Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

СИГИДАЕВ

Алексей Сергеевич

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЛАСТОЦИСТНОЙ ИНВАЗИИ У БОЛЬНЫХ hcv-ИНФЕКЦИЕЙ

14.01.09 Ц инфекционные болезни

03.02.11 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2012 

Работа выполнена в Федеральном государственном казенном военном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Жданов  Константин Валерьевич

доктор медицинских наук профессор Козлов Сергей Сергеевич

Официальные оппоненты:

Антонова Тамара Васильевна доктор медицинских наук профессор

ГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии

итвинов Сергей Кириллович кандидат медицинских наук

Институт медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е.И. Марциновского ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 17 декабря 2012 года в 12-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д215.002.01 на базе Федерального государственного казенного военного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке

Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова

Автореферат разослан  л____ _______________2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор

Пономаренко Геннадий Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. HCV-инфекция представляет собой одну из наиболее актуальных медико-социальных проблем в мире, что обусловлено стабильно высоким уровнем заболеваемости и повсеместным распространением, а также колоссальными экономическими затратами на диагностический и лечебный процессы. Согласно данным ВОЗ, около 170 миллионов человек заражены вирусом гепатита С (HCV), что соответствует 3% общей численности населения в мире (ВОЗ, 63 сессия ассамблеи здравоохранения А63/15, 2010). Кроме того, необходимо отметить, что среди всей инфекционной патологии в России вирусные гепатиты наносят наибольший экономический ущерб на 1 случай заболевания, а по суммарному экономическому ущербу уступают только гриппу и ОРЗ [Жданов К.В. и др., 2011].

В феврале 2001 года в Государственной Думе России были проведены парламентские слушания О государственной политике по предупреждению распространения в Российской Федерации заболеваемости инфекционным гепатитом, на которых было подчеркнуто, что эта проблема переросла из медицинской в общегосударственную, поскольку распространенность данных инфекций приобрела катастрофические масштабы и представляет реальную угрозу для здоровья нации [Парламентские слушания ГД ФС РФ, 2001].

Вместе с тем, в последние годы отмечается значительное изменение этиологической структуры инфекционных заболеваний. Среди микроорганизмов, вызывающих заболевания человека, стали чаще выявляться различные виды условно-патогенных возбудителей, в том числе простейших. В связи с этим все большую актуальность приобретает проблема паразитарных заболеваний, которые в РФ являются наиболее массовыми после гриппа и острых респираторных вирусных инфекций [Онищенко Г.Г., 2004].

Подчеркивая, что линфекция - это первая глава в патологии желудочно-кишечного тракта, - Г.Г. Онищенко (2004) указывал на явную недооценку значения кишечных паразитозов, возбудители которых могут оказывать как иммунодепрессивное воздействие, так и вызывать аллергизацию организма. Между тем, по данным ВОЗ, третье и четвертое места по массовости заболеваний занимают именно паразитарные инвазии: кишечные паразитозы и малярия, при этом число больных ежегодно составляет 14 миллиардов [ВОЗ, Доклад Комиссии по правам интеллектуальной собственности, инновациям и общественному здравоохранению, 2006].

Среди кишечных паразитарных объектов в настоящее время особый интерес вызывает Blastocystis hominis, который обитает преимущественно в толстой кишке и часто встречается у людей. Еще совсем недавно этих простейших не рассматривали в качестве этиологического фактора патологических состояний человека, а бластоцистоз считали не заболеванием, а лишь транзиторным носительством непатогенных микроорганизмов. В настоящее время доказана патогенная роль B. hominis в возникновении кишечной инвазии Ч бластоцистоза [Moe К. et al., 1998; Stenzel D., 1996; Yoshikawa H. 2000].

Простейшие Blastocystis hominis в кишечнике человека являются частью симбиотической системы микроорганизмов и оказывают влияние на ее равновесие. Для протозойных колитов характерен декомпенсированный дисбактериоз с выраженным снижением популяционного уровня облигатной микрофлоры, в первую очередь бифидо- и лактобактерий, обладающих высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. В связи с этим в кишечнике создаются условия для развития тех микробов, размножение которых при нормоценозе подавлено конкуренцией активных симбионтов [Muller H.E., 1994].

Нарушение биоценотических взаимоотношений между патогенными, условно-патогенными агентами и нормальной микрофлорой кишечника является одним из важнейших факторов, влияющих на развитие многих хронических заболеваний. Доказана роль дисбиоза толстой кишки в развитии хронических дерматитов [Person J. et al., 1986], однако, значение изменений микробиоценоза кишечника в течение хронических заболеваний печени до сих пор не получило однозначной оценки [Закиров И.Г., 2003; Радченко В.Г. и др., 2011].

Известно, что практически при всех изменениях в организме в патологический процесс вовлекается печень. Нарушения ее функций при различных заболеваниях неизбежно приводят к широкому кругу обменных, гормональных и гомеостатичесхих расстройств. Однако влияние патологии печени на развитие бластоцистной инвазии остается неизученным. Также остается открытым вопрос и о влиянии бластоцист на инфекционный процесс при ХГС. Не изучены клинические проявления бластоцистной инвазии у больных ХГС, клинико-лабораторные особенности течения дисбиоза кишечника, ассоциированного с бластоцистозом, и без него. Остается невыясненной роль Blastocystis hominis в формировании клинических проявлений у лиц с различной выраженностью поражения печени и его влияние на эффективность стандартных схем терапии ХГС. Выраженная генетическая неоднородность Blastocystis hominis диктует необходимость изучения распространения различных субтипов этих простейших у человека, в том числе и у больных ХГС. Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования.

Цель исследования. Дать клинико-лабораторную характеристику бластоцистной инвазии у больных HCV-инфекцией.

Задачи исследования.

1. Определить частоту встречаемости Blastocystis hominis у больных хроническим гепатитом С в зависимости от стадии заболевания.
2. Изучить особенности клинического течения хронического гепатита С у больных с сопутствующей бластоцистной инвазией.
3. Оценить состояние микрофлоры кишечника у больных хроническим гепатитом С и на основании молекулярно-биологического метода исследования определить спектр субтипов бластоцист, паразитирующих в кишечнике этих пациентов.
4. Научно обосновать эффективность предложенных схем коррекции дисбиоза с применением пробиотиков и антипротозойных препаратов у больных HCV-циррозом, ассоциированным с бластоцистной инвазией.

Научная новизна исследования. Уточнена частота встречаемости бластоцистной инвазии у жителей Санкт-Петербургского мегаполиса, впервые для этого региона установлены субтипы бластоцист, паразитирующих в кишечнике здоровых лиц и у больных хроническим гепатитом С. Дана оценка клинической значимости различных методов лабораторной диагностики бластоцистной инвазии и микроэкологических нарушений в кишечнике у больных хроническим гепатитом С.

Проанализированы особенности клинических проявлений протозойной инвазии у лиц с различной выраженностью поражения печени. На основе обширного клинического материала показана роль Blastocystis hominis в развитии дисбиоза кишечника у пациентов с хроническим гепатитом С и определены некоторые клинико-лабораторные показатели, свидетельствующие об участии Blastocystis hominis в патогенезе заболевания. Выявлена взаимосвязь между персистенцией Blastocystis hominis в толстой кишке и замедленной регрессией клинической симптоматики у пациентов с хроническим гепатитом С.

Полученные данные позволяют расширить теоретические представления о характере межмикробных и микробно-паразитарных взаимодействий, определяющих формирование микробиоценоза кишечника и поддержание дисбиотических нарушений у больных  хроническим гепатитом С, ассоциированным с Blastocystis hominis.

Практическая значимость. Высокая выявляемость бластоцист у больных хроническим гепатитом С, особенно на стадии цирроза печени, диктует необходимость паразитологического обследования таких пациентов с целью своевременной диагностики сопутствующей паразитарной инвазии. Для повышения эффективности лабораторной диагностики и идентификации субтипа бластоцист необходимо сочетать микроскопический метод с молекулярно-биологическим (ПЦР).

Наличие бластоцистной инвазии у больных хроническим гепатитом С приводит к развитию клинически выраженного дисбиоза кишечника, коррекция которого требует назначения не только пробиотических препаратов, но и использования антипаразитарных средств.

Применение комплексных пробиотических препаратов способствует более быстрому регрессу клинических проявлений бластоцистной инвазии и дисбиоза у больных хроническим гепатитом С, и позволяет добиться санации кишечника от паразита.

ичное участие автора в получении результатов. Автор провел паразитологическое обследование всех пациентов, принял непосредственное участие в их клиническом обследовании и лечении, организовал проведение лабораторных и инструментальных исследований. Диссертантом разработана формализованная карта обследования пациента, выполнено формирование базы данных, статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Нарушения функции печени у больных хроническим гепатитом С способствуют более частому формированию дисбиоза кишечника, характеризующегося снижением содержания облигатной флоры и увеличением условно-патогенной, причем степень его выраженности зависит от наличия бластоцист и стадии развития основного заболевания.
2. У больных хроническим гепатитом С формируются оптимальные условия для паразитирования в их кишечнике бластоцист. Формирующиеся условия способствуют обитанию зоонозных субтипов этих простейших, которые у здоровых лиц встречаются редко.
3. Наличие бластоцистной инвазии у больных хроническим гепатитом С диктует необходимость включения в программу лечебных мероприятий комплекса из антипаразитарных средств и пробиотиков.

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены в практическую деятельность кафедры и клиники инфекционных болезней ВМедА им. С.М. Кирова, Санкт-Петербургской городской инфекционной больницы №30 им. С.П. Боткина.

Результаты работы включены в план тематических занятий со студентами, слушателями, курсантами на факультетах подготовки врачей и последипломного образования, а также курсах повышения квалификации ВМедА им. С.М. Кирова.

Апробация и публикация материалов исследования. Основные положения и материалы диссертации доложены на Европейском конгрессе клинической микробиологии и инфекционных болезней (г. Лондон, 2012); VI международной научно-практической конференции Актуальные проблемы диагностики, лечения и профилактики инфекционных и паразитарных заболеваний (г. Ташкент, 2010); II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010); 10-ой Юбилейной научно-практической конференции молодых ученных лактуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, 2010).

По материалам исследования опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 6 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований), заключения, выводов и практических рекомендаций. Указатель литературы включает 172 источника, в том числе 53 отечественные и 119 зарубежные. Текст содержит 31 таблицу и 27 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Критерии включения: больные ХГС (анти-HCV л+, РНК HCV л+) на различных стадиях заболевания в возрасте от 18 до 59 лет. Критерии исключения: больные острым ГС, наркопотребители и употребляющие алкоголь пациенты.

Под наблюдением находилось 327 больных ХГС, средний возраст составил 33±1,5 года. Из них 226 (69,1%) мужчин и 101 (30,9%) женщина. В группу сравнения вошли 152 практически здоровых человека, репрезентативных по полу и возрасту.

В соответствии с задачами работы обследование пациентов включало: клинический осмотр по органам и системам, общие клинические анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, исследование крови на специфические маркеры вирусных гепатитов в ИФА, молекулярно-биологические исследования крови с использованием ПЦР для оценки качественного и количественного содержания РНК ВГС. Кроме этого проводили микроскопию окрашенных и нативных мазков кала, ПЦР диагностику протозойных инвазий (в кале) с детекцией генов штаммов Blastocystis, определение углеводов в кале (углеводный тест), микробиологическое исследование кала на дисбиоз кишечника, количественное ПЦР-определение основных представителей кишечной микрофлоры.

В зависимости от наличия или отсутствия бластоцистной инвазии и ЦП, больные ХГС были разделены на 4 группы наблюдения. Распределение обследованных больных по группам представлено в табл. 1.

Таблица 1

Распределение обследованных больных по группам

Показатели	Группы наблюдения				Всего
	Группа 1 ЦП-/БЛ+	Группа 2 ЦП-/БЛ-	Группа 3 ЦП+/БЛ+	Группа 4 ЦП+/БЛ-
Число больных	31	177	77	42	327
% больных от общего числа	9,5	54,2	23,5	12,8	100

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенные нами скрининговые паразитологические исследования  у пациентов с ХГС показали, что у каждого третьего больного (33%) обнаруживались бластоцисты. Чаще всего они определялись у пациентов в возрастной группе от 41 года до 60 лет. Инвазированность бластоцистами больных HCV-циррозом составляла 64,7%. Паразиты одинаково часто выявлялись как у мужчин, так и у женщин. Вместе с тем, среди лиц контрольной группы эти простейшие встречались достаточно редко - только у 5,3% людей.

При микроскопии мазков кала, приготовленных из нативных фекалий больных ХГС, обнаруживались вакуолярные формы бластоцист (в 65,5% случаев) размером от 10 до 50 мкм, число которых варьировало от 1 в 5-10 полях зрения до нескольких десятков в одном поле зрения. Описываемые в научной литературе амебовидные и цистные формы простейшего нами не были обнаружены ни в одном случае. При учете результатов паразитологических исследований с использованием методов седиментации (формалин-эфирный метод) было установлено, что выявляемость бластоцист резко ухудшалась, что было связано с их деформацией и частичным разрушением.

Сравнительный анализ традиционного метода обнаружения B. hominis и молекулярно-биологического показал, что при паразитологическом обследовании 327 пациентов с ХГС у 108 (33%) были микроскопически обнаружены бластоцисты. А при исследовании фекалий методом ПЦР с использованием тест-системы Blastocystis elongation factor 1-alpha gene (на антропонозный субтип 3) из 327 образцов положительными оказались лишь 39 (12%), при этом, из 108 образцов, в которых микроскопически обнаруживались бластоцисты, результаты ПЦР оказались позитивными в 15% случаев (16 проб).

Столь противоречивые данные позволили предположить, что в кишечнике пациентов с ХГС паразитиуют различные субтипы бластоцист, причем антропонозный субтип 3 не является доминирующим. Для подтверждения данной гипотезы было проведено повторное исследование того же материала методом ПЦР, но с использованием родоспецифических праймеров (Blastocystis 18 s ribosomal RNA gene). Результаты ПЦР-исследования показали наличие нуклеотидных последовательностей генома рода Blastocystis в 158 пробах из 327 (48,3%), что на 15,3% превысило результаты микроскопических исследований. Затем было проведено исследование всех образцов кала с использованием праймеров, специфичных для семи субтипов паразита.

Рис. 1. Частота обнаружения различных субтипов  бластоцист  у больных ХГС

По результатам генотипирования бластоцист от больных ХГС (158 чел.) было выявлено, что чаще всего определялись зоонозные субтипы этих простейших (75,3%). Одинаково, в 36,1% случаев выявлялись Subtypes 5 и 6, несколько реже - Subtype 3 (24,7%), а Subtype 1 регистрировался в 12% случаев. Следует также заметить, что у 8,9% больных ХГС было обнаружено присутствие одновременно двух субтипов этих простейших (Subtype 5 и Subtype 1) и при этом, ни в одном случае не были обнаружены Subtypes 2, 4 и 7 (рис. 1).

При генотипировании простейших, полученных от лиц из контрольной группы (без патологии печени), а также при  скрининговом исследовании, проведенном у 70 пациентов с бластоцистной инвазией без сопутствующей патологии печени, оказалось, что в 65,4% случаев метод ПЦР давал положительный результат на Blastocystis species subtype 3. При этом subtypes 5 и 6 не были обнаружены не в одном случае.

На момент поступления в стационар все больные ХГС предъявляли жалобы на снижение аппетита, недомогание и тошноту. Нередко у них наблюдались диарея и рвота. У большинства больных ХГС с бластоцистной инвазией отмечался выраженный синдром кишечной диспепсии. Так, при пальпации живота у пациентов 1 группы, отмечалась резкая болезненность левого отдела толстой кишки (35,5%), тогда как у больных без бластоцистной инвазии (2 группа) она отмечалась только в 12% случаев (р<0,05). Вместе с тем, болезненность поперечной ободочной кишки, правого отдела и по ходу всей толстой кишки встречались у пациентов обеих групп, а частота встречаемости этих признаков достоверно не отличалась друг от друга.

У пациентов с ЦП в ассоциации с бластоцистной инвазией симптомы желудочно-кишечной диспепсии имели тенденцию к усилению, а выраженная болезненность при пальпации живота имела отчетливую локализацию болей в левом отделе кишечника. У больных 3 группы при пальпации живота болезненность в проекции левого отдела толстой кишки отмечалась у 40 чел. (51,9%, р<0,05), поперечной ободочной кишки у 19 (24,7%), правого отдела толстой кишки у 8 (10,4%), а болезненность по ходу всей толстой кишки отмечали 10 чел. (13%). Напротив, у пациентов 4 группы болезненность при пальпации левого отдела толстой кишки определялась только в 9,5% (4 чел.), поперечной ободочной - в 16,7% (7 чел.), правого отдела - в 50% (21 чел., р<0,05) и по ходу всей толстой кишки - в 23,8% (10 чел.). Обращает на себя внимание и тот факт, что при пальпации живота у большей части пациентов 3 группы (75,3%) выявлен спазм толстой кишки, тогда как у пациентов 4 группы этот симптом выявлялся лишь у 12 человек (28,6%, р<0,05).

В большинстве случаев пациенты всех групп сравнения отмечали расстройство стула (88,9% - 1 группа, 67,2% - 2, 92,2% - 3 группа и 90,5% - 4). В 1 группе больных практически у каждого второго наблюдался мазевидный (типы 4 и 5 Бристольской шкалы фекалий) вязкий кал (48,4%), а у пациентов 3 группы (64,9%) - жидкий неоформленный (типы 6 и 7, р<0,05). В тоже время, в группе 2 у 58 чел. (32,8%) достоверно чаще (р<0,05) встречался оформленный стул (типы 3 и 4), а у пациентов с HCV-циррозом без бластоцистной инвазии (61,9%) чаще наблюдался мазевидный вязкий кал (р<0,05).

В копрограмме у всех больных на момент поступления в стационар выявлены патологические изменения. Обнаруживались мыла, лейкоциты, жир, кристаллы Шарко-Лейдена, переваримая клетчатка и слизь, что свидетельствовало о вовлечении в патологический процесс толстой кишки и недостаточности желчеотделения. Однако достоверные различия по этим показателям выявлены лишь у больных на терминальных стадиях основного заболевания. Так, у пациентов 3 группы в копрограмме достоверно чаще (р<0,05) определялись лейкоциты, переваримая растительная клетчатка, крахмал, мышечные волокна и кристаллы Шарко-Лейдена. В кале больных 4 группы чаще определялся нейтральный жир (р<0,05).

При определении содержания сахаров (моно- и дисахариды) в кале по методу Бенедикта у пациентов 1 и 2 групп сравнения различия отсутствовали (29% и 31,6% соответственно). Тогда как, в 3 группе углеводы в фекалиях определялись лишь у 7 чел. (9,1%), а у больных 4 группы в 61,9% случаев (26 чел., р<0,01). Выявлены достоверные различия в концентрации углеводов в кале у пациентов групп сравнения. В группе больных HCV-циррозом с B. hominis (3 группа) в 100% случаев концентрация была низкой (от 0,05 до 0,4%), схожие данные были получены и у больных 1 группы, в 66,7% случаев углеводы определялись в низкой концентрации (от 0,05 до 0,15%). В группах больных с HCV-инфекцией без бластоцистной инвазии (2 и 4 группы) концентрация сахаров имела разнонаправленный характер (от 0,05 до 2,0% и выше, р<0,05).

Установлены значимые различия в содержании бактероидов в кале у больных с бластоцистной инвазией и без (p<0,05). Количественный метод определения бактероидов (ПЦР) показал, что в группе больных ХГС и бластоцистной инвазией у 9 человек (29,0%, p<0,05) количество этих микроорганизмов было в пределах нормы (от 1010 до 1012). У 64,5% (20 человек) их количество было ниже нормы (p<0,05), а у 6,45% (2 человек) бактероиды не выявлены. При обследовании 2 группы у 31,5% (56 чел.) количество бактероидов было ниже нормы, а у 65,5% (116 чел.) в пределах нормы и у 3% (5 чел.) превышало норму и составляло 1013 в 1 г фекалий. В 3 группе больных нормальные показатели содержания бактероидов наблюдались только в 3,9% случаев (3 чел., р<0,05). У 64,9% (50 чел.). количество бактероидов было ниже нормы, а у 14,3% (11 чел.) они вовсе отсутсвовали. При обследовании 4 группы у 57,1% (24 чел.) количество бактероидов было ниже нормы, у 33,3% (14 чел.) в пределах нормы и у 4,8% (2 чел.) пациентов превышало норму и составляло 1013 в 1 г фекалий, у 2 пациентов (4,8%) они отсутствовали (р<0,05).

Общеклиническое исследование крови проводилось в первые сутки поступления больных в стационар. Изменения в составе периферической крови носили слабовыраженный и разнонаправленный характер. У больных ХГС с B. hominis, в периферической крови определялась тенденция к снижению гемоглобина и эритроцитов. В этой группе больных умеренная эозинофилия (от 6 до 10%) выявлялась у каждого второго пациента (51,6%). Во 2 группе больных повышенное содержание эозинофилов до 6% наблюдалось только у десяти человек (5,6%, р<0,05). У больных ЦП с B. hominis, в периферической крови определялось снижение гемоглобина, содержания эритроцитов и лейкоцитов, ускорение СОЭ (р<0,05). В этой группе больных умеренная эозинофилия (от 6 до 10%) выявлялась у 54 пациентов (70%). В 4 группе повышение эозинофилов до 6% наблюдалось только у 5 чел. (11,9%, р<0,05).

При исследовании основных биохимических показателей крови у пациентов групп сравнения достоверных различий выявить не удалось.

Изучение особенностей изменения микробиоценоза кишечника на разных стадиях HCV-инфекции было проведено в репрезентативных по полу и возрасту группах. В качестве группы сравнения использовали данные, полученные при обследовании 30 здоровых лиц, проживающих в Санкт-Петербурге.

Установлено, что лишь содержание бифидобактерий и эпидермального стафилококка не имело существенных различий в сравнении с контрольной группой. У всех больных ХГС помимо снижения концентрации облигатной нормальной микрофлоры выявлено увеличение концентрации условно-патогенной и появление бактерий с измененными свойствами. Наиболее выраженные изменения индигенной микробиоты кишечника были характерны для пациентов с HCV-циррозом, ассоциированным с бластоцистной инвазией (табл. 2).

Таблица 2

Показатели микробиоты кишечника больных HCV-инфекцией, ассоциированной с бластоцистной инвазией, и у здоровых лиц

Микроорганизмы	Количественное содержание микрофлоры (lg KOE/г)
	группа 1 ЦП-/БЛ+	Группа 3 ЦП+/БЛ+	Группа сравнения
Bifidobacterium spp.	9,70,4	9,20,2	10,10,6
Lactobacillus spp.	7,60,5*	7,50,1*	8,60,3
Escherichia coli	7,70,3*	7,30,2*	8,90,2
- лактозонегативная**	1,20,2*	2,60,4*	0,30,1
- гемолитическая	1,90,2	2,20,3	-
Bacteroides spp. **	8,70,2	7,20,1*	9,60,4
Enterococcus spp. **	6,60,3	7,90,2*	6,10,2
Proteus spp.	0,90,2	1,00,3	0,50,1
Klebsiella spp. **	1,40,2*	2,30,3*	0,20,06
Staphylococcus aureus	0,90,1	1,30,2	-
S. epidermidis	1,10,1	1,80,3	0,90,2
Clostridium spp. **	1,20,1	3,10,3*	0,80,1
Candida spp.	2,10,1*	2,70,4*	0,40,1

Примечания: * - достоверность различий показателей с группой сравнения (p<0,05);

** - достоверность различий показателей в группах наблюдения (р<0,05)

Как при HCV-циррозе, так и ХГС на дотерминальных стадиях, ассоциированных с бластоцистной инвазией, максимальное снижение количественных показателей отмечалось в отношении кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью (7,30,2 lg КОЕ/г и 7,70,3 lg КОЕ/г соответственно; в группе сравнения - 8,90,2 lg КОЕ/г, p<0,05). Уменьшение количества других представителей нормальной микрофлоры, таких как лактобациллы и бактероиды также было статистически значимым (p<0,05).

Проведенные исследования выявили значительные изменения в количественной и качественной составляющих микробиоценоза кишечника с частой выявляемостью условно-патогенных представителей семейства энтеробактерий.

У больных 3 группы уровень контаминации клебсиеллами превышал аналогичный показатель в группе сравнения в 11,5 раз, у пациентов 1 группы - в 7 раз.

Количество бактерий рода Proteus было в 2 раза выше при HCV-циррозе с бластоцистной инвазией и в 1,8 раза - при ХГС, ассоциированным с бластоцистозом, по сравнению с контролем (0,50,1 lg КОЕ/г).

Проведенные исследования выявили также достоверное превышение содержания клостридий у больных 3-ей группы по сравнению с контрольной (p<0,05). Если у обследованных из группы сравнения количество клостридий составляло 0,80,1 lg КОЕ/г, то у больных 3 группы данный показатель был выше в 3,9 раза. При ХГС увеличение содержания клостридий не было статистически достоверным.

Наибольшее увеличение содержания Candida spp. было выявлено у больных ЦП и бластоцистной инвазией (2,70,4 lg КОЕ/г; при ХГС - 2,10,1 lg КОЕ/г). В группе сравнения данный показатель не превышал 0,40,1 lg КОЕ/г (p<0,001).

При всех формах хронической HCV-инфекции у больных обнаруживался Staphylococcus aureus. Также у обследованных обнаружена кишечная палочка с нетипичными свойствами, однако гемолитическая E. coli, также как и S. aureus, обнаруживались только у больных хроническими заболеваниями печени (в группе сравнения они отсутствовали). Максимальные показатели их содержания отмечались у больных с HCV-циррозом в ассоциации с B. hominis (2,20,3 lg КОЕ/г). Повышение содержания лактозонегативной кишечной палочкой при всех нозологических формах хронической HCV-инфекции, по сравнению с контролем, было статистически значимым (p<0,05).

Изучение микробиоты кишечника у больных HCV-инфекцией без бластоцистной инвазии в сравнении с группой больных с HCV-инфекцией, протекающей на фоне бластоцистной инвазии, выявило достоверные изменения количественных показателей отдельных представителей микроценоза данного биотопа, однако явления дисбиоза при отсутствии бластоцистной инвазии были менее выраженными.

При ХГС без сопутствующей бластоцистной инвазии значимых изменений кишечного микробиоценоза выявлено не было. Обнаруженное уменьшение содержания облигатной микрофлоры кишечника может быть охарактеризовано как тенденция к снижению. Было выявлено одновременное уменьшение количества Bifidobacterium spp. (9,70,3 lg KOE/г), Lactobacillus spp. (8,30,2 lg KOE/г ), Escherichia coli с нормальной ферментативной активностью (8,50,4 lg KOE/г) и Bacteroides spp. (8,90,2 lg KOE/г). На фоне этих изменений отмечалось повышение содержания Enterococcus spp. (6,90,2 lg KOE/г), способных частично компенсировать утрачиваемую метаболическую активность бифидо- и лактофлоры (табл. 3).

Наиболее типичным для этой группы пациентов было увеличение количества дрожжеподобных грибов рода Candida spp. - 1,60,2 lg KOE/г против 0,40,1 у здоровых лиц (p<0,05). Повышение содержания таких условно-патогенных агентов как Proteus spp. (0,90,2 lg KOE/г ), Klebsiella spp. (0,90,4 lg KOE/г), S. epidermidis (1,10,3 lg KOE/г) не носило достоверный характер, однако выявлялось у абсолютного большинства пациентов. Еще одной типичной характеристикой дисбиотических процессов у этой группы больных было появление в составе кишечного микробиоценоза Staphylococcus aureus (0,40,2 lg KOE/г) и гемолитических эшерихий (1,10,2 lg KOE/г). Несмотря на то, что превышение концентрации этих микроорганизмов по сравнению со здоровыми лицами не было достоверным, общая тенденция формирования популяции условно-патогенных агентов, обладающей провоспалительной и протеолитической активностью, была типичной для абсолютного большинства обследованных больных.

Таблица 3

Количественные показатели микрофлоры кишечника больных HCV-инфекцией, протекающих без бластоцистной инвазии

Микроорганизмы	Количественное содержание микрофлоры (lg KOE/г)
	группа 2 ЦП-/БЛ-	группа 4 ЦП+/БЛ-	Группа сравнения
Bifidobacterium spp.	9,70,3	9,60,4	10,10,6
Lactobacillus spp.	8,30,2	8,10,3	8,60,3
Escherichia coli	8,50,4	8,40,2	8,90,2
- лактозонегативная**	0,90,2	1,30,2*	0,30,1
- гемолитическая	1,10,2	1,40,3	-
Bacteroides spp.	8,90,2	8,10,2	9,60,4
Enterococcus spp.	6,90,2	7,10,1*	6,10,2
Proteus spp.	0,90,2	1,00,1	0,50,1
Klebsiella spp.	0,90,4	1,10,3	0,20,06
Staphylococcus aureus	0,40,2	0,80,2	-
S. epidermidis	1,10,3	1,30,2	0,90,2
Clostridium spp. **	0,90,2	2,20,2*	0,80,1
Candida spp.	1,60,2*	1,80,2*	0,40,1

Примечания: * - достоверность различий показателей с группой сравнения (p<0,05);

** - достоверность различий показателей в группах наблюдения (р<0,05)

У пациентов 4 группы помимо выраженного увеличения количества дрожжеподобных грибов рода Candida spp.(до 1,80,2 lg KOE/г) было обнаружено достоверное увеличение концентрации лактозонегативных кишечных палочек (1,30,2 lg KOE/г против 0,30,1 у здоровых лиц, p<0,05), энтерококков (7,10,1 lg KOE/г против 6,10,2 у здоровых лиц, p<0,05), а также клостридий (2,20,2 lg KOE/г против 0,80,1 у здоровых лиц, p<0,05). При этом наблюдалось еще более значимое снижение количества индегенной флоры - Bifidobacterium spp. (9,60,4 lg KOE/г), Lactobacillus spp. (8,10,3 lg KOE/г ), Escherichia coli с нормальной ферментативной активностью (8,40,2 lg KOE/г) и Bacteroides spp. (8,10,2 lg KOE/г).

Таким образом, показано, что у больных хронической HCV-инфекцией наблюдаются значительные изменения показателей колонизации кишечника: количество нормальной микробиоты уменьшается, а условно-патогенной, наоборот, увеличивается. Выявленные нарушения нарастают по мере прогрессирования ХГС и достигают наибольшей выраженности на цирротических стадиях заболевания. При бластоцистной инвазии отмечается ускоренное формирование выраженных дисбиотических изменений в кишечнике пациентов, проявляющихся в раннем появлении нарушений, типичных для более поздних стадий ХГС.

У больных ЦП, ассоциированным с B. hominis, помимо микробиологических нарушений выявляются клинические проявления, требующие изменений комплексной терапии с включением в нее препаратов, целенаправленно влияющих на микробиоценоз кишечника и B. hominis.

С этой целью в комплекс лечебных мероприятий пациентов с ЦП, помимо стандартного лечения (дезинтоксикационная терапия, витаминотерапия, диуретики), была включена противопаразитарная терапия и проведена коррекция дисбиоза кишечника пробиотиком.

В качестве антипаразитарного препарата больным назначали метронидазол по 250 мг 3 раза в сутки через час после еды в течение 7 дней. В качестве пробиотика применяли Линекс по 2 капсулы 3 раза в день сразу после еды в течение 10 дней. Лечение проводили с учетом тяжести заболеваний, информации об эффективности предыдущих курсов лечения, сопутствующей патологии и данных о непереносимости медикаментов.

Были сформированы 3 группы пациентов с HCV-циррозом для оценки эффективности различных схем терапии. В каждую группу было включено по 25 пациентов. Группы были репрезентативны по полу и возрасту.

Первая группа (М) получала метронидазол. Больные второй группы (Л) получали Линекс, а третья (М+Л) - комбинацию из метронидазола и Линекса. Эффективность терапии оценивали по нескольким показателям: элиминация B. hominis, динамика клинических проявлений, переносимость препаратов, изменение степени тяжести дисбиоза.

Проведенные исследования показали, что на 5 день проводимой терапии бластоцисты обнаруживались у всех пациентов групп сравнения. После окончания курса лечения метронидазолом (10-ый день наблюдения) у 10 пациентов (40%) первой группы (М) продолжали обнаруживаться B. hominis. К 25 дню наблюдения все пациенты первой группы (М) отмечали улучшение своего состояния здоровья, однако у 4 из них (16%) продолжали обнаруживаться бластоцисты в небольшом количестве (1-2 в поле зрения).

Похожая картина наблюдалась у пациентов второй группы (Л). На 10 день наблюдения бластоцисты при световой микроскопии мазков фекалий обнаруживались у 7 чел. (28%). На 25 день исследования - только у 3 (12%), при этом число бластоцист на 2-3 поля зрения составляло 1-2 экз.

Наиболее эффективной схемой оказалась комбинированная (метронидазол + Линекс). К 10 дню наблюдения лишь у 3 пациентов (12%) обнаруживались единичные бластоцисты, а на 25 день наблюдения у всех больных бластоцисты микроскопически не выявлены.

Спектр и продолжительность основных симптомов у пациентов групп сравнения на фоне проводимой терапии были сопоставимы. При оценке уровня достоверности по Wald-Wolfowitz Runs Test статистически значимые различия выявлены лишь по нескольким показателям. Так, длительность жалоб на общую слабость, головную боль, тошноту, рвоту, головокружение, а также на адинамию были статистически не значимы (p>0,05). Продолжительность жалоб на метеоризм, вздутие и урчание в животе у больных первой группы (М) была больше, чем у пациентов второй (Л) и третей групп (p<0,05). Наиболее выраженными различия были в продолжительности сохранения отрыжки и дискомфорта в эпигастрии (p<0,01).

На фоне проводимого лечения клиническая симптоматика достоверно быстрее регрессировала у пациентов второй (Л) и третьей группы (М+Л). Сроки наступления регресса клинических симптомов (вздутие живота, отрыжка, дискомфорт в эпигастрии) были сокращены с 4 суток до 1. При назначении Линекса в режиме монотерапии отмечен наиболее быстрый регресс основных симптомов кишечной диспепсии (тошнота, рвота, вздутие, отрыжка).

После проведенной этиотропной терапии показатели копрограммы (25 день наблюдения) значительно приблизились к норме. Так, мышечные волокна, кристаллы Шарко-Лейдена и мыла в несколько раз реже обнаруживались по сравнению с результатами копрограммы в день поступления. Эритроциты определялись лишь у одного пациента второй группы (Л) сравнения. Лейкоциты чаще определялись у пациентов первой группы (p<0,05), но при изучении установлено их снижение в 2,4 раза по сравнению с исследованиями, проведенными в день поступления в стационар. Также следует отметить, что в кале больных третьей группы (М+Л) чаще определялся крахмал (p<0,05).

Проведенные исследования по определению содержания моно- и дисахаров в кале показали, что в 3 группе (М+Л) наблюдения у 11 человек (44%) в фекалиях определялись углеводы методом Бенедикта. Во второй группе (Л) наблюдения углеводы определялись у 6 человек (24%), а в первой (М) - лишь у 3 (12%).

Достоверных различий в изменениях показателей гемограммы у больных всех групп выявлено не было, за исключением содержания эозинофилов. По сравнению с исходными данными их количество снизилось до 3,90,16 (без статистически значимых различий в группах сравнения, р>0,05). Также не выявлены различия в основных биохимических показателях среди пациентов трех групп наблюдения.

У пациентов 1 группы (М) к 25 дню восстановление микробиоценоза было зарегистрировано только у 4 больных (16%). У остальных продолжали определяться нарушения, вплоть до дисбиоза 3 степени (8%).

Во 2-ой (Л) и 3-ей (М+Л) группах наблюдения после окончания терапии отмечалось восстановление микрофлоры кишечника в 48% и 56% случаев соответственно (p<0,05, по сравнению с 1 группой). Также обращало на себя внимание достоверное различие в частоте встречаемости дисбиоза второй степени тяжести у больных 1-ой группы (32%) в сравнении с 2-ой и 3-ей (12% и 8% соответственно, p<0,05). В остальных случаях сохранялся дисбиоз 1 степени.

Классическая схема терапии ХГС с применением метронидазола не обеспечивала элиминацию из кишечника B. hominis. При назначении этого препарата отмечается более длительное сохранение жалоб на общую слабость, тошноту, рвоту, урчание в животе, отрыжку, дискомфорт в эпигастрии, в генезе которых может принимать участие и метронидазол.

Введение в состав комплексной терапии препарата с целенаправленным действием на кишечный микробиоценоз - Линекса, способствовало не только уменьшению выраженности дисбиотических изменений в кишечнике, но сокращало длительность жалоб и клинических проявлений заболевания, а также потенцировало антипаразитарный эффект метронидазола. Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что у абсолютного большинства больных ХГС с сопутствующей инвазией B. hominis отмечено снижение частоты выявления, плотности популяции и размеров этого простейшего. Данные наблюдения подтверждают роль дисбиотических нарушений в формировании и дальнейшим существовании протозойно-бактериальных ассоциаций в кишечнике больных ХГС. При наличии ограничений или противопоказаний к применению метронидазола у этой группы больных противопаразитарная и пробиотическая терапия может проводиться только с применением комплексного пробиотика Линекс.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что у каждого третьего больного с HCV-инфекцией выявляются простейшие Blastocystis, а на терминальных стадиях основного заболевания частота встречаемости этого паразита увеличивается. У больных ХГС антропонозный субтип бластоцист (Blastocystis species subtype 3) встречается относительно редко, лишь у 24,7%. В подавляющем большинстве случаев обнаруживаются бластоцисты других (зоонозных) субтипов (1, 5 и 6). Также у пациентов с этой инвазией в периферической крови отмечается достоверно значимое снижение уровня гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов, ускорение СОЭ и умеренная эозинофилия. У больных ХГС в ассоциации с бластоцистной инвазией наблюдается увеличение частоты встречаемости симптомов желудочно-кишечной диспепсии, выраженная болезненность при пальпации в левом отделе живота и достоверно чаще регистрируется неоформленный (мазевидный или жидкий) стул, с резким снижением в нем углеводов и бактероидов. Показано, что у больных с HCV-инфекцией наблюдаются значительные изменения показателей колонизации кишечника: количество нормальной микробиоты снижено, а условно-патогенной, наоборот, увеличено. Указанные нарушения, характерные для дисбиоза, в наибольшей мере выражены при ХГС на терминальных стадиях. При наличии бластоцистной инвазии эти изменения еще более усугублены. Доказано, что для элиминации паразита и регресса основных симптомов требуется комбинированное лечение с использованием антипротозойного препарата (метронидазол) и пробиотика (Линекс).

ВЫВОДЫ

1. Частота встречаемости Blastocystis hominis у пациентов с хроническим гепатитом С составляет 33%, тогда как у практически здоровых жителей Санкт-Петербургского мегаполиса этот показатель не превышает 5,3%. У больных HCV-циррозом бластоцисты выявляются значительно чаще (64,7%).
2. Клиническая картина хронического гепатита С в сочетании с бластоцистной инвазией характеризуется более выраженным синдромом желудочно-кишечной диспепсии, особенно с поражением левого отдела толстой кишки, а также часто встречающимися признаками гемоколита и поражения тонкой кишки. У пациентов с циррозом печени эти клинические проявления носят более выраженный характер. Гематологическим признаком участия Blastocystis hominis в инфекционном процессе при хроническом гепатите С является эозинофилия, уровень которой коррелирует с количеством бластоцист в кишечнике.
3. У больных хроническим гепатитом С, протекающим на фоне бластоцистной инвазии, наблюдаются выраженные дисбиотические нарушения в толстом отделе кишечника. Это проявляется снижением количества облигатной микрофлоры (Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Esherichia coli с типичными свойствами) на фоне увеличения частоты встречаемости условно-патогенных микроорганизмов (Clostridium spp., Klebsiella spp., Staphylococcus aureus и грибы рода Candida). Выявленные нарушения более характерны для больных на стадии цирроза печени.
4. Проведенное генотипирование бластоцист позволило установить, что у пациентов с хроническим гепатитом С в кишечнике паразитируют преимущественно зоонозные субтипы (Subtype 1, 5 и 6) этих простейших (75,3%), тогда как антропонозный субтип (Subtype 3) встречается относительно редко (24,7%), вместе с тем, у людей без сопутствующей патологии печени Subtype 3 является доминирующим (64,5%).
5. Применение антипротозойных препаратов и пробиотиков в комплексной терапии HCV-цирроза у пациентов с бластоцистной инвазией позволяет добиться иррадиации Blastocystis hominis (к 25 дню терапии), сокращает сроки наступления регресса клинической симптоматики (с 4 суток до 1) и продолжительность стационарного лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для повышения эффективности лабораторной диагностики Blastocystis hominis целесообразно использовать не только микроскопические, но и молекулярно-генетические методы с расширенным набором праймеров для определения субтипов этих простейших.
2. Метод формалин-эфирного обогащения для диагностики бластоцистной инвазии мало информативен, особенно в случаях низкого уровня паразитемии. При невозможности проведения паразитологических исследований испражнений в ближайшие 2 часа от момента дефекации, необходимо осуществлять отбор материала в консервант (Сафаралиева, Турдыева  и др.), что позволяет проводить отсроченные паразитологические исследования.
3. Выявленные нарушения микробиотической системы кишечника у больных ХГС с бластоцистной инвазией являются показаниями к включению в комплекс лечебных мероприятий метронидазола  по 250 мг 3 раза в сутки через час после еды в течение 7 дней и Линекса по 2 капсулы 3 раза в день сразу после еды в течение 10 дней.
4. В целях динамической оценки протозойной инвазии в выписном эпикризе целесообразно отмечать наличие Blastocystis hominis и указывать среднее количество паразитов в поле зрения. Контрольные исследования мазков фекалий следует проводить через 30 суток после этиотропной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жданов К.В. Протозойные инвазии желудочно-кишечного тракта у больных хроническими вирусными гепатитами / К.В. Жданов, С.С. Козлов, А.С. Сигидаев // Материалы II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - М., 2010. - С.110.
2. Жданов К.В. Blastocystis Hominis у пациентов с диарейным синдромом и хроническими вирусными гепатитами / К.В. Жданов., А.В. Ласкин., А.С. Сигидаев, С.С. Козлов, С.М. Захаренко, И. Ю. Несмачная // Материалы IX Республиканского съезда эпидемиологов, гигиенистов, санитарных врачей и инфекционистов Узбекистана. - Ташкент, 2010.  - С. 60 - 61.
3. Сигидаев А.С. Встречаемость Blastocystis Hominis у больных с патологией желудочно-кишечного тракта / А.С. Сигидаев, А.В. Ласкин, И. Ю. Несмачная, С.С. Козлов, С.М. Захаренко // Материалы 10-ой Юбилейной научно-практической конференции молодых ученных лактуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. - СПб, 2010. - С.209.
4. Жданов К.В. Оценка степени изменений микробиоценоза кишечника у больных хроническими диффузными заболеваниями печени вирусной и невирусной этиологии / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, Д.М. Шахманов, К.В. Козлов, А.С. Сигидаев, М.В. Куртуков, В.С. Сукачев, С.М. Захаренко // Журнал инфектологии - 2010. - Т.2, №4 - С. 65 - 66.
5. Жданов К.В. Синдром избыточного бактериального роста у больных хроническим гепатитом С / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, С.М. Захаренко, К.В. Козлов, А.С. Сигидаев, М.В. Куртуков, В.С. Сукачев // Журнал инфектологии Ц 2011. Ц Т.3, №4 Ц С. 98 - 101.
6. Сигидаев А.С. Лабораторная характеристика бластоцистной инвазии у больных с хроническими вирусными гепатитами / А.С. Сигидаев, В.С. Сукачев, М.В. Куртуков, К.В. Жданов, С.С. Козлов, К.В. Козлов, А.В. Ласкин, Е.А. Тарасова, М.А. Суворова // Журнал инфектологии Ц 2011. Ц Т.3, №4 Ц С. 62 Ц 66.
7. Жданов К.В. Характеристика синдрома избыточного бактериального роста у больных хроническим гепатитом С / К.В. Жданов, С.М. Захаренко, Д.А. Гусев, К.В. Козлов, А.С. Сигидаев, М.В.Куртуков, В.С. Сукачев // Инфекционные болезни - 2012. - Т.10, Прилож. №1 - С. 140.
8. Жданов К.В. Применение цитруллина малата в комплексной терапии печеночной энцефалопатии у больных циррозом печени / К.В. Жданов, С.М. Захаренко, Д.А. Гусев, К.В. Козлов, М.В. Куртуков, В.С. Сукачев, А.С. Сигидаев // Новые Санкт-Петербургские врачебные ведомости - 2012. - № 1-С. 49 - 55.
9. Сигидаев А.С. Особенности бластоцистной инвазии у больных хроническими вирусными гепатитами и у детей / А.С. Сигидаев, М.А. Суворова, С.С. Козлов, С.М. Захаренко // Журнал инфектологии - 2012. - Т.4, Прилож. №3 - С. 91 - 92.
10. Tarasova Е.A. Distribution of Blastocystis genotypes colonization among the children with gastrointestinal disorders in Saint Petersburg / E.A. Tarasova, М.A. Suvorova, А.S. Sigidayev, А.N. Suvorov // 22nd ECCMID 2012. - London, United Kingdom, 2012. - Abst. № 2769.
11. Жданов К.В. Оценка эффективности антипротозойной комплексной терапии бластоцистной инвазии у больных с HCV циррозом / Жданов К.В., Козлов С.С., Гусев Д.А., Захаренко С.М., Козлов К.В., Сукачев В.С., Сигидаев А.С. // Материалы Всероссийского конгресса к 180-летию выдающегося русского врача-терапевта С.П. Боткина. - СПб, 2012. - С. 40.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЛ - бластоцисты

ВГС - вирус гепатита С

КОЕ - колониеобразующая единица

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

ХГС - хронический гепатит С

ЦП - цирроз печени

B. hominis - Blastocystis hominis

HCV - вирус гепатита С

spp. - species

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии