Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ИЛЬЯСОВА АЛЬБИНА АБУЗАРОВНА
Конститутивная гетерологичная экспрессия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3 в трансгенных растениях табака
03.01.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук (ИБГ УН - РАН) Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович Официальные оппоненты Шакирова Фарида Миннихановна Доктор биологических наук, профессор Зав. отделом ИБГ УН - РАН Данилова Светлана Алексеевна Кандидат биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН Старший научный сотрудник Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН
Защита диссертации состоится л__ октября 2012 г. в л__ часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УН - РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 71.
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, и на сайте ИБГ УН - РАН: molgen@anrb.ru
Автореферат разослан л__ сентября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета С.М. Бикбулатова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Размеры органов растений контролируются двумя основными механизмами, а именно регуляцией клеточного деления и клеточного растяжения. Во время первой, так называемой, пролиферативной фазы развития любого органа клетки митотически делятся и растет их число.
Затем клетки, продолжая делиться, начинают постепенно увеличиваться в размерах за счет роста и растяжения, а также дифференцируются. Регуляция клеточного деления и растяжения в растениях скоординирована и контролируется фитогормонами, микроРНК и большим количеством белковых факторов. Наиболее изученными являются взаимоотношения генетических факторов в апикальной меристеме побега, в то время как о генетической регуляции клеточной пролиферации в зачатках органов известно гораздо меньше. Одним из наиболее известных генов, контролирующих клеточную пролиферацию в зачатках листьев и цветков, является AINTEGUMENTA (ANT) (Krizek, 1999; Mizukami, Fisсher, 2000). Транскрипция гена ANT регулируется трансмембранным белком ARGOS, экспрессия которого в свою очередь индуцируется фитогормонами ауксинами и цитокининами (Hu et al., 2003).
Было показано, что трансгенные растения, сверхэкспрессирующие ген ANT под контролем 35S промотора, характеризуются несколько большими размерами генеративных и вегетативных органов, за счет увеличения количества клеток (Mizukami, Fischer 2000).
Размер органа растения зависит также от изначального количества недифференцированных клеток в апикальной и флоральной меристемах.
Одними из наиболее изученных генов-регуляторов клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега являются WUSCHEL (WUS) и CLAVATA3 (CLV3) (Haecker, Laux, 2001). Продукт гена CLV3 негативно влияет на пролиферацию апикальной и флоральной меристем через уменьшение экспрессии гена WUS, что способствует блокированию цитокининового сигнала регуляции клеточного деления (Sablowski, 2011). В то же время, в литературе имеется довольно мало сведений о взаимодействии генов, контролирующих клеточную пролиферацию в апикальной меристеме побега и в зачатках органов. Знания в этой области могут приблизить к пониманию особенностей генетической регуляции величины органов у растений и будут способствовать дополнению генных сетей новыми генами и связями между ними. В свою очередь, выяснение механизмов генетической регуляции роста растений, является весьма важным для народного хозяйства, так как данные исследования будут способствовать разработке подходов к получению сельскохозяйственных, декоративных и древесных растений с увеличенными размерами органов.
Для создания трансгенных растений с повышенным уровнем экспрессии целевых генов в основном применяется 35S промотор, активности которого часто оказывается недостаточно. В связи с этим поиск или создание более сильных, чем 35S промотор, растительных промоторов, а также создание генноинженерных конструкций этих промоторов в сочетании с генами-регуляторами роста и развития растений являются весьма актуальными и, в конечном счете, могут привести к получению трансгенных растений с увеличенными размерами органов. Одним из путей создания новых эффективных промоторов является поиск более сильных природных гомологов 35S промотора вируса мозаики цветной капусты из группы каулимовирусов, а также создание их гибридных форм.
Цель исследования: определение роли и взаимодействия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3, а также возможности их использования в качестве целевых генов для создания трансгенных растений с увеличенными размерами органов.
Задачи исследования:
1. получить гибридные формы промоторов каулимовирусов и отобрать варианты с наибольшей активностью для создания трансгенных растений табака;
2. амплифицировать и клонировать гены ARGOS и CLAVATA3 резуховидки Таля Arabidopsis thaliana и AINTEGUMENTA рапса Brassica napus;
3. получить трансгенные растения табака с повышенным уровнем экспрессии гетерологичных генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3;
4. провести сравнительный морфологический анализ полученных трансгенных растений табака;
5. определить фитогормональный статус и уровень экспрессии генов AINTEGUMENTA и NtEXPA5 в трансгенных по гену CLAVATA3 растениях табака;
6. на основе литературных данных и полученных обобщенных результатов построить генную сеть, отражающую возможные пути взаимодействия генов ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3.
Научная новизна. Методом рестрикции-лигирования получены гибридные формы промоторов каулимовирусов. Показано, что в трансгенных растениях табака промотор вируса мозаики георгина обладает большей активностью, чем 35S промотор. Впервые получены трансгенные растения табака с повышенным уровнем экспрессии гетерологичных генов AINTEGUMENTA B. napus, а также ARGOS и CLAVATA3 A. thaliana.
Эктопическая экспрессия генов AINTEGUMENTA и ARGOS в табаке, в отличие от A. thaliana, способствовала, в первую очередь, увеличению размеров листьев и стебля, а размеры цветков изменялись в меньшей степени. Впервые показано, что сверхэкспрессия гена CLAVATA3 приводит к увеличению концентрации цитокининов и уменьшению уровня экспрессии гена AINTEGUMENTA в листьях трансгенных растений табака.
Практическая значимость работы. Генно-инженерные конструкции на основе бинарных векторов с промоторами каулимовирусов могут быть использованы для получения трансгенных растений с повышенным уровнем экспрессии различных целевых генов. Знания о взаимодействии геноврегуляторов роста между собой и с фитогормонами будут способствовать разработке стратегии создания хозяйственно-полезных растений с увеличенными и уменьшенными размерами органов. Выделенные нами гены AINTEGUMENTA и ARGOS в сочетании с промоторами каулимовирусов могут быть использованы для увеличения размеров листьев и стебля у хозяйственноценных растений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на школе-конференции Генетика микроорганизмов и биотехнология (МоскваПущино, 2008), на 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии Биомика - наука XXI века (Уфа, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе, 4 в журналах из Перечня ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 1страницах, содержит 6 таблиц и 16 рисунков. Включает в себя введение, обзор литературы (глава 1), описание методов исследования (глава 2), результаты исследования и их обсуждение (глава 3), заключение, выводы и список литературы (139 источников).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследований служили гены ARGOS и CLAVATA3, выделенные из A. thaliana и ген AINTEGUMENTA Brassica napus. Для проведения агробактериальной трансформации были использованы листья табака Nicotiana tabacum сорта Petit Havana SR-1 в возрасте двух-трёх месяцев.
Для получения трансгенных форм табака применяли штамм AGL Agrobacterium tumefaciens. Из плазмид были использованы Т-вектор pKRX и бинарные векторы pCambia 2201 и 2301 с геном устойчивости к канамицину и pCambia 1301 и 1305.1 с геном устойчивости к гигромицину (CAMBIA, Австралия). Для оценки активности исследуемых промоторов использовали бинарные векторы pCambia 1281Z/1291Z, содержащие ген GUS без промотора. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы DNASTAR, Inc. (США).
Флюориметрическое определение активности GUS в клеточных экстрактах проводили по методу, описанному Jefferson (1987). Целевые гены ARGOS, AINTEGUMENTA и CLAVATA3 были выделены методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием смеси полимераз Taq/Pfu из геномной ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей амплифицированных генов растений проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3фирмы УApplied BiosystemsФ (США), используя наборы для секвенирования УBig Dye Terminator v. 3.0Ф. Электропорацию компетентных клеток E.coli и A.tumefaciens проводили при помощи электропоратора фирмы УBio-RadФ модели Micropulser. Трансгенные формы табака получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков (Gallois, Marinho 1994).
Наблюдение за растениями поколения Т1 осуществляли, начиная от стадии появления корешков до получения семян в течение 3-5 месяцев. Все растения в течение 45 дней культивировали в климатостате при температуре 25оС с фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота) и освещенностью около 10 000 люкс в вегетационных сосудах объемом 450 мл, заполненных универсальным грунтом (УГераФ, Россия). После 45 дней, вплоть до созревания семян, растения выращивали на открытой светоплощадке при тех же условиях. Замеры величины органов производили после пересадки в почву через 30, 45, 60 дней и во время цветения, в итоге было осуществлено по четыре замера. По каждому варианту было отобрано по пять растений, измеряли по три нижних листа в длину, начиная от начала листовой пластины, по черешку до самого кончика.
Затем вычисляли среднее значение длины листа для каждого растения. Длину стебля определяли в период цветения. Площадь клеток эпидермиса и мезофилла листьев определяли при помощи универсального флюоресцентного микроскопа модели Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Германия). Уровень экспрессии целевых генов оценивали при помощи метода полуколичественной ОТ-ПЦР.
Количественную оценку свободных форм фитогормонов в одних и тех листьях проводили методом иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител против зеатин рибозида, ИУК и АБК и антикроличьих антител, меченых пероксидазой (Shakirova et al., 2004).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Конструирование гибридных промоторов каулимовирусов молекулярно-биологическими методами и анализ их экспрессионной активности в трансгенных растениях табака Для получения гибридных форм промоторов каулимовирусов методами ПЦР и рестрикции-лигирования были использованы промотор вируса мозаики георгина (ВМГ) размером 442 п.н. (EF513491) и промотор вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ) размером 501 п.н. (EF513492). Промотор ВМГ был расщеплен рестриктазой HindIII, при этом образовались два фрагмента размерами 249 и 193 п.н. При расщеплении той же рестриктазой промотора ВКГГ, были получены также два фрагмента размерами 50 и 451 п.н. Фрагменты данных промоторов размерами 249 и 451 п.н. были лигированы Т4 ДНКлигазой, лигазная смесь амплифицирована, а полученный ампликон клонирован в T-векторе pKRX. В итоге был получен гибридный промотор размером 7п.н. (рис. 1-1). При расщеплении промотора ВМГ рестриктазой AatII, были получены фрагменты размерами 299 и 143 п.н., а промотор ВКГГ дал фрагменты размерами 286 и 215 п.н. После проведения перекрестных лигирований, амплификации методом ПЦР и клонирования в векторе pKRX были получены гибридные промоторы размерами 514 и 429 п.н. (рис. 1-2, 3).
Далее промоторы ВМГ и ВКГГ были амплифицированы при помощи Pfu ДНКполимеразы, в результате были получены ампликоны с УтупымиФ концами.
Исследуемые промоторы расщеплялись рестриктазой ZraI, которая также приводит к образованию фрагментов ДНК с УтупымиФ концами, при этом из промотора ВМГ образовались фрагменты размерами 297 и 145 п.н., а из промотора ВКГГ - 284 и 217 п.н. Фрагмент промотора ВКГГ размером 284 п.н.
был лигирован с полноразмерным промотором ВМГ, в результате чего получен гибридный промотор размером 726 п.н. (рис. 1-4). Далее фрагмент промотора ВМГ размером 297 п.н. был лигирован с полноразмерным промотором ВМГ, при этом был получен модифицированный промотор ВМГ размером 739 п.н.
(рис. 1-5). Все полученные гибридные промоторы были клонированы в бинарных векторах pCambia 1281Z/1291Z и затем при помощи последних получены трансгенные растения табака.
Рис. 1. Схемы созданных гибридных промоторов каулимовирусов.
Флюориметрическим методом было показано, что наиболее УсильнымФ из полученных нами гибридных и модифицированных форм промоторов каулимовирусов является промотор размером 739 п.н., а наиболее слабыми были гибридные промоторы размерами 429 и 726 п.н.
В результате проведенной работы были получены пять модифицированных промоторов, которые характеризовались различной активностью в трансгенных растениях. Самым сильным из исследованных промоторов оказался промотор ВМГ дикого типа, который в наших экспериментах был активнее 35S промотора в 1,7 раза. Наименьшая активность была показана для промотора ВКГГ дикого типа размером 501 п.н., который оказался слабее 35S промотора в 2,7 раза. Промотор ВКГГ дикого типа размером 371 п.н. показал примерно равную с 35S промотором силу. Таким образом, объединив данные для всех полученных и исследованных нами гибридных и диких форм промоторов каулимовирусов, можно привести следующий ряд, в котором все они представлены по убыванию активности в трансгенных растениях табака:
ВМГ 442 > 739 > 700 > 514 > 35S > ВКГГ 371 > 429 и 726 > ВКГГ 501.
Из исследованных нами промоторов для создания трансгенных растений, сверхэкспрессирующих гены-регуляторы роста и развития, когда более предпочтительным является повышенное содержание целевого белка в тканях, наиболее оптимальным будет применение промотора ВМГ размером 442 п.н.
Поэтому именно промотор ВМГ был использован в дальнейшей работе при создании целевых генно-инженерных конструкций.
Конститутивная экспрессия гена ARGOS под контролем промотора вируса мозаики георгина Участок молекулы ДНК A. thaliana размером 732 п.н., включающий ген ARGOS, был амплифицирован и клонирован в Т-векторе pKRX. Этот участок ДНК был секвенирован, полученная последовательность была проанализирована при помощи программ MegAlign и MegaBlast. По результатам выравнивания было показано, что выделенная нами копия гена ARGOS полностью совпадает по нуклеотидной последовательности с исследуемым участком ДНК A. thaliana (AY305869). Затем ген ARGOS был выщеплен из вектора pKRX и клонирован в векторе pCambia 2301, в который в качестве регуляторов экспрессии были предварительно клонированы промотор вируса мозаики георгина и сайт полиаденилирования 35S. После агробактериальной трансформации листовых дисков табака целевой генноинженерной конструкцией вектора pCambia 2301 с геном ARGOS удалось отобрать 12 растений. Из них укоренились на агаризованной среде MС пять растений, из которых, в свою очередь, только три растения окрашивались синим цветом при обработке субстратом x-gluc. Для дальнейшей работы были отобраны эти три растения, так как предполагалось, что только в них уровень экспрессии трансгена также высок, как и репортерного гена GUS. При помощи ПЦР-анализа было показано, что все отобранные растения содержат в своем геноме как ген ARGOS A. thaliana, так и промотор вируса мозаики георгина.
Экспрессия в трансгенных растениях табака была доказана при помощи ОТПЦР. Отобранные растения были акклиматизированы к условиям почвы и находились под наблюдением до периода созревания семян. У двух растений отмечались существенное по сравнению с нормой увеличение размера листьев, более быстрый переход к стадии цветения, несколько увеличенные по размеру цветки (рис. 2).
Рис. 2. Трансгенные растения табака с эктопической экспрессией гена ARGOS поколения Т0 на различных стадиях развития.
а - контрольные растения, б и в - опытные растения.
Второе поколение двух линий опытных и одной контрольной линии растений было высажено на селективную среду МС, а затем пересажено на почву для проведения их сравнительного морфологического анализа. Через дней после пересадки трансгенные по гену ARGOS растения опережали контрольные растения по размеру листьев в среднем на 50% (рис. 3-1). Во время второго замера, через 30 дней после пересадки, эта разница увеличилась и составила примерно 79%. Однако уже через 45 дней после пересадки на почву, разница между опытными и контрольными растениями начала уменьшаться и составила в среднем 52% (рис. 3-2), еще через 15 дней она уменьшилась до 42%. Во время последнего замера размеры листьев у трансгенных по гену ARGOS растений были всего на 30% больше, чем у контрольных. Стебли у опытных растений табака были длиннее, чем у контрольных в среднем на 40%. По величине цветков разница составила в среднем 11%. При помощи микроскопического анализа было показано, что размеры клеток эпидермиса листьев опытных и контрольных растений практически не различались. Это означает, что размеры листьев у трансгенных растений увеличивались в основном за счет увеличения количества клеток.
Рис. 3. Сравнение трансгенных растений поколения Т1 экспрессирующих ген ARGOS A. thaliana, и контрольной группы.
1 - растения через 15 дней после пересадки в почву (вид сверху). 2 - растения через 45 дней после пересадки в почву.
Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген AINTEGUMENTA рапса под контролем промоторов каулимовирусов Участок ДНК, содержащий ген ANT, был амплифицирован из геномной ДНК рапса и его размер составил около 2400 п.н. Ампликон был клонирован в фагмидных векторах pKRX и pAL-TA, а затем секвенирован. Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что выделенная нами копия целевого гена совпадает с теоретически ожидаемой. Затем ген ANT выщепили из вектора pKRX и осуществили его ненаправленное клонирование в бинарных векторах pCambia 2201 с 35S промотором и pCambia 2301 с промотором вируса мозаики георгина. После проверки ориентации вставки с ними были получены трансгенные растения, и для проведения морфологического анализа были отобраны три линии, содержащие вектор pCambia 2201 (№11, №21, №23) и одно растение, содержащее вектор pCambia 2301 с целевым геном ANT (№67).
Через 30 и 45 дней после акклиматизации опытные и контрольные растения практически не отличались по длине листьев. В то же время в период цветения листья у опытных растений были длиннее, чем у контрольных на 14-25 % (рис.
4а), что может говорить о пролонгировании времени роста листьев под влиянием эктопической экспрессии гена ANT. По площади листьев лишь трансгенные растения 2301/BnANT №67 характеризовались небольшим их увеличением. По высоте стебля опытные растения были выше контрольных, и разница составляла у линии №23 - 19%, у линии №21 - 25%, а у линии №67 - 28% (рис. 4б). По длине цветка различия между опытными и контрольными растениями были небольшими и в целом составили от 6% (у линии №21) до 9% (у линии №67) (рис. 4в). По форме листьев, стебля и цветков опытные и контрольные растения не различались.
Рис. 4. Морфологические параметры опытных и контрольных растений:
а - длина листьев в период цветения; б - высота стебля в период цветения;
в - длина цветка; г - масса семян.
Было показано влияние эктопической экспрессии гена ANT на массу семян (рис. 4г), причем наибольшая разница была характерна для линии 2301/BnANT №67. Для выяснения возможных причин увеличения размеров листьев, были проведены микроскопические исследования клеток эпидермиса листьев. Оказалось, что размеры клеток эпидермиса листьев у опытных растений не только не увеличивались, но у линий №21 и №23 даже несколько уменьшились. Это означает, что длина листьев опытных растений увеличивалась за счет стимулирования клеточного деления, а не процессов клеточного роста. Методом полуколичественной ОТ-ПЦР было проведено исследование экспрессии гена ANT в трех линиях трансгенных растений. Было показано, что уровень экспрессии трансгена наиболее высок у растений линии №67 (рис. 5-4), которые содержат в качестве регулятора транскрипции целевого гена промотор вируса мозаики георгина. Таким образом, повышение уровня экспрессии гена ANT отражалось в трансгенных растениях в виде увеличения размеров листьев, стебля и цветков (рис. 4).
Рис. 5. Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР гена ANT в исследуемых линиях трансгенных растений: 1 - контрольное растение; 2 - трансгенное растение линии 2201/BnANT №21; 3 - трансгенное растение линии 2201/BnANT №23; 4 - трансгенное растение линии 2301/BnANT №67.
Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген CLAVATA3 A. thaliana под контролем 35S промотора, и их морфофизиологический анализ Для подбора праймеров и амплификации гена CLAVATA3 (CLV3) A.
thaliana была использована последовательность под номером NM_128283 из GenBank. Участок ДНК A. thaliana, содержащий ген CLV3, был амплифицирован из геномной ДНК и его размер составил 783 п.н. (рис. 6а).
Ампликон был клонирован в Т-векторе pKRX, а затем секвенирован. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что выделенная нами копия целевого гена полностью совпадает с теоретически ожидаемой и не содержит замен нуклеотидов. Ген CLV3 был выщеплен из вектора pKRX и по сайту рестрикции SmaI было осуществлено клонирование целевого гена в вектор pCambia 1301, содержащий 35S промотор. Агробактериальный клон, содержащий вектор pCambia 1301 с целевым геном в сенс-ориентации, был использован для экспериментов по трансформации листовых дисков табака. В результате агробактериальной трансформации был отобран 21 трансгенный побег, из которых успешно укоренились лишь 12. Репортерный ген GUS хорошо экспрессировался в шести отобранных растениях табака. Три трансгенных растения с высоким уровнем экспрессии репортерного гена были акклиматизированы к условиям почвы.
Рис. 6. Электрофореграммы ПЦР и ОТ-ПЦР гена CLV3. а - результаты ПЦР участка ДНК A. thaliana, содержащего ген CLV3. 2 - отрицательный контроль ПЦР, 3-6 - ампликоны гена CLV3 размером 783 п.н. б - результаты ОТ-ПЦР гена CLV3. 2-5 - ампликоны кДНК гена CLV3 размером 285 п.н. а-1, б-1 - маркеры молекулярной массы 250 п.н.-10000 п.н. (Сибэнзим, Россия).
При выращивании поколения Т0 у двух растений (№14 и №18) были выявлены определенные морфологические особенности, такие как закругление и пятнистость листьев, бледность их окраски, а также отставание в росте. Поэтому было решено более тщательно изучить растения этих двух линий. К тому же при помощи метода ОТ-ПЦР было показано, что в этих двух линиях опытных растений наблюдается достаточно высокий уровень экспрессии целевого гена (рис. 6б).
Пять растений линии №14 и двенадцать растений линии №18 были акклиматизированы к условиям почвы для проведения дальнейших экспериментов по их морфофизиологической характеристике. Для контроля использовали две линии трансгенных растений, содержащих Т-ДНК бинарного вектора без целевого гена (№5 и №19). Линейные размеры листьев в ходе онтогенеза у опытных и контрольных растений различались мало. Различий не наблюдалось и при измерении площади листьев. Высота стебля лишь у линии опытных растений №18 была снижена на 17% по сравнению с контролем, размеры же стебля у растений линии №14 не изменялись. Размеры цветка у опытных растений были лишь незначительно уменьшены, по сравнению с размерами цветка контрольных. В то же время у нескольких анализируемых растений, в отличие от контроля, наблюдались уродливые цветки (рис. 7г, д), что выражалось в асимметричности венчика, в наличии большого разрыва в венчике и чашечке, слиянии тычинок с лепестками и их недоразвитии.
Опытные растения всегда зацветали раньше контрольных, при этом растения линии №14 в среднем на 9 дней, а растения линии №18 на 25 дней раньше растений, содержащих Т-ДНК холостого вектора pCambia 1301. Также у сверхэкспрессирующих ген CLV3 растений табака наблюдалось сокращение количества цветков, например, у линии №18 наблюдалось их уменьшение в среднем на два. В целом линия №14 морфологически была более близка к контрольным растениям. При исследовании растений линии №18, кроме уменьшения размеров стебля, было выявлено уменьшение числа листьев (на три листа) и встречающееся довольно часто изменение формы листьев, выражавшееся в их небольшой удлиненности относительно ширины. Наиболее интересные данные были получены нами при измерении размеров клеток у анализируемых растений. Оказалось, что, несмотря на одинаковые размеры листьев у исследуемых растений, размеры клеток эпидермиса листьев у опытных растений всегда были заметно больше, чем у контрольных форм. У опытных растений линии №14 размеры клеток по сравнению с контрольной группой были увеличены на 38%.
Рис. 7. Морфологические особенности трансгенных растений табака поколения Т1, сверхэкспрессирующих ген CLV3 A. thaliana.
a - двухмесячное контрольное растение табака. б - двухмесячное трансгенное растение табака поколения Т1 линии №18. в - цветки контрольных растений. г, д - цветки трансгенных растений поколения Т1 линии №18. е - сравнение листьев контрольных (слева) и трансгенного (справа) растения линии №18. ж - клетки нижнего эпидермиса листьев контрольных растений. з - клетки нижнего эпидермиса листьев трансгенных по гену CLV3 растений линии №18. и - продольный срез верхушки побега контрольного растения; к - продольный срез верхушки побега трансгенного растения, экспрессирующего ген CLV3; л - поперечный срез листа контрольного растения; м - поперечный срез листа трансгенного по гену CLV3 растения.
Еще более значительным оказалось увеличение размеров клеток эпидермиса листьев у растений линии №18, которое составило 64%. При этом число клеток эпидермиса листьев, приходящихся на 1 мм2 листовой поверхности, наоборот, уменьшалось на 36%. Выявленные различия в размерах клеток эпидермиса сохранялись и при измерении площади клеток мезофилла листьев (рис. 7л, м) и эпидермиса цветков. У некоторых опытных растений наблюдалось уменьшение размера верхушечной почки, а у трех растений линии №18 верхушка побега вообще была не видна (рис. 7б), и в течение двух месяцев эти растения имели только два листа без стебля. Листья у этих растений были бледные, искривленные, на ощупь более твердые, мясистые, шершавые.
Проводящая система листьев у этих трех растений была недоразвитой, размеры клеток нижнего и верхнего эпидермиса листьев увеличены в пять раз по сравнению с контролем (рис. 7з), размеры устьиц оставались неизменными, но их было очень мало, и они все были закрытыми. Из особенностей этих растений необходимо также отметить их небольшие размеры, хлороз и некроз на листьях, быстрое высыхание нижних листьев. Продольный срез верхушки растений (т.е. апекса с образующимися листьями) показал уменьшение объёма апикальной меристемы у опытных растений, уменьшение количества клеток в теле верхушки побега, но клетки при этом увеличивались в размерах, поэтому в целом величина самого растения почти не изменялась (рис. 7и, к). Поперечный срез листа показал наличие лишь губчатой паренхимы с очень крупными межклетниками, столбчатый мезофилл отсутствовал, что косвенно может означать недоразвитость фотосинтетического аппарата (рис. 7м).
Нами обнаружено, что трансгенные растения линий №14 и №отличались существенно более высоким уровнем содержания цитокининов в сравнении с контрольными растениями линии №5 (рис. 8). Интересно отметить, что по содержанию ИУК и АБК контрольные и опытные растения практически не различались (рис. 8а). Далее для трансгенных по гену CLV3 растений табака был проведен анализ экспрессии генов AINTEGUMENTA и NtEXPA5 табака, первый из которых участвует в регуляции клеточного деления (Mizukami, Fischer, 2000), а второй в регуляции клеточного растяжения (Link et al., 1998).
Было показано, что в трансгенных растениях линий №14 и №18 снижен уровень экспрессии гена AINTEGUMENTA (рис. 8б), чем, возможно, и объясняется уменьшение количества клеток в листьях опытных растений.
Рис. 8. Сравнительный анализ содержания фитогормонов и мРНК генов AINTEGUMENTA и NtEXPA5 в 7-м листе двухмесячных контрольных и трансгенных по гену CLV3 растений табака: а - содержание цитокининов, ИУК и АБК; б, в - ОТ-ПЦР генов NtANT и NtEXPA5. 1, 2 - контрольные растения. 3, 4 - опытные растения.
Компенсаторное увеличение размеров клеток могло быть вызвано стимуляцией экспрессии экспансинов. У табака идентифицировано шесть генов -экспансинов (Link et al., 1998), получивших названия NtEXPA, с порядковыми номерами от 1 до 6, и их нуклеотидные последовательности представлены в GenBank (AF049350-AF049355 соответственно). Было решено провести анализ уровня экспрессии гена NtEXPA5, так как именно этот ген оказался более близким к гену AtEXPA10, который участвует в регуляции роста листьев (Cho et al., 2000). Однако уровень экспрессии гена NtEXPA5 в трансгенных растениях оставался почти неизменным (рис. 8в). Видимо, клеточное растяжение стимулировалось в данном случае под влиянием экспрессии других экспансинов или других белковых факторов.
Результаты проведенного нами морфофизиологического анализа подтверждают литературные данные о том, что продукт гена CLVспособствует уменьшению количества стволовых клеток в апикальной меристеме побега, что проявляется в снижении числа клеток, приходящихся на один орган (Brand et al., 2000). Наши данные также позволяют говорить о взаимосвязи регуляции клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега, в зачатках листьев и растущих листьях. Сокращение времени зацветания у трансгенных растений, по всей видимости, обусловлено тем, что экспрессия CLV3 способствует дифференцировке клеток, в то время как WUSфактор ответственен за поддержание меристематически компетентных клеток в центре апикальной меристемы (Leibfried et al., 2005). Число листьев и цветков у исследуемых растений уменьшалось, вероятнее всего, из-за сокращения количества недифференцированных клеток в апикальной меристеме побега, что привело к более редкой закладке их зачатков. Причиной уменьшения количества и размеров цветков могло быть также снижение уровня экспрессии гена AGAMOUS из-за подавления экспрессии WUS-фактора (Ikeda et al., 2009).
В полученных нами трансгенных растениях 35S::CLV3 количество ауксинов не изменялось, а поскольку синтез гиббереллинов цитокининами регулируется негативно (Романов, 2009), то поэтому наиболее вероятными регуляторами клеточного растяжения в исследуемых нами растениях, видимо, являются цитокинины. В то же время, исходя лишь из наших данных, невозможно понять, каким образом повышенная экспрессия гена CLVспособствует снижению уровня экспрессии гена ANT. Для решения данного вопроса было решено обратиться к литературным данным. В итоге проведенной теоретической работы была построена схема, отражающая некоторые аспекты регуляции клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега и зачатках листьев (рис. 9).
Рис. 9. Схема регуляции клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега и в листьях, построенная на основе литературных данных.
STM Ч гомеодомен-содержащий транскрипционный фактор SHOOTMERISTEMLESS. IPT - изопентилтрансфераза. LOG - фермент LONELYGUY, катализирующий отщепление рибозо-5-фосфата от изопентиладенозина и принимающий, таким образом, участие в активации цитокининов. ARR - Arabidopsis Response Regulators, гены первичного ответа на цитокинины. ARGOS (Auxin-Regulated Gene Involved in Organ Size) - ауксининдуцибельный ген, участвующий в передаче сигнала к транскрипционному фактору ANT. ANT - транскрипционный фактор AINTEGUMENTA, поддерживающий меристематически компетентные клетки в центре зачатков органов. MP - ауксин-индуцибельный ген MONOPTEROS, негативный регулятор генов ARR типа А. WUS - транскрипционный фактор WUSCHEL.
POL - ген POLTERGEIST, кодирующий ядерную протеинфосфатазу. STIP - ген STIMPY, кодирующий ядерную протеинфосфатазу. CRN - мембраноассоциированная протеинкиназа CORYNE. CLV - гены CLAVATA. GAI (GA Insensitive), RGA (Repressor of GA1) - негативные регуляторы гибберелинового сигнала. LBD - lateral organ boundaries domain. (по Downes, Crowel 1998; Brand et al., 2000; Mizukami, Fischer, 2000; Haecker, Laux, 2001; Hu et al., 2003;
Williams, Fletcher, 2005; Xie et al., 2009; Dodsworth, 2009; Zhu et al., 2010;
Sablowski, 2011).
Из схемы видно, что повышенный уровень экспрессии гена CLVприводит к уменьшению уровня экспрессии генов ARR типа В, что, видимо, и способствует снижению уровня экспрессии гена ANT. Однако для подтверждения данного предположения необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на изучение взаимодействия генов ARR типа В и ANT. Повышение содержания цитокининов в трансгенных по гену CLVрастениях, судя по литературным данным (Sablowski, 2011), тоже может происходить через уменьшение уровня экспрессии генов ARR типа В (рис. 9).
Требует также решения вопрос о том, через какие именно гены цитокинины стимулируют клеточное растяжение. Наиболее известными белковыми факторами, принимающими участие в регуляции клеточного растяжения, являются экспансины. Однако в нашей работе повышение содержания цитокининов не приводило к увеличению уровня транскрипции гена NtEXPA5.
Тем не менее, полученные нами результаты не противоречат литературным данным, так как известно, что цитокинины влияют на экспрессию экспансинов на посттранскрипционном уровне (Downes, Crowel 1998).
*** Результаты наших исследований показывают, что гены ARGOS и AINTEGUMENTA могут быть использованы в качестве универсальных геноврегуляторов роста для создания растений с увеличенными листьями и стеблем.
Однако применение этих генов ограничивается компенсаторными механизмами в самих растениях, в связи с чем существует необходимость в поиске и исследовании других более эффективных генов-регуляторов роста и развития, а также в создании более сильных растительных промоторов. В случае сверхэкспрессии гена CLV3 также срабатывает компенсаторный механизм, способствующий поддержанию размеров органов в пределах нормы. Таким образом, можно сделать выводы о том, что для получения хозяйственно-ценных растений с увеличенными размерами органов необходимо одновременно влиять на уровень экспрессии генов-регуляторов как клеточного деления, так и клеточного растяжения.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что промотор вируса мозаики георгина в трансгенных растениях табака характеризуется большей активностью, чем 35S промотор, что выражается в виде возрастания уровня экспрессии целевых генов ARGOS и AINTEGUMENTA, а также более существенным влиянием последних на фенотип.
2. Выявлено, что сверхэкспрессия генов ARGOS и AINTEGUMENTA способствует увеличению размеров листьев на 14-30%, стеблей на 19-40% и цветков на 6-11%, по сравнению с контролем.
3. Показано, что размеры листьев и цветков трансгенных по генам ARGOS и AINTEGUMENTA растений табака увеличиваются только за счет возрастания в них количества клеток.
4. Трансгенные по гену CLAVATA3 растения табака характеризуются снижением высоты стебля, уменьшением числа листьев и цветков, существенным увеличением размеров клеток в листьях, повышенным содержанием цитокининов, уменьшением уровня экспрессии гена AINTEGUMENTA. В то же время размеры листьев, содержание мРНК гена NtEXPA5, ауксинов и АБК у трансгенных по гену CLAVATA3 растений в целом остаются в пределах нормы.
5. Увеличение концентрации цитокининов в трансгенных по гену CLAVATA3 растениях связано со снижением уровня экспрессии генов ARR типа В через регуляторную цепь, включающую также гены CLAVATA, WUSCHEL и ARR типа А, а уменьшение количества клеток в органах обуславливается снижением уровня транскрипции гена AINTEGUMENTA.
6. Гены ARGOS и AINTEGUMENTA могут быть использованы для создания генно-инженерных конструкций с целью получения хозяйственнополезных растений с увеличенными размерами листьев и стебля.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В., Ильясова А.А., Ибрагимов Р.И.
Применение амплификации по типу катящегося кольца и ДНК-шаффлинга для генетической рекомбинации промоторных последовательностей с низким уровнем гомологии // Вестник Башкирского университета. 2008. Т. 13. №1.
С.39-42.
2. Кулуев Б.Р., Князев А.В., Лебедев Я.П., Ильясова А.А., Чемерис А.В.
Конструирование гибридных промоторов каулимовирусов и анализ их активности в трансгенных растениях // Физиология растений. 2010. T. 57. C.
623-632.
3. Кулуев Б.Р., Князев А.В., Ильясова А.А., Чемерис А.В.
Конститутивная экспрессия гена ARGOS в растениях табака под контролем промотора вируса мозаики георгина // Физиология растений. 2011. Т. 58. №3.
с. 443-452.
4. Кулуев Б.Р., Князев А.В., Ильясова А.А., Чемерис А.В. Эктопическая экспрессия генов PnANTL1 и PnANTL2 тополя черного в трансгенных растениях табака // Генетика. 2012. Т. 48. №10. С. 1162-1170.
5. Кулуев Б.Р., Ильясова А.А., Лебедев Я.П. Получение гибридных и модифицированных форм промоторов вирусов мозаики георгина и кольцевой гравировки гвоздики // Материалы школы-конференции Генетика микроорганизмов и биотехнология. Москва-Пущино. 2008. С. 55.
6. Кулуев Б.Р., Ильясова А.А. Создание генно-инженерных конструкций для посттранскрипционного сайленсинга гена AINTEGUMENTA // Материалы 14-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, 1923 апреля 2010 г. Пущино. Т.2. С. 150.
7. Ильясова А.А., Князев А.В., Кулуев Б.Р. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген ARGOS арабидопсиса // Материалы 14ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, 19-апреля 2010 г. Пущино. Т.1. С. 252.
8. Кулуев Б.Р., Князев А.В., Ильясова А.А., Юлдашев Р.А., Авальбаев А.М. Конститутивная экспрессия гена CLAVATA3 под контролем 35S промотора // Материалы II Всероссийской школы-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии Биомика - наука XXI века. 2011. С. 63-64.