Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Борзилов Евгений Евгеньевич
ИЗУЧЕНИЕ ВОВЛЕЧЕННОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КЛЕТОЧНОГО ГОМЕОСТАЗА В ЭТИОЛОГИЮ И ПАТОГЕНЕЗ ДЕТСКИХ ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ ПАРАЛИЧЕЙ
03.02.07 - генетика А В Т О Р Е Ф Е Р А Т диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научный консультант:
Иванов Владимир Петрович заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Щипков Валерий Петрович доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов, профессор Петрин Александр Николаевич доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный медико-стоматологический университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, профессор
Ведущая организация:
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Защита диссертации состоится л06 июня 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 в ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.
Автореферат разослан л___ ___________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент Гигани Ольга Борисовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Одной из наиболее актуальных проблем в современной неврологии является детский церебральный паралич. Медико-социальное значение ДЦП определяется не только грубыми двигательными и психоэмоциональными нарушениями, приводящими к инвалидизации, но и тенденцией к росту количества больных с данной патологией. Распространенность случаев ДЦП составляет от 1,3 до 5 на 1000 новорожденных [Bhasin T.K., 2006].
Термин ДЦП объединяет группу не прогрессирующих, но способных к изменению синдромов двигательных нарушений, возникающих в результате повреждения или наличия аномалий в развивающемся / незрелом головном мозге [Cans C., 2007; Krageloh-Mann, 2009]. ДЦП характеризуется клиническим полиморфизмом, т.е. может проявляться различной симптоматикой:
двигательными и чувствительными нарушениями, задержкой речевого и психического развития, судорогами.
Эти синдромы проявлений ДЦП могут быть вызваны как генетическими, так и средовыми факторами, хотя конкретные причины часто выявить не удается или же они носят множественный характер. В настоящее время большинство исследователей склоняется к мнению о наличии типового патологического процесса - гипоксии, - приводящего к повреждению ЦНС в интра- и постнатальный период, конечным исходом которого является ДЦП [Барашнёв Ю.И., 2001; Гусев Е.И., 2003]. Однако в практической неврологии не редки клинические случаи, когда воздействие минимального повреждающего фактора в перинатальный период приводит к формированию тяжелых двигательных нарушений, и наоборот - сочетание нескольких выраженных неблагоприятных патогенных факторов сопровождается относительно благоприятным исходом. Очевидно, механизмы, лежащие в основе индивидуальной реакции организма в условиях оксидантного стресса, во многом объясняются генетической гетерогенностью ДЦП.
Клеточный гомеостаз между про- и антиоксидантными реакциями преимущественно регулируется антиоксидантными ферментами, функционирующими в тесном взаимодействии с ферментами биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков. Межиндивидуальные различия в активности данных ферментов определяются наличием в структуре их генов функционально не полноценных аллельных вариантов. В результате многолетних исследований, проводившихся на базе кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, была впервые сформулирована эколого-токсико-генетическая концепция мультифакториальных заболеваний. Согласно данной концепции генетическая основа формирования распространенных мультифакториальных заболеваний у человека определяется специфическим взаимодействием между генами ферментов биотрансформации ксенобиотиков, которые совместно с токсическими внутренними и внешними факторами способны инициировать развитие различных по клиническим проявлениям заболеваниям [Иванов В.П., Полоников А.В., Солодилова М.А., 2008]. Учитывая малочисленность данных о молекулярно-генетической составляющей в патогенезе ДЦП, определение ведущих ДНК-полиморфизмов, которые могут принимать участие в формировании ДЦП согласно эколого-токсико-генетической концепции МФЗ, представлялось нам в качестве актуального направления проводимого исследования.
Ввиду того, что количество фермента определяется не только наличием или отсутствием определенного аллельного варианта гена, но и возможностью выработки клеткой необходимого количества продукта данного гена, нам представлялось важным изучить состояние белоксинтетического аппарата клетки. Очевидно, что при сниженной скорости синтеза белка в клетке даже при наличии структурно не поврежденного генома, количество конечного генного продукта, то есть фермента, может оказаться не достаточным для поддержания скорости биохимической реакции на необходимом уровне. В этой связи нами было принято решение изучить функциональную активность рибосомных генов как модифицирующего фактора, отражающего скорость синтеза белка в клетке.
Изложенное выше, а также необходимость дальнейшего расширения представлений о молекулярно-генетической и цитогенетической составляющих клеточного гомеостаза при детском церебральном параличе определили проведение настоящего исследования.
Цель исследования Изучить роль функциональной активности рибосомных генов, а также роль генов системы биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков в патогенезе различных клинических форм детского церебрального паралича.
Задачи исследования 1. Изучить особенности перинатального анамнеза среди различных форм детского церебрального паралича.
2. Оценить состояние функциональной активности рибосомных генов у детей с детским церебральным параличом.
3. Выявить взаимосвязи между цитогенетическими показателями и различными клиническими вариантами ДЦП.
4. Изучить влияние полиморфизма генов ферментов системы биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков у детей с различными формами ДЦП.
Научная новизна исследования Впервые осуществлен комплексный подход, заключающийся в анализе клинических, цитогенетических и молекулярно-генетических факторов такого социально значимого заболевания, как детский церебральный паралич.
Установлены взаимосвязи между показателями функциональной активности рибосомных генов и особенностями клинических проявлений при детском церебральном параличе. Реализованный в настоящей работе комплексный подход, включающий стандартные методы генетической эпидемиологии, статистической генетики и компьютерного моделирования, позволил установить 4 новых генетических маркера предрасположенности к детскому церебральному параличу (FMO3 E158K, NAT2 G590A, MDRI C3435T и GST Т).
Данные нашего исследования наглядно демонстрируют наличие индивидуальных генетических особенностей, формирующих норму реакции организма, реализующуюся в условиях воздействия стрессорного фактора в виде хронической гипоксии у детей с ДЦП.
Научно-практическая значимость исследования Полученные в ходе исследования результаты о взаимосвязи показателей функциональной активности рибосомных генов при ДЦП могут быть рекомендованы к применению врачам-неврологам и врачам медикогенетических консультаций с целью оценки риска формирования данного заболевания у детей с двигательными нарушениями. Результаты типирования полиморфных вариантов генов ферментов СБК и АОС открывают новые перспективы для более глубокого изучения молекулярно-генетических механизмов формирования ДЦП и могут быть использованы для профилактики ДЦП в отягощенных семьях в рамках медико-генетического консультирования.
Положения, выносимые на защиту 1. При всех клинических формах детского церебрального паралича, за исключением атонически-астатической, имеют место особенности функционирования белоксинтезирующего аппарата в виде статистически значимого снижения большинства показателей ФАРГ. Показатели ФАРГ в сочетании с данными перинатального анамнеза могут быть использованы в практической неврологии с целью определения степени риска формирования ДЦП в группе детей с двигательными нарушениями на основе полученных вероятностных оценок.
2. Гены ферментов системы биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков вовлечены в формирование предрасположенности к детскому церебральному параличу, а генетическая основа развития этого заболевания характеризуется значительной аллельной и локусной гетерогенностью, проявляющейся на уровне фенотипа выраженным половым диморфизмом.
3. Отклонения частот аллелей и генотипов ферментов СБК при детском церебральном параличе характеризуются преимущественным накоплением среди больных детей функционально активных аллелей генов ферментов прооксидантного действия, в сочетании с функционально неполноценными аллельными вариантами генов ферментов антиоксидантного действия. Таким образом формируется генетическая основа для нарушения баланса между прооксидантами и антиоксидантами, которая способствует усилению окислительного стресса органов и тканей на фоне внутреннего типового патологического процесса, каковым является гипоксия.
Апробация и публикации Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и техникоэкономических сфер жизни общества (Курск, 2008), на VII Российском конгрессе Современные технологии в педиатрии и детской хирургии (Москва, 2008), на международном (Германо-Российско-Американском) медицинском конгрессе Euromedica Hannover (Ганновер, 2009), на XIV конгрессе педиатров России с международным участием Актуальные проблемы педиатрии (Москва, 2010), на Всероссийской конференции с международным участием Охрана репродуктивного здоровья - будущее России (Белгород, 2010), на VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, иллюстрирована 62 таблицами и 14 рисунками, содержит 1 приложение. Библиографический список используемой литературы включает 177 источников: 62 отечественных авторов и 115 - зарубежных.
ичный вклад автора Автором составлены план и дизайн исследования, проведен анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, проведены клинико-лабораторные исследования, проанализированы совместно с научным руководителем полученные результаты, сделаны выводы и практические рекомендации. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследований с долей личного участия автора 75-95%.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал исследования: Материалом для исследования послужила популяционная выборка неродственных индивидов - детей ЦентральноЧерноземного региона России, проживающих на территории г. Курска и Курской области. Все обследованные, включая здоровых детей и больных детским церебральным параличом, были русской национальности. Всего обследовано 134 больных детским церебральным параличом и 186 здоровых детей. Группа больных ДЦП была сопоставима по полу и возрасту с контрольной группой.
Методы исследования. Метод клинико-анамнестического исследования.
На каждого больного заполнялась специально разработанная медицинская карта, включавшая паспортные и анамнестические данные, сведения из наследственного и акушерского анамнеза, периода новорожденности, первого года жизни, а также всех этапов онтогенеза. Неврологический статус больных ДЦП изучался по общепринятой схеме.
Диагноз ДЦП устанавливался на основании изучения клинической картины заболевания, данных анамнеза, сведений из медицинской документации (амбулаторная карта, выписной эпикриз). В соответствии с классификацией К.А. Семеновой (1972) больные были распределены по следующим клиническим формам: 49 больных - нижняя спастическая диплегия, 38 - спастическая гемиплегия, 34 - спастическая тетраплегия и у 13 человек установлена атонически-астатическая форма ДЦП.
Тяжесть двигательных нарушений оценивалась согласно классификации Gross Motor Function>
3 - передвижение больного в пространстве за счет опоры собственных нижних конечностей невозможно в связи с выраженностью двигательных нарушений (28 человек).
Цитогенетический метод. Получение цитогенетических препаратов проводили c помощью микрометода из лимфоцитов периферической крови человека [Захаров А.Ф. и соавт., 1982]. Фиксацию клеток и приготовление цитогенетических препаратов метафазных хромосом лимфоцитов периферической крови проводили на 72-м часу после стимуляции ФГА строго по методике. После высушивания препараты маркировались и до окраски хранились при комнатной температуре. Для выявления районов ядрышковых организаторов использовался метод дифференциальной окраски хромосом нитратом серебра, предложенный Howell и Black с некоторыми модификациями [Сабанаева Е.В., 1989; Howell W.M., 1977]. Для каждого случая средний показатель суммарной активности 10 ЯОР рассчитывался без кариотипирования хромосом в 20 клетках. Количество активных РГ лимфоцитов периферической крови оценивалось визуально по пятибалльной шкале [Ляпунова Н.А. и соавт., 2001]. Для анализа отбирались метафазные пластинки с завершенной Ag-окраской. Помимо оценки общей функциональной активности рибосомных генов учитывались показатели активности рибосомных генов отдельно по хромосомам групп D и G. Также подсчитывалось число активных рибосомных цистронов (число окрашенных метафазных хромосом). Отдельно учитывалась ассоциативная активность. За ассоциацию принималась структура, состоящая из акроцентрических хромосом, взаимно ориентированных короткими плечами с расстоянием между ними менее толщины хроматиды. Для индивида подсчитывалось среднее число хромосом в ассоциациях и среднее число ассоциаций акроцентрических хромосом на одну клетку. Всего проанализировано 2920 метафазных пластинок (1720 - в выборке больных (N=86) и 1200 - в контрольной группе (N=60)).
Молекулярно-генетический метод. Для проведения молекулярногенетических исследований у всех обследуемых проводился забор венозной крови в количестве 5-10 мл. Выделение геномной ДНК осуществлялось из замороженной крови стандартным двухэтапным методом фенольнохлороформной экстракции [Маниатис Т. и др., 1984]. Генотипирование полиморфизмов генов СБК и АОС проводили методом ПЦР-ПДРФ согласно протоколам, описанным в литературе. Обнаружение SNP проводилось путем обработки продуктов ПЦР специфическими эндонуклеазами согласно протоколам, описанным производителями ферментов. После гидролиза продукты ПЦР-рестрикции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле различной концентрации (1-3,5%), приготовленном на основе ТВЕ буфера. После электрофореза гели документировали на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете с применением компьютерной видеосъемки на приборе GDS-8000 (UVP, США) и программного аналитического пакета LabWorksTM v4.5 (США). В рамках работы проводилось генотипирование 126 больных детским церебральным параличом и 126 здоровых детей по 12 полиморфизмам (SNP-маркеры) 3 генов ферментов АОС и 8 генов СБК, обладающих антиоксидантной активностью: CYP1A1 (I462V), PON2 (C311S), EPHX (H139R, Y113H), CYBA (A640G), FMO3 (E158K), CAT1 (C262T), MDR1 (C3435T), NAT(G590A), GSTM1 (+/0), GSTT1 (+/0) и GSTP1 (I105V).
Статистические методы. Статистический анализ полученных данных проводился на ПК с использованием пакета прикладных программ Statistiсa 6.фирмы StatSoft Inc. (США) и MS Excel. Обработку данных осуществляли по стандартным методикам вариационной статистики [Фогель Ф., 1989]. При описании количественных признаков использовали параметры нормального распределения: среднее значение, стандартную ошибку среднего значения, минимальные и максимальные значения признака, несмещенную дисперсию [Гланц С., 1998; Реброва О.Ю., 2003]. В работе использовали корреляционный, кластерный, дискриминантный, регрессионный анализы. Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных и здоровых использовали критерий 2 Пирсона.
Для сравнения частот аллелей и генотипов между различными группами использовали критерий 2 с поправкой Йетса [Реброва О.Ю., 2003]. Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеваниям судили по величине отношения шансов (OR) [Pearce С., 2003; Реброва О.Ю., 2003]. Границы 95% доверительного интервала (CI) для OR вычисляли методом B. Woolf. Межгенные взаимодействия изучали двумя путями: 1 - посредством сравнительного анализа парных комбинаций генотипов между группами и расчета отношения шансов; 2 - при помощи биоинформатического метода Multifactor Dimensionality Reduction (MDR), предложенного M.D. Ritchie et al.
[2005] для моделирования геномных взаимодействий высокого порядка, которые невозможно оценить при помощи традиционных параметрических методов [Moore, 2003; Motsinger et al., 2006]. Метод MDR позволяет уменьшить размерность числа рассчитываемых параметров при одновременной оценке взаимодействий большого количества SNP-маркеров путем создания новых переменных на основе суммирования сочетаний генотипов как повышенного, так и пониженного риска развития болезни. Важным преимуществом метода MDR является возможность статистической оценки воспроизводимости тестируемых моделей (Cross-validation consistency), а также расчет ошибки предсказания модели (Prediction error). Помимо этого, метод MDR позволяет представить графически иерархическую структуру и характер взаимодействий между различными генами.
Для оценки межгенных взаимодействий при помощи метода MDR изначально нами использовался алгоритм всестороннего поиска (Exhaustive search algorithm), который оценивал все возможные комбинации ДНК-маркеров в отношении риска развития ДЦП. В тех ситуациях, когда указанный алгоритм не позволял выявить статистически значимую модель межгенных взаимодействий, мы использовали алгоритм Forced search algorithm, на основании которого для тестирования n-локусных комбинаций ДНК-маркеров вручную выбирались генные локусы, для которых на предыдущих этапах анализа установлена вовлеченность в развитие ДЦП.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ При анализе факторов риска возникновения ДЦП у обследованных детей было установлено, что перечень интранатальных воздействий на онтогенез больных ДЦП существенно не изменился по сравнению с тем, что имеется в литературе, а недоношенная беременность и преждевременные роды продолжают оставаться ведущими факторами риска развития ДЦП.
Полученными данными подтверждено влияние гипоксии в качестве фона интра- и постнатального этапа развития у большинства детей с ДЦП. В этой связи одними из наиболее значимых факторов, определяющих норму реакции организма в условиях оксидантного стресса, можно считать состояние ферментативных систем, обеспечивающих утилизацию токсичных продуктов клеточного метаболизма, а также состояние белоксинтетического аппарата клетки, поддерживающего выработку жизненно необходимых веществ на оптимальном уровне.
Особенности функционирования белоксинтетического аппарата клетки у детей с детским церебральным параличом Фенотипическим отображением процессов синтеза белка в клетке является показатель функциональной активности рибосомных генов. В ходе проведенного исследования в группе больных с ДЦП выявлено значимое снижение ряда цитогенетических показателей, отражающих уровень белкового метаболизма в организме: суммарной ФАРГ - за счет снижения активности рибосомных генов по хромосомам группы D; числа хромосом, вступивших в ассоциацию, и количества ассоциаций (табл. 1).
Таблица Показатели ФАРГ у детей с ДЦП в сравнении с контрольной группой Дети с ДЦП, Контрольная Признак N=86 группа, N=60 t p ХSx ХSx Суммарная ФАРГ, усл. ед. 18,70,2 19,410,21 2,41 0,ФАРГ по D-хромосомам, усл. ед. 11,150,13 11,760,16 2,98 0,0ФАРГ по G-хромосомам, усл. ед. 7,550,14 7,640,17 0,44 0,Число хромосом, вступивших 0,580,03 0,780,04 3,84 <0,в ассоциацию Количество ассоциаций 1,230,07 1,70,1 3,94 <0,Число активных 8,810,08 8,650,08 1,39 0, рибосомных цистронов В то же время значимых различий среди индивидов мужского и женского пола в группе детей с ДЦП не выявлено. Однако при сравнении с группой контроля выявлены различия, обусловленные экспрессией рибосомных генов.
Среди мальчиков с ДЦП наблюдалось снижение суммарной ФАРГ (t=2,0, p=0,04), числа ассоциаций (t=3,57, p<0,001) и количества хромосом, вступивших в ассоциацию (t=3,45, p<0,001), по сравнению со здоровыми индивидуумами мужского пола. В группе девочек с ДЦП обнаружено значимое снижение ФАРГ по D-хромосомам по сравнению с контролем (t=2,37, p=0,02).
Особый интерес представляет функционирование белок-синтетического аппарата при клинических формах ДЦП (табл. 2).
Таблица Показатели ФАРГ при различных клинических формах ДЦП Спастическая Спастическая Спастическая Контрольная диплегия, гемиплегия, тетраплегия, группа, Признак N=32 N=30 N=17 N=ХSx ХSx ХSx ХSx Суммарная ФАРГ, усл. ед. 18,880,32 18,57 0,35* 18,780,4 19,410, ФАРГ по D11,40,17 11,0 0,31* 11,760,0,24* 10,9 хромосомам, усл. ед.
ФАРГ по G7,50,23 7,560,19 7,90,36 7,640,хромосомам, усл. ед.
Число хромосом, вступивших в 0,57 0,06* 0,52 0,04* 0,63 0,06* 0,780, ассоциацию Количество 1,21 0,13* 1,1 0,1* 1,34 0,14* 1,70, ассоциаций Число активных 8,80,13 8,810,14 8,830,17 8,650,рибосомных цистронов Примечание. * - различия по указанным параметрам в сравнении с контролем достоверно значимы.
Так, при спастической гемиплегии (t=2,67, p=0,01) и спастической тетраплегии (t=2,51, p=0,01) выявлено достоверное снижение ФАРГ в сравнении с контролем по хромосомам группы D. Данная особенность привела к достоверному снижению суммарной ФАРГ при спастической гемиплегии (t=2,14, p=0,03). Среди таких форм ДЦП, как спастическая гемиплегия, спастическая диплегия и спастическая тетраплегия, отмечено высокодостоверное снижение следующих цитогенетических показателей: число хромосом, вступивших в ассоциацию, и количество ассоциаций. Полученные данные свидетельствуют о сниженном уровне синтеза белка у больных с ДЦП.
При сравнении цитогенетических показателей среди детей с ДЦП с учетом срока гестации на момент рождения обнаружена высокая степень схожести между недоношенными детьми и родившимися в срок по всем показателям, отражающим уровень ФАРГ в организме. Таким образом, проведенное исследование позволяет считать, что активность рибосомных генов оказывает низкое влияние на гестационный возраст при рождении среди детей с ДЦП в исследованной популяции.
Проведенный линейно-дискриминантный анализ подтвердил на статистически значимом уровне различный характер взаимосвязей цитогенетических показателей и данных перинатального анамнеза между группой детей с ДЦП и контрольной группой - полученное F-отношение было выше теоретически ожидаемого (F=14,11, p<0,05, теоретически ожидаемое значение F=5,79).
При помощи логистического регрессионного анализа были рассчитаны коэффициенты регрессии для получения предварительной оценки клинического исхода у конкретного пациента. При этом из 6 показателей, вошедших в итоговое уравнение регрессии, 4 показателя отражали уровень функциональной активности рибосомных генов в организме (табл. 3).
Таблица Диагностически ценные количественные характеристики активности РГ и данных перинатального анамнеза при сегрегации обследуемых на больных и здоровых t- Коэффициент № Показатель p статистика регрессии (b) 1 ФАРГ по хромосомам группы D, усл. ед. 4,1 0,0001 -0,12 ФАРГ по хромосомам группы G, усл. ед. 2,83 0,005 -0,0Количество хромосом, вступивших в 3 3,02 0,003 -0,1ассоциацию 4 Количество активных рибосомных цистронов 3,2 0,002 0,2Гестационный возраст на момент рождения, 5 2,75 0,006 -0,0недели Показатель тяжести состояния ребенка при 6 3,57 0,001 -0,0рождении по шкале Апгар, баллы 7 Constanta (b0) 4,162 0,0001 2,5F(6,14)=14,11, р<0,0Рассчитав значения регрессии (y) для каждого индивидуума, входящего в исследуемую выборку (n=146 человек), были получены минимальные и максимальные значения y среди детей с ДЦП и в группе контроля с соответствующими им 95% доверительными интервалами:
y (max) для детей с ДЦП = 1,418 [1,151; 1,684], y (min) для здоровых детей = - 0,178 [-0,392; 0,036].
Таким образом, рассчитанный интервал y для нашей регрессионной модели составил [-0,392; 1,684]. Значения, меньшие нижней границы, можно с 95% вероятностью отнести к здоровым индивидуумам; значения, большие верхней границы, можно с вероятностью 95% отнести к больным ДЦП. Оценки ошибки прогноза по регрессионной модели на основе экспериментальной выборки составили: для здоровых детей ошибка классификации 23,3%, для больных детей - 14%.
Подставив полученные границы доверительного интервала в уравнение вероятности - Р=еу/(1+еу), границы вероятности, полученные в нашем исследовании, составили:
Р (max) для детей с ДЦП = 84,3%, Р (min) для здоровых детей = 40,3%.
Таким образом, в ходе цитогенетического исследования установлено, что изменения в работе белоксинтезирующего аппарата клетки на примере функциональной активности рибосомных генов могут являться фактором риска развития детского церебрального паралича. Сниженные показатели ФАРГ являются важными маркерами патогенетических изменений организма на клеточном уровне и должны приниматься во внимание при разработке методов прогнозирования и профилактики ДЦП.
Молекулярно-генетическая характеристика системы биотрансформации ксенобиотиков и антиоксидантной системы при детском церебральном параличе Поиск полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, ассоциированных с развитием ДЦП, состоял из нескольких этапов. Было установлено, что практически все исследованные полиморфизмы генов СБК как в опытной, так и в контрольной группе находились в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга. Лишь для полиморфизма FMOE158K в группе детей с ДЦП было установлено отклонение от РХВ, обусловленное увеличением уровня наблюдаемой гетерозиготности (Ho=0,6, He=0,49, 2=5,69, р<0,05). Анализ частот аллелей и генотипов генов СБК и АОС между здоровыми детьми и больными ДЦП позволил выявить ассоциации различных ДНК-маркеров с предрасположенностью к изучаемой патологии.
Общая предрасположенность к ДЦП ассоциировалась с аллельным вариантом 590A гена фермента N-ацетилтрансферазы 2-го типа (частота мутантного аллеля в группе детей с ДЦП 0,345; в контрольной группе 0,261; 2=4,04, р=0,04, OR=1,49, 95%Cl=1,01-2,21). При сравнении общих выборок больных ДЦП и контрольной группы установлено значимое увеличение частоты гетерозиготного 158ЕК гена FMO3 у детей с ДЦП (2=4,6, р=0,03, OR=1,72;
95%CI 1,05-2,84). Данная закономерность наблюдалась вследствие полового диморфизма - среди девочек с ДЦП также выявлено значимое увеличение частоты указанного генотипа гена флавинмонооксигеназы 3-го типа (2=4,48, р=0,03, OR=2,21, 95%Cl=1,06-4,64).
В ходе анализа частот генотипов среди различных форм ДЦП были получены следующие результаты. Предрасположенность к спастической гемиплегии ассоциировалась с полиморфным вариантом гена NAT2 G590A, к спастической тетраплегии - с геном GST Т (табл. 4).
Таблица Ассоциации генотипов ферментов СБК и АОС с предрасположенностью к ДЦП Распределение частот генотипов Критерий Ген, различий Контрольная полимор- Генотипы OR 95%Cl Больные ДЦП при df=1, группа физм 2 (p) n % n % Спастическая гемиплегия (n=37) 590GG 10 27,0 64 55,7 9,18 (<0,01) 3,39 1,5-7,590GG 10 27,0 64 55,NATNAT590GA 19 51,4 42 36,5 2,56 (0,11) - - 590GA 19 51,4 42 36,G590A G590A 590AA 8 21,6 9 7,8 4,06 (0,04) 3,23 1,18-8,590AA 8 21,6 9 7,Спастическая тетраплегия (n=31) + (W) 21 67,7 110 87,3 6,89 (0,01) 3,27 1,31-8,+ (W) 21 67,7 110 87,GST T 0 (Del) 10 32,3 16 12,7 6,89 (0,01) 3,27 1,31-8,0 (Del) 10 32,3 16 12,Легкая степень тяжести двигательных нарушений (n=76) 158EE 20 26,3 47 37,3 2,58 (0,11) - - 158EE 20 26,3 47 37,3 2,58 (0,11) FMO158EK 47 61,8 58 46,0 4,75 (0,03) 1,9 1,06-3,158EK 47 61,8 58 46,0 4,75 (0,03) E158K 158KK 9 11,8 21 16,7 0,53 (0,47) - - 158KK 9 11,8 21 16,7 0,53 (0,47) 590GG 29 38,2 64 55,7 5,61 (0,02) 2,03 1,13-3,590GG 29 38,2 64 55,7 5,61 (0,02) NAT590GA 35 46,1 42 36,5 1,73 (0,19) - - 590GA 35 46,1 42 36,5 1,73 (0,19) G590A 590AA 12 15,8 9 7,8 2,21 (0,14) - - 590AA 12 15,8 9 7,8 2,21 (0,14) Тяжелая степень тяжести двигательных нарушений (n=26) 3435CC 2 7,7 21 16,7 0,74 (0,39) - - 3435CC 2 7,7 21 16,7 0,74 (0,39) MDRI 3435CT 9 34,6 61 48,4 1,14 (0,29) - - 3435CT 9 34,6 61 48,4 1,14 (0,29) C3435T 3435TT 15 57,7 44 34,9 4,71 (0,03) 2,54 1,08-6,3435TT 15 57,7 44 34,9 4,71 (0,03) При исследовании сопряженности генотипов генов ферментов СБК и АОС со степенью тяжести двигательных нарушений установлено значимое увеличение частот гетерозиготного 158ЕК генотипа гена FMO3 и снижение частоты гомозиготного дикого 590GG генотипа гена NAT2 у больных с легкой степенью тяжести двигательных нарушений. Среди детей с ДЦП с тяжелыми двигательными нарушениями выявлена тенденция к накоплению мутантного 3435ТТ аллеля гена MDRI (табл. 4).
При использовании метода MDR для изучения межгенных взаимодействий были выявлены следующие закономерности. Проведенный кластерный анализ полученных MDR-моделей межгенных взаимодействий в системе биотрансформации ксенобиотиков позволил установить характерные для каждой клинической формы детского церебрального паралича связи между полиморфизмами, формирующими данную модель. Важная отличительная особенность MDR-анализа заключается в возможности определения направленности влияния и степени сопряженности полиморфных вариантов генов, входящих в модель. На рисунке представлены дендрограммы кластерного анализа результатов моделирования межгенных взаимодействий методом MDR при А-спастической диплегии, Б-спастической гемиплегии, В-спастической тетраплегии. Среди детей со спастической диплегией с помощью алгоритма Forced установлена значимая (р=0,01) трехлокусная модель взаимодействия генов FMO3 E158K EPHX1 H139R и GSTP1 I105V, для которой были характерны 100% воспроизводимость и ошибка предсказания 33%. В группе детей со спастической гемиплегией при использовании алгоритма Forced установлена значимая (р=0,01) четырехлокусная модель, сформированная из полиморфных вариантов генов MDRI C3435T GST M NAT2 G590A и GSTP1 I105V. Воспроизводимость модели составила 100%, ошибка предсказания 37%. Применение алгоритма Forced при спастической тетраплегии позволило выявить трехлокусную модель взаимодействия генов CYBA 640A>G GST Т и CYP1A1 I462V, продемонстрировавшую 100% воспроизводимость, ошибку предсказания 34% и уровень значимости р=0,01.
Интересен тот факт, что структура выявленных межгенных взаимодействий была сформирована не только за счет локусов, значимость которых была подтверждена на предыдущих этапах статистической обработки, но и другими полиморфизмами. Полученный результат возможно объяснить особенностями алгоритма компьютерного ранжирования первичных данных в анализируемых выборках. Указанный подход позволил выявить межгенные взаимодействия более высокого уровня сопряженности по сравнению со стандартными параметрическими критериями.
FMO3 E158K А EPHX1 H139R GSTP1 I105V MDRI С3435Т Б GST M NAT2 G590A GSTP1 I105V CYP1A1 I462V В CYBA 640A>G GST T Выраженный антагонизм Умеренный антагонизм Аддитивное взаимодействие Выраженный синергизм Рис. Взаимодействия между генами ферментов СБК и АОС при детском церебральном параличе (программа MDR v1.1.0).
Выводы 1. Изучение состояния белоксинтезирующего аппарата у детей с детским церебральным параличом обнаружило статистически значимое снижение большинства показателей функциональной активности рибосомных генов (суммарной ФАРГ - преимущественно за счет снижения активности рибосомных генов по хромосомам группы D - при спастической гемиплегии и тетраплегии; числа хромосом, вступивших в ассоциацию, и количества ассоциаций - при спастической диплегии, гемиплегии и тетраплегии).
2. Использование приемов многомерной статистики позволило получить уравнение регрессии, включающее как показатели ФАРГ, так и данные перинатального анамнеза, на основании которого открылась возможность прогнозирования клинического исхода у детей с двигательными нарушениями с диагностической ошибкой 17,8%.
3. Впервые установлены 4 новых кандидатных гена детского церебрального паралича, значимость которых была подтверждена на различных этапах статистического анализа: FMO3 E158K, NAT2 G590A, MDRI C3435T и GST Т.
4. Характер выявленных ассоциаций межгенного взаимодействия на основе частот парных сочетаний генотипов ферментов СБК указывает на преимущественное аккумулирование среди больных ДЦП функционально не полноценных аллелей антиоксидантного действия на фоне сохраненного функционирования аллелей, обладающих прооксидантным эффектом.
Практические рекомендации 1. С целью индивидуального прогнозирования клинического исхода у детей с двигательными нарушениями представляется целесообразным введение в лабораторную диагностику оценки показателей функциональной активности рибосомных генов (ФАРГ по хромосомам группы D и G; количество хромосом, вступивших в ассоциацию; количество активных рибосомных цистронов) наряду с данными перинатального анамнеза (гестационный возраст на момент рождения; показатель тяжести состояния ребенка при рождении по шкале Апгар).
2. Введение в практику медико-генетического консультирования типирования полиморфизмов 4 новых генов ферментов СБК (FMO3 E158K, NAT2 G590A, MDRI C3435T и GST Т) для определения индивидуального фона реагирования организма в условиях вероятного оксидантного стресса.
3. В рамках высшего медицинского образования в курсах медицинской и клинической генетики шире освещать проблемы функционирования рибосомных генов и роль системы биотрансформации ксенобиотиков как при ДЦП, так и при мультифакториальной патологии у человека в целом.
Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Сравнение показателей функциональной активности рибосомных генов при различных заболеваниях человека с показателями по общей популяции Курской области / В.П. Иванов, Е.В. Трубникова, Н.В. Стабровская, Е.Е.
Борзилов, Е.В. Кохтенко // Теоретические и прикладные проблемы социальноправовых, медико-биологических и технико-экономических сфер жизни общества : материалы Междунар. науч.-практ. конф. (Курск, 20-21 марта 2008 г.). - Курск, 2008. - С. 73-74.
2. Борзилов, Е.Е. Состояние функциональной активности рибосомных генов при детском церебральном параличе / Е.Е. Борзилов, В.П. Иванов, Е.В. Трубникова // Современные технологии в педиатрии и детской хирургии :
материалы VII Рос. конгр. (21-23 окт. 2008 г.). - М.: Оверлей, 2008. - С. 78.
3. The role of hereditary component in the origin of cerebral palsies / E.V. Trubnikova, V.P. Ivanov, A.S. Belous, A.P. Maslov, E.V. Kohtenko, E.E. Borzilov, N.V. Stabrovskaya, A.N. Barkov, I.I. Bart // Internationaler Medizinischer Kongress Euromedica Hannover (4-5 Juni 2009) - Programm Abstracts. - Hannover, 2009. - P. 83-84.
4. Состояние белоксинтезирующего аппарата у детей с различными формами церебральных параличей / Е.Е. Борзилов, В.П. Иванов, Е.В. Трубникова, Н.В. Стабровская // Курский науч.-практ. вест. Человек и его здоровье. - 2009. - № 4. - С. 49-55.
5. Иванов В.П., Трубникова Е.В., Борзилов Е.Е. Особенности экспрессии рибосомных генов у детей с церебральными параличами / В.П. Иванов, Е.В. Трубникова, Е.Е. Борзилов // Актуальные проблемы педиатрии : сб.
материалов XIV конгр. педиатров России с междунар. участием (Москва, 15-18 февраля 2010 г.). - М., 2010. - С. 304.
6. Показатели функциональной активности рибосомных генов в семьях детей с детскими церебральными параличами / Е.В. Трубникова, Е.Е. Борзилов, О.Ю. Бушуева, Н.В. Стабровская, А.Н. Барков // Охрана репродуктивного здоровья - будущее России : материалы Всерос. конф. с междунар. участием (Белгород, 11-12 марта 2010 г.). - Белгород, 2010. - С. 240-242.
7. Особенности функциональной активности рибосомных генов у людей с различными вариантами генотипов гена DNMTP149 / Е.В. Кохтенко, Е.В. Трубникова, Н.В. Стабровская, В.Н. Рыжаева, А.С. Белоус, А.Н. Барков, А.Ю. Брежнев, Е.Е. Борзилов // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г.). - Ростов н/Д, 2010. - С. 94.
8. Возрастные особенности функциональной активности рибосомных генов у человека / Е.А. Климова, Е.В. Трубникова, Н.В. Стабровская, О.Ю. Бушуева, А.Н. Барков, И.И. Барт, Е.Е. Борзилов, О.Н. Бачинский, В.П. Иванов // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г.). - Ростов н/Д, 2010. - С. 84-85.
9. Связь полиморфизма Е158К гена флавинсодержащей монооксигеназы-3 с тяжестью двигательных нарушений у детей с церебральным параличом / Е.Е. Борзилов, В.П. Иванов, А.В. Полоников, Е.А.
Переверзева, Е.В. Кохтенко, И.В. Булгакова, Д.С. Тевс // Медицинская генетика. - 2010. - Т. 9, № 10. - С. 35-38.
10. Связь полиморфизма с3435т гена множественной лекарственной устойчивости 1-го типа с двигательными нарушениями при детском церебральном параличе / Е.Е. Борзилов, А.В. Полоников, Е.В. Трубникова, Е.С. Курцева, Н.О. Толбатова, Г.В. Анцупова // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 2; URL: www.science-education.ru/102-59СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АОС - антиоксидантная система ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДЦП - детский церебральный паралич МФЗ - мультифакториальные заболевания НАДФ - никотинамиддинуклеотид фосфат ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПЦР - полимеразная цепная реакция РГ - рибосомные гены СБК - система биотрансформации ксенобиотиков Усл. ед. - условные единицы ФАРГ - функциональная активность рибосомных генов ЦНС - центральная нервная система ЯОР - ядрышкообразующие районы CYBA - цитохром b(-245), -субъединица (p22-phox субъединица НАДФН оксидазы) CYP1A1 - цитохром Р-450, семейство A, подсемейство I, полипептид EPHX1 - эпоксидгидролаза 1 типа, микросомальная FMO3 - флавинсодержащая монооксигеназа, 3 тип GSTM1 - глутатион-S-трансфераза, класс , изоформа GSTT1 - глутатион-S-трансфераза, класс , изоформа GSTP1 - глутатион-S-трансфераза, класс , изоформа MDRI - ген множественной лекарственной устойчивости NAT2 - N-ацетил-трансфераза 2 типа SNP - single nucleotide polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм) Борзилов Евгений Евгеньевич (Россия) Изучение вовлеченности молекулярно-генетических механизмов и цитогенетических показателей клеточного гомеостаза в этиологию и патогенез детских церебральных параличей В работе представлены результаты исследования, отражающие вовлеченность белоксинтезирующего аппарата клетки, а также генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в формирование детских церебральных параличей (ДЦП). В работе впервые доказан модифицирующий эффект функциональной активности рибосомных генов на клинические проявления ДЦП; выявлены 4 новых полиморфизма, для которых установлена предрасположенность к детскому церебральному параличу: FMO3 E158K, NAT2 G590A, MDRI C3435T и GST Т. Разработаны критерии оценки риска формирования ДЦП у детей с двигательными нарушениями. Результаты исследования рекомендуются к использованию в практической медицине и научных исследованиях.
Borzilov Evgeniy Evgenyevich (Russia) Involving of molecular-genetic mechanisms and cytogenetic parameters of cellular homeostasis in etiology and pathogenesis of infantile cerebral palsies The results of this work represent the role of cellular protein-synthesizing complex and the xenobiotics biotransformation enzymes genes in the developing of infantile cerebral palsies (ICP). The modifying effect of ribosomal genesТ functional activity on clinical manifestation of ICP was proved; also 4 new polymorphisms associated with predisposition to infantile cerebral palsy were discovered: FMOE158K, NAT2 G590A, MDRI C3435T и GST Т. Criteria of risk estimation of ICP among children with movement disorders were worked out. Investigation results are recommended to application in practical medicine and scientific researches.
Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г.
Сдано в набор 16.04.2012 г. Подписано в печать 18.04.2012 г.
Формат 30x42 1/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom.
Печать офсетная. Усл. печ. л. 1.
Тираж 100 экз. Заказ № 201"А".
Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.