛНП (3,31,4 и 4,10,8 ммоль/л) соответственно (р0,05), но не других факторов риска или показателей липидного спектра.

Рисунок 13 - Встречаемость НМ апо(а) в подгруппах больных, стратифицированных по количеству окклюзированных шунтов в ранние сроки после операции (до 1 года).

40 Статистическая значимость различий 2 = 16,9 р<0,001).

Анализ групп в соответствии 0 1 2 3 и более с изоформами апо(а) и Кол-во окклюзированных шунтов концентрацией Лп(а) показал, что в группе больных с поражением 3 и более венозных анастомозов 40% имели сочетание НМ апо(а) и ГЛп(а). Напротив, у 73% больных с ВМ апо(а) и ГЛп(а) было отмечено поражение одного или двух шунтов. По данным множественного регрессионного анализа с поправкой на возраст и показатели липидного спектра только НМ апо(а) (=0,297, p<0,05), особенно в сочетании ГЛп(а) (=0,410, p=0,005) были связаны с поражением венозных анастомозов.

Следовательно, ГЛп(а) и НМ апо(а) являются факторами риска окклюзий аутовенозных шунтов, а также тяжести поражения венозных анастомозов, особенно в первый год после операции реваскуляризации миокарда.

5.2. Влияние концентрации Лп(а) и полиморфизма апо(а) на прогноз больных ИБС. 289 пациентов (82% мужчин, средний возраст 52,58,4 лет) из общей группы обследованных больных наблюдались в течение 12-180 мес (в среднем 6933 мес), что позволило оценить влияние концентрации Лп(а) и полиморфизма апо(а) на прогноз течения ИБС.

206 пациентов (71%) имели тяжелое течение стенокардии, соответствующее 34 ФК. Прогрессия стенокардии была отмечена у 72 человек (25%), повторная КАГ была проведена 96 (33%) пациентам, стентирование - 47 (16%), рестеноз стентов был отмечен у 27 (9%) больных, ИМ перенесли 28 пациентов (10%), смертельные исходы были зарегистрированы у 49 человек (17%). По результатам доля НМ апо(а), (%) корреляционного анализа, как концентрация Лп(а) (r=0,29, p<0,0001), так и НМ апо(а) (r=0,22, p<0,0001), связаны с развитием коронарных событий, наряду с полом (r=0,24, p<0,0001), курением (r=0,19, p<0,001) и исходной распространенностью атеросклероза (r=0,19, p<0,01), выраженного в количестве пораженных сосудистых бассейнов. Связь с концентрацией ХС ЛНП нивелировалась после пересчета коррегированного ХС ЛНП.

В группе больных с НМ апо(а) нежелательные коронарные события встречались достоверно чаще, чем у больных с ВМ апо(а) (p<0,005).

Относительный риск коронарных событий у пациентов с НМ апо(а) был в 1,5 раза выше, чем у больных с ВМ апо(а) ОР=1,55(1,17-2,06). По данным множественного регрессионного анализа с поправкой на традиционные факторы риска только пол (=0,24, p<0,0001) и концентрация Лп(а) (=0,25, p<0,0005) являлись предикторами коронарных событий у больных ИБС. При введении поправки на концентрацию Лп(а), НМ апо(а) теряли свою значимость как прогностический фактор (=0,03,

0,05). Регулярный прием статинов позволял достоверно уменьшить вероятность коронарных событий (=-0,14, p<0,05).

При проведении статистического анализа, с конечными точками коронарная смерть и нефатальный ИМ, была выявлена связь с концентрацией Лп(а) и полиморфизмом апо(а). Также отмечено ухудшение прогноза ИБС (р< 0,05) в группах больных с НМ апо(а) (рис. 14).

0,8 Рисунок 14 - Кривые выживаемости Каплана-Мейера в группах больных с НМ и ВМ апо(а).

Конечная точка - коронарная 0,смерть, результаты лог-рангового теста 2 = 5,7, p=0,019.

0,0 50 100 150 2По данным корреляционного Время (мес) анализа наличие НМ апо(а) (r=0,13, p<0,05), наряду с ВМ (n=101) НМ (n=136) полом (r=0,22, p<0,05), курением (r=0,20, p<0,05) и приемом статинов были связаны со смертельным исходом в результате ИБС.

Тогда как с развитием нефатального ИМ был связан только Лп(а) (r=0,19, p<0,05) и фенотип апо(а) (r=0,16, p<0,05). Относительный риск смертельного исхода в результате ИБС у больных с НМ апо(а) был достоверно, но незначительно выше, чем у больных с ВМ апо(а) (ОР=1,14 (1,06-1,28)). Подобное наблюдение было сделано в отношении риска развития нефатального ИМ (ОР=1,09 (1,01-1,19)).

По результатам множественного регрессионного анализа с поправкой на все факторы риска и концентрацию Лп(а) только пол, возраст и прием статинов были связаны с риском смерти от сердечно-сосудистых заболеваний. Связь НМ апо(а) с развитием нефатального ИМ в исследованной группе больных, теряла свою значимость при введении в математическую модель концентрации Лп(а), что Выживаемость (%) согласовывалось с данными, полученными нами в ретроспективном исследовании.

Разделение больных на четыре группы в зависимости от концентрации Лп(а) и изоформы апо(а) (табл. 5.) показало отсутствие достоверных отличий в факторах риска ИБС и исходном статусе пациентов.

Таблица 5. Стратификация больных ССЗ в зависимости от концентрации Лп(а) и НМ апо(а).

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 р НЛп(а) и ГЛп(а) и НЛп(а) и ГЛп(а) и ВМ апо(а) ВМ апо(а) НМ апо(а) НМ апо(а) Кол-во пациентов 66 35 29 1Пол (% муж) 51 (77%) 30 (86%) 23 (79%) 93 (87%) >0,Возраст, лет 53,08,8 52,69,4 54,69,1 51,38,Артериальная гипертония 40 (61%) 21 (60%) 18 (62%) 64 (60%) >0,Курение 17 (26%) 10 (28%) 6 (21%) 42 (39%) >0,Ожирение 19 (29%) 8 (23%) 4 (14%) 21 (20%) >0,Семейный анамнез 18 (27%) 11 (31%) 14 (48%) 39 (36%) >0,Сахарный диабет 10 (15%) 6 (17%) 2 (7%) 7 (7%) >0,Гиперлипидемия 64 (97%) 33 (94%) 29 (100%) 96 (90%) >0,ОХС, ммоль/л 6,41,0 6,71,4 6,71,2 6,61,ТГ, ммоль/л 2,10,8 2,31,0 2,41,2 2,11,ХС ЛВП, ммоль/л 1,30,4 1,20,3 1,10,2 1,20,ХС ЛНП, ммоль/л 4,71,0 5,01,2 4,71,2 4,71,ХС ЛНПк, ммоль/л 4,61,0 4,61,2 4,61,2 4,01,1* Фибриноген, г/л 3,20,9 3,10,8 3,10,8 1,90,5** Лп(а), мг/дл 147 5521 147 8343** 3-х сосудистое поражение 26 (39%) 9 (26%) 17 (58%) 52 (49%) <0,0Стентирование в анамнезе 18 (27%) 11 (31%) 6 (21%) 25 (23%) >0,КШ в анамнезе 22 (33%) 9 (26%) 12 (41%) 36 (34%) >0,Повторная КАГ 17 (26%) 10 (28%) 8 (28%) 46 (43%) >0,Смерть от ИБС 7 (11%) 6 (17%) 9 (31%) 22 (21%) <0,Нефатальный ИМ 2 (3%) 3 (8%) 2 (7%) 17 (16%) <0,Операция КШ 4 (6%) 1 (3%) 4 (14%) 15 (14%) <0,Прогрессия стенокардии 8 (12%) 16 (46%) 3 (10%) 30 (28%) <0,00Коронарные события 22 (33%) 24 (68%) 14 (48%) 72 (67%) <0,00Прием статинов 34 (52%) 21 (60%) 9 (31%) 66 (62%) <0,*p<0,0005, **p<0,00У больных в группах с повышенной концентрацией Лп(а) и/или НМ апо(а) достоверно чаще отмечались нефатальный ИМ, операции по реваскуляризации миокарда, прогрессия ИБС, выражающаяся в нарастании тяжести стенокардии, смертельные исходы ИБС, а также достоверно увеличивалась частота любых коронарных осложнений (таб.5.).

Вывод: Концентрация Лп(а) и низкомолекулярный фенотип апо(а) достоверно связаны с отрицательным прогнозом течения заболевания у больных ИБС.

Глава 6. Разработка методов коррекции повышенной концентрации Лп(а).

6.1. Снижение Лп(а) медикаментозными методами. В 1990 году M.Rath и L.Pouling выдвинули гипотезу, согласно которой накопление Лп(а) в субэндотелии является защитным механизмом и направлено на укрепление стенки сосуда. На возможность использования больших доз витамина С для воздействия на липиды крови в целях лечения и профилактики атеросклероза еще в 1960 году указывал А.Л.Мясников [Мясников 1960]. Совместно с отделением проблем атеросклероза было проведено 12 недельное исследование влияния аскорбиновой кислоты и лизина, а также их комбинации на уровень Лп(а) у 40 больных ИБС с повышенной концентрацией Лп(а). Больные были рандомизированы в четыре группы по 10 человек в каждой, отличающиеся схемой и дозами принимаемых препаратов. В результате лечения уровень Лп(а) снизился на 14% после увеличения дозы аскорбиновой кислоты с 6 до 12 г.

Изолированное применение лизина и его сочетания с большими дозами витамина С не влияло на уровень Лп(а). Полученные нами на ограниченном контингенте больных данные не подтверждали гипотезу о возможном влиянии больших доз аскорбиновой кислоты, лизина и их сочетания на уровень Лп(а) у больных ИБС.

Изучение возможности снижения Лп(а) с применением гормональной заместительной терапии у женщин с ИБС, подтвержденной КАГ (возраст 52г.) показало, что прием препаратов, содержащих по 2 мг эстрадиол валерата и 1 мг ципротерона ацетата по 10 дней ежемесячно приводил к снижению уровня Лп(а) на 14%, за 6 месяцев - на 23%. Наиболее эффективным методом медикаментозной коррекции Лп(а) у больных с ИБС являлась терапия высокими дозами никотиновой кислоты замедленного высвобождения. Как было показано при проведении 24-недельного, открытого, рандомизированного, контролируемого клинического исследования у мужчин с ИБС до 60 лет, получавших никотиновую кислоту, отмечено достоверное снижение уровня Лп(а) с 8440 до 6725 мг/дл к неделям терапии (p<0,01) и до 6537 мг/дл к 6 месяцам (-23%, p<0,01) (рис. 15). Прием статинов не оказал влияния на уровень Лп(а).

Рисунок 15 - Динамика уровня Лп(а) в группе больных ИБС, получавших препараты никотиновой кислоты замедленного высвобождения.

6.2. Снижение Лп(а) методами эфферентной терапии. Присутствие в составе частицы Лп(а) апоВ100 позволяет рассматривать методы ЛНП афереза как эффективый способ снижения концентрации Лп(а). Исследование динамики Лп(а) на процедурах ЛНП афереза проводимых в отделении гемодиализа и плазмафереза ВКН - в период с 1989 по 1993 года показали, что среднее снижение концентрации Лп(а) практически не зависит от вида системы для ЛНП афереза и варьируется от 43 до 49%, что подтверждалось другими исследователями [Thompson 2003, Bambauer 2001, Keller 2007].

Рисунок 16 - Эффективность удаления Лп(а) на 30 сорбентах для афереза липидов.

Дальнейшие исследования по сравнению Лп(а) связывающей способности сорбентов для ЛНП афереза удалять Лп(а) в одинаковых условиях in vitro, показали, что эффективность сорбции Лп(а) в 6 раз уступала сорбенту для Лп(а) афереза (рис.16).

Сорбент на основе фракции IgG, содержащих ПкАт барана к Лп(а) человека, выделенных согласно методу 1 (глава 1), был синтезирован в 1989 году.

Иммуносорбент обладал высокой специфичностью, сорбционной емкостью и стабильностью в ряду хроматографий [Афанасьева О.И. и соавт 1991, 1993, Pokrovsky S. et al 1991].

Одним из недостатков сорбента являлось использование в качестве лиганда не специфических Ат, а фракции иммуноглобулинов, что приводило к необходимости иммобилизовать на сорбент 10-12 мг белка/мл геля, а также трудности стандартизации сорбционной емкости сорбента.

Разработанный метод выделения препаративных количеств Лп(а) с использованием аффинной хроматографии позволил нам синтезировать сорбент с иммобилизованными Лп(а) и выделить высокоспецифичные ПкАт барана к Лп(а) (метод 3). В результате был получен сорбент соизмеримый по сорбционной емкости Лп(а), но содержащий в 5 раз меньше иммобилизованного лиганда.

Удельная Лп(а) связывающая активность разработанного сорбента в пересчете на мг иммобилизованных антител составляла 1,50,8 и 0,40,1 мг Лп(а)/мг белка IgG, соответственно. Оптимизированные условия элюции 0,2 М глициновым буфером с пониженной ионной силой, обеспечивали стабильность иммуносорбента в ряду 50 хроматографических циклов, что позволяло использовать колонки многократно.

Ограниченные клинические испытания иммуносорбента для удаления Лп(а) в плазме крови человека методом иммуносорбции в системе экстракорпорального кровообращения были начаты в институте клинической кардиологии КН - РАМН в конце 1990 года [Сусеков и соавт. 1993], в начале 1992 года продолжены в клинике Люденшайда (Германия) (таб. 6). Критерии включения пациентов и методы ведения процедуры Лп(а) афереза были унифицированы.

Коэффициент распределения Таблица 6. Характеристика больных, включенных в исследование в России и Германии.

Параметр Пациенты ЛН ЗЕ ФИ КВ KH KF KR Пол/возраст м/38 м/53 м/52 м/58 м/54 ж/45 м/Кол-во пораженных 3 3 3 3 3 2 КА ИМ - - 2 1 1 3 Операции нет нет нет 3 ЧКВ 3 АКШ нет ЧКВ реваскуляризации Лп(a), мг/дл 100 90 90 47 147 160 1Фенотип апо(а) НМ НМ НМ НМ НМ НМ НМ ОХС, мг/дл 230 210 217 200 221 180 1ХС-ЛВП, мг/дл 38 45 34 52 44 35 ХС-ЛНП, мг/дл 160 140 140 134 119 110 ХС-ЛНП корр*, мг/дл 130 113 113 116 75 62 Однократное проведение Лп(а) афереза на колонках Лп(а) Липопак приводило к снижению Лп(а) на 70-80%, изменение ОХС соответствовало количеству ХС, входящего в состав Лп(а) тогда как другие показатели липидов практически не изменялись. Процедуры иммуносорбции проводили с интервалом в 7 дней, исходя из данных восстановления концентрации Лп(а) после проведения процедуры Лп(а) афереза (рис. 17 и 18).

100 111112 0 до после 0 10 20 30 40 50 Лп(а) ОХС Количество процедур Лп(а) афереза ХС ЛВП ХС ЛНП корр а б Рисунок 17 - Динамика липидного профиля и Лп(а) при проведении одной процедуры и длительного курса процедур Лп(а) афереза.(а) динамика липидов и Лп(а) при проведении одной процедуры Лп(а) афереза пациенту Ф.И.(Москва), данные представлены как среднеестандартная ошибка среднего для концентрации до и после каждой из 80 процедур Лп(а) афереза. (б) динамика Лп(а) при проведении курса Лп(а) афереза пациенту K.H.

(Германия).

За 11 лет наблюдения было проведено более 1200 процедур в клиниках Москвы и Германии. При проведении длительного курса Лп(а) афереза не было отмечено значимых отклонений в биохимических показателях, следовательно Лп(а) мг/дл Лп(а), мг/дл липиды, ммоль/л удаление Лп(а) не приводило к каким-либо изменениям в параметрах гомеостаза.

Длительное удаление Лп(а) из организма человека не оказывало влияния на углеводный, жировой и белковый обмены, коагулогический статус. Расчет константы фракционной скорости катаболизма в соответствии с формулой, предложенной Armstrong V.W. et.al. (1989), показал, что у трех пациентов скорость восстановления Лп(а) после удаления достоверно снижалась при проведении длительного курса Лп(а) афереза (рис. 18). Вероятно, что подобное замедление синтеза Лп(а) приводило к снижению концентрации Лп(а) до 39% от исходного уровня у двух из 7 пациентов. Также было отмечено незначительное увеличение ЛВП. Подобные результаты воздействия специфического Лп(а) афереза на липидный спектр у 2 больных с изолированноповышенным Лп(а) были опубликованы и в других независимых исследованиях [Bambauer 2002].

Рисунок. 18 - Динамика восстановления уровня Лп(а) в плазме крови после его удаления в процедуре Лп(а) афереза(пациент Ф.И.).(а)-после 1-ой процедуры Лп(а) афереза;

(б)-после 40-ой процедуры Лп(а) афереза.

Проведение Лп(а) афереза пациентам уже через полгода приводило к существенному улучшению клинического состояния: уменьшению приступов стенокардии в среднем в 3 раза, а также в увеличении толерантности к физической нагрузке по данным велоэргометрии. Данные повторной КАГ, проведенной через 1-1,5 года пациентам показали стабилизацию и частичную регрессию атеросклеротических бляшек у 2 больных. За время наблюдения пациентов, находящихся на Лп(а) аферезе от 3 до 11 лет не было отмечено новых случаев острых коронарных событий (рис. 19). Улучшение клинического статуса больных ИБС и отсутствие прогрессирования коронарного атеросклероза по данным повторной КАГ на фоне процедур Лп(а) афереза, можно рассматривать как доказательство клинической эффективности использования Лп(а) в качестве терапевтической мишени.

Снижение количества приступов стенокардии на курсе Лп(а) афереза было отмечено у всех больных, как в нашем собственном исследовании, так и в клиниках Германии и Англии [Ulrich et al 1998, Thompson et al 1994, Baumbauer et al 2003] Наши данные подтверждаются результатами наблюдения за 120 больными с повышенной концентрацией Лп(а), показавшими, что применение ЛНП афереза на фоне оптимальной медикаментозной терапии, при снижении концентрации Лп(а) в среднем на 60-70%, снижает любые коронарные события на 80-90%, относительно периода, когда больные получали только медикаментозную терапию [Jaeger et al 2009].

Рисунок 19 - Динамика коронарных событий у 2,больных находящихся на длительном курсе КС специфического Лп(а) афереза. Время наблюдения ИМ 3-11 лет. Данные приведены для 7 пациентов как ЧКВ отношение суммарного количества КШ нежелательных коронарных событий к 1,количеству пациентов, находящихся в исследовании. КС - все коронарные события, ИМ - инфаркт миокарда, ЧКВ - чреcкожное коронарное вмешательство, КШ - операция аортокоронарного шунтирования.

0,Мы считаем, что полученные нами до лечения на Лп(а) аферезе результаты, а также имеющиеся литературные данные, позволяют сделать вывод, что Лп(а) аферез, как метод, специфически и высокоэффективно снижающий уровень Лп(а) приводит к стабилизации атеросклеротического процесса.

С использованием полученных данных по характеристике сорбентов была разработана кинетическая модель, позволяющая рассчитывать эффективность удаления Лп(а) при проведении процедур терапевтического афереза с учетом индивидуальных параметров пациента, таких как объем циркулирующей плазмы, исходный уровень Лп(а) и ХС ЛНП, скорость плазмотока и характеристик используемых колонок. Расчеты, проведенные с использованием данного алгоритма, подтвердили ограниченную эффективность систем для ЛНП афереза для удаления Лп(а) свыше 80 мг/дл, а также сформулированы критерии отбора пациентов с нарушением липидного обмена в различные группы терапевтического афереза - специфический Лп(а) аферез, ЛНП аферез и сочетанный аферез липидов с использованием двух типов иммуносорбционных колонок, специфичных к ЛНП и к Лп(а).

Вывод: Высокоспецифическое удаление Лп(а) из плазмы крови человека при помощи иммуносорбента с ПкАт к Лп(а) положительно влияет на клинический статус больных ИБС с изолированно повышенным Лп(а). Согласно полученным результатам Лп(а) принимает непосредственное участие в процессе атеротромбогенеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Повышенная концентрация Лп(а), а также наличие НМ апо(а), являются независимыми факторами риска атеросклероза различных локализаций и ИБС.

При этом, наличие НМ апо(а) значительно увеличивает атерогенный потенциал Лп(а). Доказана достоверная независимая связь между НМ апо(а) и атеросклеротическим поражением коронарных, сонных и периферических артерий, а также выраженностью заболевания. Впервые показана связь НМ апо(а) Кол-во событий на 1 пациента и повышенной концентрации Лп(а) с окклюзией аутовенозных шунтов после операций реваскуляризации миокарда. Продемонстрирована прогностическая значимость изоформ апо(а) у больных ИБС, что позволяет использовать Лп(а) как предиктор, определяющий выбор тактики лечения ИБС.

Разработанные иммуносорбционные колонки внедрены в практическую деятельность ряда клиник, имеющих отделения экстракорпоральной терапии. В рамках проспективного клинического наблюдения за больными с повышенной концентрацией Лп(а) с помощью процедур Лп(а) афереза показано участие Лп(а) в атерогенезе и определена целесообразность коррекции высокого уровня Лп(а).

Разработаны оригинальные методологические подходы для выделения препаративных количеств высокоочищенного препарата Лп(а), используемого в качестве антигена для иммунизации животных и создания аффинных колонок.

Создан лабораторный прототип отечественной тест-системы для определения концентрации Лп(а) в плазме/сыворотке крови человека.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны препаративные методы выделения высокоочищенного препарата Лп(а) из плазмы крови человека и получения моноспецифических поликлональных Ат барана против Лп(а) человека.

2. Разработан иммуноферментный метод, позволяющий с высокой точностью и воспроизводимостью определять концентрацию Лп(а) в плазме/сыворотке крови человека. На основе полученных высокоспецифичных поликлональных антител разработан метод фенотипирования апо(а), основанный на разделении апо(а) по электрофоретической подвижности в SDSполиакриламидном геле с последующим иммуноблотингом.

3. Показано, что у больных с атеросклеротическим поражением различных сосудистых бассейнов концентрация Лп(а) 30 мг/дл и низкомолекулярные изоформы апо(а) встречаются в 1,5-2 раза чаще, чем у здоровых доноров и больных без признаков атеросклероза.

4. Низкомолекулярные изоформы апо(а) являются независимым предиктором наличия, тяжести и распространенности атеросклеротического поражения коронарных, сонных, периферических артерий и мультифокального атеросклероза у больных ИБС, независимо от других факторов риска и концентрации Лп(а). Отношение шансов атеросклероза коронарных, сонных и периферических артерий в 3-6 раз выше у больных с повышенной концентрацией Лп(а) и низкомолекулярными изоформами апо(а), чем у больных с высокомолекулярными изоформами апо(а). Наиболее значимая связь Лп(а), и особенно полиморфизма апо(а) с атеросклеротическими поражениями и ИБС отмечена у больных молодого и среднего возраста.

5. Повышенная концентрация Лп(а) и наличие низкомолекулярных изоформ апо(а) связаны с неблагоприятным прогнозом течения ИБС независимо от других факторов риска, а также с развитием осложнений после операции реваскуляризации миокарда.

6. На основе аффинно-очищенных поликлональных антител к Лп(а) разработан иммуносорбент, способный с высокой специфичностью и эффективностью удалять Лп(а) из плазмы крови человека при проведении процедур терапевтического афереза. Специфическое удаление Лп(а) из организма пациента на процедурах Лп(а) афереза с использованием иммуносорбционных колонок положительно влияет на клинический статус больных ИБС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Концентрацию Лп(а) необходимо определять как рутинный показатель липидного спектра, при обследовании пациентов в кардиологических, неврологических и хирургических отделениях.

2. Определение фенотипа апо(а) у людей с отягощенным семейным анамнезом по ССЗ позволит улучшить стратификацию риска развития ИБС.

3. Необходимо рассматривать повышенную концентрацию Лп(а) как показатель нарушения метаболизма липидов и включить данную категорию в существующие классификации гиперлипидемий.

4. При измерении ХС ЛНП необходимо учитывать концентрацию Лп(а) и рассчитывать данный показатель в соответствии с модифицированной формулой Фридвальда, особенно при назначении гиполипидемических препаратов.

5. Больным ИБС, имеющим повышенную концентрацию Лп(а) в дополнение к максимальной медикаментозной терапии целесобразно рекомендовать препараты никотиновой кислотой или проведение Лп(а) афереза.

6. У больных с сочетанным повышением Лп(а) и ЛНП возможно применение Лп(а) афереза на фоне терапии статинами, ЛНП афереза или афереза липидов с использованием двух типов иммуносорбционных колонок для Лп(а) и ЛНП афереза.

7. Необходимы дальнейшие расширенные исследования клинической эффективности методов терапевтического афереза для лечения больных ИБС с повышенной концентрацией Лп(а).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сусеков А.В., Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Лякишев А.А., Кухарчук В.В., Покровский С.Н. Применение иммуносорбента для селективного снижения уровня липопротеида (а) у больных с коронарным атеросклерозом// Кардиология. - 1993. - Т.32. - №. 11-12. - C.52-56.

2. Pokrovsky S.N., Adamova I.Yu., Afanasieva O.I., Susekov A.V., Kukharchuk V.V. Dynamic of Lp(a) level during long-term Lp(a) apheresis.//Abstract book of 62nd European Atherosclerosis Society Congress, Jerusalem, Israel.- 1993.- P.124.

3. S. Pokrovsky, A. Susekov, O. Afanasieva, I. Adamova, A. Lyakishev, V. Kukharchuk.

Extracorporeal immunoadsorption for the specific removal of lipoprotein (a) (Lp(a) apheresis):

preliminary clinical data// Chemistry and Physics of Lipids.- 1994. - 67/68. - P. 323-330.

4. Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Беневоленская Г.Ф., Покровский С.Н. Иммуноферментный метод определения липопротеида (а).// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 1995. - № 10. - C. 398-401.

5. Покровский С.Н., Сусеков А. В., Адамова И. Ю.,Афанасьева О. И., Беневоленская Г. Ф., Кухарчук В. В. Иммуносорбенты для удаления атерогенных аполипопротеин В-содержащих липопротеидов в процедуре экстракорпорального кровообращения// Тезисы Симпозиума Липопротеиды и атеросклероз ИЭМ РАМН, Санкт-Петербург. - 1995. - C.85.

6. М.В.Ежов, О.И.Афанасьева, О.И.Кононова, И.Ю.Миронова, А.А.Лякишев, С.Н.Покровский.Влияние аскорбиновой кислоты, лизина и их сочетания на уровень липопротеида(а) у больных ИБС //Материалы 1 Конгресса Человек и лекарство, Москва.

- 1995.- C.7. M.V. Ezhov, A.V. Sussekov, O.I. Afanasieva, O.I. Kononova, I.Yu. Mironova, A.A. Lyakishev, S.N. Pokrovsky. The effect of ascorbic acid and lysine on high plasma Lp(a) level in patients with coronary heart disease: a single-blind randomized controlled study.// Abstract book of 12th International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism. Houston, USA, - 1995. - P.8. Rostapshova T.V., Schurigina N.P., Yarovaya Y.B., Afanasieva O.I., Pokrovsky S.N., Kukharchuk V.V. Model analysis of different hypotheses of lipoprotein(a) influx rate into plasma in vivo studies.// Atherosclerosis. - 1995. - V. 115. - С. S87.

9. S.N Pokrovsky, A.V.Sussekov, I.Yu.Adamova, O.I.Afanasieva, G.F.Benevolenskaya, G.A.Konovalov, V.V.Kukharchuk. Development of Immunosorbents for apoB-Containing Lipoproteins Apheresis. //Artificial Organs.- 1995. - V.19.- N.6.- P. 500-505.

10. A. Sussekov, O. Afanasieva, I. Adamova, V. Kukharchuk, C. Neuwirth, J. Deanfield, D.

Celermajer, G. Thompson, S. Pokrovsky. Lp(a) apheresis in the treatment of CHD patients.// The International J. of Artificial Organs. - 1995.- V.18.- №. 8.- P.420.

11. М.В. Ежов, О.И. Афанасьева, О.И. Кононова, И.Ю. Миронова, А.А. Лякишев, С.Н.

Покровский. Влияют ли аскорбиновая кислота, лизин и их сочетание на уровень липопротеида(а) у больных ИБС?// Кардиология.- 1996.- № 9.- C.31-33.

12. Е. Б. Яровая, А. В. Сусеков, О. И. Афанасьева, С. Н. Покровский, В. В. Кухарчук. Оценка метаболических параметров липопротеида (а) на фоне длительного курса Лп(а) афереза// Материалы 4 Конференции Московского общества гемафереза, Москва. - 1996. - C.57.

13. S. Pokrovsky, A. Sussekov, O. Afanasieva, I. Adamova, V. Kukharchuk. Lp(a)-apheresis. What we can say today.// Japanese Journal of Apheresis.- 1996.- V. 15 Supplement.- s24.

14. Pokrovsky S.N., Afanasieva O.I., Adamova I.Yu., Benevolenskaya G.F., Sussekov A.V., Kukharchuk V.V.УLp(a) LipopakФ - new unique material for specific removal of lipoprotein(a).// Abstract book of World Apheresis Association 6th International Congress. Florence, Italy.- 1996. - P.115. М.В. Ежов, О.И. Афанасьева, Г.Ф. Беневоленская, А.П. Савченко, А.А. Лякишев, С.Н.

Покровский. Липопротеид(а) как биохимический маркер коронарного атеросклероза.// Тер.

Архив. - 1997.- T. 69.- № 9.- P.31-35.

16. М.В. Ежов, О.И. Афанасьева, А.А. Лякишев, С.Н. Покровский. Липопротеид(а) как фактор риска, коррелирующий с выраженностью коронарного атеросклероза.// Материалы I Конгресса ассоциации кардиологов стран СНГ, Москва. - 1997. - C.60.

17. O.I. Afanasieva, M.V. Ezhov, G.F. Benevolenskaya, A.P. Savchenko, A.A. Lyakishev, S.N.

Pokrovsky. Apolipoprotein(a) phenotype as a predictor of occlusions in coronary arteries.// Atherosclerosis. - 1997. - V.134. - N.1-2. - P.136.

18. M.V. Ezhov, O.I. Afanasieva, G.F. Benevolenskaya, T.V. Balakhonova, A.A. Lyakishev, S.N.

Pokrovsky. Relation of lipoprotein(a) concentration and apolipoprotein(a) phenotypes to the presence and severity of carotid atherosclerosis.// Atherosclerosis. - 1997. - V.134. - N.1-2. - P.140.

19. S.N. Pokrovsky, A.V. Sussekov, O.I. Afanasieva, I.Yu. Adamova, V.V. Kukharchuk. Lp(a) apheresis new approach for specific Lp(a) lowering// Atherosclerosis. - 1997. - V.134. - N.1-2. - P.147.

20. S.N. Pokrovsky, E.Ye. Vlasova, L.N. IlТina, O.I. Afanasieva, A.A. Shiryaev, A.A. Agapov, R.S.

Akchurin. Lp(a) as a possible marker for vien graft stenosis after coronary artery bypass surgery// Atherosclerosis. - 1997. - V.134. - N.1-2. - P.166.

21. E.B. Yarovaya., A.V. Sussekov, O.I. Afanasieva, S.N. Pokrovsky, V.V. Kukharchuk. Effect of repeated Lp(a) apheresis on metabolic parameters of lipoprotein(a)// Atherosclerosis. - 1997. - V.134. - N.1-2. - P.152.

22. M.V. Ezhov, O.I.Afanasieva, G.F. Benevolenskaya, A.A. Lyakishev, S.N. Pokrovsky. The relationship between lipoprotein(a), apolipoprotein(a) isoforms аnd coronary atherosclerosis// Abstract book of 9th International Dresden Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis, Dresden, Germany. - 1997. - P.90.

23. E.B. Yarovaya, A.V. Sussekov, O.I. Afanasieva, S.N. Pokrovsky, V.V. Kukharchuk. Model fitting to study Lp(a) kinetics in vivo using Lp(a) apheresis results// Abstract book of 9th International Dresden Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis. Dresden, Germany. - 1997. - P.77.

24. S. Pokrovsky, A. Sussekov, O. Afanasieva, I. Adamova, V. Kukharchuk. Lp(a)-apheresis. What we can say today// Japanese Journal of Apheresis. - 1997. - V.16. - № 1. - P. 72-77.

25. M.V. Ezhov, A.A. Lyakishev, O.I. Afanasieva, G.F. Benevolenskaya, T.Yu. Polevaja, S.N.

Pokrovsky. Association of apolipoprotein(a) phenotype with premature coronary heart disease in men// Eur. Heart J. - 1998. - № 19. - Suppl. - P. 347.

26. M.V. Ezhov, O.I. Afanasieva, G.F. Benevolenskaya, S.N. Pokrovsky. Lipoprotein(a) abnormalities in coronary heart disease patients.// Abstract book of 13th International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism, Florence, Italy. - 1998. - P.30.

27. Акчурин Р. С., Ильина Л. Н., Синицин В. Е., Савченко А. П., Афанасьева О. И., Беневоленская Г. Ф., Покровский С. Н. Влияние Лп(а) и других показателей липидного спектра крови на проходимость шунтов в течении 1 года после операции коронарного шунтирования.// Материалы 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, Москва, 1999. C. 173.

28. Ежов М.В., Афанасьева О.И., Лякишев А.А., Беневоленская Г.Ф., Савченко А.П., Покровский С.Н. Липопротеид(а) как фактор риска коронарного атеросклероза.// Материалы 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, Москва. - 1999. - C. 66.

29. М.В. Ежов, О.И. Афанасьева, А.А. Лякишев, С. Н. Покровский. Связь фенотипа апобелка(а) с наличием ишемической болезни сердца у мужчин в молодом возрасте.// Кардиология. - 1999. - № 4. - С.12-15.

30. Ильина Л.Н., Афанасьева О.И., Беневоленская Г.Ф., Синицин В.Е., Савченко А.П., Королев С.В., Покровский С.Н., Акчурин Р.С. Связь уровня Лп(а) с проходимостью шунтов в течении первого года после операции коронарного шунтирования.// Кардиология. - 1999. - Т. 39. - № 10. - P. 7-14.

31. Ильина Л.Н., Афанасьева О.И., Ежов М.В., Беневоленская Г.Ф., Акчурин Р.С., Покровский С.Н. Динамика липидного спектра крови в течение первых двух месяцев после операции коронарного шунтирования.// Ангиология и сосудистая хирургия. - 1999. - №3.- C. 15-18.

32. Покровский С.Н., Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Ежов М.В., Ильина Л.Н., Арабидзе Гр.Г. (мл.), Акчурин Р.С. Липопротеид(а) и развитие атеросклеротических поражений в коронарных и сонных артериях// Центрально-азиатский медицинский журнал. - 1999. - Т. V, приложение. - С.29.

33. M.V. Ezhov, O.I. Afanasieva, G.F. Benevolenskaya, S.N. Pokrovsky. Lipoprotein(a) in coronary heart disease patients: is there a need to lower it?// Cardiovasc. Drugs and Therapy. - 1999. - V.

13. - № 1. - P.10.

34. M.V. Ezhov, A.A. Lyakishev, O.I. Afanasieva, G.F. Benevolenskaya, S.N. Pokrovsky.

Association of apolipoprotein(a) phenotypes with history of myocardial infarction in young men.// The Journal of Heart Disease. - 1999. - V.1. № 1. - P. 122.

35. IlТina L.N., Afanasieva O.I., Ezhov M.V., Benevolenskaya G.F., Akchurin R.S., Pokrovsky S.N.

Changes in plasma lipid profile during the first two months after coronary artery bypass surgery.// The Journal of Heart Disease. - 1999. - V.1.- №.1.- P.203.

36. Pokrovsky S., Afanasieva O., Adamova I., Benevolenskaya G., Sussekov A., Kukharchuk V.

Lp(a)-apheresis new approach for the lipoprotein(a) lowering in severe CHD patients.// Transfusion Science - 1999. -V. 21.- №3.- P.219.

37. M.V. Ezhov, A.A. Lyakishev, O.I. Afanasieva, G.F. Benevolenskaya, T.V. Balakhonova, S.N.

Pokrovsky. Carotid atherosclerosis in coronary heart disease patients: association with lipoprotein(a) level and apolipoprotein(a) phenotypes.// Abstract book of 5th International Symposium on Multiple Risk factors in Cardiovascular Disease, Venice, Italy. - 1999. - P.90.

38. J.V. Dotsenko, M.V. Ezhov, O.I. Afanasieva, A.A.Lyakishev, V.G. Naumov, S.N. Pokrovsky.

Effect of hormonal replacement therapy on Lipoprotein(a) level in postmenopausal women with coronary heart disease.// Abstract book of 5th International Symposium on Multiple Risk factors in Cardiovascular Disease, Venice, Italy. - 1999. - P.43.

39. G. G. Arabidze Jr., M. V. Ezhov, O.I. Afanasieva, G. F. Benevolenskaya, S. N. Pokrovsky. Trend to higher lipoprotein(а) levels in men with acute coronary syndromes.// Abstract book of 5th International Symposium on Multiple Risk factors in Cardiovascular Disease, Venice, Italy. - 1999.

- P.87.

40. Pokrovsky S., Afanasieva O, Adamova I., Benevolenskaya G., Sussekov A., Kukharchuk V.

Lipoprotein(a) extracorporeal elimination by immunoadsorption - new tool for the treatment of severe CHD patients.// Abstract book of the 5th International Symposium Multiple Risk Factors in Cardiological Disease: Global Assement and Intervention. Venice, Italy. - 1999. - P.90.

41. L.N. IlТina, O.I. Afanasieva, M.V. Ezhov, I.Yu. Adamova, V.E. Sinitsin, A.P. Savchenko, S.V.

Korolev, R.S. Akchurin, S.N. Pokrovsky. Association of lipoprotein(a) level with the patency of grafts during the first year after coronary artery bypass surgery.// Abstract book of 5th Int.

Symposium on Multiple Risk factors in Cardiovascular Disease, Venice, Italy. - 1999. - P.89.

42. Акчурин Р.С., Ильина Л.Н., Афанасьева О.И., Беневоленская Г.Ф., Синицин В.Е., Покровский С.Н. Лп(а) как фактор риска окклюзирования аутовенозных шунтов в течении первого года после операции коронарного шунтирования.// Материалы Симпозиума Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза Ассоциации кардиологов СНГ, Москва. - 2000.- С.1.

43. М.В. Ежов, О.И. Афанасьева, Г.Ф. Беневоленская, А.П. Савченко, Т.В. Балахонова, А.А.

якишев, С.Н. Покровский. Связь липопротеида(а) и фенотипа апобелка (а) с атеросклерозом коронарных и сонных артерий у мужчин с ишемической болезнью сердца.// Тер. архив.- 2000. - № 1. - С.28-32.

44. Pokrovsky S., Afanasieva O., Adamova I., Benevolenskaya G., Sussekov A., Straube R, Kukharchuk V. Lipoprotein (a) extracorporeal elimination by specific immunoadsorption for the treatment of CHD patients.// Atherosclerosis. - 2000.- V.151.- №1. - P.249.

45. S. Pokrovsky, I. Adamova, O. Afanasieva, H. Borberg. Comparison of two system for LDLapheresis: immunoadsorption and hole blood perfusion.// Atherosclerosis. - 2000.- V.151.- №1. - P.284-246. M.V. Ezhov, O.I. Afanasieva, G.F. Benevolenskaya, T.V. Balakhonova, A.A. Lyakishev, S.N.

Pokrovsky. Carotid atherosclerosis and lipoprotein(a) in coronary heart disease patients.// Atherosclerosis. - 2000.- V.151.- №1. - P.160.

47. S. Pokrovsky, L.Il`ina, M.Ezhov, O. Afanasieva, V. Sinitsin, A. Savchenko, S. Korolev, R.

Akchurin. Lipoprotein(a) and patency of the grafts after coronary bypass surgery.// Atherosclerosis. - 2000.- V.151.- №1. - P.249-250.

48. M. Ezhov, O. Afanasieva, I. Adamova, G. Benevolenskaya, A. Savchenko, A. Lyakishev, S.

Pokrovsky. Lipoprotein(a) level predicts myocardial infarction in young men.// Atherosclerosis. - 2000.- V.151.- №1. - P.304.

49. Бритарева В.В., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Добровольский А.Б., Покровский С.Н., Карпов Ю.А. Связь липопротеида(а) с наличием ишемической болезни сердца у больных с эссенциальной гипертонией.// Материалы 2 международной научно-практической конференции Наука и образование в XXI веке, Москва. - 2001. - С.50.

50. Бритарева В.В., Афанасьева О.И., Добровольский А.Б., Титаева Е.В., Карпов Ю.А., Покровский С.Н. Липопротеид(а) и ишемическая болезнь сердца у больных гипертонической болезнью. // Кардиология. - 2002. - Т. 42. №. 5. С.4-8.

51. Козлов С.Г., Доценко Ю.В., Санкова А.В., Лякишев А.А., Творогова М.Г., Афанасьева О.И., Титов В.Н., Покровский С.Н., Наумов В.Г. Динамика показателей липидного обмена под влиянием заместительной гормональной терапии у женщин в постменопаузе с сахарным диабетом 2-го типа. // Кардиология.- 2002.- Т. 42. - № 7. - С. 47-52.

52. В.В. Бритарева, О.И. Афанасьева, А.Б. Добровольский, М.В.Ежов, Е.В.Титаева, Ю.А.Карпов, С.Н. Покровский. Липопротеид(а) и изоформы апо(а) у больных с перемежающейся хромотой.// Тер. архив. - 2002. - № 12. С. 49-52.

53. Коновалов Г.А., Чебышев А.Н., Смольников В.С., Адамова И.Ю., Афанасьева О.И., Кипор С.Г., Покровский С.Н. Аферез липидов с использованием колонок "ЛНП-Липопак" и "Лп(а)Липопак" в лечении больных ИБС с нарушениями липидного обмена// Материалы первого объединенного конгресса "Актуальные проблемы экстракорпорального очищения крови, нефрологии и гемафереза" Москва. - 2002. - С. 164-165.

54. Ежов М.В., Матчин Ю.Г., Афанасьева О.И., Савченко А.П., Полевая Т.Ю., Наумов В.Г., Покровский С.Н. Связь липопротеида(а) с ангиографическим рестенозом после коронарного стентирования// Материалы Российского национального конгресса кардиологов, СанктПетербург. - 2002. - С.133.

55. Чернядьева И.Ф., Н.С.Лопата, О.И. Афанасьева, С.Н.Покровский, В.В.Кухарчук. Динамика соотношения уровней аполипопротеина(а) и липидов плазмы крови человека при взаимодействии с поликлональными антителами барана к липопротеиду (а)// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2002.- Т.133.- №4. - С.354-356. Afanasieva O.I., Kukharchuk V.V., Konovalov G.A., Chebyshev A.N., Porkovsky S.N. Lp(a) apheresis - new approach in the therapeutic apheresis technology.// Abstract book of 9th Congress of the World Apheresis Assosiation, France, Paris. - 2002.- P.57. M.V. Ezhov, Y.G. Matchin, A.P. Savchenko, O.I. Afanasieva, T.Y. Polevaya, V.G. Naumov, S.N.

Pokrovsky. Lipoprotein(a) is associated with angiographic restenosis after coronary stenting.// Atherosclerosis.- 2002.- V.3.- №.2.- P. 106.

58. Адамова И.Ю., Афанасьева О.И., Кузнецова Ю.В., Коновалов Г.А., Покровский С.Н.

Эффективность удаления патогенных компонентов в процедурах иммуносорбции.// Эфферентная терапия.- 2003.- N.9.- №1. - C. 51.

59. Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Сусеков А.В., Кухарчук В.В., Покровский С.Н.

Специфический аферез липопротеида(а) - новый подход к лечению больных с тяжелыми формами атеросклероза.// Эфферентная терапия.- 2003.- N.9.- №1. - C.52.ВАК 60. Кипор С.Г., Афанасьева О.И., Адамова И.Ю. Разработка и производство иммуносорбционных колонок для терапевтического афереза. Обеспечение безопасности.// Эфферентная терапия.- 2003.- N.9.- №1. - C. 89-90.

61. Ежов М.В., Афанасьева О.И., Чернина Г.В., Афанасьева М.И., Наумов В.Г., Покровский С.Н. Гомоцистеин у больных ИБС молодого возраста.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2003.- Т.2.- №3.- С. 162. S. Pokrovsky, R. Straube, O. Afanasieva, I. Adamova, A. Sussekov and V. Kukharchuk.

Lipoprotein (a) apheresis by specific immunoadsorption is the single way for effective treatment of severe CHD patients with elevated Lp(a) level// Ther Apher & Dial. - 2003.- V. 7.- №. 5. - P.11.

63. Pokrovsky S.N., Ezhov M.V., IlТina L.N., Afanasieva O.I., Sinitsyn V.Y., Shiriaev A.A., Akchurin R.S. Association of lipoprotein(a) excess with early vein graft occlusions in undergoing coronary bypass surgery.// The Journal of Thoraric and Cardiovaskular Surgery.- 2003.-, Vol.

126.- №4.- P. 1071-1075.

64. M.V. Ezhov, A.A. Lyakishev, M.I. Afanasieva, O.I. Afanasieva, V.G. Naumov, S.N. Pokrovsky.

Homocysteine and premature coronary heart disease.// Atherosclerosis Suppl.- 2003.-V.4.- №.2.- P. 122-123.

65. Pokrovsky S., Straube R., Afanasieva O., Kukharchuk V. Lipoprotein(a) apheresis is the unique method for treatment of severe CHD patients// Atherosclerosis Suppl. - 2003- V. 4.- №2. - p.292.

66. Арабидзе Г.Г., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Маметов К.А., Скрябина Е.О., Инанеишвили И.Г. Связь липопротеида(а) и аполипопротеина В100 как факторов риска с развитием инфаркта миокарда.// Медицина критических состояний.- 2005.- №3.- С.20-23.

67. Арабидзе Г.Г., Ипатов А.И., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Скрябина Е.О.

Исследование показателей липидного профиля, липопротеида(а), аполипопротеида В100 у больных инфарктом миокарда с различной локализацией и глубиной поражения// Кардиоваскулярная терапия и профилактика.- 2005.- Т4.- №S2.- С.21.

68. Теблоев К.И., Арабидзе Г.Г., Полякова О.В., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Скрябина Е.О. Роль липопротеида(а) и аполипопротеина В-100 в развитии ишемической болезни сердца.// Российский кардиологический журнал.- 2005.- №5.- с.20-23.

69. Pokrovsky S.N., IlТina L.N., Afanasieva O.I., Ezhov M.V., Sinitsyn V.Y., Akchurin R.S.

Association of elevated Lp(a) with early vein graft occlusions after CABG.// Аbstracts of 75 EAS Congress, Prague.- 2005.- P. 24.

70. S. Pokrovsky, R. Straube, O. Afanasieva, V. Kukharchuk and G. Konovalov. Lp(a) apheresis for the treatment of severe CHD patients with Lp(a) hyperlipidemia.// Ther Apher Dial.- 2005.- V. 9.- №. 5.- P. 40.

71. Арабидзе Г.Г., Скрябина Е.О., Инанеишвили И.Г., Афанасьева О.И. Роль повышения уровней липопротеида (а) и аполипопротеина В-100 у больных ишемической болезнью сердца и их взаимосвязь с содержанием холестерина и триглицеридов.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2006. - Т. 5. - № 5. - С. 14-20.

72. Алтынова Е.В., Афанасьева О.И., Болдырев А.Г., Потокин И.Л., Соколов А.А., Афанасьева М.И., Покровский С.Н. Гемосорбенты для удаления атерогенных липопротеидов (in vitro сравнение).// Эфферентная терапия.- 2006.- Т.12..- №4.- C. 3-73. Афанасьева О.И., Алтынова Е.В., Болдырев А.Г., Соколов А.А., Адамова И.Ю., Покровский С.Н. Сравнение эффективности и специфичности различных сорбентов для афереза липопротеидов низкой плотности.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2006.- Т. 142.- № 5.- P.532-536.

74. Афанасьева О.И., Алтынова Е.В., Кузнецова Ю.В., Болдырев А.Г., Соколов А.А., Потокин И.Л., Адамова И.Ю., Покровский С.Н. Иммуногемосорбенты для перфузии цельной крови (синтез и характеристика).// Эфферентная терапия.- 2006.- Т. 12.- №4.- C. 15-20.

75. Афанасьева О.И., Ильина Л.Н., Ежов М.В., Афанасьева М.И., Беневоленская Г.Ф., Акчурин Р.С., Покровский С.Н. Влияние уровня Лп (а) и фенотипа апо (а) на клиническое состояние больных после операции реваскуляризации миокарда.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика.- 2006.- Т.5.- №6.- С. 32.

76. Ежов М.В., Камбегова А.А., Афанасьева О.И., Наумов В.Г., Лякишев А.А., Покровский С.Н.Связь липопротеида (а) и низкомолекулярного фенотипа апобелка(а) с атеросклерозом коронарных артерий в молодом возрасте.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика.- 2006.- Т.5.- №6.- С.177. Афанасьева О.И., Адамова И.Ю., Дмитриева О.А., Афанасьева М.И., Кипор С.Г., Коновалов Г.А., Покровский С.Н.Аферез липидов - эффективный способ лечния больных с тяжелыми формами сердечно-сосудистых заболеваний.// Материалы научно-практической конференции "Актуальные вопросы экстракорпоральной терапии". Москва. - 2007. - С.8182.

78. L.N. Ilyina, O.I. Afanasieva, M.V. Ezhov, M.I. Afanasieva, V.E. Sinitsyn, R.S. Akchurin, S.N.

PokrovskyLp(a) andapo(a) phenotype and with patency of vein graft in patients after CABG.// Atherosclerosis Suppl. - 2007. - V. 8. - № 1. - P. 35А.

79. M.V. Ezhov, A.A. Lyakishev, O.I. Afanasieva, M.I. Afanasieva, V.V. Kukharchuk, S.N.

Pokrovsky. High lipoprotein(a) and low-molecular weight apo(a) phenotypes predispose to coronary occlusions// Atherosclerosis Suppl. - 2007. - V. 8. - № 1. - P. 150А.

80. O.I. Afanasieva, M.V. Ezhov, A.A. Lyakishev, M.I. Afanasieva, V.V. Kukharchuk, S.N.

Pokrovsky. Lipoprotein(a) and apo(a) phenotypes are associated with carotid atherosclerosis in younger coronary heart disease patients// Atherosclerosis Suppl. - 2007. - V. 8. - № 1. - P. 35А.

81. S.N. Pokrovsky, I.Y. Adamova, O.I. Afanasieva, S.G. Kipor, G.A. Konovalov, V.V. Kukharchuk.

LDL and Lp(a) apheresis for the treatment of severe lipid abnormalities.// Atherosclerosis Suppl. - 2007. - V. 8.- № 1.- P. 186.

82. Ежов М.В., Трухачева Е.П., Афанасьева О.И., Афанасьева М.И., Камбегова А.А., Лякишев А.А., Покровский С.Н.Связь липопротеида(а) и гомоцистеина с коронарным атеросклерозом у мужчин молодого и среднего возрастов.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика.

- 2008. - №5. - С.10-15.

83. M.V. Ezhov, O.I. Afanasieva, E.P. Trukhacheva, A.A. Lyakishev, S.N. Pokrovsky. Risk factors associated with coronary atherosclerosis in young men// Abstract book of 7th International Symposium on УMultiple risk factors in cardiovascular diseases - Prevention and Intervention - Heath PolicyФ Venice, Italy.- 2008.- P. 78.

84. Ежов М.В., Афанасьева О.И., Камбегова А.А., Афанасьева М.И., Трухачева Е.П., Наумов В.Г., Покровский С.Н. Роль факторов риска атеросклероза в развитии ишемической болезни сердца у мужчин молодого возраста.// Тер. архив.- 2009.- №.5. C.50-53.

85. Ежов М.В., Доценко Ю.В., Афанасьева О.И., Матчин Ю.Г., Афанасьева М.И., Лякишев А.А., Покровский С.Н.Связь повышенного уровня липопротеида(а) с рестенозом и прогрессированием атеросклероза после чрезкожных коронарных вмешательств// Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2009.- Т.8.- № S6.- С. 112-113.

86. Pokrovsky S.N., Afanasieva O.I., Ezov M.V., Adamova I.Yu., Kipor S.G., Konovalov G.A.

Specific Lp(a) Apheresis. Whom, When and How?.// Ther Apher Dial.- 2009.- V. 13.- № 1.- P.11.

87. M.V. Ezhov, Y.G. Matchin, O.I. Afanasieva, M.I. Afanasieva, J.V. Docenko, A.A. Lyakishev, S.N. Pokrovsky. Association of lipoprotein(a) with clinical events after percutaneous coronary intervention.// Atherosclerosis Suppl. - 2009. - V. - 10. - № 2. P. 984A 88. S.N. Pokrovsky, O.I. Afanasieva, M.V.Ezhov, I. Yu. Adamova, G.A.Konovalov, S.G.Kipor.

Specific Lp(a) apheresis by УLp(a) LipopakФо columns - unique approach for effective Lp(a) elimination.// Atherosclerosis Suppl. - 2009. - V. - 10. - № 2. P. 1339.

89. О.И. Афанасьева, М.В. Ежов, М.И. Афанасьева, М.С. Сафарова, Ю.В. Берестецкая, С.Н.

Покровский. Связь низкомолекулярного фенотипа апобелка(а) и концентрации липопротеида(а) с мультифокальным атеросклерозом у больных ишемической болезнью сердца.// Рациональная Фармакотерапия в Кардиологии.- 2010.- T. 6.- № 4.- C. 474-490. Афанасьева О.И., Ежов М.В., Сафарова М.С., Афанасьева М.И., Адамова И.Ю., Покровский С.Н.Полиморфизм липопротеида(а) как фактор риска коронарного и каротидного атеросклероза и их осложнений у женщин.// Кардиоваскулярная терапия и профилактика.- 2010. - Т. 9.- № 6. - С. 10-16.

91. Ежов М.В., Афанасьева О.И., Сафарова М.С., Афанасьева М.И., Соболева Д.И., Лякишев А.А., Покровский С.Н. Связь повышенного уровня липопротеида(а) с поражением венозных анастомозов и ухудшением прогноза после коронарного шунтирования.// Материалы Конгресса ВНОК, Москва. - 2010.

92. Афанасьева О.И., Ежов М.В., Афанасьева М.И., Сафарова М.С., Соболева Д.И., Лякишев А.А., Покровский С.Н. Полиморфизм липопротеида(а) как фактор риска коронарного атеросклероза и его осложнений у женщин.// Материалы Конгресса ВНОК, Москва. - 2010.

93. Сафарова М.С., Ежов М.В., Афанасьева О.И., Ильина Л.Н., Покровский С.Н.

ипопротеид(а) как предиктор неблагоприятного прогноза в отдаленные сроки после операции коронарного шунтирования.// Бюллетень НЦССХ Сердечно-сосудистые заболевания. - 2010. - №. 11.- С.71.

94. Сафарова М.С., Ежов М.В., Афанасьева О.И., Ильина Л.Н., Коновалов Г.А., Покровский С.Н. Влияние комбинации каскадной плазмофильтрации с аторвастатином на проходимость венозных шунтов через 3 месяца после операции коронарного шунтирования.// Бюллетень НЦССХ Сердечно-сосудистые заболевания. - 2010. - №. 11.- С.259.

95. M. Ezhov, O. Afanasieva, A. Lyakishev, M. Afanasieva, R. Akchurin, S. Pokrovsky.High Lipoprotein(a) level is associated with poor long-term prognosis after coronary artery bypass grafting.// Atherosclerosis Suppl.- 2010.- V.11.- № 2.- P.48.

96. M. Safarova, M.Ezhov, O. Afanasieva, A. Lyakishev, S. PokrovskyAssociation of elevated lipoprotein(a) level with premature coronary heart diseases in man and women.// Atherosclerosis Suppl.- 2010.- V.11.- № 2.- P.48.

97. E. Trukhacheva, M. Ezhov, V. Titov, O. Afanasieva, M. Afanasieva, A. Lyakishev, V.

Kukharchuk, S. Pokrovsky. Effect of niacin with atorvastatin on secretory phospholipase A2 in men with coronary heart disease and lipoprotein(a) excess.// Atherosclerosis Suppl.- 2010.- V.11.- № 2.- P.178.

98. Ежов М.В., Матчин Ю.Г., Сафарова М.С., Соболева Д.И., Афанасьева О.И., Покровский С.Н.Связь высокого уровня липопротеида(а) с проходимостью коронарных артерий в течение первого года после чрескожных коронарных вмешательств.// Клиницист.- 2011.- №1.- С.18-24.

99. Афанасьева О.И. Коррекция повышенного уровня липопротеида(а) методами терапевтического афереза.// Вестник МЕДСИ. - 2011. - №10. - С.28-36.

100. Ежов М.В., Сафарова М.С., Афанасьева О.И., Ильина Л.Н., Лякишев А.А., Покровский С.Н. Высокий уровень липопротеида (а) как предиктор неблагоприятного прогноза в отдаленные сроки после операции коронарного шунтирования.// Кардиология 2011. - №1. - С. 18 - 23.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ- артериальная гипертония НМ апо(а) - низкомолекулярные Апо(а) - апобелок (а) изоформы апобелка(а) АпоВ100 - апобелок В100 ОР - относительный риск ВМ апо(а) - высокомолекулярные ОХС - общий холестерин изоформы апобелка(а) ОШ - отношение шансов ВЭМ - велоэргометрия ПААГ - полиакриламидный гель ГЛп(а) - гиперлипопротеидемия (а) ПАП - комплекс плазминДИ - доверительный интервал антиплазмин ИАП-1 - ингибитор активатора ПкАт - поликлональные антитела плазминогена 1 типа ПХ - перемежающаяся хромота ИБС - ишемическая болезнь сердца РИД - радиальная иммунодиффузия ИМ - инфаркт миокарда СРБ - С-реактивный белок ИФА - иммуноферментный анализ ССЗ - сердечно-сосудистые K IV2 - IV крингл типа 2 заболевания КАГ - коронарная ангиография ТАП-ИАП - комплекс тканевой КШ - коронарное шунтирование активатор плазминогена/ ингибитор ЛВП - липопротеиды высокой активатора плазминогена 1 типа плотности ТГ - триглицериды ЛНП - липопротеиды низкой ТИМ - толщина комплекса интимаплотности медиа ЛОНП - липопротеиды очень низкой ФК - функциональный класс плотности ХС ЛВП-холестерин липопротеидов Лп(а) - липопротеид(а) высокой плотности МкАт - моноклональные антитела ХС ЛНП - холестерин липопротеидов НЛп(а) - нормальный низкой плотности (<30 мг/дл) уровень Лп(а) ЭХОКГ - эхокардиография НК - нижние конечности IgG Циммуноглобулины класса G Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии