Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии
На правах рукописи
МОДЕСТОВА Юлия Александровна
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ LUCIOLA MINGRELICA МЕТОДОМ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА
02.00.15 - кинетика и катализ 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Москва - 2012
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.
Научные руководители:
доктор химических наук, профессор Угарова Наталья Николаевна кандидат химических наук, доцент Ломакина Галина Юрьевна
Официальные оппоненты:
Чухрай Елена Семёновна, доктор химических наук, профессор кафедры физической химии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Высоцкий Евгений Степанович, кандидат биологических наук, доцент кафедры биофизики Сибирского федерального университета, заведующий лабораторией фотобиологии Института биофизики Сибирского Отделения Российской академии наук
Ведущая организация:
Институт Биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук
Защита диссертации состоится ___ июля 2012 года в 15 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1., стр. 11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.
Автореферат разослан 01 июня 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук Сакодынская И.К.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Люцифераза светляков (КФ 1.13.12.7) - фермент, катализирующий окисление люциферина кислородом воздуха в присутствии АТP и Mg2+, сопровождаемое выделением квантов света. Неослабевающий научный интерес к изучению структуры и функций фермента обусловлен широкими возможностями биоаналитического применения люцифераз. Это связано с уникальной специфичностью и высоким квантовым выходом биолюминесцентной реакции.
Уникальной особенностью люцифераз светляков является наличие большого числа свободных SH-групп остатков цистеина, содержание которых в молекуле варьируется в широком диапазоне для люцифераз из светляков разных видов.
Являясь наиболее реакционно-способными аминокислотными остатками, SH-группы цистеина могут выполнять в ферментах разнообразные функции: поддерживать третичную структуру белка за счёт образования внутримолекулярных дисульфидных связей; принимать непосредственное участие в каталитической реакции в качестве нуклеофила; координировать ионы металлов-кофакторов в активном центре фермента. Кроме того, свободные остатки цистеина, не входящие в состав активного центра, могут играть ключевую роль на разных этапах фолдинга фермента, образовывать межмолекулярные S-S-связи; участвовать в реакциях обратимого окисления, выполняющих важную роль в регуляторных процессах в клетке.
Роль остатков цистеина в функционировании люцифераз в настоящее время остаётся неясной. Немногочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что хотя остатки цистеина в молекуле люцифераз не входят в состав активного центра и не участвуют в структурообразовании молекулы, они чрезвычайно важны для функционирования фермента, поскольку их химическая модификация и мутагенез приводит к существенным изменениям свойств люцифераз. Так, было показано, что замена всех 4-х остатков Cys в люциферазе Photinus pyralis на Ser приводит к резкому падению ферментативной активности (до 6,5%); кроме того, прослеживается существенное взаимовлияние между данными остатками.
Самопроизвольное окисление белков, обусловленное, в первую очередь, окислением свободных SH-групп остатков цистеина, как наиболее реакционноспособных, является одной из существенных проблем биотехнологии. Исключение доступных для окисления остатков цистеина из состава молекулы люциферазы может способствовать стабилизации фермента. В то же время наличие свободных -3- остатков цистеина, доступных для модификации, открывает возможности для проведения направленной конъюгации люциферазы, что может существенным образом расширить её биотехнологическое применение.
Для увеличения выхода данного фермента и упрощения процедуры очистки в структуру люциферазы была введена шестигистидиновая последовательность (Hisтаг), и был осуществлён переход к использованию экспрессионной плазмиды pETL7.
Ранее вопрос о влиянии His-тага на свойства люциферазы в литературе не рассматривался, однако он является важным, поскольку существуют публикации, указывающие на возможность существенного изменения свойств фермента за счёт введения His-тага в состав его молекулы.
Данная работа посвящена изучению функции неконсервативных остатков цистеина в молекуле люциферазы светляков Luciola mingrelica: изучению возможности замены данных остатков в структуре молекулы для повышения стабильности фермента за счёт снятия эффекта окислительной инактивации фермента, а также возможности использования этих остатков для проведения направленной конъюгации люциферазы светляков. Ещё одной актуальной задачей являлось изучение влияния шестигистидиновой последовательности на С-конце люциферазы на свойства данного фермента.
Цели и задачи исследования.
1. Изучение роли неконсервативных остатков Cys62,146,164 в молекуле люциферазы светляков L. mingrelica методом сайт-направленного мутагенеза.
2. Изучение влияния шестигистидиновой последовательности (His-тага) на Сконце молекулы люциферазы светляков L. mingrelica на свойства фермента.
3. Изучение роли неконсервативных остатков Cys62,86,146 и 164 в молекуле люциферазы светляков L. mingrelica, содержащей дополнительную шестигистидиновую последовательность на С-конце молекулы.
4. Изучение возможности использования свободных SH-групп люциферазы для проведения направленной конъюгации.
В соответствии с целями в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
1. Получение мутантов люциферазы светляков L. mingrelica, несущих единичные замены: Cys62Ser, Cys146Ser, Cys164Ser. Изучение -4- каталитических свойств данных ферментов и влияния вводимых замен на кинетику процесса термоинактивации люциферазы.
2. Изучение влияния шестигистидиновой последовательности на С-конце люциферазы на свойства исходного фермента и его мутантных форм:
Cys62Ser, Cys86Ser, Cys146Ser и Cys164Ser.
3. Получение мутантов люциферазы светляков L. mingrelica, содержащей шестигистидиновую последовательность на С-конце молекулы, несущих множественные замены: Cys62/146Ser, Cys62/164Ser, Cys86/146Ser, Cys146/164Ser и Cys62/146/164Ser для выявления возможного взаимовлияния остатков цистеина.
4. Изучение возможности проведения направленной конъюгации c использованием свободных остатков цистеина в молекуле люциферазы.
Научная новизна. Впервые продемонстрирован стабилизирующий эффект мутаций неконсервативных остатков цистеина Cys62Ser, Cys146Ser и Cys164Ser в молекуле люциферазы L. mingrelica, который определяется частичным снятием эффекта окислительной инактивации при замене остатка Cys62 и практически полным снятием данного эффекта при замене остатков Сys146 и Cys164. Показано, что введение указанных замен снижает зависимость стабильности люциферазы от ее концентрации. Особенно яркий стабилизирующий эффект замены остатков Cys наблюдается при низких концентрациях фермента. Введение С-концевой шестигистидиновой последовательности приводит к изменению каталитических свойств люциферазы, а также к смене механизма термоинактивации и исчезновению концентрационной зависимости стабильности фермента. Впервые показана критическая роль остатка Cys86 для функционирования люциферазы.
Продемонстрировано наличие взаимного влияния между остатками Cys62 и Cys1в молекуле люциферазы, несущей С-концевую шестигистидиновую последовательность.
Практическая значимость работы. Показано, что введение замен Cys146Ser и Cys164Ser приводит к трехкратной стабилизации фермента, а также практически полностью исключает протекание процесса окислительной инактивации, что позволяет избежать использования дитиотреитола в качестве протектора для предотвращения окисления SH-групп при очистке и хранении люциферазы светляков. Показано, что использование остатка Cys146, локализованного на поверхности белковой глобулы, открывает широкие возможности для проведения химической конъюгации люциферазы с различными биоспецифичными молекулами.
-5- Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: IV Международный Московский биотехнологический конгресс УБиотехнология 2007: Состояние и перспективы развитияФ (Москва, Россия, 2007), 15th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Shanghai, China, 2008), Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов - 2007 (Москва, Россия, 2007), V Съезд Российского фотобиологического общества (Пущино, Россия, 2008), International conference УBiocatalysis 2009: Fundamentals and ApplicationsФ (Arkhangelsk, Russia, 2009), VI Международный Московский биотехнологический конгресс УБиотехнология 2011: Состояние и перспективы развитияФ (Москва, Россия, 2011) и VI Съезд Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, Россия, 2011).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 9 тезисов докладов конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (три главы), выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 135 страниц печатного текста, 41 рисунок, 27 таблиц и 155 ссылок.
Принятые в тексте обозначения. WT - люцифераза, аминокислотная последовательность которой идентична природной люциферазе; WT-His - люцифераза, содержащая дополнительную шестигистиновую последовательность на C-конце фермента; 4TS - термостабильный мутант люциферазы; His-таг - концевая шестигистидиновая последовательность; ДТТ - дитиотреитол; DTNB - 5,5'дитиобис-2-нитробензойная кислота; SPDP - N-сукцинимидил 3-(2пиридилдитио)пропионат; kin - константа скорости инактивации.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Получение и свойства мутантных форм люциферазы све тляков L.
mingrelica с единичными заменами C62S, C146S и C164S Гомология и топология остатков цистеина в молекулах люцифераз. В настоящее время известны первичные последовательности более чем люцифераз светляков (гомология ~ 60%), 9 из которых, включая люциферазу L.
-6- mingrelica, относятся к подсемейству Luciolinae (гомология ~84%). Количество остатков Cys варьирует от 4 до 10.
юцифераза L. mingrelica содержит 8 остатков цистеина: Cys62, Cys82, Cys86, Cys146, Cys164, Cys260, Cys284 и Cys393, расположенных в составе N-домена молекулы (рис.1). Для выявления потенциально доступных для модификации остатков цистеина был проведен компьютерный анализ, включающий в себя сравнение аминокислотных последовательностей различных люцифераз светляков, характеристику микроокружения каждого из остатков Cys в молекуле и расчёт площади поверхности остатков Cys, доступной для растворителя. Анализ выравниваний аминокислотных последовательностей показал, что остатки Cys82 и Cys260 абсолютно консервативны для всех люцифераз. Эти остатки, а также остаток Cys393, абсолютно консервативный для люцифераз подсемейства Luciolinae, были ранее изучены в нашей лаборатории. Остаток Cys284 также консервативен для люцифераз подсемейства Luciolinae, расположен в глубине белковой глобулы и не контактирует с растворителем.
Остаток Cys 86 не консервативен, но находится в высококонсервативной области, вблизи остатка Cys82 и центра связывания субстратов. Этот остаток расположен на участке фермента между двумя подвижными доменами люциферазы. В то же время оценка степени доступности растворителю с помощью компьютерной программы Surface Racer показала, что данный остаток потенциально подвержен воздействию внешней среды. Периферические остатки Cys62, Cys146 и Cys164 удалены от активного центра на 25-30 и расположены в области, наименее консервативной для люцифераз подсемейства Luciolinae. Остаток Cysвстречается структуре всех люцифераз светляков (за исключением Photinus pyralis) и входит в состав -спирали, образованной остатками 61-78. Остаток Cys1расположен в -спирали, образованной остатками 142-164, причем -спирали 61-и 142-164 находятся в непосредственном контакте. Остатки Cys 62 и Cys1локализованы в приповерхностной зоне подвижной части молекулы белка, так что существует возможность их модификации компонентами растворителя. Наибольшую площадь доступной растворителю поверхности имеет остаток Cys146. Он находится на поверхности белковой глобулы, и его SH-группа экспонирована во внешнюю среду. Таким образом, наибольший интерес для нашего исследования представляют неконсервативные остатки Cys62, Cys86, Cys146 и Cys164.
-7- 3322112211Рис. 1. Молекула люциферазы светляков L. mingrelica.
Получение мутантных форм люциферазы светляков L. mingrelica с единичными заменами Cys62Ser, Cys146Ser и Cys164Ser. Для изучения роли остатков Cys в молекуле люциферазы методом сайт-направленного мутагенеза были получены ферменты, содержащие единичные замены остатков C62S, C146S и C164S. В качестве матрицы при проведении ПЦР была использована плазмида pLR3, несущая ген рекомбинантной люциферазы дикого типа. Наличие соответствующих аминокислотных замен и отсутствие случайных мутаций на синтезированном методом ПЦР участке было подтверждено секвенированием.
Очистка ферментов проводилась методом ионно-обменной ДЕАЕхроматографии в присутствии ДТТ для защиты SH-групп люциферазы от окисления.
Степень чистоты полученных ферментов по данным SDS-электрофореза по Лэммли, полученного в 12% ПААГ геле, составила 80-90%. Выход по активности составил для исходной (WT) люциферазы 46%, для мутанта C62S - 62%, для мутанта C146S - 57%, а для мутанта C164S - 59%. Было показано, что введение единичных замен остатков цистеина в молекулу люциферазы светляков не оказало влияния на -8- уровень экспрессии белка в клетках E. coli, его удельную активность как в лизате, так и в очищенном препарате, а также на его стабильность в процессе очистки.
Физико-химические свойства мутантных форм люциферазы светляков L. mingrelica с единичными заменами Cys62Ser, Cys146Ser и Cys164Ser. Кинетические параметры исходной люциферазы и её мутантных форм представлены в табл. 1. Величины и для исходной и мутантных люциферазы совпали в пределах погрешности. Как видно, ни одна из мутаций не повлияла на сродство фермента к субстратам.
Таблица 1. Кинетические параметры реакции, катализируемой нативной люциферазой и её мутантными формами. Условия: 0,05 М Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgSO4, pH 7,Исходная Мутантные формы люциферазы люцифераза Свойства светляков L. mingrelica светляков L. mingrelica C62S C146S C164S 19 3 20 2 16 3 19, мкМ, мкМ 180 40 210 30 170 30 170Vmax, усл.ед. 1,5 0,4 1,0 0,4 0,9 0,2 1,30,Анализ спектров биолюминесценции исходной люциферазы и её мутантных форм (концентрация фермента 10-6 М, концентрации субстратов - 1 мМ ATP; 0,15 мМ LH2, рН 7,8, 25С) показал, что введение единичных замен остатков цистеина не привело к изменению формы спектров биолюминесценции. Максимум спектров биолюминесценции (max), наблюдался при 5660.5 нм для WT, C62S и C164S форм и при 561,5 нм для мутанта C146S.
Спектры собственной флуоресценции также совпали для всех изученных форм люцифераз. Собственная флуоресценция люциферазы светляков L. mingrelica с max = 340 нм вызвана единственным остатком триптофана Trp419, расположенным вблизи активного центра. Индольные кольца триптофана являются флуорофорами, чувствительными к полярности растворителя, отсутствие изменений спектра свидетельствует о том, что мутации остатков цистеина в положениях 62, 146 и 1не привели к изменению микроокружения остатка Trp419 и, следовательно, не затронули активный центр белка.
-9- Таким образом, введение единичных замен остатков цистеина не повлияло на кинетические и спектральные свойства люциферазы, что объясняется существенной удалённостью этих остатков от активного центра фермента.
Термоинактивация исходной люциферазы светляков L. mingrelica и её мутантных форм при 37С. Известно, что активная форма люциферазы представляет собой димер. Термоинактивация люциферазы светляков является сложным процессом, в ходе которого, согласно литературным данным, происходит диссоциация димерной формы люциферазы (1), за которым следует разворачивание белковой глобулы (2). Определённый вклад в суммарный процесс термоинактивации белка может вносить инактивация фермента за счёт окисления свободных SH-групп остатков цистеина (3):
2E (1) E2 E (2) Ein (3) E-SH (E2-SH) E-S(Ox) Изучение термоинактивации исходной и мутантных форм люциферазы при 37С при различных концентрациях люциферазы (1,610-6, 1,610-7 и 1,610-8 М) показало, что процесс инактивации люциферазы светляков в этих условиях описывается двухэкспоненциальной зависимостью, характерной для диссоциативного механизма (см. рис. 2). Первая, быстрая, стадия инактивации длится не более 5 минут и приводит к потере 30-60% ферментативной активности в зависимости от концентрации фермента в растворе - чем выше исходная концентрация фермента, тем больший процент активности сохраняется к концу быстрой стадии инактивации. Константы быстрой и медленной стадии инактивации (kин) различных форм люцифераз приведены в таблице 2.
При высокой концентрации фермента (1,610-6 М) величины kин медленной стадии сходны в пределах погрешности для всех форм люциферазы. Различие в значениях kин проявляется при снижении концентрации фермента: так, при концентрации люциферазы 1,610-8 М kин WT люциферазы возрастает в 4 раза, мутанта C62S - в 1,7 раза, а kин мутантов C146S и C164S остается неизменной.
Таким образом, замены остатков цистеина привели к стабилизации фермента на медленной стадии в области его низких концентраций, но не оказали существенного влияния на кинетику быстрой стадии инактивации.
-10- Таблица 2. Константы скорости инактивации исходной люциферазы и её мутантных форм при различных концентрациях фермента при 37С. Условия: см. табл. 1.
kин, мин-Концентрация WT Мутант С62S фермента, M Быстрая Медленная Быстрая Медленная стадия стадия стадия стадия 1,610-6 0,150,04 0,0160,005 0,070,01 0,0200,01,610-7 0,310,06 0,0540,003 0,190,04 0,0160,01,610-8 0,880,15 0,070 0,009 0,250,06 0,0340,01,610-8, 12 мМ ДТТ 0,210,03 0,0140,003 0,300,07 0,0110,0Мутант С146S Мутант С164S Концентрация Быстрая Медленная Быстрая Медленная фермента, M стадия стадия стадия стадия 1,610-6 0,100,02 0,0120,003 0,080,02 0,0180,01,610-7 0,120,04 0,0160,004 0,140,04 0,0170,01,610-8 0,280,06 0,0150,003 0,230,06 0,0230,01,610-8, 12 мМ ДТТ 0,200,05 0,0100,002 0,150,03 0,0140,0По-видимому, при снижении концентрации фермента остатки цистеина оказываются более доступными для окисления, что ускоряет процесс его инактивации. Действительно, скорости медленной стадии инактивации мутантных люцифераз в области низких концентраций (1,610-8 М) в присутствии 12 мМ ДТТ, препятствующего окислению SH-групп, практически совпадают для всех изученных форм люциферазы, и полученное значение kин в присутствии ДТТ (табл. 2) отвечает процессу денатурации белка. В присутствии ДТТ величина kин WT фермента уменьшается ~ в 5 раз, мутанта C62S - в 3 раза, мутанта C164S - в ~1,8 раз, а величины kин мутанта C146S совпадают в пределах погрешности в присутствии и в отсутствие ДТТ. Как видно, наибольший вклад в процесс окислительной инактивации вносят остатки Cys146 и Cys164.
-11- Рис. 2. Кинетические кривые термоинактивации различных форм люциферазы в зависимости от концентрации фермента при 37С. Обозначения: 1 - 1,610-6 М.
юциферазы, 2 - 1,610-7 М люциферазы, 3 - 1,610-8 М люциферазы.
Условия: см. табл.1.
Кинетика термоинактивации исходной и мутантных люцифераз при 42С. Изучение кинетики инактивации исходного и мутантных люцифераз при 42С в диапазоне концентраций 1,610-6 - 1,610-8 М показало, что, как и при 37С, процесс инактивации является двухстадийным. Стабильность WT люциферазы уменьшается в ~ 1,5 раза при снижении концентрации до 1,610-8 М, в то время как для мутантов концентрационные зависимости kин люциферазы на медленной стадии менее выражены и мало зависят от концентрации фермента. При этом стабильность всех мутантных форм в области низких концентраций фермента примерно в 2 раза выше, чем WT люциферазы (табл. 3).
Изучение спектров флуоресценции люцифераз в процессе термоинактивации исходного и мутантных ферментов при 42С, показало, что интенсивность собственной флуоресценции люциферазы уменьшается примерно на 25% в течение первых минут инкубации для всех форм фермента независимо от введённой мутации. Дальнейшая инкубация фермента (до 8 часов) при 42С практически не привела к изменению формы спектров флуоресценции и положению его максимума.
Таким образом, наиболее существенные конформационные изменения вблизи -12- остатка Trp419, приводящие к деформации активного центра молекулы, происходят на быстрой стадии инактивации фермента.
Таблица 3. Константы скорости быстрой и медленной стадии инактивации WT люциферазы и её мутантных форм в зависимости от концентрации фермента при 42С. Условия: см. табл.1.
kин, мин-Концентрация WT Мутант С62S фермента, M Быстрая стадия Медленная стадия Быстрая стадия Медленная стадия 1,610-8 M 0,560,13 0,1270,017 0,630,14 0,0680,01,610-7 M 0,450,11 0,0820,009 0,480,12 0,0940,01,610-6 M 0,390,09 0,0870,010 0,250,06 0,0970,0Мутант С146S Мутант С164S Концентрация фермента, M Быстрая стадия Медленная стадия Быстрая стадия Медленная стадия 1,610-8 M 0,830,19 0,0700,012 0,350,08 0,0660,01,610-7 M 0,440,11 0,0820,011 0,400,10 0,0710,01,610-6 M 0,280,06 0,0830,014 0,150,03 0,0900,0Наиболее ярко стабилизирующий эффект замен остатков цистеина проявляется при снижении температуры, когда скорость денатурации замедляется и оказывается сопоставимой со скоростью окислительной инактивации фермента.
Эффект стабилизации люцифераз за счет замены C146S и C164S отчетливо проявляется при 30С. При указанной температуре стабильность мутантов C146S и C164S превышает стабильность WT люциферазы - в 9,6 и в 4 раза соответственно, в то время как при 42С - всего в 2 раза. Менее выражен стабилизирующий эффект от замены C62S, что объясняется, по-видимому, минимальной доступностью растворителю и, как следствие, незначительным вкладом окислительной инактивации.
На основании данных о температурной зависимости констант медленной стадии инактивации люцифераз были рассчитаны энергии активации Ea данной реакции (табл. 4). Явно прослеживается зависимость Ea от концентрации люциферазы. При высокой концентрации фермента (1,610-6 М), когда фермент существует в олигомерной форме, Ea близки для исходной люциферазы и её мутантов. Различия проявляются при уменьшении концентрации до 1,610-8 М: при данной концентрации люциферазы величины Ea практически совпадают для WT и -13- мутанта C62S, для мутанта C164S они выше в 1,5-2 раза и наиболее высоки для C146S.
Таблица 4. Величины энергии активации реакции инактивации исходной и мутантных люцифераз (концентрация 10-6-10-8 М) при температурах 30-42С.
Ea, кДж/моль 1,610-8 М 1,610-7 М 1,610-6 М WT 12315 14017 239C62S 12316 21125 258C146S 22324 23628 283C164S 16820 19924 249На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что основной вклад в процесс окислительной инактивации WT-люциферазы вносят остатки Cys146 и Cys164, а в результате их замены стабильность люциферазы становится менее зависимой от концентрации фермента.
2. Получение и свойства мутантных форм люциферазы светляков L.
mingrelica, содержащей His-таг на С-конце молекулы Далее в нашей работе была использована рекомбинантная люцифераза, содержащая His-таг на С-конце молекулы. Ген данной формы люциферазы входит в состав плазмиды pETL7, полученной ранее в нашей лаборатории. Экспрессия данного гена протекает под контролем промотора фага Т7, что обеспечивает высокий выход целевого белка, а наличие His-тага позволяет существенно упростить и ускорить процесс очистки фермента, увеличив степень чистоты и концентрацию белка в конечной фракции.
Наличие His-тага, как следует из анализа литературы, может изменить свойства фермента, поэтому было проведено сравнение каталитических параметров и кинетики инактивации WT и WT-His ферментов. Было показано, что для WT-His величина Km по АТФ увеличилась в 1,7 раза, а Km по LH2 - в 3 раза (сравнить данные таблиц 1 и 5). По-видимому, шестигистидиновая последовательность создает определённые стерические препятствия, влияющие на взаимодействия субстратов с активным центром фермента. Кроме того, введение His-тага привело к изменению кинетики термоинактивации: для WT-His люциферазы этот процесс протекает по первому порядку - отсутствует быстрая стадия инактивации, характерная для WT фермента (табл. 6). Более того, стабильность WT-His фермента не зависит от его -14- концентрации, что указывает на отсутствие стадии диссоциации в процессе его инактивации. Таким образом, введение His-тага на С-конец молекулы люциферазы существенно повлияло не только на фермент-субстратные взаимодействия, но и на взаимодействия между молекулами люциферазы, что в конечном итоге привело к изменению кинетики термоинактивации. Благодаря данному эффекту, стабильность WT-His люциферазы существенно возросла по сравнению с WT формой: значение kин WT-His люциферазы не зависит от концентрации фермента и сопоставимо со значением kин для высоких концентраций WT фермента.
На основе плазмиды pETL7 методом сайт-направленного мутагенеза были получены мутанты с единичными и множественными заменами, а именно: C62S, C86S, C146S, C164S, C146/62S, C146/86S, C146/164S, C62/164S и C146/62/164S.
Показано, что уровень экспрессии и удельная активность WT-His люциферазы и её мутантных форм C62S, C62V, C164S, C62/146S и C146/164S примерно равны.
Введение замены C86S привело к снижению уровня экспрессии фермента (62% от WT-His) и его удельной активности (30% от WT) для мутантов C86S и C146/86S. При введении двойной замены C62/164S и тройной замены C62/146/164S наблюдалось резкое снижение как уровня экспрессии, так и удельной активности люциферазы, что свидетельствует о существовании взаимного влиянии остатков Cys62 и Cys164.
Физико-химические свойства мутантных форм люциферазы светляков L. mingrelica, несущей С-концевой His-таг. Для всех мутантных форм были определены каталитические характеристики биолюминесцентной реакции (табл. 6). При введении замены C86S наблюдалось снижение в 1,6 раза сродства к обоим субстратам по сравнению с WT-His. Данный эффект может объясняться близостью остатка Cys86 к субстрат-связывающим сайтам. Среди ферментов с множественными заменами выделяются люциферазы, несущие двойную замену Cys62/164Ser: для таких мутантов (двойной мутант и тройной мутант с дополнительной заменой C146S) также наблюдалось увеличение констант Михаэлиса по обоим субстратам, но менее значительное по сравнению с остатком Cys86.
Анализ спектров биолюминесценции показал, что ни введение His-тага, ни единичные и множественные замены остатков цистеина не оказывают влияния на форму спектра биолюминесценции при 25С и рН 7.8 и практически не сдвигают max пика биолюминесценции (5661.7 нм).
-15- Таблица 5. Кинетические параметры реакции, катализируемой исходной люциферазой и её мутантными формами с шестигистидиновой последовательностью на С-конце.
Форма фермента, мМ, мкМ WT-His 31028 61C62S-His 32714 75C62V-His 35121 68C86S-His 49636 103C146S-His 29019 49C164S-His 31630 58C146/62S-His 30714 55C146/86S-His 50138 113C146/164S-His 34627 63C62/164S-His 41632 72C62/146/164S-His 40532 79Термоинактивация WT-His люциферазы светляков L. mingrelica и её мутантных форм была изучена при 37С и 42С при концентрациях фермента 1,610-8-1,610-6 М. В качестве примера на рис.3 показаны кинетические кривые термоинактивации мутанта С62S, которые показывают, что термоинактивация протекает по первому порядку при всех изученных концентрациях фермента, а константы скорости инактивации не зависят от концентрации белка. Аналогичные результаты были получены для всех мутантных форм WT-His люциферазы.
Значения kин приведены в табл. 6.
Среди мутантных форм люциферазы наиболее стабильным как при 37С, так и при 42С является мутант C146S. Остальные единичные мутанты по стабильности близки к WT-His. Мутант C86S оказался наименее стабильным. Анализ трехмерной модели молекулы люциферазы показывает, что остаток Cys86 участвует в образовании петли, фиксируемой с помощью водородной связи SH-группы Cys86 и атома кислорода OE1 в составе Glu88. Известно, что SH-группа остатка цистеина имеет тенденцию к образованию нелинейных водородных связей вследствие того, -16- что деформация валентного угла происходит с относительно малыми затратами энергии. OH-группа остатка серина такой тенденции не имеет, поэтому можно предположить, что в мутанте Cys86Ser водородная связь между остатками Ser86 и Glu88 не образуется, что приводит к увеличению подвижности участка цепи, содержащего указанные остатки, нарушая нативную структуру люциферазы в области активного центра.
Рис.3. Кинетические кривые термоинактивации при 37С мутанта C62S-His при различных концентрациях фермента, М: 1 - 1,610-8, 2 - 1,610-7, 3 - 1,610-6.
Условия: как в табл. 1.
Интересен эффект взаимовлияния остатков Cys62 и Cys164. В то время как единичные замены данных остатков не оказывают существенного влияния на свойства белка, двойная замена приводит как к возрастанию величин Кm по обоим субстратам, так и к уменьшению термостабильности люциферазы. Изучение трехмерной модели люциферазы показывает, что остатки Cys62 и Cys164 входят в состав двух близко расположенных -спиралей. Можно предположить, что введение двойной замены оказывает влияние на их взаимное расположение и взаимодействие, что приводит к изменениям свойств фермента.
Следует отметить, что как и в случае WT люциферазы, наибольший эффект стабилизации наблюдается для мутанта C146S-His. Так, мутация C146S увеличила стабильность WT-His люциферазы в два раза при 37С и в 1,5 раза - при 42C.
-17- Таблица 6. Константы скорости инактивации WT-His люциферазы и её мутантных форм при 37C. Условия: см. табл.1.
kин, мин-1 kин, мин-Замена Замена 37C 42C 37C 42C WT-His 0,0220,003 0,0740,003 C146/62S-His 0,0420,005 0,1080,0C62V-His 0,0240,004 0,1350,004 C146/164S-His 0,0230,006 0,0860,C62S-His 0,0360,004 0,1270,004 C146/86S-His 0,0470,004 0,1200,0C86S-His 0,0400,002 0,1600,006 C62/164S-His 0,0520,003 0,1530,0C146S-His 0,0110,002 0,0580,003 C62/146/164S-His 0,0550,005 0,1420,0C164S-His 0,0180,003 0,1080,03. Направленная конъюгация люциферазы светляков через поверхностные SH-группы остатков цистеина Активные SH-группы поверхностных остатков цистеина люциферазы, удаленные от активного центра, являются удобной мишенью для проведения конъюгации фермента с различными биоспецифичными молекулами с использованием гетеробифункционального сшивающего агента SPDP. Схема конъюгации люциферазы с ВSА приведена на рис. 4.
Рис. 4. Схема проведения конъюгации через гетеробифункциональный сшивающий агент SPDP.
-18- В нашей лаборатории методом направленной эволюции был получен термостабильный мутант 4TS, содержащий С-концевой His-таг и (следующие) замен аминокислотных остатков (S118C, С146S, K156R, R211L, T213S, A217V, E356K, S364C). Наличие замены C146S в этом мутанте свидетельствует о значимости остатка Cys146 для стабильности люциферазы. Мутант 4TS стабилен при повышенных температурах (kin = 0.016 мин-1 при 42С), поэтому он весьма перспективен для использования в биоаналитических методах. Однако, в реакции получения конъюгатов мутант 4TS, несмотря на его высокие биотехнологические характеристики, проявляет гораздо меньшую активность по сравнению с WT люциферазой. Мы предположили, что это связано с отсутствием в мутанте 4TS реакционно-способного остатка C146. Поэтому методом сайт-специфического мутагенеза в мутант 4TS был введен остаток цистеина С146. Полученный мутант (4TS-C) был выделен и очищен методом металло-аффинной хроматографии и использован для конъюгации.
На первой стадии реакции в молекулу BSА вводили активные пиридилдисульфидные группы и после отделения непрореагировавшего SPDP гельфильтрацией на сефадексе G-25 получали конъюгат 4TS-C-BSA взаимодействием пиридил-дисульфидной группы молекулы BSA с SH-группами люциферазы 4TS-C.
Благодаря наличию His-тага в молекуле люциферазы очистку конъюгата от непрореагировавшего BSA осуществляли с помощью металло-хелатной хроматографии на Ni-IDA колонке (1 мл). Элюцию проводили 0,3 М имидазолом.
Были оптимизированы следующие условия протекания реакции: состав буфера, температура, время инкубации, а также соотношение концентраций люциферазы и BSA (изучен диапазон соотношений 4TS-C:BSA от 1:1 до 1:5).
Показано, что при эквимолярном соотношении люциферазы и BSA конъюгация протекает не полностью: примерно 30% исходного фермента остаётся в немодифицированной форме даже при длительном протекании реакции. При использовании 3-5-кратного избытка BSA уже после 2 ч инкубации полоса свободного фермента в реакционной смеси исчезает.
Для дальнейшей работы были выбраны следующие условия проведения конъюгации: соотношение 4TS-C:BSA = 1:3 (обеспечивающее полное протекание реакции), 2,5 ч инкубации при 37С. Как видно из рис. 5, основным продуктом реакции является конъюгат 4TS-C/BSA преимущественно состава 1:1 с молекулярным весом 120 кДа. Можно предположить, что в данных условиях мутант 4TS-C реагирует преимущественно по поверхностному остатку Cys146.
-19- Каталитические свойства люциферазы 4TS-C и её конъюгата с BSA. В табл. 7 приведены каталитические параметры люциферазы 4TS-C и конъюгата 4TS-C-BSA, полученного на её основе. Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что введение остатка C146 в молекулу фермента 4TS и проведение конъюгации полученного фермента с BSA не повлияли на каталитические параметры фермента. Это объясняется локализацией остатка Cys146 на периферической части молекулы, более чем в 30 от активного центра фермента.
Рис. 5. Очистка конъюгата 4TS-C-BSA от не связавшегося BSA на Ni-IDA колонке.
1 - BSA (контроль), 2 - 4TS-C (контроль), 3 - конъюгат 4TS-C-BSA 1:3 до очистки, 4 - конъюгат 4TS-C-BSA 1:3, рабочая фракция, 5 - проскок/промывка.
Таблица 7. Кинетические параметры реакции, катализируемой различными формами термостабильной люциферазы.
Фермент, мМ, мкМ 4TS 796 224TS-C 7015 284TS-C-BSA 758 23-20- Стабильность люциферазы 4TS-C и её конъюгата с BSA при различных температурах (0-45С) изучена при концентрации фермента 1,610-7 М. В качестве сравнения использовали фермент 4TS в той же концентрации.
Полученные данные приведены в табл. 8.
Таблица 8. Константы скорости инактивации для различных форм люциферазы при температурах 0-45С. Условия: см. табл. 1.
Константы скорости инактивации фермента при температуре Фермент 0С 22С 45С kин, ч-1 kин, ч-1 kин, мин-4TS 0,00340,0004 0,0170,002 0,0160,04TS-C 0,00590,0005 0,0240,002 0,0150,04TS-C - BSA 0,00180,0002 0,0090,001 0,0080,0При 45С стабильность мутантной формы 4TS-C совпадает со стабильностью исходного мутанта 4TS. При понижении температуры мутант 4TS имеет более высокую стабильность по сравнению с 4TS-C формой, что, по-видимому, обусловлено процессом окисления остатка Cys146, введённого в состав люциферазы 4TS-C. Таким образом, введение мутации S146C не приводит к дестабилизации фермента при повышенных температурах (45С), когда лимитирующей стадией инактивации является тепловая денатурация фермента, однако снижает стабильность фермента при хранении и при комнатной температуре, когда процесс инактивации включает в себя окислительную инактивацию.
Конъюгация фермента 4TS-C c BSA существенно увеличивает его стабильность при всех рассматриваемых температурах. С одной стороны, при конъюгации с BSA активная SH-группа фермента включена в образование ковалентной связи, что практически снимает эффект окислительной инактивации белка. С другой стороны, известно, что BSA является хорошим стабилизирующим агентом для люциферазы даже в виде растворимой добавки. Поскольку размер молекулы BSA сопоставим с размером молекулы люциферазы, можно предположить, что наличие молекулы BSA в непосредственной близости от молекулы люциферазы экранирует её от воздействия гидрофильной внешней среды -21- и обеспечивает дополнительную стабилизацию конъюгата. Полученные результаты указывают на то, что остаток Cys146 является удобным инструментом для проведения химической модификации молекулы люциферазы и получения активных ковалентных конъюгатов фермента однородного состава.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что основную роль в процессе окислительной инактивации WT люциферазы светляков L. mingrelica играют остатки Cys146 и Cys164, поскольку мутации этих остатков приводят к тому, что уменьшается различие в скоростях инактивации фермента в отсутствие и в присутствии дитиотреитола.
2. Показано, что введение C-концевого His-тага изменяет свойства люциферазы и ее мутантов: уменьшается сродство к субстратам; термоинактивация протекает в одну стадию, в то время как для WT люциферазы и ее мутантов термоинактивация протекает в две стадии. Выдвинута гипотеза о влиянии Hisтага на олигомерное состояние люциферазы.
3. Показано, что из всех изученных мутаций остатков цистеина наибольший эффект стабилизации как для WT люциферазы, так и для люциферазы с Сконцевой шестигистидиновой последовательностью достигается при введении замены C146S. Так, мутация C146S увеличила стабильность WT-His люциферазы в два раза при 37С и в 1,5 раза - при 42C.
4. Обнаружено взаимовлияние мутаций остатков Cys62 и Cys164: введение двойной замены снижает уровень экспресcии и удельную активность люциферазы, ухудшает каталитические параметры и стабильность мутантов.
Данные эффекты не наблюдаются при введении единичных замен по этим остаткам. Выдвинута гипотеза о том, что одновременная замена данных остатков приводит к изменению взаимного расположения -спиралей, в состав которых входят остатки Cys62 и Cys164.
5. Показано, что замена остатка Cys86 в молекуле люциферазы с С-концевой шестигистидиновой последовательностью приводит к резкому падению уровня экспрессии фермента, его удельной активности, ухудшению каталитических параметров и стабильности. Выдвинута гипотеза о том, что замена остатка Cys86 на Ser приводит к исчезновению водородной связи, скрепляющей петлю полипептидной цепи, локализованную вблизи активного центра.
-22- 6. Показано, что конъюгация люциферазы с биоспецифичными белками с участием SH-групп фермента протекает преимущественно за счет сульфгидрильной группы остатка Cys146.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи.
1. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю., Угарова Н.Н. Сайт-направленный мутагенез остатков цистеина в люциферазе светляков Luciola mingrelica. // Биохимия.
2011. Т. 76, вып. 10. С. 1407 - 1415.
2. Ломакина Г.Ю., Модестова Ю.А., Угарова Н.Н. Повышение термостабильности люциферазы светляков Luciola mingrelica сайтнаправленным мутагенезом неконсервативных остатков цистеина 62 и 146. // Вестник МГУ, Сер.2, химия.
2008. Т.49, №2. С. 8186.
Тезисы конференций.
1. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю. Сайтнаправленный мутагенез неконсервативных остатков цистеина люциферазы светляков Luciola mingrelica как способ улучшения биотехнологических характеристик фермента. // Материалы конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития 2007. Часть 2. С. 295.
2. Модестова Ю.А. Мутагенез неконсервативных остатков цистеина люциферазы светляков Luciola mingrelica как способ изменения физико-химических свойств фермента. // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов - 2007, Москва, 11-14 апреля, 2007.
3. Lomakina G.Y., Modestova Y.A., Ugarova N.N. Enhancement of thermostability of Luciola mingrelica firefly luciferase by mutagenesis of nonconservative residues Сys62 and Сys146. // Luminescence. 2008. V. 23. P. 83.
4. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю., Угарова Н.Н. Роль остатков цистеина люциферазы светляков L mingrelica в функционировании фермента. // V Съезд Российского фотобиологического общества. Пущино, 813 июня 2008. Тезисы докладов. С. 205.
5. Lomakina G.Y., Modestova Y.A., Ugarova N.N. Enhancement of thermostability of Luciola mingrelica firefly luciferase by mutagenesis of non-conservative residues Сys62 and Сys146. // In: Bioluminescence And Chemiluminescence. Light Emission:
Biology and Scientific Applications, Eds.: Xun Shen, Xiao-Lin Yang, Xin-Rong Zhang, -23- Zong Jie Cui, L.J. Kricka and Ph.E.Stanley, World Scientific Publ. Co. 2009. P. 4346.
6. Modestova Yu.A., Lomakina G.Yu., Ugarova N.N. Role of solvent-exposed cysteine residues in thermal stability of firefly luciferase L. mingrelica.// Abstracts of International conference Biocatalysis-2009: Fundamentals and Applications. 19-June 2009, Arkhangelsk. P. 78-79.
7. Modestova Y.A., Lomakina G.Y., and Ugarova N.N. Temperature dependence of thermal inactivation of L. mingrelica firefly luciferase and its mutants with C62S, C146S and C164S single point mutations. // Luminescence. 2010. V. 25. P. 184-185.
8. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю., Угарова Н.Н. Роль неконсервативных остатков цистеина в люциферазе светляков Luciola mingrelica. // Материалы 6-ого Международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития. Москва. 2011. Часть 2. С. 279.
9. Модестова Ю.А., Ломакина Г.Ю., Угарова Н.Н. Влияние шестигистидиновой последовательности на свойства люциферазы светляков L. mingrelica, содержащей замены остатков цистеина. // VI Съезд Российского фотобиологического общества. Пос. Шепси, 15-22 сентября 2011 г. Тезисы докладов. С. 123.
10. Modestova Y.A., Lomakina G.Y., Ugarova N.N. The role of non-conservative Cys 62, 86, 146 and 164 residues in the functioning of Luciola mingrelica firefly luciferase. // Luminescence. 2012. V. 27. P. 142-143.