Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

На правах рукописи

ТИМОФЕЕВА НАДЕЖДА АЛЕКСАНДРОВНА

КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЧЕЛОВЕКА APE1 В ПРОЦЕССЕ ИНЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный консультант:

д.х.н., профессор Федорова Ольга Семеновна

Официальные оппоненты:

Малыгин Эрнст Георгиевич, д.х.н., профессор Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор Роспотребнадзора, г.н.с.

Белоусова Екатерина Анатольевна, к.х.н.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, м.н.с.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится л 15 июня 2012 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр-кт академика Лаврентьева,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан л ___ мая 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент Коваль В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большое число эндогенных и экзогенных факторов вызывают химические повреждения клеточной ДНК. Под действием ионизирующего излучения в отсутствие кислорода основными модифицированными основаниями являются 5,6-дигидропиримидины.

Образование 5,6-дигидроуридина (DHU) из цитидина может вызывать превращение G/C-пары ДНК в A/T-пару. В процессе эксцизионной репарации оснований (BER) репарация DHU начинается с действия ДНК-гликозилаз с образованием апуринового/апиримидинового сайта (AP-сайта). В организме человека ДНК разрезается с 5'-стороны от AP-сайта с помощью апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы APE1. Кроме того, APEспособна участвовать в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (NIR), разрезая ДНК с 5'-стороны от DHU по эндонуклеазному механизму, независимо от присутствия ДНК-гликозилаз. Из анализа кристаллической структуры комплекса APE1 с AP-ДНК ясно, что AP-сайт упакован в активном центре фермента очень плотно. Кристаллическая структура APE1 в комплексе с ДНК, содержащей повреждённое азотистое основание, репарируемое в процессе NIR, до сих пор не получена. Остаётся невыясненным вопрос о том, как фермент узнаёт и связывает объёмные повреждённые нуклеотиды и каков детальный кинетический механизм процесса NIR.

Цель настоящей работы состояла в установлении детального кинетического механизма действия AP-эндонуклеазы человека (APE1) в процессе инцизионной репарации нуклеотидов и его сравнении с кинетическим механизмом действия APE1 в процессе эксцизионной репарации оснований.

Задачи настоящего исследования состояли в том, чтобы:

Х исследовать динамику конформационных превращений фермента APE1 и ДНК-субстратов в предстационарных и стационарных условиях по регистрации изменений интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ферменте и остатков 2-аминопурина, введённых в ДНК-субстраты;

Х установить детальные кинетические механизмы взаимодействия APE1 с неповреждённой ДНК и ДНК, содержащей DHU или AP-сайт, и выяснить механизм связывания ферментом таких структурно различных повреждений, как AP-сайт и DHU;

Х изучить влияние делеции 61-ой аминокислоты на N-конце APE1 и замены лизина-98 белка на аланин на кинетические параметры действия фермента в процессах NIR и BER.

Научная новизна и практическая ценность работы. Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование кинетического механизма действия фермента APE1 и его мутантных форм APE1K98A и N61APE1 в процессе NIR. Предложены кинетические схемы взаимодействия APE1 с неповреждённой ДНК и ДНК, содержащей DHU или AP-сайт. Определены количественные параметры этих процессов.

Результаты, полученные в настоящей работе, важны для понимания механизма действия APE1 в процессе NIR и биологической роли такого пути репарации.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты работы были представлены на конференциях: Chemical and Biological Problems of Proteomics, Новосибирск, 2004; Физико-химическая биология, Новосибирск, 2006;

IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008; X International Conference on Environmental Mutagens, Флоренция, Италия, 2009; Медицинская геномика и протеомика, Новосибирск, 2009; Supramolecular Chemistry for Materials and Life Sciences, Новосибирск, 2010; л8th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids, Шеффилд, Великобритания, 2010; Физико-химическая биология, Новосибирск, 2011; Annual Meeting of European Environmental Mutagen Society, Барселона, Испания, 2011.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 186 страницах, содержит 49 рисунков, 10 схем и 35 таблиц. Библиография включает 182 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Фермент APE1 в процессе BER разрезает ДНК с 5'-стороны от AP-сайта (Рис. 1). В процессе NIR APE1 разрезает фосфодиэфирную связь с 5'-стороны от некоторых повреждённых дезоксинуклеотидов с образованием на 3'-конце разрыва гидроксильной группы, на 5'-конце - фосфатной (Рис. 1). Разрезание фосфодиэфирной связи AP-ДНК ферментом APE1 происходит по кислотноосновному SN2(P) каталитическому механизму, с участием двух ионов Mg2+.

Один из этих ионов находится в так называемом сайте связывания металла А, второй ион расположен в сайте связывания металла Б.

К началу выполнения данной работы уже были известны кристаллические структуры APE1 в свободном состоянии (Gorman M.A. et al., 1997; Beernink P.T. et al., 2001) и в комплексах с субстратом и продуктом эндонуклеазной реакции, содержащими аналог AP-сайта (Mol D.C. et al., 2000). Данных, свидетельствующих об изменении конформации фермента при взаимодействии с субстратом и в ходе ферментативной реакции, не было.

Напротив, из рентгеноструктурного анализа был сделан вывод, что APEимеет жёсткую заранее сформированную структуру для узнавания ДНК, содержащей AP-сайт. AP-сайт упакован в активном центре фермента очень плотно. Эта плотная упаковка исключает связывание нуклеотидов ДНК и специфична для -аномера природного AP-сайта. Кристаллической структуры APE1 в комплексе с ДНК, содержащей повреждённое азотистое основание, репарируемое в процессе NIR, до сих пор не получено. Оставался невыясненным вопрос о том, как фермент узнаёт и связывает объёмные повреждённые нуклеотиды. Поэтому представляло интерес провести детальное кинетическое исследование механизма взаимодействия фермента c ДНК-субстратами, специфическими для NIR, и сравнить кинетические механизмы взаимодействия APE1 с субстратами, специфическими для NIR- и BER-путей.

' ' 5 O O P O O - Рис. 1. Схема реакций, O O P O B O O катализируемых APE1 в B O процессах BER (X - OH) или OH O NIR (X - 5,6-дигидроурацил OO P O (DHU), 5,6-дигидротимин, O P O O APEO 5-гидроксиурацил, O X O X 5-гидроксицитозин, dA, dC, O - 3,N4-бензэтено-dC, O O P O O P O O 1,N6-бензэтено-dA, B O O B O 1,N2-бензэтено-dG.

O 2,6-диамино-4-гидрокси-5-NO O P O метилформамидопиримидин).

O P O O ' O ' Используя регистрацию флуоресценции остатков триптофана (Trp) белков и 2-аминопурина (2-аPu), введённых в субстраты, в настоящей работе была проанализирована конформационная динамика и изучен кинетический механизм действия APE1 дикого типа и его мутантных форм APE1K98A и N61APE1. Домен Ref-1 (61-на аминокислота на N-конце APE1) является регулятором транскрипции. По-видимому, для проявления активности BER этот домен не важен. В то же время предполагается, что этот домен может быть необходимым для проявления активности NIR. Lys98, вероятно, принимает опосредованное участие в координации иона Mg2+ в активном центре фермента, поскольку он образует водородные связи с карбоксильной группой Asp70, который вовлечён в связывание иона Mg2+ в сайте связывания металла А.

1. Методы исследования В работе использовали как метод лостановленной струи для изучения предстационарной кинетики ферментативных реакций, так и различные методы для исследования реакций, протекающих в стационарных условиях.

Ферментативные реакции проводили в буферах следующего состава: 20 мМ HEPES/KOH pH 7,5, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2 (буфер, оптимальный для BER или буфер BER); 20 мМ HEPES/KOH pH 6,8, 50 мМ KCl, 0,01 мМ MgCl(буфер, оптимальный для NIR или буфер NIR). Использовали набор ДНК-лигандов, содержащих или не содержащих специфические сайты узнавания (Таблица 1, Рис. 2).

Таблица 1. Олигодезоксирибонуклеотиды, использованные в работе.

d(TGACTGCATACGCATGTAGACGATGTGCAT) С d(TGACTGCATAFGCATGTAGACGATGTGCAT) F d(TGACTGCATA(AP)GCATGTAGACGATGTGCAT) AP d(TGACTGCATA(DHU)GCATGTAGACGATGTGCAT) DHU d(ATGCACATCGTCTACATGCGTATGCAGTCA) G d(TGACTGCAT(2-aPu)CGCATGTAGACGATGTGCAT) (2-aPu)C d(TGACTGCAT(2-aPu)(DHU)GCATGTAGACGATGTGCAT) (2-aPu)DHU d(TGACTGCATA(DHU)(2-aPu)CATGTAGACGATGTGCAT) DHU(2-aPu) d(TGACTGCATA) pd(FGCATGTAGACGATGTGCAT) pd((DHU)GCATGTAGACGATGTGCAT) O N NH Рис. 2. Структуры N O O O N O N O модифицированных O O O O N OH NHнуклеозидов, O O O O использованных в работе.

AP F DHU 2-aPu В качестве специфического субстрата для изучения процесса NIR использовали 30-звенный олигодезоксирибонуклеотидный дуплекс (ODN), содержащий остаток DHU в одной из цепей напротив гуанозина (DHU/G).

Кроме того, для регистрации конформационной динамики ДНК при взаимодействии с ферментом в этот двуцепочечный ODN вводили остаток 2аPu с 5'- ((2-aPu)DHU/G), либо 3'-стороны (DHU(2-aPu)/G) от DHU. В качестве специфических субстратов для изучения процесса BER использовали 30-звенные двуцепочечные ODN, содержащие природный AP-сайт (AP/G), либо его синтетический аналог 2-гидроксиметил-3-гидрокситетрагидрофуран (тетрагидрофуран, F) (F/G) в одной из цепей дуплекса напротив гуанозина. В качестве неспецифического субстрата как для NIR-, так и для BER- процессов использовали 30-звенный полностью комплементарный двуцепочечный ODN, несодержащий повреждений (C/G).

Кроме того, в этот неспецифический субстрат вводили остаток 2-аPu ((2-aPu)C/G). Для определения сродства исследованных форм фермента к продуктам реакций использовали двуцепочечные ODN с разрывом в одной цепи, моделирующие продукты ферментативного разрезания субстратов F/G или DHU/G. Количественную обработку кинетических кривых проводили с помощью метода нелинейной регрессии, включающего численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих кинетическую схему процесса. Для этого использовали программный пакет DynaFit (BioKin, США). Кинетические схемы, описывающие взаимодействие ферментов с субстратами или лигандами, представляли собой последовательности обратимых и необратимых стадий. Первая стадия соответствовала связыванию фермента с субстратом/лигандом. Завершающая стадия соответствовала диссоциации фермента из комплекса с продуктом ферментативной реакции или с лигандом. Кинетическая схема подбиралась таким образом, чтобы минимально возможное количество стадий описывало весь набор кинетических данных, полученных для исследуемого процесса.

Часть кинетических кривых, зарегистрированных в работе, полностью описывалась предложенной для соответствующего процесса схемой. В то же время большинство кинетических кривых описывались отдельными стадиями полной схемы. В этом случае полная схема ферментативного процесса составлялась путём объединения данных, полученных из разных кинетических кривых. В процессе количественной обработки кинетическая кривая разбивалась на временные диапазоны таким образом, чтобы каждый следующий диапазон включал предыдущий. Начальный диапазон обрабатывали в соответствии со схемой, содержащей начальные кинетические стадии. Обрабатывая следующий диапазон, к начальным стадиям добавляли ещё одну равновесную или неравновесную стадию.

2. Сродство APE1 к DHU-субстрату и продуктам ферментативного разрезания субстратов DHU/G и F/G Для определения сродства фермента дикого типа к субстрату DHU/G, а также сродства всех исследованных форм фермента к продуктам разрезания субстратов DHU/G и F/G проводили титрование ферментов в стационарных условиях соответствующими ДНК (данные не представлены). При этом регистрировали зависимости интенсивности флуоресценции остатков Trp от концентрации лигандов.

Значение равновесной константы диссоциации Kd комплекса APE1 с DHU-субстратом в буфере NIR составило (1,30,1)10-6 М. Значения равновесных констант диссоциации (KP) комплексов ферментов с продуктами представлены в Таблице 2. Значение Kd комплекса APE1 с DHU-субстратом (1,3 мкМ) практически совпадало с величиной KP для комплекса фермента с DHU-содержащим продуктом (1,4 мкМ). Таким образом, продукт разрезания субстрата, содержащего DHU, может являться конкурентным ингибитором APE1. Из Таблицы 2 видно, что фермент дикого типа и APE1K98A проявляют практически одинаковое сродство к продуктам реакций. Сродство N61APE1 к продуктам немного понижено.

KP, мкМ Буфер DHU-продукт F-продукт Таблица 2. Равновесные BER 2,20,3 0,480,APEконстанты диссоциации NIR 1,40,3 2,10,комплексов APE1, BER не определено 0,440,APE1K98A APE1K98A и N61APE1 с NIR 1,90,2 не определено продуктами разрезания BER не определено 0,830,N61APEсубстратов DHU/G и F/G.

NIR 2,30,4 не определено 3. Ферментативное разрезание [32P]-меченых субстратов Для определения скоростей накопления продуктов ферментативной реакции в процессе NIR были проведены эксперименты по ферментативному разрезанию 5'-[32P]-меченых субстратов DHU/G (Рис. 3) и (2-aPu)DHU/G (данные не представлены). Обнаружено, что за 35 часов фермент дикого типа расщепляет > 60% субстрата, содержащего остаток DHU, как в буфере NIR, так и BER (Рис 3А, Б). Тот же результат был получен и для субстрата, содержащего остаток 2-aPu ((2-aPu)DHU/G), в буфере NIR. Это показывает, что остаток 2-aPu не влияет на скорость разрезания ферментом субстрата, содержащего DHU, поэтому в этих условиях его можно использовать как нейтральную флуоресцентную группу. Видно (Рис. 3В, Г), что мутантные формы APE1K98A и N61APE1 работают медленнее фермента дикого типа.

На всех полученных кинетических кривых накопления продуктов (Рис. 3) можно выделить три фазы. В случае фермента дикого типа в первой фазе на временах < 20 с как в BER-, так и в NIR-буферах наблюдался скачок в накоплении продуктов. В следующих двух фазах продукты накапливались более медленно.

Рис. 3. Разрезание субстрата А Б DHU/G ферментами (1 мкМ) APE1 (А, Б), APE1K98A (В) и N61APE1 (Г) в буферах BER (А) и NIR (Б, В, Г).

Концентрации субстрата приведены на правой оси.

А, Б - На левых врезках изображены начальные участки кинетических В Г кривых, соответствующие окончанию фазы 1. На правых врезках - участки кинетических кривых, соответствующие фазе 2. В, Г - На врезках изображены начальные участки кинетических кривых, соответствующие фазе 1.

В случае мутантных форм фермента в первой фазе наблюдалось быстрое накопление продуктов с выходом на промежуточное плато на временах < 100 с в случае APE1K98A и на временах < 200 с в случае N61APE1. В следующих двух фазах продукты накапливались более медленно, как и в случае APE1. Вторая фаза накопления продукта наблюдалась на временах 20 < t < 2000 с для APE1, 100 < t < 20000 с для APE1K98A и 200 < t < 5000 с для N61APE1. Третья фаза соответствовала крайне медленному накоплению продукта и протекала на временах > 2000 с для APE1, > 20000 с для APE1K98A и > 5000 с для N61APE1. Медленное двухфазное накопление продукта может свидетельствовать о реакции с менее активной формой фермента и о существовании стабильного комплекса фермента с продуктом.

Особенностью всех описанных кинетических серий (Рис. 3) было то, что концентрация продуктов, образовавшихся в первой фазе процесса, была меньше соответствующей начальной концентрации фермента. Во всех случаях амплитуда первой фазы составляла ~15% от концентрации исходного DHU-субстрата.

4. Определение активности APEМетодом задержки в геле было показано, что с ДНК-лигандом, содержащим DHU, связывалось не менее 64%, 48% и 44% молекул APE1, APE1K98A и N61APE1, соответственно (данные не представлены).

Известно, что такой метод недооценивает количество связанной ДНК. Для точного определения доли активного фермента было проведено титрование APE1 неповреждённым лигандом (2-aPu)C/G, содержащим 2-aPu (Рис. 4).

Рис. 4. Флуоресцентное титрование APE1 (25 мкМ) неповреждённым 30-звенным ДНК-дуплексом (2-aPu)C/G в буфере NIR. Экспериментальные точки приведены после коррекции базовой линии.

При этом регистрировали изменение интенсивности флуоресценции 2-aPu, возникающее при связывании лиганда с ферментом. Возрастание интенсивности флуоресценции 2-aPu за счёт увеличения концентрации лиганда с 2-aPu исключали путём коррекции базовой линии. Концентрация APE1 составляла 25 мкМ и была намного больше константы диссоциации комплекса фермента с неповреждённым лигандом (Kd = 2,1 мкМ), определённой методом флуоресцентного титрования. В этих условиях весь лиганд образовывал комплекс с ферментом до тех пор, пока концентрация лиганда не превосходила концентрацию активных связывающих центров фермента (Рис. 4). На кривой возрастания интенсивности флуоресценции (Рис. 4) можно выделить один чётко выраженный излом в точке, соответствующей соотношению концентрации фермента и лиганда 1:1.

Исходя из этого, было сделано заключение, что около 100% молекул APEактивно для связывания. Таким образом, пониженная амплитуда первой фазы накопления продуктов на Рис. 3 не может быть вызвана снижением концентрации активного APE1 относительно общей концентрации белка.

Наиболее вероятно, что мутантные формы APE1K98A и N61APE1 ведут себя в отношении связывания субстрата так же, как и фермент дикого типа.

Одно из возможных объяснений снижения амплитуды первоначального скачка на кинетических кривых накопления DHU-продуктов (Рис. 3) может состоять в том, что фермент существует в двух конформациях. В начальный момент времени часть фермента существует в конформации (E1), энергетически менее выгодной, но более активной для разрезания DHU-субстрата; другая часть фермента существует в конформации (E2), энергетически более выгодной, но намного менее активной для разрезания данного субстрата. Менее активная форма фермента может либо непосредственно участвовать в формировании начального ферментсубстратного комплекса, либо находиться в равновесии с более активной формой. Поэтому как процесс формирования комплекса E2 с субстратом, так и конформационный переход E2 в E1 сильно смещены в обратную сторону.

Таким образом, в начальный момент времени (Рис. 3, фаза 1) при использованных концентрациях субстратов ~15% фермента APE1 и его мутантных форм находятся в каталитически активном фермент-субстратном комплексе, и процесс накопления продукта лимитируется скоростью химического разрезания DHU-субстрата ферментом, существующим в более активной конформации E1. В течение второй фазы (Рис. 3) накопление продукта лимитируется либо скоростью формирования комплекса менее активной формы E2 с DHU-субстратом, либо конформационным переходом формы E2 в форму E1. В течение третьей фазы (Рис. 3) накопление продукта лимитируется скоростью распада комплекса фермента с продуктом.

По-видимому, диссоциация фермента из комплекса с продуктом является лимитирующей стадией всего ферментативного процесса.

5. Изменение интенсивности флуоресценции 2-аминопурина, введённого в DHU-субстраты, в ходе взаимодействия APE1 с этими субстратами Была исследована динамика конформационных превращений в ДНК-субстрате, содержащем остаток DHU, в ходе ферментативного процесса путем регистрации изменения интенсивности флуоресценции остатка 2-aPu, располагавшегося в субстрате либо с 5'-, либо с 3'-стороны от DHU.

При связывании APE1 с неповреждённой ДНК ((2-aPu)C/G) не было обнаружено никаких изменений интенсивности флуоресценции 2-aPu во времени (данные не представлены). В то же время, при взаимодействии ферментов с субстратом (2-aPu)DHU/G на кинетических кривых можно выделить три фазы изменения интенсивности флуоресценции остатка 2-aPu (Рис. 5). В начальной быстрой фазе (для APE1 в буфере NIR < 0,2 с; для APEв буфере BER < 1 с; для APE1K98A < 20 с; для N61APE1 < 30 с) интенсивность флуоресценции остатков 2-aPu увеличивалась и выходила на промежуточное плато. Эти начальные отрезки возрастания интенсивности флуоресценции остатков 2-aPu по времени соответствовали отрезкам на Рис. 3 (Фаза 1), на которых происходило первоначальное накопление продуктов разрезания [32P]-меченого субстрата, содержащего DHU, то есть соответствовали химическому разрезанию DHU-субстрата ферментом, находящимся в более активной конформации. Вторая фаза увеличения интенсивности флуоресценции наблюдалась до ~1000 с для APE1, до ~4000 с для APE1K98A и до ~2000 с для N61APE1 (Рис. 5) и соответствовала изменению конформации продукта в комплексе с ферментом. Далее протекала третья фаза, которая соответствовала третьей фазе медленного накопления продуктов разрезания [32P]-меченого DHU-субстрата на Рис. 3, то есть диссоциации фермента из стабильного комплекса с продуктом.

А Б Рис. 5. Изменение интенсивности флуоресценции остатков 2-aPu при взаимодействии APE1 (А, Б), APE1K98A (В) и N61APE1 (Г) с субстратом (2-aPu)DHU/G В Г (1 мкМ) в буферах BER (А) и NIR (Б, В, Г) от времени.

Гладкие кривые - теоретическая подгонка.

Концентрации ферментов приведены на правой оси.

В случае взаимодействия APE1 c субстратом DHU(2-aPu)/G (Рис. 6А, Б), у которого остаток 2-aPu находится с 3'-стороны от DHU, увеличение интенсивности флуоресценции остатков 2-aPu в первой фазе (< 0,2 с) (Рис. 6Б) соответствует быстрому участку (Фаза 1) на Рис. 3Б, на котором происходит первоначальный скачок в накоплении продуктов разрезания [32P]-меченого DHU-субстрата, то есть быстрой стадии разрезания субстрата ферментом. Во второй фазе (< 10 с) (Рис. 6А) происходит изменение конформации продукта разрезания в комплексе с APE1. В третьей фазе (< 1000 с) (Рис. 6А), где наблюдается медленное увеличение интенсивности флуоресценции с выходом на плато, происходит ещё одно изменение конформации продукта в комплексе с APE1. При этом образуется стабильный комплекс фермента с продуктом, концентрация которого достигает равновесия на отрезке времени до 1000 с. Третья фаза на Рис. 6А соответствует второй фазе на Рис. 5Б.

Рис. 6. Изменение интенсивности А Б флуоресценции остатков 2-aPu при взаимодействии APE1 с субстратом DHU(2-aPu)/G (1 мкМ) в буфере NIR от времени. Гладкие кривые - теоретическая подгонка.

А - Полная кинетическая кривая;

Б - начальный участок кинетической кривой, представленный в увеличенном масштабе.

6. Изменение интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ходе взаимодействия APE1 с неповреждённым лигандом Была исследована динамика конформационных превращений в ферментах путем регистрации изменения интенсивности флуоресценции Trp на временах, не превышающих 10 с, что исключает выгорание белка.

При исследовании неспецифического связывания трёх форм APE1 с ДНК использовали неповреждённый 30-звенный ДНК-лиганд (C/G) (Рис. 7).

А В Д Б Г Е Рис. 7. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp при взаимодействии ферментов (1 мкМ) APE1 (А, Б), APE1K98A (В, Г) и N61APE1 (Д, Е) с C/G-лигандом в буферах BER (А, В, Д) и NIR (Б, Г, Е) от времени. Гладкие кривые - теоретическая подгонка.

По-видимому, начальное падение интенсивности флуоресценции на кинетических кривых (Рис. 7) отражало образование начального неспецифического фермент-субстратного комплекса. Дальнейшее изменение интенсивности флуоресценции соответствовало изомеризации начального комплекса. Такое двухстадийное связывание описывалось кинетической Схемой 1, содержащей две обратимые стадии. Таким образом, полученные экспериментальные данные ES1 isom свидетельствуют о том, что при kbind kon on E+S (ES)1 (ES)взаимодействии APE1 с неповреждённым kbind kES1 isom ДНК-лигандом после образования off off начального комплекса (ES1) фермент Схема изменяет свою конформацию. В результате обработки кинетических кривых в соответствии со Схемой 1 были получены значения кинетических параметров процессов взаимодействия APE1, APE1K98A и N61APE1 с C/G-лигандом (Таблица 3). В ряде случаев значения соответствующих констант скорости различны в разных буферах. Этот факт указывает на влияние pH и концентрации ионов Mg2+ на активность фермента.

Таблица 3. Константы скорости реакций, входящих в кинетическую Схему 1, для процессов взаимодействия APE1, APE1K98A и N61APE1 с C/G-лигандом.

bind bind ES1isom ES1isom Буфер (MЦ1сЦ1) 10Ц6 (сЦ1) kon koff kon (сЦ1) koff (сЦ1) APE1 111 20010 160,1 80BER APE1K98A 2,00,1 782 8,30,1 59N61APE1 6,20,1 501 4,30,1 55 APE1 0,440,01 121 0,820,01 1,50,NIR APE1K98A 3,80,1 711 0,230,01 280,N61APE1 6,60,1 101 0,280,01 0,100,7. Изменение интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ходе взаимодействия APE1 с субстратом, содержащим DHU Была исследована динамика конформационных превращений в ферментах APE1, APE1K98A и N61APE1 путём регистрации изменения интенсивности флуоресценции Trp в ходе взаимодействия с DHU-содержащим субстратом (DHU/G).

На кинетических кривых в случае APE1 в буфере BER (Рис. 8А) и мутантных форм фермента в буфере NIR (Рис. 8В, Г) наблюдалось сначала резкое падение интенсивности флуоресценции Trp (в случае APE1 до 50 мс; в случае APE1K98A для концентраций субстрата 0,75 мкМ, 1 мкМ до 0,1 с, для концентраций 1,25 мкМ, 1,5 мкМ, 2 мкМ до 1 с; в случае N61APE1 до 1 с), что, вероятно, соответствовало образованию комплексов ферментов в более активной конформации E1 с субстратом и изомеризации этих комплексов.

Затем в случае APE1 в буфере BER происходило небольшое возрастание интенсивности флуоресценции белка с выходом на плато, а в случае мутантных форм фермента наблюдалось более медленное снижение интенсивности флуоресценции. Это изменение интенсивности флуоресценции совпадало по времени с начальным увеличением интенсивности флуоресценции (2-aPu)DHU/G (Рис. 5, фаза 1), то есть соответствовало 1-ой быстрой фазе разрезания субстрата. На кинетических кривых в буфере NIR интенсивность флуоресценции Trp двухфазно снижалась (Рис. 8Б). Сравнение кинетических кривых, представленных на Рис. 8Б, с кинетическими кривыми, представленными на Рис. 5Б, 6, позволило сделать вывод о том, что первая стадия процесса взаимодействия APE1 с субстратом DHU/G в буфере NIR (Рис. 8Б) соответствует образованию комплекса фермента (E1) с субстратом, вторая стадия - изменению конформации белка в комплексе с продуктом ферментативной реакции, происходящему уже после каталитической стадии. Константы скорости прямой и обратной реакций стадии образования ферментbind bind субстратного комплекса ( *, *) представлены в Таблице 5. Константы kon koff скорости прямой и обратной реакций стадии изомеризации фермента в EP EP комплексе с продуктом составляют = 1,1 с-1, = 1,3 с-1, kon isom * koff isom * соответственно.

А Б Рис. 8. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp при взаимодействии ферментов (1 мкМ) APE(А, Б), APE1K98A (В) и В Г N61APE1 (Г) с субстратом DHU/G в буферах BER (А) и NIR (Б, В, Г) от времени.

Гладкие кривые - теоретическая подгонка.

8. Кинетический механизм APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов На основании полученных данных была предложена кинетическая схема ферментативного процесса, описывающая механизм превращения субстрата, содержащего остаток DHU, ферментом APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (Схема 2). В начальный момент времени часть фермента находится в более активной для разрезания DHU-субстрата конформации E1, тогда как другая часть фермента существует в менее активной конформации E2. Менее активная форма фермента E2 может либо непосредственно участвовать в формировании начального ферментсубстратного комплекса (ES)1, либо находиться в медленном равновесии с более активной формой E1. Фермент в более активной конформации Eбыстро образует начальный фермент-субстратный комплекс (ES)1, который подвергается двум конформационным переходам в (ES)2 и (ES)3. Затем протекает быстрый гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи субстрата, вслед за которым происходят две стадии конформационых превращений комплекса фермента с продуктом ферментативной реакции. После этого следует лимитирующая стадия диссоциации фермента из стабильного комплекса с продуктом. Поэтому регистрируемые кинетические кривые представляют собой суперпозицию превращений двух форм фермента E1 и E2.

Схема Каждая кинетическая кривая, полученная для процессов взаимодействия ферментов с DHU-содержащими субстратами (Рис. 3, 5, 6, 8), была количественно обработана в соответствии со Схемой 2 и с тем числом кинетических стадий, которое удалось зафиксировать на данной кривой.

Полученные кинетические параметры представлены в Таблицах 4, 5 для фермента дикого типа и в Таблице 6, для мутантных форм APE1N61 и APE1K98A, соответственно.

Таблица 4. Константы скорости реакций, входящих в кинетическую Схему 2, для процесса взаимодействия APE1 с субстратами, содержащими DHU, в буфере BER.

DHU/G (Рис. 8А) [32P]-DHU/G1 (Рис. 3А) (2-aPu)DHU/G1 (Рис. 5А) bind (380,1)1kon (MЦ1сЦ1) bind koff (сЦ1) 1310,ES1isom (сЦ1) 1450,kon ES (сЦ1) koff isom 360,bind (323)10-kinact (сЦ1) kcut (сЦ1) 200,1 150,EP (сЦ1) (160,6)10-k2 isom kEP diss (сЦ1)2 (222)10-6 (180,2)10-При расчётах полагали, что концентрация фермента, участвовавшего в расщеплении субстрата, составляла 15% от его исходной концентрации.

В значения константы kEP diss вносит дополнительную ошибку частичная инактивация фермента при длительной инкубации.

Таблица 5. Константы скорости реакций, входящих в кинетическую Схему 2, для процесса взаимодействия APE1 с субстратами, содержащими DHU, в буфере NIR.

DHU/G [32P]-DHU/G1 (Рис.3Б) (2-аPu)DHU/G1 DHU(2-аPu)/G(Рис. 8Б) {[32P]-(2-аPu)DHU/G}1 (Рис. 5Б) (Рис. 6) bind (2,90,1)1kon *(MЦ1сЦ1) bind koff * (сЦ1) 18(16020)10-bind kinact (сЦ1) {(25020)10-4} kcut (сЦ1) 4910 53EP (сЦ1) k1 isom 0,560,EP (сЦ1) k2 isom (370,3)10-4 (271)10-(133)10-kEP diss (сЦ1)2 (150,1)10-{(223)10-6} 1, См. Таблицу 4.

Таблица 6. Константы скорости реакций, входящих в кинетическую Схему 2, для процессов взаимодействия N61APE1 и APE1K98A с субстратами, содержащими DHU, в буфере NIR.

N61APE1 APE1K98A (2-aPu)DHU/G DHU/G [32P]-DHU/G1 (2-aPu)DHU/G1 DHU/G [32P]-DHU/G(Рис. 5В) (Рис. 8Г) (Рис. 3Г) (Рис. 5Г) (Рис. 8В) (Рис. 3В) bind (9,20,1)1kon (MЦ1сЦ1) (4,30,01)1bind 81koff (сЦ1) 130,ES1isom 4,10,kon (сЦ1) 1,60,ES130,koff isom (сЦ1) 1,60,ES1,70,kon isom (сЦ1) ES2,20,koff isom (сЦ1) bind (1,90,6)10-(112,1)10-kinact (сЦ1) 0,200,01 0,220,03 0,300,kcut(сЦ1) 0,110,01 0,100,01 0,100,EP (4,40,7)10-k2 isom (сЦ1) (7,90,41)10-(125)10-kEP diss(с-1)2 (9,41,1)10-6 (9,51,7)10-1, См. Таблицу 4.

9. Изменения интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ходе взаимодействия APE1 с F- и AP-субстратами Для определения кинетического механизма взаимодействия APE1 с субстратом в процессе BER в настоящей работе была исследована динамика конформационных превращений в APE1 (Рис. 9), APE1K98A (Рис. 10А, Б) и N61APE1 (Рис. 10В, Г) при их взаимодействии с субстратами F/G и AP/G.

При этом регистрировались изменения интенсивности флуоресценции остатков триптофана белков.

А Б В Рис. 9. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp при взаимодействии APE1 (1мкМ) с субстратами F/G (А, В) и AP/G (Б) в буферах BER (А, Б) и NIR (В) от времени. Гладкие кривые - теоретическая подгонка. Концентрации субстратов приведены на правой оси.

А Б Рис. 10. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Trp при взаимодействии APE1K98A (А, Б) и N61APE1 (В, Г) с В Г субстратами F/G (А, В) и AP/G (Б, Г) в буфере BER от времени. Концентрация ферментов составляла 1 мкМ (А, Б, Г) и 1,5 мкМ (В).

Начальное падение интенсивности флуоресценции на кинетических кривых (Рис. 9, 10) отражает стадии образования начального ферментсубстратного комплекса и изомеризации этого комплекса. Таким образом, можно заключить, что при связывании с субстратом, содержащим природный AP-сайт или его аналог, APE1 подвергается индуцированной конформационной подгонке. Небольшое возрастание интенсивности флуоресценции с выходом на плато в случае фермента дикого типа и N61APE1, а также перегиб на кинетических кривых в случае APE1K98A были отнесены нами к стадии гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи субстрата.

Дальнейшее медленное падение интенсивности флуоресценции, зарегистрированное на кинетических кривых в случае APE1K98A, по-видимому, соответствовало стадии изомеризации фермента в комплексе с продуктом реакции. На основании полученных данных предложена кинетическая схема, описывающая механизм действия фермента APE1 в процессе BER (Схема 3). Данная схема включает в себя две обратимые стадии (стадию образования начального фермент-субстратного комплекса и стадию его изомеризации), необратимую стадию гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи субстрата, обратимую стадию изомеризации фермента в комплексе с продуктом реакции и обратимую стадию диссоциации фермента из комплекса с продуктом.

ES1 isom EP isom kbind kon kon KP on E + S (ES)1 (ES)2 (EР)1 (EР)2 E + P ES1 isom EP isom kbind koff koff off Схема Каждая кинетическая кривая (Рис. 9, 10) была количественно обработана в соответствии с предложенной кинетической схемой и с тем числом кинетических стадий, которое удалось зафиксировать на данной кривой.

Полученные значения констант скорости для процессов взаимодействия ферментов с субстратами F/G и AP/G представлены в Таблицах 8 и 9.

Из полученных для AP- и F- субстратов экспериментальных данных невозможно выяснить, сколько конформаций имеет APE1 в начальный момент времени. Можно лишь предположить, что если фермент находится в двух конформационных формах, то конформационный переход сильно смещён в сторону формы, активной для разрезания этих субстратов.

Таблица 8. Константы Буфер NIR Буфер BER скорости реакций, F/G F/G AP/G входящих в bind (0,230,01)108 (3,80,1)108 (1,80,1)1kon (MЦ1сЦ1) кинетическую Схему 3, bind koff (сЦ1) 4,90,1 791 120для процесса ESвзаимодействия APE1 с (сЦ1) 241 591 18kon isom субстратами, ES (сЦ1) koff isom 681 181 32содержащими F и kcut (сЦ1) 1,00,1 681 97AP-сайт.

Таблица 9. Константы скорости реакций, входящих в кинетическую Схему 3, для процессов взаимодействия APE1K98A и N61APE1 с субстратами, содержащими F и AP-сайт, в буфере BER.

APE1K98A N61APEF/G AP/G F/G AP/G bind (3,70,1)108 (2,00,1)108 (1,60,1)108 (2,60,1)1kon (MЦ1сЦ1) bind koff (сЦ1) 381 4922 7,30,5 34ES (сЦ1) 301 2891 151 38kon isom ES (сЦ1) koff isom 3101 3552 581 4,20,kcut (сЦ1) 5,50,1 58EP (сЦ1) kon isom 2,70,EP (сЦ1) koff isom 1,50,10. Особенности взаимодействия APE1 с субстратами, содержащими DHU и AP-сайт В соответствии с моделью конформационной селекции (Ma B. et al., 2002; Ma B. et al., 2010) все белки изначально существуют в динамическом равновесии между различными конформационными формами, связывающими различные лиганды. Результаты, полученные в настоящей работе, выявили тот факт, что конформационная селекция присутствует в процессе связывания APE1 с DHU-субстратом. Получено, что APEсуществует по меньшей мере в двух конформациях, находящихся в равновесии. Показано, что фермент в комплексах с субстратами, содержащими DHU, AP-сайт и F, подвергается дальнейшим изменениям конформации. Эти данные указывают на существование линдуцированной конформационной подгонки фермента и субстрата при образовании комплексов APE1 с ДНК. Согласно модели линдуцированного соответствия (Koshland D.E. Jr., 1960), после образования начального комплекса с субстратом фермент подвергается конформационным изменениям перед каталитической стадией. Исходя из данных рентгеноструктурного анализа, AP-ДНК, связанная с APE1, изогнута на ~35, AP-сайт при этом вывернут из спирали. Можно предположить, что наблюдаемые в настоящей работе изменения конформации фермента после образования начального ферментсубстратного комплекса приводят к изгибанию ДНК и выворачиванию AP-сайта или DHU из спирали. При этом образуются каталитически активные фермент-субстратные комплексы, в которых происходит гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи субстратов. В то же время, в работе показано, что после образования комплекса с неповреждённой ДНК APE1 также меняет свою конформацию. Можно предположить, что, двигаясь по ДНК, APEменяет свою конформацию, непрерывно пытаясь образовать каталитически активный комплекс. Такой комплекс ферменту удаётся образовать лишь при взаимодействии с сайтами ДНК, которые содержат повреждения, являющиеся субстратами для APE1. Таким образом, механизм образования комплекса APE1 с ДНК-субстратом, вероятно, представляет собой комбинацию моделей конформационной селекции и линдуцированного соответствия. Активный центр фермента достаточно пластичен для того, чтобы связывать такие различные субстраты, как AP-сайт и DHU.

Полученные в работе данные указывают на то, что комплексы APE1 с продуктами разрезания субстратов, содержащих DHU, AP-сайт и F, стабильны. Ранее (Mol D.C. et al., 2000) было показано, что фермент APEструктурно оптимизирован для того, чтобы удерживать расщеплённую ДНК, содержащую AP-сайт. Результаты, полученные в настоящей работе, позволяют предположить, что структура данного фермента также оптимизирована для того, чтобы удерживать расщеплённую ДНК, содержащую остаток DHU. По-видимому, существование прочного комплекса между APE1 и продуктами разрезания субстратов обеспечивает координированное присоединение других белков, участвующих в репарации, к субстратам и передачу субстратов от одного фермента к другому.

Кроме того, данная работа показала, что скорость гидролитического разрезания ДНК-субстрата, содержащего DHU, ферментом APE1 в процессе NIR сопоставима по величине со скоростью разрезания ДНК-субстрата, содержащего AP-сайт, в процессе BER (Таблицы 5, 8). Это свидетельствует о том, что NIR может являться биологически значимым процессом.

11. Влияние замены K98A на кинетические характеристики APEПолученные данные показывают, что при образовании начального неспецифического фермент-субстратного комплекса мутация K98A практически устраняет наблюдавшиеся для APE1 большие различия между bind bind значениями соответствующих констант и, определёнными в двух kon koff разных буферах. Более того, замена Lys98 на Ala затрудняет индуцированную подгонку фермента в комплексе с неповреждённой ДНК.

Кроме того, мутация K98A значительно затрудняет индуцированную подгонку структуры фермента в комплексе с F-содержащим субстратом. Эта мутация в 12 раз понижает скорость гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи субстрата, содержащего F. В случае взаимодействия фермента с ДНК, содержащей природный AP-сайт, замена K98A существенно понижает стабильность начального комплекса (ES)1 и ускоряет конформационные переходы в комплексе фермента с AP-субстратом. Таким образом, APE1 поразному взаимодействует с AP-сайтом и остатком тетрагидрофурана, который широко используется в качестве стабильного аналога AP-сайта.

Получено, что в процессе NIR замена лизина-98 на аланин значительно bind замедляет активацию менее активной формы фермента E2 ( ) и в 200 раз kinact снижает скорость гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи DHU-субстрата. Более того, эта аминокислотная замена замедляет конформационную перестройку комплекса фермента с продуктом разрезания DHU-субстрата.

На основании того, что мутация K98A оказывает влияние на разрезание и DHU-субстрата, и F-субстрата, был сделан вывод, что двухвалентный ион металла, координированный в сайте А, для разрезания DHU-субстрата необходим так же, как и для разрезания AP-субстрата. Вероятно, APEиспользует один и тот же активный центр для катализа разрезания субстратов, содержащих DHU и AP-сайт.

12. Влияние домена Ref-1 на кинетические характеристики APEПолученные данные свидетельствуют о том, что отсутствие домена Ref-1 в APE1 приводит к увеличению стабильности начальных комплексов фермента как с неповреждённой ДНК, так и с ДНК, содержащей AP-сайт и F.

При образовании начального неспецифического фермент-субстратного комплекса, как и в случае замены K98A, мутация N61 устраняет наблюдавшиеся для APE1 большие различия между значениями константы bind, полученными в двух разных буферах. Следовательно, структура APEkon оптимизирована таким образом, что скорость начального связывания APE1 с неповреждённой ДНК сильно зависит от концентрации ионов Mg2+ и pH.

Более того, как и замена K98A, мутация N61 замедляет индуцированную подгонку фермента в комплексе с неповреждённой ДНК.

В процессе BER домен Ref-1 влияет на скорость изомеризации начального комплекса и стабильность второго каталитически активного фермент-субстратного комплекса, причём это влияние не одинаково в случае F- и AP- субстратов. В процессе NIR домен Ref-1 участвует в специфическом узнавании повреждённой ДНК, содержащей DHU, ускоряет активацию менее bind активной формы фермента E2 ( ), гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи kinact DHU-субстрата и конформационную перестройку комплекса фермента с продуктом разрезания DHU-субстрата. Домен Ref-1 немного повышает сродство APE1 к продуктам разрезания DHU-субстрата и F-субстрата.

Опираясь на эти данные можно предположить, что этот домен делает передачу расщеплённого продукта последующим ферментам, участвующим в репарации, более эффективной.

Присутствие домена Ref-1 в APE1 приводит к ускорению гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи DHU-субстрата в 500 раз, в то время как значительного влияния на скорость гидролиза F-субстрата не оказывает.

Исходя из этого, можно заключить, что в процессе эволюции APE1 вместе с доменом Ref-1 приобрёл способность осуществлять эффективную инцизионную репарацию нуклеотидов.

ВЫВОДЫ 1. Впервые установлен детальный кинетический механизм ферментативной реакции, катализируемой апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой человека APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (NIR).

Х Показано, что APE1 в свободном состоянии существует по меньшей мере в двух конформациях, находящихся в равновесии и обладающих разной способностью связывать ДНК. При этом связывание ДНК-субстрата ферментом происходит по механизму конформационной селекции.

Х Лимитирующей стадией процесса NIR является диссоциация фермента из комплекса с продуктом. Продукт разрезания DHU-субстрата может выступать конкурентным ингибитором APE1.

Х Скорость гидролитического разрезания ДНК-субстрата, содержащего 5,6-дигидроуридин, ферментом APE1 в процессе NIR сопоставима по величине со скоростью разрезания ДНК-субстрата, содержащего AP-сайт, в процессе BER, что свидетельствует о NIR, как о биологически значимом процессе.

2. Показано, что APE1 изменяет свою конформацию при образовании комплексов со специфическими и неспецифическими ДНК, а в комплексах с субстратами, содержащими DHU, AP-сайт или тетрагидрофуран, подвергается изменениям конформации перед стадией гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи, что свидетельствует об линдуцированной конформационной подгонке молекулы фермента.

3. Установлено, что замена остатка Lys98 на аланин и удаление домена Ref-1 (61 аминокислота с N-конца) влияют на кинетические характеристики ферментативных процессов с участием APE1.

Х Мутация Lys98Ala оказывает более сильное влияние на катализ в процессе NIR, чем в процессе BER.

Х Присутствие домена Ref-1 в APE1 приводит к уменьшению стабильности начальных комплексов APE1 как с неповреждённой ДНК, так и с ДНК, содержащей F или AP-сайт; специфическому узнаванию повреждённой ДНК, содержащей DHU; ускорению каталитической стадии в процессе NIR и увеличению стабильности комплекса фермента с продуктом, что может способствовать эффективной передаче расщеплённого продукта последующим ферментам, участвующим в процессах репарации NIR и BER.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Тимофеева, Н.А., Коваль, В.В., Федорова, О.С. Кинетический механизм действия фермента APE1 в эксцизионной репарации оснований // Вестник НГУ. - 2008. - Т. 6. - С. 90-95.

2. Timofeyeva, N.A., Koval, V.V., Knorre, D.G., Zharkov, D.O, Saparbaev, M.K., Ishchenko, A.A., Fedorova, O.S. Conformational dynamics of human AP endonuclease in base excision and nucleotide incision repair pathways // J. Biomol. Struct. Dyn. - 2009. - V. 26. - P. 637-652.

3. Тимофеева, Н.А., Коваль, В.В., Ищенко, А.А., Сапарбаев, М.К., Федорова, О.С. Кинетический механизм действия апуриновойапиримидиновой эндонуклеазы человека в процессе инцизионной репарации нуклеотидов // Биохимия. - 2011. - Т. 76. - С. 333Ц344.

4. Timofeyeva, N.A., Koval, V.V., Ishchenko, A.A., Saparbaev, M.K., Fedorova, O.S. Lys98 substitution in human AP endonuclease 1 affects the kinetic mechanism of enzyme action in base excision and nucleotide incision repair pathways // PLoS ONE. - 2011. - V. 6. - e24063.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии