Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

БАЙМИЕВ АНДРЕЙ ХАНИФОВИЧ

КЛУБЕНЬКОВЫЕ  БАКТЕРИИ  ДИКОРАСТУЩИХ  БОБОВЫХ

РАСТЕНИЙ  ЮЖНОГО  УРАЛА  И  МОЛЕКУЛЯРНОЕ

КОНСТРУИРОВАНИЕ  ИХ  ИСКУССТВЕННЫХ  АССОЦИАЦИЙ

С  НЕБОБОВЫМИ  РАСТЕНИЯМИ

03.01.03 - молекулярная биология

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Уфа Ц 2012

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.

Научный консультант	доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович
Официальные оппоненты	доктор биологических наук, профессор Шакирова Фарида Миннихановна
	доктор биологических наук, профессор Антонюк Людмила Петровна
	доктор биологических наук, профессор Алимова Фарида Кашифовна
Ведущая организация	Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

Защита состоится ___ марта 2012 г. в ___ часов

на заседании Объединенного Диссертационного совета Д 002.133.01 при Учреждении Российской Академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу:

450054, г. Уфа, пр. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71),

С авторефератом - на сайте ВАК РФ и

на сайте ИБГ УНЦ РАН  ibg.anrb.ru/dissov.html

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан У____Ф февраля  2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета                                Бикбулатова С.М.

             

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клубеньковые бактерии (ризобии) - обширная, генетически разнородная группа почвенных грамотрицательных микроорганизмов, способных вступать во внутриклеточный симбиоз с бобовыми растениями и обеспечивать фиксацию атмосферного азота.

Интерес к этим бактериям со стороны исследователей связан, с одной стороны, сельскохозяйственной значимостью симбиотической азотфиксации и необходимостью разработки генетических методов селекции и конструирования хозяйственно-ценных штаммов ризобий, инокуляция которыми позволяет получать высокие урожаи бобовых культур без использования дорогостоящих и экологически небезопасных азотных удобрений (Симаров, 1990), а с другой - использованием ризобий как модельного объекта для изучения биологии взаимодействия микроорганизмов с высшими растениями, генетического контроля и эволюции симбиотических систем (Онищук, 1995).

Одной из актуальных задач современной биотехнологии является исследование генетических ресурсов клубеньковых бактерий, особенно естественных природных популяций, где наиболее эффективным подходом для этих исследований является анализ их генетического разнообразия, результатом которого может быть понимание процессов возникновения новых генотипов за счет мутаций, рекомбинаций, горизонтального переноса генов. В настоящее время для характеристики ризобий широко используются различные молекулярно-генетические методы. Преимущество этих методов состоит в том, что они позволяют получать стабильные характеристики, независящие от физиологического статуса микроорганизма.

Значение таких исследований велико, поскольку они могут позволить выявить наиболее удачные комбинации геномов ризобий, которые могут быть использованы в качестве основы для направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для практики.

Рациональное использование свойств аборигенных популяций ризобий, в перспективе, несомненно, является важным элементом биологизации земледелия и создания адаптивно-интенсивной стратегии растениеводства не только бобовых культур, но за счет использования ассоциативного симбиоза и других сельскохозяйственно значимых растений.

Создание искусственных азотфиксирующих ассоциаций культурных растений с эндофитными микроорганизмами, которые выделены из природных симбиозов, является относительно новым направлением в биоинженерии симбиотических систем. Клубеньковые бактерии могут также выступать и в качестве ассоциативных микросимбионтов для многих экономически ценных небобовых культур, таких как рис, кукуруза, пшеница, рапс, подсолнечник и т. д. Эти бактерии способны колонизировать корневую систему и повышать урожайность растений, выделяя ростостимулирующие вещества и защищая от фитопатогенов. Как показали исследования последних лет, ризобии принимают активное участие в усвоении растениями труднорастворимых соединений фосфора и даже, проникая в надземную часть растения, могут усиливать процесс фотосинтеза (Chi et al., 2005; Черемных и др., 2007; Perrine-Walker et al., 2007) . Поэтому получение искусственных симбиотических ассоциаций этих бактерий с различными видами растений является одним из наиболее перспективных направлений на пути создания экологически ориентированного сельского хозяйства. Вместе с тем, следует отметить, что эти процессы неконтролируемы, и в естественных условиях ризосферные бактерии с полезными признаками, к сожалению, не выдерживают конкуренции и вытесняются более агрессивными бактериями, зачастую обладающими фитопатогенными свойствами. Задача исследователей состоит в том, чтобы придать растениям способность контролировать микрофлору своей ризосферы.

Цель работы заключалась в исследовании генетического разнообразия и филогении клубеньковых бактерий дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала и разработке подходов для использования биологического потенциала данных бактерий при культивировании небобовых хозяйственно-ценных растений.

Задачи исследования:

1. Собрать коллекцию штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала, проанализировать их генетическое разнообразие и определить филогенетическое положение.
2. С целью выявления возможности влияния горизонтального переноса генов на видовое разнообразие микросимбионтов исследованных растений провести филогенетический анализ симбиотических и 16S рибосомных генов.
3. Создать плазмидные конструкции для мечения клубеньковых бактерий флуоресцентными белками и получить маркированные штаммы для их детекции in vivo и in vitro.
4. Провести анализ полиморфизма генов лектинов представителей рода Lathyrus, вступающих в симбиоз с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae.
5. Оценить специфичность взаимодействия лектинов из семян гороха посевного и козлятника восточного с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae и Rhizobium galegae.
6. Исследовать возможность адгезии клеток ризобий Rhizobium leguminosarum bv. viciae на контрольных и трансгенных по гену лектина psl бородатых корнях растений рапса и табака.
7. На модельных растениях трансгенного табака и композитных растений томата и рапса изучить возможность специфичной колонизации их  ризосферы целевым видом клубеньковых бактерий в условиях конкуренции с почвенной микрофлорой.

Научная новизна. Изолировано более 1200 штаммов ризобий из клубеньков 36-ти видов дикорастущих бобовых растений, относящихся к 12-ти родам. Исследовано их генетическое разнообразие и на основе сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК определено их филогенетическое положение.

Выявлено, что для штаммов ризобий, выделенных из клубеньков дикорастущих видов растений трибы Vicieae, которые по последовательности генов 16S рРНК за небольшим исключением относятся к виду Rhizobium leguminosarum, характерна высокая степень гетерогенности, обусловленная различиями в их плазмидном составе, вызванная, предположительно, высокой трансмиссивностью мобильной части их генома. С помощью кластерного анализа RAPD-фингерпринтов данных штаммов обнаружено, что внутри популяции клубеньковых бактерий существует разделение на субпопуляции, рекомбинационные процессы между которыми имеют определенные ограничения.

Несмотря на то, что почти все исследованные штаммы, вступающие в симбиоз с растениями трибы Vicieae, относились к Rhizobium leguminosarum, у некоторых видов растений рода Lathyrus в клубеньках были обнаружены бактерии, не являющиеся типичными симбионтами для этих растений. Так, в клубеньках у L.аvernus и L.аsylvestris идентифицированы ризобии, близкие к R.аtropici, у L.аpalustris - бактерии, близкие к Agrobacterium sp., а у L.аgmelinii - к Phyllobacterium sp. Выявлено, что симбиотические гены данных артефактных бактерий имеют филогенетическое родство с аналогичными генами, ранее описанными у бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae, что, скорее всего, и является причиной изменения их специфичности.

Показано, что основными симбионтами дикорастущих видов бобовых растений подтрибы Astragalinae трибы Galegeae в условиях Южного Урала являются бактерии рода Mesorhizobium, хотя некоторые виды растений данной подтрибы в зависимости от почвенно-климатических условий способны вступать в симбиоз и с представителями других родов ризобий, таких как Rhizobium, Bradyrhizobium, Ensifer. Для растений трибы Genisteae характерно преобладание в клубеньках бактерий рода Bradyrhizobium, для растений трибы Hedysareae - Mesorhizobium. Все полученные из клубеньков растений Coronilla varia (триба Loteae) штаммы бактерий по последовательности генов 16S рРНК оказались близки к бактериям Rhizobium leguminosarum.

У штамма ризобии, изолированного из клубенька H. razoumowianum, близкого по последовательности гена 16S рРНК к Bradyrhizobium, обнаружен ген nifH, имеющий заметно большую гомологию с аналогичными генами, описанными у Mesorhizobium, что может служить аргументом в пользу горизонтального переноса генов.

Создана серия векторов экспрессии, содержащих гены флуоресцентных белков TurboGFP и TurboRFP под контролем конститутивного промотора фага Т5, предназначенных для прижизненного окрашивания клубеньковых бактерий. Векторы на основе репликона широкого круга хозяев pBBRI предназначены для мечения штаммов с экспрессией маркерного гена с трансформируемой плазмиды, а векторы на основе плазмиды pRL765gfp созданы для маркирования штаммов путем введения генов флуоресцентных белков в состав хромосомы бактерий.

Показано, что для переноса конструкций в клетки клубеньковых бактерий наиболее предпочтителен метод трансформации, поскольку при наличии mob-участка в векторах, необходимых для конъюгативного переноса, возможна случайная мобилизация плазмиды и ее переход из клеток маркированных штаммов в другие почвенные бактерии.

У растений L.аvernus, L.аpalustris и L.аgmelinii обнаружено несколько изоформ лектинов, что может быть причиной выявленной в работе пластичности при выборе микросимбионтов данными видами растений.

Показана специфичность агглютинации лектинами из семян гороха посевного (Pisum sativum) (PSL) ризобий R.аleguminosarum bv. viciae, и лектинами из семян козлятника восточного (Galega orientalis) (GOL) - R.аgalegae.

Продемонстрировано, что используя гены лектинов бобовых растений в качестве трансгенов, можно создавать искусственные ассоциации клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями. На трансгенных по гену лектина PSL гороха растениях табака показана избирательность колонизации их ризосферы бактериями R.аleguminosarum bv. viciae в условиях конкуренции с естественной микрофлорой почвы.

Практическая значимость работы. Собрана и генетически охарактеризована коллекция штаммов клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими бобовыми растениями Южного Урала. Сведения о генетическом разнообразии и филогении клубеньковых бактерий, полученные в ходе исследований, могут быть использованы как для селекции высокоэффективных и приспособленных к почвенно-климатическим условиям Южного Урала штаммов клубеньковых бактерий, так и для создания штаммов ризобий с полезными для сельского хозяйства признаками. В связи с тесным взаимодействием бобовых растений со своими микросимбионтами, зачастую определяющих их экологическую нишу и нередко ареал распространения, новые знания о молекулярно-генетических особенностях и биоразнообразии клубеньковых бактерий таких краснокнижных видов бобовых как L.аlitvinovii, A.аcornutus, A.аhelmii, H.аgrandiflorum, H.аrazoumowianum, O.аhippolyti сделают возможным успешное интродуцирование этих растений из неблагоприятных мест в другие районы, и тем самым обеспечат их сохранение.

Серия векторов экспрессии, содержащих гены флуоресцентных белков TurboGFP и TurboRFP под контролем конститутивного промотора фага Т5, созданных для прижизненного окрашивания клубеньковых бактерий, может быть использована для научных экспериментов в области изучения бобово-ризобиальных симбиозов.

Разработанный экспериментальный подход к конструированию лискусственной ризосферы несимбиотрофных растений, избирательно колонизируемой клубеньковыми бактериями (выполняющими полезные для растений трофические, ростостимулирующие и/или защитные функции), путем введения в их геном в качестве трансгена гена лектина бобового растения, с которым данные ризобии вступают в симбиоз, может быть использован для создания стабильных и эффективных ассоциаций хозяйственно-полезных растений с ростостимулирующими азотфиксирующими микроорганизмами, которые могут найти самое широкое коммерческое применение в сельскохозяйственном производстве.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Клубеньковые бактерии дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала представлены всеми основными родами ризобий: Rhizobium, Mesorhizobium, Ensiferа(Sinorhizobium), Bradyrhizobium.
2. Основными симбионтами дикорастущих видов бобовых растений подтрибы Astragalinae трибы Galegeae и трибы Hedysareae в почвенно-климатических условиях Южного Урала являются бактерии рода Mesorhizobium.
3. Для растений трибы Genisteae характерно преобладание в клубеньках бактерий рода Bradyrhizobium.
4. Для клубеньковых бактерий дикорастущих видов растений трибы Vicieae, относящихся к виду Rhizobium leguminosarum, характерна  высокая степень гетерогенности, обусловленная различиями в их плазмидном составе.
5. Используя гены лектинов бобовых растений в качестве трансгенов, можно создавать искусственные ассоциации клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье (№ 10-04-97018_а) и грантами Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ России (НШ-1003.2006.4 и НШ-649.2008.4), ГК N02.740.11.0290 ФЦП Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013гг.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной школе-конференции молодых ученых  Биотехнология будущего (Санкт-Петербург, 2006); Международной конференции Генетика в России и мире, посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2006); III Межрегиональной конференции молодых ученых Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов, 2006); Международной школе-конференции Генетика микроорганизмов и биотехнология (Москва, 2006); Всероссийской конференции с международным участием Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем (Саратов, 2007); V Всероссийской конференции молодых учёных Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов, 2010); 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых учёных Биология - наука XXI века (Пущино, 2010); Всероссийском симпозиуме Растение и стресс (Plants under Environmental Stress) (Москва, 2010); VI Съезде Общества физиологов растений России Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий (Нижний Новгород, 2011); Международной конференции Микробиология в решении современных проблем сельскохозяйственной микробиологии (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 34 печатных работах, в том числе, 16 статей опубликованы в журналах из Перечня ВАК, из них 13 из международной базы цитирования, в 1-й монографии, а также депонированы в международных банках данных DDBJ/EMBL/GenBank.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 302 страницах, содержит 35 рисунков и 6 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 580 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектами исследования в данной работе служили клубеньковые бактерии, выделенные из клубеньков дикорастущих бобовых растений Южного Урала: горошка заборного (Vicia sepium L.), Г.атонколистного (V.аtenuifolia Roth), Г.алесного (V.аsylvatica L.), Г.агороховидного (V.аpisiformis L.), Г.амышиного (V.аcracca L.), Г.аволосистого (V.аhirsuta (L.) Gray), чины весенней (LathyrusаvernusаL. Bernh.), Ч.аГмелина (L.аgmelinii Fritsch), Ч.аклубненосной (L.аtuberosus L.), Ч.алуговой (L.аpratensis L.), Ч.аЛитвинова (L.аlitvinovii Iljin), Ч.алесной (L.аsylvestris L.), Ч.агороховидной (Lаpisiformis L.), Ч.аболотной (L.аpalustris L.), Ч.абледноватой (L.аpallescens (Bieb.) С. Koch), караганы древовидной (Caragana arborescens Lam.), К.акустарниковой (C.аfrutex (L.) C.Koch), лядвенца украинского (Lotus ucrainicus Klokov), вязеля разноцветного (Coronilla varia L.), дрока красильного (Genista tinctoria L.), ракитника русского (Chamaecytisus ruthenicus (Fisch. ex Vorosch.) Klask.), астрагала датского (Astragalus danicus Retz.), А.адлинноножкового (A.аmacropus Bunge), А.арогоплодного (A.аcornutus Pall.), А.аволжского (A.аwolgensis Bunge), А.аГельма (A.аhelmii Fisch.), А.анутового (A.аcicer L.), остролодочника грязноватого (Oxytropis sordida (Willd.) Pers.), О.аИпполита (O.аhippolyti Boriss.), О.аволосистого (O.аpilosa (L.) DC.), О.аяркоцветного (O.аfloribunda (Pall.) DC), О.аколосистого (O.аspicata (Pall.) O. Fedtsch. & B. Fedtsch.), копеечника крупноцветкового (Hedysarum grandiflorum Pall.), К.аРазумовского (H.аrazoumowianum Fisch. & Helm ex DC.).

В исследованиях по специфичности взаимодействия лектинов с клубеньковыми бактериями использовали штаммы, полученныe из Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (С.-Петербург): CIAM 0702 Rhizobium galegae и CIAM 1078 R.аleguminosarum bv. viciae, вступающие в эффективный симбиоз с козлятником восточным (Galega orientalis) и горохом посевным (Pisum sativum), соответственно.

В работе использованы следующие методы. Выделение высокомолекулярной растительной и бактериальной ДНК проводили по Грэхэму (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК, анализ рекомбинантных клонов, клонирование амплифицированной ДНК в плазмидных векторах, расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами, подготовку компетентных клеток и их трансформацию плазмидной ДНК, электрофорез фрагментов ДНК и их элюцию из легкоплавкой агарозы проводили по прописям, изложенным в лабораторном руководстве Сэмбрука с соавт. (Sambrook et al., 1989). ДНК мегаплазмид ризобий выделяли методом Экхардта с некоторыми модификациями (Eckhardt, 1978). ПЦР проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК. RAPD-анализ проводили в амплификаторе T1 Thermocycler фирмы Biometra (Германия) в течение 25 - 30 циклов при температурах отжига от 32С до 48С для разных праймеров. Кластерный анализ RAPD-профилей проводили с помощью копьютерной программы GelComparII (Applied Maths) с использованием метода невзвешенного попарного среднего - Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Averages (UPGMA). Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы УApplied BiosystemsФ (США), используя наборы для секвенирования Big Dye Terminator v.3.0. Анализ нуклеотидных последовательностей генов и выведенных на их основе аминокислотных последовательностей белков проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы УУDNASTAR, Inc.ФФ (США). Трансгенные растения табака получали методом агробактериальной трансформации листовых пластинок (Horsh, Fry, 1985). Визуализацию взаимодействий клубеньковых бактерий с корневыми волосками трансгенных растений осуществляли при помощи универсального флуоресцентного микроскопа модели Axio Imager.M1 (Carl Zeiss, Германия) и Biozero (Keyence, Япония). Процентное содержание клеток клубеньковых бактерий, содержащих маркирующе белки, определяли на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 (УBeckman CoulterФ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий бобовых трибы Vicieae. Триба Виковых (Vicieae (Adans.) Bronn) (Fabaceae) объединяет рода Lathyrus L. (чина), PisumаL. (горох), ViciaаL. (горошек) и Lens Mill. (чечевица). В умеренных широтах к данной трибе относятся большинство хозяйственно-значимых видов бобовых растений. К дикорастущим видам на Южном Урале в основном относятся представители двух родов: Vicia L. - горошек, или вика и Lathyrus L. - чина. Считается, что представители данной трибы образуют группу перекрестной инокуляции и вступают в симбиоз с различными штаммами вида Rhizobium leguminosarum bv. viciae.

Нами были проанализированы клубеньковые бактерии из клубеньков 6 видов растений рода Vicia и 9 видов растений рода Lathyrus (табл. 1).

Анализ гетерогенности собранных штаммов методом RAPD выявил, что клубеньковые бактерии всех взятых в анализ растений отличаются высокой степенью полиморфности ДНК. В наших исследованиях наиболее гетерогенными оказались микросимбионты L.аtuberosus, где индекс разнообразия Шеннона составил 0,84. Менее разнородными оказались микросимбионты L. litvinovii  и L. palustris, где данные индексы были равными 0,39 и 0,36 соответственно (табл. 1).

Предварительные исследования филогении исследуемых клубеньковых бактерий методом ПДРФ-анализа гена 16S рРНК выявили, несмотря на высокую гетерогенность штаммов бактерий, достаточно высокую их филогенетическую однородность (табл. 1).

Таблица 1

Состав и генетическая характеристика штаммов клубеньковых бактерий, изолированных из клубеньков дикорастущих бобовых трибы Vicieae

Вид растения- хозяина	Количество выделенных штаммов (А)	Количество гомогенных по RAPD групп  штаммов	Индекс разно-образия Шеннона (Hs)	Кол-во групп штаммов, гомоген-ных по 16S-ПДРФ	Предполагаемый вид бактерий и их %-ное содержание к общему кол-ву выявленных у дан-ного вида растения штаммов
V. tenuifolia	24	16	0,62	1	R.leguminosarum
V. sepium	50	21	0,73	1	R.leguminosarum
V. sylvatica	60	42	0,78	2	R.leguminosarum
V. pisiformis	30	23	0,53	2	R.leguminosarum
V. cracca	57	27	0,65	1	R.leguminosarum
V. hirsuta	25	14	0,55	1	R.leguminosarum
L.аlitvinovii	63	20	0,36	1	R.аleguminosarum
L.аpalustris	42	13	0,39	3	R.аleguminosarum 79%
				1	Agrobacterium sp. 21%
L.аpallescens	77	40	0,51	3	R.аleguminosarum
L.аpisiformis	51	42	0,80	4	R.аleguminosarum
L.аvernus	159	120	0,72	1	R.аtropici 70%
				4	R.аleguminosarum 30%
L.аsylvestris	78	59	0,70	1	R.аtropici 67%
				1	R.аleguminosarum 33%
L.аtuberosus	49	40	0,84	2	R.аleguminosarum
L.аpratensis	19	11	0,63	3	R.аleguminosarum
L.аgmelinii	5	-	-	2	Phyllobacterium sp.

Определение филогенетического положения исследуемых штаммов клубеньковых бактерий по сравнительному анализу их секвенированных фрагментов генов 16S рРНК размером примерно 1400ап.н. с уже известными аналогичными последовательностями из базы данных GenBank и RDP ( показало, что последовательности гена 16S рРНК у большинства исследованных микроорганизмов имеют высокое сходство с последовательностями аналогичных генов Rhizobium leguminosarum (>99,5%).

Наряду с этим у некоторых растений обнаружены микросимбионты филогенетически близкие к другим видам бактерий. У L.аvernusа и L.аsylvestris были обнаружены ризобии, близкие (99,7%) к R.аtropici, у чины болотной в клубеньках обнаружены бактерии, близкие (98,2%) к Agrobacterium albertimagni, а у L.аgmelinii - к Phyllobacterium myrsinacearum (99,9%).

Таким образом, показано, что все взятые в анализ представители трибы Vicieae (кроме L.аgmelinii, у которой были обнаружили в клубеньках только бактерии, близкие к Phyllobacterium myrsinacearum), вступают в симбиоз со штаммами клубеньковых бактерий, хотя и отличающихся высоким полиморфизмом ДНК, но филогенетически родственных R.аleguminosarum (>99,5% сходства по последовательности гена 16S рРНК), что подтверждает вхождение данных растений в одну группу перекрестной инокуляции.

Тем не менее, обнаруженные нами в клубеньках некоторых видов растений рода Lathyrus отличных от R.аleguminosarum видов ризобий говорит о том, что в некоторых отдельных случаях границы данной группы перекрестной инокуляции могут быть расширены. Такие исключительные случаи возникают, скорее всего, в ходе адаптации растений к определенным условиям произрастания.

Несомненно, обращает на себя внимание высокий полиморфизм ДНК штаммов, вступающих в симбиоз с растениями трибы Vicieae. Подобная высокая гетерогенность исследуемых штаммов при филогенетической однородности позволяет предположить, что штаммы имеют различия в подвижной части их генома, в том числе и мегаплазмид.

Действительно, при исследовании плазмидных профилей полученных клубеньковых бактерий обнаружилось, что все полиморфные по ДНК штаммы микросимбионтов внутри филогенетически однородных групп имеют различный состав плазмид. Разброс плазмид по количеству среди штаммов варьировал от 2 до 13 и по размеру приблизительно от 150 до 1000 тпн (рис. 1).

Значительные различия плазмидного состава штаммов филогенетически однородных бактерий говорят о довольно высокой трансмиссивности их плазмид, и, вследствие чего, высокой частоте генетической рекомбинации между ризосферными бактериями, приводящей к появлению большого количества высокополиморфных по ДНК штаммов.

Рис.а1. Плазмидные профили штаммов ризобий, вступающих в симбиз с чиной весенней, относящихся к одной  филогенетически однородной группе. Размер указан в тысячах пар нуклеотидов. Цифрами обозначены номера штаммов.

С помощью кластерного анализа RAPD профилей клубеньковых бактерий растений чины весенней, относящихся к R.аleguminosarum, показано, что в ризосфере одной популяции данного растения клубеньковые бактерии разделены на  отдельные группы, рекомбинационные процессы между которыми, скорее всего, имеют определенные ограничения, что приводит к увеличению их генетических различий, отраженных на дендрограмме в виде образования отдельных кластеров А и Б так же, как и их географическое разделение (кластер В) (рис. 2).

Рис.а2. Дендрограмма, построенная на основе кластерного анализа RAPD профилей клубеньковых бактерий R.аleguminosarum, полученных из клубеньков растений чины весенней.  А и Б - RAPD профили бактерий, собранных из клубеньков растений одной популяции, произрастающей в Татышлинском районе РБ; В - RAPD профили бактерий, собранных из клубеньков растений,  произрастающих в Белорецком районе РБ. Одним цветом показаны бактерии, полученные из клубеньков одного растения.

Исследование влияния горизонтального переноса генов на видовой состав клубеньковых бактерий растений рода Lathyrus. Многочисленные работы показывают, что горизонтальный перенос sym генов является неотъемлемой частью в эволюции симбиотических взаимоотношений ризобий и бобовых растений (Freiberg et al., 1997; Bailly et al., 2007; Estrella et al., 2009; Marchetti et al., 2009). С целью выявления возможного влияния процесса горизонтального переноса sym генов на изменение специфичности микросимбионтов растений рода Lathyrus, относящихся по последовательностям генов 16S рРНК к R.аtropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., была исследована филогения их симбиотических генов nifH, nifD и nodA.

Сравнительный анализ секвенированых фрагментов генов nifH и nodA показал высокую гомологию между последовательностями всех исследуемых штаммов. Поиск сходных последовательностей в базе данных выявил, что секвенированные фрагменты генов nifH всех исследуемых штаммов клубеньковых бактерий имеют высокую гомологию с аналогичными последовательностями бактерий вида R.аleguminosarum bv. viciae, что показывает их филогенетическую близость (рис.а3).

Рис.а3. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основе сравнительного анализа последовательностей генов nifH. Исследуемые штаммы указаны жирным шрифтом.

У штаммов R.аtropici и R.аleguminosarum, нодулирующих растения L.аvernus, были также амплифицированы и секвенированы фрагменты генов nifD. Сравнительный анализ секвенированных фрагментов с аналогичными последовательностями других клубеньковых бактерий, депонированных в GenBank, также показал их высокую гомологию с генами nifD R.аleguminosarum bv. viciae.

Полученные результаты, показывающие филогенетическую близость симбиотических генов исследуемых клубеньковых бактерий с аналогичными генами R.аleguminosarum bv. viciae, свидетельствует в пользу имевшего место горизонтального переноса симбиотических генов R.аleguminosarum bv. viciae в штаммы R.аtropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., что и явилось причиной возможности образования клубеньков данными бактериями на корнях растенй рода Lathyrus.

В работах многих авторов показано, что немаловажную роль в узнавании симбиотических партнеров в азотфиксирующем симбиозе также играют лектины бобовых растений, которые за счет своей углевод-связывающей активности специфично взаимодействуют с сахарными остатками на клеточной стенке ризобий, обеспечивая тесное взаимодействие симбиотических партнеров, что облегчает их взаимное узнавание (Hamblin and Kent 1973; De Hoff, 2009) Специфичность лектинов напрямую связано со структурой их углевод-связывающего пептида (УСП).

Как правило, гены лектинов бобовых растений, вступающих в симбиоз с одними и теми же штаммами ризобий, характеризуются высокой гомологией последовательностей УСП. Кроме того, имеющиеся замены в УСП растений, входящих в одну группу перекрестной инокуляции, в большинстве случаев представляют собой замены на подобные аминокислоты. У растений L.аvernus, L.аpalustris и L.аgmelinii нами были обнаружены, клонированы и секвенированы по три различающихся гена лектина.

При анализе выведенных аминокислотных последовательностей УСП секвенированных лектинов чин были обнаружены заметные их различия по консервативным аминокислотам. Так, во всех трех фрагментах лектинов LGmL 1, 2, 6 в позиции 126 Ala заменен на Pro, кроме того, у LGmL 6 в 127-й позиции Ala заменен на отрицательно заряженный Glu. У LPaL 3 в 126-м положении неполярная аминокислота Ala заменена на полярный Thr. В той же позиции замены во всех трех фрагментах лектинов L. vernus: у LVeL 9 на Leu, у LVeL 10 на Ile, а у LVeL 13 на Thr. Также у LVeL 9 и LVeL 10 в позиции 124 вместо Tyr стоит положительно заряженный Arg, а в позиции 135 положительно заряженный Arg заменен на полярные незаряженные аминокислоты Thr и Ser, соответственно. Кроме того, у этих двух лектинов в вариабельном участке УСП присутствует делеция нескольких аминокислот. В результате изменяется длина петли, в которой находится УСП. Как можно видеть из рис.а4, большинство вышеуказанных замен в УСП лектинов чин приходятся на консервативные аминокислоты, определяющие углеводспецифичность лектинов у растений трибы Vicieae. Также у LPaL 3 в позиции 136 положительно заряженный гистидин, который является инвариантной аминокислотой УСП лектина, связывающей ионы металлов и стабилизирующей пространственную структуру белка, заменен на полярный незаряженный глутамин. Эта замена может оказать существенное влияние на функциональную активность данного белка.

Таким образом, по всей видимости, у каждого исследованного нами вида растений рода Lathyrus секвенированы несколько генов лектинов, которые могут кодировать изолектины.

Рис.а4. Сравнительный анализ выведенных аминокислотных последовательностей УСП лектинов Lathyrus sp. и некоторых других видов бобовых растений трибы Vicieae. Последовательности УСП подчеркнуты. Жирным шрифтом выделены аминокислоты, участвующие в связывании ионов металлов. Цифрами указаны положения аминокислот относительно лектина гороха. Курсивом выделены аминокислоты, определяющие в УСП растений трибы Vicieae специфичность связывания лектина c моносахаридом. Дефисами указаны делеции.

В составе первичной структуры исследованных нами фрагментов лектинов, как уже описывалось выше, имеют место замены, способные существенным образом повлиять на свойства соответствующего белка, что может сказаться на изменении специфичности при взаимодействии бобового растения с микросимбионтами. Наличие же нескольких изоформ данного белка у одного вида растения может объяснить пластичность в некоторых случаях при выборе растением УсвоегоФ микросимбионта, что может являться одним из механизмов приспособления к различным почвенно-климатическим условиям.

Исследование эффективности штаммов R.аtropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., обнаруженных в клубеньках растений рода Lathyrus. Эффективность клубеньковых бактерий оценивали по массе надземной части опытного растения чины посевной. После 30 дней выращивания было выявлено достоверное отличие в массе надземных частей растений, инокулированных штаммами R.аtropici, Agrobacterium sp. по сравнению с контролем (без инокуляции), тогда как растения, инокулированные штаммом Phyllobacterium sp. от контроля по массе не отличались (рис. 5).

Рис. 5. Влияние инокуляции штаммами R.аtropici, Agrobacterium sp., и Phyllobacterium sp., выделенных из клубеньков некоторых видов растений рода Lathyrus на изменение массы 30-ти дневных растений Lathyrus sativus. В качестве положительного контроля взяты растения, инокулированные R.аleguminosarum 1078, в качестве отрицательного контроля - без инокуляции.

При визуальном обследовании образовавшихся клубеньков было обнаружено, что немногочисленные клубеньки (3-5 шт. на растение), образованные Phyllobacterium sp., имели зеленый окрас, что говорит об их нефункциональности. Клубеньки же, образованные R.аtropici и Agrobacterium sp., имели розовый цвет и были более многочисленными (15-28 шт. на растение) (рис. 6).

Рис. 6. Клубеньки на корнях чины посевной, образованные R.аtropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., выявленными в клубеньках разных видов чин.

Можно предположить, что при получении симбиотических генов от R.аleguminosarum у штаммов близкородственных видов R.аtropici и Agrobacterium sp. произошло не только изменение специфичности, но также появилась способность к азотфиксирующему симбиозу. В то же время у штаммов неродственного вида Phyllobacterium sp. возникла возможность к образованию лишь неэффективных клубеньков.

Тем не менее, проанализированные штаммы R.аtropici и Agrobacterium sp. заметно уступали производственному штамму R.аleguminosarum 1078 как по эффективности, так и по количеству образуемых клубеньков (35-58 шт. на растение).

Эффективность клубеньковых бактерий является полигенным фактором, и при этом наличие симбиотических генов, локализованных в одной лишь sym-плазмиде, может быть недостаточно для успешного образования азотфиксирующего симбиоза, поскольку некоторая часть необходимых для этого генов может находиться или на хромосоме или на других плазмидах (Young, 2006; Gonzlez, 2006). Поэтому шанс возникновения удачного сочетания необходимых для этого генов высок при рекомбинации между родственными микроорганизмами, тогда как переход sym-плазмиды к неродственным бактериям не обеспечивает полноценной реализации программы образования азотфиксирующего клубенька, что мы и наблюдали в случае со штаммом Phyllobacterium sp., который способен был формировать лишь неэффективные клубеньки.

Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий трибы Galegeae. Данная триба на Южном Урале представлена 4 родами дикорастущих видов бобовых растений: Caragana Fabr. (Карагана), Astragalus L. (Астрагал), Oxytropis DC. (Остролодочник), объединенными в подтрибу Astragalinae и Glycyrrhiza L. (Солодка), а также интродуцированным видом Galega orientalis.

Были проанализированы клубеньковые бактерии 2-х видов караган, 6-ти видов астрагалов, 5-ти видов остролодочника и козлятника восточного (Galega orientalis L.).

При анализе микроорганизмов из клубеньков данных растений была выявлена разная степень их гетерогенности. Ризобии растений Astragalus и Oxytropis внутри симбионтов одного вида оказались однородны. Исключение составили бактерии, изолированные из клубеньков A.аcicer, у клубеньковых бактерий которого в одной из точек сбора была обнаружена некоторая гетерогенность. Тем не менее, RAPD фингерпринты их ДНК в своем составе содержали большое количество (до 60% от общего числа для отдельных праймеров) совпадающих полос (рис. 7). С помощью 16S ПДРФ-анализа было выявлено, что штаммы, полученные из разных точек сбора, отличаются своей филогенией.

Рис. 7. Электрофореграмма RAPD анализа амплифицированной ДНК штаммов бактерий (1-20) из клубеньков астрагала нутового с использованием произвольного олигонуклеотидного праймера 5Т-CAGGCCCTTC-3Т

У микросимбионтов растений рода Caragana также обнаружены отличия как в полиморфности ДНК штаммов, так и в скорости их роста на питательных средах. Из 54 изолированных штаммов у Caragana frutex к медленнорастущим можно было отнести 34 штамма, у Caragana arborescens из 85 изолированных штаммов - 80. 16S ПДРФ анализ выявил, что микросимбионты  Caragana frutex образуют 5 монофилетических групп, а микросимбионты Caragana arborescens - 10. Примечательно то, что у Caragana arborescens быстрорастущие штаммы объединены в одну монофилетическую группу, а медленнорастущие по 16S

ПДРФ профилям проявляли отличия между собой только при применении рестриктазы MspI, а при использовании рестриктазы AluI отличий обнаружено не было, что говорит о близком родстве представителей группы медленнорастущих штаммов данного растения. Филогенетический анализ на основании сравнения последовательностей гена 16S рРНК показал, что все исследованные штаммы ризобий растений рода Astragalus и Oxytropis, кроме штаммов A.аwolgensis и части штаммов A.аcicer, близки к бактериям рода Mesorhizobium. Тем не менее, на филогенетическом древе, построенном на основании множественного выравнивания последовательностей генов 16S рРНК ризобий (рис. 8) симбионты A.аhelmii и A.аmacropus ближе к виду Mesorhizobium plurifarium, симбионты A.аcornutus и O.аsordida - к M.аhuakuii; симбионты C.аfrutex и O.аspicata -  к M.аmediterraneum, симбионты A.аcicer и O.аhippolyti - к Mesorhizobium tianshanense; симбионты Astragalus danicus и O.аpilosa - к Mesorhizobium loti, O.аfloribunda - к Mesorhizobium alhagi. Бактерии из клубеньков A.аwolgensis имеют высокое родство с Ensifer (Sinorhizobium) meliloti, а у A.аcicer все клубеньковые бактерии, собранные в точке сбора, в которой полученные штаммы имели некую гетерогенность, имеют родство с  Agrobacterium sp. Все медленнорастущие  штаммы Caragana arborescens оказались близки к бактериям рода Mesorhizobium: Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium loti и Mesorhizobium caragana (рис. 9).

Интересным является тот факт, что у данного интродуцированного из Дальнего Востока вида растения, произрастающего за тысячи километров от естественного ареала произрастания, состав клубеньковых бактерий оказался идентичен составу клубеньковых бактерий, описанных Yan (2007) у растений, произрастающих в Китае, что говорит о высокой степени специфичности симбиоза данного растения.

Клубеньковые же бактерии Caragana frutex оказались весьма разнообразны. Из 5-ти монофилетических групп основная группа, включающая более половины анализированных штаммов, близка к бактериям  Mesorhizobium sp., две группы - к бактериям Rhizobium sp., и по одной группе к Phyllobacterium sp., и Bradyrhizobium sp. 

К подтрибе Galeginae трибы Galegeae относится один род - Galega. На Южном Урале чаще всего встречается вид Galega orientalis, интродуцированный из Кавказа как перспективная кормовая культура.

Рис. 8. Дендрограмма нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК бактерий семейства Rhizobiaceae, построенная с помощью программы MegAlign пакета Lasergene (DNASTAR, США). Жирным шрифтом отмечены исследованные нами штаммы. На горизонтальной оси приведено  количество замен нуклеотидов на 100 оснований

Обычным симбионтам данного вида растения - бактериям R.аgalegae свойственна строгая специфичность по отношению к своему растению-хозяину. Опыт  районирования козлятника восточного на территории России, и в частности, в условиях Южного Урала, показывает, что посев этой многолетней культуры без предварительной обработки семян препаратами ризобий малоэффективен.

Рис. 9. Древо сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК бактерий из клубеньков Caragana arborescens.

При исследовании более 100 штаммов клубеньковых бактерий у растений в 15-летних посевах, выращиваемых без искусственной инокуляции на опытных полях Госсортоучастка с.аБузовьязы Кармаскалинского района Республики Башкортостан, было обнаружено, что полученные штаммы весьма однородны и по последовательности генов 16S рРНК все принадлежат к виду R.аgalegae. Таким образом, в условиях Южного Урала нам не удалось обнаружить местные бактерии, способные изначально или приспособившиеся позже заражать козлятник восточный. Методом ПЦР было показано, что все полученные штаммы из клубеньков растений трибы Galegeae имеют в своем составе симбиотические гены, кроме бактерий из клубеньков Caragana frutex по последовательности 16S рРНК близких к роду Phyllobacterium, у которых амплифицировать симбиотические гены стандартными праймерами не удалось (табл. 2).

Таблица 2

Состав и генетическая характеристика штаммов клубеньковых бактерий,

  изолированных из клубеньков бобовых растений трибы Galegeae

Растение-хозяин	Кол-во выделенных штаммов	Количество групп штаммов, гомогенных по 16S-ПДРФ	Предполагаемый вид бактерий и их процентное соотношение у одного и того же растения	Наличие симбиоти-ческих генов
Caragana frutex	54	5	Mesorhizobium sp. 58% Rhizobium sp. 18% Phyllobacterium sp. 18% Bradyrhizobium sp. 6%	+ + - +
Caragana arborescens	85	10	Mesorhizobium sp. 94% Phyllobacterium sp. 6%	+ +
Astragalus danicus	10	1	Mesorhizobium sp.	+
A. macropus	10	1	Mesorhizobium sp.	+
A. cornutus	5	1	Mesorhizobium sp.	+
A.wolgensis	10	1	Ensifer  sp.	+
A. helmii	10	1	Mesorhizobium sp.	+
A. cicer	10+80	2	Mesorhizobium sp. 12% Agrobacterium sp. 88%	+ +
Oxytropis sordida	5	1	Mesorhizobium sp.	+
O. hippolyti	5	1	Mesorhizobium sp.	+
O. pilosa	5	1	Mesorhizobium sp.	+
O. floribunda	5	1	Mesorhizobium sp.	+
O. spicata	4	1	Mesorhizobium sp.	+
Galega orientalis	>100	1	Rhizobium galegae	+

Сравнение филогении генов 16S рРНК и nifH взятых в анализ клубеньковых бактерий в целом не выявил их различий. Исключение составили штаммы Phyllobacterium sp. из клубеньков Caragana arborescens, у которых ген nifH имеет высокую гомологию с аналогичными генами бактерий рода Mesorhizobium.

Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий трибы Loteae, Genisteae и Hedysareae. Трибы Loteae, Genisteae и Hedysareae на Южном Урале представлены относительно небольшими количествоми родов и видов. Так, например, триба Loteae представлена двумя родами дикорастущих бобовых: Lotus  (2 вида) и Coronilla, (1 вид); триба Genisteae - двумя родами: Genista (1 вид) и Chamaecytisus (2 вида); триба Hedysareae - двумя родами: Hedysarum (5 видов) и Onobrychis (1 вид). Были проанализированы клубеньковые бактерии следующих видов растений: лядвенеца украинского (Lotus ucrainicus), вязеля разноцветного (Coronilla varia), дрока красильного ( Genista tinctoria), ракитника русского (Chamaecytisus ruthenicus), копеечника крупноцветкового (Hedysarum grandiflorum), копеечника Разумовского (Hedysarum razoumowianum) и эспарцета песчаного (Onobrychis arenaria). Анализ гетерогенности методом PAPD выявил разную степень полиморфности ДНК у штаммов в зависимости от их растения-хозяина. У растений Lotus ucrainicus, Hedysarum grandiflorum и Onobrychis arenaria исследованные штаммы клубеньковых бактерий оказались однородны, а микросимбионты остальных растений имели разную степень гетерогенности. Первичный филогенетический анализ методом 16S ПДРФ выявил разделение штаммов Genista tinctoria на 5 монофилетических групп, а микросимбионтов Coronilla varia, Chamaecytisus ruthenicus и Hedysarum razoumowianum на 2 группы. Филогенетический анализ на основе сравнения генов 16S рРНК показал (рис.а8), что все исследуемые штаммы ризобий из клубеньков Lotus ucrainicus близки к бактериям Mesorhizobium ciceri, а обе монофилетические группы микросимбионтов родственного вида Coronilla varia к Rhizobium leguminosarum. Самую высокую разнородность показали клубеньковые бактерии из клубеньков Genista tinctoria, которые по последовательности генов 16S рРНК оказались близки Bradyrhizobium elkanii., Rhizobium sp. и Phyllobacterium sp. Микросимбионты Chamaecytisus ruthenicus оказались близки к Bradyrhizobium elkanii и Phyllobacterium sp., микросимбионты Onobrychis arenaria - Phyllobacterium trifolii (табл. 3).

Клубеньковые бактерии растений рода Hedysarum (Hedysarum grandiflorum и H.аrazoumowianum) совместно с микросимбионтами Oxytropis floribunda на филогенетическом древе образуют отдельную ветвь. По последовательности генов 16SарРНК данные бактерии похожи на недавно описанный вид Mesorhizobium alhagi, штаммы которого первоначально выявлены в клубеньках Alhagi sparsifolia (Chen et al., 2010). Минорный же штамм из клубенька H.аrazoumowianum, имеет родство с Bradyrhizobium elkanii.

Таблица 3

Состав и генетическая характеристика штаммов клубеньковых бактерий из клубеньков дикорастущих видов бобовых трибы Loteae, Genisteae и Hedysareae

Растение-хозяин	Кол-во выделенных штаммов	Количество групп штаммов, гомогенных по 16S-ПДРФ	Предполагаемый вид бактерий и их процентное соотношение у одного и того же растения	Наличие симбиоти-ческих генов
ТРИБА Loteae
Lotus ucrainicus	5	1	Mesorhizobium loti	+
Coronilla varia	24	2	Rhizobium leguminosarum	+
ТРИБА Genisteae
Genista tinctoria	18	5	Bradyrhizobium sp. 61% Rhizobium sp. 22,3% Phyllobacterium sp. 16,7%			+ + -
Chamaecytisus ruthenicus	5	2	Bradyrhizobium sp. 60% Phyllobacterium sp. 40%			+ +
ТРИБА Hedysareae
Hedysarum grandiflorum	5	1	Mesorhizobium sp.		+
H. razoumowianum	4	2	Mesorhizobium sp. 75% Bradyrhizobium sp. 25%		+ +
Onobrychis arenaria	> 100	1	Phyllobacterium trifolii

Исследования методом ПЦР выявили у всех взятых в анализ штаммов наличие симбиотических генов, за исключением Phyllobacterium sp. из клубеньков Genista tinctoria.

Сопоставление филогении рибосомного и симбиотических генов показало, что в основном для полученных микросимбионтов характерно их совпадение, кроме минорного штамма 11B, полученного из клубенька H. razoumowianum, который по последовательности гена 16S рРНК близок к Bradyrhizobium, но содержит ген nifH, имеющий гораздо большую гомологию с аналогичными генами, описанными у Mesorhizobium. Если учесть тот факт, что основными симбионтами у H.аrazoumowianum, по нашим данным, являются бактерии рода Mesorhizobium, то можно предположить, что штамм 11В, возможно, приобрел симбиотические гены данных бактерий посредством горизонтального переноса генов, что придало ему способность вступать в симбиоз с этим растением. У Phyllobacterium sp., выделенных из клубеньков Chamaecytisus ruthenicus, ген nifH имеют высокую гомологию с аналогичными генами Bradyrhizobium.

Делая обобщение, можно сказать, что состав исследованных микросимбионтов, взятых в анализ дикорастущих видов бобовых Южного Урала, оказался довольно разнообразным. Основное значение на таксономический  состав микросимбионтов имеет вид растения-хозяина. Но в некоторых случаях прослеживается также влияние других факторов. В присутствии в клубеньках минорных видов ризобий у Caragana frutex и Genista tinctoria четко прослеживается зависимость от условий произрастания растения-хозяина. Так, например, у Caragana frutex, произрастающей в степной зоне и на южных склонах, в клубеньках были обнаружены бактерии Mesorhizobium sp. и Bradyrhizobium sp., а у растений, произрастающих в лесных и парковых зонах, где почва менее прогревается и более увлажнена - Mesorhizobium sp. и Rhizobium sp. Подобная картина наблюдается и у Genista tinctoria, у которой в прогреваемых почвах в клубеньках обнаруживаются только Bradyrhizobium sp., а в лесных зонах еще и Rhizobium sp. Данное явление, как мы предполагаем, связано с различной приспособленностью видов бактерий к разным почвенным условиям. Так, известно, что для большинства штаммов Rhizobium оптимальная температура наибольшей азотфиксирующей продуктивности в симбиозе с бобовыми растениями находится в пределах 24-26С, а при повышении температуры > 30С она резко снижается (Мишустин, Шильникова, 1973), что и является, скорее всего, причиной их отсутствия в клубеньках растений, произрастающих в прогреваемых сухих почвах.

Также в этом плане весьма интересны штаммы, относящиеся к Phyllobacterium sp. Данные бактерии, описанные впервые Knosel (1962), как бактерии, образующие клубенек-подобные структуры на листьях некоторых тропических растений, в клубеньках дикорастущих бобовых умеренного климата встречаются довольно часто (Mantelin et al., 2006; Valverde et al., 2005). Нами Phyllobacterium sp. были обнаружены в клубеньках всех взятых в анализ кустарниковых видов бобовых: Chamaecytisus ruthenicus, Caragana frutex, Caragana arborescens и Genista tinctoria, а также в клубеньках двух травянистых видов бобовых: Onobrychis arenaria и Lathyrus gmelinii. Но, тем не менее, симбиотические гены были обнаружены не у всех исследованных штаммов данного вида. Так, не удалось обнаружить sym-гены методом ПЦР с использованием стандартных праймеров у штаммов, полученных из клубеньков Genista tinctoria, Caragana frutex и Onobrychis arenaria, а обнаруженные у других штаммов данные гены имели разное происхождение. У штамма С2А (Chamaecytisus ruthenicus), ген nifH имеет высокую гомологию с аналогичными генами, описанными у штаммов Bradyrhizobium, у бактерий из клубеньков Lathyrus gmelinii nifH и nodA соответствовали таковым R.аleguminosarum bv. viceae. В работах некоторых авторов также не были обнаружены симбиотические гены у Phyllobacterium выделенных из клубеньков (Bromfield, 2010; Lei et al., 2008). Роль данных бактерий в симбиотических взаимоотношениях ризобий с бобовыми растениями остается неясной и является предметом дальнейших исследований.

Надо сказать, что любые вновь появившиеся рекомбинанты проходят через селектирующий отбор, который преодолевает лишь очень небольшая их часть, поскольку не любая трансмиссия симбиотических генов приводит к появлению эффективных и конкурентоспособных штаммов клубеньковых бактерий. Необходимо образование удачной комбинации вновь приобретенных sym-генов и имеющегося генетического фона. И для появления подобной комбинации порой необходим большой промежуток времени. По крайней мере, как нами было выявлено, у интродуцированных на территорию Южного Урала бобовых растений Galega orientalis (интродуцирован в 80-е годы прошлого века) и Caragana arborescens (в культуре с 1752 года) за время их произрастания в новых условиях изменений в составе клубеньковых бактерий еще не произошло. Хотя, например, у аборигенного родственного вида Caragana frutex состав симбионтов весьма разнообразен.

С другой стороны, в некоторых случаях даже малоэффективные рекомбинанты могут получить преимущество перед другими штаммами, если на них воздействует определенное селектирующее внешнее давление. Именно этим, скорее всего можно объяснить обнаружение нами у растений L.аvernus и L.аsylvestris, произрастающих на кислых почвах, бактерий R.аtropici, которые более устойчивы к подобным условиям по сравнению R.аleguminosarum - обычного симбионта бобовых трибы Vicieae.

Влияние окружающей среды как селектирующего фактора зачастую является определяющей. Так, например, штаммы, полученные нами из клубеньков растений, относящихся к трибам Galegeae и Hedysareae, в основном филогенетически близки к различным видам рода Mesorhizobium. Из литературы известно, что растения Astragalus, Oxytropis и Hedysarum не являются строгими симбионтами и способны вступать в симбиоз со штаммами, относящимся к Mesorhizobium, Rhizobium, Ensifer (Sinorhizobium) и Bradyrhizobium (Han et al., 2008; Hou et al., 2009; Sui et al., 2009). Возможно, большую роль преимущественного симбиотического взаимодействия данных растений с бактериями рода Mesorhizobium в этом случае сыграли условия произрастания растений, у которых были собраны клубеньки, характеризующиеся щебенистыми почвами и в основном на прогреваемых южных склонах. По видимому, Mesorhizobium более приспособлен к таким условиям существования. В пользу этого говорит и тот факт, что у A.аwolgensis, выращенного из семян, собранных у растений, произрастающих в сходных с другими растениями данного рода условиях, на покупном грунте все выделенные штаммы из клубеньков по последовательности 16S рРНК оказались близкородственны Ensifer (Sinorhizobium) meliloti, и к тому же на проверку успешно заражали Medicago sativa, у которого данные бактерии являются обычными симбионтами. Это говорит о более широком симбиотическом потенциале данных растений и значительном влиянии их условия произрастания и обсемененности почвы различными штаммами на их взаимоотношения с клубеньковыми бактериями.

Таким образом, в условиях Южного Урала ризобии Rhizobium leguminosarum являются основными симбионтами дикорастущих видов растений трибы Vicieae, Mesorhizobium - основными симбионтами дикорастущих видов растений трибы Galegeae, Hedysareae и вида Lotus ucrainicus, принадлежащего трибе Loteae, а ризобии рода Bradyrhizobium - дикорастущих видов трибы Genisteae. Кроме того, в зависимости от условий произрастания отдельные виды бобовых способны также вступать в симбиоз и с некоторыми другими видами клубеньковых бактерий.

Нужно отметить, что исследования ризобий дикорастущих бобовых растений - это ключ к пониманию и выявлению устоявшихся в течение тысячелетий в данных почвенно-климатических условиях симбиотических отношений между клубеньковыми бактериями и бобовыми растениями,  которые, по сути, являются наиболее приспособленными и конкурентоспособными в данных условиях. И это, в свою очередь, может представлять огромный научный интерес, поскольку при исследовании разнообразия дикорастущих бобовых растений мы имеем возможность заглянуть в природный полигон, где постоянно проходят испытания различных вариантов штаммов клубеньковых бактерий, возникающих вследствие  горизонтального переноса генов, что может служить полезным источником информации для понимания механизмов становления азотфиксирующего симбиоза. К тому же дикорастущие бобовые растения являются естественным поставщиком большого разнообразия штаммов клубеньковых бактерий, приспособленных к данным условиям окружающей среды для селекционных работ по поиску высокоэффективных и конкурентоспособных штаммов для выращивания бобовых растений, а также для ассоциативного симбиоза с небобовыми растениями в качестве ростстимулирующих бактерий, возможности которых были продемонстрированы многими авторами.

Получение флуоресцентно меченых штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых для их детекции in vivo и in vitro. Для проведения визуальных исследований взаимодействия клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых с растениями и другими микроорганизмами, с использованием созданных нами маркерных векторов были получены штаммы клубеньковых бактерий, меченые разными флуоресцентными белками.

При создании векторных конструкций были использованы гены белков серии TurboColors: TurboGFP (Shagin et al., 2004) и TurboRFP (Merzlyak et al., 2007), отличающиеся улучшенными характеристиками по сравнению с первыми вариантами подобных белков. Векторные конструкции были созданы как для экспрессии гена маркерного белка с плазмиды, так и для встраивания его в состав хромосомы бактериальной клетки, поскольку у каждого из этих методов есть свои преимущества и недостатки. Для кратковременных экспериментов по исследованию свойств микроорганизмов, механизмов взаимодействия, конкурентоспособности и т.д., в которых основным требованием является неизменность фенотипа исследуемого штамма, более применима плазмидная экспрессия маркерного гена; для долгосрочных же экспериментов, где более важно устойчивое маркирование - желателен перенос и интеграция маркерного гена в состав хромосомы.

Первый набор, состоящий из векторов, обозначенных нами как pJNTurboGFP и pJNTurboRFP, был создан для плазмидной экспрессии маркерного гена. В качестве основы для конструкций была взята плазмида широкого круга хозяев pJN105, содержащая репликон pBBR1. Уникальность данного репликона заключается в том, что он не принадлежит ни к одной из известных групп несовместимости.

Поскольку нами был обнаружен спонтанный переход mob-содержащих маркирующих плазмид между некоторыми штаммами клубеньковых бактерий, в частности переход плазмиды был обнаружен между штаммами BKBLV16.17 R.аLeguminosarum, трансформированным pJNTurboGFP и штаммом BKBLPu14 Agrobacterium sp., трансформированным pJNTurboRFP, приведший к образованию клеток, содержащих как красный, так и зеленый флуоресцентные белки, выявленных методом проточной цитометрии (рис. 10),  mob-участки с данных конструкций  были удалены сайтЦнаправленным мутагенезом.

Рис.а10. Разделение популяций клеток ризобий методом проточной цитометрии. Нижний левый квадрант - дебрис, мертвые нефлуоресцирующие клетки, верхний левый квадрант - клетки штамма BKBLPu14 Agrobacterium sp., содержащие RFP, нижний правый квадрант - клетки штамма BKBLV16.17 R.аleguminosarum, содержащие GFP, верхний правый квадрант - пул клеток, содержащий оба маркирующих белка. А - клетки, выращенные на жидкой питательной среде,  Б - клетки, выращенные на твердой питательной среде.

Данные конструкции были обозначены как mob-: pJNTurboGFPmob- и pJNTurboRFPmob- (рис. 11).

С использованием данной серий векторов методом электропорации были успешно получены маркированные штаммы, относящиеся к различным родам клубеньковых бактерий: Rhizobium, Mesorhizobium, Ensiferа(Sinorhizobium), Bradyrhizobium, Phyllobacterium и Agrobacterium.

Рис.а11. Схема получения экспрессирующей векторной конструкции, содержащей ген TurboGFP.

Для маркирования бактерий встраиванием гена флуоресцентного белка в состав хромосомы для долговременных экспериментов была модифицирована плазмида pRL765gfp, в которой ген gfp под регуляцией промотора psbA, находящийся в составе транспозона Tn5, был заменен на гены флуоресцентных белков серии TurboColors под регуляцией конститутивного промотора фага Т5. Такие плазмиды были обозначены как pRL765TurboGFP и pRL765TurboRFP (рис. 12).

Проведенная модификация заметно улучшила флуоресцентные характеристики меченных с использованием данных конструкций штаммов по сравнению с исходным pRL765gfp. Но, к сожалению, как и в случае pRL765gfp, при использовании pRL765TurboGFP и pRL765TurboRFP возникают проблемы с эффективностью трансформации. С применением данных конструкций нами были получены маркированные штаммы Rhizobium sp., Phyllobacterium sp., Agrobacterium sp., где эффективность трансформации не превышала 1-5 колоний на 1 мкг трансформируемой ДНК. Трансформация же штаммов Mesorhizobium sp., Ensiferаsp., Bradyrhizobium sp. не увенчались успехом. Во всех случаях трансформацию проводили электропорацией.

Рис. 12. Схема модификации плазмиды pRL765gfp путем замены гена gfp под регуляцией промотора psbA на ген TurboGFP под регуляцией промотора фага Т5.

Исследование адгезии клеток ризобий Rhizobium leguminosarum bv. viciae  на трансгенных по гену лектина psl бородатых корнях растений рапса и табака. Ризосфера растений не является структурно ограниченной симбиотической нишей и специфичность ее колонизации почвенными микробами относительно невелика. Однако состав ризосферной микрофлоры можно сделать гораздо более контролируемым, например, как предлагается нами, путем придания несимбиотрофным растениям способности синтезировать углеводсвязывающие белки (лектины), специфически адгезирующие полезные азотфиксирующие микроорганизмы к их корням.

ектины бобовых растений - секретируемые белки, способные узнавать и избирательно связывать разнообразные углеводы. Благодаря субъединичной структуре лектины являются би-(тетра-)валентными и тем самым способны избирательно связывать свои бактерии между собой и адгезировать их на поверхность корней бобовых растений, способствуя тем самым прикреплению клубеньковых бактерий к своему макросимбионту. Отсюда, трансгенные растения, синтезирующие лектины определенных бобовых растений, могут стать способными связывать микросимбионты к своим корням.

В качестве растительного объекта для подтверждения данной гипотезы были выбраны несимбиотрофные виды растений табака (Nicotiana tabaccum) и рапса (Brassica napus L. var. napus), на которых с помощью вирулентного штамма Agrobacterium rhizogenesа15834, несущего бинарный вектор pCAMBIAа1305.1psl, были получены трансгенные по гену лектина гороха (psl), находящегося под управлением сильного CaMV-35S промотора, бородатые корни. Далее настоящие корни отрезали и получившиеся композитные, состоящие из нетрансгенной надземной части и трансгенных бородатых корней, растения высаживали на агровермикулит или грунт. Трансгенная природа корней была подтверждена активностью репортерного GUS-гена у 40% проростков. ПЦР анализ ДНК этих корней показал присутствие в них гена лектина и на уровне мРНК его конститутивную экспрессию (рис. 13). В качестве отрицательного контроля были использованы бородатые корни, полученные с помощью исходного штамма A.аrhizogenesа15834.

Рис. 13. Электрофореграмма ОТ-ПЦР-анализа экспрессии гена лектина в Убородатых корняхФ: 1 - контроль на наличие ДНК в препарате мРНК, 2 - Убородатые корниФ, в которых идет экспрессия гена лектина, 3 - отрицательный контроль без генетического материала, 4 - продукт ПЦР на наличие гена лектина в Убородатых корняхФ, 5 - 1 Kb ДНК маркер (250-10000 п.н.).

Котрансформированные геном лектина гороха и контрольные (без этого гена) Убородатые корниФ композитных растений рапса и табака были обработаны микросимбионтом гороха посевного R.аleguminosarum 1078, предварительно трансформированным плазмидой pCAMBIA1304 (несущей ген gus, способный экспрессироваться в бактериальных клетках), что позволяло легко идентифицировать бактерии по синему окрашиванию колоний, выросших на среде с X-Gluc. Определение количества адсорбированных ризобий через 1 час инкубации при комнатной температуре методом подсчета синих колоний, выросших на чашках Петри после рассева гомогената отмытых и растертых корней, показало более чем на порядок увеличение численности бактерий на трансформированных геном psl корнях (в среднем в 14 раз у табака и в 37 раз у рапса), по сравнению с контрольными Убородатыми корнямиФ (количества адгезированных бактерий представлены в табл. 4 ). При этом был обнаружен достаточно большой разброс результатов опытов от растения к растению, связанный, скорее всего, с разным уровнем экспрессии гена лектина гороха в Убородатых корняхФ (эффект положения гена является характерным недостатком трансгенов, введенных с помощью агробактериальной трансформации).

Таблица 4

Количество ризобий, адгезированных на поверхности Убородатых корнейФ

Бородатые корни	Бактерии	Количество бактерий, адгезированных на корешках, кл/г х 107		Повторность
		Табак	Рапс
Контрольные (без psl)	R.аleguminosarum	2,01-2,25	3,76-3,81	10
Опытные (psl)		22,6-38,2	105-175

Известно, что в природе адсорбция ризобий на корневых волосках происходит за счет двойного специфичного связывания лектина и с бактериями и с растительными клетками. Таким образом, на первом этапе бобово-ризобиального симбиоза бактерии колонизируют ризоплану растения-хозяина, в результате которой их численность в прикорневой зоне возрастает на 3Ц4 порядка (Kijne et al., 1992). Проведенные нами эксперименты на трансгенных по гену лектина гороха корнях убедительно показывают возможность использования данных белков в качестве якорных молекул, способных сорбировать клубеньковые бактерии на поверхности корней несимбиотрофных растений.

Анализ специфичности взаимодействия лектинов бобовых растений с клубеньковыми бактериями. При создании искусственных ассоциаций важным моментом является обеспечение специфичности взаимодействия полученных трансгенных растений с бактериями, оказывающими на них благоприятное воздействие. С этой точки зрения использование лектинов бобовых для прикрепления ризобий на поверхность корней является оптимальным решением, поскольку данные белки обладают достаточно высокой избирательностью к углеводам и участвуют в специфичном узнавания макро- и микросимбионтов на начальных стадиях образования симбиоза.

ектины бобовых растений, взаимодействуя с углеводными остатками на поверхности клеточной стенки клубеньковых бактерий, участвуют в их прикреплении к клеткам эпидермиса корней и способны вызвать агглютинацию бактерий. Это свойство было выбрано нами для проверки специфичности взаимодействия данного класса белков с различными видами ризобий.

В качестве объектов для исследования были выбраны лектины из семян козлятника восточного (Galega orientalis) и гороха посевного (Pisum sativum), а также обычные симбионты данных растений R.аgalegae и R.аleguminosarum bv. Viciae, соответственно. Выбор данных пар был продиктован с одной стороны строгой специфичностью при взаимодействии этих растений со своими микросимбионтами, с другой - относительной филогенетической близостью микросимбионтов, относящихся к одному роду.

В работе были использованы штамм CIAM 0702 R.аgalegae (симбионт козлятника восточного) и штамм CIAM 1078 R.аleguminosarum bv. viciae (симбионт гороха). Оба штамма для удобства детектирования были трансформированы плазмидой pJNTurboRFPmob- для маркирования их красным флуоресцентным белком. В качестве лектина гороха был использован коммерческий препарат PSL (Serva, Германия), а лектин козлятника восточного (GOL) ввиду отсутствия коммерчески доступного препарата белка был выделен из семян растения. В качестве контроля использовали коммерческий препарат лектина FHA из семян фасоли (Serva, Германия).

При визуальном анализе клеток при помощи флуоресцентного микроскопа после 8 часов инкубации было обнаружено, что клетки каждого из исследуемых штаммов агглютинируют только при обработке лектином растений, к которым специфичен данный вид ризобий (рис. 14). При перекрестной же обработке или при воздействии FHA агрегации не происходило. Таким образом, можно сделать вывод, что лектины из семян гороха посевного и козлятника восточного имеют высокую специфичность при взаимодействии с микросимбионтами своих растений.

Рис.а14. Агглютинация ризобий лектинами из семян бобовых растений. А. R.аleguminosarum bv. viciae + PSL; Б. R.аleguminosarum bv. viciae + GOL; В. R.аgalegae + GOL; Г. R.аgalegae + PSL;

Следовательно, лектины бобовых растений, обладающих высокой избирательностью симбиоза со своими ризобиями, могут стать удачным инструментом для создания строго контролируемых искусственных ассоциаций растений с клубеньковыми бактериями.

Создание искусственных ассоциативных симбиозов с помощью лектинов на примере трансгенных растений табака и бородатых корней томата и рапса. Для проверки возможности получения стабильных искусственных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями в естественных условиях, нами были получены полностью трансгенные по гену psl лектина гороха растения табака, а также композитные (с трансгенными по гену psl корнями) растения томата и рапса, (рис. 15).

В качестве микросимбионтов для инокуляции были использованы перекрестно не заражающие виды ризобий R.аleguminosarum bv. viciae 1078 и R.аgalegae CIAM 0702, которые для удобства детектирования были маркированы разными флуоресцентными белками.

Рис.а15. Гистохимический анализ GUS-активности корней композитных растений томата (А), рапса (Б) и трансгенного растения табака (В).

Выращенные в течение месяца на грунте за счет трансгенных бородатых корней композитные растения томата и рапса, а также месячные растения табака заражали культурами клубеньковых бактерий R.аleguminosarum bv. viciae 1078 (TurboRFP) и R.аgalegae 0702 (TurboGFP) по отдельности каждое растение и в смеси. Для этого к корневой системе растений добавляли 5 мл суспензии клеток в концентрации 1000 КОЕ/мл и оставляли на ночь, после чего проводили подсчеты сорбировавшихся клеток. Полученные данные наглядно показали влияние трансгенного лектина на взаимодействие растений с бактериями, поскольку на трансгенных по psl+ корнях адгезировалось значительно больше клеток R.аleguminosarum bv. viciae по сравнению с контрольными растениями, как в случае полностью трансгенного табака, так и на трансгенных корнях композитных растений. Более того, взаимодействие бактерий с корнями растений было строго специфичным, поскольку количество адгезированных клеток R.аgalegae как на psl+, так и на psl- корнях опытных растений достоверно не отличалось, и было примерно равно количеству клеток R.аleguminosarum bv. viciae, прикрепившихся на psl- корнях (рис. 16).

При визуальном анализе с помощью флуоресцентной микроскопии также была обнаружена специфическая колонизация R.аleguminosarum bv. viciae поверхности корней (преимущественно корневых волосков) именно psl+ растений. На psl- корнях всех видов растений явной колонизации обнаружено не было.

Рис.а16. Количество клеток R.аleguminosarum bv. viciae и R.аgalegae, адгезированных на поверхности корней опытных (psl+) и контрольных (psl) растений табака, томата и рапса.

Схожая картина наблюдалась и при совместной инокуляции R.аleguminosarum bv. viciae и R.аgalegae (рис. 17).

 

Рис.а17. Совместная инокуляция R.аleguminosarum bv. viciae (TurboRFP -красный) и R.аgalegae (TurboGFP - зеленый) psl+ трансгенных корней опытных растений. А - рапс, Б - томат, В - табак.

Кроме прочего, наблюдается также влияние трансгенного белка на симбиотические реакции psl+ корневых волосков табака при обработке R.аleguminosarum bv.аviciae. После инокуляции корней растений этим микросимбионтом с помощью микроскопирования были выявлены немногочисленные скручивания корневых волосков, которых не наблюдалось в случае обработки данными бактериями контрольных растений без гена лектина (рис. 18).

Рис. 18. Скручивания корневых волосков psl+ трансгенного табака при взаимодействии с R.аleguminosarum bv.аviciae

Наконец, в пользу того, что именно лектин является заякоривающим агентом, говорит то, что клетки R.аleguminosarum bv.аviciae в начальной фазе прикрепления располагаются, как видно на рис. 19, перпендикулярно поверхности корня psl+ трансгенного табака.

Рис. 19. Начальная фаза прикрепления клеток R.аleguminosarum bv.аviciae (GFP) к поверхности корня psl+ трансгенного табака.

Дело в том, что у данного вида бактерий полисахариды, которые участвуют во взаимодействии бактериальной клетки с лектином, расположены именно на полюсах клеток. Карбогидратный анализ показал, что эти полисахариды на 95% состоят из остатков маннозы и глюкозы. Именно за счет них происходит взаимодействие  бактериальных клеток с лектинами на поверхности корня гороха, что и является причиной первичного прикрепления бактерий к корням одним из полюсов. При этом данный признак не связан с симбиотическими генами и кодирован на хромосоме, что делает наличие данных полисахаридов видовым признаком, не зависящим от состава плазмид (Laus, 2006). 

Обобщая вышесказанное, можно отметить, что: во-первых, очевидно участие лектина в прикреплении клубеньковых бактерий к поверхности трансгенных корней; во-вторых, взаимодействие лектинов и ризобий на поверхности трансгенных корней имеют специфический характер; в-третьих, колонизация трансгенных по гену лектина корней специфичными ризобиями успешно происходит и в условиях грунта, где существует конкуренция с другими почвенными микроорганизмами. Таким образом, становится очевидным, что лектин может служить якорным белком для специфичного направленного прикрепления определенных полезных бактерий к корням трансгенных по гену данного белка растений.

* * * * *

Таким образом, было изолировано и генетически охарактеризовано более 1200 штаммов клубеньковых бактерий из клубеньков 36 видов дикорастущих бобовых растений Южного Урала принадлежащих 12 родам. Были получены сведения об их генетическом разнообразии и филогенетической принадлежности 65-ти нуклеотидных последовательности генов 16S рРНК штаммов клубеньковых бактерий  и зарегистрированы в международных банках данных EMBL/GenBank/DDBJ.

Получены данные о влиянии горизонтального переноса симбиотических генов на изменение состава клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений.

Создана серия векторов экспрессии, содержащих гены флуоресцентных белков TurboGFP и TurboRFP под контролем конститутивного промотора фага Т5, предназначенных для прижизненного окрашивания клубеньковых бактерий. Это векторы на основе репликона широкого круга хозяев pBBRI для маркирования штаммов, экспрессирующих маркерный ген с трансформируемой плазмиды и векторы на основе плазмиды pRL765gfp для маркирования штаммов путем введения генов флуоресцентных белков в состав хромосомы бактерий.

Получены данные о возможности использования генов лектинов бобовых растений в качестве трансгенов для создания искусственных ассоциаций клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями.

Показано, что ризобии могут быть использованы не только в качестве инокулянтов при выращивании бобовых растений, но и для создания новых ассоциаций с несимбиотрофными растениями. Применение стратегии конструирования лискусственной ризосферы, специфически колонизируемой только теми микробами, которые выполняют полезные для растений трофические, ростостимулирующие и/или защитные функции, с использованием лектинов бобовых растений в качестве трансгенов, может стать важным шагом к получению стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями.

ВЫВОДЫ

1. Собрана и генетически охарактеризована коллекция клубеньковых бактерий 36 видов дикорастущих бобовых растений Южного Урала, относящихся к 12 родам, состоящая из 1217 штаммов.
2. Обнаружена высокая полиморфность ДНК бактерий, вступающих в симбиоз с бобовыми растениями трибы Vicieae. Коэффициент гетерогенности Шеннона у исследованных штаммов составил от 0,32 для ризобий чины Литвинова до 0,82 для ризобий чины клубненосной. Показано, что их гетерогенность вызвана различиями в плазмидном составе, что говорит о высокой рекомбинационной активности данных бактерий.
3. У четырех видов рода Lathyrus в клубеньках обнаружены микросимбионты, которые считались для них несвойственными (L.аvernus и L.аsylvestris - R.аtropici, L.аpalustris  -  Agrobacterium sp., L.аgmelinii - Phyllobacterium sp.).
4. Выявлено, что симбиотические гены (nifH, nifD и nodA) штаммов R.аtropici и Agrobacterium sp., образующих клубеньки на корнях видов Lathyrus, имеют высокую степень гомологии с аналогичными симбиотическими генами R.аleguminosarum bv. Viciae, что свидетельствут в пользу того, что данные штаммы получили  sym гены от R.аleguminosarum bv. viciae путем горизонтального переноса генов.
5. Идентичность состава микросимбионтов у караганы древовидной, произрастающей как на Южном Урале, так и в Китае, указывает на высокую специфичность взаимодействия этого вида растения со своими ризобиями.
6. Показано, что на территории Южного Урала основными симбионтами растений трибы Genisteae  являются бактерии рода Bradyrhizobium, растений подтрибы Astragalinae трибы Galegeae и растений трибы Hedysareae - бактерии рода Mesorhizobium.
7. Созданы плазмидные конструкции для флуоресцентного мечения клубеньковых бактерий и получены их маркированные штаммы с генами TurboGFP и TurboRFP как с экспрессией маркерного гена с трансформированной плазмиды, так и с переводом его в состав хромосомы бактерий. Показана необходимость отсутствия mob участка в составе маркирующих плазмид во избежание спонтанной их передачи другим почвенным бактериям с помощью конъюгации.
8. Выявлено, что пластичность при выборе L.аvernus, L.аpalustris и L.аgmelinii своих микросимбионтов может быть обусловлена наличием у этих растений нескольких изоформ лектина.
9. Увеличение адсорбции ризобий на поверхности трансгенных по гену лектина гороха psl бородатых корней рапса и табака подтверждает участие данного белка в прикреплении бактерий к клеткам эпителия трансгенного корня.
10. Экспрессия гена лектина гороха psl способствует избирательной колонизации ризосферы табака, рапса и томата ризобиями R.аleguminosarum bv. viciae в условиях конкуренции с посторонней микрофлорой. Это может быть использовано для получения стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с азотфиксирующими бактериями.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В., Баймиев Ан.Х., Вахитов В.А. Углеводсвязывающие пептиды лектинов бобовых растений в связи с различной хозяйской специфичностью макросимбионта при образовании симбиоза с клубеньковыми бактериями // Генетика. 2001. Т. 37, № 2. С. 215-222.
2. Губайдуллин И.И., Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х., Чемерис А.В., Вахитов В.А.  Синтезированный в E.coli лектин гороха посевного (psl) способен инициировать клубенькообразование на люцерне посевной при ее инокуляции Rhizobium leguminosarum bv. viciae // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии. 2006. Т. 2, № 2. С. 11-16.
3. Баймиев Ал.Х., Губайдуллин И.И., Баймиев Ан.Х., Чемерис А.В., Баймиев Х.М., Вахитов В.А. Симбиоз козлятника восточного с клубеньковыми бактериями Rhizobium galegae: специфичность и конкурентоспособность // Прикладная биохимия и микробиология.  2007. Т. 43, №3. С. 311-317.
4. Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х., Губайдуллин И.И., Куликова О.Л., Чемерис А.В. Филогения и генетическое разнообразие клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с астрагалом нутовым // Микробиология. 2007. Т. 76, №1. С. 129-131.
5. Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х., Губайдуллин И.И., Куликова О.Л., Чемерис А.В. В клубеньках эспарцета песчаного обнаружены бактерии, близкие по гену 16S рРНК к Phyllobacterium trifolii // Генетика. 2007. Т. 43, № 5. С. 716-719.
6. Баймиев Ал.Х., Губайдуллин И.И., Баймиев Ан.Х., Чемерис А.В. Сайт-направленный мутагенез углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений с использованием инвертированной ПЦР // Молекулярная биология. 2007. Т. 41, № 5. С. 940-942.
7. Баймиев Ал.X, Губайдуллин И.И., Баймиев Ан.X., Чемерис А.В. Влияние природных и гибридных лектинов на взаимодействие бобовых растений с ризобиями // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45, № 1. С. 84-91.
8. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Баймиев Ал.Х. Влияние интродукции караганы древовидной на состав ее клубеньковых бактерий // Микробиология. 2010. Т. 79, №1. С. 123-128.
9. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Благова Д.К., Мулдашев А.А., БаймиеваАл.Х. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с чиной весенней Lathyrus vernus (L.) Bernh. // Mикробиология. 2011. Т. 80, № 1. С. 100-104.
10. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Мулдашев А.А., Баймиев Ал.Х. Генетическая характеристика клубеньковых бактерий бобовых рода Lathyrus L. (Fabaceae), произрастающих на территории Республики Башкортостан // Экологическая генетика. 2011. № 2. С. 3-8.
11. Вершинина З.Р., Баймиев Ан.Х., Благова Д.К., Князев А.В., Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В. Биоинженерия симбиотических систем: создание новых ассоциативных симбиозов с помощью лектинов на примере табака и рапса // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47, № 3. С. 336-342.
12. Баймиев Ан.Х., Ямиданов Р.С., Матниязов Р.Т., Благова Д.К., БаймиеваАл.Х., Чемерис А.В. Получение флуоресцентно меченых штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых для их детекции in vivo и in vitro // Молекулярная биология. 2011. Т. 45, № 6. С. 984Ц991.
13. Чубукова О.В., Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х. Полиморфизм генов лектинов растений рода Lathyrus // Генетика. 2011. Т. 47, № 7. С. 920-926.
14. Баймиев Ан.Х., Иванова Е.С., Птицын К.Г., Чубукова О.В., Баймиев Ал.Х. Филогенетический анализ симбиотических генов клубеньковых бактерий растений рода  Lathyrus (L.) (Fabaceae) // Молекулярная генетика, микробиолгия и вирусология. 2011. № 4. С. 14-17.
15. Иванова Е. С., Баймиев Ан. Х., Ибрагимов Р. И., Баймиев Ал. Х. Симбиотические гены клубеньковых бактерий и влияние их горизонтального переноса на видовой состав микросимбионтов бобовых растений // Вестник Башкирского университета. 2011. T. 16, № 4. С. 1050-1054.
16. Баймиев Ан.Х., Иванова Е.С., Птицын К.Г., Белимов А.А., Сафронова В.И., Баймиев Ал.Х. Генетическая характеристика клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых Южного Урала // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012. № 1.

МОНОГРАФИЯ

17. Вершинина З.Р., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Лектины бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем. Germany: Lambert Academic Publishers, 2010. 140 С.

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ И СТАТЬИ В СБОРНИКАХ КОНФЕРЕНЦИЙ

18. Губайдуллин И.И., Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х. Получение лектинов с измененной углеводспецифичностью. // Международная школа-конференция молодых ученых  БИОТЕХНОЛОГИЯ БУДУЩЕГО. Санкт-Петербург. 2006. С. 23-24.
19. Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х., Губайдуллин И.И., Чемерис А.В. Клубень-ковые бактерии астрагала нутового и эспарцета песчаного: генетическое разнообразие и филогенетическое положение // Международная конференция Генетика в России и мире, посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва. 2006. С. 12.
20. Баймиев Ан. Х., Баймиев Ал. Х., Птицын К.Г., Чемерис А.В. Генетическая гетерогенность ризобий, вступающих в симбиоз с дроком красильным и караганой древовидной // Международная конференция Генетика в России и мире, посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва. 2006. С. 11.
21. Губайдуллин И.И., Баймиев Ал. Х., Баймиев Ан. Х. Различия в углеводсвязывающих пептидах лектинов клеверов Trifolium repens, T. pratense, T. trichocephalum, инокулирующихся сходными ризобиальными штаммами // Международная конференция Генетика в России и мире, посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва. 2006. С. 56.
22. Губайдуллин И.И., Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х. Экзогенная обработка гибридными лектинами способна расширять круг перекрестной инокуляции бобовых растений ризобиями // III Межрегиональная конференция молодых ученых Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой. Саратов. 2006 г. С. 24.
23. Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х., Вершинина З.Р., Куликова О.Л. Генетическое биоразнообразие популяций ризобий Sinorhizobium meliloti, вступающих в симбиоз с бобовыми родов Medicago и Melilotus произрастающих в Башкортостане // Международная школа-конференция Генетика микроорганизмов и биотехнология, посвящённая 100-летию со дня рождения С. И. Алиханяна. Москва. 2006. C. 36-37.
24. Баймиев Ан.Х., Бурмистрова Л.Е., Птицын К.Г. Филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с караганой кустарниковой (Caragana frutex) и караганой древовидной (Caragana arborescens). // Школа-конференция молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии Биомика - наука XXI века. Уфа. 2007. С. 8-10.
25. Бурмистрова Л.Е., Баймиев Ан. Х. Генетическое биоразнообразие  клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с вязелем разноцветным (Coronilla varia) // Школа-конференция молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии Биомика - наука XXI века. Уфа. 2007. С. 12-13.
26. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х. Определение филогении ризобиальных бактерий, вступающих в симбиоз с горошком заборным (Vicia sepium) // Школа-конференция молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии Биомика - наука XXI века. Уфа. 2007. С. 8-10.
27. Баймиев Ан.Х., Бурмистрова Л.Е., Гареев А. Симбиотические отношения караганы кустарниковой с клубеньковыми бактериями являются малоспецифичными. // Материалы Всероссийской конференции с международным участием Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем. Саратов. 2007. С. 74
28. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал. Х. Генетическая гетерогенность и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими растениями рода чина (Lathyrus), произрастающими на территории Республики Башкортостан // V Всероссийская конференция молодых учёных Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой. Саратов. 2010. С. 29.
29. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Генетическая гетерогенность клубеньковых бактерий вступающих в симбиоз с чиной бледноватой (Lathyrus pallescens (Bieb.) C.Koch) // 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных Биология - наука XXI века. Пущино. 2010. С. 255.
30. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Благова Д.К., Баймиев Ал.Х. Изменение видового состава клубеньковых бактерий чины весенней Lathyrus vernus (L.) Bernh и чины лесной Lathyrus sylvestris L. в зависимости от почвенно-климатических условий // Всероссийский симпозиум Растение и стресс (Plants under Environmental Stress). Москва. 2010. С. 44-45.
31. Халитова Л.Х., Баймиев А.Х. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей некоторых симбиотических генов штаммов клубеньковых бактерий, нодулирующих чину весеннюю Lathyrus vernus(L.) Bernh // V Всероссийская конференция молодых учёных Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой. Саратов. 2010. С. 31.
32. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Баймиев Ал.Х. Влияние почвенно-климатических условий на состав клубеньковых бактерий Genista tinctoria и Caragana frutex (Fabaceae) // VI Съезд Общества физиологов растений России Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий. Нижний Новгород. 2011. С. 64-65.
33. Благова Д.К., Баймиев А.Х. Плазмидный состав штаммов клубеньковых бактерий, нодулирующих чину весеннюю Lathyrus vernus (L.) Bernh // V Всероссийская конференция молодых учёных Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой. Саратов. 2010.  С. 21.
34. Чубукова О.В., Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х. Полиморфизм генов лектинов растений трибы Galegeae, различных групп перекрестной инокуляции. // VII Съезд Общества физиологов растений России Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий. Нижний Новгород. 2011. С. 749-750.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГПГ - горизонтальный перенос генов

GFP - зеленый флуоресцентный белок

RFP - красный флуоресцентный белок

УСП - углевод связывающий пептид

FHA - лектин Phaseolus vulgaris

PSL - лектин Pisum sativum

GOL - лектин Galega orientalis

RAPD Цпроизвольная амплификация полиморфной ДНК

ПДРФ (RFLP)Ц полиморфизм длины рестриктазных фрагментов

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии