Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

МАЛЫШЕВ Алексей Юрьевич

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПОВЕДЕНИЯ У ЖИВОТНЫХ

С ПРОСТОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМОЙ: СРАВНИТЕЛЬНЫЙ НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2011 г.

Диссертация выполнена в лаборатории клеточной нейробиологии обучения (заведующий - д.б.н., профессор П. М. Балабан) Учреждения Российской академии наук Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор - д.б.н., профессор 

П. М. Балабан)

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Павел Милославович Балабан

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Дмитрий Антонович Сахаров

доктор биологических наук Халил Латыпович Гайнутдинов

доктор биологических наук Елена Владимировна Савватеева-Попова

Ведущее учреждение:

Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита состоится 26 октября 2011 года на заседании Специализированного ученого совета (Д.002.044.04) при Учреждении Российской академии наук Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН по адресу: 117865, Москва, ул. Бутлерова, д. 5А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Автореферат разослан л___ _________ 2011 г.

Ученый секретать

Диссертационного совета

Доктор биологических наук, профессор В. В. Раевский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что даже небольшие изменения в организации нейронной сети могут приводить к значительным изменениям в поведении животного (Katz and Harris-Warrick, 1999). Изучая то, как у таксономически близких видов организованы нейронные сети, контролирующие одни и те же виды поведения, и сравнивая между собой различия в функционировании этих сетей, можно понять общие принципы строения и эволюции нервной системы (Arbas et al., 1991; Katz,1991; Paul, 1991; Katz and Harris-Warrick, 1999). В свое время сравнительная анатомия обеспечила колоссальный вклад в развитие теоретической и эволюционной биологии. Сравнительная нейроэтология в наше время помогает понять, каким образом в процессе эволюции осуществлялось развитие тех или иных нейронных механизмов, приведших в итоге к возникновению сознания.

Одной из основ сравнительной нейробиологии является понятие о гомологичных нейронах (Сахаров, 1974; Weiss and Kupfermann, 1976; Granzow and Rowell, 1981; Pentreath et al., 1982; Croll, 1987). Вообще, гомологичными называются структуры, связанные общностью происхождения, т.е. восходящие к одной и той же предковой структуре (Сахаров, 1974). Однако, несмотря на наличие множества общих признаков у гомологичных нейронов беспозвоночных, детали их функционирования зачастую различаются, что отражает эволюционные приспособления поведения к разным условиям существования. Таким образом, сравнивая между собой гомологичные нейронные сети не только у представителей одной таксономической группы, но и у животных, находящихся на разных ступенях эволюционного развития, мы можем проследить, как эволюционный процесс лапробирует разные модели организации нейронной сети и затем закрепляет наиболее удачные схемы.

Неоднократно подчеркивалось, что моллюски являются прекрасным объектом для изучения нейронных механизмов поведения. Главными достоинствами этого объекта являются сравнительно просто устроенная нервная система и наличие стереотипных, четко различимых между собой типов поведения. Все это дает уникальную возможность проследить, как изменения в функционировании нейронов (в  том числе на клеточном и молекулярно-генетических уровнях) отражаются в поведении целого животного. Подобная задача до сих пор трудно реализуема на позвоночных животных. Другим, неоправданно редко упоминаемым достоинством моллюсков как объекта нейробиологических исследований является возможность работы на так называемом полуинтактном препарате. Полуинтактный препарат представляет собой зачастую целое животное, в необходимой степени зафиксированное и отпрепарированное таким образом, чтобы обеспечить доступ к ЦНС. С одной стороны, такой препарат предоставляет исследователю прекрасную возможность внутриклеточной регистрации и стимуляции нейронов, а с другой, позволяет наблюдать  элементы целостного поведения и проводить адекватную сенсорную стимуляцию животного.

Одним из основных постулатов, лежащих в основе исследований нервной системы беспозвоночных животных, является тезис о том, что фундаментальные механизмы развития и функционирования нервной системы остаются схожими от вида к виду в процессе эволюции. Как пишут С. Куффлер и Дж. Николлс в предисловии к первому изданию своей книги От нейрона к мозгу, Е в мозге всех исследованных животных существует четкое единообразие принципов нейронной организации. Таким образом, при известном везении примеры из лобстера или пиявки будут иметь отношение к нашей собственной нервной системе (Kuffler and Nicholls, 1976).

В то же время, как справедливо замечает Николлс в последнем издании своей книги, не все работы, выполняемые на ЦНС беспозвоночных, непременно имеют цель понять механизмы работы мозга человека (Николлс и др., 2008). Понять то, каким образом сравнительно простая нервная система контролирует зачастую очень сложное поведение, обеспечивающее выживание особи в непростых условиях окружающей среды, само по себе является чрезвычайно интересной и важной задачей.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение не описанных ранее нейронных механизмов поведения крылоногого моллюска Clione limacinа L., наземной улитки Helix lucorum L. и проведение сравнительного нейрофизиологического анализа найденных механизмов путем сопоставления с уже известными нервными механизмами аналогичных типов поведения у других брюхоногих моллюсков. Согласно вышеопределенной цели исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить нейронные механизмы скоординированной активности трех различных структур, вовлеченных в  пищевое поведение Clione limacina.
2. Изучить принципы нейронной регуляции активности сердечно-сосудистой системы Clione при разных типах поведения, требующих разнонаправленных изменений в работе сердечно-сосудистой системы.
3. Провести анализ нейронной сети, лежащей в основе пассивно-оборонительного поведения виноградной улитки.

Научная новизна исследования

Впервые описаны нейронные сети, контролирующие движение уникальных структур буккального аппарата гимносомат - крючков. Описаны нейронные механизмы, лежащие в основе фазовозависимой координации активности крючков и радулы во время пищевого поведения Clione. В работе был применен принципиально новый подход, заключающийся в том, что, используя данные об организации мотонейронной сети, иннервирующей исследуемую анатомическую структуру, можно сделать вывод об эволюционном происхождении этой структуры. Полученные поведенческие и нейрофизиологические данные об активности радулы и крючков у Clione в сравнении с соответствующими данными об активности радулы и челюстей у родственных видов моллюсков указывают на то, что более вероятным эволюционным сценарием является происхождение крючков у Clione от маргинальных зубов радулы, нежели от челюстей, причем этом вывод совпадает с результатами  сравнительно-морфологических исследований.

Впервые описан новый элемент нейронных механизмов пищевого поведения моллюсков, представленный активацией ресничного эпителия в пищеводе Clione идентифицированными нами пептидергическими буккальными нейронами. Описана новая функция для гигантских церебральных серотониновых клеток (существующих у всех изученных видов брюхоногих) - серотонинергическая регуляция активности ресничного эпителия в пищеводе Clione.

В плевральных ганглиях виноградной улитки были впервые идентифицированы первично-сенсорные нейроны, опосредующие передачу тактильной информации в нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки, что долгие годы являлось недостающим звеном при исследовании нейронных механизмов пластичности оборонительного поведения на этом объекте.

Впервые показано, что амплитуда кальциевых сигналов, сопровождающих высокоамплитудные ВПСП в командных нейронах виноградной улитки, линейно зависит от силы синаптической стимуляции, в то время как динамика изменения амплитуды самих ВПСП при увеличении силы стимуляции демонстрирует выраженное насыщение.

Научно-теоретическое и практическое значение работы

В настоящей работе предложен новый метод определения эволюционного происхождения анатомических структур, основанный на анализе иннервирующих их нейронных сетей и сопоставлении с данными о структурах соответствующих нейронных сетей, полученных на родственных видах животных.

Виноградная улитка Helix lucorum является широко используемым объектом для изучения нейронных механизмов поведения и, в особенности, механизмов пластичности поведения. Идентифицированные в настоящей работе нейроны и синаптические связи в цепи оборонительного поведения виноградной улитки в настоящее время широко используются исследователями в качестве модели для изучения нейронных механизмов обучения и памяти.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Используя данные об организации нейронной сети, иннервирующей данную анатомическую структуру, можно сделать вывод о ее эволюционном происхождении. Собрав вместе поведенческие и нейрофизиологические данные о механизмах контроля активности радулы и крючков у Clione и сравнивая их с соответствующими данными об активности радулы и челюстей у аплизии, мы склоняемся к выводу, что более вероятным эволюционным сценарием является происхождение крючков у Clione от маргинальных зубов радулы, нежели от челюстей.
2. Один и тот же гомологичный идентифицирумый нейрон у эволюционно близких видов демонстрирует командный или модуляторный принцип управления нейронной сетью в зависимости от степени стереотипности поведения, в контроль которого он вовлечен.
3. Один и тот же нейропептид может быть задействован в нейронных механизмах совершенно разных и зачастую функционально противоположных типов поведения у разных представителей одной и той же таксономической группы животных, в то время как роль классических медиаторов в нервном контроле поведения более консервативна.

Апробация работы

Материалы диссертации многократно докладывались на отечественных и международных симпозиумах и конференциях.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 18 статей в реферируемых журналах, из них 3 в отечественных и 15 в международных журналах.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, пяти глав результатов с их предварительным обсуждением, общего обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация проиллюстрирована 116 рисунками и содержит 1 таблицу.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была выполнена на двух видах брюхоногих моллюсков: морском крылоногом моллюске Clione limacina и виноградной улитке Helix lucorum.

Электрофизиологические исследования проводили на полуинтактных препаратах или на препаратах изолированной ЦНС. Внутриклеточная регистрация активности нейронов и стимуляция клеток осуществлялись при помощи стеклянных микроэлектродов. Электрофизиологические сигналы были усилены, оцифрованы и записаны на компьютере с использованием общепринятых методов. Для изучения морфологии исследуемых нейронов и для экспериментов с двойным мечением в раствор для заполнения электродов добавляли витальный краситель (карбоксифлуоресцеин, нейробиотин, AlexaFluor, люцифер желтый и др.), который ионофоретически вводился в клетку путем пропускания через электрод импульсов тока необходимой полярности. Затем в части случаев живые препараты наблюдались под эпифлуоресцентным микроскопом или же препараты подвергались фиксации с последующим проявлением красителя при помощи различных систем усиления сигнала (флуоресцентно меченый стрептавидин или антитела к красителю). После этого морфология изучаемых нейронов анализировалась при помощи эпифлуоресцентных микроскопов Nikon (Tokyo, Japan), Olympus BX51W или лазерных сканирующих конфокальных микроскопов BioRad MRC 600 (Hercules, USA) и Zeiss LSM 5 Live.

В экспериментах с регистрацией движений изучаемых структур на полуинтактном препарате CCD видеокамера монтировалась на бинокулярный микроскоп, находящийся в электрофизиологической установке. Видео оцифровывалось при помощи видео-конвертера Pinnacle-700 и записывалось на компьютере. Для синхронизации видео- и внутриклеточных записей один из каналов внутриклеточного усилителя подавался параллельно на аудиоканал видеоконвертера. Видеозаписи обрабатывались при помощи программы PhysVis (Kenyon College, USA). Перемещение интересующей структуры отслеживалось покадрово и затем откладывалось как функция времени.

Регистрацию активности дыхальца в экспериментах на полуинтактном препарате Helix lucorum осуществляли при помощи фотодиода, который измерял интенсивность светового пучка, проходящего через дыхальце. Тактильное раздражение кожи осуществлялось при помощи электромеханического стимулятора с фиксированной интенсивностью давления в 1г (диаметр кончика составлял 0,05мм).

Для иммунохимического окрашивания и экспериментов с двойным мечением полуинтактные препараты фиксировались в 4% параформальдегиде 2-3 часа при комнатной температуре или 12 часов при +4С. При окраске антителами к ГАМК препараты фиксировали в смеси 4% параформальдегида и 0,1% глютаральдегида. При окрашивании препаратов антителами к пептидам CNP-семейства применялся 4% раствор параформальдегида, насыщенный пикриновой кислотой. После фиксации препараты промывались 12 часов в PTA (PBS с 0,5% Тритон Х-100 и 0,01% азидом натрия). Затем препараты выдерживали 6 часов в блокирующем растворе, представляющем собой 8% раствор специфической сыворотки (чаще всего козьей) и 5% бычьего сывороточного альбумина в PTA. Блокирующий раствор использовался в дальнейшем и для разведения первичных и вторичных антител. Препараты инкубировались 48 часов в первичных антителах (обычно использовали разведения 1:100 - 1:200) и после 12-часовой отмывки в PTA выдерживались 36 часов во вторичных антителах (1:40) при +4С. Затем, после 12-часовой отмывки, препараты обезвоживались в спиртовых растворах, просветлялись в ксилоле и заливались в DPX. Препараты анализировались при помощи эпифлуоресцентных или  конфокальных микроскопов (см. выше).

При изучении функции ресничного эпителия в пищеводе Clione применялись две различные методики. В обоих случаях пищевод разрезался вдоль и раскалывался на дне чашки Петри, покрытой Силгардом, ресничным эпителием вверх и помещался под объектив микроскопа. В одном случае изображение бьющихся ресничек проецировалось на 80Х80 CCD камеру комплексной установки для оптической регистрации NeuroCCD (RedShirtImaging, USA). Биение ресничек создавало флуктуации проходящего светового потока, которые регистрировались CCD камерой с частотой дискретизации 125Гц. Затем по каждому каналу оптически записанных осцилляций строились спектры мощности Фурье, по которым определялась доминантная частота биения ресничек в данном участке пищевода. В другой части экспериментов на тот же микроскоп устанавливалась компактная CCD видеокамера, регистрирующая транспорт пятен краски по поверхности пищевода, возникающий вследствие активности ресничного эпителия. Затем при помощи специально разработанного программного обеспечения мы измеряли скорость перемещения капель краски по ограниченному участку пищевода на видеозаписи.

Для оптической регистрации изменения внутриклеточной концентрации ионов кальция исследуемые нейроны виноградной улитки после снятия тонких оболочек инъецировались кальций-чувствительным красителем OregonGreen 488 BAPTA-1 (Molecular Probes, USA). После инкубации в течение 60 мин при +4С препарат помещался под объектив эпифлуоресцентного микроскопа Olympus BX51W, и в нейрон вводился стандартный микроэлектрод для внутриклеточной регистрации. Затем изображение флуоресцирующих отростков нейрона, заполненного OregonGreen, проецировалось на высокочувствительную CCD камеру, и изменение светимости нейритов, отражающее изменение внутриклеточной концентрации кальция, регистрировалось при помощи комплексной установки NeuroCCD (RedShirtImaging, USA). Запись внутриклеточной активности нейрона и, при необходимости, стимуляция осуществлялись параллельно оптической регистрации при помощи соответствующих стандартных методов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 НЕЙРОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПИЩЕВОГО ПОВЕДЕНИЯ

3.1.1. Нейронные основы фазово-зависимой координации активности буккального аппарата Clione

Координация между различными двигательными центрами в нервной системе является необходимым условием для реализации сложных форм поведения как у позвоночных, так и у беспозвоночных животных. В нашей работе были идентифицированы нейронные механизмы координации активности разных буккальных  структур, участвующих в пищевом поведении морского ангела Clione limacina.

Морские ангелы являются хищными моллюсками и питаются родственными им видами также крылоногих, но облаченных в раковину моллюсков из подотряда текосомата (твердотелые) вида Limacina helicina (Lalli, 1970). Непосредственный контакт головной части Clione с Limacina вызывает резкую протракцию трех пар специализированных структур - буккальных щупалец Clione, которые осуществляют захват жертвы. После поимки жертвы Clione начинает быстро манипулировать щупальцами таким образом, чтобы отверстие раковины Limacina оказалось напротив ротового отверстия Clione (Lalli, 1970). После этого происходит экстракция тела жертвы из раковины Ц  наступает консуматорная стадия пищевого поведения. На этой стадии Clione также использует специализированные пищевые структуры, возникшие в эволюции исключительно у гимносомат, - хитиновые крючки (Рис. 1). Помимо крючков, Clione обладает также общей для всех брюхоногих радулой, которая представляет собой подвижный мышечный орган, покрытый тонкой кутикулой и несущий твердые зубцы, расположенные  поперечными рядами (Догель, 1981). Активно действуя крючками и радулой, Clione вытаскивает тело лимацины из раковины.

Таким образом, существуют три главные структуры, участвующие в пищевом поведении Clione: во-первых, это головные (буккальные) щупальца, обеспечивающие захват жертвы, во-вторых, это хитиновые крючки, и в-третьих, - радула. Детальный видеоанализ пищевого поведения Clione показал, что при экстрации тела лимацины крючки и радула работают ритмично и строго синхронизованно - протракция крючков всегда соответствует ретракции радулы и наоборот (Рис. 2). Таким образом, крючки и радула работают поочередно наподобие того, как человек чередует левую и правую руки при вытягивании веревки. Движение крючков и радулы полностью контролируется нейронами буккального ганглия. Нами была проведена детальная идентификация буккальных мотонейронов, контролирующих движения крючков и радулы. Всего было описано четыре типа мотонейронов: протракторы и ретракторы крючков (Бк-ПК и Бк-РК) (Рис. 3) и протракторы и ретракторы радулы (Бк-ПР и Бк-РР). Применение общепринятых нейрофизиологических критериев позволило убедиться, что все идентифицированные клетки являются именно мотонейронами.

Во время эпизодов спонтанной или индуцированной пищевой активности буккальной массы наблюдались следующие фазовые взаимоотношения активности буккальных мотонейронов: 1) нейроны протракции и ретракции радулы были активны, как и ожидалось, в противоположные фазы (Рис. 2); 2) пачки спайков в нейронах Бк-ПР совпадали с эпизодами торможения в нейронах Бк-РР; 3) нейроны ретракции крючков были активны одновременно с протракторами радулы; 4) протракторы крючков разряжались в одну фазу с ретракторами радулы.

Хотя нейроны Бк-РК и Бк-ПР, в целом, были активны одновременно, между ними наблюдался небольшой фазовый сдвиг. Спайковая активность нейрона РК заканчивалась обычно через 0,1-0,5с после начала залпа в нейроне ПК, создавая, таким образом, короткий период коактивации мотонейронов протракции и ретракции крючка (Рис. 4). Такая коактивация может быть необходима для обеспечения более мощной и быстрой протракции крючка.

Во время ритмической активности буккальной массы наблюдались эпизоды, в течение которых крючки не двигались, но радула была при этом активна. Было найдено, что во время таких периодов нейроны протракции крючка получают подпороговые ритмичные входы, совпадающие по времени со спайками в мотонейронах ретракции радулы, что свидетельствует в пользу того, что мотонейронные сети крючков и радулы управляются, по всей видимости, единым центральным генератором паттернов.

Все зарегистрированные мотонейроны протракции крючков и ретракторы радулы были электрически связаны между собой (Рис. 5). В то же время ретракторы крючка и протракторы радулы электрических связей между собой не образовывали, что, по всей видимости, было необходимо для возможности существования фазового сдвига в активности этих клеток. Было найдено, что в дополнение к электрическим связям противофазные мотонейроны образуют между собой тормозные химические связи. Однако эти связи являются полисинаптическими, поскольку легко блокировались раствором с повышенным содержанием кальция и магния.

Таким образом, наличие электрических связей между синфазными мотонейронами и тормозных химических связей между противофазными может быть одним из механизмов скоординированной работы крючков и радулы.

3.1.2. Регуляция и координация активности нейронов сети пищевого поведения Clione церебрально-буккальным интернейроном ЦрБМ

В церебральных ганглиях Clione нами был идентифицирован билатерально симметричный интернейрон, производящий синхронный возбуждающий эффект как на буккальные, так и на церебральные сети, контролирующие пищевое поведение. Эти интернейроны были обозначены нами как церебральные интернейроны буккальной массы (Цр-БМ). Стимуляция Цр-БМ интернейронов на полуинтактном препарате приводила к протракции буккальных щупалец и активации буккальной моторной программы. Тела Цр-БМ нейронов располагались на ростро-дорзальной поверхности церебральных ганглиев, между головными нервами (Рис. 6). Окрашивание этих клеток карбоксифлуоресцеином показало, что каждый нейрон дает несколько коротких отростков, ветвящихся в пределах ипсилатерального ганглия (Рис. 6), и один большой аксон, выходящий через церебро-буккальную коннективу и иннервирующий оба буккальных ганглия.

Известно, что в системе пищевого поведения Clione ГАМК играет роль мощного возбуждающего медиатора (Arshavsky et al., 1993; Norekian and Satterlie, 1993b). Было показано, что аппликация ГАМК приводит к активации ритмической активности буккальных и церебральных мотонейронов пищевого поведения. Поэтому мы произвели двойное мечение Цр-БМ нейронов (клетки внутриклеточно окрашивались нейробиотином, и затем на этих препаратах иммунохимически определялись ГАМК-содержащие клетки), которое показало, что эти нейроны являются ГАМК-ергическими.

В дальнейшем были изучены синаптические связи Цр-БМ интернейрона с мотонейронами пищевого поведения. Было показано, что активирующее влияние Цр-БМ на церебральные мотонейроны протракции щупалец является полисинаптическим и опосредуется интернейронами буккальных ганглиев. Последний факт представляется особенно интересным вот в какой связи. Известно, что церебральные мотонейроны протракции буккальных щупалец Цр-А, расположенные в непосредственной близости от Цр-БМ (Рис. 6), очень чувствительны к ГАМК: локальная аппликация ГАМК в концентрации 1мкМ на сому этих клеток вызывает в них мощную деполяризацию, сопровождаемую генерацией потенциалов действия (Norekian, 1999). Как показали проведенные нами морфологические исследования, ГАМК-ергический интернейрон Цр-БМ активно ветвится в нейропиле буккальных ганглиев, при этом его стимуляция вызывает активацию окружающих Цр-А мотонейронов. Казалось бы, что здесь удивительного? Стимуляция ГАМК-ергического нейрона активирует близлежащие клетки, высокочувствительные к ГАМК. Однако оказалось, что перерезка ипсилатеральной церебро-буккальной коннективы прямо во время эксперимента при помощи небольшого лезвия, укрепленного на микроманипуляторе, полностью элиминирует активирующий эффект стимуляции Цр-БМ на Цр-А нейроны (Рис. 7). Таким образом, на примере интернейрона Цр-БМ Clione отчетливо видно, что само по себе наличие определенного медиатора в первом нейроне, ветвление его отростков вблизи второго нейрона и присутствие на мембране второго нейрона специфических рецепторов к данному медиатору не являются достаточными условиями для существования межнейронной связи между двумя клетками, как это предполагается сторонниками доминирования объемной внесинаптической передачи в межнейронной коммуникации у моллюсков.

Было детально изучено влияние Цр-БМ интернейрона на мотонейроны буккального ганглия. Мы показали, что Цр-БМ интернейроны формируют химические моносинаптические связи со всеми типами мотонейронов, причем на мотонейроны протракции крючка и ретракции радулы эта связь тормозная (ТПСП) а на мотонейроны протракции радулы - возбуждающая (ВПСП). Гораздо сложнее оказалась связь с мотонейроном ретракции крючка. Потенциал действия в Цр-БМ интернейроне вызывал двухфазный ответ в ретракторе крючка: быстрая гиперполяризация (фактически ТПСП), за которой следовала медленная деполяризация. При более интенсивной стимуляции Цр-БМ в ретракторе крючка наблюдалась кратковременная гиперполяризация, которая сменялась деполяризационным ответом со спайками, даже если разряд в Цр-БМ интернейроне еще продолжался. Во всех случаях было показано соблюдение формальных критериев моносинаптической связи: соотношение 1 спайк : 1 ПСП, стабильная и короткая латентность и сохранение ответов в растворе с повышенной концентрацией кальция и магния (у двухфазного ответа сохранялись обе фазы).

Наличие двухфазного ответа мотонейрона ретракторов крючков хорошо согласуется также с тем фактом, что этот нейрон разряжается с небольшим фазовым сдвигом относительно других буккальных мотонейронов. Как нами было показано ранее, разряд ретрактора крючков начинается с небольшой задержкой после начала вспышки в протракторе радулы. Одним из механизмов обеспечения такого фазового сдвига может являться двухфазное действие Цр-БМ интернейрона. Таким образом, эта клетка обеспечивает не только координацию церебральной и буккальных моторных программ между собой, но и непосредственно координирует буккальные мотонейроны внутри сетей, управляющих движениями крючков и радулы.

Кроме того, было показано, что аппликация ГАМК на сому исследованных мотонейронов вызывает схожий эффект со стимуляцией Цр-БМ интернейрона: гиперполяризацию протракторов крючков и ретракторов радулы и деполяризацию протракторов радулы и ретрактора крючков. Последний факт дает нам возможность предположить, что именно ГАМК ответственна за медленную деполяризационную фазу ответа ретрактора крючков, а быстрые ТПСП, видимо, вызывает какой-то другой ко-медиатор Цр-БМ интернейрона. Мы также обнаружили, что аппликация таких известных антагонистов ГАМК, как бикукулин и пикротоксин на 70-80% обратимо блокирует быстрые ТПСП, возникающие в нейронах протракции крючка и ретракции радулы. Это еще раз указывает на то, что именно ГАМК является медиатором, опосредующим синаптические эффекты Цр-БМ на буккальные мотонейроны Clione.

Таким образом, Цр-БМ интернейрон координировал между собой активность нескольких пищедобывательных структур Clione: крючков, радулы, складок кожи, закрывающих ротовое отверстие, и буккальных щупалец. Это позволяет считать Цр-БМ интернейроном высокого порядка в нервной сети контроля пищевого поведения Clione. А способность интернейрона Цр-БМ запускать фиктивное пищевое поведение дает нам право отнести его к командным нейронам пищевого поведения.

3.1.3. Роль гигантского церебрального серотонинового нейрона Ц1 в регуляции активности нейронов буккального ганглия Clione

Другим важным церебро-буккальным нейроном, принимающим участие в пищевом поведении моллюсков, является гигантский церебральный серотонинергический нейрон, или метацеребральная клетка (Ц1). Ц1 была обнаружена у всех исследованных брюхоногих моллюсков (Weiss and Kupferman, 1976; Gillette and Davis, 1977), а также у Clione (Kabotyansky and Sakharov, 1990; Arshavsky et al., 1991). Ц1, расположенная в церебральных ганглиях и иннервирующая буккальные ганглии, оказывает активирующее влияние на пищевую моторную программу путем увеличения частоты разряда буккальных мотонейронов. Поскольку у Clione в филогенезе появилась новая структура - крючки - вместе с сетью управляющих ими мотонейронов, возник вопрос: каким образом Ц1 влияет на мотонейроны крючков.

Во-первых, было найдено, что внутриклеточная стимуляция Ц1 приводит к запуску пищевого ритма в мотонейронах крючков и радулы (Рис. 8). Интересно, что активация ритма происходила даже на молчащих препаратах. При этом активация всегда наступала с довольно значительной задержкой от стимуляции Ц1. Таким образом, по способности к запуску пищевой программы Ц1 у Clione может быть отнесен к классу командных нейронов пищевого поведения.

Кроме того, оказалось, что внутриклеточная стимуляция Ц1 вызывает деполяризацию в мотонейронах протракции радулы, включая Бк-ПИН, и мотонейронах ретракции крючков. При этом в мотонейронах протракции крючков и ретракции радулы наблюдался двухфазный ответ: кратковременная подпороговая деполяризация, длящаяся около 1 сек, за которой следовала длительная гиперполяризация. То есть Ц1 оказывает активирующее влияние на мотонейроны одной фазы (Бк-ПР и Бк-РК), но при этом в некоторой степени тормозит активность нейронов противоположной фазы, Бк-РР и Бк-ПК. Таким образом, помимо активирующего влияния Ц1 на буккальную моторную программу, у Clione эти клетки обладают новой, не описанной у других моллюсков функцией - функцией координации активности буккальных мотонейронов.

3.1.4. Коактивация функционально антагонистических групп мотонейронов во время пищевого поведения Clione

В работе нервной системы особый интерес представляют ситуации, когда одна и та же нейронная сеть производит разные паттерны активности в зависимости от поведенческих нужд. В нашей работе мы описали смену паттернов активности с антагонистического на синергический в двух группах мотонейронов, контролирующих движение буккальных щупалец. Кроме того, был описан нейронный механизм, обеспечивающий подобную смену паттернов, и найдено функциональное значение наблюдаемого феномена в процессе пищевого поведения Clione. 

Как уже говорилось, ключевую роль в пищевом поведении Clione играют буккальные щупальца. Их быстрая протракция обеспечивает захват и удержание жертвы. Затем наступает вторая фаза пищевого поведения - фаза экстракции, когда ритмически активные хитиновые крючки и радула вытаскивают мягкое тело жертвы из раковины. При этом, как мы обнаружили, складки кожи остаются открытыми, но буккальные щупальца становятся частично втянутыми. Компьютерный анализ видеозаписей этого этапа пищевого поведения Clione показал, что складки кожи и частично втянутые буккальные щупальца совершают ритмические движения, которые четко скоординированы с движениями крючков, видимых сквозь полупрозрачную раковину лимацины. Когда крючки были зацеплены за тело лимацины и вытягивали его из раковины, складки кожи были широко открыты. Когда же затем крючки высвобождали ткани жертвы и вытягивались вглубь раковины, чтобы захватить более дальний участок тела лимацины, складки кожи вместе с частично втянутыми буккальными щупальцами плотно схлопывались вокруг раковины, удерживая ее на месте. Подобный паттерн активности, при котором втянутые буккальные щупальца и складки кожи перехватывают каждый раз заново раковину лимацины, когда она придвигается наиболее близко к ротовому отверстию в результате деятельности крючков, препятствует, по всей видимости, случайному выскальзыванию жертвы в процессе довольно длительного пищевого поведения, которое занимает около 40 минут. Таким образом, во время фазы экстракции все три главные пищедобывательные структуры Clione - крючки, радула и буккальные щупальца - демонстрировали четко скоординированные по фазе ритмические движения.

Мы показали, что буккальные щупальца способны демонстрировать два принципиально разных паттерна активности, которые сменяют друг друга в процессе пищевого поведения Clione. Эти поведенческие наблюдения предполагают, что нейронная сеть, контролирующая движения буккальных щупалец, также должна быть способной производить два разных паттерна активности. Каким же образом обеспечивается такой широкий поведенческий диапазон? Движения буккальных щупалец контролируются двумя группами мотонейронов, расположенных в церебральном ганглии. Протракция обеспечивается группой Цр-A, тогда как ретракцию производят мотонейроны Цр-Б. Обычно эти две группы клеток взаимно антагонистичны: возбуждение в одной группе всегда сопровождается торможением в другой (Рис. 9 А). Мы обнаружили, что тормозные входы на Цр-Б мотонейрон иногда исчезают, и Цр-А и Цр-Б начинают демонстрировать принципиально иной паттерн активности - коактивацию. Подобные периоды коактивации иногда возникали спонтанно и представляли собой ритмичные возбуждающие входы от неизвестных источников (Рис. 9 Б). Ответственным за антагонистические взаимоотношения протракторов и ретракторов является специализированный церебральный интернейрон (Цр-Аинт), моносинаптически активирующий А-мотонейроны и тормозящий Б-клетки, а также электрически связанный со всеми А-мотонейронами (Norekian, 1999).

Таким образом, во время первой фазы пищевого поведения происходит синхронная активация мотонейронов Цр-А, приводящая к протракции буккальных щупалец, и торможение спонтанно активных мотонейронов ретракции Цр-Б. В следующую фазу в процесс вовлекаются крючки и радула и запускается буккальная пищевая программа, состоящая из ритмической активности мотонейронов крючков и радулы. Оказалось, что в буккальном ганглии существует интернейрон, впервые описанный группой Аршавского (Arshavsky et al., 1993) и названный ими интернейроном протракции Бк-ПИН. Этот нейрон вовлечен в буккальный пищевой ритм и разряжается в фазу протракции радулы. Нами было показано, что этот мотонейрон с высокой эффективностью моносинаптически активирует церебральные мотонейроны групп А и В, обеспечивая, таким образом, их совместную активацию в строгой координации с буккальным ритмом (Рис. 10). При этом, как мы установили, вследствие невыясненных еще модуляторных механизмов происходит снижение возбудимости в А-интернейроне, что препятствует его активации (активация этого интернейрона автоматически привела бы к торможению Б группы и активации А - развитию антагонистического паттерна). Нами было показано, что небольшая искусственная деполяризация Цр-Аинт на препаратах, спонтанно демонстрирующих синергический тип активности мотонейронов щупалец, приводит к смене паттерна на антагонистический.

В чем может быть функциональное значение коактивации А и Б мотонейронов? По всей видимости, активация Б клеток приводит к тому, что буккальные щупальца в частично втянутом состоянии в этот момент времени плотно сжимают раковину лимацины. Кроме того, активация Б нейронов приводит к закрытию складок кожи, которые также принимают участие в удержании жертвы. Эффект активации Цр-А на складки кожи, по всей видимости, перебивается более сильным влиянием Б нейронов, но необходим для обеспечения тургора буккальных щупалец и препятствует их полному втягиванию, что произошло бы в случае изолированной активации Б нейронов.

Остается открытым вопрос о природе модуляторных и/или сенсорных входов, которые приводят к изменению возбудимости Цр-Аинт и обеспечивают тем самым смену паттерна активности сети церебральных мотонейронов, контролирующих буккальные щупальца. Мы считаем, что на роль подобного триггера вполне могут претендовать

хемосенсорные входы, активирующиеся при контакте крыльев лимацины с губами Clione. Такой контакт означает, что в процессе манипуляции отверстие раковины лимацины уже находится непосредственно напротив рта Clione и можно переходить ко второй фазе пищевого поведения. Для этого требуется укорочение удерживающих жертву буккальных щупалец при одновременно открытых кожных складках, а подобная конфигурация может быть достигнута только при совместной активации Цр-А и Цр-Б  мотонейронов.

3.1.5. Нервный контроль активности ресничного эпителия в пищеводе Clione

Как было найдено в нашей лаборатории, командные нейроны виноградной улитки содержат уникальный ген - HCS2, кодирующий пропептид, содержащий кальций-связывающий фрагмент, и четыре коротких нейропептида, получивших название CNP пептидов. С применением поликлональных антител к пептидам семейства CNP был произведен иммунохимический анализ центральной нервной системы и периферических тканей крылоногого моллюска Clione. В результате проведенной работы были получены данные о распределении иммунореактивности к продуктам гена HCS2 в периферических тканях и нервной системе Clione. В буккальных ганглиях животного были идентифицированы нейроны, содержащие продукты гена HCS2 (Рис. 11). Было показано, что эти клетки, используя в качестве нейромедиатора пептиды семейства CNP, оказывают мощное активирующее воздействие на активность ресничного эпителия пищевода (Рис. 12 А). Было продемонстрирвано, что найденные нейроны активируются во время пищевого поведения Clione и составляют, таким образом, ранее не описанный нейронный механизм пищевого поведения моллюсков.

Кроме того, нами впервые было показано, что церебральные серотонинергические нейроны Ц1 также оказывают активирующий эффект на активность ресничного эпителия пищевода Clione (Рис. 12 Б). При этом было убедительно продемонстрировано, что этот эффект является прямым и опосредуется серотонином. Принимая во внимание высокую степень гомологии церебральных серотониновых клеток у всех исследованных видов брюхоногих моллюсков, можно предположить, что этот нейрон вовлечен в контроль ресничного эпителия и у других видов. Выяснилось, что хотя эти две системы (CNP и серотонинергическая), в общем, выполняют одну и ту же функцию - активацию ресничного эпителия, сами нейроны находятся в антагонистических взаимоотношениях. Было найдено, что внутриклеточная стимуляция метацеребральных клеток приводит к выраженной гиперполяризации CNP-содержащих нейронов (Рис. 12 В). Кроме того, во время спонтанной активности эти клетки демонстрировали одновременные синаптические входы противоположной направленности: ВПСП в церебральных нейронах соответствовали ТПСП в буккальных CNP-содержащих клетках. Было высказано предположение, что, возможно, CNP пептиды и серотонин достигают одного и того же результата - увеличения скорости ресничного транспорта - разными способами. Например, один медиатор может увеличивать силу сокращения ресничек, а другой - увеличивать частоту биения. Поскольку пищевое поведение Clione является сложным, многоступенчатым процессом, на разных его этапах может требоваться разный паттерн работы ресничного эпителия, что достигается активацией CNP- и серотониновой систем в разные периоды пищевого поведения, а найденные нами нейронные механизмы препятствуют одновременной активации этих двух систем.

3.1.6. Роль ГАМК в нейронных механизмах пищевого поведения Helix lucorum

Как было показано в ряде работ, ГАМК-ергическая система играет важную роль в организации пищевого поведения у моллюсков. В связи с этим мы решили изучить влияние ГАМК на пищевое поведение виноградной улитки.

Мы изучали эффект аппликации ГАМК на изолированную буккальную массу и буккальную массу, соединенную с буккальными ганглиями. Было найдено, что аппликация ГАМК в концентрации от 10-5 до 10-4М на препарат буккальной массы, соединенной с буккальными ганглиями, на всех протестированных препаратах (n=8) приводила к немедленному увеличению частоты движений радулы и соответствующих сокращений мышц глотки на десятки минут. Запись активности церебро-буккальной коннективы при помощи присасывающего пластикового электрода на препарате изолированных буккальных ганглиев показала, что аппликация ГАМК приводила к появлению ритмичных вспышек активности, отражающих активацию буккального генератора ритма. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о вовлечении ГАМК в запуск пищевого поведения у виноградной улитки.

3.2. НЕЙРОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ CLIONE

Одной из отличительных особенностей моллюсков является исключительно важная роль гидроскелета в реализации практически любого типа поведения. Ответственной за гидродинамические изменения гидроскелета является сердечно-сосудистая система. В связи с этим быстрая и адекватная регуляция функции сердечно-сосудистой системы со стороны ЦНС приобретает у моллюсков исключительное значение, что дает хорошую модель для изучения принципов нервной регуляции физиологических процессов. В нашей работе было проведено детальное исследование нейронного субстрата и механизмов нервной регуляции активности сердечно-сосудистой системы у морского ангела.

Группа, состоящая из четырех кардиоактивных нейронов, была  идентифицирована нами в интестинальном ганглии Clione. Эти клетки были названы интестинальными кардиостимуляторами (Инт-КС) и представляли собой, по всей видимости, две пары билатерально симметричных нейронов. Относительно слабая внутриклеточная стимуляция этих нейронов вызывала сокращения только предсердия, в то время как более сильная стимуляция вызывала сокращение предсердия, за которым следовало несколько полноценных атриовентрикулярных сокращений (Рис. 13).  Эффект Инт-КС нейронов на сердце был, по всей видимости, опосредован пептидом, схожим с педальным пептидом тритонии (Тпеп). Эти нейроны демонстрировали выраженную иммунореактивность к Тпеп и, кроме того, их эффект на сердце воспроизводился аппликацией экзогенного педального пептида тритонии (Рис. 14 А).

В педальных ганглиях Clione ранее был описан серотонинергический нейрон, вызывающий мощную активацию сердца (Arshavsky et al., 1990). Однако детальное описание эффекта этого нейрона, названного позже педальным кардиостимулятором (Пед-КС), раздельно на предсердие и желудочек дано не было. Нами было обнаружено, что этот нейрон оказывает сильное активирующее воздействие  только на сокращения желудочка. Мы доказали, основываясь на иммунореактивности к серотонину, блокирующему действию антагониста серотониновых рецепторов миансерина и метизергида и наблюдению, что экзогенный серотонин воспроизводит эффект стимуляции Пед-КС на активность сердца (Рис. 14 Б), что с высокой долей вероятности серотонин является основным медиатором, опосредующим действие этого нейрона на сердце.

Плотная сеть волокон, иммунореактивных к Тпеп, была обнаружена как в предсердии, так и в желудочке сердца  Clione, в то время как серотониновая иммунореактивность была представлена в основном в желудочке. В предсердии при этом обнаруживались редкие серотонин-иммунореактивные волокна, пересекающие предсердие на пути к желудочку. Таким образом, распределение иммунореактивности к серотонину и педальному пептиду тритонии в сердце Clione отчетливо демонстрировало выраженную корреляцию с физиологическими эффектами педальных и интестинальных кардиостимулирующих нейронов.

Помимо описанных выше двух кардиостимулирующих и одной кардиоингибиторной нейронных сетей в ЦНС Clione, мы также впервые описали новый дополнительный элемент нейрональной кардиорегуляторной сети. Этот элемент представлен гигантским интестинальным нейроном, получившим название Z-клетки. Внутриклеточная стимуляция  Z-клетки вызывала сокращения предсердия, не оказывая никакого эффекта на активность желудочка. Отростки Z-клетки были прослежены вплоть до сердца, причем интенсивное ветвление тонких отростков было обнаружено в тканях предсердия, но не желудочка.

С целью определения иерархического положения Z-клетки в нейронной сети Clione мы производили стимуляцию ряда ключевых интернейронов, ответственных за реализацию определенных типов поведения, при одновременной регистрации активности Z-клетки. Было найдено, что стимуляция педального кардиостимулятора вызывала активацию Z-клетки. Оказалось, что сильная внутриклеточная стимуляция оборонительного интернейрона Pl-Wh, который обеспечивает запуск пассивно- оборонительной реакции (Norekian and Satterlie, 1996), также вызывала активацию Z-клетки. Таким образом, Z-клетка активировалась при реализации двух функционально противоположных форм поведения и активировалась двумя клетками, оказывающими также противоположные физиологические эффекты.

Хотя общая реакция сердца Clione на тактильную стимуляцию головы и хвоста была описана ранее (Arshavsky et al., 1990), детальный паттерн кардиоваскулярных реакций с разделением активности желудочка и предсердия до настоящего времени изучен не был. Мы провели детальный видеоанализ активности сердца во время протекания пассивно- и активно-избегательной реакции на полуинтактном препарате. Выяснилось, что тактильная стимуляция хвоста, вызывающая активно-избегательную реакцию, вызывала увеличение частоты сокращений как желудочка, так и предсердия. Стимуляция головы, приводящая к развитию пассивной оборонительной реакции, вызывала при этом прекращение активности как желудочка, так и предсердия, однако после паузы предсердие возобновляло свою работу раньше желудочка, причем в некоторых случаях частота сокращений предсердия была даже выше, чем до стимуляции.

Одной из целей настоящей работы было определить роль каждого из типов кардиорегуляторных нейронов в регуляции активности сердца при протекании двух функционально противоположных типов поведения, требующих противоположных изменений в активности сердечно-сосудистой системы - быстрого избегательного плавания и пассивной оборонительной реакции. Быстрое избегательное плавание индуцировалось нанесением тактильного стимула на каудальную часть тела животного, тогда как пассивно-оборонительная реакция вызывалась сильной тактильной стимуляцией головы. Сильная тактильная стимуляция хвоста Clione вызывала активно-избегательную реакцию животного, которая выражалась в значительной активации локомоторной активности, что требовало соответствующей активации сердечно-сосудистой системы. При этом, как это было показано ранее, происходила активация педального кардиостимулятора и торможение интестинального кардиоингибитора (Arshavsky et al., 1990). Мы впервые продемонстрировали, что при реализации этого типа поведения на полуинтактном препарате происходит также активация интестинальных кардиостимуляторов и интестинальной Z-клетки. Индукция пассивно-оборонительной реакции путем тактильной стимуляции головы приводила к угнетению локомоторной активности, сокращению крыльев и тела и временной остановке сердца. Ранее было продемонстрировано также, что тактильная стимуляция головы на полуинтактном препарате вызывала угнетение спайковой активности в педальном кардиостимуляторе и активацию интестинального кардиоингибитора (Arshavsky et al., 1990). Мы обнаружили, что интестинальные кардиостимуляторы и Z-клетка также активируются во время реализации пассивно-оборонительного поведения, хотя и с выраженной латентностью и в значительно меньшей степени, чем при активно-избегательной реакции.

Как было сказано выше, эффект стимуляции интестинальных кардиостимуляторов на активность сердца зависит от частоты импульсации: относительно слабая стимуляция этих клеток приводит к активации только предсердия, тогда как более сильная стимуляция, вызывающая частоту импульсации больше 5Гц, вызывает активацию как предсердия, так и желудочка (Malyshev et al., 1999). Таким образом, тактильная стимуляция головы Clione приводила к отставленной активации Z-клетки, а также к отставленной относительно слабой активации интестинальных кардиостимуляторов, что, как нам известно, приводит к активации предсердия. Желудочек сердца Clione, так же как и аплизии, имеет толстые мышечные стенки, тогда как предсердие образовано тонкими прозрачными соединительно-тканными стенками, бедными мышечными волокнами. Очевидно, что основную насосную функцию выполняет желудочек, в то время как предсердие, по-видимому, служит лишь для наполнения желудочка. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что активация  предсердия при неактивном желудочке, происходящая при развитии пассивно-оборонительной реакции, обеспечивается сложным паттерном активности интестинальных кардиостимуляторов и Z-клетки, что обеспечивает кровенаполнение желудочка и, таким образом, делает сердце готовым к последующей активации.

3.3. НЕЙРОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ОБОРОНИТЕЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ НАЗЕМНОГО МОЛЛЮСКА HELIX LUCORUM

3.3.1. Нейронная сеть оборонительного поведения Helix

Виноградная улитка Helix lucorum является широко используемым объектом для изучения нейронных механизмов поведения и, в особенности, механизмов пластичности поведения. Как и у других видов брюхоногих, наиболее пластичным у виноградной улитки является оборонительное поведение. По изучению нейронных механизмов пластичности оборонительного поведения Helix lucorum опубликовано уже довольно значительное количество работ, и каждый год публикуются все новые и новые исследования. Однако, если эфферентная часть нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки, представленная командными нейронами, была изучена в деталях, то до начала настоящей работы сенсорные элементы этой сети  были практически не описаны.

В нашей работе впервые были идентифицированы первичные механосенсорные нейроны, передающие тактильную информацию с поверхности кожи виноградной улитки на командные нейроны оборонительного поведения и вовлеченные, таким образом, в контроль оборонительных реакций животного. Эти нейроны, названные по месту их локализации, плевральными вентро-латеральными нейронами (ПВЛ), располагались на вентролатеральной поверхности плевральных ганглиев между плевропедальной и плевроцеребральной коннективами. Всего в каждом ганглии насчитывалось, по нашим оценкам, порядка 15-30 клеток (Рис. 15). Большинство ПВЛ клеток имело диаметр тела около 20-30 мкм, однако одна из клеток этой группы была существенно больше остальных (около 40 мкм) и могла быть визуально идентифицирована. Эта клетка была обозначена нами как нейрон плевральный четвертый (Пл4). Внутриклеточное окрашивание ПВЛ нейронов нейробиотином показало, что все клетки этой группы посылают свои отростки через плевропедальную коннективу в педальный ганглий и далее во второй кожный нерв. Пл4 нейрон, кроме того, имел дополнительный отросток, который выходил через плевро-церебральную коннективу в церебральный ганглий.

ПВЛ нейроны в изолированной ЦНС и на полуинтактном препарате виноградной улитки в отсутствие стимуляции были электрически неактивны: они демонстрировали отсутствие спонтанной спайковой активности и фоновых ВПСП. Точечная тактильная стимуляция кожи, покрывающей дорзальную поверхность ноги животного, вызывала в ПВЛ нейронах потенциал действия, который развивался прямо от потенциала покоя клетки (Рис. 16 А). Последний факт указывает на то, что место генерации этого потенциала действия находилось на значительном расстоянии от сомы. Интересно, что при продолжительной тактильной стимуляции потенциал действия в ПВЛ нейронах генерировался только в начале и в конце стимула (длительность тактильных стимулов в этих экспериментах варьировалась от 0.02 до 10 с). Мы обнаружили, что каждый из ПВЛ нейронов имеет рецептивное поле овальной формы, расположенное на коже, покрывающей дорзо-латеральную поверхность виноградной улитки (Рис. 16 Б). Рецептивное поле идентифицированного нейрона Пл4 имело длину около 20мм и располагалось сразу за задними щупальцами. Рецептивные поля остальных ПВЛ нейронов были существенно меньше (5-12мм). Довольно часто наблюдалось частичное перекрывание рецептивных полей разных нейронов. Тактильная стимуляция кожи по внешнему краю рецептивного поля не вызывала гиперполяризующего ответа данного ПВЛ нейрона, хотя такое поведение типично для механосенсорных нейронов моллюсков (Getting, 1976; Mellon, 1972; Spray et al., 1980; Walters et al., 1980).

Нанесение на рецептивное поле ПВЛ нейронов различных химических агентов, таких как концентрированный раствор поваренной соли, 0,5М растворы HCl и NaOH, не приводило к генерации потенциалов действия в этих клетках, несмотря на то, что подобная стимуляция приводила к выраженному деполяризационному ответу в командных нейронах оборонительного поведения. Последнее свидетельствует в пользу того, что ПВЛ нейроны являются специфическими механоафферентыми клетками, тогда как сенсорная информация других модальностей передается другими нейронами.

Было найдено, что каждый потенциал действия, индуцированный в ПВЛ нейроне вызывает ВПСП в соотношении 1:1 в ипсилатеральных Пл1, Па2 и Па3, а также контрлатеральных Па2 и Па3 нейронах. Было найдено, что короткая пачка потенциалов действия была способна вызвать генерацию потенциала действия  в Пл1 клетке, при этом во всех париетальных командных нейронах регистрировался лишь подпороговый ответ. Вызванные спайками в ПВЛ клетках ВПСП в командных нейронах сохранялись в растворе с повышенным содержанием ионов кальция и магния. Кроме того, эти ВПСП демонстрировали короткую и стабильную латентность. Все приведенные здесь данные убедительно свидетельствуют, что связь между ПВЛ клетками и плевральными и париетальными командными нейронами  оборонительного поведения является моносинаптической.

Синаптическая связь между ПВЛ клетками и командными нейронами демонстрировала выраженную депрессию при ритмической стимуляции, причем динамика угасания ВПСП и поведенческих ответов при ритмической тактильной стимуляции кожи была довольно схожей.

Следующим шагом в наших исследованиях стала идентификация нейротрансмиттера, используемого в синаптической связи между ПВЛ и командными нейронами оборонительного поведения. Было обнаружено, что специфические блокаторы ацетилхолина, серотонина и дофамина в концентрациях до 10-4М не оказывали значительного влияния на ВПСП, вызванные стимуляцией ПВЛ клеток. Однако оказалось, что аппликация специфического антагониста NMDA-рецепторов CNQX (5х10-5М) и DNQX (10-5М) приводила к существенному снижению амплитуды ВПСП, вызванных стимуляцией ПВЛ клеток. Кроме того, экзогенный L-глутамат, локально апплицируемый на сому изолированных командных нейронов, вызывал в последних выраженный деполяризационный ответ. Все эти данные указывают на то, что именно глутамат опосредует синаптическую передачу между ПВЛ и командными нейронами виноградной улитки.

Основываясь на морфологичеcком, электрофизиологическом и функциональном сходстве ПВЛ нейронов с другими механосенсорными нейронами, описанными на различных видах моллюсков, мы полагаем, что найденные нами клетки являются первичными механосенсорными нейронами. Подобно другим механоафферентам и сенсорным интернейронам у беспозвоночных (Byrne, 1982; Byrne et al., 1974; Callec et al., 1971; Walters et al., 1983; Zucker, 1972), синаптическая связь между ПВЛ и командными нейронами демонстрировала прогрессирующую депрессию при ритмической стимуляции. Однако, в отличие от механоафферентных нейронов аплизии (Walters et al., 1983) и прудовика (Inoue et al.. 1996), демонстрировавших медленную адаптацию ответов к продолжающейся (непрерывной) механической стимуляции, ПВЛ нейроны в этих условиях отвечали одиночным потенциалом действия лишь на начало и конец стимула (ON/OFF ответ). Это делает их похожими на Т клетки пиявки (Nicholls and Baylor, 1968), S нейроны тритонии  (Getting, 1976) и механоафферентные нейроны морского черенка (Olivo, 1970). Однако S нейроны тритонии  активировались, помимо механических, также химическими стимулами, чего мы никогда не наблюдали в наших экспериментах. Другим характерным отличием ПВЛ нейронов от механосенсорных клеток других моллюсков является отсутствие гиперполяризационного ответа при нанесении стимула вне рецептивного поля данного нейрона (Getting, 1976; Spray et al., 1980). Интересно, что другие сенсорные нейроны, описанные у виноградной улитки и иннервирующие внутренние органы (Па7, 9, 11) (Логунов и Балабан, 1978), отвечали гиперполяризацией на тактильную стимуляцию кожи и мантии, тогда как механическая стимуляция висцеральных органов вызывала в них вспышку потенциалов действия, которые также характеризовались отсутствием препотенциала (Аракелов и др., 1989). К сожалению, авторы не применяли продолжительную (непрерывную) механическую стимуляцию, поэтому мы не можем сравнить адаптационные свойства ответов ПВЛ и Па7, 9, 11 нейронов.

Синаптическая связь между ПВЛ  и командными нейронами виноградной улитки оказалась схожей по своим нейрохимическим свойствам с сенсомоторными синапсами L-кластера аплизии, опосредующими рефлекс отдергивания жабры. И у аплизии, и в наших экспериментах синаптическая связь в сенсомоторных синапсах блокировалась специфическими антагонистами NMDA рецепторов (Dale and Kandel, 1993). Последний факт имеет огромное научно-теоретическое значение. Дело в том, что NMDA-зависимая пластичность в нейронах гиппокампа является на сегодняшний день важным установленным механизмом обучения и памяти у млекопитающих. Поэтому идентификация NMDA-подобных синаптических связей в нейронных сетях, служащих моделями обучения на моллюсках, дает возможность использовать данные, полученные на беспозвоночных моделях, при анализе механизмов пластичности  у млекопитающих и человека.

3.3.2. Роль продуктов гена HCS2 в функции командных нейронов

Относительно недавно в нашей лаборатории были изолированы и описаны гены HCS1 (Helix Command Specific 1) и HCS2 (Helix Command Specific 2), наибольший уровень экспресии которых наблюдается в гигантских командных нейронах париетальных ганглиев (Bogdanov et al., 1994, 1998). Кодируемый геном HCS2 белок-предшественник имеет в своем составе Са-связывающий фрагмент и четыре нейропептида, три из которых (CNP2, CNP3, CNP4) потенциально амидируемы (и экскретируемы) и имеют сходную последовательность аминокислот Tyr-Pro-Arg-X-Gly на С-конце. Несмотря на то, что позже CNP-подобные пептиды были обнаружены у целого ряда беспозвоночных, о функции этого гена и кодируемых им пептидов известно сравнительно мало. Было показано, что уровень экспрессии гена HCS2 возрастает под влиянием стрессирующих воздействий на животное, а также при аппликации на изолированную нервную систему серотонина и химических агентов, увеличивающих внутриклеточную концентрацию свободного кальция. В условиях стимуляции, вызывающей оборонительное поведение, экспрессия этого гена наблюдается и в других нейронах (Balaban et al., 2001).

Одним из компонентов оборонительной реакции улитки на "опасные" стимулы, по крайней мере частично опосредованной париетальными командными нейронами, является закрытие отверстия легочной полости (дыхальца). Показано (Балабан и Литвинов, 1977), что внутриклеточная стимуляция даже одного командного нейрона приводит к кратковременному закрытию дыхальца. Закрытие дыхальца является, пожалуй, наиболее выраженной реакцией, наблюдаемой на полуинтактном препарате в ответ на стимуляцию париетальных командных нейронов. В связи с этим мы поставили задачу изучить возможную роль CNP пептидов в опосредовании этой реакции. Ранее предварительно было найдено, что при аппликации нейропептида CNP4 наблюдалось некоторое изменение активности висцеральных нейронов, среди которых располагаются мотонейроны закрытия и открытия дыхальца (Bogdanov et al., 1998).

В серии экспериментов с одновременной регистрацией движений дыхальца, активности мотонейронов дыхальца и активности командных нейронов в соответствии с описанным ранее (Балабан, 1981) было обнаружено, что внутриклеточная активация одного командного нейрона приводит к увеличению частоты спайков в мотонейронах закрытия дыхальца, торможению спонтанной активности мотонейронов открытия дыхальца и закрытию дыхальца (Рис. 17). Однако оказалось, что вслед за экстренным закрытием дыхальца через несколько десятков секунд после сильной стимуляции одного командного нейрона наблюдалась интенсификация дыхательных движений, выражающаяся в появлении серии из нескольких высокоамплитудных движений открытия-закрытия дыхальца, что сопровождалось усилением ритмической активности мотонейронов дыхальца (Рис. 17). Таким образом, во влиянии командного нейрона на дыхальце можно выделить прямой эффект (закрытие) и отставленный эффект, или эффект отдачи (интенсификация дыхательных движений).

Далее мы изучили влияние пептида CNP4 на активность мотонейронов дыхальца и активность самого дыхальца. Выяснилось, что аппликация CNP4 в концентрации 10-7M на препараты, в которых фоновая спонтанная активность дыхальца была невысокой (не чаще одного движения в 1мин), приводила к достоверному увеличению частоты и интенсивности дыхательных движений. Происходило также усиление ритмической активности мотонейронов дыхальца, выражающееся в увеличении числа спайков в пачке и частоты пачек (Рис. 18). Число и частота пачек увеличивались в соответствии с изменением числа дыхательных движений. На препаратах с высокой спонтанной активностью дыхальца (больше одного движения в 1мин) аппликация пептида не приводила к выраженному эффекту. Следует отметить, что ЦНС и мантийный комплекс в наших экспериментах находились в разных отделениях ванночки; пептид при этом апплицировался только в отделение, где находились ганглии. Аппликация пептида в отделение, где находился мантийный комплекс, не приводила к каким-либо значительным изменениям в активности дыхальца.

Исходя из полученных данных, можно предположить, что именно пептиды, кодируемые геном HCS2, ответственны, по крайней мере частично, за отставленные эффекты стимуляции париетальных нейронов. Представляется наиболее вероятным, что пептиды действуют не на сами мотонейроны, а на неидентифицированные элементы центрального генератора паттернов дыхательного ритма.

Каково могло бы быть функциональное значение подобного CNP-опосредованного отставленного эффекта стимуляции командных нейронов - активации дыхательных движений? Ведь прямым эффектом стимуляции командных нейронов, как известно, является закрытие дыхальца. Тот же эффект вызывают сенсорные стимулы практически любой модальности, предъявляемые интактному животному. Однако при развитии генерализованной оборонительной реакции улитки, когда все тело втягивается в раковину, происходит как раз открытие пневмостома, необходимое для того, чтобы воздух вышел из легочной полости, что необходимо для уменьшения объема тела (Захаров, 1992). Таким образом, отставленный эффект стимуляции командных нейронов, выражающийся в открытии дыхальца, может являться элементом генерализованной оборонительной реакции виноградной улитки.

3.3.3. Кальциевые сигналы, вызываемые высокоамплитудными ВПСП в командных нейронах

Командные нейроны оборонительного поведения в ЦНС Helix lucorum собирают сенсорные входы практически всех модальностей и затем трансформируют эти входы в оборонительные реакции. Известно, что стимуляция любого чувствительного нерва в ЦНС Helix вызывает комплексный ВПСП в командных нейронах. При этом париетальные командные нейроны характеризуются чрезвычайно высоким порогом генерации потенциалов действия, что приводит к возможности возникновения высокоамплитудных ВПСП в этих клетках (до 25мВ) в ответ на электрическую стимуляцию нервов или на адекватную сенсорную стимуляцию периферических органов на полуинтактном препарате. Было показано, что даже подпороговые ВПСП могут сопровождаться кратковременным повышением внутриклеточной концентрации ионов кальция, или, как мы будет в дальнейшем говорить, кальциевым сигналом (Sakman et al., 1994). Известно также, что изменение внутриклеточной концентрации ионов кальция в нейроне является одним из основных триггеров различных внутриклеточных процессов - от активации протеинкиназ до запуска экспрессии генов. В связи с этим мы решили проверить, что происходит с концентрацией ионов кальция в париетальных командных нейронах во время генерации высокоамплитудных ВПСП. Была поставлена серия экспериментов, в которых париетальные командные нейроны внутриклеточно инъецировались кальций-чувствительным красителем Oregon Green, после чего препарат инкубировался в течение 60мин при +4 С. После этого морфология командных нейронов становилась хорошо видимой под эпифлуоресцентным микроскопом. Оптическая регистрация, проводимая практически от любого участка нейритного дерева командного нейрона, показала, что высокоамплитудные ВПСП (при условии, что их амплитуда превышала некоторый критический уровень) сопровождались выраженными кальциевыми сигналами. Максимальная амплитуда кальциевого сигнала, вызванного ВПСП, составляла 1/3 от амплитуды кальциевого сигнала, вызванного потенциалом действия (Рис. 19 А). Таким образом, вполне возможно, что кальциевые сигналы, индуцированные  высокоамплитудными ВПСП, способны индуцировать биохимические  изменения в нейроне даже без генерации клеткой потенциалов действия.

В дальнейшем нами было обнаружено, что  увеличение силы стимуляции нерва в 2 раза (речь идет о стимуле, который уже вызывает выокоамплитудные ВПСП) обычно приводило к 20-30%  увеличению амплитуды ВПСП и при этом к  непропорционально большому (300%) увеличению кальциевого сигнала (Рис. 19 Б). Для выяснения причин такой диспропорции мы провели специальную серию опытов, в которых ВПСП были имитированы инъекцией деполяризационных ступенек тока. При этом в командный нейрон внутриклеточно инъецировались короткие (100-200мс) деполяризующие ступеньки тока разной амплитуды. Одновременно производилась оптическая регистрация изменения уровня кальция в отростках клетки. Оказалось, что короткая деполяризация командного нейрона через внутриклеточный электрод вызывает выраженный кальциевый сигнал, довольно схожий с тем, что наблюдается при генерации высокоамплитудных ВПСП. Подавая ступеньки тока разной амплитуды и регистрируя изменение мембранного потенциала, который эти ступеньки вызывали, мы построили кривую зависимости степени деполяризации мембраны от амплитуды ступенек тока. Оказалось, что эта зависимость носит нелинейный характер, демонстрируя выраженный перегиб в районе -65мВ (Рис. 20, темные кружки). В противоположность  этому, кривая, отражающая зависимость амплитуды кальциевого сигнала от силы деполяризующего тока ступенек носила строго линейный характер и имела существенно больший угол наклона к оси линъецируемый ток (Рис. 20, светлые кружки). Это означает, что в определенном диапазоне изменений мембранного потенциала кальциевые сигналы более адекватно передают силу синаптически индуцированных токов, чем уровень деполяризации постсинаптического нейрона. Мы предполагаем, таким образом, что кальциевые сигналы, индуцированные высокоамплитудными ВПСП, способны индуцировать биохимические изменения в нейроне и таким образом опосредовать ответ клетки в подпороговом для потенциала действия диапазоне.

4. ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Вопрос об эволюционном происхождении крючков у Clione: доводы нейрофизиологии

Гимносоматы являются единственными представителями брюхоногих моллюсков, обладающими уникальной пищедобывательной структурой - хитиновыми крючками, которые сформировались в эволюции как приспособление к хищному пищевому поведению. Однако вопрос об эволюционном происхождении крючков гимносомат на настоящий момент абсолютно неясен. На наш взгляд, существуют две наиболее вероятные гипотезы: 1) крючки - это производные радулы 2) крючки - это производные челюстей. Мы попробуем ответить на вопрос об эволюционном происхождении крючков у Clione, используя полученные нами данные об активности радулы и крючков во время пищевого поведения, а также данные о строении мотонейронных сетей, контролирующих крючки и радулу у Clione, в сравнении с имеющимся в литературе описанием организации мотонейронной сети челюстей у аплизии. Нервный контроль активности челюстей был наиболее детально изучен на морском моллюске Aplysia kurodai. На поведенческом уровне у аплизии (и у тритонии) движения челюстей строго не скоординированы с движениями протракции-ретракции радулы. Челюсти открыты во время протракции радулы и остаются открытыми в течение еще некоторого времени, когда уже начинается ретракция радулы (Audesirk and Audesirk, 1979; Nagahama and Takata, 1988). Считается, что активное поддержание челюстей в открытом состоянии во время ретракции радулы необходимо для захватывания пищи и продвижения ее в буккальную полость. В противоположность этому, крючки и радула у Clione работают в четких противофазных взаимоотношениях: протракции радулы всегда соответствует ретракция крючков и наоборот. Перейдем теперь на уровень мотонейронов соответствующих структур. В начале жевательного цикла в мотонейронах открытия и закрытия челюстей у аплизии наблюдается синхронная нарастающая деполяризация. Однако первыми  начинают спайковать мотонейроны открытия - происходит открытие челюстей. Затем деполяризация достигает пороговых значений и в мотонейронах закрытия, и они также начинают разряжаться (на фоне продолжающейся активности в мотонейронах открытия, хотя и несколько ослабленной) - происходит закрытие челюстей. После этого мотонейроны обоих типов получают синхронные тормозные входы, приводящие к прекращению в них спайковой активности и, таким образом, к прекращению жевательного цикла (Nagahama and Takata, 1988). Совершенно иная картина наблюдается в активности мотонейронов протракции и ретракции крючков у Clione: здесь эти клетки находятся в четких противофазных отношениях: во время активности мотонейронов протракции мотонейроны ретракции получают тормозные входы и наоборот. Кроме того, между мотонейронами протракции крючка и ретракции радулы существуют полисинаптические тормозные связи. Рассмотрим теперь взаимоотношения между мотонейронами крючков и радулы у Clione. Во-первых, как мы показали, между мотонейронами протракции крючков и ретракции радулы - клетками, иннервирующими разные структуры, но работающими синхронно - существуют электрические связи. Во-вторых, между нейронами протракции крючков и ретракции радулы - клетками, опять-таки иннервирующими разные структуры, но работающими уже противофазно - существуют полисинаптические тормозные связи. И в-третьих, похоже, что обе мотонейронных сети - крючков и радулы - управляются одним центральным генератором паттернов, поскольку нами наблюдались ситуации, когда при неподвижных крючках, но активной радуле мотонейроны крючков получали ритмичные подпороговые входы, скоординированные по фазе с разрядами в мотонейронах радулы. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об очень тесной связи между мотонейронными сетями крючков и радулы у Clione. Похоже, что мотонейронная сеть крючков скорее образовалась из сети, контролирующей движения радулы, нежели из мотонейронов челюстей. То есть ретрактор крючков эволюционировал из протрактора радулы, а ретрактор радулы эволюционировал в протрактор крючков. Собрав вместе поведенческие и нейрофизиологические данные об активности радулы и крючков у Clione и сравнивания их с соответствующими данными об активности радулы и челюстей у аплизии, мы склоняемся к выводу, что более вероятным эволюционным сценарием является происхождение крючков у Clione от маргинальных зубов радулы, нежели от челюстей. На рисунке 21 изображен процесс ретракции радулы у гипотетического эволюционного предка Clione. Если во время ретракции радулы сокращению больше подвергается центральная ее часть, то края радулы с расположенными на них маргинальными зубами как бы выворачиваются вперед и в центр, что в целом напоминает процесс жестко скоординированных движений протракции крючков и ретракции радулы у Clione. Соответственно, мотонейроны ретракции радулы автоматически начинают играть роль протракторов крючков. У одного из видов анаспид, Akera bullata, который является предком по отношению к гимносоматам, маргинальные зубы радулы отчётливо крупнее остальных зубов и в этом отношении могут рассматриваться как первый шаг к формированию крючков.

Вывод о происхождении  крючков у Clione от маргинальных зубьев радулы подтверждается также сравнительно-морфологическими исследованиями, проведенными эволюционным биологом Александром Мартыновым. Им было показано, что челюстные элементы других заднежаберных существенно отличаются от крючков гимносомат. Прежде всего, челюсти располагаются на внутренних краях передней части глотки, тогда как мешки с крючками берут начало в задней части буккального аппарата. Кроме того, морфология отдельных челюстных элементов у анаспид принципиально отличается от морфологии крючков гимносомат. Как видно из рисунка 22, маргинальные зубья Akera по внешнему виду гораздо более схожи с крючками  Clione (ср. с Рис. 1), нежели элементы ее челюстей. Наконец, функционально челюсти у заднежаберных - весьма пассивная структура и у самых различных групп Opisthobranchia имеют отчётливую тенденцию к полной редукции. Напротив, крючки гимносомат очень подвижны и лабильны (А. Мартынов, неопубликованные наблюдения). Собранные данные убедительно демонстрируют, что крючки гимносомат имеют гораздо большее сходство с маргинальными зубьями радулы, нежели с челюстями их предковых форм.

Таким образом, используя данные об организации мотонейронной сети, иннервирующей исследуемую анатомическую структуру, нам удалось сделать вывод о ее эволюционном происхождении, причем этом вывод совпал с результатами  сравнительно-морфологических исследований.

4.2. Преобладание командных или модуляторных свойств гомологичного нейрона у разных видов моллюсков, возможно, зависит от особенностей контролируемого им поведения

Несмотря на наличие множества общих черт церебральных серотонинергических нейронов Ц1 у разных брюхоногих моллюсков, между этими клетками существуют некоторые различия. Одним из таких различий, представляющих особенный интерес в связи с исследованием Ц1 у Clione, является разный эффект стимуляции Ц1 на буккальную моторную программу. Так, у пресноводной улитки Helisoma trivolvis, стимуляция Ц1 может инициировать и поддерживать буккальный ритм на молчащих препаратах и ускорять его на препаратах со спонтанной жевательной активностью (Granzow and Kater, 1977). То есть Ц1 у этого животного демонстрирует выраженную командную функцию. В то же время у прудовика стимуляция Ц1 не приводит ни к инициации пищевой программы, ни к увеличению частоты уже идущего ритма, а приводит лишь к увеличению интенсивности разрядов мотонейронов ретракции радулы (McCrohan and Benjamin, 1980a). Таким образом, у Lymnaea Ц1 выполняет по отношению к пищевому поведению исключительно модуляторную функцию. Если расположить всех изученных брюхоногих моллюсков в соответствии с некоторой шкалой функций Ц1 по критерию командность - модуляторность, то с одного конца этой шкалы будет располагаться Helisoma, у которой командная функция Ц1 выражена максимально, а с другого конца Ц  Lymnaea. Все остальные изученные моллюски будут располагаться в разных местах этой шкалы между этими крайними точками. Так, у Pleurobranchea стимуляция Ц1 может активировать одиночный пищевой цикл, однако не способна поддерживать пищевой ритм на молчащих препаратах. При этом стимуляция Ц1 у этого моллюска увеличивает частоту уже идущего буккального ритма (Gillette & Davis, 1977).  Как показывают наши собственные, а также литературные данные, у Clione Ц1 несомненно обладает командной функцией: стимуляция этого нейрона приводит к запуску буккальной моторной программы. Возникает закономерный вопрос, чем вызвано такое различие функции Ц1 у разных моллюсков? Считается, что подобные отличия отражают эволюционные приспособления клеток к разным пищевым условиям, однако, например, Helisoma и Lymnaea, находящиеся на разных концах нашей виртуальной шкалы, демонстрируют довольно сходное пищевое поведение, заключающееся в ритмичных движениях радулы, соскребающей пищевой субстрат. Одно из возможных объяснений наблюдаемому явлению нам видится в разном паттерне активности буккальной массы во время пищевого поведения у разных моллюсков. Так, виды, у которых Ц1 играет преимущественно модуляторную роль (Lymnaea, Aplysia, Helix), питаются относительно твердой пищей (листья растений), для отделения которой требуется приложение определенных усилий; при этом скорость этих движений часто бывает небольшой. В то же время Helisoma и Planorbis во время пищевого поведения соскабливают с субстрата мягкие диатомовые водоросли, а у Clione ритмичные движения радулы способствуют заглатыванию мягкого тела жертвы (моллюск Limacina) целиком. Хищный моллюск Pleurobranchea и вовсе лишен радулы, и его консуматорное пищевое поведение заключается в ритмичном сокращении глотки, обеспечивающем всасывание пищи. Жевательный ритм при этом может быть гораздо более стереотипичным и, будучи раз инициированным, продолжаться определенное время без изменений. Так, и Helisoma, и Planorbis, попав на место, богатое диатомовыми водорослями, образно говоря, включают жевательный ритм и ползут вперед, как комбайн, методично опустошая поверхность. У Clione и Pleurobranchea после того, как жертва захвачена, начинается процесс ее проглатывания - процесс, длящийся достаточно долго и также допускающий запуск стереотипного жевательного ритма на продолжительное время. Соответственно, у всех четырех вышеописанных видов Ц1 в той или иной степени выполняет командную функцию по отношению к жевательному ритму. В противоположность этому, у аплизии консуматорная часть пищевого поведения часто включает в себя и откусывание пищи. Кроме того, при случайном поедании несъедобной пищи у аплизии запускается процесс отторжения - моторная программа, противоположная жеванию и проглатыванию. То есть здесь недопустим просто запуск жевательного ритма по принципу включил и забыл. Прудовик и виноградная улитка, как и аплизия, также питаются твердой пищей, и каждое жевательное усилие может слегка отличаться от предыдущего, поскольку геометрия куска пищи постоянно меняется в процессе ее поедания. И, как было показано в целом ряде работ, Ц1 у этих трех видов по отношению к пищевому поведению не выполняет командную (запускающую) функцию, а лишь модуляторную.

Таким образом, суммируя все вышесказанное, можно предложить следующую схему, объясняющую различия роли Ц1 в нейронных механизмах контроля пищевого поведения. Можно предположить, что влияние Ц1 на буккальную пищевую программу у разных видов брюхоногих моллюсков меняет свою функцию по шкале командность - модуляторность в зависимости от особенностей движений пищедобывательных структур в процессе консуматорной фазы пищевого поведения. У видов, питающихся мягкой пищей, у которых стереотипный жевательный ритм может быть запущен на некоторое продолжительное время, Ц1 обладает более выраженной командной функцией, тогда как у моллюсков, питающихся твердой пищей, где в каждый момент времени может потребоваться модификация или остановка жевательного ритма, Ц1 оказывает  скорее модуляторное влияние на пищевую программу.

4.3. Сравнение консервативности функции нейропептидов и классических медиаторов в нейронных механизмах поведения у родственных видов моллюсков

При исследовании роли пептида CNP4 в функционировании париетальных командных нейронов виноградной улитки было найдено, что в эффекте стимуляции командного нейрона на активность дыхальца помимо хорошо описанного прямого эффекта (экстренное закрытие дыхальца, торможение мотонейронов открытия и активация мотонейронов закрытия), существует еще и отставленный эффект стимуляции командных нейронов: значительное увеличение частоты и интенсивности движений дыхальца и усиление ритмической активности мотонейронов дыхальца. Также было найдено, что подобный эффект (интенсификация движений дыхальца) наблюдался при аппликации на ЦНС CNP4 - нейропептида, содержащегося в командных нейронах. Исходя из этих  данных, можно предположить, что именно пептиды, кодируемые геном HCS2, ответственны, по крайней мере частично, за отставленные эффекты стимуляции париетальных нейронов.

При изучении функции CNP-подобных пептидов на морском ангеле было обнаружено, что буккальные нейроны пищевода (Бк-ПИ) этого моллюска демонстрировали выраженную CNP-подобную иммунореактивность. С другой стороны, аппликация DYPRL-амида, одного из CNP пептидов виноградной улитки, увеличивала частоту биения ресничек в пищеводе Clione - эффект, сходный с эффектом внутриклеточной стимуляции Бк-ПИ клеток. Следовательно, вполне вероятно, что, по крайней мере частично, эффект стимуляции Бк-ПИ нейронов может быть опосредован нейропептидом, схожим с CNP пептидами виноградной улитки.

Таким образом, нейропептид CNP-семейства, по всей видимости, принимает участие в нейронных механизмах оборонительного поведения виноградной улитки, и при этом похожий пептид вовлечен в контроль пищевого поведения крылоногого моллюска Clione limacina. Оборонительное поведение у виноградной улитки доминирует над пищевым (Балабан и Захаров, 1992), в то время как у морского ангела пищевое (охотничье) поведение является доминантным по отношению к оборонительному (Norekian and Satterlie, 1996). В любом случае у обоих изученных видов пищевое и оборонительное поведение являются взаимоисключающими. Таким образом, как следует из полученных нами данных, CNP-подобный нейропептид у Clione и Helix вовлечен в контроль функционально противоположных видов поведения. Кроме того, как было недавно показано в нашей лаборатории, пептиды семейства CNP, по всей видимости, вовлечены в контроль активности сердечно-сосудистой системы виноградной улитки, а именно, обладают выраженной кардиостимулирующей функцией (Aseyev, 2010).

В интестинальных ганглиях Clione нами были идентифицированы четыре кардиоактивных нейрона Инт-КС, демонстрировавшие выраженную иммунореактивность к педальному пептиду тритонии (Тпеп). Кроме того, аппликация Тпеп имитировала эффект внутриклеточной стимуляции Инт-КС - вызывала сильную активацию предсердия и менее выраженную активацию желудочка. С другой стороны, у тритонии, животного, из которого, собственно, был выделен Тпеп, он регулирует функцию ресничного эпителия. Было показано, что этот нейропептид увеличивает частоту биения ресничек на поверхности ноги тритонии (Willows et al., 1997), в пищеводе (Pavlova et al., 1999) и слюнных железах (Gaston, 1999). Таким образом, как и в случае с CNP пептидами, мы сталкиваемся с тем, что один и тот же пептид выполняет совершенно разную функцию у разных, но эволюционно близких видов животных. Тпеп увеличивает активность ресничного эпителия у тритонии, тогда как родственный пептид у Clione активирует деятельность сердца.

Если же обратиться к ситуации с классическими медиаторами, то, похоже, ситуация здесь гораздо более консервативная. Так, ГАМК, как было показано в наших экспериментах, запускает пищевое поведение у виноградной улитки. Аналогичную функцию этот медиатор выполняет у Clione (Arshavsky et al., 1993) и Helisoma (Robinson et al., 1993). Серотонин посредством гомологичного церебрального нейрона Ц1 у всех изученных видов моллюсков выступает в качестве положительного модулятора пищевого поведения. Точно так же у широкого круга моллюсков серотонин выступает в качестве кардиоакселераторного, а ацетилхолин - в качестве кардиоингибиторного медиатора. Нельзя не упомянуть также изученную на многих видах подкрепляющую роль серотонина при выработке обучения. Таким образом, собранный массив данных указывает на то, что функции нейропептидов в нервной системе эволюционно близких видов гораздо менее консервативны по сравнению с функцией классических нейромедиаторов.

4.4. Распределенная или специализированная сеть?

Одной из замечательных особенностей нейронной сети является ее способность производить множество различных паттернов активности. В современной нейробиологии существуют две основных модели организации нейронной сети, обеспечивающие подобное многообразие (Hooper, 2005). Первая модель предполагает, что множественность выходных паттернов обеспечивается одной мультифункциональной сетью, состоящей из большого числа связанных между собой нейронов (Рис. 23). Различные модуляторные влияния приводят к модификации связей между клетками сети, что приводит к реконфигурации сети. В результате этого нейронная сеть начинает генерировать новый паттерн активности. Такую нейронную сеть часто называют распределенной (distributed), или мультифункциональной (Marder and Calabrese, 1996; Hooper and DiCaprio, 2004). Ярким примером распределенной нейронной сети является нейронная сеть, контролирующая изгибание пиявки в ответ на механическую стимуляцию кожи. Стимуляция дорзальной стороны пиявки вызывает вентральное сокращение, в то время как прикосновение с вентральной стороны вызывает дорзальный изгиб. Было показано, что эти сокращения контролируются высокораспределенной нейронной сетью в которой промежуточные интернейроны образуют синапсы со всеми мотонейронами и большинство интернейронов (включая антагонистические к данному сокращению) активны в той или иной степени во время сокращений любой направленности (Lockery and Kristan, 1990a, b; Lockery and Sejnowski, 1992). И в целом, большая часть описанных как на позвоночных, так и на беспозвоночных животных нейронных сетей устроена по принципу распределенных нейронных сетей. Так, реконфигурация нейронных сетей, ведущая к изменению паттерна выходной активности, как было показано, лежит в основе генерации разных паттернов дыхания у мышей: нормального дыхания, одиночных глубоких вдохов и форсированного дыхания (Lieske et al., 2000).

Другая концепция предполагает, что, условно говоря, каждый новый паттерн выходной активности обеспечивается специализированной нервной сетью, которая активна только при данном типе поведения и неактивна при других типах (Рис. 23). Такой принцип организации нейронных сетей называют специализированным (dedicated). Дж. Джинг и К. Вайс несколько модифицировали концепцию специализированной нервной сети, предположив, что сеть имеет модульную организацию, где каждый модуль представляет собой набор функционально связанных нейронов, производящих определенный идентифицируемый паттерн активности (Jing and Weiss, 2005). Множественные паттерны активности в данном случае будут достигаться комбинацией различных модулей. Авторы полагают, что подобная схема организации нейронной сети имеет вычислительные преимущества перед распределенной нервной сетью, поскольку требует гораздо меньшего количества вычислений для достижения того же результата. Пример модульной организации можно обнаружить в нейронной сети пищевого поведения аплизии. Во время естественного пищевого поведения аплизии длительность протракции и ретракции радулы сильно варьирует от цикла к циклу. Дж. Джинг и К. Вайс описывают два интернейрона, CBI-2 и CBI-12, производящие протракцию радулы большей или меньшей длительности соответственно. Было продемонстрировано, что CBI-2 преимущественно активирует два буккальных нейрона, B34 и B40, что приводит к возникновению длительной протракции, в то время как CBI-12 действует через B30 и B65, вызывая короткую протракцию. Таким образом, в нейронной сети пищевого поведения аплизии существуют два модуля, каждый из которых обеспечивает два разных паттерна протракции радулы: CBI-2/B34/B40 и CBI-12/B30/B65. Самое интересное, совместное действие этих двух модулей, активированных в разной степени, обеспечивает протракцию радулы промежуточной длительности (Jing and Weiss, 2005). В то же время нейронная сеть пищевого поведения аплизии представляет собой яркий пример распределенной сети. Так, было показано, что в результате реконфигурации одна и та же нейронная сеть способна производить несколько паттернов активности в процессе пищевого поведения: кусание, глотание, резание пищи и два паттерна отторжения пищи (Kupfermann, 1974; Morton and Chiel, 1993a,b; Nagahama et al., 1999).

Обнаруженные нами два разных паттерна активности, сменяющие друг друга на разных стадиях пищевого поведения Clione, контролируются, по всей видимости, одной и той же распределенной нейронной сетью. Во время первой (охотничьей) стадии пищевого поведения происходит резкая протракция буккальных щупалец, сопровождающаяся мощной и длительной активацией всех Цр-А мотонейронов протракции и торможением Цр-Б мотонейронов ретракции. Затем, на второй стадии, происходит активация буккальной ритмической моторной программы. За счет буккального интернейрона Бк-ПИН, который, с одной стороны, сам участвует в буккальном ритме, а с другой, активирует одновременно Цр-А и Цр-Б, происходит вовлечение церебральных мотонейронов щупалец в буккальный ритм. А функциональное выключение интернейрона Цр-Аинт делает возможной коактивацию Цр-А и Цр-Б мотонейронов, т.е. реконфигурацию сети, что приводит к тому, что частично втянутые буккальные щупальца и складки кожи, удерживающие лимацину, совершают ритмичные движения в такт с движениями крючков и радулы, что способствует экстракции лимацины из раковины. Таким образом, мы видим, что нейронная сеть пищевого поведения Clione построена по принципу распределенных, или мультифункциональных сетей.

В противоположность этому, контроль активного оборонительного поведения Clione реализован, по всей видимости, по совершенно иному принципу. Напомним, что активная оборонительная реакция Clione возникает при болевой стимуляции хвоста животного и представляет собой стартл-реакцию (один-два очень мощных взмаха крыльями), сразу за которой следует быстрое плавание (Satterlie et al., 1997). Было показано, что стартл-реакция контролируется педальными мотонейронами, которые никак не связаны с мотонейронами плавательного генератора, но при этом иннервируют те же мышцы, которые используются для плавания (Satterlie et al., 1997). То есть в данном случае мы имеем дело с разными высокоспециализированными нейронными сетями, контролирующими движения крыльев. Одна сеть контролирует плавание, а другая - стартл-реакцию.

Если рассмотреть внимательно схемы строения распределенной и специализированной нейронных сетей, то выясняется следующее. И та, и другая схема подразумевает наличие уровня командных нейронов, то есть нейронов принятия решения. Естественно, что на этом уровне команды о запуске того или иного вида поведения сегрегированы. А вот дальше, на следующем уровне, на уровне интернейронов, модель специализированных нейронных сетей подразумевает сегрегацию сигнала (каждая отдельная сеть обрабатывает свой сигнал), а модель распределенных сетей - нет. Однако на выходе и та, и другая схема подразумевает использование одних и тех же эфферентных структур, т.е. мотонейронов. В случае же с организацией нейронной сети активного избегательного поведения  Clione мы наблюдаем крайнюю степень сегрегации нейронных сетей - сегрегацию даже на мотонейронном уровне. Подобное разделение на мотонейронном уровне - явление довольно редкое (если вообще не единственное) в животном мире. Так, аналогичная стартл-реакция у рыб, запускаемая знаменитыми Маутнеровскими клетками, опосредуется абсолютно теми же мотонейронами, что используются для плавания. Разряд Маутнеровских клеток как бы навязывает плавательным мотонейронам другой тип активности, вне зависимости от того, какая активность наблюдалась в них до развития стартл-реакции (Fetcho, 1991).

Таким образом, в нервной системе Clione мы видим пример параллельного существования обоих типов организации нейронных сетей: распределенного и специализированного. В случае с Clione можно попытаться объяснить выбор соответствующего типа организации нейронной сети. Распределенные сети, судя по их широкому распространению в животном мире, являются, по всей видимости, более удачным способом организации нейронных сетей вообще, поскольку представляют собой более гибкий инструмент, обеспечивающий генерацию широкого репертуара поведенческих реакций при меньшем количестве используемых элементов сети. Однако такому способу организации присущ один существенный недостаток. Для реконфигурации нейронных сетей, происходящей вследствие изменений синаптических связей между нейронами в результате модуляторных влияний, требуется, пусть и небольшое, но время. А для осуществления избегательной стартл-реакции важны даже доли секунды, которые могут стоить животному жизни. Возможно, именно поэтому в создании нейронной сети оборонительного поведения Clione природа пошла по пути создания специализированных нейронных сетей, дойдя в этом процессе до крайностей - создания разных пулов специализированных мотонейронов, иннервирующих те же мышцы, но контролирующих разные типы поведения.

ВЫВОДЫ

1. Во время пищевого поведения Clione движения крючков четко скоординированы с движениями радулы: протракции крючков всегда соответствует ретракция радулы и наоборот. На нейронном уровне такая координация обеспечивается, во-первых, наличием электрических связей между мотонейронами, работающими в одну фазу, но иннервирующими разные структуры (между протракторами крючков и ретракторами радулы), и во-вторых, наличием реципрокных тормозных полисинаптических связей между нейронами, работающими в противоположные фазы и иннервирующими разные структуры (между протракторами крючков и протракторами радулы).

2. Мотонейронные сети крючков и радулы имеют, по всей видимости, общий центральный генератор паттернов, поскольку даже при неподвижных крючках, но активной радуле мотонейроны крючков получают ритмичные подпороговые входы, скоординированные по фазе с разрядами в мотонейронах радулы.

3. Пачечная активность мотонейрона ретракции крючков во время пищевого ритма смещена по фазе относительно остальных буккальных мотонейронов, что приводит к возникновению небольшого периода коактивации функционально антагонистических мотонейронов протракции и ретракции крючков. Этот период коактивации обеспечивает, по всей видимости, более резкий и сильный выброс крючка во время пищевого поведения Clione.

4. Описанный нами ГАМК-ергический церебральный интернейрон Цр-БМ осуществляет координацию нескольких структур, вовлеченных в пищевое поведение Clione: крючков, радулы, складок кожи, закрывающих ротовое отверстие, и буккальных щупалец. При этом данный интернейрон выполняет командную функцию по отношению к пищевому поведению Clione.

5. Во время пищевого поведения Clione существуют два четко различимых сменяющих друг друга паттерна двигательной активности буккальных щупалец: полная протракция во время первой фазы поведения и ритмическая активность в частично втянутом состоянии во время второй фазы. Клеточным механизмом, лежащим в основе смены паттерна двигательной активности буккальных щупалец, является реконфигурация активности церебральных мотонейронов протракции и ретракции буккальных щупалец: переход от антагонистического к синергическому паттерну активности этих двух групп мотонейронов. Триггерным механизмом, обеспечивающим реконфигурацию сети мотонейронов буккальных щупалец во время пищевого поведения, является изменение возбудимости ГАМК-ергического церебрального интернейрона Цр-Аинт.

6. Ц1 у Clione образуют моносинаптические серотонинергические связи с мотонейронами буккальных ганглиев, причем ответы в мотонейронах Бк-ПР и Бк-РР на потенциалы действия в Ц1 представляют собой двухфазные изменения мембранного потенциала: деполяризацию, за которой следует гиперполяризация. Подобный тип ответов на стимуляцию Ц1 у моллюсков описывается впервые. Как следствие наличия выраженной гиперполяризационной фазы ответов в буккальных мотонейронах на стимуляцию Ц1 у Clione, эти клетки, помимо общей для всех брюхоногих моллюсков функции активации буккальной моторной программы, имеют функцию фазово-зависимой координации активности мотонейронных сетей крючков и радулы.

7. Идентифицированные нами пептидергические буккальные нейроны Бк-ПИ обеспечивают активацию ресничного эпителия в пищеводе Clione во время пищевого поведения, что представляет собой новый, ранее не описанный, элемент нейронных механизмов пищевого поведения моллюсков. Бк-ПИ нейроны используют пептид, родственный CNP пептидам виноградной улитки, для осуществления контроля активности ресничного эпителия в пищеводе Clione.

8. Впервые показано, что гигантские серотонинергические церебральные клетки, описанные у всех без исключения изученных видов брюхоногих моллюсков, принимают участие в регуляции активности ресничного эпителия пищевода Clione, используя в качестве нейромедиатора серотонин.

9. Идентифицированные нами интестинальные кардиостимулирующие нейроны Clione влияют на активность сердца посредством пептида, родственного CNP пептидам виноградной улитки.

10. Кардиоактивные нейроны Clione влияют на активность сердца по-разному: педальный серотонинергический кардиоактиватор влияет только на активность желудочка, CNP-позитивные интестинальные кардиостимуляторы активируют или только предсердие, или как желудочек, так и предсердие (в зависимости от частоты импульсации), в то время как интестинальная Z-клетка активирует только работу предсердия.

11. При развитии пассивно-оборонительной реакции Clione, сопровождающейся общим угнетением функции сердечно-сосудистой системы, происходит отставленная активация нейронов, активирующих функцию предсердия - интестинальных кардиостимуляторов и Z-клетки. Это приводит к активации предсердия на фоне покоящегося желудочка, что, по всей видимости, обеспечивает кровенаполение желудочка и создает условия для последующей быстрой активации сердечно-сосудистой системы.

12. Идентифицированные нами плевральные вентролатеральные нейроны являются первично-сенсорными нейронами, опосредующими передачу тактильной информации в нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки.

13. Выделение CNP пептидов париетальными командными нейронами оборонительного поведения виноградной улитки приводит к отставленной активации висеральных мотонейронов дыхальца и интенсификации движений открытия-закрытия дыхальца.

14. Амплитуда кальциевых сигналов, сопровождающих высокоамплитудные ВПСП в командных нейронах, линейно зависит от силы синаптической стимуляции, в то время как динамика изменения амплитуды самих ВПСП при увеличении силы стимуляции демонстрирует выраженное насыщение. Это означает, что в определенном диапазоне изменений мембранного потенциала кальциевые сигналы более адекватно передают силу стимула, чем уровень деполяризации постсинаптического нейрона.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Malyshev A.Y., Norekian T.P., Willows A.O.D. Differential effects of serotonergic and peptidergic cardioexcitatory neurons on the heart activity in the pteropod mollusc, Clione limacina. J. Comp. Physiol. A., 1999, 185(6):551Ц560.
2. Balaban P.M., Poteryaev D.A., Zakharov I.S., Uvarov P., Malyshev A., Belyavsky A.V. Up- and down-regulation of HCS2 gene expression in the nervous system of terrestrial snail, Helix lucorum., Neuroscience, 2001, 103(2):551Ц559.
3.        Норекян Т.П., Никитин Е.С., Браваренко Н.И., Малышев А.Ю., Балабан П.М. Фазозависимая  координация двух моторных программ в буккальном ганглии крылоногого моллюска., 2001,  Журн. высш. нервн. деят., 51(6):765Ц771.
4. Bravarenko N.I., Ierusalimsky V.N., Korshunova T.A., Malyshev A.Y., Zakharov I.S., Balaban P.M.  Participation of GABA in establishing behavioral hierarchies in the terrestrial snail. Exp Brain Res., 2001, 141(3):340Ц348.
5. Malyshev A.Y., Norekian T.P. Phase-Locked Coordination between Two Rhythmically Active Feeding Structures in the Mollusk Clione limacina. I. Motor Neurons  J Neurophysiol 2002, 87(6):2996Ц3005.
6. Malyshev A.Y., Balaban P.M. Identification of Mechanoafferent Neurons in Terrestrial Snail: Response Properties and Synaptic Connections. J Neurophysiol., 2002, 87(5):2364Ц2371.
7. Boguslavsky D., Ierusalimsky V., Malyshev A., Balaban P., Belyavsky A. Selective blockade of gene expression in a single identified snail neuron. Neuroscience., 2003, 119(1): 15Ц18.
8. Bravarenko N.I., Korshunova T.A., Malyshev A.Y., Balaban P.M. Synaptic contact between mechanosensory neuron and withdrawal interneuron in terrestrial snail is mediated by L-glutamate-like transmitter. Neurosci Lett., 2003, 341(3):237Ц240.
9. Balaban P., Chistiakova M., Malyshev A., Volgushev M. Dependence of calcium influx in neocortical cells on temporal structure of depolarization, number of spikes, and blockade of NMDA receptors. J Neurosci Res., 2004, 76(4):481Ц487.
10. Браваренко Н.И., Малышев А.Ю., Воронин Л.Л., Балабан П.М. Эфаптическая обратная связь в идентифицированном синапсе наземного моллюска. Журн. высш. нервн. деят., 2004, 54(4):565Ц572. 
11. Norekian T.P., Malyshev A.Y. Coordinated excitatory effect of GABAergic interneurons on three feeding motor programs in the mollusk Clione limacina. J Neurophysiol,. 2005, 93(1): 305Ц315.
12. Коршунова Т.А., Малышев А.Ю., Захаров И.С., Иерусалимский В.Н., Балабан П.М. Функции пептида CNP4, кодируемого геном HCS2, в нервной системе Helix lucorum Журн. высш. нервн. деят., 2005, 55(1):91Ц99.        
13. Norekian T.P., Malyshev A.Y. Neural mechanisms underlying co-activation of functionally antagonistic motoneurons during a Clione feeding behavior. J Neurophysiol., 2006, 95(4):2560Ц2569.
14. Ivanova J.L., Leonova O.G., Popenko V.I., Ierusalimsky V.N., Korshunova T.A., Boguslavsky D.V., Malyshev A.Y., Balaban P.M., Belyavsky A.V. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell Mol Neurobiol., 2006, 26(2):127Ц144.
15. Lemak M.S., Bravarenko N.I., Bobrov M.Y., Bezuglov V.V., Ierusalimsky V.N., Storozhuk M.V., Malyshev A.Y., Balaban P.M. Cannabinoid regulation in identified synapse of terrestrial snail. Eur J Neurosci., 2007, 26(11):3207Ц3214.
16. Malyshev A.Y., Norekian T.P., Balaban P.M. Neural Control of Heartbeat during Two Antagonistic Behaviors: Whole Body Withdrawal and Escape Swimming in the Mollusk Clione limacina, J. Comp. Physiol. A., 2008, 194(10):899Ц906.
17. Malyshev A.Y., Balaban P.M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina J. Exp. Biol., 2009 Sep;212(18):2969Ц2976.
18. Malyshev A.Y., Balaban P.M. Serotonergic cerebral cells control activity of cilia in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacine J. Comp. Physiol. A., 2011 197(1):25Ц32.

ДРУГИЕ ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА

1. Volgushev M., Malyshev A., Balaban P., Chistiakova M., Volgushev S., Wolf F. Onset dynamics of action potentials in rat neocortical neurons and identified snail neurons: quantification of the difference. PLoS ONE., 2008, 3(4):e1962.
2. Tchumatchenko T., Malyshev A., Geisel T., Volgushev M., Wolf F. Correlations and synchrony in threshold neuron models. Phys. Rev. Lett., 2010, 104(5):058102.
3. Hoch T., Volgushev S., Malyshev A., Obermayer K., Volgushev M. Modulation of the amplitude of -band activity by stimulus phase enhances signal encoding. Eur J Neurosci., 2011, 33(7):1223Ц1239.
4. Balaban P.M., Malyshev A.Y., Ierusalimsky V.N., Aseyev N.A., Korshunova T.A., Bravarenko N.I, Lemak M.S., Roshchin M.V., Zakharov I.S., Popova E., Boyle R.  Functional Changes in the Snail Statocyst System Elicited by Microgravity. PLoS ONE., 2011, 6(3):e17710.
5.        Малышев А.Ю., Балабан П.М. Роль дендро-соматического выброса медиатора в межнейронной коммуникации. Росс. Физиол. Журн. им Сеченова., 2011, 11 (принято в печать).

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии