Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по химии  

На правах рукописи

Малинин

Андрей Сергеевич

КОМПЛЕКСЫ катионных ПОлимеров С АНИОННЫМИ КОЛЛОИДАМИ: ФОРМИРОВАНИЕ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА

02.00.06 - высокомолекулярные соединения, химические науки

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

МОСКВА - 2012

Работа выполнена в Московском государственном университете имени

М.В. Ломоносова на химическом факультете (в лаборатории синтеза и изучения свойств полимеров кафедры высокомолекулярных соединений).

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Ярославов Александр Анатольевич

Официальные оппоненты:

Прокопов Николай Иванович доктор химических наук, профессор (Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова, заведующий кафедрой химии и технологии высокомолекулярных соединений) Мисин Вячеслав Михайлович доктор химических наук, профессор (Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля, заведующий лабораторией комплексной оценки антиоксидантов)

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элементо-органических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук (ИНЭОС)

Защита состоится л14 ноября  2012 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г.Москва, Ленинские горы, д.1, стр.3, МГУ имени М.В.Ломоносова, Химический факультет, Лабораторный корпус А, кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан л ___________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

к.х.н.                                              Долгова Алла Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Адсорбция полиэлектролитов (полимеров с ионогенными группами) на противоположно заряженных твердых субстратах (стекле, полимере, металле) представляет собой простой и эффективный способ модификации поверхности. Этот прием позволяет придать поверхности нужную функциональность, упростить процедуру очистки конечного продукта, ковалентно связать на модифицированной поверхности биологически активные вещества, красители и проч. Последовательная адсорбция катионных и анионных полимеров позволяет получать полимерные слои контролируемой толщины, сохраняющие стабильность в широком интервале концентрации соли и рН раствора.

Между тем, существует целый ряд задач, для решения которых необходимы полимерные покрытия (моно и мультислойные), обратимо десорбирующиеся с поверхности при изменении внешних условий, например, концентрации соли и/или температуры. Высокая стабильность межфазных электростатических комплексов полиэлектролит-поверхность достигается благодаря множественным солевым связям, в образовании которых участвуют ионогенные группы обоих компонентов. Можно ожидать, что уменьшение количества заряженных групп в макромолекуле будет сопровождаться понижением устойчивости межфазного комплекса в водно-солевых средах. Такие лабильные (возобновляемые) покрытия представляют интерес для конструирования носителей лекарственных веществ, катализаторов, сорбентов для извлечения токсичных соединений, антикоррозионных и биоцидных пленок и проч.

Цель работы состояла в синтезе сополимеров с различной долей катионных звеньев в макромолекуле, в формировании комплексов сополимеров с анионными коллоидами, в исследовании стабильности комплексов в водно-солевых средах и миграции адсорбированных макромолекул между коллоидными частицами, и в изучении функциональных свойств белков, адсорбированных на межфазных полимерных слоях.

Для этого в работе необходимо было:

1) синтезировать

• сополимеры с (а) катионными и (б) гидрофильными или гидрофобными группами;

2) исследовать

• адсорбцию катионных сополимеров на поверхности анионных боросиликатных микросфер (БСМ),
• стабильность комплексов поликатион-БСМ в водно-солевых средах;
• кинетику перераспределения адсорбированных молекул поликатиона между микросферами;
• формирование мультислойных чередующихся покрытий поликатион/ полианион на поверхности БСМ и каталитическая активность фермента
• -химотрипсина (ХТ), иммобилизованного на полимерных мультислоях;

Научная новизна. Модификацией поли-4-винилпиридина бромистым этилом и бромуксусной кислотой впервые синтезированы две серии катионных сополимеров:  1) с катионными и гидрофобными звеньями и 2) с катионными и гидрофильными электронейтральными (цвиттер-ионными) звеньями. Впервые показано, что устойчивость комплексов катионных сополимеров с анионными гидрофильными коллоидными частицами (БСМ) в водно-солевых средах резко возрастает с увеличением мольной доли катионных звеньев в макромолекуле (). Продемонстрирована способность адсорбированных молекул поликатионов перемещаться между БСМ, сделана оценка эффективного коэффициента латеральной диффузии макромолекул DПК = 1,410-12 см2/с (при 20 С). Путем чередующейся адсорбции поликатиона и полианиона получены полимерные мультислои на поверхности БСМ; гидролитический фермент (-химотрипсин), иммобилизованный на полимерном мультислое, сохраняет около 50% своей каталитической активности.

Практическая значимость. Разработан и экспериментально проверен способ контролируемой десорбции поликатиона с анионной поверхности путем изменения концентрации соли в окружающем растворе. Описанная в работе электростатическая адсорбция ферментов на поверхности полиэлектролитного мультислоя может быть использована для получения высокоэффективных биокатализаторов и нанолекарств. Предложен способ нековалентной конъюгации белков с частицами вирусов растений через поликатионный спейсер, который может быть использован для получения биологически безопасных нановакцин.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 7-м Международном симпозиуме по полиэлектролитам УPolyelectrolytes 2008Ф (Португалия, Коимбра, 2008), Юбилейной научной конференции, посвящённой 80-летию Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (Россия, Москва, 2009), 5-ой Всероссийской каргинской конференции УПолимеры-2010Ф (Россия, Москва, 2010), 7-ом Международном симпозиуме ИЮПАК по молекулярной подвижности и порядку в полимерных системах (Россия, Санкт-Петербург, 2011), а также на XIV, XV и XVI-ой Международных конференциях Ломоносов 2007, 2008 и 2009 (Россия, Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 2 патента, 9 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 2 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы из 181 ссылки.

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

В литературном обзоре проанализированы описанные в литературе теории адсорбции полиэлектролитов и обсуждены экспериментальные данные о кинетике адсорбции полиэлектролитов на лиофильных коллоидных частицах, строению и свойствам адсорбционных слоев. В дополнение к этому рассмотрены теоретические и экспериментальные работы, посвящённые латеральной (вдоль поверхности) динамике макромолекул.

В экспериментальной части описаны объекты и методы исследования. Структурные формулы и составы использованных в работе катионных сополимеров представлены на рис. 1 и в таблице 1.

Катионные сополимеры с гидрофобными звеньями в основной цепи (лгидрофобные катионные сополимеры, КСфоб) получали за счет неполной кватернизации 10%-ного метанольного раствора поли-4-винилпиридина (ПВП) со степенью полимеризации 600 бромистым этилом. Катионные сополимеры с цвиттер-ионными гидрофильными звеньями (лгидрофильные катионные сополимеры, КСфил) получали путем последующей кватернизации гидрофобных поликатионов бромуксусной кислотой.

Рис. 1. Структурные формулы катионных сополимеров. , и - доли катионных, гидрофобных (неалкилированных) и гидрофильных электронейтральных (цвиттерЦионных) звеньев соответственно.

Таблица 1. Состав катионных сополимеров.

Сополимер
КСфоб-24	0,24	0,76	0
КСфоб-33	0,33	0,67	0
КСфоб-40	0,40	0,60	0
КСфоб-51	0,51	0,49	0
КСфоб-61	0,61	0,39	0
КСфоб-67	0,67	0,33	0
КСфоб-98*	0,98	0,02	0
КСфил-0/97	0	0,03	0,97
КСфил-3/94	0,03	0,03	0,94
КСфил-5/92	0,05	0,03	0,92
КСфил-8/90	0,08	0,02	0,90
КСфил-10/86	0,10	0,04	0,86
КСфил-13/85	0,13	0,02	0,85
КСфил-15/82	0,15	0,03	0,82
КСфил-20/76	0,20	0,04	0,76
КСфил-29/67	0,29	0,04	0,67
КСфил-40/56	0,40	0,04	0,56
КСфил-47/50	0,47	0,03	0,50
КСфил-63/34	0,63	0,03	0,34
КСфил-67/29	0,67	0,04	0,29
КСфил-98/0*	0,98	0,02	0

*) КСфоб-98 КСфил-98/0 КСпред

Состав сополимеров определяли методом ИК спектроскопии. Концентрация катионных сополимеров приведена в молях кватернизованных групп на литр раствора. Во флуоресцентных экспериментах использовали гидрофильный катионный сополимер КСфил-88/10 с = 0,88, = 0,02 и = 0,10, дополнительно ковалентно модифицированный этилендиамином и флуоресцеин-изо-тиоционатом (ФИТЦ) в расчете лодна флуоресцентная метка на макромолекулу (Ф-КС).

Каталитическую активность ХТ определяли спектрофотометрически, измеряя скорость гидролиза специфического субстрата, п-нитроанилид пироглутамил-фенилаланина (Glp-Phe-pNA), по накоплению в растворе пара-нитроанилина при =410 нм.

Катионные сополимеры адсорбировали на поверхности БСМ со средним диаметром 4,90,5 мкм (рис. 2). Для получения максимального количества поверхностных анионных групп БСМ обрабатывали смесью концентрированной серной кислоты и пероксида водорода. Среднее количество силанольных групп на поверхности каждой анионной микросферы составило 2,6108 или 3 силанольные группы на 1 нм2 поверхности БСМ.

Рис. 2. Микрофотография борсиликатных стеклянных микросфер (БСМ). Просвечивающая электронная микроскопия.

В работе использовали методы флуоресцентной, УФ и ИК спектроскопии, сканирующей, просвечивающей, флуоресцентной и конфокальной микроскопии, кондуктометрии и потенциометрии. Если не оговорено особо, результаты экспериментов приведены после нормирования на 1 г микросфер. Эксперименты проводились в 10-2М боратном буфере с pH 9,2.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Адсорбция катионных сополимеров на поверхности анионных микросфер.

Количество связанного с микросферами сополимера оценивали следующим образом. Водную суспензию БСМ добавляли к раствору сополимера, через 5 мин стеклянные микросферы с адсорбированным сополимером отделяли центрифугированием и находили его концентрацию в надосадочной жидкости [КС]своб, сравнивая оптическую плотность супернатанта с соответствующей градуировочной зависимостью.

На рис. 3а и 3б приведены экспериментальные данные по связыванию на БСМ четырех катионных сополимеров с гидрофобными звеньями (из 7 исследованных) и четырёх гидрофильных сополимеров (из 14 исследованных) в координатах концентрация свободного полимера ([КС]своб]) - общая концентрация полимера в суспензии ([КС]). Видно, что каждый сополимер полностью связывался с БСМ вплоть до некоторой предельной концентрации [КС]макс. При больших концентрациях несвязанный с микросферами (свободный) полимер появлялся в растворе.

Зависимость [КСфоб]макс от мольной доли катионных групп в сополимере , включающая результаты для всех 7 исследованных КСфоб (рис. 4а, кривая 1), свидетельствует о том, что возрастание сопровождалось уменьшением количества адсорбированного сополимера. Путем пересчета общей концентрации звеньев адсорбированного поликатиона [КСфоб]макс на концентрацию его катионных групп ([КС+фоб]макс = [КСфоб]макс ) получили зависимость л[КС+фоб]макс - (рис. 4а, кривая 2), вид которой указывает на то, что количество катионных групп в предельно насыщенных адсорбционных слоях КСфоб не изменялось с увеличением их содержания в поликатионе.

Зависимость [КСфил]макс от с учетом всех 14 гидрофильных сополимеров представлена кривой 1 на рис. 4б. Она имеет колоколообразный вид с максимумом при = 0,15 и горизонтальным участком в области > 0,4. Пересчетом общей концентрации звеньев адсорбированного гидрофильного поликатиона [КСфил]макс на концентрацию его катионных групп ([КС+фил]макс= [КСфил]макс ) получили зависимость л[КС+фил]макс - (рис. 4б, кривая 2) с ростом [КСфил]макс в области низких значений и выходом на плато при 0,4.

На основании приведённых зависимостей можно заключить, что сополимеры количественно связывались с поверхностью БСМ. В случае гидрофобных сополимеров количество предельно адсорбированного поликатиона прогрессивно уменьшалось с ростом , что отражало уменьшение количества балластных некватернизованных групп в адсорбированных сополимерах. В соответствии с этой моделью количество катионных групп в предельно насыщенных адсорбционных слоях КСфоб ([КС+фоб]макс) не менялось (рис. 4а, кривая 2).

Рис. 3. а) Зависимость концентрации несвязанного с микросферами КСфоб от его общей концентрации в суспензии. КСфоб-24 (1), КСфоб-33 (2), КСфоб-51 (3) и КСфоб-98 (4).

б) Зависимость концентрации несвязанного с микросферами КСфил от его общей концентрации в суспензии. КСфил-0/98 (1), КСфил-8/90 (2), КСфил-15/82 (3) и КСфил-40/56 (4).

Рис. 4. а) Зависимость концентрации КСфоб, обеспечивающей максимальное заполнение поверхности БСМ, от (1). Кривая 2 получена путем пересчета общей концентрации звеньев КСфоб в концентрацию его катионных групп.

б) Зависимость концентрации КСфил, обеспечивающей максимальное заполнение поверхности БСМ, от (1). Кривая 2 получена путем пересчета общей концентрации звеньев КСфил в концентрацию его катионных групп.

Несколько сложнее развивалось связывание гидрофильных сополимеров с теми же коллоидными частицами. Согласно теоретическим представлениям об адсорбции полиамфолитов, эффективность адсорбции определяется балансом между притяжением полимерных цепей к поверхности, индуцированным их поляризацией в электрическом поле частицы, и отталкиванием звеньев макромолекулы. Замена части цвиттер-ионных групп на катионные приводила к изменению баланса сил в пользу притяжения и возрастанию количества адсорбированных макромолекул (или, в других терминах, [КСфил]макс); так продолжалось до тех пор, пока не становилось равным 0,15 (рис. 4б, кривая 1). Последующее увеличение сопровождалось увеличением количества солевых связей, формируемых адсорбированными макромолекулами, и одновременным уменьшением количества связанных с поверхностью балластных цвиттер-ионных групп, что находило отражение в понижении [КСфил]макс.

Стабильность комплексов катионных сополимеров с БСМ в водно-солевом растворе (2,5 М растворe NaCl) оценивали спектрофотометрически по содержанию поликатионов в супернатантах после отделения комплексов с помощью центрифугирования. Результаты представлены на рис. 5 в виде зависимости доли поликатиона, связанного с БСМ, от содержания катионных групп в сополимере. Видно, что КСфоб полностью десорбировался с поверхности микросфер при = 0,24; при большем содержании катионных групп весь адсорбированный поликатион оставался на поверхности микросфер в 2,5 М растворе соли (кривая 1). Что касается гидрофильного поликатиона, его комплекс с БСМ приобретал стабильность в солевом растворе уже при небольшом содержании катионных групп (при = 0,08 - 0,1); диссоциация комплекса полностью подавлялась для сополимеров с 0,15 (кривая 2).

Рис. 5. Зависимость доли КСфоб (1 - ) и КСфил (2 - ), связанных с поверхностью частиц БСМ в 2.5 М растворе NaCl, от .

Таким образом, увеличение суммарного заряда катионного полимера сопровождалось повышением стабильности его комплекса с БСМ. Отличие в поведении гидрофобных и гидрофильных поликатионов проявлялось в том, при каком содержании катионных групп связывание сополимеров на поверхности БСМ становилось необратимым (нечувствительным к присутствию соли в окружающем растворе). Гидрофильные сополимеры демонстрировали необратимое связывание при меньшем содержании катионных групп, чем гидрофобные: = 0,3 для гидрофильных сополимеров против = 0,15 для гидрофобных. Это могло быть связано с дополнительным участием цвиттер-ионных групп гидрофильных сополимеров в стабилизации их комплексов с БСМ.

2. Миграция катионного сополимера между микросферами.

Как показано в предыдущей главе, стабильность комплексов катионных сополимеров с БСМ в солевых средах резко возрастала с повышением доли катионных групп в сополимере. По достижении некоторого порогового содержания катионных групп макромолекулы удерживались на поверхности БСМ даже в растворах с высокой концентрацией низкомолекулярной соли. Однако адсорбированный полимер сохранял способность перемещаться по поверхности микросфер и переходить с одной микросферы на другую. Для демонстрации латеральной подвижности адсорбированных макромолекул был использован метод конфокальной микроскопии.

Водная суспензия БСМ (67 мг/мл) была добавлена к раствору флуоресцентно меченого катионного сополимера (Ф-КС) с таким расчетом, чтобы обеспечить максимальное заполнение поверхности микросфер адсорбированным сополимером. Возможный избыток сополимера удалялся центрифугированием, что гарантировало отсутствие свободного (несвязанного с микросферами) сополимера в водном растворе. Затем к суспензии комплекса БСМ/сополимер добавляли суспенизию исходных (лпустых) БСМ. В полученной таким образом смеси количество микросфер с адсорбированным катионным сополимером (NКС) было равно количеству пустых микросфер (N): NКС = N, или NКС/N = 1.

Сразу после приготовления смесь была разбавлена в 20 раз, и аликвоту смеси наносили на стеклянную пластину, помещенную на объектив конфокального микроскопа. Фотография смеси, сделанная во флуоресцентном режиме, представлена на рис. 6а. Хорошо видно, что только что приготовленная смесь содержала два типа микросфер: зеленых и черных с адсорбированным Ф-КС и без него соответственно. Через 24 часа смесь была снова проанализирована с помощью конфокальной микроскопии. Оказалось, что все находящиеся в фокусе микроскопа частицы были окрашены в зеленый цвет (рис. 6б), то есть несли на себе флуоресцентно меченый поликатион. Этот результат однозначно свидетельствовал о том, что адсорбированный катионный сополимер перераспределялся между всеми микросферами в суспензии.

Мы проделали описанный выше эксперимент, добавляя разные количества пустых микросфер к максимально насышенному комплексу БСМ/Ф-КС и анализируя интенсивность флуоресценции индивидуальных частиц с помощью программного обеспечения, предлагаемого фирмой-разработчиком (Carl Zeiss, США). На рис. 7 представлена зависимость средней интенсивности флуоресценции частиц в поле микроскопа (в относительных координатах, I/I0), установившейся через 24 часа после приготовления смеси БСМ/Ф-КС + БСМ, от соотношения =NКС/(NКС+N). Пунктирными линиями отмечены средние интенсивности флуоресценции частиц в обменивающейся полимером системе, рассчитанные при условии равномерного распределения Ф-КС между всеми микросферами в системе: I/I0(теор)=NКС/(NКС+N). Видно, что экспериментально найденная величина I/I0 прогрессивно уменьшалась с понижением и каждый раз соответствовала равномерному распределению Ф-КС между микросферами.

Рис. 6. Микрофотография смеси БСМ/Ф-КС + БСМ через 5 минут (а) и 24 часа (б) после смешения. Конфокальная микроскопия (флуоресцентный режим).

Рис. 7. Зависимость средней интенсивности флуоресценции частиц в смеси БСМ/Ф-КС + БСМ от соотношения =NКС/(NКС+N).

Сополимер может перераспределяться между микросферами либо путем десорбции и последующей адсорбции на новой частице, либо переползая с одной частицы на другую при непосредственном контакте частиц. Стеклянные микросферы - частицы с высокой плотностью (2,5 г/см3) практически количественно осаждались на дно сосуда пробирки в течение 5 минут после добавления суспензии; получившийся осадок не перемешивался в ходе миграционного эксперимента. Поэтому перераспределение сополимера происходило, скорее всего, в ходе его латеральной миграции между соседними микросферами в осадке. Несмотря на высокую вероятность такого способа перераспределения адсорбированного полимера, мы провели модельный эксперимент, результаты которого могли бы помочь в выборе механизма миграции сополимеров.

Были приготовлены две стеклянные пластинки (10 мм 40 мм) с силанольными группами на поверхности (их обработка смесью серной кислоты и перекиси водорода проводилась в тех же условиях, что и модификация БСМ). Поверхность одной из пластинок была покрыта 10 мкл 10-2 М раствора Ф-КС. Через 10 мин избыток раствора был удален с поверхности пластинки, а сама она была промыта 3 раза в большом объеме дистиллированной воды. Полученная таким образом пластинка флуоресцировала при λфлуор= 515 нм (λвозб = 493 нм), интенсивность флуоресценции составляла 1,19 а.е, что свидетельствовало о связывании Ф-КС с поверхностью модифицированной пластинки. Затем две пластинки - с адсорбированным Ф-КС и без него - были помещены в наполненный боратным буферным раствором стеклянный сосуд на расстоянии ~1 мм друг от друга. Через 2 недели была измерена интенсивность флуоресценции обеих пластинок, которая оказалась равной 1,19 а.е. для пластинки с адсорбированным Ф-КС, а интенсивность флуоресценции второй пластинки была близка к нулю. Иными словами, нам не удалось за 2 недели зарегистрировать перемещение Ф-КС между платинками, разделенными буферным раствором. Этот результат находился в согласии со сделанным ранее выводом о том, что миграция сополимера развивается в основном по механизму его латеральной диффузии между соседними микросферами.

В описанных выше экспериментах свободная поверхность, на которую переходил флуоресцентно меченый катионный сополимер, создавалась за счет добавления пустых микросфер к микросферам с адсорбированным сополимером. Если же комплекс БСМ/Ф-КС смешивали с микросферами, поверхность которых была максимально заполнена немеченым КС, то даже через неделю в системе присутствовали два типа частиц - зеленые с адсорбированным Ф-КС и черные с адсорбированным немеченым КС (данные флуоресцентной микроскопии). Иными словами, а такой системе - со 100%-ным заполнением поверхности частиц сополимером - он не перераспределялся между частицами.

Это наблюдение было использовано при постановке кинетических экспериментов для оценки скорости миграции сополимера. Кинетическая кривая, описывающая перераспределение сополимера между микросферами, была получена следующим образом. Были приготовлены восемь одинаковых образцов с соотношением (БСМ/Ф-КС)/БСМ (вес./вес.) = 1. Последовательно с интервалом в два часа к образцам добавляли избыток стоп-реагента - немеченого КС, что приводило к заполнению всех свободных для адсорбции мест на поверхности микросфер и блокированию миграции меченого сополимера. Полученные смеси были проанализированы с помощью конфокальной микроскопии и результаты анализа оцифрованы, как описано выше.

Во всех образцах присутствовали два сорта частиц с примерно равным содержанием частиц обоих типов: (1) с 1>I/I0>0,5 и (2) с 0,5>I/I0>0. Первые логично было приписать микросферам, с поверхности которых сополимер уходил, вторые - микросферам, на поверхности которых он появлялся. Первые для простоты изложения мы назовем теряющими сополимер БСМ (т-БСМ), вторые - приобретающими сополимер БСМ (п-БСМ). На рис. 8 представлены временные зависимости I/I0 для обоих типов микросфер.

Рис. 8. Кинетика изменения интенсивности флуоресценции т-БСМ ( 1) и п-БСМ (2).

Полученная кинетическая зависимость для количества (концентрации) сополимера, перешедшего с т-БСМ на п-БСМ (или в обратном направлении), позволяет рассчитать коэффициент латеральной диффузии катионного сополимера (DКС) в предположении, что этот процесс подчиняется второму закону Фика: dC/dt = DКС(d2C/dx2). Аналитическое решение данного уравнения дало значение DКС равное 1,410-12 см2/с при 20 С. Мы повторили описанные выше эксперименты при 20 С, но в 3М растворе NaCl, и в стандартном 10-2М боратном буфере с pH 9.2, но при температуре 60 С. В обоих случаях мы видели ожидаемый отклик системы - возрастание коэффициента диффузии (до 3,210-12 см2/с в солевом растворе и до 4,210-12 см2/с при повышении температуры).

Вычисленное нами значение латеральной диффузии адсорбированного на стеклянных микросферах катионного сополимера оказалось на 2-3 порядка ниже коэффициентов латеральной диффузии, приводимых в литературе для (био)полимеров, в частности, белков и ДНК. Меньшая скорость миграции катионных сополимеров в суспензии (плотном слое) БСМ может быть следствием (i) несовершенной морфологии отдельных микросфер (наличием гор и ловрагов на их поверхности) и образованных ими агломератов (сополимеру приходится перемещаться по бугристой поверхности, что эквивалентно увеличению пройденного им пути), (ii) возможного застревания макромолекул в узких щелях между соседними микросферами, (iii) больших расстояний между соседними микросферами, существенно превышающих длину сегмента макромолекулы (то есть отсутствия подходящих мостиков для перехода на соседнюю частицу), (iv) блокирования больших участков поверхности микросфер (доступных мест связывания) в агломератах, и ряда других причин. Поэтому в нашем случае правильнее говорить об эффективном коэффициенте латеральной диффузии катионного сополимера, имея в виду те специфические ограничения, которые характерны для перемещения адсорбированного полимера в плотном слое 5 мкм частиц (см. выше).

3. Латеральная подвижность катионного сополимера в тройной системе анионная микросфера-сополимер-линейный/сшитый полианион.

Общепринято, что латеральная (вдоль плоскости) миграция гибкоцепных полиэлектролитов развивается по механизму рептации. Решающую роль в такой диффузии играют петли и хвосты адсорбированных макромолекул. Движение макромолекул осуществляется за счёт разрыва старых и образования новых ионных контактов полимер-поверхность. При таком скомпенсированном разрушении/формировании связей движущихся макромолекул с поверхностью энергетические затраты диффузии сведены к минимуму и движение макромолекул характеризуется низким барьером активации.

Мы видим, что необходимыми условиями для реализации двумерной диффузии полиэлектролитов являются (1) свободное (незанятое полимером) пространство и (2) наличие нескомпенсированного заряда в адсорбированных макромолекулах. Первое условие было обсуждено выше. Важность выполнения второго была продемонстрирована в ходе следующего эксперимента. Мы воспроизвели условия кинетического опыта с одним изменением: после завершения адсорбции Ф-КС на поверхности БСМ к суспензии комплекса был добавлен раствор полиакриловой кислоты (ПАК). (Перед этим - в отдельном эксперименте с использованием флуоресцентно меченой ПАК - было показано, что ПАК не адсорбируется на поверхности анионных БСМ, но эффективно связывается с БСМ, поверхность которых предварительно покрыта слоем адсорбированного катионного сополимера, например, КСпред) Понятно, что ПАК могла связываться с БСМ/Ф-КС только за счет образования солевых связей с катионными петлями и хвостами адсорбированного Ф-КС. Но это должно было приводить к исчезновению необходимого условия диффузии Ф-КС! И, действительно, мы наблюдали полное блокирование миграции комплекса Ф-КС/ПАК на пустые микросферы.

Таким образом, катионный сополимер способен перемещаться на свободное место на поверхности соседней анионной микросферы, но неспособен покидать поверхность и переходить в раствор даже в присутствии больших избытков линейного полианиона. В первом случае перемещение сополимера между микросферами не приводит к потере конформационного набора адсорбированных макромолекул (конформационной энтропии системы), но сопровождается повышением конфигурационной энтропии системы за счет увеличения числа возможных вариантов размещения макромолекул по поверхности микросфер. Во втором случае переход сополимера в раствор за счет формирования интерполиэлектролитного комплекса (ИПЭК) с полианионом (если бы такое имело место) должен был бы привести к значительному обеднению конформационного набора молекул ПАК и, как следствие, к заметному уменьшению энтропии системы. Минимальные энтропийные потери достигаются в том случае, если только часть молекул полианиона электростатически связывается с адсорбированным катионным сополимером, формируя тройной комплекс полианион-поликатион-анионная поверхность. Другая часть анионных макромолекул остается в растворе, сохраняя высокий уровень энтропии в системе. Именно по этому пути развивается взаимодействие в тройной системе с участием линейного полианиона: ПАК+КС+БСМ.

Что произойдет, если мы будем увеличивать длину молекулы полианиона и в пределе возьмем супермолекулу, достаточно жесткую, один конец которой закрепим на поверхности сорбента, а другой оставим в растворе? Очевидно, такой жесткий анионный стержень будет выполнять ту же функцию, что и поверхность соседней микросферы в экспериментах по миграции поликатиона между анионными БСМ: поликатион будет перемещаться вдоль стержня, удаляясь от поверхности сорбента. Некоторую иллюстрацию к описанному мысленному эксперименту можно получить, используя в качестве супермолекулы частицы слабосшитого гидрогеля из поли-2-акрилоамид-2- метил-1-пропансульфокислоты (ПАМПС), сшитого N,N-метиленбисакриламидом, в котором 1 поперечная сшивка приходится на 100 звеньев ПАМПС1.

Мы добавили частицы гидрогеля к суспензии БСМ с адсорбированным Ф-КС; параллельно был проведен эксперимент, в котором гидрогель был помещен на поверхность стеклянной пластинки с адсорбированным Ф-КС. Изображения двух систем сразу после смешивания приведены на рис. 9а и 9б, причем на каждом из них приведены две пары изображений: слева флуоресценция, справа видимый свет. Спустя 5 минут в обоих случаях наблюдалось окрашивание частиц гидрогеля в зеленый цвет (рис. 10а и 10б), что свидетельствовало о переходе части молекул Ф-КС с поверхности микросфер и стекла внутрь частиц гидрогеля. Процесс перераспределения Ф-КС между частицами происходил за более короткое время по сравнению с перераспределением полимера между частицами БСМ. По-видимому, причина этого заключалась в существенно большей плотности заряда геля ПАМПС по сравнению с плотностью заряда БСМ.

Рис. 9. Микрофотографии смеси БСМ/Ф-КС+гидрогель (а) (слева изображение флуоресценции, справа изображение в видимом свете) и стеклянной пластинки с нанесенным Ф-КС в контакте с гидрогелем (б) (слева изображение флуоресценции, справа изображение в видимом свете) сразу после смешения.
Рис. 10. Микрофотографии смеси БСМ/Ф-КС+гидрогель (а) (слева изображение флуоресценции, справа изображение в видимом свете) и стеклянной пластинки с нанесенным Ф-КС в контакте с гидрогелем (б) (слева изображение флуоресценции, справа изображение в видимом свете) через 5 минут.

4. Полиэлектролитные мультислои с иммобилизованным -химотрипсином.

Полиэлектролитные мультислои на поверхности микросфер получали последовательной адсорбцией катионного и анионного полимеров. Адсорбция максимально возможного количества поликатиона создавала на поверхности микросфер избыточный положительный заряд, который мог быть использован для последующей адсорбции полианиона. После завершения каждой стадии адсорбции микросферы с адсорбированными полиэлекролитами отделяли от водного раствора многократным центрифугированием, включающим промывание осадка дистиллированной водой. Это обеспечивало удаление избыточных полиэлектролитов и формирование полимерного мультислоя на поверхности микрочастиц.

Для формирования полимерных мультислоев использовали два типа микросфер: описанные выше анионные БСМ и катионные БСМ, полученные из анионных путем аминирования их поверхности 3-аминопропилтриэтоксисиланом в абсолютном толуоле:

.

Среднее количество аминопропильных групп на поверхности каждой микросферы составило 2,2108 или 3 амино-группы на 1 нм2 поверхности БСМ.

В этом разделе - для удобства описания состава комплексов микросфер с нанесенными моно- и мультислоями - мы будем пользоваться следующими обозначениями:

БСМ(-)	анионные БСМ
БСМ(+)	катионные БСМ
БСМ(-)//КСпред, БСМ(-)//КСпред//ПАК, БСМ(-)//КСпред//ПАК//КСпред и т.д.	моно- и мультислойные ИПЭК предельного состава на поверхности анионных микросфер
БСМ(+)//ПССК*, БСМ(+)//ПССК//КСпред, БСМ(+)//ПССК//КСпред//ПАК и т.д.	моно- и мультислойные ИПЭК предельного состава на поверхности катионных микросфер

*) Полистиролсульфокислота

Количество связанного с микросферами полиэлектролита определяли, отделяя микросферы с адсорбированным полимером (или полимерами) и измеряя оптическую плотность раствора при λ=257 и 230 нм (для КСпред и ПССК, соответственно) или интенсивность флуоресценции λфлуор= 515 нм (λвозб = 493 нм) (для флуоресцентно меченой ПАК). Полученные результаты позволили рассчитать предельное количество катионных и анионных групп, которые приносит на поверхность микросферы адсорбированный полимер: 5,5108 для КСпред и 3,7108 для ПССК. Увеличение числа полимерных слоев практически не сказывалось на количестве вновь адсорбируемых полимеров. Иными словами, соотношение поликатион/полианион в межфазном комплексе не менялось в ростом толщины мультислойного покрытия. Составы полученных комплексов микросфера-полиэлектролит приведены в таблице 2 (колонка 2).

Таблица 2. Состав и свойства полимерных слоев с иммобилизованным ХТ

№ п/п	Состав	Заряд	Количество адсорбированных глобул ХТ*	Активность адсорбированного ХТ (%)**
1	2	3	4	5
1	БСМ(-)	отрицат.	9,3104	5
2	БСМ(+)//ПССК	отрицат.	9,8104	18
3	БСМ(+)//ПССК//КСпред//ПАК	отрицат.	9,5104	42
4	БСМ(+)//ПССК//(КСпред//ПАК)2	отрицат.	9,6104	44
5	БСМ(+)	положит.	4,6104	1
6	БСМ(-)//КСпред	положит.	5,2104	30
7	БСМ(-)//КСпред//ПАК//КСпред	положит.	5,4104	16
8	БСМ(-)//КСпред//(ПАК//КСпред)2	положит.	5,5104	15

*) В расчете на одну микросферу;

**) По отношению к активности ХТ в буфере с рН 5,5 (1-4) и 9,2 (5-8).

Микросферы с моно- и мультиполимерными покрытиями были использованы для электростатической иммобилизации протеолитического фермента (ХТ) с pI=8,6-8,8. Мы ожидали, что активность фермента будет сохраняться в большей степени при его иммобилизации на мягкой поверхности - полимерном (мульти)слое. Для повышения эффективности связывания фермента его адсорбцию проводили в условиях, когда заряды поверхности и глобулы были противоположны по знаку: использовали водный раствор с рН 9,2 для связывания ХТ с анионными БСМ и раствор с рН 5,5 для его связывания с катионными БСМ. Знак заряда поверхности указан в таблице 2 (колонка 3).

Количество связанного с микросферами ХТ определяли, отделяя микросферы с адсорбированным ферментом и измеряя интенсивность флуоресценции супернатанта при λфлуор= 345 нм (λвозб = 280 нм). Каталитическую активность адсорбированного фермента оценивали по скорости гидролиза субстрата, Glp-Phe-pNA. Результаты адсорбционных и каталитических экспериментов для всех исследованных систем сведены в таблицу 2 (колонки 4 и 5).

Каталитическая активность фермента, иммобилизованного на поверхности исходных анионных и катионных микросфер (образцы 1 и 5 в таблице 2), была на порядки ниже его активности в растворе (последнюю принимали за 100%), но прогрессивно увеличивалась по мере возрастания числа полиэлектролитных слоев на поверхности микросфер. Иммобилизация ХТ на один слой полианиона повышала его активность до 18% (образец 2), иммобилизация на три слоя (полианион/поликатион/полианион) сохраняла 42% ферментативной активности (образец 3). Дальнейшее увеличение количества полимерных слоев (толщины полиэлектролитной прослойки) не оказывало заметного влияния на активность ХТ (44% активности, образец 4). Таким образом, трехслойное полиэлектролитное покрытие с анионным полимером на внешнем слое обеспечивало эффективную иммобилизацию фермента и высокий уровень его каталитической активности.

5. Тройные комплексы белок-катионный сополимер-вирус табачной мозаики.

Описанный выше подход - электростатическая адсорбция полиэлектролитов и белков на поверхности анионных микросфер - был использован для модификации коллоидных частиц биологического происхождения. В этом разделе мы описываем получение и свойства тройного комплекса, полученного последовательной адсорбцией катионного сополимера (КСпред) и затем белка на поверхности частиц вируса табачной мозаики (ВТМ). Растительные вирусы безопасны для человека и в то же время высоко иммуногенны, что позволяет использовать их в качестве носителей для иммобилизации различных по химической природе биологически активных веществ - полипептидных антигенов, лекарственных препаратов, ферментов - и разрабатывать новые биотехнологии для медицины и ветеринарии.

В качестве сорбентов для иммобилизации полимера и белка использовали нативный палочкообразный ВТМ (рис. 11а) и сферический термически модифицированный ВТМ2 (тер-ВТМ, рис. 11б); последний был получен кратковременным нагреванием раствора ВТМ до 94-98С.

Рис. 11. Микрофотографии нативного ВТМ (а) и тер-ВТМ (б). Просвечивающая электронная микроскопия, контрастирование 2% уранил ацетатом (а), сканирующая электронная микроскопия (б).

В растворах с рН, близким к нейтральному, частицы вируса заряжены отрицательно; поэтому катионный сополимер эффективно адсорбировался на поверхности частиц. Данные микроэлектрофореза смеси ВТМ+поликатион показали, что адсорбция поликатиона приводила к перезарядке поверхности вирусных частиц (рис. 12а). Это позволяло адсорбировать на межфазном монослое поликатиона отрицательно заряженные синтетические полипептиды или нативные белки. Максимальное количество связанного с ВТМ поликатиона было определено методом спектрофотометрии после отделения комплекса ВТМ/поликатион и измерения оптической плотности супернатанта (рис. 12б).

[КСпред]своб104, моль/л [КСпред]104, моль/л

Рис. 12. а)Зависимость электрофоретической подвижности (ЭФП) частиц ВТМ от концентрации КСпред и б) зависимость концентрации не связанного с микросферами КСпред от его общей концентрации в суспензии. Концентрация ВТМ 1 мг/мл;

10-2М ТРИС-HCl буфер, pH 7.5.

За формированием тройного комплекса ВТМ/КС1/белок следили с помощью метода флуоресценции; использовали БСА, ковалентно меченый ФИТЦ, который добавляли к комплексу ВТМ/ КСпред с максимальным содержанием поликатиона. Оказалось, что белок не регистрировался в супернатанте вплоть до [БСА]макс = 210-6М, которая соответствовала предельному заполнению поверхности бинарного комплекса белковыми глобулами. Для тер-ВТМ предельное заполнение поверхности достигалось при [БСА]макс = 1,510-5М.

Принцип последовательной адсорбции, лежащий в основе получения тройной системы вирион-поликатион-белок, был затем использован для электростатической иммобилизации на поверхности вириона рекомбинантного гидрофильного фрагмента гемаглютинина вируса гриппа (Flu1-3). Иммуногенная активность полученного тройного комплекса ВТМ/КС1/Flu1-3, оказалась значительно выше активности изолированного (не связанного с вирионом) фрагмента вируса гриппа Flu 1-33

.

ВЫВОДЫ

1. Впервые модификацией поли-4-винилпиридина бромистым этилом и бромуксусной кислотой синтезированы две серии катионных сополимеров: 1) с катионными и гидрофобными звеньями и 2) с катионными и гидрофильными электронейтральными (цвиттер-ионными) звеньями, и исследована их адсорбция на поверхности анионных боросиликатных микросфер (БСМ).
2. Показано, что устойчивость комплексов катионных сополимеров с БСМ в водно-солевых средах критическим образом зависит от содержания (мольной доли) катионных звеньев в макромолекуле (). Сополимеры с гидрофобными звеньями необратимо связываются с микросферами при > 0,24, c гидрофильными - при > 0,15.
3. Впервые продемонстрирована способность адсорбированных молекул поликатионов перемещаться между БСМ, сделана оценка эффективного коэффициента латеральной диффузии макромолекул DПК = 1,410-12 см2/с (при 20 С). Показано, что коэффициент диффузии возрастает при увеличении температуры и/или концентрации соли в окружающем растворе.
4. Путем чередующейся адсорбции поликатиона и полианиона получены полимерные мультислои на поверхности БСМ. Гидролитический фермент (-химотрипсин), иммобилизованный на полимерном мультислое, сохраняет около 50% своей каталитической активности.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. А.С. Малинин, И.В. Калашникова, А.А. Рахнянская, А.А. Ярославов. Адсорбция катионных полимеров на поверхности анионных стеклянных микросфер. // Высокомолек. соед. Сер.А. 2012. Т. 54. № 1. С. 208-214.
2. Н.А. Никитин, А.С. Малинин, А.А. Рахнянская, Е.А. Трифонова, О.В. Карпова, А.А. Ярославов, И.Г. Атабеков. Использование поликатионого спейсера для нековалентной иммобилизации альбумина на термически модифицированных вирусных частицах. // Высокомолек. соед. Сер.А. 2011. Т. 53. № 11. С. 1885-1891.
3. А.А. Ярославов, И.Б. Каплан, Т.Н. Ерохина, С.Ю. Морозов, А.Г. Соловьев, А.Д. Лещинер, А.А. Рахнянская, А.С. Малинин, Л.А. Степанова, О.И. Киселев, И.Г. Атабеков. Новый способ получения биологически активных нанокомплексов путем нековалентной конъюгации белков с вирусными частицами. // Биоорганическая химия. 2011. Т. 37. № 4. С. 441-447.
4. А.С. Малинин, А.А. Рахнянская, А.В. Бачева, А.А. Ярославов. Активность фермента, иммобилизованного на полиэлектролитных мультислоях. // Высокомолек. соед.  Сер.А. 2011. Т. 53. № 1. С. 54-59.
5. И.Г. Атабеков, И.Б. Каплан, С.Ю. Морозов, А.Г. Соловьёв, Т.Н. Ерохина, О.В. Карпова, А.А. Ярославов, А.А. Рахнянская, А.С. Малинин. Биологически активный комплекс, обладающий протективной активностью против вируса гриппа. Патент РФ № 2427385. 29.12.2009.
6. И.Г. Атабеков, И.Б. Каплан, С.Ю. Морозов, А.Г. Соловьёв, О.В. Карпова, А.А. Ярославов, А.А. Рахнянская, А.С. Малинин. Способ получения биологически активного комплекса. Патент РФ № 2427386. 29.12.2009.
7. A.S. Malinin, A.A. Rakhnyanskaya, A.A. Yaroslavov. Diffusion of polyelectrolytes adsorbed on glass microspheres // Book of Abstracts of 7th International Symposium УMolecular Mobility and Order in Polymer SystemsФ, 2011, Saint-Petersburg, Russia, p. O-16.
8. Н.А. Никитин, Е.А. Трифонова, А.С. Малинин, А.А. Рахнянская, О.В. Карпова, А.А. Ярославов, И.Г. Атабеков. Создание функционально активных комплексов на основе нового типа сферических наночастиц. // Сб. тезисов докладов Третьей Международной конференции УОт наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий к наноиндустрииФ, 2011, Ижевск, с. 109-110.
9. T.N. Erokhina, A.A. Yaroslavov, I.B. Kaplan, S.Yu. Morozov, A.G. Solovyev, J.G. Atabekov, A.A. Rakhnyanskaya, A.S. Malinin. A method to produce biologically active nanocomplexes by non-covalent conjugation of proteins with viral particles // Book of Abstracts of 2nd Russian - Hellenic Symposium УBiomaterials and bionanomaterials: Recent Advances and Safety - Toxicology issuesФ, 2011, Heraklion, Greece, c. 44.
10. А.С. Малинин, А.А. Рахнянская, А.А. Ярославов. Активность фермента, иммобилизованного на полиэлектролитных мультислоях // Сб. тезисов докладов Пятой Всероссийской Каргинской конференции УПолимеры - 2010Ф, 2010, Москва, с. 145.
11. А.С. Малинин, А.А. Рахнянская, А.А. Ярославов. Наноструктурированные полимерные слои на твёрдой поверхности. // Сб. тезисов докладов Второго международного конкурса научных работ молодых учёных в области нанотехнологий в рамках Международного форума по нанотехнологиям, 2009, Москва, секция УУглеродные волокна. Армидные волокна. Композиционные полимерыФ, с. 360-361.
12. А.С. Малинин, А.А. Рахнянская, А.А. Ярославов. Влияние степени полимеризации адсорбированных полиэлектролитов на их подвижность. // Сб. тезисов докладов Юбилейной научной конференции, посвящённая 80-летию Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, 2009, Москва, с. 89.
13. И.В. Калашникова, А.С. Малинин. Устойчивость последовательно адсорбированных полиэлектролитов // Сб. тезисов докладов XVI Конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009", 2009, Москва, секция "Химия ", подсекция УВысокомолекулярные соединенияФ, с. 52.
14. A.S. Malinin, A.A. Rakhnyanskaya, A.A. Yaroslavov. Multilayer adsorption of polyelectrolytes on the surface of the glass microspheres. // Book of Abstracts of 7th International Symposium on Polyelectrolytes, 2008, Coimbra, Portugal, с. 99.
15. А.С. Малинин, А.А. Рахнянская, А.А. Ярославов. Мультислойная адсорбция полиэлектролитов и устойчивость полимерных слоёв. // Сб. тезисов XV Конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2008", 2008, Москва, секция "Химия ". Подсекция УВысокомолекулярные соединенияФ, с. 159.

---

1) Предоставлен к.х.н. В.Б.Рогачевой (химический факультет МГУ имени М.И. Ломоносова)

2) Предоставлен д.б.н. О.В.Карповой (биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова).

3) Эксперименты по определению иммуногенной активности выполнены Т.Н.Ерохиной (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН).

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по химии