КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ СИСТЕМЫ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ ЧЕЛОВЕКА 14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по медицине

На правах рукописи

ХОРЕВА МАРИНА ВИКТОРОВНА

КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ

СИСТЕМЫ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ

ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ ЧЕЛОВЕКА

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва Ц 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор Ковальчук Леонид Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

зав.кафедрой фармакологии

ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова

Минздравсоцразвития России Козлов Иван Генрихович

доктор медицинских наук, профессор,

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Минздравсоцразвития России.

профессор кафедры клинической

иммунологии и аллергологии Калюжин Олег Витальевич

доктор медицинских наук,

профессор, ФГУН Центральный НИИ

эпидемиологии Роспотребнадзора

зав. лабораторией госпитальных инфекций

и эпидемиологического анализа Тутельян Алексей Викторович

Ведущая организация: ФГБУ УГНЦ Институт иммунологииФ ФМБА

России

Защита состоится л24 декабря 2012 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан л.......... ............................ 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Изучение механизмов врожденного иммунитета в настоящее время является одной из актуальных проблем современной фундаментальной и клинической иммунологии. В 90-х годах XX столетия Ch. Janeway и R. Medzhitov выдвинули гипотезу о том, что врожденный иммунитет обладает определенной специфичностью к чужеродным антигенам. Ключевыми рецепторами врожденного иммунитета являются сигнальные паттерн распознающие рецепторы (ПРР) - Toll-подобные рецепторы (TLR) [Ковальчук Л.В.,2005; Medzhitov R., Janeway Ch., 1997]. За последние 20 лет достигнуты впечатляющие успехи в изучении роли TLR во врожденном и адаптивном иммунитете, что позволило совершенно по-новому взглянуть на природу иммунных процессов в организме. TLR распознают высоко консервативные структуры патогенных микроорганизмов, так называемые паттерны, ассоциированные с микроорганизмами (pathogen-associated molecular patterns - PAMP). Различные макромолекулы служат микробными лигандами для TLR, включая липиды, углеводы, белки и нуклеиновые кислоты. К наиболее известным лигандам TLRs экзогенного происхождения относятся компоненты клеточной стенки бактерий: пептидогликаны (ПГ), липополисахариды (ЛПС); флагеллин, ДНК микроорганизмов, вирусная РНК и многие другие. В настоящее время показано, что лигандами для TLR могут также являться эндогенные молекулы, высвобождающиеся в результате некроза клеток и массивной деструкции тканей, а также распада молекул внеклеточного матрикса. Такие лиганды получили обозначение как сигналы опасности или DAMP (damage-associated molecular pattern). К эндогенным активаторам TLR относятся белки теплового шока - HSP60, HSP70, фибронектин, β-дефензин и многие другие [Tsan Min-Fu, Gao Baochong, 2004; Bianchi M. E. et al., 2007; Erridge С. et al., 2010]. Распознавание экзогенных и эндогенных лигандов TLR инициирует активацию сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов, костимуляторных молекул, противомикробных пептидов и других молекул. Продукты этих генов контролируют систему врожденного иммунитета и в дальнейшем направляют развитие адаптивного иммунного ответа [Ковальчук Л.В., 2007; Хаитов Р.М., Ярилин А.А., 2011; Hoebe K. et al.,2003; Akira S.,Takeda K.,2004; Parker L.C.,2007; Uematsu S, Akira S. et al., 2007; Kawai T, Akira S., 2010]. Интенсивность ответа и его направленность в дальнейшем определяются несколькими компонентами, составляющими систему TLR. Система TLR включает лиганды активирующие TLR, сами рецепторы, молекулы, осуществляющие трансдукцию сигнала - адапторные белки, а также эффекторные молекулы, которые вырабатываются в результате активации TLR и опосредуют их дальнейшие эффекты [Ковальчук Л.В., 2007]. Дефекты в системе TLR: нарушения распознавания лигандов, экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов TLR могут приводить к развитию тяжелых инфекций, аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии и других заболеваний [Cook D.N., Pisetsky D.S.,2004; Sandor F., Buc.M.,2005; Li Liwu,2004, Ulevitch R.J.,2004; MonteroVega M.T.,2009]. Количество патологий с нарушениями в системе TLRs растет.

Первичные иммунодефициты (ПИД) с дефектами антителообразования, такие как общая вариабельная иммунологическая недостаточность - ОВИН и Х-сцепленная агаммаглобулинемия - Х-АГГ характеризуются частыми реккурентными бактериальными инфекциями. Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы, и на данный момент нет единого мнения о молекулярных механизмах этих нарушений. В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН [Bayry. J.,2004; Cunningham-Rundles C. et al.,2005; Yong P.F.et al.,2008]. Изучение механизмов функционирования врожденной иммунной системы, оценка состояния компонентов системы TLR у больных ПИД с дефектами антителообразования позволит прояснить иммунопатогенез ОВИН, оценить вклад механизмов врожденного иммунитета в развитие и тяжесть течения инфекций и других осложнений.

Со времени открытия TLR представление о них как о структурах, участвующих только в противоинфекционной защите, существенно видоизменилось. При многих воспалительных заболеваниях, сопровождающихся массивной клеточной деструкцией таких, как инфаркт миокарда, острый панкреатит, происходит высвобождение большого количества эндогенных лигандов, что приводит к активации сигнальных путей TLR. Иногда высвобождаемые DAMP связывают с так называемым Устерильным воспалениемФ, которое развивается в ответ на травму, ишемию, массивное тканевое повреждение при отсутствии патогенной инфекции и сопровождается высокой выработкой провоспалительных цитокинов. Чрезмерная активация TLR и выработка неконтролируемого количества провоспалительных цитокинов могут способствовать развитию системной воспалительной реакции, дальнейшему повреждению тканей, формированию осложнений основного заболевания [Ковальчук Л.В., 2008]. Исследование системы TLR имеет важное значение в понимании патогенеза заболеваний, сопровождающихся деструкцией ткани.

Для выявления дефектов, связанных с нарушением функционирования системы TLR, необходимы надежные методы. Комплексное исследование системы TLR при различных заболеваниях позволит оценить роль механизмов врожденного иммунитета в развитии патологии. Выявление нарушений в системе Toll-подобных рецепторов способствует проведению более точной своевременной диагностике, прогнозированию характера течения заболевания, дает возможность изучить патогенетические аспекты развития патологии, а также научно обосновать и разработать новые подходы адекватной терапии.

Цель исследования: разработать аналитический подход комплексной оценки компонентов системы распознающих рецепторов врожденного иммунитета - Toll-подобных рецепторов, основанный на определении эффекторной функциональной активности, экспрессии молекул TLR и уровня экспрессии мРНК TLR у здоровых людей, больных с иммунодефицитами и у больных при острых заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани, оценить возможность использования выявленных изменений в качестве маркеров прогноза течения заболевания.

Задачи исследования:

1.Разработать подход комплексной оценки системы Toll-подобных рецепторов на уровне экспрессии генов, белков и секретируемых молекул, опосредующих эффекторную функциональную активность TLR на мононуклеарных клетках периферической крови человека.

2.Разработать метод и провести оценку эффекторной функциональной активности TLR на мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови in vitro у здоровых людей различной возрастной категории (взрослые здоровые доноры, дети).

3.Провести анализ системы Toll-подобных рецепторов у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования. Определить эффекторную функциональную активность TLR2 и TLR4, их экспрессию на поверхности моноцитов, а также уровень экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК периферической крови больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью - ОВИН и Х-сцепленной агаммаглобулинемией - X-АГГ.

4.Оценить значимость выявленных изменений экспрессии и функционирования TLR для развития клинических проявлений у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.

5.С помощью разработанного подхода проанализировать состояние TLR на МНК периферической крови больных при острых заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит) в динамике.

6.Определить диагностическую значимость выявленных изменений уровня экспрессии мРНК TLR, экспрессии молекул рецепторов на поверхности клеток и эффекторной функциональной активности TLR у больных острым инфарктом миокарда и острым деструктивным панкреатитом.

7.Оценить возможность использования показателей, характеризующих состояние системы TLR, в качестве маркеров прогноза течения и исхода заболевания

Научная новизна работы

В работе впервые представлен комплексный подход к оценке системы Toll-подобных рецепторов, заключающийся в поэтапном исследовании и анализе эффекторной функциональной активности TLR, экспрессии молекул TLR и уровне экспрессии мРНК TLR МНК периферической крови человека.

Работа содержит новые данные о вовлечении механизмов врожденного иммунитета в патогенез ОВИН. Обнаружены дефекты в системе Toll-подобных рецепторов у больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ). Показано, что при данных ПИД нарушена эффекторная функциональная активность TLR2 и TLR4 на МНК, определяемая по выработке ФНОα в ответ на стимуляцию соответствующими лигандами этих рецепторов. Выявлен дисбаланс TLR4-опосредованной выработки ФНОα и ИФНα МНК больных ОВИН. Сниженная эффекторная функциональная активность TLR2 и TLR4 и низкие значения экспрессии этих молекул у больных ОВИН сопровождаются повышенной частотой развития инфекций.

Впервые на основе нарушения функционирования системы TLR определены прогностические критерии развития неблагоприятного исхода острого инфаркта миокарда. Показано, что повышение функциональной активности и экспрессии TLR2 и TLR4 на МНК у больных ОИМ к 14-м суткам может приводить к развитию осложнений основного заболевания.

Впервые проанализированы показатели системы TLR у больных острым деструктивным панкреатитом различной тяжести течения заболевания в динамике: эффекторная функциональная активность TLR2 и TLR4, экспрессия молекул на поверхности моноцитов и уровень экспрессии мРНК в МНК. Показано, что снижение экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 к концу 1-ой недели заболевания характерно для легкого течения, в то время как тяжелое течение ОДП сопровождается ростом уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в эти сроки.

Выявлены новые маркеры ранней диагностики неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита, основанные на определении экпрессии мРНК TLR2 и TLR4, их эффекторной функциональной активности и определении содержания ИЛ-6 в сыворотке крови больных в 1-е сутки острого деструктивного пакреатита.

Установлено, что нестероидный противовоспалительный препарат - лорноксикам приводит к снижению индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 выработки провоспалительных цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров в культуре in vitro.

Впервые установлено, что применение лорноксикама в комплексном лечении больных ОДП на ранних сроках заболевания приводит к снижению TLR2 и TLR4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов, уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК у этих больных.

Практическая значимость работы

В данной работе разработан метод для оценки эффекторной функциональной активности TLR, основанный на определении индуцированной соответствующими лигандами TLR выработки провоспалительного цитокина - ФНО и ИФН МНК периферической крови человека. Проведена оценка выработки ФНОα и ИФНα МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых людей различного возраста. Полученные данные позволяют оценить эффекторную функциональную активность рецепторов врожденного иммунитета у больных с иммунопатологией.

У больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) в ходе настоящего исследования обнаружены нарушения в системе рецепторов TLR на МНК: снижение эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4, снижение экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН и нарушение экспрессии мРНК TLR2, TLR4 и TLR9 по сравнению со значениями здоровых доноров, что свидетельствует о новых молекулярных дефектах в системе врожденного иммунитета у больных ОВИН и позволяет уточнить иммунопатогенез ОВИН. Выявлены дефекты TLR2 и TLR4-опосредованной выработки ФНО и ИФН МНК, экспрессии этих рецепторов у больных Х-АГГ.

Выявлены новые маркеры развития осложнений у больных острым инфарктом миокарда. Показано, что увеличение эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 и экспрессии этих рецепторов на моноцитах больных к 14-м суткам заболевания может служить диагностическим критерием развития осложнений ОИМ.

Низкие значения уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и эффекторной функциональной активности этих рецепторов в 1 сутки острого деструктивного панкреатита с тяжелой формой течения в сочетании с высокими концентрациями ИЛ-6 в сыворотке крови могут рассматриваться в качестве ранних маркеров диагностики неблагоприятного исхода заболевания.

Обосновано применение нестероидного противовоспалительного препарата - лорноксикам в комплексном лечении больных острым деструктивным панкреатитом на ранних сроках заболевания. Лорноксикам приводит к снижению TLR2 и TLR4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов, уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК у больных на 3-и сутки заболевания и позволяет снизить риск развития системной воспалительной реакции.

Предложенный комплексный подход к оценке системы TLR открывает новые направления в раннем прогнозе течения заболевания и возможности проведения патогенетической коррекции.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан аналитический подход комплексной оценки системы рецепторов врожденного иммунитета - Toll-подобных рецепторов, основанный на определении эффекторной функциональной активности TLR, экспрессии молекул и уровня экспрессии мРНК TLR мононуклеарными клетками человека.

2. Использование разработанного подхода позволило выявить нарушения в системе врожденного иммунитета у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) на уровне функционирования и экспрессии TLR2, TLR4 мононуклеарными клетками периферической крови.

3. Комплексное исследование системы TLR при заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит), позволило выявить активацию системы TLR на ранних сроках заболевания. Увеличение эффекторной функциональной активности и экспрессии TLR2 и TLR4 мононуклеарными клетками периферической крови в динамике заболевания может служить маркером развития осложнений острого инфаркта миокарда.

4.Определены ранние маркеры диагностики неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита, основанные на выявлении крайне низких значений эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 и экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК в сочетании с высокими концентрациями ИЛ-6 в сыворотке крови больных в 1-е сутки заболевания.

5. Использование нестероидного противовоспалительного препарата - лорноксикам в лечении больных острым деструктивным панкреатитом на ранних сроках заболевания приводит к снижению TLR2 и TLR4 - опосредованной выработки провоспалительных цитокинов и экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в МНК.

Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры иммунологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова для студентов, аспирантов и ординаторов, используются в практической работе хирургических отделений ГКБ №55 г.Москвы.

Апробация результатов диссертационной работы

Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России, в 2006 году на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии и иммунологии, в 2007 году на VI Российском конгрессе Современные технологии в педиатрии и детской хирургии, в 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011 и 2012 году в Москве на XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX Российском национальном конгрессе Человек и лекарство, на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008 г.), Европейском конгрессе педиатров (Москва, 2009 г.), III Всероссийском Конгрессе по детской аллергологии и иммунологии (Москва 2009 г.), IX Российском конгрессе Современные технологии в педиатрии и детской хирургии (Москва, 2010 г.), XVIII международный Конгресс Хирургов - гепатологов стран СНГ Актуальные проблемы Хирургической гепатологии (Москва, 2011г.), XI Международный конгресс Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии (Москва, 2011г.).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 45 печатных работ, в том числе 17 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 292 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 422 источника, из которых 87 отечественных и 335 зарубежных. Работа содержит 46 таблиц и 52 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы.

Для исследований использовали кровь здоровых доноров, больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ), больных с острыми заболеваниями, сопровождающимися деструкцией ткани - острый инфаркт миокарда (ОИМ) и острый деструктивный панкреатит (ОДП). Критерием отбора доноров было отсутствие острых инфекционных и аллергических заболеваний. Кровь забирали из локтевой вены в пробирки, содержащие антикоагулянт (гепарин, из расчета 25 ед. на 1 мл крови). Забор крови проводился утром, натощак.

Характеристика групп обследованных пациентов.

Больные первичными иммунодефицитами. Всем больным первичными иммунодефицитами диагноз был поставлен в соответствии с диагностическими критериями, разработанными Европейским обществом иммунодефицитов (ESID).

Группу I больных ОВИН составили 9 человек: 5 мужчин в возрасте 20-30 лет и 4 женщины в возрасте 20-45 лет. Больные находились в 4 аллергологическом отделении ГКБ № 7 Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач Афанасьев В. А., зав.отделением Андросов В.В.).

Группу II больных ОВИН составили 14 человек: 11 мальчиков в возрасте 7-17 лет и 3 девочки в возрасте 6-16 лет.

Группу больных X-АГГ составили 9 мальчиков в возрасте 4-17 лет. Больные находились в отделении клинической иммунологии ФГБУ РДКБ Миздравсоцразвития России (главный врач д.м.н., профессор Ваганов Н.Н., зав.отделением д.м.н.профессор Кондратенко И.В).

В иммунном статусе всех пациентов отмечалось резкое снижение уровней сывороточных IgА, IgМ, IgG, количества CD4+ Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и NK-клеток. Клинически у наблюдаемых пациентов в течение их жизни развивались тяжелые рецидивирующие, хронические бактериальные инфекции.

Все больные после постановки диагноза получали адекватную заместительную терапию иммуноглобулином для внутривенного введения. Кроме того, пациенты получали постоянную профилактическую антибактериальную терапию. Исследование проводили в 2006 -2009гг.

Исследование показателей в группе больных острым инфарктом миокарда проведены в 2006-2009гг. совместно с сотрудниками кафедры факультетской терапии им. академика А.И.Нестерова лечебного факультета (заведующая кафедрой д.м.н., профессор, заслуженный врач РФ Шостак Н. А.), на базе ГКБ №1 и совместно с сотрудниками отделения реанимации ЦКБ РАН (главный врач профессор, д.м.н. Гончаров Н. Г.). Группу больных острым инфарктом миокарда составили 19 человек. Из них 16 мужчин и 3 женщины в возрасте 50-75 лет. У всех обследованных больных был трансмуральный инфаркт миокарда различной локализации. Для лечения больных применялась стандартная схема с использованием препаратов из группы -адреноблокаторов, ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента, нитратов и антиагрегантов. Забор крови у больных проводился на 1 и 14 сутки после инфаркта миокарда.

Анализ компонентов системы рецепторов врожденного иммунитета у больных острым деструктивным панкреатитом проводили совместно с сотрудниками кафедры экспериментальной и клинической хирургии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России (заведующий кафедрой д.м.н., профессор Шуркалин Б.К.) на базе хирургического отделения ГКБ №55 (И.о.главного врача Бышов А.А.) в 2007-2012гг. Группу больных ОДП составили 55 человек в возрасте от 20 до 60 лет с тяжелым и среднетяжелым течением острого панкреатита токсической этиологии, 15 больных ОДП тяжелой и критической стадии заболевания. Деление по степени тяжести проводилось по международной шкале APACHE. 23 человека, которым проводилась только стандартная консервативная терапия ОДП были включены в 1-ю группу обследованных. 32 больных дополнительно получали лорноксикам Ц НПВС группы оксикамов и были включены во 2-ю группу обследованных. Забор крови у больных проводился на 1,3,7 и 14 сутки заболевания.

Здоровые доноры. Группа здоровых доноров включала 70 человек в возрасте 20-45 лет: 52 мужчины и 18 женщин. Донорская кровь была любезно предоставлена отделением переливания крови и гравитационной хирургии ФГБУ РДКБ Миздравсоцразвития России.

Контрольная группа включала также 15 здоровых детей в возрасте 10-14 лет (12 мальчиков и 3 девочки); и 15 здоровых детей в возрасте от 6 месяцев до 3 лет (5 девочек и 10 мальчиков).

МЕТОДЫ

Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови человека. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови здоровых доноров и больных проводили в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-пака (ρ=1,077; Pharmica, Швеция) по методу Boyum [Boyum, 1968]. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью 0,1% раствора трипанового синего. Жизнеспособность клеток после выделения была выше 95%.

Культивирование МНК периферической крови человека. МНК, выделенные из периферической крови, культивировали в полной среде RPMI 1640(НПП ПанЭко, Россия), содержащей гентамицин (ОАО Дальхимфарм, г. Хабаровск) и 10% ЭТС (Sigma, США), в течение 24 часов при 37С в присутствии лигандов TLR. Рабочая концентрация клеток составляла 1х106 в мл. Для стимуляции мононуклеарных клеток использовали следующие лиганды TLR: пептидогликан (ПГ) (Staphylococcus aureus, Sigma,США), ЛПС (E.сoli 0127: B8, Sigma,США), зимозан А (Saccharomyces cerevisiae, "Sigma",США); флагеллин (Salmonela thyphimurium, "InvivoGen",США), полиинозин-полицитидин (Poly (I:C), ("InvivoGen", США), Имиквимод (R837) ("InvivoGen",США), Гардиквимод ("InvivoGen", США), ssRNA40/LyoVec ("InvivoGen", США) и олигодезоксинуклеотид (ОДН) CpG ("InvivoGen", США), действующие через TLR1/2, TLR4, TLR2/6, TLR5, TLR3, TLR7, TLR7/8, TLR8 и TLR9, соответственно. Контролем служили МНК, культивируемые только в среде RPMI 1640. Полученные супернатанты хранили в течение 2-3 месяцев при -700С.

Определение концентрации цитокинов в культуральных супернатантах методом иммуноферментного анализа. Для определения концентрации ФНОα, ИФНα, ИЛ-6, ИЛ-8 использовали коммерческие наборы для иммуноферментного анализа (BioSource, Бельгия) и (Bender Medsystems, Австрия). Результаты анализа учитывали спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Оптическую плотность определяли на приборе Anthos 2020. Калибровочная кривая строилась автоматически по результатам, полученным для стандартов, и по ней определяли содержание цитокинов в исследуемых образцах.

Оценка эффекторной функциональной активности TLR.

При исследовании влияния различных лигандов TLR на продукцию цитокинов МНК принимали спонтанную выработку цитокина за 1 и стимулирующее влияние различных лигандов на продукцию цитокина оценивали, используя коэффициент стимуляции (КС). КС рассчитывали как отношение концентрации цитокина в супернатантах стимулированных лигандами МНК к концентрации цитокина в супернатантах нестимулированных МНК. Относительные единицы вводились для выявления прироста уровня цитокинов под действием лигандов TLR по отношению к спонтанной выработке цитокинов, а также c целью стандартизации метода.

Оценка экспрессии TLR на моноцитах периферической крови человека. Экспрессию молекул на поверхности клеток оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител. Данное исследование проводили совместно с сотрудниками лаборатории клинической иммунологии ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова (директор центра академик РАМН Сухих Г.Т) и сотрудниками ФГБУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития России (директор академик РАМН, профессор Румянцев А.Г.). В работе использовали МкАТ к CD14, меченые ФИТЦ (лCaltag, Invitrogen, e-Biosciences,США), а также к TLR2, меченые ФЭ (лe-Biosciences,США), к TLR4, меченые ФЭ Cy-5 (лe-Biosciences,США) и к TLR4, меченые ФЭ (лe-Biosciences,США). В качестве изотипического контроля использовали мышиные IgG2a, меченые ФИТЦ (лCaltag, Invitrogen, e-Biosciences,США) и мышиные IgG2a, меченые ФЭ (лe-Biosciences,США), Для определения экспрессии антигенов на поверхности моноцитов периферической крови МНК инкубировали с мечеными МкАТ в течение 30 мин. при 4оС, отмывали при 1200 об/мин при 4оС и фиксировали раствором BD Cell Fix. Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре Facscan (Becton Dickinson, США). В каждом образце выявляли процент двойных позитивных (CD14+TLR2+ или CD14+TLR4+) клеток и оценивали относительную интенсивность экспрессии TLR2 и TLR4 (ИФ).

Выделение РНК из мононуклеарных клеток периферической крови человека. Выделение РНК из мононуклеарнвх клеток периферичекой крови человека проводили методом кисло-фенольной экстракции и с использованием коммерческих наборов для выделения РНК УRNeasy Plus Mini KitФ (Qiagen, Германия). Полученные образцы нуклеиновых кислот хранили при температуре минус 700С.

Проведение реакции обратной транскрипции. Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор реагентов УHigh capacity RNA to cDNA Master mixФ, (Applied Biosystems,США) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Постановка полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени, метод ct. Анализ проводили на приборе Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Смесь для реакции готовили по инструкции к реагентам УTaqman Gene Expression Master MixФ (Applied Biosystems,США), использовали набор праймеров для определения генов tlr2, tlr4 (Applied Biosystems,США). Реакционная смесь содержала 12,5 мкл УTaqman Gene Expression Master MixФ, 1,25 мкл праймеров, 2,5мкл кДНК в общем объеме 25 мкл. Уровни экспрессии TLR нормировали по гену -актина (Applied Biosystems,США). Режим для проведения реакции амплификации: 2 мин при t = 50 С , 10 мин при t = 95 С , 15 сек при t = 95 С, 1 мин при t = 60 С. Количество циклов 40. Расчет осуществлялся в программе к прибору Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, версия 2.0.5. Метод Сt - это относительный метод измерения, при применении которого получали результаты в виде относительных единиц (ОЕ), которые показывают уровень экспрессии гена-мишени в исследуемом образце по отношению к калибратору. В качестве шага 1 проводили нормализацию по эндогенному контролю (Ct гена-мишени - Ct эндогенного контроля = Ct), шаг 2: нормализация по калибратору (Ct образца -Ct калибратора = Ct), ОЕ=2-Ct . ОЕ показывают уровень экспрессии гена-мишени в исследуемом образце по отношению к калибратору (за калибратор принимали пулированную кДНК доноров).

Статистические методы обработки данных. Обработку данных проводили в программном пакете StatSoft Statistica 6.0. Исследованные количественные показатели представляли в виде Ме (L-H), где Ме - медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний квартиль. Результаты также выражали как среднее арифметическое для анализируемой группы показателей стандартное отклонение. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием непараметрических критериев. Для сравнения групп по количественным признакам использовали U-критерий Манна-Уитни и критерий Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В настоящей работе разработан аналитический подход к изучению TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитета в норме и при различных патологических состояниях человека. Сформулированный подход включает поэтапную оценку компонентов системы рецепторов врожденного иммунитета -Toll-подобных рецепторов на разных уровнях: определение эффекторной функциональной активности TLR, экспрессии молекулы TLR, экспрессии мРНК TLR. Подобный подход был сформулирован ранее Л.В.Ковальчуком и А.Н.Чередеевым для оценки иммунного статуса человека по патогенетическому принципу: предлагалось оценивать различные этапы функционирования иммунной системы [Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н.,1990]. Комплексный подход позволяет уточнить и локализовать дефекты в системе рецепторов врожденного иммунитета и впоследствии проводить коррекцию выявленных нарушений. Предложенный аналитический подход оценки компонентов системы был использован нами при исследовании состояния рецепторов врожденного иммунитета у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) и у больных острыми заболеваниями, сопровождающимися деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит).

На первом этапе для реализации предложенного комплексного подхода оценки TLR рецепторов нами разработан метод определения эффекторной функциональной активности TLR на мононуклеарных клетках периферической крови человека in vitro. Связывание лигандов с TLR на клетках приводит к их активации и запуску сигнального каскада, приводящего к активации транскрипционных факторов - NF-B, IRF3, что, в свою очередь, приводит к синтезу провоспалительных цитокинов, таких как ФНОα, ИЛ-6, хемокинов, интерферонов, костимулирующих молекул на антигенпрезентирующих клетках и др. [Akira S., Takeda K.,2004; Iwasaki A., Medzhitov R.,2004]. В связи с этим для оценки эффекторной функциональной активности TLR нами предложен и разработан метод определения продукции ФНО и ИФН клетками, экспрессирующими TLR, в ответ на действие лигандов TLR в культуре in vitro. При исследовании влияния различных лигандов TLR на продукцию цитокинов МНК спонтанную выработку цитокина принимали за 1 и стимулирующее влияние различных лигандов на продукцию цитокина оценивали, используя коэффициент стимуляции (КС). КС рассчитывали как отношение концентрации цитокина в супернатантах стимулированных лигандами МНК к концентрации цитокина в супернатантах нестимулированных МНК. Выявлено, что все используемые нами лиганды TLR стимулируют выработку ФНОα МНК периферической крови здоровых доноров, тогда как продукция ИФНα активировалась только лигандами TLR3, TLR4, TLR7/8 и TLR9. Для отработки условий постановки метода оценки эффекторной функциональной активности TLR мы использовали следующие концентрации лигандов TLR: Пептидогликан: 1,0 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 5,0 мкг/мл; Зимозан: 1,0мкг/мл, 10,0 мкг/мл, 100 мкг/мл; ЛПС: 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1,0 мкг/мл; Флагеллин: 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл; ОДН CpG: 1,0 мкг/мл и 10,0 мкг/мл; P(I:C): 5,0 мкг/мл, 10,0 мкг/мл, 20 мкг/мл, 40,0 мкг/мл; Гардиквимод: 1 мкг/мл (рекомендации производителя); Имиквимод: 2,5 мкг/мл (рекомендации производителя); ssRNA: 5 мкг/мл (рекомендации производителя); rHSP70: 1 мкг/мл; 2,5 мкг/мл; 5 мкг/мл; 10 мкг/мл.

Мы проанализировали выработку ФНОα МНК периферической крови здоровых доноров в ответ на выбранные нами оптимальные концентрации различных лигандов TLR: пептидогликан - 2,5 мкг/мл; зимозан - 10 мкг/мл; ЛПС - 0,1 мкг/мл; флагеллин - 0,5 мкг/мл; PI(:C) - 10 мкг/мл; ОДН CpG - 1,0 мкг/мл. Максимальным стимулирующим эффектом обладают лиганды TLR4 и TLR1/2,TLR2/6 - ЛПС, пептидогликан и зимозан, соответственно (Рис.1).

Рисунок 1. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНОα МНК здоровых доноров под влиянием лигандов TLR. *- достоверные различия показателей по сравнению со спонтанной выработкой цитокина,(р<0,05).

Анализируя опосредованную лигандами TLR выработку ФНО в группе здоровых людей, нами выявлены индивидуальные особенности профиля стимулированной лигандами TLR выработки ФНО. Максимальная выработка ФНО МНК у одних доноров выявляется под влиянием ЛПС или в ответ на флагеллин и CpG. У других доноров максимальное количество ФНО вырабатывается при стимуляции МНК пептидогликаном, зимозаном, в то время как показатели, полученные при стимуляции ЛПС, флагеллином, CpG - сравнимы с контролем. Индивидуальные различия выработки ФНОα среди здоровых доноров могут определяться несколькими причинами: различной экспрессией TLR на МНК, полиморфизмом генов TLR и ФНО, функциональным состоянием клеток, участвующих в синтезе ФНОα и других цитокинов. В эпоху развития персонализированной медицины индивидуальные различия выработки ФНОα, не обнаруженные для других цитокинов, могут быть приняты во внимание. Некоторые лиганды TLR (CpG, липид А) рассматриваются сейчас как адъюванты, входящие в состав вакцин,в связи с этим анализ профиля TLR-опосредованной выработки цитокинов может быть использован для подбора индивидуальной вакцины, с целью увеличения эффективности вакцинации.

Cуществуют противоречивые данные о возможности лигандов эндогенного происхождения активировать TLR [Geisler F. et al., 2005]. В связи с этим мы оценили влияние rHSP70 на выработку ФНО МНК периферической крови здоровых доноров. Нами было выявлено, что rHSP70 также оказывал стимулирующее влияние на выработку ФНО МНК здоровых доноров in vitro. Максимальное стимулирующее влияние на выработку ФНО МНК здоровых доноров оказывал rHSP70 в дозе 5 мкг/мл (КС составил 2,50,8).

Активация TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9 запускает также сигнальный каскад, задействующий адапторные молекулы TRIF и MyD88, и приводит к выработке интерферонов I типа [Ito T.et al., 2002; Hoebe K., 2003; Akira S., Takeda K., 2004; Levy O.et al.,2004; Uematsu S.et al.,2005].

Мы исследовали влияние лигандов TLR на выработку ИФНα. Спонтанная выработка ИФНα в группе здоровых доноров составила 29,949,78 пг/мл. Стимулированную лигандами TLR выработку ИФНα оценивали также как и для ФНОα в КС. Выработка ИФНα стимулировалась под действием следующих лигандов: ЛПС, P(I:C), CpG, имиквимод и гардиквимод, причем воздействие лигандов TLR7/8 и TLR9 оказывало наибольший стимулирующий эффект (Рис.2). Индивидуальных особенностей выработки ИФНα МНК здоровых доноров нами выявлено не было.

Рисунок 2. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ИФНα мононуклеарными клетками здоровых доноров под влиянием лигандов TLR, * - показатель достоверно отличается от спонтанной продукции цитокина (р< 0,05)

Возрастные особенности эффекторной функциональной активности и экспрессии Toll-подобных рецепторов у здоровых людей.

В данном разделе приведены результаты исследования по определению эффекторной функциональной активности TLRs на МНК периферической крови детей и взрослых здоровых доноров. Выявили, что у детей в возрасте 0,5 - 3 года несколько снижена спонтанная выработка ФНО по сравнению с детьми в возрасте 10-15 лет и взрослыми донорами (28,459,83 пг/мл; и 46,7426,53пг/мл, соответственно). Спонтанная выработка ФНО МНК в группе детей 10-15 лет достоверно не отличалась от спонтанной выработки цитокина в группе взрослых доноров. Индуцированная выработка цитокина у детей в возрасте 10-15 лет также сопоставима с индуцированной лигандами TLR выработкой ФНО в группе взрослых доноров. Выявлена более высокая индуцированная выработка ФНО, опосредованная лигандами TLR1/2, TLR4, TLR2/6 у детей в возрасте 0,5-3 года по сравнению с детьми 10-15 - летнего возраста и взрослыми донорами (КС детей 0,5-3 лет в ответ на лиганды TLR1/2, TLR4,TLR2/6 составили 12,333,73*; 10,745,68; 13,263,9*; КС здоровых доноров: 5,331,39; 6,021,99; 5,862,33, р<0,05). Высокие значения эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 у детей 0,5-3 лет по сравнению со взрослыми донорами возможны за счет повышенного количества клеток, продуцирующих ФНО у детей раннего возраста, показано, что у детей 1-2 летнего возраста процент клеток (дендритных клеток), продуцирующих ФНО выше, чем у новорожденных и взрослых доноров [Corbett N.P., 2011].

Анализировали также спонтанную и индуцированную лигандами выработку ИФН МНК периферической крови здоровых людей различной возрастной категории. Спонтанная выработка ИФН МНК периферической крови у взрослых доноров (20-40 лет) и у детей в возрасте 10-15 лет не различалась. У детей в возрасте 0,5-3 года спонтанная выработка ИФН МНК достоверно снижена по сравнению со взрослыми здоровыми донорами (6,992,76пг/мл*; 29,949,78пг/мл соответственно, р<0,05). Максимальным стимулирующим влиянием на индуцированную выработку ИФН обладали лиганды TLR9 и TLR7/8, как в группе взрослых доноров, так и у детей. При этом выявили, что выработка ИФН МНК периферической крови взрослых доноров в ответ на имиквимод и гардиквимод, лиганды TLR7/8, выше таковой у детей в возрасте 0,5-3 года (КС: 9,883,95; 12,325,74 - у взрослых доноров; 6,692,18; 9,253,94 - у детей 0,5-3 лет). Низкие значения выработки интерферона в исследуемых возрастных группах были выявлены на лиганды TLR3 и TLR4.

Таким образом, нами был разработан метод для оценки эффекторной функциональной активности TLR на МНК периферической крови человека. При анализе эффекторной функциональной активности TLR в группах здоровых доноров разной возрастной категории выявили статистически значимые различия эффекторной функциональной активности TLR1/2 и TLR2/6 в группе взрослых доноров (20-40 лет) и детей (0,5-3 года).

На следующем этапе оценивали экспрессию TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови здоровых доноров. Данные по экспрессии TLR на моноцитах периферической крови здоровых доноров представлены в таблице 1.

Не выявили достоверно значимых различий в экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах здоровых людей разных возрастных категорий.

Таблица 1.

Экспрессия СD14, TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов

периферической крови здоровых доноров.

Исследуемые группы	СD14+TLR2+ %	ИФ TLR2	CD14+TLR4+ %	ИФ TLR4
Здоровые доноры (20-40 лет)	39,7111,2	2,770,53	6,851,34	1,880,66
Дети (10-15 лет)	29,659,56	2,6 0,7	7,52,44	2,10,83
Дети (0,5-3 года)	31,5410,34	3,4 0,82	6,82,34	2,41,2

Анализ компонентов системы Toll-подобных рецепторов у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.

Первичные иммунодефициты с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) характеризуются частыми реккурентными бактериальными инфекциями. В последнее время появились публикации, сообщающие о дефектах врожденного иммунитета у больных ОВИН [Amoras A.L.B.,2007; Bayry J.et al.,2005]. Возможным механизмом формирования нарушений врожденного иммунитета может быть наличие дефектов в системе TLR. Больные Х-АГГ, также как и больные ОВИН, страдают рецидивирующими инфекциями, преимущественно респираторного и желудочно-кишечного тракта [Кондратенко И.В., 2002]. В литературе мы встретили противоречивые данные об индуцированной выработке цитокинов (ФНОα и ИЛ-6) клетками больных Х-АГГ. Показано, что у этих больных нарушена индуцированная выработка ФНОα и сохранна выработка других цитокинов [Horwood N.J.,2003; Prez de Diego R.,2006, Schmidt N.W.,2006]. Недавние исследования показали, что В-клеточная тирозинкиназа - Btk взаимодействует с компонентами сигнальных путей TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9 и, таким образом, участвует в этом процессе [Doyle S.L. et al.,2007; Sochorov K.et al.,2007; Taneichi H.,2008; Horwood N.J.et al.,2006].

С целью исследования вовлечения механизмов врожденного иммунитета в патогенез и клиническую картину ПИД с дефектами антителообразования мы провели комплексную трехуровневую оценку системы TLR у больных ОВИН и Х-АГГ. На первом этапе оценивали эффекторную функциональную активность TLR в этой группе больных. В ходе исследования выявлено, что у больных ОВИН I и II групп и больных Х-АГГ повышена спонтанная выработка ФНО (у больных ОВИН I группы спонтанная выработка цитокина составила 581,19271,74* пг/мл; у больных ОВИН II группы - 209,74124,01пг/мл; у больных Х-АГГ -298,54136,41пг/мл; у здоровых доноров - 46,7426,53пг/мл; р<0,05.), что свидетельствует о повышенной функциональной активности клеток-продуцентов цитокина, вероятно благодаря постоянной микробной стимуляции клеток врожденного иммунитета у этих больных. Во всех группах больных ПИД с дефектами антителообразования мы наблюдали нарушение индуцированной продукции ФНОα под влиянием пептидогликана, зимозана и ЛПС, лигандов TLR1/2, TLR 2/6 и TLR4, соответственно. Таким образом, у больных ОВИН и Х-АГГ нарушена потенциальная способность МНК лотвечать на лиганды TLR2 и TLR4 т.е. нарушена эффекторная функциональная активность рецепторов (Таблица 2). Низкие значения эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 у больных ОВИН сопровождались повышенной частотой развития инфекций.

Спонтанная продукция ИФНα МНК периферической крови больных ОВИН оказалась значительно ниже по сравнению с группой здоровых доноров и составила 5,410,87 пг/мл в группе I, и в группе II - 6,453,1 пг/мл. Поскольку стимулирующей активностью на выработку ИФНα МНК периферической крови здоровых доноров в наших экспериментах обладают лиганды TLR3, TLR4 и TLR9, МНК периферической

Таблица 2.

Сравнительная характеристика коэффициентов стимуляции выработки ФНОα

мононуклеарными клетками больных Х-АГГ и больных ОВИН.

Исследуемые группы	Пептидогликан	Зимозан	ПС	Флагеллин	ОДН CpG	Спонтанная выработка ФНОα, пг/мл
Больные Х-АГГ	2,611,17*	1,010,39*	1,610,47*	1,630,89	1,811,00	298,54153,09
Больные ОВИН, группа I	2,440,69*	Н.о.	1,780,65*	1,450,36	1,490,51	581,19271,74*
Больные ОВИН, группа II	2,270,61*	2,331,1*	1,920,47*	1,560,69	1,540,69	209,17124,01*
Здоровые доноры	5,331,39	5,862,33	6,021,99	1,820,64	1,830,58	46,7426,53

КС - коэффициенты стимуляции. Н.о. - не определяли.

* - достоверные различия с группой здоровых доноров, р<0,05

крови больных ОВИН активировали P(I:C), ЛПС и CpG . У больных ОВИН I и II группы КС в ответ на ЛПС, P(I:C) и CpG статистически значимо отличаются от показателей в группе здоровых доноров. Причем в группе детей - больных ОВИН КСЛПС выше как по сравнению со взрослыми больными ОВИН, так и со здоровыми донорами. В нашем исследовании мы показали, что индуцированная лигандами TLR4 и TLR9 выработка ИФНα МНК периферической крови больных ОВИН не нарушена. Полученные результаты свидетельствуют о наличии дисбаланса индуцированной ЛПС выработки ФНОα, и ИФНα, который возможно обусловлен нарушением сигнальных путей TLR4, вовлечением в активацию в ответ на действие лиганда TLR4 транскрипционного фактора TRIF, а не MyD88, что может приводить к нарушению ответа на вторичную инфекцию in vivo. Выявленный нами дисбаланс в продукции цитокинов может определять особенности клинической картины у больных ОВИН.

Рисунок 3. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ИФН МНК периферической крови больных ПИД под влиянием лигандов TLR. *- достоверные отличия показателей по сравнению с группой здоровых доноров, (р<0,05).

Изучая выработку ИФНα у больных Х-АГГ, мы не выявили дисбаланса в выработке ФНОα и ИФНα. Лиганды TLR4 и TLR3 (ЛПС и P(I:C)) не оказывали стимулирующего влияния на выработку ИФНα МНК периферической крови больных Х-АГГ (рис. 3). Таким образом, у больных Х-АГГ нами выявлено нарушение индуцированной лигандами TLR2, TLR4 и TLR3 выработки цитокинов - ФНОα и ИФНα МНК периферической крови. Участие Btk в сигнальных путях от TLR2, TLR4, TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9 позволяет предположить, что мутации Btk, выявляемые у больных Х-АГГ приводят к дефекту в передаче сигнала от TLR.

Выявленные изменения эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 у больных ОВИН и Х-АГГ могут быть опосредованы нарушением экспрессии соответствующих рецепторов, полиморфизмом генов рецепторов, а также нарушением трансдукции сигнала от этих рецепторов. Нарушение выработки ФНОα МНК больных в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 может лежать в основе повышенной чувствительности больных ОВИН и Х-АГГ к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам in vivo.

На следующем этапе мы оценивали экспрессию CD14, TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов больных ОВИН I и II групп и больных Х-АГГ. Выявили, что у больных в исследуемых группах процент CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ моноцитов статистически значимо не отличался от показателей в группе здоровых доноров.

Таблица 3.

Экспрессия CD14 , TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови больных ПИД и здоровых доноров.

Исследуемые группы	% CD14+	%СD14+TLR2+	ИФ TLR2	%СD14+TLR4+	ИФ TLR4
Здоровые доноры	86,679,28	39,7111,2	2,770,53	6,851,34	1,880,66
Больные ОВИН, группа I	63,5518,57	27,810,13	1,210,5*	6,731,71	1,20,37*
Больные ОВИН, группа II	64,6615,84	25,312,22	1,460,46*	8,081,5	1,40,56*
Больные Х-АГГ	65,2414,02	23,910,3*	1,340,67*	6,652,81	1,20,31*

*- достоверность различий с группой здоровых доноров, р<0,05

Однако относительная интенсивность флуоресценции TLR2 и TLR4 на поверхности СD14-положительных моноцитов больных ОВИН и Х-АГГ была снижена (Таблица 3). Снижение экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ПИД с дефектами антителообразования, в клинической картине которых наблюдаются рецидивирующие хронические бактериальные инфекции, может быть обусловлено нарушением процессов регуляции поверхностной экспрессии молекул, а также нарушением процессов транскрипции и трансляции продуктов этих генов. Возможно, различные лекарственные препараты также оказывают влияние на уровень экспрессии TLRs и их корецепторов на поверхности клетки.

Во II группе больных ОВИН выявлено двое детей, у которых наряду с высокой спонтанной выработкой ФНОα обнаружены крайне низкие значения индуцированной лигандами TLR выработки цитокина МНК периферической крови, кроме того определялись низкие уровни экспрессии TLR2, TLR4 и CD14 на поверхности моноцитов. Обнаруженные дефекты у этих больных ОВИН сочетались с тяжелым течением заболевания, развитием злокачественных новообразований.

Следующий уровень оценки компонентов системы TLR включал оценку экспрессии мРНК TLR2, TLR4 и TLR9 в МНК периферической крови больных ОВИН и Х-АГГ. Обнаружили статистически значимое снижение экспрессии мРНК TLR9 в МНК больных ОВИН II группы (Таблица 4). Полученные нами данные по экспрессии мРНК TLR9 согласуются с данными литературы: показано, что у больных ОВИН нарушена экспрессия мРНК и белка TLR9 в В лимфоцитах и пДК, снижена также функциональная активность TLR9 при стимуляции CpG [Cunningham-Rundles C. et al.,2006; Clemente A. et al., 2011]. Выявленные нарушения экспрессии и функциональной активности TLR9 могут объяснить частые энтеровирусные инфекции у больных ОВИН. Выявили, что экспрессия мРНК TLR2 и TLR4 в контрольной группе детей выше, чем в группе взрослых доноров, р<0,05. По уровню экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в группе детей больных ОВИН (II группа) выделены 2 подгруппы: больные с высокими значениями экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и с низкими значениями экспрессии по сравнению с контрольными группами детей и взрослыми донорами, различия между этими подгруппами достоверны (р<0,05). Продолжительность заболевания у больных ОВИН II группы с высокой экспрессией мРНК TLR2 и TLR4 составила более 6 лет. Известно, что больные ОВИН страдают частыми реккурентными бактериальными инфекциями, возможно, в ответ на микробную стимуляцию у этих больных происходит повышение уровня экспрессии мРНК TLR.

Таблица 4.

Значения экспрессии мРНК генов TLR в группах больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.

Исследуемые группы	TLR-2	TLR-4	TLR-9
Здоровые доноры (20-40 лет)	1	1	1
Здоровые дети (10-15 лет)	2,841,25*	3,031,57*	2,00,98
ОВИН I группа	1,560,67	1,330,79	1,050,48
ОВИН II группа	11,85,77*#	4,322,08*	0,530,22*#
ОВИН II группа	0,720,25#	0,760,34#	0,530,22*#
Х-АГГ	1,70,62	1,570,52	1,090,54

Данные в таблице представлены в относительных единицах

* достоверные различия с группой здоровых доноров, р<0,05

# достоверные различия с группой детей, р<0,05

У больных 2-ой подгруппы с продолжительностью заболевания от 1 года до 3 лет выявили низкие значения экспрессии мРНК TLR2 и TLR4, в этой группе у больных наблюдались тяжелые сопутствующие заболевания. У взрослых больных ОВИН и детей с Х-АГГ статистически значимых нарушений в экспрессии мРНК TLR2, TLR4 и TLR9 в МНК периферической крови не выявлено.

Проведенная трехуровневая оценка системы TLR у больных ОВИН и Х-АГГ позволила выявить нарушения в системе врожденного иммунитета на уровне эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4, экспрессии молекул этих рецепторов и экспрессии мРНК TLR2, TLR4 и TLR9. Выявленные изменения носят неоднозначный характер: с одной стороны, снижение экспрессии рецепторов на поверхности клеток и их эффекторной функциональной активности предотвращает гиперактивацию этих рецепторов, развитие неконтролируемой воспалительной реакции у больных ОВИН и Х-АГГ. С другой стороны, выявленные дефекты экспрессии и функциональной активности рецепторов могут приводить к развитию тяжелых инфекций. Обнаруженные нами нарушения экспрессии и функционирования паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета у больных ОВИН могут приводить к дефектам созревания антигенпрезентирующих клеток, описанным у больных ОВИН, помогают уточнить патогенез ОВИН, и в дальнейшем могут служить новой терапевтической мишенью в лечении больных ОВИН и Х-АГГ.

Оценка компонентов системы Toll-подобных рецепторов у больных при острых заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани.

Массивное повреждение тканей с большим количеством клеток, подвергающихся некрозу, приводит к выбросу DAMP-эндогенных лигандов TLR, активации TLR и развитию воспаления. Длительная и избыточная активация TLR, в свою очередь, приводит к высвобождению повышенных количеств ФНОα, который будет выполнять не только позитивную роль в организме, но может оказаться фактором тканевого повреждения, способствующим развитию различных осложнений основного заболевания. TLR4 и TLR2 Ц паттерн-распознающие рецепторы, которые взаимодействуют с большим количеством разнообразных лигандов эндогенного происхождения [Kaczorowski D.J.,2008; Li Yu et al., 2010; Lorne E. et al., 2010;].

На данном этапе исследования мы оценивали состояние компонентов системы TLR, в частности TLR2 и TLR4, у больных острым инфарктом миокарда (ОИМ). У больных ОИМ в 1 сутки заболевания мы выявили повышение спонтанной выработки ФНО по сравнению со здоровыми донорами. К 14-м суткам после развития ОИМ спонтанная выработка ФНО у больных снижалась и приближалась к спонтанной выработке ФНО МНК здоровых доноров. Повышенная спонтанная продукция ФНОα МНК больных в 1 сутки ОИМ может быть связана с воздействием различных молекул, высвобождающихся при повреждении миокарда, например, белков теплового шока, активных форм кислорода и других молекул и свидетельствует о повышении функциональной активности клеток врожденного иммунитета у этих больных [Frantz S., 2007]. Выявили, что у больных ОИМ повышена эффекторная функциональная активность TLR2/6 и TLR4 на МНК периферической крови в 1 сутки заболевания. Высокие значения эффекторной функции рецепторов сохраняются и к 14 суткам заболевания (Таблица 5).

Таблица 5.

Индуцированная лигандами TLR2 и TLR4 выработка ФНОα мононуклеарными клетками больных острым инфарктом миокарда

Используемые стимуляторы

Больные

ОИМ 1 сутки

Больные

ОИМ 14 сутки

Здоровые

доноры

Спонтанная

выработка (пг/мл)

147,6137,38

84,777,73

46,7426,53

ПС

10,84,98*

9,22,59*

6,021,99

Пептидогликан

7,982,59

6,922,59

5,331,39

Зимозан

15,44,66*

14,25,32*

5,862,33

Результаты представлены в КС-коэффициент стимуляции

* - достоверные различия с группой здоровых доноров, р<0,05;

У некоторых больных ОИМ в обследованной нами группе к 14-м суткам заболевания наблюдалось повышение спонтанной и индуцированной лигандами TLR4 и TLR2/6 продукции ФНО по сравнению с соответствующими значениями на 1 сутки (Рис.4). В дальнейшем у этих больных развились осложнения (повторный инфаркт миокарда, формирование аневризмы сердца). Не исключено, что избыточная выработка ФНО у больных ОИМ на 14 сутки заболевания является одним из факторов, приводящим к развитию осложнений основного заболевания.

Рисунок 4. Спонтанная и индуцированная лигандами TLR2/6 и TLR4 выработка ФНО у больных ОИМ. *-достоверные различия между группами, р< 0,05

Таким образом, дальнейшее увеличение выработки ФНО МНК больных в ответ на лиганды TLR 4 и TLR2/6 - ЛПС и зимозан к 14 суткам после развития ОИМ в сравнении с индуцированной выработкой ФНО на 1 сутки заболевания может служить прогностическим признаком неблагоприятного исхода заболевания.

Наряду с изучением эффекторной функции TLR2 и TLR4 проводили оценку экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности CD14+ моноцитов больных ОИМ в 1 и 14 сутки заболевания. Выявили, что у больных ОИМ в 1 сутки заболевания, наряду с эффекторными функциями TLR2 и TLR4, повышено количество СD14+TLR2+ клеток и CD14+TLR4+ клеток. К 14 суткам количество СD14+TLR2+ моноцитов снижается до значений, сопоставимых со значениями здоровых доноров, а количество СD14+TLR4+ моноцитов еще остается повышенным. Достоверно повышена в 1 сутки заболевания у больных и относительная интенсивность экспрессии TLR2 и TLR4 на CD14+ моноцитах (Таблица 6).

Таблица 6.

Экспрессия TLR2 и TLR4 на CD14+моноцитах

больных острым инфарктом миокарда

Исследуемые группы	СD14+TLR2+ %	ИФ TLR2	CD14+TLR4+ %	ИФ TLR4
Здоровые Доноры	39,7111,2	2,770,53	6,851,34	1,880,66
Больные ОИМ 1 сутки	57,113,69	4,250,8*	12,22,12*	4,71,3*
Больные ОИМ 14 сутки	40,29,85	3,10,6	9,12,1	3,53,0,7

*достоверные отличия значений по сравнению с группой здоровых доноров, р<0,05

Избыток провоспалительных цитокинов может влиять на репаративные процессы, происходящие в ткани миокарда. Своевременное снижение уровня провоспалительных цитокинов важно для индукции процессов тканевой репарации. Важно, что источником провоспалительных цитокинов могут быть не только клетки иммунной системы, но и клетки миокарда. Кардиомиоциты экспрессируют широкий спектр TLR, включая TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 и TLR9, через NF-kВ эти рецепторы инициируют высвобождение провоспалительных цитокинов и хемокинов самими кардиомиоцитами [Boyd J.H. et. al., 2006]. Длительная и чрезмерная активация TLR на моноцитах, кардиомиоцитах и других клетках, участвующих в процессах постинфарктного заживления, избыточным количеством высвобождающегося Hsp70 или других эндогенных лигандов у больных ОИМ сопровождается продукцией высоких уровней провоспалительных цитокинов, приводящих к дополнительному повреждению ткани, и может играть роль в развитии системного воспалительного ответа, способствующего развитию неблагоприятного исхода заболевания. Затянувшийся воспалительный процесс, включающий продукцию повышенных уровней провоспалительных цитокинов, возможно, играет важную роль в формировании осложнений ОИМ, в частности, развития сердечной недостаточности [Satoh M. et al. 2006; Frantz S. 2007, Zhu X. et.al.,2007; Sun M. et.al., 2007].

Проведенное исследование свидетельствует о повышенной эффекторной функции и экспрессии TLR2 и TLR4 на МНК периферической крови больных острым инфарктом миокарда, вовлечении этих рецепторов в развитие и течение ОИМ. Анализ экспрессии и эффекторной функциональной активности TLR у больных ОИМ в динамике позволил выявить новые маркеры развития осложнений основного заболевания.

Оценка компонентов системы TLR у больных острым деструктивным панкреатитом.

Нарушения в иммунной системе, как в адаптивном иммунитете, так и во врожденном иммунитете играют ведущую роль в патогенезе острого панкреатита. Изучение системы TLR имеет важное значение в понимании патогенеза острого панкреатита, так как повышенная экспрессия TLR, особенно на ранней стадии заболевания, может приводить к чрезмерной активации иммунной системы, гиперпродукции провоспалительных цитокинов, развитию системной воспалительной реакции, и, в особо тяжелых случаях, полиорганной недостаточности. С другой стороны, дефицит TLR усугубляет транслокацию грамотрицательных бактерий, что в свою очередь может приводить к развитию инфекционных осложнений у больных острым панкреатитом.

Изучение влияния лорноксикама на опосредованную TLR 1/2 и TLR 4 выработку провоспалительных цитокинов МНК здоровых доноров in vitro.

В наше исследование наряду с группой больных ОДП, получающих стандартную терапию, были включены больные, дополнительно к стандартной терапии получающие нестероидный противовоспалительный препарат группы оксикамов - лорноксикам в 1-3 сутки заболевания. В связи с этим мы оценили действие лорноксикама на TLR - опосредованную выработку провоспалительных цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров in vitro. Выявили, что лорноксикам достоверно ингибирует выработку ФНО, ИЛ-1 и ИЛ-6 в ответ на ПГ и ЛПС, лиганды TLR1/2 и TLR4 МНК здоровых доноров в культуре in vitro. Максимальное подавление продукции этих цитокинов достигается под действием лорноксикама в дозе 300 мкМ. При этом наибольший подавляющий эффект наблюдался в случае индукции выработки цитокинов через TLR1/2 (Таблица 7).

Таблица 7

Подавление лорноксикамом выработки провоспалительных цитокинов МНК здоровых доноров in vitro.

		Стимулирован ная выработка (пг/мл)	Ингибирование (%)
		Стимулирован ная выработка (пг/мл)	орноксикам 10 мкМ	орноксикам 30 мкМ	орноксикам 300 мкМ
ФНОα	ПС	612 262	не влияет	12,858,72	33,4329,77
ФНОα	ПГ	1050581	не влияет	29,7113,27	70,8619,96*
ИЛ-1	ПС	568305	14,849,50	не влияет	42,6927,30
ИЛ-1	ПГ	2012533	18,4814,19	65,7020,37*	85,715,19*
ИЛ-6	ПС	1736443	9,356,09	4,763,64	29,477,29
ИЛ-6	ПГ	1624615	13,097,09	15,054,18	50,2226,11*
ИЛ-8	ПС	111534050	7,415,67	36,5031,44	60,6322,51*
ИЛ-8	ПГ	99584316	10,936,55	43,1628,53	70,6312,67*
ИЛ-12	ПС	474120	11,689,99	78,1218,23*	85,1111,08*
ИЛ-12	ПГ	362125	4,533,47	58,8340,17	91,225,00*

* - достоверность различий, р 0,05

Значительное снижение уровня провоспалительных цитокинов служит аргументом в пользу выраженного противовоспалительного эффекта лорноксикама и его способности воздействовать не только на метаболизм арахидоновой кислоты, но и на пути трансдукции сигнала от активированных TLR. Ингибирующее действие лорноксикама на выработку провоспалительных цитокинов МНК периферической крови возможно опосредовано подавлением активации фактора транскрипции NF-B [Yin J.et al., 2009].

У больных ОДП мы проводили трехуровневую оценку системы TLR в МНК периферической крови в динамике заболевания на 1, 3, 7 и 14 сутки. Первый уровень включал оценку эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4. Обнаружено, что у больных ОДП повышены значения эффекторной функции TLR2 и TLR4, начиная с 1-х суток заболевания (Рис.5,Таблица 8). Значения оставались высокими и к 14 суткам заболевания.

Рисунок 5. Индуцированная ЛПС выработка ФНО МНК больных острым деструктивным панкреатитом.

*- показатель с достовернми различиями между группами, (р< 0,05)

Полученные результаты свидетельствуют о вовлечении TLR2 и TLR4 в патогенез заболевания. Больные ОДП 1-ой группы получали только стандартную терапию; больные ОДП 2-ой группы, кроме стандартной терапии, получали лорноксикам в 1-3 сутки. В 1-ой группе больных происходило дальнейшее повышение индуцированной ЛПС выработки ФНО на 3-и сутки, в группе больных, получающих лорноксикам, выявленные высокие значения индуцированной выработки ФНО в 1-е сутки заболевания снижались к 3 сутки. У больных 1-ой и 2-ой групп также наблюдалась повышенная индуцированная ПГ выработка ФНО на 1-е сутки заболевания. У больных 1-ой группы происходило значительное повышение TLR2-индуцированной выработки цитокина на 3-и сутки, мы не выявили повышения значений в группе больных, получающих лорноксикам.

Таблица 8.

Индуцированная ПГ выработка ФНО МНК больных ОДП.

1 сутки

3 сутки

7 сутки

14 сутки

Больные ОДП

1 группы

848,4

(779,66-980,32)

1859,2*

(830,4-3813,7)

691,6

(321,6-1495,9)

973,6*

(845,1-1102,3)

Больные ОДП

2 группы

886,1

(727,6-1356,9)

727,6

(472,9-1356,9)

762,9

(333,3-954,1)

850,6

(610,8-1160,5)

Здоровые

доноры

478,2

(285,2-829,7)

478,2

(285,2-829,7)

478,2

(285,2-829,7)

478,2

(285,2-829,7)

Данные в таблице представлены как Me (25Ц75 процентили),

* - достоверность различий с группой здоровых доноров, р<0,05

Выявленное снижение TLR2 и TLR4 индуцированной выработки провоспалительных цитокинов на 3-и сутки заболевания у больных 2-ой группы возможно происходит за счет действия лорноксикама. По данным литературы известно, что у больных ОДП важное прогностическое значение имеют уровни провоспалительных цитокинов - ИЛ-6 и ИЛ-8. Показано, что высокие уровни ИЛ-6 и ИЛ-8 тесно коррелируют с тяжестью заболевания [Mayer J. Et al.,2000;Sathyanarayan G. et al.,2007]. В связи с этим мы определяли спонтанную и индуцированную лигандами TLR2 и TLR4 выработку ИЛ-6 и ИЛ-8 у больных ОДП в динамике. Выявили, что у больных ОДП достоверно повышены значения спонтанной выработки ИЛ-6 и ИЛ-8 МНК периферической крови на 3,7,14 сутки. Повышенные значения индуцированной ЛПС и ПГ выработки ИЛ-6 и ИЛ-8 наблюдались нами у больных ОДП с 1-х суток заболевания. В 1-ой группе больных индуцированная выработка ИЛ-6 и ИЛ-8 повышалась на 3-и и 7-е сутки по сравнению со значениями в 1-е сутки, во 2-ой группе больных, получающих лорноксикам, происходило достоверное снижение индуцированной продукции цитокинов по сравнению с показателями в 1-е сутки и со значениями у больных 1-ой группы на 3 сутки заболевания. Снижение TLR2 и TLR4 индуцированной выработки провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО) МНК больных ОДП, получающих лорноксикам, согласуется с полученными нами данными по ингибированию лорноксикамом выработки провоспалительных цитокинов МНК здоровых доноров in vitro. На первой неделе заболевания у больных ОДП может развиваться лцитокиновый шторм, который в свою очередь может привести к развитию системной воспалительной реакции и полиорганной недостаточности, поэтому необходим контроль за выработкой провоспалительных цитокинов на 1-ой неделе заболевания и использование препаратов, снижающих выработку провоспалительных цитокинов в этот период.

На втором этапе оценивали экспрессию TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови больных ОДП. Обнаружили снижение количества CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ клеток у этих больных по сравнению со здоровыми донорами, низкие значения экспрессии TLR2 и TLR4 на CD14+ моноцитах на 1-14 сутки. При этом у больных 1-ой группы наблюдали повышение интенсивности флуоресценции и количества CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ клеток к 3-м суткам заболевания. У больных 2-ой группы, получающих лорноксикам, количество CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ моноцитов и экспрессия TLR2 и TLR4 не изменялась по сравнению с показателями в 1-е сутки (Таблица 10). Повышенная индуцированная лигандами TLR2 и TLR4 выработка провоспалительных цитокинов у больных ОДП не сопровождалась высокими значениями базовой экспрессии этих рецепторов на поверхности клеток.

Таблица 9.

Экспрессия TLR2 и TLR4 на моноцитах больных острым деструктивным панкреатитом.

	Здоровые доноры	Больные ОДП 1 сутки		Больные ОДП 3 сутки		Больные ОДП 7 сутки		Больные ОДП 14 сутки
	Здоровые доноры	Больные 1 группа	Больные 2 группа	Больные 1 группа	Больные 2 группа	Больные 1 группа	Больные 2 группа	Больные 1 группа	Больные 2 группа
CD14+TLR2+ (% клеток)	39,7111,16	27,4012,39	26,005,65	55,502,12*	24,001,41	36,6612,01	30,003,53	47,001,41	28,504,24
ИФ	2,770,53	2,310,57	1,730,035	3,620,076	1,670,63	1,650,09	2,140,25	1,870,77	2,10,26
CD14+TLR4+ (% клеток )	6,851,34	3,931,08	5,002,82	6,470,67	3,891,22	3,780,33	1,800,91	5,91,67	5,830,23
ИФ	1,880,66	1,240,16	1,680,96	1,440,83	1,220,20	1,360,29	1,320,14	1,620,87	1,520,20

*-достоверные различия по сравнению с показателями в группе здоровых доноров,р<0,05

Возможный механизм сниженной экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОДП - интернализация этих рецепторов после их связывания эндогенными лигандами и активации. Было показано, что после связывания TLR4 с лигандом (ЛПС) происходит его интернализация, доставка в эндолизосомы, где он подвергается деградации [Haas B., Leonard F. et al., 2011].

Третий уровень оценки системы TLR - оценка экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в мононуклеарных клетках периферической крови больных ОДП. Показано, что уровни экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в МНК больных ОДП в 1-7 сутки заболевания повышены.

У больных с тяжелым течением ОДП выявлены более высокие значения экспрессии мРНК TLR2 и TLR4. При проведении исследования нами было выявлено, что у больных средней степени тяжести экспрессия мРНК TLR2 и TLR4 снижается на 3,7 сутки, а у больных с тяжелым течением заболевания и развитием осложнений уровень экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 продолжает повышаться, что может приводить к гиперактивации системы TLR в случае тяжелого течения заболевания. У больных 2-ой группы, дополнительно к стандартной терапии получавших лорноксикам, выявили достоверное снижение уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 по сравнению с больными 1-ой группы на 3-7 сутки. Уровень экспрессии мРНК TLR2 у больных с тяжелым течением, получающих лорноксикам, достоверно ниже, начиная с 3-х суток по 14 сутки по сравнению с пациентами 1-ой группы (Таблица 10). У больных со среднетяжелым течением снижение экспрессии мРНК TLR2 на 3 сутки происходило как в 1-ой, так и во и 2-ой исследуемых группах. При оценке экспрессии мРНК TLR4 на 1-е и 3-и сутки заболевания мы не выявили достоверного различия в экспрессии мРНК TLR4 между больными 1-ой и 2-ой групп, к 7-м суткам у больных 2-ой группы экспрессия мРНК TLR4 достоверно снижалась по сравнению с больными 1-ой группы, находящимися на стандартной терапии. Не выявили, достоверного различия в экспрессии мРНК TLR4 в МНК периферической крови больных с тяжелым и среднетяжелым течением 1-ой и 2-ой групп.

Таблица 10.

Значения экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 у больных острым деструктивным панкреатитом

Исследуемые группы

1сутки

3 сутки

7сутки

14сутки

Больные

1 группы

Тяжелое

течение

34,83*

(34,77-43,75)

45,94*#

(34,39-48,34)

26,7

(20,43-35,45)

23,92*#

(12,81-35,6)

Средне-

тяжелое

течение

11,89

(10.12-21.27)

10,11

(9,42-10,81)

18,09

(10,97-27,85)

4,59

(3,72-5,46)

Больные

2 группы

Тяжелое

течение

28,96*

(27,67-42.99)

27,72*

(22,41 - 33,65)

17,81

(6,14-39,85)

9,56*

(8,51-10,63)

Средне-

тяжелое

течение

18,09

(12,03-26,52)

11,43

(7,57-14,87)

7,84

(3,21-16,12)

5,72

(5,36-6,09)

Исследуемые группы

1сутки

3 сутки

7сутки

14сутки

Больные

1 группы

Тяжелое

течение

11,071

(8,21-11,83)

8,15*

(5,6-11,74)

7,03

(5,07-8,24)

5,18*#

(4,65-5,71)

Средне

тяжелое

течение

8,31

(5,1-9,16)

4,75

(4,57-4,92)

11,56#

(9,48-13,64)

3,52

(2,44-4,19)

Тяжелое

течение

9,68

(6,17-10,81)

8,199

(4,43-10,42)

5,59

(3,75-7,51)

2,87

(2,43-3,32)

Больные

2 группы

Средне

тяжелое

течение

8,48

(5,06-11,9)

4,28

(3,94-4,89)

4,26

(2,54-6,45)

2,19

(2,09-2,29)

Данные в таблице представлены в относительных единицах, как Me (25Ц75 процентили),

* - достоверные различия в группах между больными с тяжелым течением и больными с течением средней тяжести (р < 0,05)

#- достоверные различия по сравнению с больными 2 группы

Выявленная нами высокая функциональная активность клеток врожденного иммунитета у больных ОДП (определяемая по повышенной спонтанной и индуцированной выработке провоспалительных цитокинов) сопровождается высокими значениями уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4. Однако на поверхности клеток у этих больных мы не выявили высокой экспрессии молекул TLR2 и TLR4. В последние годы в литературе появляются сведения о растворимых формах TLR, в частности TLR2, TLR4 и TLR9 [Raby A-C., et al., 2009; Chockalingam A., et al., 2011; Zunt S. L.et al., 2009]. Обсуждается протективная роль растворимых рецепторов в развитии системной воспалительной реакции и осложнений. При связывании лигандов с растворимым рецептором не происходит включение сигнальных путей, трансдукции сигнала и, соответственно, не происходит синтеза цитокинов. Кроме того, возможная интернализация активированных рецепторов и различные транскрипционные и посттранскрипционные механизмы могут приводить к снижению экспрессии белка, предотвращая развитие системной воспалительной реакции у больных острым деструктивным панкреатитом.

Таким образом, у больных ОДП нарушения в системе рецепторов врожденного иммунитета -TLR характеризуются высоким уровнем экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и высокой эффекторной функцией этих рецепторов на МНК периферической крови на первой неделе заболевания. Применение лорноксикама на начальных этапах развития ОДП позволяет снизить экспрессию мРНК TLR2 и TLR4, чрезмерную выработку провоспалительных цитокинов и предотвратить развитие системной воспалительной реакции.

При обследовании отдельных больных с тяжёлой и критической формой ОДП мы не выявили повышения эффекторной функции TLR2 и TLR4 в 1-7 сутки заболевания (в 1 сутки заболевания. КС индуцированной выработки ФНО в ответ на ЛПС и ПГ у этих пациентов составили 3,91,3 и 4,3 2,7, соответственно; у здоровых доноров КСЛПС =6,021,99; КСПГ= 5,331,39. У 40% больных этой группы обнаружены крайне низкие значения индуцированной выработки ФНО в ответ на ЛПС и ПГ (спонтанная выработка ФНО - 57,6519,35пг/мл; индуцированная ЛПС: 64,414,8пг/мл; индуцированная ПГ: 60,89,6пг/мл), через 2-3 дня эти больные умерли. Выявленные крайне низкие значения эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 при тяжелых и критических формах острого деструктивного панкреатита могут служить прогностическим критерием неблагоприятного исхода заболевания.

Экспрессия мРНК TLR2 и TLR4 в группе больных с тяжелой и критической формой ОДП была низкой на протяжении 1-ой недели заболевания и не отличалась достоверно от значений в группе здоровых доноров. Мы предполагаем, что выявленные нами сниженные значения эффекторной функциональной активности и экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в 1-е сутки у больных ОДП могут свидетельствовать об иммуносупрессии, которая может развиваться при тяжёлых острых воспалительных заболеваниях. Подобное ослабление компонентов врождённого иммунитета может приводить к последующему присоединению инфекции и развитию инфекционных осложнений ОДП [Kylanpaa M-L.et al.,2010; Matsumura N. et al.,2007]. В нашем исследовании у 30% пациентов этой группы на 2-ой неделе заболевания развивались гнойные осложнения, которые в дальнейшем сопровождались повышением экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и их эффекторной функции на 14-28 сутки. Таким образом, выявленные нами низкие значения экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и снижение эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 на первой неделе заболевания у больных ОДП могут способствовать развитию гнойных осложнений на второй неделе заболевания.

Мы обнаружили, что у больных с тяжелой и критической формой ОДП с неблагоприятным исходом заболевания низкий уровень экспрессии мРНК TLR2, пониженная экспрессия TLR2 и TLR4 на моноцитах и отсутствие индуцированной TLR2 и TLR4 выработки ФНОα сочетались с высокой концентрацией ИЛ-6 в сыворотке периферической крови больных в 1 сутки заболевания (концентрация ИЛ-6 у больных ОДП в 1 сутки составила - 354,3100,4пг/мл; здоровых доноров -31,512,8пг/мл, р<0,05).

Рисунок 6. Алгоритм проведения комплексной оценки системы TLRs .

На рисунке представлены выявленные в работе изменения в системе TLR у больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН,Х-АГГ), у больных острым инфарктом миокарда и острым деструктивным панкреатитом, в красной рамке Ц показатели, которые могут рассматриваться как маркеры прогноза течения и развития осложнений.

Таким образом, проведение комплексной трехуровневой оценки системы TLR у больных острым деструктивным панкреатитом позволяет уточнить нарушения механизмов врожденного иммунитета, на основе выявленных изменений выдвинуть новые ранние маркеры тяжести течения и развития неблагоприятных исходов заболевания, а также осуществлять контроль за проводимой терапией у этих больных. Кроме того, выявленные дефекты функционирования системы TLR могут рассматриваться как мишени для терапевтического воздействия в лечении больных ОДП.

Предложенный в работе комплексный анализ системы TLRs, включающий поэтапую оценку эффекторной функциональной активности TLR, экспрессии молекул TLR и мРНК TLR раскрывает новые подходы к пониманию роли механизмов врожденного иммунитета в развитии патологии, позволяет оценить функциональное состояние клеток врожденного иммунитета, точно локализовать дефект в системе TLR и в дальнейшем проводить целенаправленную коррекцию выявленных нарушений. На рисунке 6 представлен алгоритм проведения комплексной оценки системы TLR, приведены выявленные нами изменения в системе TLR у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ), у больных с острыми заболеваниями, сопровождающимися деструкцией ткани (ОИМ и ОДП), представлены показатели, которые могут рассматриваться как маркеры ранней диагностики развития осложнений, неблагоприятного исхода заболевания при данных патологических состояниях. Разработанный подход оценки системы TLR дает возможность выявлять новые диагностические и прогностические критерии течения заболеваний, развития осложнений, оценить эффективность применения лекарственных препаратов. Выявляемые нарушения в системе TLR открывают возможности для проведения терапии и в дальнейшем могут служить новой терапевтической мишенью.

ВЫВОДЫ

1. Разработан аналитический подход комплексной оценки системы паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета - Toll-подобных рецепторов (TLR), заключающийся в поэтапном определении эффекторной функциональной активности TLR, экспрессии молекул TLR на поверхности клеток и уровне экспрессии мРНК TLR мононуклеарными клетками периферической крови человека.

2. Анализ системы TLR у здоровых людей позволил выявить повышенные значения эффекторной функциональной активности и экспрессии TLR2 на МНК периферической крови здоровых детей в возрасте 0,5-3 лет по сравнению с детьми 10-15 лет и взрослыми здоровыми донорами 20-40 лет.

3. У больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью выявлены низкие значения эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4, дисбаланс TLR4 - опосредованной выработки ФНОα и ИФНα; снижение экспрессии TLR2 и TLR4 на CD14+ моноцитах больных, изменения уровня экспрессии мРНК TLR2, TLR4 и TLR9 по сравнению со значениями у здоровых доноров, что свидетельствует о нарушении механизмов врожденного иммунитета у этих больных. Низкие значения эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 на МНК у больных ОВИН сопровождались повышенной частотой развития инфекций.

4. У больных Х-сцепленной агаммаглобулинемией обнаружены дефекты в системе Toll - подобных рецепторов врожденного иммунитета, характеризующиеся сниженной эффекторной функциональной активностью TLR2 и TLR4, низкими значениями экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови больных.

5. Выявлены нарушения в системе рецепторов врожденного иммунитета у больных острым инфарктом миокарда: повышение эффекторной функциональной активности и уровня экспрессии молекул TLR2 и TLR4 на мононуклеарных клетках периферической крови больных острым инфарктом миокарда в 1 и 14 сутки заболевания.

6. Гиперактивация TLR2 и TLR4 на мононуклеарных клетках периферической крови больных острым инфарктом миокарда к 14-м суткам заболевания, выражающаяся в увеличении TLR2 и TLR4 - опосредованной выработки ФНО и экспрессии молекул TLR2 и TLR4 по сравнению со значениями в 1-е сутки заболевания, ассоциирована с развитием осложнений острого инфаркта миокарда,

7. У больных острым деструктивным панкреатитом повышена эффекторная функциональная активность TLR2 и TLR4, экспрессия мРНК TLR2 и TLR4 МНК периферической крови в 1-7 сутки заболевания по сравнению со значениями у здоровых доноров. Уровень экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 может служить критерием тяжести течения острого панкреатита: легкое течение сопровождается снижением экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 на 3-7 сутки заболевания, повышение экспрессии в эти сроки наблюдается у больных с тяжелым течением.

8. Нарушения в системе TLR у больных острым деструктивным панкреатитом, характеризующиеся низкими значениями экспрессии мРНК TLR2 и TLR4, молекул TLR2 и TLR4 на моноцитах, сниженной эффекторной функциональной активностью TLR2 и TLR4 на мононуклеарных клетках в сочетании с высокой концентрацией ИЛ-6 в сыворотке крови в 1 сутки заболевания могут служить прогностическим критерием неблагоприятного исхода заболевания.

9. Обосновано применение препарата лорноксикам в комплексном лечении острого деструктивного панкреатита. При использовании лорноксикама в лечении больных острым деструктивным панкреатитом отмечено снижение индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 выработки провоспалительных цитокинов и уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК периферической крови больных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Хорева М.В. Спонтанная и индуцированная продукция ИЛ-12 и ИФН-γ МНК периферической крови у детей, больных ОВИН./ Хорева М.В.,Долгина Е.Н.,Пащенко О.Е. и др.// Аллергология и иммунология. - 2004. Цт.5, №1, С.153

2.Хорева М.В. Особенности выработки ФНО- под влиянием различных стимулов в норме и при первичных иммунодефицитах./ Л.В.Ковальчук, М.В. Хорева, А.С. Варивода и др. // Аллергология и иммунология.-2005.- т.6, № 2, С.159.

3.Хорева М.В. Врожденные компоненты иммунитета: Toll-подобные рецепторы в норме и при иммунопатологии./ Л.В.Ковальчук , М.В.Хорева, А.С.Варивода // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии.- 2005.- №4, С. 96-104.

4.Khoreva M.V. Cytokine-secretory function of human leukocytes of peripheral blood expressing Toll-like receptors. The role of different ligands./ Kovalchuk L.V., Khoreva M.V., Varivoda A.S.// Abstr.of the Congress УImmune-Mediated Diseases:from Theory to TherapyФ, JAPAIR. -2005. - v.6,suppl.1, P.91-92.

5.Хорева М.В. Изучение функциональной активности Toll-подобных рецепторов у больных инфарктом миокарда./ М.В.Хорева, А.С.Варивода, Л.В.Ковальчук и др.// Аллергология и иммунология. - 2006.- т. 7, №3, С.352.

6.Хорева М.В. Анализ поверхностной экспрессии СD14 и CD62L молекул и выработки ИЛ-8 нейтрофилами периферической крови пациентов с инфарктом миокарда под влиянием агонистов TLR2/6 и TLR4./ И.Н.Николаева, А.С.Варивода, М.В.Хорева и др.// Аллергология и иммунология. - 2006.- т. 7, №3, С.353.

7.Хорева М.В. Дефекты системы врожденного иммунитета у больных с первичными иммунодефицитами./ Л.В. Ковальчук, М.В. Хорева, А.С. Варивода // Аллергология и иммунология в педиатрии. -2006.-, №2-3(9), С. 75.

8.Хорева М.В. Опосредованные через Toll-подобные рецепторы выработка цитокинов и экспрессия поверхностных маркеров лейкоцитами человека./ М.В. Хорева, Л.В.Ковальчук, А.С. Варивода и др.// Аллергология и иммунология. Ц 2006.- т.7, №2, С. 199-206.

9.Хорева М.В. Влияние лигандов Toll-подобных рецепторов на выработку in vitro провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови здоровых людей и больных с общей вариабельной иммунологической недостаточностью./ Л.В. Ковальчук, М.В. Хорева, А.С. Варивода и др.// Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии.- 2007.-№1,С. 38-42.

10.Хорева М.В. Влияние лигандов TLR на выработку провоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных первичными иммунодефицитами./ Л.В. Ковальчук, М.В. Хорева, А.С. Варивода и др.// Сборник материалов VIII конгресса Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии (27-29 июня 2007),С.55.

11.Хорева М.В. Анализ зависимой от Toll-подобных рецепторов выработки провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови человека in vitro у здоровых доноров и больных первичным иммунодефицитом./ Л.В.Ковальчук, М.В.Хорева, А.С.Варивода и др. // БЭБИМ. - 2007. Ц т.144, №7, С. 68-72.

12. Khoreva M.V.Expression and functional activity of TLR2 and TLR4 in patients with congenital disorders of antibody production./ Khoreva M.V., Varivoda A.S., Paschenco O.E.// Abstr.of the 2 Congress УImmune-Mediated Diseases: from Theory to TherapyФ ЦJAPAIR.- 2007.- v.11, suppl.2, P.30.

13.Хорева М.В. Экспрессия и функциональная активность TLR2 и TLR4 на мононуклеарных клетках здоровых людей и больных ОВИН./ Варивода А.С., Ковальчук Л.В., Хорева М.В. и др.// Сборник материалов VI Российского Конгресса Современные технологии в педиатрии и детской хирургии.- октябрь 2007.-С. 76-77.

14.Хорева М.В. Анализ поверхностной экспрессии и TLR2 TLR4 на моноцитах периферической крови больных первичными иммунодефицитами./ Л.В.Ковальчук, М.В.Хорева, А.С.Варивода и др.// Сборник материалов XVI Российского национального конгресса Человек и лекарство.- 2008.-С.161.

15.Хорева М.В. Подходы к оценке рецепторов врожденного иммунитета./ Хорева М.В., Ковальчук Л.В., Варивода А.С. и др.// Российский иммунологический журнал.-2008.- т. 2 (11), № 2-3.С. 151.

16.Хорева М.В. Дефекты в системе Toll-подобных рецепторов у детей с первичными иммунодефицитами./ Варивода А.С., Хорева М.В., Ковальчук Л.В. и др.// Российский иммунологический журнал. -2008.- т. 2 (11), № 2-3. - C. 274.

17.Хорева М.В. Экспрессия и функциональная активность TLR2 и TLR4 у больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью./ Варивода А.С., Николаева М.А., Хорева М.В. и др.// Российский иммунологический журнал.-2008.- т. 2 (11), № 2-3. - C. 274.

18.Хорева М.В. Рецепторы врожденного иммунитета: подходы к количественной и функциональной оценке Toll-подобных рецепторов человека./ Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. и др.// Иммунология.- 2008.- №4, С.223-227.

19.Хорева М.В. Роль рецепторов врожденного иммунитета в развитии острого инфаркта миокарда./ Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2008.- №4, С. 64-68.

20.Хорева М.В. Комплексный анализ системы Toll-подобных рецепторов при первичных иммунодефицитах с дефектом антителообразования./ Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. и др.// Материалы научно-практической конференции Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины.- 2008.- Москва, С 56.

21.Хорева М.В. Эффекторные функции Toll-подобных рецепторов при алопеции у детей./ Варивода А.С., Костина С.В., Хорева М.В. и др.// Российский аллергологический журнал.- 2009.- №3, вып. 1. С.41.

22.Хорева М.В. Анализ провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у детей с очаговой алопецией./ Костина С.В., Варивода А.С., Шарова Н.М. и др.// Российский аллергологический журнал.- 2009.- №3, вып. 1. С.357.

23. Khoreva M.V. Systemic approach to Toll-like receptors analysis in patients with primary immunodeficiency./ Varivoda A.S., Koval'chuk L.V., Khoreva M.V.et al.// Materials of 4-th Europaediatrics Congress.- Moscow, July 2009.

24.Хорева М.В. Клиническое значение цитокинов при различных формах очаговой алопеции у детей./ С.В. Костина, Хорева М.В., Варивода А.С. и др.//Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии.- 2009.-, т.2, С.5-9.

25.Хорева М.В. Исследование цитокинов у детей с очаговой алопецией.// С.В. Костина, Варивода А.С., Шарова Н.М. и др.// Материалы 3-ей российской научно-практической конференции Санкт-Петербургские дерматологические чтения. -Сентябрь 2009.

26.Хорева М.В. Влияние ингибитора циклооксигеназы на опосредованную через TLR2 и TLR4 выработку цитокинов мононуклеарными клетками человека в норме и при остром панкреатите./Хорева М.В., Ковальчук Л.В., Варивода А.С. и др.// Российский иммунологический журнал.- 2009.- №3-4, 3(12), С.294-302.

27.Хорева М.В. Роль цитокинов в развитии острого панкреатита./ М.А. Агапов, В.А. Горский, М.В. Хорева и др.// Анналы хирургической гепатологии.- 2009.- №3, С.85-111.

28.Хорева М.В. Корригирующее действие ингибитора циклооксигеназы на функциональное состояние мононуклеарных клеток, экспрессирующих Toll- подобные рецепторы./ Л.В.Ковальчук, М.В. Хорева, А.С. Никонова и др.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии .- 2010.- №1, С.45-50.

29.Хорева М.В. Антимедиаторная терапия в комплексном лечении острого деструктивного панкреатита./ В.А. Горский, Л.В. Ковальчук,М.А. Агапов и др.// Хирургия. Журнал им. Н.И.Пирогова.- 2010.- №3, С. 54-61.

30.Хорева М.В. Применение нестероидных противовоспалительных препаратов в лечении панкреонекроза./ Шуркалин Б.К., Ковальчук Л.В., Агапов М.А. и др.// Хирург. - 2010.- №3, С.5-13.

31.Хорева М.В. Кардиоиммунные взаимодействия на основе рецепторов врожденного иммунитета: состояние вопроса, перспективы развития./ Л.В. Ковальчук, А.С. Никонова, М.В.Хорева и др.// Вестник Российского государственного медицинского университета.- 2010.- №1, С. 11-18.

32.Хорева М.В. Изучение системы Toll-подобных рецепторов врожденного иммунитета в острый период после инфаркта миокарда./ Л.В. Ковальчук, М.В.Хорева, А.С. Никонова, Е.В. и др.// Вестник Российского государственного медицинского университета.- 2010.- №1, С.19-24.

33.Хорева М.В. Анализ функциональной активности и экспрессии Toll-подобных рецепторов на мононуклеарных клетках у детей с нейтропенией./ М.В.Хорева, А.С. Никонова, Л.В. Ковальчук и др.// Материалы XVI конгресса Человек и лекарство.- 2010.- С. 476.

34.Хорева М.В. Синдром системной воспалительной реакции при остром панкреатите: особенности молекулярной патофизиологии и возможные пути коррекции./ В.А.Горский, М.А.Агапов, Л.В.Ковальчук и др.// Клиническая медицина.- 2010.- №2, С.39-44.

35.Хорева М.В. Влияние нестероидных противоспалительных препаратов на медиаторы воспаления у больных панкреонекрозом./ Б.К.Шуркалин, В.А.Горский, М.А.Агапов и др.// Инфекции в хирургии.- 2010.- Т.8, №2, С.28-32.

36.Хорева М.В. Опосредованная Toll-подобными рецепторами функциональная активность мононуклеарных клеток у детей с нейтропениями./Л.В. Ковальчук, М.В.Хорева А.С. Никонова и др.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 2010.- №2, С.45-50.

37.Хорева М.В. Цитокин-антагонистическая терапия острого деструктивного панкреатита./ М.А.Агапов, Л.В. Ковальчук, М.В.Хорева и др.// Хирургия, приложение к журналу Consilium Medicum.- 2010.- №1,С.43-46.

38.Хорева М.В. Распознающие рецепторы врожденного иммунитета (NLR,RLR и CLR)./ Л.В. Ковальчук, М.В.Хорева, А.С. Никонова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-2011.- №1, С.93-100.

39. Khoreva M. Antimediator Therapy as a Part of the Complex Treatment of Acute Destructive Pancreatitis./ V. Gorsky, M. Agapov, M. Khoreva et al.// Pancreatology, 43rd European Pancreatic Club (EPC) Meeting. Magdeburg, Germany. - June 22Ц25, 2011.- № 11, Р.178.

40. Патент на изобретение №2408256: Способ диагностики безболевой ишемии миокарда у женщин Чукаева И. И., Клепикова М.В., Орлова Н.В., Ковальчук Л. В., Хорева М. В., Никонова А.С., Речнова Н.П., Денисова Н.Н., Смирнова Т. В., Чура О.В. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 января 2011г.

41.Хорева М.В. Возможности коррекции синдрома системной воспалительной реакции при остром деструктивном панкреатите./ Агапов М.А., Хорева М.В., Горский В.А.// Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2011.- №7, С.18-23.

42. M.V. Khoreva . Mechanical Stretching of Cells of Different Tissues: The Role of Mediators of Innate Immunity./ L. V. Kovalchuk, M.V. Khoreva, A. Nikonova et al.// Mechanosensitivity in Cells and Tissues, 1, Volume 5, Mechanical Stretch and Cytokines, P. 35-58, 2012, Book Chapter.

43. M.V. Khoreva. The Role of Proinflammatory Cytokines in Regulation of Cardiac Bioelectrical Activity: Link to Mechanoelectrical Feedback ./ V. S. Kuzmin, D. V. Abramochkin, V. M. Mitrochin et al.// Mechanosensitivity in Cells and Tissues, 1, Volume 5, Mechanical Stretch and Cytokines, P. 107-153, 2012, Book Chapter.

45. M.V. Khoreva. An Anti-inflammatory Cytokine Interleukin-13:Physiological Role in the Heart and Mechanoelectrical Feedback. / D. V. Abramochkin, E. Yu. Makarenko,V. M. Mitrochin et al.// Mechanosensitivity in Cells and Tissues, 1, Volume 5, Mechanical Stretch and Cytokines, P. 155-164, 2012, Book Chapter.

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по медицине

Blog