Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Сивкова Татьяна Николаевна
Кариопатические и патоморфологические изменения под действием продуктов метаболизма паразитов и влияние на репродуктивную функцию домашних плотоядных
Специальность 03.00.11 - паразитология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва- 2010
Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.И.Скрябина (ВИГИС)
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор
БЕРЕЖКО Вера Кузьминична
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Новик Тамара Самуиловна
доктор биологических наук, профессор
Новак Михаил Дмитриевич
доктор биологических наук, доцент
Жданова Ольга Борисовна
Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии
Защита состоится 12 мая 2010г. в 11 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.011.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии имени К.И.Скрябина (ВИГИС)
Адрес: 117218, Москва, Б.Черемушкинская ул., д.28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС.
Автореферат размещен на официальном сайте ВАК РФ.
Автореферат разослан л_______________ 2010г.
Ученый секретарь Совета по защите
докторских и кандидатских диссертаций,
доктор биологических наук В.К. БЕРЕЖКО
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время на территории крупных городов собаки и кошки составляют подавляющее большинство пациентов ветеринарных клиник. По данным Воличева А.Н. (2000), Пешкова Р.А. (2007) среди всех заболеваний плотоядных инвазионные болезни занимают четвертое-пятое место. Широкому распространению паразитарных заболеваний способствуют незначительное количество мест, приспособленных для выгула собак, некачественное кормление и содержание животных, отсутствие своевременной диагностики этих заболеваний, дегельминтизация без контроля со стороны ветеринарных специалистов, а также отсутствие обработки против простейших.
Болезни репродуктивной системы мелких домашних животных составляют от 12 до 20% общего числа заболеваний (Федин А.А., 2005; Шафикова А.В., 2006). Этиологическими факторами при данных патологиях принято считать патогенную и условно-патогенную микрофлору (Емельянова Н.С., 2007, Кухарь И.В., 2007).
В последние годы активно идет изучение патологии при гельминтозах и разработка способов ее коррекции. Известно, что паразит оказывает на организм хозяина не только механическое, трофическое, но и аллергическое и токсическое воздействие. Токсины гельминтов угнетают деятельность центральной нервной, сердечно - сосудистой и пищеварительной систем. Установлено отрицательное влияние некоторых гельминтов на функцию органов размножения хозяев (Карбышева Н.В. и др., 2000; Карбышева Н.В. и др., 2001; Гасанова Т.А., 2006; Соловьева А.В., 2007; Weigel M.M. et al., 1996). Данные исследования проводятся, главным образом, в гуманитарной медицине, тогда как сведений о влиянии гельминтов и их токсинов на репродуктивную функцию домашних животных в литературе имеется недостаточно. В связи с возрастающей популярностью племенного разведения собак и кошек, широким распространением у них паразитарных заболеваний, проблема изучения влияния воздействия гельминтов на размножение мелких домашних животных является весьма актуальной.
Несмотря на то, что в настоящее время на рынке товаров для животных широко представлены различные промышленные корма, большинство владельцев продолжает отдавать предпочтение натуральному кормлению, которое осуществляется продуктами животного (мясо, рыба) и растительного происхождения (крупы). Жители крупных городов приобретают продукты в основном в специализированных магазинах или на рынках, где продукция животного происхождения сертифицирована и проходит ветеринарноЦсанитарный контроль.
Известно, что рыба, инвазированная личинками гельминтов, может стать причиной заражения человека и плотоядных животных. В речной рыбе содержатся метацеркарии трематод (Opisthorhis felineus, Clonorhis sinensis, Echinochasmus perfoliatus и др.) и плероцеркоиды широкого лентеца Dyphillobothrium latum. Большинство владельцев животных имеет представление об опасности этих заболеваний, поэтому избегает кормления собак и кошек сырой речной рыбой. Морскую рыбу часто скармливают в сыром виде.
Анизакидоз, вызванный личинками нематод семейства Anisakidae (Skrjabin et Korokhin, 1945), является опасным для здоровья человека заболеванием (Горохов В.В. и др.,1998; Довгалев А.С. и др., 1999; Карманова И.В. и др., 2002). Возбудители анизакидоза человека - личиночные стадии развития гельминтов родов Anisakis, Contracaecum, Pseudoterranova, Hysterothylacium. За последние годы во всем мире было зарегистрировано несколько случаев этого заболевания в основном в тех странах, где придерживаются традиционной японской и китайской кухни, в которой рыба и другие гидробионты используются в сыром или полусыром виде.
В замороженной рыбе и других гидробионтах допускается наличие нежизнеспособных личинок гельминтов (Поздняковский В.М. и др., 2005). Однако, товарная рыба, содержащая паразитов, вызывает негативную реакцию покупателей. Необходимо также помнить, что соматические белки гельминтов и продукты их метаболизма могут оказывать токсическое и аллергенное действие. Установлено, что инвазированная рыба имеет более интенсивную обсемененность микрофлорой по сравнению со здоровой, что отрицательно сказывается на сроках хранения (Софронова П.П., 1999; Гаевская А.В., 2004; Рамлочан П., 2006), и может стать причиной микробной интоксикации.
В связи с этим изучение патогенного воздействия гельминтов и простейших на функцию размножения животных актуально. Имеется необходимость разработки экономически эффективных методов обеззараживания рыбной продукции при таких опасных заболеваниях как анизакидоз.
Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение кариопатических и патоморфологических изменений под действием гельминтов и их антигенов, личинок анизакид и некоторых простейших на органы размножения и патологии беременности, разработка профилактических мероприятий.
В задачи исследований входило:
- Изучение распространения паразитозов домашних плотоядных и установление взаимосвязи с заболеваниями половой сферы.
- Исследование патологии плаценты на фоне паразитарных заболеваний.
- Выявление степени пораженности товарной рыбы личинками анизакид.
- Приготовление соматических антигенов-экстрактов и метаболитов гельминтов, их биохимический и иммунохимический анализ.
- Установление клинической и морфологической патологии, вызванной продуктами метаболизма личинок анизакид.
- Изучение эмбриотоксического и кариопатического действия продуктов жизнедеятельности личинок анизакид в сравнении с кариопатическим действием белковых продуктов жизнедеятельности других гельминтов.
- Установление степени влияния белковых компонентов личинок анизакид на репродуктивную функцию самцов лабораторных мышей.
- Оценка влияния витаминов - антиоксидантов на кариопатические свойства личинок анизакид.
- Разработка методов обезвреживания экскреторно - секреторных и соматических продуктов метаболизма личинок анизакид.
Научная новизна. Впервые изучено распространение гельминтозов и протозоозов желудочно-кишечного тракта среди домашних плотоядных животных г. Перми, выявлены случаи заражения ослеруозом, капилляриозом, спироцеркозом, мезоцестоидозом, криптоспоридиозом, неоспорозом, бластоцистозом. Впервые проведен серологический мониторинг токсоплазмоза собак и кошек и лямблиоза собак в городской популяции г. Перми.
Установлены патогистологические изменения в плаценте плотоядных на фоне инвазионной патологии.
Впервые оценено влияние соматических и экскреторно-секреторных продуктов личинок анизакид, токсокар, гидатигеры и дифиллоботриума на митоз клеток красного костного мозга и деление клеток семенников лабораторных животных. Выявлено эмбриотоксическое действие продуктов метаболизма личинок анизакид на лабораторных животных. Проведена оценка влияния термической обработки на кариопатические и патогенные свойства личинок анизакид.
Практическая ценность и внедрение результатов исследований.
Материалы исследований, выполненные автором самостоятельно, а также совместно с другими учеными и специалистами используются для чтения лекций и проведения лабораторных занятий со студентами факультета ветеринарной медицины по курсу Паразитология и инвазионные болезни животных в ФГОУ ВПО Пермская ГСХА.
Разработаны:
- Рекомендации Гельминтологические исследования, ПГСХА, 2005;
- Методическое пособие Получение и характеристика антигенов гельминтов, ПГСХА, 2009;
- Методическое пособие Профилактика анизакидоза, ПГСХА, 2009;
- абораторный регламент На проведение кариопатической оценки продуктов метаболизма гельминтов in vivo, утвержден на секции Инвазионные болезни животных РАСХН 25 сентября 2009г;
- Методические рекомендации Способ определения поражения рыбной продукции личинками анизакид, утверждены на секции Инвазионные болезни животных РАСХН 25 сентября 2009г.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на Всероссийской конференции Актуальные вопросы ветеринарной медицины мелких домашних животных, Екатеринбург, 2004; Международной научно-практической конференции Вузовская наука - сельскому хозяйству, Барнаул, 2005; Научных конференциях Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями (2007-2009гг.); Первой региональной научно-практической конференции Организм как среда обитания, Оренбург, 15-17 мая 2007 г.; Научно-практической конференции Современные проблемы биологии, экологии, физиологии и ветеринарии домашних животных, Тюмень, 2008; VI Международной научно-практической конференции Паразитарные болезни человека, животных и растений, Витебск, ВГМА, 2008; Всероссийских научно-практических конференциях ФГОУ ВПО Пермская ГСХА (2005-2010гг.); Всероссийской научно-практической конференции Инновационный потенциал аграрной науки - основа развития АПК, Пермь, 2008; Международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию Саратовского Госагроуниверситета Вавиловские чтения, Саратов, 2008; Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию образования Волгоградской государственной сельскохозяйственной академии, Использование инновационных технологий для решения проблем АПК в современных условиях, Волгоград, 2009; Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения П.Г.Петского, Современные научные тенденции в животноводстве, Киров, 16-17 апреля 2009 года; Региональной конференции молодых ученых Современные тенденции развития АПК в Северном Зауралье, Тюмень, 2009; Всероссийской научно-практической конференции Современные достижения ветеринарной медицины сельскохозяйственному производству, Донской ГАУ, 2009; Международной научно-практической конференции Высшее образование и аграрная наука - сельскому хозяйству, Казахстан, Семей, 2009; Международной научно-практической конференции, посвященной 35-лению образования факультета ветеринарной медицины Кубанского государственного аграрного университета Достижения современной ветеринарной науки и практики в области охраны здоровья животных, 2009; секции Инвазионные болезни животных РАСХН 25 сентября 2009г.; научной конференции Современный мир, природа и человек, Томск, 2009; научной конференции Актуальные проблемы инфекционной патологии, Томск, 2009; Международной научно-практической конференции Вавиловские чтения, Саратов, 2009.
ичный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом многолетних (с 2002 по 2010 год) научных исследований автора. Исследования паразитофауны плотоядных, сбор патологического и гельминтного материала, приготовление антигенов-экстрактов и метаболитов и оценка их кариопатического и аллергенного действия, в том числе внутрибрюшинная иммунизация мышей, пероральное введение крысам личинок гельминтов, вскрытие лабораторных животных и приготовление мазков отпечатков красного костного мозга и семенников с последующим микроскопическим анализом выполнены диссертантом лично. Гистологические исследования были проведены в лаборатории гистопатологии Краевой детской клинической больницы Пермского Края при участии к.м.н. Патлусовой Е.С.
Работа выполнялась при консультативном руководстве доктора биологических наук, профессора В.К. Бережко.
Основные положения, выносимые на защиту.
- Анализ зараженности кошек и собак городской популяции Перми инвазионными болезнями.
- Влияние гельминтов и простейших на морфологию плаценты, патологию органов размножения плотоядных.
- Получение экстрактов и метаболитов гельминтов и оценка их антигенного, кариопатического и патоморфологического влияния на клетки и органы лабораторных животных, кариопротективное действие витаминов-антиоксидантов А и Е.
- Распространение личиночного анизакидоза товарной рыбы.
- Иммунохимический анализ антигена-экстракта из личинок анизакид.
- Влияние температурной обработки и СВЧ на антигенное и кариопатическое действие личинок анизакид.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ, в том числе 7 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для докторских диссертаций, в которых изложены основные положения и выводы по изучаемым вопросам.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 243 страницах компьютерного текста, включает 26 таблиц, 40 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, список литературы и приложение. Список использованной литературы включает 394 источника, в том числе 239 отечественных и 155 зарубежных авторов.
- ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В главе представлен анализ работ по распространению гельминтов и простейших у плотоядных животных на территории Российской Федерации, влиянию инвазии на деление половых и соматических клеток организма хозяина и протективному действию витаминов - антиоксидантов, развитию патологии беременности на фоне паразитарных заболеваний. Представлены данные по распространению личиночного анизакидоза среди морской рыбы и способов ее обеззараживания, методов диагностики данной инвазии у человека и животных.
- СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Материалы и методы
Исследования паразитофауны домашних плотоядных
Для определения экстенсивности инвазии кишечными паразитами проводили обследование домашних кошек и собак, которые поступали в ветеринарные клиники города. Кроме того, обследованию подвергали собак различных служебных пород (немецкая, кавказская, среднеазиатская и французская овчарки, ротвейлеры, лабрадоры, сенбернары, русские спаниели, американские кокер-спаниели и спрингер-спаниели) в возрасте от 1 месяца до 9 лет, принадлежавших питомнику Зонального кинологического центра при ГУВД г. Перми, колониям общего режима и питомнику при Пермском колледже юстиции. Для выявления инвазированности безнадзорных животных обследовали кошек и собак из Пермского муниципального приюта.
Фекалии плотоядных собирали сразу после выделения в чистую сухую пластиковую промаркированную посуду. Исследование проводили комбинированным методом Г.А. Котельникова и В.М. Хренова (1984г.) с раствором аммиачной селитры плотностью 1,3 г/мл. Для диагностики криптоспоридиоза готовили тонкие мазки фекалий с последующим окрашиванием по методике Циля - Нильсена. Для выявления цист лямблий и других простейших, а также яиц трематод свежевыделенные фекалии собирали в контейнеры с консервантом Турдыева, тщательно перемешивали и исследовали методом формалин-эфирного осаждения (Новикова Т.В., 2005). Исследования на лямблиоз проводили трехкратно с интервалом 3-5 дней (Бандурина Т.Ю., Кнорринг Г.Ю., 2003; Коровина Н.А., 2004).
Для диагностики дирофиляриоза собирали пробы венозной крови в количестве 2-3-мл с добавлением гепарина; 1 мл гепаринизированной крови отстаивали с 9 мл дистиллированной воды в течение 5 мин, затем центрифугировали 5 мин при 2000 об/мин и исследовали осадок на наличие личинок - микрофилярий (Ястреб В.Б., 2005).
Посмертно проводили компрессорную трихинеллоскопию поперечно-полосатых мышц для выявления инцистированных личинок. Таким образом, было исследовано 113 трупов собак и 143 - кошек как домашних, так и безнадзорных.
Для диагностики кровепаразитарных заболеваний (пироплазмоз) готовили тонкие мазки периферической крови собак, полученной из когтя, окрашивали их по методике Романовского-Гимзы, а затем микроскопировали под иммерсионным увеличением микроскопа. Всего таким способом было анализировано 180 проб.
Для обнаружения антител к возбудителю токсоплазмоза собирали сыворотку крови домашних и содержащихся в приюте собак и кошек и исследовали с помощью иммуноферментной тест - системы ИФА - анти-Тох. g - Cate - Dog (Казанская ГАВМ), предоставленной профессором Р.Х. Равиловым. Таким образом, было обследовано 218 животных.
Обнаружение антител к антигенам лямблий проводили у собак с помощью диагностического набора (Вектор-Бест). В качестве конъюгата использовали антитела диагностические против IgG сыворотки крови собаки, меченные пероксидазой хрена (Медгамал) в титре 1:4000.
Гистологические исследования.
От абортировавших или оперированных по поводу овариогистеректомии кошек и собак собирали плоды, плаценты, матку и яичники. От экспериментальных белых мышей и лабораторных крыс собирали печень, селезенку, костный мозг, участки тонкого кишечника, семенники, матки, яичники, плаценты. Собранный материал промывали, фиксировали 10%-ным раствором нейтрального формалина с целью уплотнения. Далее производили вырезку кусочков и проводку их по спиртам возрастающей крепости с целью обезвоживания по общепринятой методике. После проводки кусочки заливали в парафин и изготавливали блоки 2х2см. С полученных блоков на микротоме-полуавтомате делали срезы толщиной 4-5 микрон. Их помещали на предметное стекло и окрашивали гематоксилином и эозином (обзорная методика) и по ван Гизон с целью выявления степени развития склеропластических процессов в органах. Просмотр готовых препаратов производили с помощью микроскопа фирмы УLeicaФ и УZeissФ при увеличении окуляра х10, с объективами х4; х40 и х100 с подробным описанием имеющейся морфологической картины в органах. Оценивали дисциркуляторные, дистрофические, склеропластические, воспалительные, гиперпластические, регенераторные процессы в органах.
В семенниках описывали состояние сперматогенного эпителия, наличие митозов и степень выраженности сперматогенеза. В плаценте животных оценивали четыре группы основных процессов: инволютивные, компенсаторные, дисциркуляторные и воспалительные. В костном мозге - степень развития каждого ростка гемопоэза с выявлением возможных нарушений морфогенеза клеток. В органах РЭС (печень, селезенка) производили оценку морфологии и локализации клеток макрофагально-гистиоцитарного ряда с целью выяснения их структурно-функциональной принадлежности (воспалительный или иммунокомпетентный генез). Для этого использовали иммуногистохимический метод с антителами S-100 и CD99. Иллюстративный раздел работы выполнен с использованием цифровой видеокамеры УSonyФ на компьютере УPentium-IIIФ и Toshiba. Наиболее интересные и показательные фрагменты микропрепаратов фотографировали и сохраняли в памяти компьютера.
Получение материала из гельминтов, приготовление соматического экстракта и его биохимический анализ
Для паразитологического исследования использовали свежемороженую рыбу, приобретенную в различных торговых точках города. После размораживания тушки рыбы вскрывали по общепринятой методике. Обнаруженных гельминтов извлекали, подсчитывали их количество (интенсивность - ИИ и экстенсивность инвазии - ЭИ). Выделенных личинок нематод фиксировали в жидкости Барбагалло для последующего определения и описания. Определение принадлежности выделенных личинок проводили с применением ключа, основанного на морфологических особенностях этих паразитов (Гаевская А.В., 2005). Часть гельминтов фиксировали в 10%-ном формалине и проводили гистологическое исследование по описанной выше методике. Жизнеспособность анизакисов устанавливали с помощью температурного теста в растворе искусственного желудочного сока.
Извлеченных из тушек рыбы личинок A.simplex 3-й стадии тщательно многократно промывали проточной водой, затем обрабатывали растворами антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и нистатин), стерильным физиологическим раствором и замораживали. После многократного замораживания и оттаивания личинок гомогенизировали, заливали стерильным забуференным физиологическим раствором (рН 7,2) и экстрагировали при температуре +4С в течение 18 часов. После этого раствор сливали и процедуру повторяли. Полученный антиген хранили в замороженном состоянии при температуре -10С.
Контроль на стерильность. Для обнаружения контаминации бактериями, грибами и микоплазмами пробу экстракта из личинок анизакид высевали на МПА, МПБ и МППБ по одной пробирке. Для выявления грибковой контаминации антиген высевали на агар Сабуро в две чашки Петри. На микоплазменную контаминацию пробу антигена высевали на универсальной плотной среде для выделения микоплазм (ООО Научно-производственная фирма Диагност-Мед) согласно инструкции в две чашки Петри. Посевы на МПА, МПБ и МППБ выдерживали в течение 10 суток при +37С, посевы на полужидком агаре - 14 дней при +37С, и на среде Сабуро - 15 дней при +23С. При обнаружении хотя бы одного из контаминантов партию экстракта считали нестерильной и в дальнейшей работе не использовали.
Определение содержания белка. Концентрацию белка в полученном экстракте определяли на биохимическом полуавтоматическом анализаторе StatFax 1904+ (AWARENESS technology inc) с использованием набора реактивов Spinreact, S.A. согласно инструкции, при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали фосфатно-солевой буферный раствор.
Для сравнения кариопатического и антигенного действия белкового экстракта из личинок анизакид с антигенами других гельминтов готовили соматические экстракты из Diphyllobothrium latum, Hydatigera taeniamorfis, Toxocara canis. Проводили их биохимический анализ на биохимическом анализаторе StatFax 1904+ с помощью набора реактивов Spinreact, S.A. согласно инструкции: аспартат-аминотрансфереза, аланин-аминотрансфераза, щелочная фосфатаза, триглицериды.
Получение экскреторно-секреторного антигена T. canis
В качестве антигена также использовали метаболиты, полученные при культивировании яиц и личинок T.canis. Для этого выделенных от спонтанно зараженных животных гельминтов обрабатывали по описанной выше методике. Самок нематод вскрывали, извлекали матку с яйцами, которые культивировали в жидкой питательной среде 199 с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Perbio) при температуре +37С в течение 7 дней. Метаболиты личинок собирали, очищали центрифугированием и замораживали при температуре -10С для дальнейшего использования. Контроль на стерильность и определение содержания белка проводили с помощью методов, описанных ранее.
Изучение кариопатических свойств антигенов гельминтов
Для изучения кариопатического действия антигенов гельминтов проводили однократное внутрибрюшинное введение нелинейным белым мышам-самцам массой 18-20г 100 мкг белка-антигена. Контрольной группе животных внутрибрюшинно вводили 0,1мл забуференного физиологического раствора. Количество животных в каждой группе составило 12. Убой мышей проводили через 4; 12; 24; 48 и 72 часа после введения материала.
Для выявления протективного действия на клетки красного костного мозга витаминов-антиоксидантов группе мышей в течение пяти дней перорально вводили масляный раствор Аевит в терапевтической дозе, затем также проводили внутрибрюшинное введение белкового экстракта в дозе 100 мкг.
Для определения эффективности термической обработки пробу антигена-экстракта A.simplex обрабатывали с помощью СВЧ-нагревания в бытовой микроволновой печи в течение 1 мин. Также применяли обработку белкового экстракта 15-минутным кипячением на водяной бане. Обработанные таким образом антигенные продукты использовали для введения мышам-самцам по описанной выше схеме. После этого по стандартной методике проводили гистологическое исследование печени, селезенки, красного костного мозга и семенников. Также из красного костного мозга грудины и семенников готовили мазки-отпечатки, которые фиксировали по Май-Грюнвальду, а затем окрашивали азур-эозином по Романовскому. При микроскопировании подсчитывали количество делящихся клеток, учитывали форму, размеры и окраску ядер. Отмечали количество цитопатических и кариопатических нарушений в опытных и контрольных группах животных.
Оплодотворяющая способность мышей-самцов после внутрибрюшинного введения соматического антигена из личинок анизакид
Для выявления действия антигена-экстракта из личинок анизакид на функцию размножения проводили внутрибрюшинное введение самцам мышей массой 22-24г данного антигена как описано выше. К каждому самцу подсаживали по 4 взрослых интактных самки и оставляли на 3-4 дня. Контролем служили самки того же возраста, подсаженные к интактным самцам. С этого дня начинали отсчет сроков беременности. Кормление и содержание опытных животных оставалось неизменным на протяжении всего эксперимента. Затем самцов отсаживали, а самок содержали до 20 дня беременности, после чего подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Извлекали матку с яичниками. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, в матке - количество плацент и плодов. Выявляли предимплантационную и постимплантационную смертность плодов. Штангенциркулем определяли диаметр плаценты и краниокаудальную длину плодов, массу плацент и плодов определяли на весах ВЛКТ-500g-М. Проводили внешний осмотр плодов на наличие уродств (отсутствие глаз, пальцев, расщепление неба и т.д.).
Морфологические изменения плаценты белых крыс при пероральном введении личинок анизакид, контроль эмбрионального развития
Для определения влияния экскреторно-секреторных и соматических продуктов личинок Anisakidae на эмбриональное развитие плодов использовали половозрелых нелинейных лабораторных крыс-самок (Rattus norvegicus) массой 120-150г. Отобранных беременных животных распределяли на несколько групп. Животным первой, второй и третьей групп перорально вводили личинок анизакид в растворе антибиотиков в дозе соответственно 10, 50 и 100 экз. на животное. Сроки введения составляли 1-2 день, 7-8 день и 13-14 дни беременности, которые являются критическими сроками эмбриогенеза крыс (соответственно образование зиготы, закрытие невропора и активного органогенеза). Животным четвертой группы выпаивали только антибиотики на 0,9%-ном стерильном растворе хлорида натрия в те же сроки. Самки пятой группы служили интактным контролем. Кормление и содержание подопытных животных оставалось неизменным на протяжении всего эксперимента.
Самок подвергали эвтаназии на 20 сутки под воздействием эфира методом декапитации. При вскрытии извлекали матку с плодами и яичники. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, в матке - количество плацент и плодов. Определяли предимплантационную и постимплантационную смертность. С помощью штангенциркуля измеряли диаметр плаценты и краниокаудальную длину плодов, массу плацент и плодов определяли на весах ВЛКТ-500g-М. Проводили внешний осмотр плодов на наличие уродств.
Оценка действия личинок анизакид при пероральном введении самцам крыс на гематологические показатели и гистологическую картину
Патоморфологическое действие соматических продуктов личинок анизакид изучали на 60 самцах нелинейных лабораторных крыс, массой 120 - 150г. Подопытных животных распределяли на несколько групп по принципу аналогов. Животным опытных групп перорально инокулировали нежизнеспособных личинок анизакид в дозах 5; 10; 25; 50 и 100 штук на голову, соответственно. Шестая группа служила интактным контролем.
Для определения динамики изменения клеточного иммунного ответа на 3; 5 и 10 сутки проводили исследование периферической крови для подсчета лейкограммы. Кровь для анализа брали из когтя, готовили тонкие мазки, которые фиксировали по Май-Грюнвальду и окрашивали по Романовскому.
Инвазированную рыбу делили на три группы в зависимости от индекса зараженности (интенсивности инвазии - ИИ). Рыбу, инвазированную менее чем 10 личинками (партия 1), 10-50 личинками (партия 2) и рыбу, инвазированную более 50 личинками (партия 3) измельчали на мясорубке до состояния однородного фарша. Опытным группам животных в течение 10 дней скармливали рыбный фарш, подогретый до комнатной температуры, животные контрольной группы находились на обычном рационе.
На десятые сутки крыс декапитировали под эфирным наркозом. Семенники, печень, селезенку, желудок и участок тонкого кишечника фиксировали 10%-ным нейтральным формалином для гистологического исследования. В эти же сроки отбирали кровь из сердца для проведения биохимического анализа по основным показателям: общий белок, глюкоза, мочевина, креатинин, альфа-амилаза, общий билирубин, ААТ, АсАТ и щелочная фосфатаза.
Оценка действия термически обработанной рыбы на гематологические показатели и гистологическую картину при пероральном введении самцам крыс
Мясо инвазированной анизакидами путассу обрабатывали кипячением (варкой) при температуре 100С в течение 20 минут, другую партию рыбы обрабатывали в бытовой микроволновой СВЧ-печи в течении 10 минут. Полученные продукты скармливали крысам самцам 10 дней с проведением гематологического, биохимического анализа крови и гистологического исследования тонкого кишечника, печени, селезенки, семенников. Также готовили мазки-отпечатки красного костного мозга грудины и семенников по описанной выше методике для определения уровня кариопатических изменений в данных органах, вызванных термически обработанной рыбой.
Получение гипериммунных сывороток к антигенам анизакид
Гипериммунную сыворотку получали при введении трем кроликам соматического антигена, приготовленного из личинок A.simplex. Кроликов породы серый великан живой массой 3 кг внутримышечно иммунизировали возрастающими дозами соматического антигена с полным адъювантом Фрейнда (Диаэм, США) по методике Бережко В.К. и др. (2008) по схеме три цикла трехдневной иммунизации с трехдневными перерывами. Затем через 28 дней проводили реиммунизацию для повышения активности гипериммунных сывороток. Общая доза антигена по белку составила 10,0 мг. Кровь для исследования собирали из локтевой вены через семь дней после завершения иммунизации.
Реакция иммунодиффузии гипериммунных сывороток с антигенами анизакид и экстрактом из мышечной ткани рыбы
Реакцию иммунодиффузии (РИД) проводили в 1,2%-ном агаровом геле (Difco) на физиологическом растворе (Гусев А.И., Цветков В.С., 1961). Реакцию проводили в штампе семерка, где в центральную лунку вносили экстракт из анизакид, а в периферийные - гипериммунные сыворотки в нативном состоянии, а также в разведениях 1/1; 1/2; 1/4 и 1/8.
Также проводили РИД с сыворотками крови гипериммунизированных кроликов и термически обработанными антигенами A.simplex.
Для выявления возможных соматических и экскреторно-секреторных антигенов личинок анизакид в мышечной ткани замороженной рыбы проводили РИД, где в качестве антигена использовали экстракт из рыбы.
Статистическая обработка результатов
Фактический материал, полученный при проведении исследований, обрабатывали методом вариационной статистики. Показатели считались достоверными при значениях p0,05 (по t-критерию Стьюдента).
- РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Анализ зараженности плотоядных гельминтами и простейшими
В настоящее время в г. Перми содержится несколько тысяч домашних собак и кошек, имеется и большое количество бездомных животных. Результаты паразитологического обследования представлены в таблицах 1 и 2.
В период нашей работы было обследовано 228 служебных собак. Из них 125 собак принадлежали питомнику Зонального кинологического центра при ГУВД г. Перми, 85 собак - колониям общего режима и 18 собак - питомнику при Пермском колледже юстиции. Все собаки содержатся в обустроенных вольерах, кормление осуществляется два раза в день специально приготовленными или промышленными кормами Royal Canin, профилактическая дегельминтизация проводится согласно планам 2-3 раза в год отечественными препаратами. При клиническом осмотре у большинства собак не выявляли серьезных нарушений в состоянии здоровья.
Содержание животных, принадлежащих частным лицам, отличается значительным разнообразием. Большинство владельцев предпочитает использовать для кормления своих питомцев натуральные продукты. При этом мясо и рыбу зачастую скармливают в сыром виде.
Таблица 1
Виды гельминтов и простейших, выявленные у собак
| Название возбудителя | Собаки, принадлежащие частным лицам | Служебные собаки | Собаки из приюта | Всего | ||||
К-во | % | К-во | % | К-во | % | К-во | % | |
Toxocara canis | 132 | 10,38 | 8 | 3,51 | 57 | 27,67 | 197 | 11,55 |
Toxascaris leonina | 12 | 0,94 | 5 | 2,19 | 10 | 0,49 | 27 | 1,58 |
Ankilostoma caninum | 49 | 3,85 | 2 | 0,88 | 14 | 6,80 | 65 | 3,81 |
Uncinaria stenocephala | 15 | 1,18 | 1 | 0,44 | 9 | 4,37 | 25 | 1,47 |
Strongyloides vulpis | 16 | 1,26 | 1 | 0,44 | 2 | 0,97 | 19 | 1,11 |
Spirocerca lupi | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0,49 | 1 | 0,06 |
Dirofilaria repens | 9 | 0,71 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 0,53 |
Trichocephalus vulpis | 3 | 0,24 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0,18 |
Diphyllobothrium latum | 21 | 1,65 | 0 | 0 | 2 | 0,97 | 23 | 1,35 |
Dipylidium caninum | 18 | 1,42 | 0 | 0 | 12 | 5,83 | 30 | 1,76 |
Mesocestoides lineatus | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 1,94 | 4 | 0,23 |
Taenia sp. | 4 | 0,31 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 0,23 |
Isospora canis | 85 | 6,68 | 12 | 5,26 | 23 | 11,17 | 120 | 7,03 |
Sarcocystis spp. | 43 | 3,38 | 1 | 0,44 | 0 | 0 | 44 | 2,58 |
Neospora caninum | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 1,97 | 4 | 0,23 |
Cryptosporidium spp. | 11 | 0,86 | 2 | 0,88 | 4 | 1,97 | 17 | 1,0 |
Lamblia spp. | 3 | 0,24 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0,13 |
Отрицательно | 906 | 71,07 | 196 | 85,96 | 64 | 31,06 | 1166 | 68,34 |
Всего | 1272 | 100 | 228 | 100 | 206 | 100 | 1706 | 100 |
Дегельминтизации домашних собак и кошек проводятся нерегулярно, в основном, перед вакцинацией, выставкой или перед транспортировкой за пределы Пермского края. С этой целью используются самые разнообразные препараты. Обработки против простейших производятся изредка, только в случае установления соответствующего диагноза при проведении копрологических исследований.
В муниципальном приюте находятся в основном беспородные животные, многие из которых ранее относились к безнадзорным. Собаки содержатся в групповых вольерах или клетках. Кормление проводится дважды в сутки натуральными продуктами. Дегельминтизации подвергают всех вновь поступивших животных. Препараты против простейших не назначают.
Таблица 2
Виды гельминтов и простейших, обнаруженные у кошек
| Название возбудителя | Кошки, принадлежащие частным лицам | Кошки из приюта и безнадзорные | Всего | |||
К-во | % | К-во | % | К-во | % | |
Opisthorchis felineus | 3 | 0,30 | 0 | 0 | 3 | 0,26 |
Toxocara cati | 117 | 11,78 | 57 | 39,31 | 174 | 15,29 |
Toxascaris leonina | 10 | 1,01 | 0 | 0 | 10 | 0,88 |
Oslerus osleri | 3 | 0,30 | 0 | 0 | 3 | 0,26 |
Capillariidae | 0 | 0 | 2 | 1,38 | 2 | 0,18 |
Diphyllobothrium latum | 0 | 0 | 4 | 2,76 | 4 | 0,35 |
Dipylidium caninum | 12 | 1,21 | 0 | 0 | 12 | 1,05 |
Mesocestoides lineatus | 0 | 0 | 6 | 4,14 | 6 | 0,53 |
Hydatigera taeniaformis | 19 | 1,91 | 10 | 6,90 | 29 | 2,55 |
Taeniidae | 2 | 0,20 | 5 | 3,45 | 7 | 0,62 |
Isospora felis | 46 | 4,63 | 37 | 25,52 | 83 | 7,29 |
Isospora rivolta | 0 | 0 | 3 | 2,07 | 3 | 0,26 |
Toxoplasma gondii (ооцисты) | 0 | 0 | 28 | 19,31 | 28 | 2,46 |
Sarcocystis spp. | 9 | 0,91 | 0 | 0 | 9 | 0,79 |
Blastocystis felis | 22 | 2,22 | 0 | 0 | 22 | 1,93 |
Cryptosporidium spp. | 4 | 0,40 | 0 | 0 | 4 | 0,35 |
Отрицательно | 675 | 67,98 | 48 | 33,10 | 723 | 63,53 |
Всего | 993 | 100 | 145 | 100 | 1138 | 100 |
На территории г. Перми собаки инвазированы гельминтами и простейшими на 31,66%, кошки - на 36,47%. Данный уровень экстенсивности инвазии сопоставим с аналогичным показателем, установленным в других городах Российской Федерации. Превалирующими инвазиями являются те, при которых цикл развития происходит без участия промежуточных хозяев, т.е. фекально-оральным путем. К ним относятся нематодозы (токсокароз, анкилостомоз и унцинариоз) и протозоозы (изоспорозы, бластоцистоз кошек, реже криптоспоридиозы). Основным источником инвазии служат безнадзорные животные, что подтверждается результатами обследования поголовья содержащихся в приюте кошек и собак.
На состав паразитофауны домашних плотоядных животных в значительной мере влияет тип кормления. Домашние животные по сравнению с другими группами наиболее инвазированы описторхами, саркоцистами, так как данные инвазии передаются при скармливании, термически необработанной рыбы и мяса, которые часто используют для кормления кошек и собак.
Что касается социально опасных гельминтозов, таких как трихинеллез, то степень инвазированности домашних плотоядных животных ничтожно мала. Так, ЭИ трихинеллезом у кошек по нашим данным составила 0,7%, у собак данную инвазию не выявили. Единственная зараженная Т.spiralis кошка была доставлена из сельской местности. Таким образом, в городской популяции плотоядных животных трихинеллезная инвазия отсутствует или имеет весьма незначительное распространение, тогда как в природе сохраняются очаги, в которые могут вовлекаться домашние кошки и собаки, имеющие возможность охотиться, в первую очередь на мелких грызунов.
Серологический анализ показал, что антитела к L.intestinalis имеются в сыворотке 15,0% служебных и 26,67% домашних собак, тогда как у собак из муниципального приюта был получен отрицательный результат. Обнаружение иммуноглобулинов класса IgG может являться следствием уже перенесенной инвазии. Такой высокий уровень серопозитивных собак при незначительной доле положительных результатов копрологического исследования нельзя объяснить только появлением ложноположительных реакций, так как в группе животных из приюта, наиболее инвазированных кишечными простейшими, положительные реакции вообще отсутствовали.
Распространение лямблиоза среди собак, по всей видимости, невелико и напрямую зависит от степени контакта с человеком. По нашему мнению, бездомные животные в городской популяции могут инвазироваться лямблиями лишь случайно и большой роли в распространении возбудителя не играют. Домашние собаки, напротив, находясь в непосредственной близости к человеку, могут становиться резервуаром L.intestinalis, выделяя возбудителя в виде цист. В целом же, собаки эпидемиологического значения в распространении лямблиоза человека, по всей видимости, не имеют.
Одним из наиболее распространенных протозойных заболеваний во всем мире является токсоплазмоз. Во время наших исследований серологический диагноз на токсоплазмоз подтверждали во всех группах обследованных животных. Наименьшая зараженность токсоплазмозом оказалась у служебных собак. Известно, что плотоядные могут заразиться T.gondii тремя путями: внутриутробно, перорально при проглатывании спорулированных ооцист возбудителя или при поедании мяса, зараженного тканевыми цистами. Так как кормление служебных собак осуществляется преимущественно готовыми сухими кормами, а содержание соответствует санитарно-гигиеническим нормам, риск заражения токсоплазмозом сводится к минимуму.
Наибольшее количество серопозитивных животных выявлено нами среди поголовья, содержащегося частными владельцами. Такой высокий показатель интенсивности инвазии, вероятно, связан с тем, что в рационе данных собак значительная доля приходится на сырое мясо, которое может быть инвазировано тканевыми цистами токсоплазм. Случай массового обнаружения ооцист токсоплазм при исследовании фекалий содержащихся в приюте кошек можно объяснить одновременным заражением большого количества молодых животных. Так как в приют попадают как домашние, так и безнадзорные кошки, заражение токсоплазмозом возможно через тканевые цисты, содержащиеся в мясе сельскохозяйственных животных. Также не следует исключать роли грызунов в инвазировании животных.
2.2.2.Оценка влияния инвазии на патологию органов размножения домашних плотоядных
Для изучения распространения патологий репродуктивной системы были исследованы образцы яичников, матки и плаценты, полученные от самок во время овариогистерэктомии по различным показаниям, а также с целью стерилизации у клинически здоровых животных. Образцы семенников получали во время кастрации клинически здоровых самцов, а также при вскрытии павших или подвергнутых эвтаназии животных.
Гистологический анализ препаратов яичников 36 кошек и 20 собак позволил установить наличие кистозно измененных фолликулов и фолликулярных кист в 65,0% случаев, причем, 40,0% из них принадлежали домашним и 60,0% - содержащимся в приюте животным. Возраст обследованных самок варьировал от 4,5 месяцев до 5 лет, преимущественно - 3-4 года. Наличие фолликулярных кист выявляли как на фоне гельминтозов: токсокароза, дифиллоботриоза, гидатигероза, так и протозоозов: изоспороза и токсоплазмоза.
Под действием паразитов были выявлены изменения и органов репродукции самцов. Во время проведения работы было исследовано 16 проб семенников собак из муниципального приюта и 26 - котов. При анализе ткани семенников животных с подтвержденным диагнозом токсокароза отмечали изменения в виде отека, избыточных склеропластических процессов в строме, зачастую изменения затрагивали зрелые сперматозоиды, которые были либо частично гомогенизированы, либо имели агглютинированные хвостовые части. В одном случае обнаруживали многополюсные митозы в клетках герминативного слоя. У самцов старше 6 - 7 летнего возраста была выявлена, кроме того, дистрофия эпителия семенных канальцев.
В гистологических препаратах семенников содержащихся в приюте котов и кобелей агглютинацию сперматозоидов выявляли в 20, нарушения активности сперматогенеза - во всех случаях. В одном случае у кота после дегельминтизации с целью лечения токсокароза в семенных канальцах отмечали явления апоптоза на всех уровнях при отсутствии сперматогенеза, что может быть связано с влиянием как антгельминтика, так и метаболитов нематоды. У котов на фоне инвазии дипилидиозом и изоспорозом выраженных изменений в состоянии семенников не фиксировали, воспалительные, склеропластические и дистрофические изменения в тканях сперматогенного эпителия и канальцах отсутствовали. Гистологическое исследование 38 проб семенников домашних котов позволило выявить угнетение сперматогенеза в 25 случаях, из которых один был обнаружен у 10-летнего животного, страдающего сахарным диабетом. В остальных случаях животные были молодыми и клинически здоровыми. В трех случаях хвостовые части сперматозоидов были агглютинированы, в двух - были отмечены многополюсные и неравнополюсные анафазы митоза.
2.2.3. Патология последа при паразитарных инвазиях
В процессе нашей работы были исследованы 41 образец плаценты кошек и 22 - собак. Зависимость развития патологических процессов от паразитологического статуса животных представлена в диаграмме.
Рис. 1. Распространение патологий последа в зависимости от паразитологического статуса.
Гистологический анализ показал, что у кошек и сук (3 и 4, соответственно), клинически здоровых, свободных от паразитов, родоразрешившихся в срок либо самостоятельно, либо в результате кесарева сечения инволютивные процессы в плаценте соответствовали доношенной беременности. В базальной части выявляли мелкие пылевидные петрификаты. Воспалительные и некротические изменения отсутствовали.
В случае затяжных родов или кесарева сечения отмечали некоторые изменения в состоянии сосудов. Сосуды ворсин умеренного или слабого наполнения, материнские капилляры - расширены и полнокровны. В случае оперативного отделения плаценты от стенки матки также выявляли ретробазальные гематомы. Данные изменения характерны для острой фето-плацентарной недостаточности. Подобная патология может привести к кратковременной гипоксии плода. Признаки хронической патологии последа, вызванной интоксикацией или нарушением обмена веществ, у здоровых свободных от инвазии животных отсутствовали.
Напротив, патогистологические изменения различной выраженности отмечали в плаценте, полученной от сук и кошек, страдающих теми или иными инвазиями. При некоторых паразитарных болезнях изменения последа носили ярко выраженный характер.
От кошек с подтвержденным паразитологическим диагнозом на токсокароз было получено 8 последов, от собак - 4. На фоне токсокароза выявляли характерные изменения. В базальной части отмечали наличие отека, небольшие участки коликвационного и фибриноидного некроза, дистрофию децидуальных клеток. Петрификаты представляли собой пылевидные и очаговые образования. В мелких ворсинках плаценты сосуды слабого или умеренного кровенаполнения. Строма ворсинок рыхлая, с отеком и наличием одиночных элементов макрофагального ряда. Близ базальной пластинки определяли одиночные образования с плотной гомогенной, четко очерченной наружной границей и зернистой внутренней частью - петрифицированные личинки. В двух случаях отмечали признаки острой фетоплацентарной недостаточности при доношенной беременности без обнаружения мигрирующих личинок.
В случае гидатигероза кошек (6 проб) изменения в плаценте носили следующий характер. Инволютивные процессы соответствуют доношенной беременности. В базальной пластинке и строме ворсин определялись округлые мелкие петрификаты, участки фибриноидного некроза и дистрофия децидуальных клеток. Эпителий ворсин, а также состояние стенок кровеносных сосудов сохранены по структуре. В целом изменения соответствуют фето-плацентарной недостаточности, которая носит компенсированный или субкомпенсированный характер.
Исследованы также плаценты пяти содержащихся в муниципальном приюте кошек с подтвержденным диагнозом острого токсоплазмоза. В трех случаях (абортный материал) в базальной пластинке плаценты распространен фибриноидный некроз с наличием небольших округлых кальцинатов. Децидуальные клетки мономорфны. В прилежащем слое эндометрия железы кистозно расширены, выстланы однослойным эпителием, местами образующим истинные сосочки. Ворсинки крупные, извитые с рыхлой отечной стромой, наличием в ней значительного количества расширенных капилляров. Ворсинки покрыты двухслойным прерывистым эпителием, с признаками дистрофии. В крупных ворсинах и в базальной пластинке определяются псевдоцисты в виде округлых базофильных образований с четкой границей. Данные изменения характеризуют острый токсоплазмоз, последствием которого явилась замершая беременность.
В двух других случаях в последах выявляли недоношенную беременность с признаками преждевременного старения и диссоциированного нарушения созревания ворсин без обнаружения цист возбудителя. Фибриноидный некроз и образование петрификатов присутствовали во всех случаях.
При исследовании гистологических препаратов плацент больных изоспорозом кошек (4 пробы) плацентарная ткань содержит мелкие округлые петрификаты. Видимые изменения характерны для недоношенной беременности с признаками раннего старения, а также острого нарушения фето-плацентарного кровообращения.
При лямблиозе, который мы наблюдали у суки кавказской овчарки, содержащейся в частном питомнике, патология плаценты также носила признаки хронической фето-плацентарной недостаточности, на фоне которой впоследствии развивалась и острая, приводящая к гибели части новорожденных щенят. Выжившие щенки имели пониженный иммунитет и погибали в возрасте трех месяцев с признаками диареи и обезвоживания. Гистологический анализ тканей тонкого кишечника позволил выявить в просвете и слизистой оболочке колонии грибов рода Candida. На фоне кандидоза развивались признаки острого катарального энтерита, сопровождавшегося отеком тканей, десквамацией эпителия ворсинок, обильной плазмо-лимфоцитарной инфильтрацией с малым количеством нейтрофилов.
При исследовании плаценты кошек (3 пробы), в рационе которых присутствует значительная доля морской рыбы дешевых сортов, которая интенсивно инвазирована личинками анизакид, также отличались наличием патологических процессов. Инволютивные процессы соответствуют доношенной беременности. В базальной пластинке - отек, явления фибриноидного и коликвационного некроза. В децидуальных клетках отмечены дистрофические изменения, в слое децидуальной ткани - мелкоочаговые петрификаты. Встречались участки псевдоинфарктов. Ворсинки имели плохо выраженную структуру вследствие отека стромы, распространенного фибриноидного некроза и крупных петрификатов. Сосуды ворсинок расширены и полнокровны. Данные изменения характерны для острой плацентарной недостаточности на фоне хронической декомпенсированной. В одном случае помимо описанных выше изменений в базальной и хориальной пластинах выявляли также одиночные зрелые лимфоциты и группы клеток. Ядра децидуальных клеток находились в состоянии кариопикноза. Встречались также многоядерные децидуальные клетки, клетки с вакуолизированной цитоплазмой. Данные изменения можно было расценить как проявление внутриутробного инфицирования.
Таким образом, в группе кошек и собак с подтвержденным наличием той или иной инвазии количество хронической патологии последа в 3-7 раз превосходило аналогичный показатель в группе свободных от паразитов животных. Влияние инвазии на появление острой плацентарной недостаточности не установлено.
2.2.4. Анализ пораженности личинками анизакид
товарной рыбы
В процессе нашей работы было исследовано 3134 экземпляров путассу (Micromesistius poutassou) с длиной тела 26-28 см и 153 экземпляра сельди (Clupea harengus) длиной тела 35-36 см. Данные размеры характерны для половозрелых особей. ЭИ при исследовании путассу оказалась на уровне 99,9%, тогда как сельдь оказалась менее инвазированной, ЭИ составила 56,0%. ИИ нематодами в товарной рыбе значительно варьировала. Наименьший показатель составил 2 личинки, в то время как максимальный достиг 158. В связи с этим, в разных партиях путассу ИИ колебалась от 14,5 до 47,4. Средний показатель ИИ оказался на уровне 27,6 личинки. Что касается сельди, то ИИ в этом случае не превышала 8-9 личинок в одной тушке. Все выделенные нами из свежемороженой рыбы личинки были нежизнеспособными, что соответствует санитарным нормам.
Морфологическое исследование позволило выявить у них наличие сверлильного зуба, крупного длинного желудочка, не имеющего выростов, расположение экскреторной поры на головном конце у основания губ. При определении видовой принадлежности паразитов они были отнесены к виду Anisakis simplex. Стоит отметить, что анизакиды обнаруживались, в основном, только в полости тела рыб и на поверхности внутренних органов, чаще всего на печени, молоках и серозных покровах кишечника. При анализе мышечной ткани наличие личинок установлено в 3 случаях (0,01%). Этот факт свидетельствует о быстрой заморозке рыбы непосредственно после вылова, при которой личинки не могут мигрировать из внутренних органов в мускулатуру.
Микроскопический анализ гистологических срезов из печени путассу, содержащей личинки паразита, показал наличие глубоких деструктивных изменений в тканях как рыбы, так и нематоды, вызванных кристаллизацией воды. Целостность тканей была нарушена. Вокруг личинок была сформирована тонкая соединительнотканная капсула, которая также имела разрывы. Таким образом, обнаруженные изменения свидетельствовали о гибели личинок гельминтов и о формировании слабого ксенопаразитарного барьера вокруг них. Вероятно, незначительная толщина соединительнотканной капсулы могла быть вызвана непродолжительным сроком паразитирования в организме рыбы.
2.2.5.Сравнительная характеристика соматических экстрактов и метаболитов гельминтов
Сравнительная характеристика соматических экстрактов Anisakis simplex, Toxocara canis, Hydatigera taeniaformis и Diphyllobothrium latum, а также метаболитов T.canis представлена в таблице 3.
По результатам наших исследований можно предположить, что наибольшей ферментативной активностью обладает соматический экстракт H.taeniaformis. Некоторое количество тканевых ферментов присутствует также в составе T.canis. Наименьшая ферментативная активность выявлена в экстракте личинок анизакид. Возможно, это связано с тем, что данные личинки подвергались длительному замораживанию, которое привело к частичному разрушению белковых молекул, в том числе и ферментов.
Таблица 3.
Характеристика соматических экстрактов и метаболитов некоторых гельминтов
| Антиген | Показатель | ||||
РН | Белок Мг/мл | ААТ Ммоль/л | АсАТ Ммоль/л | ЩФ Ед/л | |
Экстракт имаго Diphyllobothrium latum | 6,5 | 5,4 | 0,63 | 0,44 | 33,8 |
Экстракт имаго Hydatigera taeniaformis | 7,0 | 14,7 | 2,03 | 1,56 | 540,4 |
Экстракт из личинок Anisakis simplex | 6,0/6,5 | 21,54/17,5 | 0,63/0,50 | 0,19/0,25 | 0 |
Экстракт имаго Toxocara canis | 6,2 | 4,3 | 27,5 | 0,75 | 6,4 |
Метаболиты личинок Toxocara canis | 6,0 | 10,8 | 0,05 | 0,06 | 6,4 |
2.2.6. Микроморфологические изменения во внутренних органах мышей после введения соматических экстрактов из: а) Anisakis simplex
Общее состояние контрольных и опытных животных оставалось удовлетворительным на протяжении всего периода исследований. В результате проведенного эксперимента установлены следующие закономерности.
При изучении морфологических изменений семенников сперматогенез был выражен неравномерно в разных канальцах. Сперматогенный эпителий сохранял четкую стратификацию слоев, однако клетки зачастую находились в состоянии дистрофии или были десквамированы. В строме отмечали умеренный отек и полнокровие сосудов. Через 48 часов после введения экстракта из анизакид количество зрелых сперматозоидов в семенных канальцах подопытных животных постепенно снижалось и оставалось низким. В семенниках мышей после витаминизации и последующего введения антигена, а также после его термической обработки (как кипячение, так и СВЧ) сперматогенез был не нарушен, однако был выражен неравномерно.
В печени отмечали дисциркуляторные и дистрофические изменения. Через 12 часов в дольках появлялись мелкие скопления зрелых лимфоцитов, которые укрупнялись к 48 часам. Данные морфологические изменения свидетельствуют об активации иммунной системы, а именно ее Т-клеточного звена на уровне центрального органа, принимающего участие в детоксикации, поскольку соматические продукты анизакид являются активно действующими антигенами.
При применении витаминов А и Е дистрофические изменения и нарушения циркуляции крови также присутствовали. Начиная с 24 часов, в синусоидах и портальных трактах выявляли одиночные зрелые лимфоциты, которые впоследствии к 48 часам превращались в скопления. Аналогичные изменения наблюдали и в печени мышей, которым вводили термически обработанные антигены.
Изменения в селезенке, как в основном органе иммуногенеза, были также характерными. В динамике хорошо просматриваются процессы, характерные для становления иммунного ответа. Уже через 4 часа после введения антигенного препарата начинает определяться четкая, но слабовыраженная макрофагальная реакция в периартериальных зонах фолликулов, которую можно расценить как первое звено иммунного ответа. Степень выраженности данного морфологического признака усиливается к 48 часу и сохраняется к 72 часам. Данные изменения свидетельствуют о возникновении довольно быстрого и адекватного иммунного ответа на внутрибрюшинное введение антигена.
Изменяется степень выраженности фагоцитарной активности макрофагов, которая усиливается в зависимости от сроков эксперимента и достигает максимума к 48 часу. Об этом можно судить по наличию в субкапсулярной и перифолликулярной зонах селезенки возрастающего количества элементов макрофагального и гистиоцитарного ряда с постепенным увеличением их ядерности (показатель незавершенности фагоцитоза и митотической активности клеток). Если через 4; 12 и 24 часа после начала эксперимента преобладали клетки с двумя ядрами, то через 48 и 72 часа - клетки с 6-8 ядрами.
Слабую макрофагальную реакцию и активизацию клеток гистиоцитарного ряда отмечали также в селезенке витаминизированных мышей, а также животных, получивших термически обработанный антиген.
Гемопоэз на уровне красного костного мозга протекал с преобладанием красного ростка. К 48 часам происходила активация миелоидного ростка с увеличением числа бластных и переходных форм клеток. Однако к 72 часу клеточный состав костного мозга в отношении миелоидного ростка нормализовался. Витаминизация и высокотемпературная обработка на активизацию миелоидных клеток влияния не оказывала.
б) Toxocara canis
В печени уже через 4 часа после введения экстракта из T.canis регистрировали расширение и полнокровие венозных сосудов и синусоидов, особенно в центральных отделах долек. Впоследствии подобные дисциркуляторные изменения приобрели более выраженный характер и достигли максимального уровня спустя 48-72 часа. Начиная с 12 часов после начала опыта, отмечали белковую дистрофию гепатоцитов, которая просматривалась более отчетливо в периферических отделах долек. Кроме того, в разных отделах долек и в портальных трактах обнаруживали скопления зрелых лимфоцитов, которые укрупнялись к 24-48 часам, затем отмечали тенденцию к уменьшению их размеров и количества клеток в них.
В селезенке изменения происходили на уровне красной пульпы. Уже через 4 часа было выражено полнокровие артерий фолликулов. В субкапсулярном слое и в перифолликулярной зоне определяли наличие одиночных многоядерных гистиоцитов, их групп (через 24-48 часов). Таким образом, в печени и селезенке происходили характерные изменения, свидетельствующие о формировании адекватного иммунного ответа.
В красном костном мозге грудины отмечали активацию миелоидного и лимфоидного ростков. Тромбоцитарный росток оставался интактным на протяжении всего опыта. При гистологическом исследовании ткани семенников при относительном сохранении стратификации слоев сперматогенного эпителия отмечали угнетение сперматогенеза в отдельных канальцах, в основном, расположенных по периферии органа. В строме и наружной оболочке был выражен умеренный отек.
г) Hydatigera taeniaformis
При исследовании гистологических препаратов семенников отмечали сохранение слоев сперматогенного эпителия с наличием незначительных очагов десквамации клеток эпителия. После введения соматического экстракта гидатигеры гидропическая дистрофия клеток усилилась вплоть до образования вакуолизации цитоплазмы. Сперматогенез частично ослаблен, неравномерно выражен в разных канальцах. Через сутки после начала эксперимента в строме семенников отмечали явления отека, полнокровия, плазматического пропитывания очагового характера. Затем к концу периода наблюдений интенсивность отека несколько снизилась, однако по-прежнему сохранялось полнокровие сосудов. В печени также отмечали дисциркуляторные и дистрофические изменения. Уже через 4 часа после введения антигена в дольках появлялись мелкие скопления зрелых лимфоцитов, которые укрупнялись к 12 часам, а затем наблюдали только одиночные зрелые лимфоциты или мелкие группы их. К 72 часу в печени отмечали активизацию клеток РЭС. Следовательно, антигенные продукты H.taeniaformis быстро всасываются в кровь при внутрибрюшинном введении лабораторным мышам и вызывают активизацию иммунной системы. Селезенка после введения экстракта гидатигеры реагировала довольно интенсивно. На фоне полнокровия органа отмечали пролиферацию гистиоцитов в различных отделах красной пульпы, а также активацию Т- и В-лимфоцитов, максимальное увеличение количества которых было выявлено уже через 12 часов и сохранялось на протяжении всего опыта. При исследовании гистологических препаратов красного костного мозга отмечали преобладание миелоидного и лимфоидного ростков. Тромбоцитарный росток оставался интактным на протяжении всего периода наблюдений. Следовательно, при внутрибрюшинном введении лабораторным мышам соматического экстракта стробилы H.taeniaformis, происходит сравнительно быстрая антигенная активация основных органов детоксикационной и иммунной системы (печени и селезенки), достигающая максимального развития уже через сутки после иммунизации. Кроме того, соматические продукты данной цестоды вызывают циркуляторные нарушения в семенниках подопытных мышей и приводят к снижению сперматогенеза.
д) Diphyllobothrium latum
Под влиянием антигенов широкого лентеца клиническое состояние экспериментальных животных соответствовало норме. Патологоанатомические изменения при этом обнаруживали во всех исследованных органах. Так, в семенниках клетки находились в состоянии дистрофии и частичной десквамации. В разных группах канальцев сперматогенез был выражен умеренно, чрез 12 часов после начала эксперимента отмечали некоторое ослабление сперматогенеза. Стратификация слоев органа сохранена. Селезенка также имела признаки патологии. Красная пульпа умеренно полнокровна, фолликулы небольшие, клеточные, однако через 12 часов фолликулы становились крупными, с наличием макрофагальной реакции в периартериальной зоне. Субкапсулярно и перифолликулярно на уровне красной пульпы обнаруживали мелкие группы многоядерных элементов гистиоцитарного ряда, количество и размеры которых увеличивалось к 12 часу эксперимента.
В печени при относительном сохранении дольковой структуры синусоиды были сдавлены, малокровны. Центральные и портальные вены через 12 часов после введения антигена были или пустые или слабого кровенаполнения. Гепатоциты находились в состоянии гидропической дистрофии. В синусоидах и портальных трактах выявляли одиночные зрелые лимфоциты. Что касается красного костного мозга, то после введения антигена у мышей отмечали некоторое увеличение клеток миелоидного и лимфоидного ряда при отсутствии реакции со стороны эритроцитарного и тромбоцитарного ростков кроветворения.
2.2.7. Микроморфологические изменения во внутренних органах мышей после введения экскреторно-секреторного антигена Toxocara canis
Все животные во время всего периода эксперимента находились в хорошем состоянии. Под влиянием экскреторно-секреторных продуктов Т.canis происходили изменения как в структуре семенников, так и печени и селезенки лабораторных мышей.
В семенниках отмечали отек капсулы и межканальцевой стромы при сохранении строения сперматогенного эпителия. Сперматогонии и сперматобласты находились в состоянии дистрофии. Сперматогенез неравномерно выражен в разных канальцах, интенсивность его несколько снижена. Через 12 часов в семенных канальцах находятся сперматозоиды с бледно окрашенными ядрами, а вокруг самих канальцев отмечаются крупные скопления клеток воспалительного ряда (макрофаги, плазмоциты, эозинофилы, нейтрофилы). Впоследствии через 48-72 часа отмечали активизацию сперматогенеза при сохранении дистрофических процессов, однако семявыносящие протоки оставались преимущественно пустыми. Следовательно, при относительной активизации сперматогенеза он заканчивался образованием неполноценных половых продуктов.
В селезенке отмечали полнокровие красной пульпы, наличие крупных клеточных фолликулов. В красной пульпе субкапсулярно и вокруг фолликулов располагались группы моно- и полинуклеарных гистиоцитов, которые впоследствии стали преобладать. Через 12 часов после введения метаболитов T.canis отмечали оживление Т-клеточного иммунного звена. Через двое суток после введения антигена в красной пульпе появились клетки - мононуклеары с крупными гиперхромными ядрами. Максимальные изменения отмечали через 12-24 часа, затем их интенсивность снижалась, однако активацию Т-клеток наблюдали на протяжении всего периода эксперимента.
В красном костном мозге выявляли преобладание миелоидного ростка, значительное количество мегакариоцитов. В печени также были выявлены как дисциркуляторные, так и дистрофические изменения. Через 24 часа появившиеся первоначально мелкие группы зрелых лимфоцитов трансформировались в крупные, вплоть до появления очаговых лимфоидноклеточных инфильтратов. К концу периода наблюдений лимфоциты выявляли в печени единично, либо в составе небольших скоплений, что свидетельствует о стремительном развитии иммунного ответа, вызванного однократным введением продуктов метаболизма личинок Т.canis, и быстрым его угасанием.
2.2.8. Кариопатическое действие на клетки красного костного мозга и семенников лабораторных животных соматических экстрактов и экскреторно-секреторных антигенов из: а) Anisakis simplex
Результаты исследования приведены в таблицах 4 и 5.
Таблица 4.
Частота кариопатических последствий в костном мозге мышей
после введения антигена-экстракта личинок анизакид в сравнении с контролем
Показатель | Кон-троль | Группы мышей после введения антигена, ч | ||||
4 | 12 | 24 | 48 | 72 | ||
Митотический индекс (%) | 0,120,01 | 0,400,02 | 0,200,02 | 0,500,03 | 1,710,04 | 0,700,03 |
Патологии митоза (%) | 0 | 0,200,03 33,334,9 | 0,660,08 50,06,1 | 0,840,15 61,549,3 | 1,00,14 58,338,1 | 0,400,05 40,04,8 |
Соотношение фаз деления ПМ/АТ | - | 0,33 | 5,0 | 0,63 | 4,0 | 0,2 |
Отставание хромосом и фрагментов в ана-телофазе (%) | 0 | 0,100,05 25,012,5 | 0 | 0,130,8 26,013,0 | 0,600,06 37,53,7 | 0,100,05 14,37,0 |
Неравнополюсная ана-телофаза (%) | 0 | 0 | 0,110,3 8,332,1 | 0,130,07 26,04,0 | 0,400,06 25,03,7 | 0,100,03 14,34,2 |
Многополюсный митоз (%) | 0 | 0,250,02 33,32,6 | 0,130,05 33,32,6 | 0,630,03 33,31,5 | 0,500,03 30,81,8 | 0,30 30,0 |
Многоядерные клетки (%) | 0,130,1 | 0,200,02 | 0,500,04 | 0,250,04 | 0,200,02 | 0,200.02 |
Кариопикноз (%) | 0,130,1 | 0 | 0 | 0,130,03 | 0 | 0,100,02 |
Примечание: % - от общего количества клеток;, % - от количества делящихся клеток., Р 0,01
Таблица 5.
Частота кариопатических последствий в семенниках мышей
после введения антигена-экстракта личинок анизакид в сравнении с контролем
Показатель | Кон-троль | Группы мышей после введения антигена, ч | ||||
4 | 12 | 24 | 48 | 72 | ||
Мейотический индекс (%) | 21,11,2 | 24,53,4 | 16,132,4 | 18,81,9 | 21,42,0 | 13,22,2 |
Патологии митоза (%) | 0,040,01 0,100,02 | 2,10,04 8,54 0,15 | 2, 00,02 12,40 0,12 | 2,90,03 15,43 0,16 | 1,750,02 8,18 0,09 | 0,60,02 4,55 0,15 |
Соотношение фаз деления ПМ/АТ | 2,76 | 1,47 | 7,06 | 2,0 | 1,94 | 2,07 |
Преждевременное расхождение хромосом в метафазе (%) | 0,040,02 0,100,05 | 0,80,04 3,250,16 | 0,250,05 1,550,30 | 0,80,04 4,260,21 | 0,300,02 1,400,09 | 0,40,02 3,030,15 |
Неравнополюсная ана-телофаза (%) | - | 0,20,02 0,810,08 | 0,380,04 2,330,20 | 0,30,01 1,600,05 | - | - |
Многогрупповая анафаза (%) | - | 0,80,02 3,250,08 | 0,250,01 1,550,06 | 0,500,02 2,660,01 | 0,050,01 2,080,40 | - |
Многоядерные клетки (%) | 1,89 | 3,2 | 1,75 | 3,20 | 2,75 | 4,7 |
Примечание: % - от общего количества клеток;, % - от количества делящихся клеток., Р 0,01
Максимальное количество митозов отмечали через 48 часов после введения подопытным животным соматического экстракта из личинок анизакид, митотический индекс составил 1,71 (контроль - 0,12). К 72 часам этот показатель снижался. Уже через 4 часа после начала эксперимента отмечали появление патологических митозов. Начиная с 4 и до 48 часов, около 30% делящихся клеток находились в состоянии многополюсного митоза. Известно, что многополюсные митозы возникают довольно легко под воздействием самых разных химических и физических факторов, особенно характерно их появление в опухолевых клетках (Алов И.А., 1972).
Наиболее часто наблюдали такую патологию митоза как образование хромосомных мостов и отставание фрагментов хромосом в анафазе, неравнополюсные анафазы, анэуплоидию. Особенностью кариопатического действия биопрепарата личинок анизакид является образование гигантских многоядерных клеток в красном костном мозге (многоядерных мегакариоцитов).
Также мы определяли соотношение фаз митоза в разных группах. В контрольной группе мышей митотические клетки находились в состоянии анафазы. Через 4 часа после внутрибрюшинного введения антигена анафазы составили 75,0% от общего числа митозов, и 25,0% клеток находились в профазе. Через 12 часов это соотношение не менялось, однако появились первые признаки К-митоза.
В семенниках животных после введения соматического экстракта из личинок анизакид увеличение делящихся клеток также отмечали, начиная с 4 часов, при этом количество патологий находилось на уровне 2%. Через 12 часов произошло значительное увеличение количества профаз, что свидетельствует об увеличении мейотического индекса клеток. К наиболее распространенным патологиям деления относились преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, неравнополюсные анафазы, а также 3-х и 4-х-полюсные анафазы.
Результаты эксперимента по определению протективного действия витаминов А и Е показали, что митотический индекс в костном мозге мышей не превышал 0,5% в течение всего периода наблюдений, но оказался выше контрольных показателей. Количество патологических митозов оказалось несколько ниже, отставания хромосом в анафазе не наблюдали. Показатели числа многополюсных и неравнополюсных митозов в период с 24 до 48 часов были снижены по сравнению с аналогичными данными, полученными в предыдущем опыте, однако через 72 часа было отмечено повышение уровней обоих процессов. Соотношение профаза-анафаза во время всего периода наблюдений смещалось в сторону последних (83,3%). Количество многоядерных клеток не отличалось от данного показателя у животных, не получавших витамины.
При введении подопытным мышам антигена анизакид, подвергнутого кипячению и СВЧ-обработке, количество патологических фигур митоза увеличивалось в 2,5 раза по сравнению с контролем, а число многоядерных клеток - в 10 раз соответственно. Количество патологий митоза при термической обработке антигена снижалось в первом случае до уровней контрольной группы, тогда как при СВЧ-обработке оно превышало этот уровень в 2,5 раза.
При микроскопии мазков-отпечатков, сделанных с семенников опытных и контрольных животных, отмечали активное деление клеток, патологические мейозы, как на стадии метафазы, так и на стадии анафазы. При этом количество делящихся клеток во всех группах животных находилось на уровне контроля, в то время как патологии мейоза встречались в первой группе подопытных животных, которым вводили антиген после заморозки, в 20 раз чаще через 24 часа после введения и в 59 раз - через 48 часов. Обработка кипячением и микроволнами снижала кариопатическое действие антигена, однако частота патологий деления клеток превышала контрольный уровень почти в 10 раз. Нарушение фигур деления клеток наиболее часто выражалось преждевременным расхождением отдельных хромосом в метафазе, неравнополюсными анафазами с образованием хромосомных мостов, а также трех- и четырех-полюсными анафазами. Подобные патологии деления приводят к формированию анэуплоидных дочерних клеток, многоядерности, а также появлению ядрышек.
Количество многоядерных клеток под воздействием антигена-экстракта увеличивалось незначительно - в 1,5 раза, а при высокотемпературной обработке антигена оно не превышало показателей контроля. Появлялись гигантские клетки с количеством ядер от 2 до 9, каждое из которых, в свою очередь, находилось в состоянии деления.
Пероральное введение нематод приводило к резкому увеличению количества делящихся клеток в красном костном мозге. При этом значительное количество митозов было многополюсным.
В семенниках показатель деления сперматоцитов незначительно повышался. Среди патологических фигур деления наиболее часто отмечали преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, а также наличие многоядерных клеток. Количество патологий деления в третьей группе превысило контрольный показатель более чем в девять раз.
При исследовании морфологии клеток периферической крови экспериментальных крыс в группе животных, ежедневная доза кормления которых составила 100 личинок, были выявлены кариопатические нарушения. Около 1,5-2,5% лейкоцитов имели патологии ядра, проявляющиеся в формировании ракеток (лишняя Х-хромосома), бобовидные или лопастные ядра лимфоцитов, лимфоциты с эозинофильной зернистостью цитоплазмы.
При скармливании крысам мышечной ткани инвазированной рыбы также происходили кариопатические изменения. В красном костном мозге количество митозов превысило показатели контроля в 4 раза, а в 3 группе животных (более 50 личинок) - в 5 раз. Патологии деления отмечали во всех опытных группах. Как и при внутрибрюшинном введении антигена анизакид, при пероральном введении как самих личинок, так и инвазированной рыбы в красном костном мозге грызунов выявляли гигантские многоядерные клетки.
В семенниках сперматогенез был несколько снижен, при этом статистически значимое увеличение количества патологий выявлено в 3 группе, которая выражалась в появлении К-митоза и преждевременном расхождении отдельных хромосом в метафазе. Чем интенсивнее была инвазирована рыба, тем сильнее проявлялись кариопатические изменения сперматоцитов, частота которых в четыре раза превысила контрольный уровень в группе животных, получавших рыбу, содержащую более 50 личинок анизакид.
Полученные при проведении предыдущих экспериментов результаты привели к необходимости выяснить, является ли инвазированная анизакидами рыба после проведения кулинарной обработки мутагеном для клеток красного костного мозга и сперматоцитов лабораторных животных. С этой целью проводили скармливание крысам рыбы, обработанной варкой и СВЧ-лучами.
Проведенное исследование клеток красного костного мозга показало увеличение активности деления в обоих случаях, особенно при использовании вареной рыбы. В этой же группе животных было выявлено значительное увеличение количества патологий деления, которые, в основном, проявлялись в виде многополюсного митоза, реже отмечали отставание отдельных хромосом в анафазе, неравнополюсные анафазы с мостом, К-митоз и формирование ядрышек. Также в обеих группах лабораторных животных отмечалось увеличение количества многоядерных мегакариоцитов.
При скармливании рыбы, подвергнутой термической обработке, в семенниках крыс отмечали некоторое усиление сперматогенеза, которое происходило, в основном, за счет ана- и телофаз. При этом рыба, обработанная в микроволновой печи, практически не оказывала антимитотического действия, тогда как вареная вызывала увеличение количества патологий деления клеток почти в пять раз. В то же время оба продукта стимулировали формирование многоядерных клеток, количество которых превзошло контрольный уровень в три раза.
б) соматический экстракт из Toxocara canis
При внутрибрюшинном введении соматических продуктов T.canis костный мозг реагировал значительным увеличением митотического индкеса, которое отмечалось через 4 и 72 часа, тогда как к 12 часам количество делящихся клеток резко снизилось. В остальные периоды наблюдений митотический индекс не отличался от контрольных показателей. Следовательно, действие антигенов данного гельминта было незначительным и сопровождалось патологией деления небольшого количества клеток в виде многополюсных митозов и отставания отдельных хромосом в анафазе.
Изменения сперматогенеза проявились более выражено резким увеличением количества патологических фигур деления, которые даже спустя 72 часа превысили контрольный уровень в три раза. Среди патологических фигур были отмечены преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, неравнополюсные анафазы, а также трех- и четырех - полюсные анафазы, которые, однако, не привели к увеличению количества многоядерных клеток, оставшись незавершенными. Незавершенный процесс деления привел к снижению количества делящихся клеток в целом, которое проявилось через 48 часов и оставалось ниже контрольного уровня до конца эксперимента. Следовательно, соматический экстракт из токсокар оказывает более выраженное патогенное действие на сперматоциты, чем на клетки красного костного мозга.
г) метаболиты личинок Toxocara canis
Костный мозг начинал реагировать на внутрибрюшинное введение метаболитов токсокары уже через четыре часа, при этом митотическая активность повысилась в два раза по сравнению с контролем. К 12 часам активность деления клеток упала ниже показателей контрольной группы, однако через сутки она резко повысилась (в 3 раза по сравнению с контролем), а затем постепенно стала снижаться. Патологические фигуры митоза были выявлены через 4 и 24 часа, при этом их количество достигало 10% от общего числа делящихся клеток.
В семенниках активизацию деления клеток выявляли, начиная с 12 часов и до конца периода эксперимента, при этом мейотическая активность повышалась незначительно (не более 2%). В то же время патологии деления клеток отмечали на протяжении всего периода наблюдений. Количество неправильных фигур деления начинало возрастать через 4 часа после введения экскреторно-секреторных антигенов, достигало максимального показателя (в четыре раза выше по сравнению с контролем) через сутки, а к третьим суткам - приближалось к контрольному уровню.
Наиболее часто среди нарушений деления клеток, как красного костного мозга, так и семенников, отмечали многогрупповые анафазы, при которых расхождение хромосом происходит к трем и более полюсам, а также преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе. Выявленные патологии приводят к неравномерному распределению хромосом в дочерних клетках, анэуплоидии или многоядерности.
В ходе нашего эксперимента было установлено, что воздействие продуктов гельминта на костный мозг лабораторных животных происходит в два этапа. Первый этап характеризуется повышением митотической активности и количества патологий деления уже в первые 4 часа после однократного внутрибрюшинного введения биоматериала. Повреждение митотического аппарата под действием токсокар происходит на уровне клеточных центров, количество которых может увеличиваться, в результате чего митоз приобретает многополюсный характер, а также на состоянии кинетохорных микротрубочек, что проявляется в виде отставания отдельных хромосом в анафазе. Происходящие изменения приводят к снижению общего количества делящихся клеток, которое отмечается уже спустя 12 часов.
Полученные нами белковые экстракты и метаболиты являются по своему составу сложными системами, отдельные компоненты которых при введении лабораторным мышам всасываются с разной скоростью. При этом экскреторно-секреторные продукты, по-видимому, вступают во взаимодействие с ядерными структурами несколько быстрее, нежели соматические, вызывая изменения в клетках в более ранние сроки. Под воздействием метаболитов наблюдается интенсивная стимуляция деления клеток красного костного мозга без возникновения патологий, что свидетельствует о развитии адекватного иммунного ответа у экспериментальных животных.
В то же время соматический экстракт токсокар более активно вызывает патологию сперматоцитов. При делении половых клеток митотические яды или токсоиды T.canis также оказывают повреждающее действие на микротрубочки и увеличение количества клеточных центров. Под влиянием данных продуктов значительно снижается активность сперматогенеза у мышей опытных групп в результате образования анэуплоидных клеток. При однократном внутрибрюшинном введении указанные выше изменения сохраняются на протяжении не менее трех суток.
д) Hydatigera taeniaformis
Костный мозг мышей, которым внутрибрюшинно вводили соматический антиген из гидатигеры, начинал реагировать увеличением количества митозов уже через 4 часа. К 12 часам количество делящихся клеток превышало контрольный показатель уже в 4,5 раза, затем с 24 до 48 часов отмечался некоторый спад митотической активности, однако через 3 суток она снова повышалась до 0,9%, что превысило показания контроля более чем в 4,5 раза. Патологии митоза выявляли во всех опытных группах животных. При этом максимум патологических фигур деления клеток приходился на 72 часа. Наиболее часто встречали многополюсный митоз, реже - образование хромосомных мостов в анафазе и неравнополюсные анафазы. Соотношение фаз деления смещалось в сторону профаза - метафаза. Многоядерные клетки в красном костном мозге мышей отмечали через 12 и 48 часов.
Семенники мышей после введения антигена гидатигеры также реагировали. Во все периоды наблюдений, исключая 24 и 48 часов, индекс активности деления клеток находился ниже уровня показателей контроля. Количество патологий клеточного деления достигло максимума к 24 часам (почти в 6 раз выше контроля). Большинство патологических фигур приходилось на преждевременное расхождение хромосом в метафазе, отставание отдельных хромосом в метафазе, многогрупповые анафазы (по три центра деления) и неравнополюсные анафазы. Количество многоядерных клеток в семенниках опытных животных незначительно превышало показатели контрольной группы, достоверное увеличение многоядерных клеток отмечали только на вторые сутки проведения опыта.
е) Diphyllobothrium latum
В костном мозге мышей, которым вводили соматический антиген широкого лентеца, интенсивность митотического деления начала возрастать с 4 часов, в два раза превысив контрольный показатель. Максимальное количество митозов зафиксировали спустя сутки после введения антигена, а затем их количество постепенно снижалось, приближаясь в конце эксперимента к показателю контроля. Следовательно, активные антигенные компоненты дифиллоботриума с большой скоростью всасываются при внутрибрюшинном введении и вызывают сравнительно быстро развивающуюся патологию в красном костном мозге лабораторных мышей. При введении мышам антигена-экстракта из D.latum также увеличивалось количество патологических митозов в клетках лимфоидного и миелоидного ряда. Подавляющее количество патологий деления пришлось на многополюсный митоз и лишь в нескольких случаях отмечали неравномерное расхождение хромосом, а также образование хромосомных мостов во время анафазы. Указанные патологии были отмечены во все периоды наблюдений с максимальным уровнем через 24 часа.
Изменения в состоянии сперматоцитов протекали несколько быстрее. Под воздействием антигенов D.latum уже через 4 часа деление клеток активизировалось, но впоследствии, за исключением суточного интервала, этот показатель был несколько ниже контрольного уровня. В соотношении фаз отмечали сдвиг в сторону ана- и телофаз. Количество патологий деления резко повысилось с максимальным значением (в три раза выше контрольного показателя) - через 12 часов и последующим постепенным снижением, однако оставалось достаточно высоким на протяжение всего эксперимента. Наиболее часто регистрируемыми формами патологий являлись отставание, а также преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, отставание хромосом в анафазе. Значительно реже по сравнению с ними отмечались неравнополюсные и многогрупповые анафазы. Следовательно, соматические компоненты широкого лентеца влияют в первую очередь на состояние центриолярных и кинетохорных микротрубочек сперматоцитов.
При сравнении действия биопрепаратов обеих цестод на процесс деления соматических и половых клеток лабораторных мышей отмечали некоторое различие между ними. Экстракт H.taeniaformis оказывал менее выраженное, но более продолжительное действие на клетки красного костного мозга грызунов по сравнению с D.latum. В первом случае значительный подъем митотической активности клеток отмечали лишь спустя 12 часов. Этот процесс продолжался на протяжении трех суток сначала за счет увеличения количества профаз и метафаз, затем - анафаз и телофаз. Во втором случае высокий уровень митотической активности был выражен уже в первые часы эксперимента, но к 72 часам она начала ослабевать. При этом соотношение фаз сдвигалось в сторону про- и метафаз. Уровень патологических митозов при введении продуктов H.taeniaformis также оставался высоким с 12 до 72 часа эксперимента, тогда как иммунизация экстрактом D.latum вызывала пик митотических нарушений через 12 и 24 часа, а к концу периода наблюдений этот показатель пошел на спад.
На фоне введения экстракта H.taeniaformis отмечали образование хромосомных мостов, что является следствием хромосомных аберраций, и неравномерное расхождение хромосом в анафазе, а также значительное количество многополюсных митозов (до четверти от количества делящихся клеток). При введении мышам препарата, приготовленным из стробилы широкого лентеца, подавляющее количество патологий митоза приходилось на формирование многополюсных митозов.
Воздействие на семенники лабораторных животных под влиянием продуктов цестод также отличалось. Экстракт гидатигеры сначала подавлял, а спустя сутки после введения - незначительно стимулировал процесс деления сперматоцитов (за счет ана- и тело - фаз), при этом значительное количество патологий было выявлено с 12 до 72 часов. Биопрепарат дифиллоботриума весьма незначительно снижал активность деления клеток семенников, но вызывал резкое увеличение количества патологий уже через 4-12 часов, количество которых к концу эксперимента начало постепенно снижаться, но все же оставалось на высоком уровне. Преобладающими формами патологий деления половых клеток в обоих случаях являлись преждевременное расхождение хромосом в метафазе, образование неравнополюсных анафаз. В то же время продукты H.taeniaformis вызывали развитие многогрупповых анафаз, при этом количество центров деления равнялось 3 или 6, что свидетельствует о явлении полиплоидии. Под влиянием экстракта D.latum количество многогрупповых анафаз было незначительным, но зато отмечали отставание отдельных хромосом в метафазе.
Проведенные исследования свидетельствуют о том, что экстракты цестод способны вызывать разнообразные патологии деления как соматических, так и половых клеток организма хозяина. При однократном внутрибрюшинном введении лабораторным мышам продукты стробилы широкого лентеца всасываются быстро, вызывая уже в первые часы реакцию организма, которая сопровождается также формированием патологий митоза. Данный биопрепарат воздействует в основном, на клеточные центры клеток миелоидного и лимфоидного ростка, вызывая формирование многополюсных митозов. В сперматоцитах лабораторных грызунов, напротив, действие широкого лентеца повреждает аппарат микротрубочек, вызывая отставание или преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, формирование неравнополюсных анафаз, что приводит, в свою очередь, к образованию анэуплоидных сперматозоидов.
Экстракт из стробилы H.taeniaformis, является многокомпонентным продуктом, который при внутрибрюшинном введении всасываются в кровь с разной скоростью, но медленнее продуктов D.latum. Воздействие экстракта гидатигеры менее выражено в отношении клеточных центров, но некоторое влияние оказывается на кинетохорные микротрубочки, что приводит к нарушению процесса расхождения хромосом в анафазе. Деление сперматоцитов под действием продуктов H.taeniaformis также нарушается, при этом помимо повреждения микротрубочек наблюдается явление полиплоидии (увеличение количества хромосом в 1,5 или 3 раза).
Таким образом, наши исследования позволяют заключить, что гельминты, а также продукты их жизнедеятельности способны вызывать нарушения деления соматических и половых клеток хозяина при разных способах введения. Следовательно, наличие гельминтозной инвазии, а также кормление инвазированными пищевыми продуктами, даже прошедшими термическую обработку, нежелательно для племенных животных, беременных самок перед вязкой и вакцинацией. Так как во время проведения дегельминтизации происходит разрушение гельминтов, продукты их распада могут всасываться в кровь и вызывать кариопатологические изменения в различных клетках, то, на наш взгляд, наилучшим способом предотвращения этих последствий может служить проведение грамотной профилактики.
2.2.8.1. Влияние антигенных продуктов паразитов на патологию размножения самцов Ц мышей
Так как проведенные исследования позволили установить, что соматические и экскреторно-секреторные продукты А.simplex обладают мутагенным действием в отношении сперматоцитов лабораторных животных и угнетают сперматогенез, было решено провести исследование оплодотворяющей способности грызунов после введения им этих антигенов и влияния их на потомство.
Состояние опытных и контрольных животных оставалось удовлетворительным на протяжении всего периода эксперимента. После отсадки самцов самки мышей оставались интактными в течение 20 дней, после чего их эутаназировали эфиром и извлекали матку с плодами. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 8.
Гистологические исследования позволили выявить, что в опытных группах мышей и плоды и плаценты по своему строению являлись незрелыми, гипотрофичными, тогда как в контрольной группе регистрировали доношенную беременность с нормальным развитием плодов.
Таблица 8.
Патологии эмбрионального развития плодов мышей после иммунизации самцов антигенами анизакид
Показатель | Контроль | Опыт* |
Кол-во беременных самок (%) | 75,0 | 6,25 |
Предимплантационная смертность (%) | 12,5 | 93,0 |
Постимплантационная смертность (%) | 0 | 12,5 |
Диаметр плаценты, см | 0,950,04 | 0,840,03 |
Длина плода, см | 1,840,12 | 1,600,13 |
Масса плаценты, г | 0,160,02 | 0,150,02 |
Масса плода, г | 0,890,04 | 0,540,02 |
Примечание: * - Р 0,05, статистически достоверная разница по сравнению с контролем
В результате оплодотворения яйцеклеток интактных самок сперматозоидами, имеющими кариопатические изменения, формируются нежизнеспособные эмбрионы, что является следствием патологии кариотипа. Изменения в организме выживших эмбрионов приводят частично к их гибели уже после имплантации, а также к замедлению, как эмбриогенеза самого плода, так и формирования плаценты. Таким образом, наши исследования подтверждают тот факт, что продукты жизнедеятельности гельминтов вызывают патологии сперматогенеза, что отрицательно сказывается на последующем эмбриогенезе.
2.2.9. Аллергенное действие замороженных личинок анизакид и инвазированной рыбы на лабораторных животных
Во время проведения эксперимента общее состояние опытных животных оставалось удовлетворительным. Известно, что одним из важнейших клинических признаков аллергии является эозинофилия периферической крови. Количество эозинофилов крови крыс перед началом проведения опыта колебалось в пределах 0-2%, что соответствует физиологической норме. В крови крыс, которые ежедневно получали 100 личинок A.simplex, уже на третий день количество эозинофилов поднималось до 3-5%, на пятый - достигало уровня 7%, однако к десятому дню этот показатель не превышал 2-3%.
Во второй группе животных (доза личинок - 50 экз. на голову) изменения в картине крови были менее выраженными. На третий и пятый день опыта количество эозинофилов не превышало 3-4%, а к десятому дню этот показатель снизился до нормальных пределов. Что касается контроля, то у этих животных уровень эозинофилов оставался в пределах нормы на всем протяжении опыта. Остальные клинические показатели крови не отличались от нормы и контрольного уровня.
Биохимическое исследование крови крыс показало статистически значимое повышение уровней общего белка, а также ААТ и АсАТ в крови животных второй и третьей групп. Кроме того в данных пробах крови выявляли незначительное увеличение креатинина и щелочной фосфатазы. Что касается остальных биохимических показателей, то они оставались без изменений по сравнению с контролем. Показатели крови крыс контрольной группы оставались в пределах физиологической нормы.
Таким образом, при продолжительном скармливании лабораторным крысам нежизнеспособных личинок анизакид происходят изменения в морфологическом и биохимическом составе периферической крови, что подтверждает их кариопатическое и аллергическое действие. Сдвиг биохимических показателей крови свидетельствует о нарушении тканевого обмена и развитии патологических процессов в печени лабораторных животных, что подтвердилось в результате дальнейшего гистологического исследования, которое позволило выявить наличие изменений и в состоянии печени и, особенно, тонкого кишечника подопытных животных.
Исследования показали, что патологические изменения в состоянии тонкого кишечника экспериментальных животных происходили уже при скармливании 5 личинок. В слизистой оболочке кишечника наблюдали небольшой отек стромы, полнокровие сосудов, отдельные лимфоциты или их небольшие группы, в подслизистом слое также отмечали наличие незначительного отека.
С увеличением дозы введенных личинок до 10 и 25 к указанным выше изменениям присоединялись увеличение количества бокаловидных клеток и гиперсекреция слизи. В строме слизистой оболочки выявляли группы зрелых лимфоцитов с примесью макрофагов и эозинофилов, которые с увеличением дозы скармливаемых личинок также становились крупнее. При дозе в 50 личинок кишечные ворсинки становились более рыхлыми, извитыми, в строме - отек и наличие крупных групп лимфоцитов и плазматических клеток с примесью макрофагов и эозинофилов. Также незначительный отек отмечали в подслизистом слое.
Наиболее выраженные изменения происходили в кишечнике крыс, получавших ежедневную дозу в 100 личинок анизакид. Слизистая оболочка отечна, эпителий верхушек ворсинок десквамирован. В строме - диффузные скопления зрелых лимфоцитов и плазмоцитов, а также довольно большого количества эозинофилов. В подслизистом слое выражен отек, полнокровие сосудов, явления плазморрагии. Данные изменения соответствуют катаральному энтериту с аллергическим компонентом .
При гистологическом исследовании соответствующих органов контрольных животных подобных изменений не отмечали. Таким образом, нежизнеспособные личинки рода Anisakis и продукты их жизнедеятельности, сохраняющиеся в свежемороженой рыбе, вызывают в кишечнике лабораторных животных развитие катарального аллергического энтерита.
При попадании в тонкий кишечник соматические и экскреторно-секреторные продукты нежизнеспособных личинок частично подвергаются перевариванию до отдельных аминокислот, однако при развитии энтерита и десквамации эпителиальных клеток процесс переваривания становится невозможен, в связи с чем данные продукты нематод всасываются в кровь и разносятся по организму. Одним из основных органов, отвечающих за процессы детоксикации, является печень, которая первая реагирует на воздействие паразитов. Уже при дозе в 5 личинок в печени регистрировали в разных отделах долек и перипортально одиночные зрелые лимфоциты. При сохранении дольковой структуры обнаруживали умеренно выраженную белковую дистрофию гепатоцитов. Синусоиды бедны кровью, вены расширены, неравномерного наполнения.
Увеличение дозы личинок постепенно привело к выраженной белковой дистрофии гепатоцитов, формированию сначала мелких, затем более крупных скоплений лимфоцитов. Также отмечались изменения со стороны сосудистого русла в виде расширения вен. Характерной особенностью воздействия продуктов личинок анизакид явилось и то, что гепатоциты имели 1-2 ядрышка и крупные ядра с глыбчатым распределением хроматина. При дозе в 100 личинок наблюдали гиалиново-капельную или гидропическую дистрофию гепатоцитов. Также выявляли гигантские многоядерные клетки. Дифференциальная окраска виментином, который специфически окрашивает гепатоциты, и S-100, окрашивающим гистиоцитарные элементы, позволила определить их как многоядерные гистиоциты.
В селезенке отмечали полнокровие красной пульпы, крупные клеточные фолликулы. Субкапсулярно и перифолликулярно обнаруживали скопления многоядерных гистиоцитов, которые с увеличением дозы введенных личинок постепенно увеличивались. Таким образом, соматические и метаболические продукты личинок Anisakis simplex, являясь сильными антигенами, вызывают пролиферацию клеток ретикуло-эндотелиальной системы в печени и селезенке лабораторных животных.
При исследовании тканей семенников отмечали относительное сохранение структуры органа, незначительный отек и полнокровие сосудов стромы. Сперматогенез был выражен слабо в разных канальцах, хвостовые отделы сперматозоидов часто были в состоянии агглютинации. Уже при дозе 5-10 личинок наблюдали частичную дистрофию и десквамацию сперматогенного эпителия. При дозе в 50 личинок эпителий семявыносящих протоков имел признаки атрофии, сами протоки - кистозно расширены.
У крыс, получавших мясо рыбы в разной степени инвазированной личинками анизакид выраженных изменений в клеточном и биохимическом составе крови не наблюдали. Однако по истечении срока эксперимента в различных органах данных животных отмечали характерные гистопатологические изменения. При скармливании рыбного фарша патологические изменения тканей тонкого кишечника также присутствовали, причем степень выраженности патогистологических изменений соответствовала степени инвазированности рыбы личинками анизакид. Если при скармливании фарша, приготовленного из путассу, содержащей менее 10 личинок, обнаруживали лишь отек слизистой оболочки и подслизистого слоя с наличием в апикальных отделах ворсинок одиночных зрелых лимфоцитов или их мелких групп, то зараженность рыбы 10-50 личинками вызывала уже и увеличение количества бокаловидных клеток и формирование в строме слизистой оболочки и подслизистого слоя полиморфных клеточных инфильтратов с примесью значительной доли эозинофилов. Наиболее высокая зараженность рыбы (более 50 личинок) вызывала изменения, соответствующие катаральному энтериту с десквамацией эпителия апикальной части ворсинок, формированием диффузных инфильтратов из лимфоцитов, плазмоцитов и эозинофилов. В строме стенки желудка также были обнаружены одиночные зрелые лимфоциты - клетки иммунной системы.
Печень как основной орган детоксикации пищеварительной системы также реагировала появлением в разных отделах долек и портальных трактах при слабой степени инвазии рыбы - единичных лимфоцитов, при увеличении интенсивности инвазии - мелких групп лимфоцитов и макрофагов. Также присутствовали признаки дисциркуляторных изменений в виде переполнения кровью и расширения венозных сосудов. При дозе до 50 экз. в гепатоцитах выявляли гидропическую, более 50 - гиалиново-капельную и вакуольную дистрофию и наличие мелких жировых вакуолей.
В красной пульпе селезенки выявляли полнокровие, под капсулой и вокруг фолликулов располагались отдельные гистиоциты с крупными ядрами. В центральных отделах долек была заметна макрофагальная реакция. При ИИ рыбы более 50 личинок в селезенке крыс отмечали густые скопления зрелых лимфоцитов.
Некоторые изменения происходили и в семенниках животных. При сохранении сперматогенеза отмечались его неравномерность в различных канальцах, десквамацию клеток в просветы, дистрофические изменения. Сперматозоиды зачастую имели слабоокрашенные ядра. С увеличением степени зараженности рыбы сперматогенез был угнетен, отдельные канальцы оказывались полностью запустевшими.
Таким образом, всасывающиеся из кишечника белковые продукты личинок Anisakis оказывают токсическое действие, проявляющееся пролиферативными изменениями в органах ретикуло-эндотелиальной системы, а также угнетением сперматогенеза. Интенсивность данных изменений напрямую зависит от интенсивности поражения рыбы личинками.
Морфологические изменения в органах крыс после скармливания обработанной в микроволновой печи, а также вареной инвазированной рыбы также присутствовали, однако были менее выраженными, нежели в группе животных, получавших свежемороженую рыбу. Так в семенниках сперматогенез оставался относительно сохраненным, с незначительными признаками дистрофии. В печени обнаруживали некоторые дисциркуляторные изменения, наличие одиночных зрелых лимфоцитов. Более выраженные изменения наблюдали в селезенке в виде полнокровия красной пульпы, активации Т и В-зависимых зон и клеток гистиоцитарного ряда. В стенке кишечника на фоне отека и инфильтрации клетками лимфоплазмоцитарного ряда установили увеличение количества эпителиоцитов в состоянии митоза, которое свидетельствует о процессах активного восстановления органа. В кишечной стенке присутствовали также и эозинофилы, но несколько в меньшем количестве по сравнению с использованием свежемороженой рыбы. Следовательно, кулинарная термическая обработка не исключает развития иммунологических и аллергических реакций при скармливании животным инвазированной личинками анизакид рыбы.
2.2.10.Эмбриотоксическое действие личинок агнизакид при экспериментальном пероральном введении лабораторным животным
Во время проведения эксперимента общее состояние опытных животных оставалось удовлетворительным. Количество эозинофилов крови крыс перед началом проведения опыта колебалось в пределах 0-2%, что соответствует физиологической норме. Через три дня после инокуляции личинок изменений в клеточном составе крови не отмечали. Через пять дней количество эозинофилов увеличилось до 3-4%, однако к 10 дню вернулось к исходной точке. Что касается крыс первой группы, а также контроля, то у них уровень эозинофилов не превышал нормы на всем протяжении опыта.
При инокуляции самкам крыс нежизнеспособных личинок во всех использованных дозах в 1-2 дни беременности отмечали 100%-ную эмбриональную смертность. При гистологическом исследовании в яичниках животных обнаруживали желтые тела, иногда кистозно измененные, в матке - отек тканей и образование кист дна измененных маточных желез. Количество желтых тел было значительно меньше (3-4) по сравнению с контролем (8-9).
Пероральное введение личинок анизакид на 7-8 и 13-14 сутки беременности вызывало изменения в состоянии половых желез, а также плодов и плацент. При однократном введении личинок в сроки 13-14 дней в яичниках отмечали множественное образование кист. В плаценте отмечали более интенсивные изменения: цитоплазма децидуальных клеток имела ярко выраженную эозинофильную зернистость, полиморфные, местами уродливой формы, гиперхромные ядра иногда с наличием 1-2 ядрышек, отмечались острые нарушения фето-плацентарного кровообращения.
Кроме этого, отмечали значительное уменьшение размеров плода и плаценты, напрямую зависящее от дозы введенных личинок анизакид, на фоне высокого показателя постимплантационной смертности. При исследовании органов плодов отмечали нарушения микроциркуляции крови в органах.
2.2.11. Иммунохимический анализ соматического экстракта A.simplex
Соматические экстракты гельминтов разных видов не однородны по антигенному составу и являются многокомпонентными системами. Установлено, что разные виды гельминтов могут иметь общие антигенные компоненты, которые затрудняют специфическую диагностику. Для определения антигенного состава различных продуктов гельминтов и выявления наличия в них идентичных компонентов используется реакция иммунодиффузии (РИД).
В результате проведения РИД мы установили, что полученные нами экстракты личинок анизакид (АГ1 и АГ2) являются антигенами, способными вызывать преципитацию с гипериммунными сыворотками кроликов. Все три пробы сыворотки иммунизированных животных оказались достаточно активными как в нативном состоянии, так и в разведении 1/1. Тем не менее, сыворотка крови одного животного реагировала с гомологичными антигенами в разведении 1/8, что свидетельствует об индивидуальном активном иммунном ответе данной особи.
В белковом спектре экстракта АГ1 выявляли в агаровом геле три преципитирующих комплекса, из которых средний был представлен четкой полосой, а крайние два проявлялись в виде слабых полос.
В экстракте из анизакид АГ2 в гомологичной системе реакции установили наличие 1-2 полос преципитации, из которых одна была четко выраженной и идентичной средней полосе АГ1. Таким образом, не менее двух белковых компонентов в этом экстракте были антигеноактивными и вызывали синтез антител.
Постановка реакции с использованием сывороток кроликов, иммунизированных антигенами анизакид, и экстракта, приготовленного из токсокар, дала отрицательный результат.
Таким образом, проведенный иммунохимический анализ белкового экстракта из личинок анизакид позволил выявить наличие в его составе не менее трех антигенных компонентов, способных вызывать иммунный ответ у кроликов. Также мы можем предположить, что в составе соматического антигена A.simplex имеется как минимум два компонента, имеющих диагностическое значение в дифференциальной диагностике анизакидоза и токсокароза.
РИД с антигенами анизакид, обработанными кипячением или с помощью СВЧ, также показала положительный результат. В агаровом геле выявляли наличие как минимум одной диффузной полосы, идентичной центральным четко выраженным линиям АГ1 и АГ2. Таким образом, термическая обработка не препятствует проявлению антигенных свойств соматического экстракта А.simplex.
При проведении РИД с использованием в качестве антигена жидкости, полученной при размораживании мышечной ткани инвазированной анизакидами путассу, и гипериммунными сыворотками кроликов также выявили наличие одной четкой полосы преципитации, идентичной центральным линиям АГ1 и АГ2. Данный результат подтверждает возможность попадания соматических и экскреторно-секреторных продуктов гельминтов в мышечную ткань рыбы, особенно при многократном замораживании и оттаивании, которое, в свою очередь, может вызывать патологические изменения желудочно-кишечного тракта при продолжительном употреблении данного продукта.
ВЫВОДЫ
1. На территории города Перми широко распространены гельминтозы и протозоозы домашних плотоядных животных. Собаки заражены на 31,66%, кошки - на 36,47%. Наибольшее количество инвазированных животных относится к безнадзорным и содержащимся в приютах. Наименее инвазированы гельминтами и простейшими служебные собаки.
2. Антитела к антигенам Тoxoplasma gondii выявили у 23,0% служебных собак, 45,5% - собак, содержащихся в муниципальном приюте, 70,2%. - собак, принадлежащих частным лицам. У кошек антитела против токсоплазм обнаружили в 80% случаев, при этом среди животных, имеющих доступ на улицу, - 100%, не имеющих - 34,0%.
3. По результатам серологического обследования сыворотки крови собак г. Перми у 22,29% животных обнаружили антитела к антигенам Lamblia intestinalis. Установлено, что носителями лямблий в городской популяции являются 15% - служебных и 26,67% домашних собак. Выделение цист возбудителя регистрировали у 0,28% домашних собак.
4. Путассу инвазирована личинками анизакид на 99,9%. Интенсивность инвазии (ИИ) колеблется в пределах от 2 до 108 экземпляров. Средний показатель ИИ установлен в пределах 27,6 личинок.
5. Иммунохимическим анализом в белковом соматическом экстракте из личинок анизакид выявлено не менее трех антигенных компонентов, способных вызывать иммунный ответ у кроликов. В белковом спектре экстракта присутствует как минимум один термостабильный компонент, имеющий потенциальное диагностическое значение.
6. Глубокая заморозка рыбы до -18С вызывает гибель личинок анизакид. В мышечной ткани рыбы с ИИ более 50 личинок Anisakis simplex установлены антигенные компоненты паразита. При обработке рыбы воздействием низких температур соматические продукты гельминтов сохраняются и вызывают реакцию в виде острого аллергического энтерита и развития умеренной эозинофилии.
7. Установлено, что соматические антигены замороженных личинок A.simplex повышают митотический индекс клеток красного костного мозга, угнетают мейоз в семенниках лабораторных мышей, вызывают патологию клеточного деления, влияя на митотический (мейотический) аппарат.
Термическая обработка (кипячение в течение 30 минут) снижает кариопатический эффект антигенных компонентов личинок анизакид.
8. Внутрибрюшинное введение соматического экстракта из личинок анизакид мышам оказывает выраженное действие на лимфоидную и миелоидную системы, стимулирует фагоцитарную активность макрофагов гистиогенного и гематогенного происхождения с последующим увеличением числа фагоцитирующих клеток в пульпе селезенки.
9. Выявлено, что соматические и метаболические продукты Toxocara canis являются митотическими ядами, оказывающими влияние на клетки красного костного мозга и сперматогенез при внутрибрюшинном введении лабораторным мышам. Наиболее интенсивное кариопатическое действие данные продукты оказывают на клетки семенников, вызывая патологию расхождения хромосом, нарушения полюсности. Выявленные изменения приводят к неравномерному распределению хромосом в дочерних клетках, анэуплоидии и, как следствие, угнетают сперматогенез.
10. Соматические белковые продукты Hydatigera taeniaformis обладают кариопатическим действием, вызывая угнетение деления клеток красного костного мозга и снижая активность мейоза в семенниках мышей, вызывая максимум повреждений через 48-72 часа после их внутрибрюшинного введения.
11. Соматический экстракт из Diphyllobothrium latum вызывает увеличение митотического индекса клеток красного костного мозга лабораторных мышей при внутрибрюшинном введении и вызывает кариопатические изменения в иммунокомпетентных и половых клетках.
12. Выраженность нарушений деления клеток зависит от эволюционной чужеродности введенных белков паразитов. Наличие ферментов паразита на развитие патологии ядра оказывает второстепенное значение.
13. Инвазия беременных самок гельминтами и простейшими приводит к развитию хронической фето-плацентарной недостаточности.
14. На фоне гельминтозов и протозоозов происходит нарушение морфологии органов репродуктивной системы. У самок развиваются фолликулярные кисты яичников. У самцов нарушается спермогенез, происходит дистрофия сперматогенного эпителия и агглютинация спермиев.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Сивкова Т.Н. Анализ зараженности собак г. Перми кишечными гельминтозами. / Т.Н.Сивкова, Н.Г.Калинкина // Материалы Всероссийской конференции Актуальные вопросы ветеринарной медицины мелких домашних животных. - Екатеринбург. - 2004.-С.89-90.
- Сивкова Т.Н. Гельминтозы домашних плотоядных города Перми. / Т.Н.Сивкова // Материалы докладов международной научно-практической конференции Вузовская наука - сельскому хозяйству. - Барнаул. - 2005. - С. 121-124.
- Сивкова Т.Н. Сероэпизоотология токсоплазмоза кошек в Перми. / Т.Н.Сивкова // Мат. Докл. Научн. Конф. Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - Вып 8. - 2007. - М. - С.330-332.
- Сивкова Т.Н. Паразитарные заболевания служебных собак города Перми. / Т.Н.Сивкова, А.В.Согрина // Мат. Докл. Научн. Конф. Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - Вып 8. - 2007. - М. - С.332-335.
- Сивкова Т.Н. Легочные гельминтозы домашних плотоядных. / Т.Н.Сивкова // Пермский аграрный вестник. - Пермь. - 2008.- С.239-241.
- Сивкова Т.Н. Мезоцестоидоз плотоядных - опасное инвазионное заболевание. / Т.Н.Сивкова // Пермский аграрный вестник. - Пермь. - 2008.- С. 241-243.
- Сивкова Т.Н. Влияние продуктов личинок анизакид на выработку эозинофилов. / Т.Н.Сивкова // Пермский аграрный вестник. - Пермь. - 2008.- С.244-246.
- Сивкова Т.Н. Патология беременности у кошек при цистоизоспорозе. / Т.Н.Сивкова // Мат. Докл. Научн. Конф. Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - Вып 9. - 2008. - М. - С.440-441.
- Сивкова Т.Н. Сероэпизоотологические исследования при токсоплазмозе собак г. Перми./ Т.Н.Сивкова, Н.Н.Катаева // Российский паразитологический журнал. Ц 2008. - №3 Ц С.60-62.
- Сивкова Т.Н. Распространение личиночного анизакидоза среди товарной рыбы. / Т.Н.Сивкова // Сборн.мат межд. Науч-практ. Конф. Современные проблемы биологии, экологии, физиологии и ветеринарии домашних животных. - Тюмень. - 2008. - С.92-96.
- Сивкова Т.Н. Влияние экстракта личинок анизакид на морфологию органов мышей. / Т.Н.Сивкова, Е.С.Патлусова // Проблемы и перспективы современной науки. Сборн. Научн. Трудов. - Томск. - 2008. - С.84-85.
- Сивкова Т.Н. Эпизоотология токсоплазмоза у кошек в городе Перми / Т.Н. Сивкова, А. В.Щукина. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. Ц 2008. - №3. - С.37-39.
- Сивкова Т.Н. Кариопатическое действие соматического экстракта из личинок анизакид на клетки красного костного мозга мышей. / Т.Н.Сивкова // Труды VI Международной научно-практической конференции Паразитарные болезни человека, животных и растений. - Витебск. - 2008, - С.220-222.
- Сивкова Т.Н. Аллергическое воспаление тонкого кишечника при употреблении рыбы, зараженной личинками анизакид. / Т.Н.Сивкова // Ветеринарная клиника.Ц 2008. - №10 (77). - С.20.
- Сивкова Т.Н. Антимитотическое действие метаболитов Toxocara canis на лабораторных животных. / Т.Н.Сивкова // Всерос. научно-практич. конференция Инновационный потенциал аграрной науки - основа развития АПК. - Пермь. - 2008.- С.181-183.
- Сивкова Т.Н. Кариопатическое действие белковых продуктов Hydatigera taeniaformis на соматические и половые клетки лабораторных животных. / Т.Н.Сивкова // Аграрный вестник Урала Ц 2008. - №11(53) Ц С.70-71.
- Сивкова Т.Н. Поражение плаценты кошек при остром токсоплазмозе. / Т.Н.Сивкова // Ветеринарная медицина домашних животных. - Сборник статей. - Вып.5. - Казань. - 2008. - С.162-163.
- Сивкова Т.Н. Кариопатическое действие экскреторно - секреторного антигена Toxocara canis на костный мозг лабораторных мышей. / Т.Н.Сивкова // Матер. Международной научно-практической конференции, посв. 95-летию Саратовского Госагроуниверситета Вавиловские чтения. - Саратов. - 2008. - С.294-295.
- Сивкова Т.Н. Кариопатическое действие соматического экстракта личинок анизакид на костный мозг мышей и протективное действие витаминов Ц антиоксидантов. / Т.Н.Сивкова // Российский паразитологический журнал. Ц 2008. - №4 Ц С.63-67.
- Сивкова Т.Н. Содержание личинок анизакид в замороженной путассу. / Т.Н.Сивкова // Матер. Межд. Научно-практ. Конф, посв. 65-летию образования Волгоградской государственной сельскохозяйственной академии, Использование инновационных технологий для решения проблем АПК в современных условиях - Волгоград - 2009. - Том 2 - С.153-154.
- Сивкова Т.Н. Аллергенное и токсическое действие замороженных личинок анизакид на лабораторных животных. / Т.Н.Сиквова // Российский паразитологический журнал Ц 2009. - №1 Ц С.58-61.
- Сивкова Т.Н. Распространение протозоозов и их роль в развитии патологии беременности домашних плотоядных города Перми. / Т.Н.Сивкова // Сборн. Научн. Трудов Современный мир, природа и человек. - Томск Ц2009. - С.39-40.
- Сивкова Т.Н. Кишечная инвазия в генезе фолликулярной кисты яичника у кошек / Т.Н.Сивкова // Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения П.Г.Петского, Современные научные тенденции в животноводстве, - Киров, 16-17 апреля 2009 года. - С.239-240.
- Сивкова Т.Н. Кариопатическое действие соматических продуктов гидатигеры на костный мозг лабораторных животных. / Т.Н.Сивкова // Сборник материалов Региональной конф. молодых ученых Современные тенденции развития АПК в Северном Зауралье, - Тюмень. - 2009. - С.67-69.
- Сивкова Т.Н. Кариопатическое действие продуктов личинок анизакид на соматические и половые клетки лабораторных крыс при пероральном введении. / Т.Н.Сивкова // Мат. Докл. Научн. Конф. Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - Вып 10. - 2009. - М. - С.366-370.
- Сивкова Т.Н. Иммунохимический анализ соматического экстракта Anisakis simplex. / Т.Н.Сивкова // Мат. Докл. Научн. Конф. Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - Вып. 10. - 2009. - М. - С.370-372.
- Сивкова Т.Н. Роль лямблиоза матери в развитии кишечного кандидоза щенков / Т.Н.Сивкова, А.В.Согрина, Е.С.Патлусова //Ветеринарная клиника - 2009. - №6. - С.24-25.
- Сивкова Т.Н. Действие продуктов личинок анизакид на печень лабораторных животных/ Т.Н.Сивкова //Мат. Всеросс. Научно-практич. Дист. Конф. Современные достижения ветеринарной медицины сельскохозяйственному производству - пос. Персиановский- 2009. - С.83-85.
- Сивкова Т.Н. Кариопатическое действие соматических продуктов Diphyllobothrium latum на клетки красного костного мозга/ Т.Н.Сивкова //Мат. Всеросс. Научно-практич. Дист. Конф. Современные достижения ветеринарной медицины сельскохозяйственному производству - пос. Персиановский- 2009. - С.85-87.
- Сивкова Т.Н. Влияние температурной обработки на иммунные свойства белкового экстракта личинок анизакид. / Т.Н. Сивкова // Труды Кубанского государственного аграрного университета. Серия: ветеринарные науки. - Краснодар Ц2009. - №1(ч.2.). Ц С.323-324.
- Сивкова Т.Н. Влияние термической обработки экстракта личинок анизакид на способность вызывать морфологические изменения у белых мышей / Т.Н.Сивкова // Матер. Межд. научно-практич. конф. Высшее образование и аграрная наука - сельскому хозяйству - Казахстан, Семей - 2009. - С.139-141.
- Сивкова Т.Н. Распространение саркоцистоза животных./ Т.Н.Сивкова, Н.А.Никонова, Н.А.Татарникова // Матер. Межд. научно-практич. конф. Высшее образование и аграрная наука - сельскому хозяйству - Казахстан, Семей - 2009. - С.141-143.
- Сивкова Т.Н. Морфологические изменения тонкого кишечника крыс под действием продуктов личинок анизакид. / Т.Н.Сивкова //Веткорм Ц 2009. - №5. Ц С.32-34.
- Сивкова Т.Н. Саркоцистоз плотоядных / Т.Н.Сивкова // Ветеринарная клиника - 2009. - №9 (88). - С.9-10.
- Сивкова Т.Н. Изменения в тканях личинок Anisakis simplex под действием замораживания. / Т.Н.Сивкова // Современный мир, природа и человек. - Томск. - 2009. - т.1, №2. - С.82-83.
- Сивкова Т.Н. Инвазия Hydatigera taeniamorfis в генезе патологий плаценты у кошек /Т.Н. Сивкова //Актуальные проблемы ветеринарной медицины. - М. - 2009. - С.216-219.
- Сивкова Т.Н. Влияние антигенов Toxocara canis на морфологию органов мышей// Актуальные проблемы инфекционной патологии - Томск Ц2009. - С.153-154.
- Сивкова Т.Н. Состояние ксенопаразитарного барьера при анизакидозе (Anisakis simplex) под влиянием низких температур. // Матер. международной научно-практической конференции Вавиловские чтения. - Саратов. - 2009. - С.289-291.
- Сивкова Т.Н. Морфология плаценты под влиянием метаболитов личинок анизакид. / Т.Н. Сивкова// Ветеринарная медицина домашних животных: сборник статей. - Выпуск 6.- Казань: Печатный двор, 2009. - С.148-151.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии