Geum.ru
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

Смольникова Яна Викторовна

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ DIGITALIS PURPUREA L.

В УСЛОВИЯХ IN VITRO И ПОЛУЧЕНИЕ СЕРДЕЧНЫХ

ГЛИКОЗИДОВ НА ЕЁ ОСНОВЕ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата

технических наук

Красноярск - 2012

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Сибирский государственный технологическинй университет на кафедре Химическая технология древесины и биотехнология, г. Красноярск.

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор  Величко Надежда Александровна

Официальные оппоненты:

Войнов Николай Александрович, доктор технических наук, профессор, Сибирский государственный технологический университет, кафедра Машины и аппараты промышленных технологий, профессор.

Балдаев Николай Сергеевич, кандидат технических наук, доцент, ФГБОУ ВПО Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управлениня, Институт пищевой инженерии и биотехнологии, кафедра Биотехнолонгия, доцент.

Ведущая организация: Института леса им. В. Н. Сукачева СО РАН

Защита диссертации состоится 19 апреля 2012 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.253.01 Сибирского государственного технологического университета по адресу: 660049, г.аКрасноярск, проспект Мира,а82. E-mail: dissovetsibgtu01@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского государственного технологического университета.

Отзывы (в двух экземплярах) с заверенными подписями просим направнлять ученому секретарю диссертационного совета по адресу: 660049, г.аКрасноярск, проспект Мира, 82.

Автореферат разослан                        марта 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета                        Исаева Елена Владимировна

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Среди лекарственных средств, применяемых в современной фармакотерапии сердечно-сосудистых заболеваний, препараты наперстянки занимают особое место. Хотя они насчитывают несколько веков истории, их мощное кардиотоническое действие пока ничем не удалось заменнить, и все лекарства этой группы вырабатываются только из растений.

В то же время, выход сердечных гликозидов из растения является непонстоянной величиной и зависит от климатических условий, срока вегетации раснтения, от времени суток, в которое производится сбор. Календарные сроки уборки ограничены.

Одним из решений данной проблемы является использование в качестве сырья культуры ткани. Культивируемые клетки высших растений способны синтезировать традиционно используемые продукты растительного происхожндения, создавать принципиально новые вещества, трансформировать дешевые предшественники в ценный продукт.

Известны работы, описывающие производство сердечных гликозидов в культуре ткани наперстянки пурпурной (Digitalis purpurea L.), однако, выход продукта остается довольно низкий. Ряд проведенных исследований показынвает, что при правильном подборе условий культивирования, использовании различных гормональных сред, изменении светового режима, воздействия элинситоров, или других стрессогенных факторов (ультрафиолетового излучения) можно существенно повлиять на синтез вторичных метаболитов.

Цель работы Ц разработать условия культивирования in vitro и устанонвить их влияние на повышение продуктивности клеточной культуры Digitalis purpurea L.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:

- изучить особенности введения в культуру Digitalis purpurea L., устанонвить закономерности влияния способов культивирования на продуктивность клеточных тканей;

- исследовать влияние эпигенетических, стрессогенных факторов на рост, развитие и накопление сердечных гликозидов в каллусной ткани Digitalis puprurea L.;

- установить закономерности влияния физико-химических факторов на прирост биомассы и накопление гликозидов и провести оптимизацию процесса культивирования каллусной ткани Digitalis puprurea L.;

- определить химический состав полученной каллусной ткани Digitalis puprurea L.;

- разработать математическую модель и подобрать условия выделения гликозидов из каллусной ткани Digitalis puprurea L.;

- разработать принципиальную технологическую схему получения серндечных гликозидов в культуре ткани Digitalis puprurea L.

Положения, выносимые на защиту:

В рамках специальности 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанонтехнологии), пункт 3, решена задача, состоящая в  изучении и разработке техннологических режимов выращивания культуры клеток Digitalis puprurea L. для получения биомассы и производства сердечных гликозидов на ее основе. В чанстности:

- оптимальные технологические режимы культивирования каллусной ткани Digitalis purpurea L., обеспечивающие высокую скорость роста культуры и накопление гликозидов в каллусной ткани. Использование пенополиуретанонвых пластин в качестве инертного носителя для иммобилизации и облучение каллусной ткани Digitalis purpurea L. УФ-излучением, позволяет повысить содержание сердечных гликозидов в культуре и выход дигитоксина;

- математическая модель и принципиальная технологическая схема выделения гликозидов из каллусной ткани Digitalis puprurea L., позволяющие использовать культуру клеток Digitalis puprurea L. в качестве альтернативного сырья для производства фармацевтических препаратов сердечных гликозидов.

Научная новизна. Определены условия введения в культуру in vitro Digitalis puprurea L., установлены зависимости влияния фитогормонов, условий и способов культивирования на цитофизиологические и биохимические характеристики каллусной ткани.

Установлены закономерности влияния условий культивирования на выход биомассы и накопление гликозидов в каллусной ткани; разработана математическая модель их выделения.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований получена высокопродуктивная клеточная культура Digitalis puprurea L. с содержанием дигитоксина в 3,5 раза выше, чем в растении, что дает возможность использовать полученную каллусную ткань в качестве альтернативного источника сырья для производства сердечных гликозидов.

Разработаны оптимальные условия культивирования и извлечения гликозидов из каллусной ткани Digitalis puprurea L.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на международной конференции Проблемы современной аграрной науки (Красноярск, 2009, 2010); всероссийских научно-практических конференциях Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития (Красноярск, 2009, 2010); Лесной и химический комплексы - проблемы и решения (Красноярск 2009, 2010); Молодые ученые в решении актуальных проблем науки (Красноярск, 2010, 2011); региональной научно-практической конференции Химия и жизнь (Новосибирск, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 (из них автора 1,49 п. л.) печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, выводов, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 120 страницах. Диссертация содержит 32 рисунка и 16 таблиц. Библиографический список включает в себя 145 источников, из них 52 на иностранных языках.

Список принятых сокращений:

2,4-ДаЦа2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, 6-БАПаЦа6-бензиламинопурин, -НУКаЦа-нафтилуксусная кислота, ИУКаЦаиндолилуксусная кислота, УФ-излучение - ультрафиолетовое излучение.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследований, показаны научная новизна и практическая ценность результатов работы.

Глава 1. Аналитический обзор содержит анализ и обобщение литературы по использованию метода культуры растительных клеток как альтернативного способа производства промышленно значимых метаболитов. Проанализированы данные о способах регуляции вторичного метаболизма в культуре in vitro, показана возможность использования биомассы, полученной в результате выращивания клеток и тканей in vitro, с целью получения экономически значимых целевых продуктов. Рассмотрены примеры технологий получения лекарстенных препаратов, биологически активных добавок и лечебно-профилак-тических косметических средств, основанных на использовании культуры тканей. Приведены данные по фармацевтической значимости и использованию представителей рода Digitalis. Особое внимание уделено поиску информации о культивировании in vitro представителей рода Digitalis, показана целесообразность использования биомассы клеток Digitalis puprurea L. как альтернативного источника сырья для получения сердечных гликозидов.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

Объект исследований: исходные, интактные растения и каллусная ткань Digitalis puprurea L. Материалом для введения в культуру являлись семена D.аpurpurea L., предоставленные Ивановской государственной сельскохозяйственной академией имени академика Д.аК.аБеляева.

Методы исследования. Для получения стерильных интактных растений семена наперстянки пурпурной стерилизовали при различных условиях и высаживали на агаризованную питательную среду с различным минеральным составом. Побеги культивировали на свету (3500 люкс) с фотопериодом 16ач день, 8ач ночь по методике Р.аГ.аБутенко.

Для получения каллусных тканей Digitalis purpurea L. каллусообразование стимулировалось искусственными регуляторами роста гормональной природы (2,4-Д, 6-БАП, -НУК, ИУК, кинетин).

Иммобилизацию каллусных тканей Digitalis purpurea L. проводили в ламинар-боксе на пенополиуретановые пластины толщиной слоя 20амм и диаметром около 50амм и силикагель. Для получения суспензионной культуры, кусочки ткани инкубировали в колбе объемом 500амл, на качалке с частотой 80аоб/мин, амплитудой вращения 2асм.

Анализ цитофизиологических параметров проводили на 3, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 30, 33-е сутки культивирования. Массу сырого каллуса оценивали на основании взвешивания не менее 10 трансплантов. Плотность каллуса (количество клеток на 1амг сырой биомассы) определялась в 5-кратной повторности путем подсчета клеток в камере Фукса Розенталя после мацерации 100амг каллуса в 20 %-й хромовой кислоте при 60аС. Жизнеспособность клеток оценивали после окраски 0,5 %-м метиленовым синим и анализа не менее 500аклеток в 3-кратной повторности. Удельную скорость роста определяли как отношение разности между конечной и начальной массой к начальной массе каллусной ткани в единицу времени. Результаты обрабатывали статистически с вычислением средних арифметических и доверительных интервалов при 95 %-м уровне значимости.

Изучение химического состава интактного растения и каллусной ткани проводили по стандартным методикам.

Определение суммарного содержания флавоноидов осуществляли спектрофотометрическим методом с использованием комплексообразующей реакции с алюминия хлоридом, суммарное содержание сапонинов - гравиметрическим методом, содержание аскорбиновой кислоты - титриметрическим методом (реакция Тильмана).

Хлорофиллы a, b и каротиноиды определяли спектрофотометрически, измерением оптической плотности вытяжки пигментов при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения хлорофиллов a (663анм), b (645анм), каротиноидов (440,5анм), с последующим расчетом концентрации пигментов по уравнениям Ветштейна и Хольма для 100 %-го ацетона.

Общее содержание гликозидов определяли по методу А.аИ.аЕрмакова с изменениями П.аМ.аЛошкарева (Всероссийский НИИ лекарственных и ароматических растений Ч ВИЛАР). Количественное определение дигитоксина осуществляли хроматоспектрофотометрическим методом.

Определение гликозидов методом высокоэффективный жидкостной хроматографии проводили на приборе Agilent Technologies 1200 (США). Обработку полученных результатов производили с использованием программного обеспечения ППаМультихрома1.5 (Ampersand Ltd. 2005).

Математическое моделирование проводили с использованием методов регрессионного анализа с помощью пакетов программ Statistica 11, DataFit 8.1. и Maple.

Глава 3. Культивирование in vitro Digitalis purpurea L.

Для культивирования стерильных проростков наперстянки были использованы агаризованные среды без добавления гормонов с минеральными основами по Мурасиге и Скугу, Блейдза, Гамборга и Уайта.

Наиболее подходящей для прорастания и развития стерильных семян наперстянки оказалась среда с минеральной основой по Мурасиге и Скугу. На этой среде наблюдались высокая жизнеспособность (93,52а%) и быстрое прорастание семян Ч 10 сут (прорастание семян в почве составляет в среднем 14асут).

В ходе эксперимента, направленного на выяснение роли экзогенных регуляторов роста в индукции каллусогенеза, определяли качественные характеристики каллусной ткани, начало и частоту каллусогенеза. На каждую среду высаживалось по 40 эксплантов.

Максимальная частота каллусогенеза (80,3а%) наблюдалась на среде с содержанием гормона 2,4-Д в концентрации 0,1амг/л.

Для накопления биомассы, полученную каллусную ткань переносили на среды с минеральной основой по Мурасиге и Скугу, с 3а%-м содержанием сахарозы, с разными концентрациями гормонов и пассировали. Масса транспланта составляла 40амг. Для пересадки брали зеленые рыхлые участки каллуса. Для выяснения влияния гормонального состава сред на рост и развитие каллусной ткани и накопление биомассы была изучена динамика роста каллусной ткани Digitalis purpurea L., определены удельные скорости роста. В конце культивирования определяли суммарную концентрацию гликозидов.

Результаты по влиянию фитогормонов на цитофизиологические параметры и накопление гликозидов в каллусной ткани Digitalis purpurea L. приведены в таблице 1.

Таблицаа1аЧаВлияние фитогормонов на цитофизиологические параметры и накопление гликозидов в каллусной ткани Digitalis purpurea L.

Соотношение гормонов

в среде, мг/л

Максимальный

прирост биомассы,

мг а. с. м./мл среды

Максимальная удельная скорость роста, сутЦ1

Содержание гликозидов,

% от а. с. м.

-НУК 0,1 / 6-БАП 0,1

4,500,22

0,150,03

0,490,02

-НУК 0,2 / 6-БАП 0,1

3,240,15

0,130,01

0,560,01

2,4-Д 0,1 / кинетин 0,1

4,960,34

0,160,02

0,350,03

2,4-Д 0,2 / кинетин 0,1

4,060,22

0,200,04

0,420,03

ИУК 0,2 / 2,4-Д 0,1

7,920,21

0,170,02

0,650,04

ИУК 0,2 / 2,4-Д 0,2

10,320,31

0,220,03

0,670,01

Таким образом, наиболее эффективной для получения биомассы и накопления наибольшего количества гликозидов оказалась среда с гормональным составом ИУК 0,2амг/л и 2,4-Д 0,2амг/л. В дальнейшем культивирование проводили с использованием этой среды.

Для получения суспензионной культуры с Digitalis purpurea L. использовали питательные среды того же состава, что и для выращивания поверхностным способом, но без добавления агара.

Продолжительность культивирования суспензионной культуры составляла около 2427асут, в этот период культура уже находилась в фазе старения, прирост биомассы уменьшался, тогда как при культивировании поверхностным способом рост культуры продолжался в течение 36Ц40 сут.

Индекс роста при суспензионном культивировании был ниже, чем при культивировании поверхностным способом и составил 8,92.

Содержание гликозидов в суспензионной культуре приведено в таблицеа2.

Таблицаа2аЧаСодержание гликозидов в каллусной ткани при различных способах культивирования и в интактном растении Digitalis purpurea L.

Способ культивирования

Гликозиды,

% отаа.ас.ам.

Дигитоксин,

мкг/г а.ас.ам.

Интактное растение

0,710,02

12,100,03

Каллусная ткань, культивируемая на агаре

0,670,03

11,500,03

Каллусная ткань суспензионной культуры

0,640,02

9,810,01

Из результатов таблицы 2 видно, что содержание гликозидов и дигитоксина в суспензионной культуре снижено относительно содержания в растении и в каллусной ткани, культивируемой на агаре. Учитывая также снижение индекса роста и быстрое старение суспензионной культуры, можно предположить недостаточную эффективность данного способа культивирования.

Одним из способов повышения продуктивности каллусных штаммов, является иммобилизация на инертные носители.

В качестве инертных носителей для иммобилизации клеток наперстянки пурпурной были выбраны пенополиуретановые пластины и силикагель марки КСМ7. В качестве контроля использовали агаризованную среду.

Максимальный прирост биомассы наблюдался у тканей, культивируемых на пенополиуретановых пластинах: за цикл выращивания биомасса каллусной ткани увеличивалась более чем в 10 раз; ростовой индекс в конце цикла выращивания достигал 11,16, максимальная скорость роста составляла 0,23асутЦ1. Минимальный прирост биомассы наблюдался при культивировании на силикагеле: ростовой индекс составлял 5,04, максимальная скорость роста составляла 0,08 асутЦ1. Динамика изменения сырой массы каллусной ткани D.аpurpurea на различных носителях приведена на рисунке 1.

Максимальная плотность каллуса наблюдалась у ткани, культивируемой на пенополиуретановых пластинах (8435 клеток/мг), жизнеспособность клеток составила 90,10а%; минимальная плотность и жизнеспособность отмечены при культивировании на силикагеле Ч 6350 клеток/мг и 70,9а% соответственно.

Рисунока1аЧаДинамика изменения сырой массы каллусной ткани D.аpurpurea на различных носителях

Изменения плотности и жизнеспособности каллусной ткани представлены на рисунках 2 и 3.

Рисунока2аЧаПлотность каллусной ткани D. purpurea на различных носителях

Рисунока3аЧаЖизнеспособность клеточной популяции D.аpurpurea на различных носителях

Исследование биохимического состава иммобилизованных каллусных тканей показало отличие в содержании биологически активных веществ в ткани наперстянки пурпурной, выращенной на агаре, силикагеле и пенополиуретане. Содержание биологически активных веществ в каллусной ткани приведено в таблице 3.

Таблицаа3аЧаБиологически активные вещества каллусной ткани Digitalisаpurpurea L., иммобилизованной на различные носители

Наименование компонента

Содержание компонента

агар

пенополиурета-

новые пластины

силикагель

Хлорофилл А, мг%

132,793,05

217,154,10

15,130,22

Хлорофилл В, мг%

102,212,21

173,152,02

11,530,30

Каротиноиды, мг%

12,300,51

13,400,21

12,100,35

Сапонины, %аа.ас.ам

6,120,12

6,390,08

1,910,05

Флавоноиды, %аа.ас.ам

1,840,04

2,530,03

2,620,02

Витамин С %аа.ас.ам

0,760,05

0,920,04

0,670,03

Витамин В1, мг%

0,050,02

0,060,02

0,040,05

Гликозиды, % от а.с.м.

0,670,04

0,680,03

0,340,01

Дигитоксин, мг%

1,150,03

1,510,01

0,770,03

Наибольшее содержание дигитоксина установлено в каллусной ткани, иммобилизованной на пенополиуретане. Наименьшее в каллусной ткани, выращенной на силикагеле.

Одним из способов повышения выхода вторичных метаболитов в культуре ткани является воздействие на клетки стрессогенными факторами.

Для наших исследований в качестве стрессогенного фактора было выбрано УФ-излучение. Интенсивность излучения составляла 0,39аВт/м2мин. Диапазон активного излучения, 280Ц320анм. Облучение тканей УФ-светом стимулировало каллусогенез, сокращая время лаг-фазы до 3-х суток, тогда как фаза логарифмического роста удлинялась.

Максимальный прирост биомассы (715,11амг сырой массы) был получен при облучении ткани в течение 1 ч. Результаты по динамике роста представлены на рисунке 4.

Рисунока4аЧаВлияние продолжительности воздействия УФ-облучения на рост каллусной ткани Digitalis purpurea L.

Содержание биологически активных веществ в каллусной ткани Digitalis purpurea L. после УФ-облучения представлено в таблице 4.

Таблица 4 - Содержание биологически активных веществ в каллусной ткани Digitalis purpurea L. после УФ-облучения

Наименование компонента

Контроль

Продолжительность облучения, ч

0,5

1

1,5

Сумма хлорофиллов А+В, мг%

390,316,03

421,127,02

462,365,02

480,148,02

Каротиноиды, мг%

1,340,02

1,890,03

2,130,04

2,220,01

Сапонины, % а. с. м

6,390,01

6,420,04

6,440,03

6,640,03

Флавоноиды, % а. с. м

2,530,03

3,650,05

4,320,05

6,450,02

Витамин С, % а. с. м

0,920,04

0,170,03

0,160,02

0,120,03

Витамин В1, мг%

0,060,02

0,050,03

0,050,01

0,040,02

Гликозиды, % от а. с. м

0,680,03

0,720,01

0,780,02

0,710,03

Дигитоксин, мг/% а. с. м

1,150,01

1,960,01

4,230,03

3,420,03

Как следует из результатов, при увеличении продолжительности воздействия УФ-излучения наблюдается повышение содержания флавоноидов и фотосинтетических пигментов, что хорошо согласуется с литературными данными. Также у полученных каллусных линий наблюдали увеличение содержания гликозидов, что может быть связано с повышением концентрации хлорофилла в клетках. Максимальное содержание дигитоксина было обнаружено в клеточной линии, полученной после часового облучения и превышало содержание дигитоксина в контроле и растении в 3,6 и 3,5 раза соответственно.

Таким образом, в результате проведенных исследований, получена каллусная линия Digitalis purpurea L. с повышенным содержанием гликозидов и дигитоксина, а также с максимальным приростом биомассы.

Для установления зависимости влияния физико-химических параметров культивирования на прирост биомассы и накопление сердечных гликозидов в каллусной ткани Digitalis purpurea L. проведено математическое моделирование.

В качестве варьируемых параметров были выбраны фотопериод Ч продолжительность световой фазы x1, температура x2 и концентрация сахарозы в среде x3. В качестве функции отклика были выбраны прирост биомассы за период культивирования y1, мгаа.ас.ам. и концентрация гликозидов в каллусной ткани Digitalis purpurea L. y2, % от а. с. м.

Оценка прироста биомассы у1 представлена следующей функциональной зависимостью:

,

(1)

где b0=183,775; b1=Ц2,644; b2=Ц3,938; b3=Ц3,1115; b4=0,0323; b5=0,0455; b6=0,06775 Ч вычисленные коэффициенты регрессии.

На основании полученных коэффициентов регрессии можно сделать вывод, что все три исследуемых параметра оказывают влияние на прирост биомассы.

В замкнутой области функция трёх переменных достигает максимума (прирост биомассы 52,45амгаа.ас.ам.) в точке х*=(12; 22; 20), что соответствует минимальным значениям исследуемых параметров. Функция достигает минимума (прирост биомассы 27,70амгаа.ас.ам.) в точке х*=(18; 30; 30), что соответствует максимальным значениям фотопериода, температуры и концентрации сахарозы.

Оценка содержания гликозидов в каллусной ткани Digitalis purpurea L. у2а представлена следующей функциональной зависимостью:

,

(2)

где b0=1,975625; b1=0,011875; b2=Ц0,05406; b3=Ц0,035625; b4=0,0001042; b5=8,333; b6=0,0010625 Ч вычисленные коэффициенты регрессии.

Из полученного уравнения регрессии следует, что фотопериод, концентрация сахарозы и температура оказывают меньшее влияние на накопление гликозидов в каллусной ткани, чем на прирост биомассы. Причем, отрицательные значения b2 и b3 можно трактовать, как факторы, оказывающие ингибирующее действие на процесс накопления гликозидов.

Графическое отображение модели процесса накопления гликозидов в каллусной ткани приведено на рисунке 5.

а

б

Рисунока5 - Содержание гликозидов в каллусной ткани Digita-lisаpurpureaаL. при средних значенияхаафотопериода  (а);атемпературы (б)а

В замкнутой области  функция трёх переменных y=f3(x), x=(x1,аx2,аx3) достигает максимума 0,68а% от а.ас.ам в точке x*=(18,а22,а20), что соответствует значениям параметров Ч фотопериод 18ач, температура 22аС и концентрация сахарозы 20аг/л, и минимума 0,32а% отаа.ас.ам. в точке x*=(12,а30,а30), что соответствует значениям параметров Ч фотопериод 12ач, температура 30аС и концентрация сахарозы 30аг/л.

В результате проведенного моделирования установлено, что оптимальные режимы культивирования каллусной ткани DigitalisаpurpureaаL. для прироста биомассы и накопления гликозидов различаются только по одному параметруаЧ фотопериоду. Для максимального прироста биомассы необходимо проводить культивирование при фотопериоде 12ач, а для накопления гликозидов ткань следует культивировать при 18часовом фотопериоде, таким образом, оптимальным можно считать среднее значение фотопериода 16 ч.

Так как каллусная ткань представляет собой новый вид сырья, для сравнительного анализа было проведено исследование химического состава и содержания минеральных компонентов в каллусной ткани, и в исходном растении Digitalis purpurea L.

Данные химического состава каллусной ткани и растения Digitalis purpurea L. приведены в таблице 5 в пересчете на абсолютно-сухое сырье.

Таблица 5 - Химический состав Digitalis purpurea L.

В процентах

Наименование компонента

истья растения

Каллусная

ткань

Экстрактивные вещества

41,330,24

38,520,53

егкогидролизуемые полисахариды

23,520,17

39,350,33

Трудногидролизуемые полисахариды

17,760,29

15,830,17

игноноподобные вещества

5,400,03

3,450,03

Зольные вещества

6,440,02

4,900,03

Из приведенных результатов следует, что на долю углеводов в растении Digitalis purpurea L приходится 41,28 %, в каллусной ткани углеводы составляет 55,18 %. Экстрактивные вещества составляют 41,33 и 38,52 % в исходном растении и каллусной ткани соответственно.

Содержание минеральных компонентов приведено в таблице 6.

Таблица 6 - Минеральный состав каллусной ткани и растения Digitalis purpurea L.

Наименование компонента

Единицы измерения

Содержание компонента

исходное

растение

интактное

растение

каллусная

ткань

Железо

мг/кг

440,12

411,54

449,45

Медь

мг/кг

6,21

6,68

13,16

Цинк

мг/кг

141,32

149,31

76,02

Марганец

мг/кг

24,56

15,48

15,55

Хром

мг/кг

0,43

0,69

0,92

Калий

г/кг

29,61

34,51

30,01

Натрий

г/кг

1,87

1,89

1,61

Кальций

г/кг

2,06

1,80

0,99

Магний

г/кг

2,82

1,75

1,51

Из результатов таблицы 6, следует, что минеральный состав каллусной ткани близок по составу к растению. Расхождения в концентрациях могут быть объяснены тем, что содержание микро- и макроэлементов в почве может существенно отличаться от содержания минеральных компонентов среды, используемой при культивировании растений in vitro.

Проведенные исследования показали схожесть химического и минерального состава каллусной ткани и растения. Это дает возможность рекомендовать каллусную ткань в качестве альтернативного сырья для производства гликозидов.

С целью установления оптимального режима выделения гликозидов из каллусной ткани Digitalis purpurea L. проведена оптимизация процесса экстракции.

В качестве варьируемых параметров были выбраны: продолжительность экстракции x1, соотношение массы сырья и объема экстрагента x2, размер частиц x3. В качестве функции отклика выбрали выход сердечных гликозидов у, % от а. с. м.

Модель оптимизации состоит из трёх расчётных схем, описывающих изменение выхода гликозидов, (рисунок 6).

а

б

в

Рисунока6аЧаВыход гликозидов при средних значениях  продолжительности экстракции (а); гидромодуля (б);  размера частиц (в)

Оценка выхода гликозидов представлена следующей функциональной зависимостью:

(3)

где b0=0,32702; b1=0,006898; b2=Ц0,000685; b3=Ц0,00866; b4=0,00023; b5=0,0078; b6=Ц6,4488аЧ вычисленные по методу наименьших квадратов коэффициенты регрессии.

В замкнутой области функция трёх переменных достигает максимума 0,68 в точке х*=(12; 10; 3) и достигает минимума 0,33 в точке х*=(3; 100; 3).

Таким образом, для достижения максимального выхода гликозидов из каллусной ткани Digitalis purpurea L. экстракцию необходимо проводить при следующих параметрах: продолжительность экстракции 12ач, гидромодуль 10, размер частиц 3амм.

Главаа4. Технология культивирования in vitro Digitalis purpurea L. и выделения гликозидов из каллусной ткани

На основании результатов по оптимизации процессов культивирования и выделения гликозидов была разработана технология производства гликозидов из биомассы каллусной ткани Digitalis purpurea L.

Твердофазное культивирование клеток Digitalis purpurea L. предполагается осуществлять в установках для твердофазного культивирования на основе аппарата, разработанного ВНИИбиотехника. Аппарат представляет собой вертикальный сосуд прямоугольной формы. Внутри он разделен перфорированными пластинами, на которые устанавливают кюветы с инертным носителем. Питательную среду подают через верхний люк, а готовую культуру выгружают через нижний. Выращивание производится в кюветах Ч 50Ц60амм высотой, объемом 10 л, в оптимальных условиях.

За цикл культивирования с 10ал среды можно получить около 1,6акг сырой биомассы. Производительность аппарата, содержащего 30 кювет, будет составлять 48акг сырой биомассы за цикл культивирования (576акг сырой биомассы в год).

На основании результатов оптимизации процесса культивирования каллусной ткани Digitalis purpurea L. при разработке технологии выращивания биомассы определены следующие параметры культивирования: возраст посевного материала 21Ц24 сут; концентрация сахарозы в среде 20 г/л; фотопериод 16 ч; температурный режим выращивания культуры (221)аС.

В промышленном производстве гликозидов можно выделить следующие основные стадии: ферментация сырья, экстрагирование действующих веществ, очистка вытяжки, выделение суммы гликозидов, перекристаллизация.

Предварительная ферментация сырья увеличивает выход гликозидов благодаря гидролизу первичных гликозидов до вторичных. С этой целью измельченное сырье замачивают водой (37-40аС) и оставляют при этой температуре на 40-48 ч.

Биомассу после ферментации помещают в экстрактор с мешалкой и экстрагируют смесью этанола и хлороформа и соотношении (1:9) при гидромодуле 10, продолжительности экстракции 12 ч.

Полученную вытяжку упаривают под вакуумом при температуре 50аС. Концентрированный экстракт обрабатывают формамидом и проводят очистку (жидкостную экстракцию), обрабатывая вытяжку бензолом 5 раз, смесью бензола и хлороформа (3:2) до 10 раз. Вытяжку упаривают под вакуумом, остаток растворяют в хлороформе.

Блок-схема производства гликозидов из биомассы Digitalis purpurea L представлена на рисунке 7.

Рисунока7аЧаБлок-схема производства гликозидов из биомассы каллусной ткани Digitalis purpurea L.

Для выделения индивидуальных гликозидов хлороформный раствор серндечных гликозидов переносят на колонку с алюминия оксидом для их распренделения.

Дигитоксин элюируют с алюминия оксида метанолом. Элюат, содержанщий дигитоксин, упаривают под вакуумом. Остаток растворяют в ацетоне, упанривают под вакуумом, добавляют бензол и оставляют для перекристаллизации дигитоксина. Перекристаллизацию проводят несколько раз при комнатной темнпературе. Кристаллы промывают этанолом и высушивают на воздухе. Выделенние и очистку гитоксина проводят аналогично.

Послеэкстракционный остаток каллусной ткани Digitalis purpurea L. сондержит значительное количество легко- и трудногидролизуемых полисахариндов, микро- и макроэлементов и может быть использован в качестве удобрения или субстрата для культивирования микроорганизмов.

Проведенные технико-экономические расчеты, показали эффективность использования каллусной ткани Digitalis purpurea L. в качестве альтернативнного сырья для получения препаратов сердечных гликозидов. Спроектированнное экспериментальное предприятие по производству гликозидов является реннтабельным.

Основные результаты и выводы по работе

В результате проведенных исследований можно сделать следующие вынводы:

1.        Введена в культуру in vitro Digitalis purpureaаL. Установлен состав среды, позволяющий получить максимальный прирост биомассы (51,6амг/гаа.ас.ам.), обеспечивающий высокую скорость роста культуры (0,22асутЦ1) и накопление наибольшего количества гликозидов (0,67а%аотаа.ас.ам).

2.        Установлено, что наиболее эффективным способом культивированния каллусной ткани DigitalisаpurpureaаL., обеспечивающим наибольшее накопнление гликозидов, является иммобилизация каллусной ткани на пенополиурентановые пластины.

3.        В результате УФ-облучения ткани получена высокопродуктивная кленточная линия с максимальным ростовым индексом (18,78), приростом бионмассы (715,11 мг сырой массы) и выходом гликозидов (0,78 % от а. с. м.)

4.        Исследование биохимического и минерального состава каллусной ткани показало, что ее состав соответствует составу исходного растения.

5.        Проведено математическое моделирование процессов культивированния и извлечения оптимальными условиями культивирования каллусной ткани DigitalisаpurpureaаL., обеспечивающими максимальный принрост биомассы и накопление гликозидов являются: концентрация сахарозы в среде 20аг/л; фотопериод 16ач; температурный режим выращивания культуры 22аС. Для максимального извлечения гликозидов из каллусной ткани DigitalisаpurpureaаL. процесс экстракции необходимо проводить при следующих параметрах: продолжительность экстракции 12ач, гидромодуль 10, размер частиц 3амм.

6.        На основании полученных экспериментальных данных разработана технологическая схема получения гликозидов из биомассы DigitalisаpurpureaаL., рассчитаны основные технико-экономические показатели. Экспериментальное предприятие по производству гликозидов из каллусной ткани DigitalisаpurpureaаL. является рентабельным, чистая прибыль данного произнводства составит 3965,82 тыс. руб. Данное предприятие окупит вложенные в него затраты, в срок 3,5 года.

Основные материалы диссертации изложены в следующих работах:

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

  1. Смольникова, Я. В. Влияние стрессогенных факторов на каллусную ткань Digitalis purpurea L. / Я. В. Смольникова, Н. А. Величко // Вестник КраснГАУ. - 2011. - Вып. 7. - С. 86-89, автора Ц  0,125 п. л.
  2. Смольникова, Я. В. Химический состав растения и каллусной ткани Digitalis purpurea L./ Я. В. Смольникова, Н. А. Величко // Химия растительного сырья. - 2011. - № 4. - С. 239-243, автора - 0,19 п. л.

Материалы конференций:

  1. Смольникова Я. В. Получение сердечных гликозидов методом кульнтуры in vitro наперстянки пурпурной (Digitalis purpurea L.) / Я. В. Смольникова, Н. А. Величко // Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспекнтивы развития: материалы всерос. очно-заоч. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Красноярск, 2009. - Ч. 2. - С. 132-134, автора - 0,125 п. л.
  2. Смольникова, Я. В. Биологически активные вещества каллусной ткани наперстянки пурпурной / Я. В. Смольникова, Н. А. Величко // Проблемы современной аграрной науки: материалы междунар. заоч. науч. конф. - Краснонярск, 2009. - Т. 3. - С. 265-268, автора - 0,125 п. л.
  3. Смольникова, Я. В. Влияние гормонального состава среды на рост и структуру каллусной ткани наперстянки пурпурной / Я. В. Смольникова, Н. А. Величко // Лесной и химический комплексы - проблемы и решения: сб. ст. всенрос. науч.-практ. конф. - Красноярск, 2009. - Т. 3. - С. 342-349, автора - 0,25ап.ал.
  4. Величко, Н. А. Влияние ультрафиолетового излучения на ростовые и морфофизиологические характеристики каллусной ткани Digitalis purpurea L. / Н. А. Величко, Я. В. Смольникова, М. Ю. Бражкина, И. А. Овчинникова  // Химия и жизнь: сб. материалов IX регион. науч.-практ. конф. с междунар. учанстием. - Новосибирск. - 2010. - Т.1 - С. 162-165, автора - 0,125 п. л.
  5. Смольникова, Я. В. Культивирование методом in vitro Digitalis purpurea L. с применением методов иммобилизации на инертных носителях / Я.аВ. Смольникова // Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, пернспективы развития: материалы всерос. очно-заоч. науч.-практ. конф. с междуннар. участием. - Красноярск, 2010. - Ч. 2. - С. 112-114, автора - 0,1 п. л.
  6. Величко, Н. А. Влияние иммобилизации на инертные носители на накопление биологически активных веществ в каллусной ткани Digitalis purpureaаL. / Н. А. Величко, Я. В. Смольникова, И. А. Овчинникова // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. ст. всерос. науч.-практ. конф.а - Красноярск, 2010. - Т. 2. - С. 43-45, автора - 0,1 п. л.
  7. Величко, Н. А. Влияние УФ-стресса на накопление биологически активных веществ в каллусной ткани Digitalis purpurea L. / Н. А Величко, Я. В. Смольникова, М. Ю. Бражкина // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. ст. всерос. науч.-практ. конф. - Красноярск, 2010. - Т. 2. - С.а3739, автора - 0,1 п. л.
  8. Смольникова, Я. В. Элементный состав интактного растения и каллусной ткани наперстянки пурпурной (Digitalis purpurea L.) / Я. В. Смольникова, Н.аА. Величко // Проблемы современной аграрной науки: материалы междунар. заоч. науч. конф. - Красноярск, 2010. - Т. 5. - С. 265-268, автора - 0,125ап. л.
  9. Смольникова, Я. В Суспензионное культивирование Digitalis purpureaаL. / Я. В. Смольникова, Н. А. Величко // Лесной и химический комплексы - проблемы и решения: сб. ст. всерос. науч.-практ. конф. - Красноярск, 2010. - Т. 2. - С. 20-23, автора - 0,125 п. л.

Санитарно-эпидемиологическое заключение № 24.49.04.953.П. 000381.09.03 от 25.09.2003 г.

Подписано в печать                . Формат 60х84/19. Бумага тип. № 1

Печать - ризограф. Учл. печ. л. 1,1 Тираж 100 экз. Заказ  № 1369

Издательство Красноярского государственного аграраного университета

660017, Красноярск, ул. Ленина, 117

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии