Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА _______________________________________________________________ Химический факультет На правах рукописи
КОЛПАКОВА Татьяна Валерьевна
ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНОЙ ФУНКЦИИ С-КОНЦЕВОГО СЕГМЕНТА РЕКОВЕРИНА
02.00.10 - биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Москва - 2012
Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и в отделе сигнальных систем клетки НИИ физикохимической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова.
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Филиппов Павел Павлович кандидат химических наук Зерний Евгений Юрьевич
Официальные оппоненты: доктор химических наук, член-корр. РАН, профессор Липкин Валерий Михайлович доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Гусев Николай Борисович
Ведущая организация: Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН
Защита диссертации состоится 29 мая 2012 г. в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус УАФ, аудитория 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 27 апреля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Смирнова И.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Ключевые аспекты функционирования нейронов регулируются за счет изменений концентрации внутриклеточного кальция, которые в зависимости от своей интенсивности и продолжительности активируют различные сигнальные каскады, приводящие к конкретным физиологическим эффектам. Разнообразие этих эффектов является результатом действия белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров (НКС), способных распознавать сигналы кальция и преобразовывать их в широкий спектр клеточных ответов. За счет этой способности НКС вовлечены в сигнальные механизмы, обеспечивающие нормальную жизнедеятельность нейронов, начиная от роста и выживаемости, и заканчивая сенсорной функцией, нейротрансмиссией и всеми этапами синаптической пластичности. Более того, нарушение экспрессии и(или) функционирования НКС приводит к активации патогенетических сигнальных механизмов, ассоциированных с целым рядом заболеваний центральной нервной системы.
Примером сигнального каскада с участием НКС является передача зрительного сигнала в фоторецепторной клетке (фототрансдукция). Центральным элементом Са2+-зависимой регуляции фототрансдукции является НКС рековерин, функция которого заключается в придании процессу десенситизации зрительного рецептора родопсина чувствительности к ионам кальция. При высокой концентрации кальция, характерной для темнового состояния фоторецепторной клетки, рековерин ингибирует фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой. В ответ на световой стимул происходит снижение концентрации кальция в цитоплазме фоторецепторной клетки, рековерин теряет способность ингибировать родопсинкиназу, в результате чего происходит фосфорилирование родопсина, инициирующее быстрое выключение фотовозбужденного рецептора.
Белки семейства НКС, включая рековерин, обладают высокой степенью структурного сходства. Гомология распространяется на структуру их Са2+-связывающих центров, а также гидрофобного кармана, который, как считается, образует основной и единственный структурный мотив, отвечающий за связывание НКС с их мишенями. Этим наблюдениям противоречит тот факт, что каждый НКС способен реагировать на изменение концентрации внутриклеточного кальция в своем узком диапазоне и в ответ на это с высокой специфичностью распознавать и эффективно модулировать активность разных сигнальных партнеров. Несмотря на интенсивные исследования НКС, проводимые в последнее время, взаимосвязь между структурной организацией этих белков и специфичностью их регуляторной активности до сих пор остается неустановленной. Кроме того, постоянное обнаружение новых мишеней для НКС усложняет решение этой проблемы. В связи с этим актуальной задачей является поиск регуляторных элементов в структуре НКС, которые могли бы обеспечивать уникальность функциональных свойств каждого из этих белков. Мы предположили, что одним из таких элементов может быть С-концевой сегмент - последовательность, которая среди НКС отличается вариабельностью структуры всех уровней. В настоящей работе исследована роль Сконцевого сегмента в обеспечении эффективности и специфичности Са2+-зависимого функционирования НКС рековерина.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование регуляторной функции Сконцевого сегмента рековерина. В процессе выполнения работы решались следующие задачи.
1. Изучение роли С-концевого сегмента в поддержании целостности структуры рековерина.
2. Изучение роли С-концевого сегмента в регуляции Са2+-зависимых свойств рековерина.
3. Изучение роли С-концевого сегмента в способности рековерина узнавать и ингибировать родопсинкиназу.
4. Установление аминокислотных остатков С-концевого сегмента, принимающих участие в Са2+-зависимой регуляторной активности рековерина.
Научная новизна. В настоящей работе впервые показана роль С-концевого сегмента как элемента структуры, обеспечивающего регуляцию функционирования рековерина. Впервые обнаружено, что C-концевой сегмент принимает участие в настройке чувствительности рековерина к ионам кальция и, как следствие, вовлечен в регуляцию Са2+-зависимых свойств белка. Исследована структурная организация С-концевого сегмента рековерина. Впервые сформулирован молекулярный механизм, в соответствии с которым обеспечивается специфичность регуляторной активности рековерина в отношении его внутриклеточной мишени родопсинкиназы. Установлены аминокислотные остатки С-концевого сегмента рековерина, принимающие участие в образовании комплекса с родопсинкиназой. Выявленные контакты стабилизируют взаимодействие родопсинкиназы с гидрофобным карманом рековерина и тем самым обеспечивают эффективность ингибирования фермента.
Практическая значимость. Рековерин локализуется в фоторецепторных клетках сетчатки глаза, где выполняет важнейшую функцию, модулируя активность родопсинкиназы и тем самым обеспечивая Са2+-зависимую регуляцию процесса фототрансдукции. Нарушение этого процесса приводит к возникновению целого ряда офтальмологических патологий. Помимо рековерина в фоторецепторных клетках присутствуют еще несколько белков НКС, каждый из которых модулирует активность строго определенных сигнальных партнеров. Отсюда выяснение структурных основ, обеспечивающих специфичность Са2+-зависимого функционирования различных НКС в фоторецепторных клетках, в частности, селективность узнавания ими своих мишеней, является необходимым условием для понимания молекулярных механизмов зрения в норме и при развитии офтальмологических заболеваний.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на семинаре отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ, на 14-й международной Пущинской школеконференции молодых ученых УБиология - наука XXI векаФ (Пущино, 2010), на международном молодежном научном форуме УЛомоносов-2010Ф (Москва, 2010), на XI симпозиуме европейского кальциевого сообщества (Варшава, 2010) и на V российском симпозиуме УБелки и пептидыФ (Петрозаводск, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы.
Библиографический указатель включает 195 цитированных работ.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Рековерин (201 аминокислотный остаток) - нейрональный кальциевый сенсор, высокоспецифичный для фоторецепторных клеток сетчатки глаза. По своей структуре рековерин состоит из N- и C-концевого доменов, каждый из которых содержит по два потенциальных Са2+-связывающих центра типа EF-hand (УEF1-4Ф). Среди Са2+-связывающих центров в рековерине только EF2 и EF3 являются функциональными, в то время как EF1 и EFлишены способности связывать катион из-за замены нескольких ключевых аминокислотных остатков в Са2+-связывающей петле. N-концевой глицин в рековерине ацилирован остатком миристиновой кислоты, причем в бескальциевой форме рековерина миристоильная группа погружена в гидрофобный карман внутри белковой глобулы. Присутствие миристоильной группы в молекуле рековерина обеспечивает междоменную кооперативность по связыванию ионов кальция с белком. Так, связывание кальция с высокоаффинным центром EF3 приводит к частичному экспонированию миристоильной группы и, как следствие, облегчает связывание катиона в низкоафинный центр EF2. Последнее, в свою очередь, запускает механизм Са2+миристоильного переключателя рековерина, который заключается в полном экспонировании миристоильной группы, а также аминокислотных остатков гидрофобного кармана белка.
Находясь вне белковой глобулы, миристоильная группа приобретает способность встраиваться в фоторецепторную мембрану, за счет чего происходит закрепление рековерина на поверхности фосфолипидного бислоя. Такая мембранная локализация рековерина имеет существенное значение для его функционирования, поскольку обеспечивает пространственное сближение белка с его мишенью родопсинкиназой. Экспонированные аминокислотные остатки гидрофобного кармана рековерина, в свою очередь, образуют протяженный участок на поверхности молекулы белка, с которым взаимодействует амфипатическая -спираль Nконцевого 15-звенного ответного участка родопсинкиназы.
Рековерин обладает высокой степенью структурного сходства с другими НКС. В частности, гомология распространяется на структуру Са2+-связывающих центров, а также гидрофобного кармана этих белков (рис. 1). Считается, что неполярные аминокислотные остатки гидрофобного кармана образуют основной и единственный сайт для связывания ответных участков мишеней НКС. Этим наблюдениям противоречит тот факт, что рековерин, как и любой другой НКС, чувствителен к изменению концентрации Са2+ в своем узком диапазоне, а также обладает селективностью регуляторной активности в отношении свойственной ему мишени (родопсинкиназы). В связи с этим возникает необходимость выявления элементов структуры в молекуле рековерина, за счет которых могла бы обеспечиваться специфичность его Са2+-зависимой регуляторной активности. Для поиска регуляторных элементов в молекуле рековерина мы провели выравнивание его первичной структуры со структурами других НКС (рис. 1), а также проанализировали имеющиеся в литературе данные о пространственной организации этих белков. Основное внимание уделялось тем последовательностям рековерина, которые отличаются вариабельностью Рис. 1. Выравнивание первичных структур рековерина и других НКС. Жирным шрифтом отмечены консервативные аминокислотные остатки гидрофобного кармана НКС; подчеркнуты те из них, которые вовлечены во взаимодействие НКС с соответствующей мишенью. Вверху схематично показаны элементы вторичной структуры рековерина.
структуры среди НКС. Оказалось, что в С-концевом домене рековерина после четвертого Са2+связывающего центра содержится последовательность, которая внутри семейства различается длиной, а также характеризуется вариабельностью всех уровней структуры. Для удобства обозначения этой последовательности нами был введен термин УС-концевой сегментФ.
Отличительной особенностью С-концевого сегмента рековерина (включает 23 аминокислотных остатка) является тот факт, что он содержит кластер из шести остатков лизина и по своей вторичной структуре образует дополнительную 11-ую -спираль K. Мы предположили, что именно С-концевой сегмент может выступать в роли элемента структуры рековерина, обеспечивающего специфичность его Са2+-зависимой регуляторной активности. Для проверки этого предположения был получен ряд делеционных, химерных и точечных С-концевых мутантных форм рековерина. С их помощью была исследована роль С-концевого сегмента в поддержании целостности структуры рековерина, а также в способности этого белка связывать ионы кальция, выполнять функцию Са2+-миристоильного переключателя, взаимодействовать с родопсинкиназой и модулировать ее активность.
1. Роль С-концевого сегмента в поддержании целостности структуры рековерина.
Для первичного скрининга участков С-концевого сегмента рековерина, потенциально вовлеченных в функционирование белка, методом сайт-направленного мутагенеза было получено несколько делеционных мутантных форм рековерина с удаленными С-концевыми фрагментами различной длины (рис. 2). При планировании делеционных мутантов принималась во внимание вторичная структура удаляемого участка С-концевого сегмента рековерина (рис.
2). Так, были сконструированы мутанты с удаленными шестью (удален участок, предшествующий -спирали K, мутант Rc2-196), десятью (мутант Rc2-192), двенадцатью (полностью удалена -спираль K, мутант Rc2-190), четырнадцатью (мутант Rc2-188), пятнадцатью (мутант Rc2-187), шестнадцатью (полностью удален участок, предшествующий -спирали J, мутант Rc2-186) и восемнадцатью (мутант Rc2-184) аминокислотными остатками С-концевой последовательности. Все формы рековерина содержали N-концевую миристоильную группу, что достигалось за счет гетерогенного ацилирования белка остатком миристиновой кислоты под действием N-миристоилтрансферазы. Перед проведением функциональных тестов необходимо было оценить насколько удаление или замена различных участков С-концевого сегмента повлияет на целостность структуры рековерина. С этой целью мы определили термостабильность полученных мутантов, регистрируя температурную зависимость положения максимума собственной флуоресценции триптофанов рековерина в присутствии (1 мМ СaCl2) и в отсутствие (1 мМ ЭГТА) ионов кальция. Оказалось, что вне зависимости от присутствия катиона профили тепловой денатурации мутантов Rc2-196, Rc2-192, Rc2-190 и Rc2-188 остаются Рис. 2. Мутанты рековерина с удаленными участками С-концевого сегмента различной длины.
(А) Первичная структура С-концевого сегмента рековерина дикого типа (RcWT) и его мутантов. Вверху схематично показаны элементы вторичной структуры рековерина; знаком отмечены положения, после которых проводилось удаление участков С-концевого сегмента. (Б) Электрофореграмма очищенных препаратов делеционных мутантных форм рековерина в 12%-ном полиакридамидном геле в денатурирующих условиях.
Рис. 3. Термостабильность С-концевых делеционных мутантов рековерина. (А-В) Температурные зависимости положения максимумов длины волны эмиссии собственной флуоресценции рековерина дикого типа (RcWT) и его мутантных форм Rc2-196, Rc2-192, Rc2-190 и Rc2-188 (А), Rc2-187 (Б), Rс2-186 (В).
Измерения проводили в присутствии (1 мМ СаСl2) или в отсутствие (1 мМ ЭГТА) ионов кальция. (Г) Зависимости значения температуры полуперехода Са2+-связанных и бескальциевых форм рековерина дикого типа и его С-концевых делеционных мутантов от количества аминокислотных остатков в молекуле белка.
практически неизменными по сравнению с рековерином дикого типа (рис. 3А). Для этих форм белка различия в положениях максимумов длины волны эмиссии собственной флуоресценции при низких температурах составляют не более 2 нм, а разница в температуре плавления не превышает 2 оС (рис. 3Г). Полученные данные позволяют говорить об отсутствии выраженных нарушений в структуре мутантов рековерина, содержащих 187 и более аминокислотных остатков. В то же время, дальнейшее укорочение С-концевого сегмента рековерина приводит к понижению термостабильности белка, а также к изменению его спектральных характеристик (рис. 3, Б-Г). Так, в случае мутанта Rc2-187 температура фазового перехода снижается на 4-7, а в случае мутантов Rc2-186 и Rc2-184 - уже на 7-9 и 22 градуса, соответственно. Более того, спектр флуоресценции апо-форм этих мутантов уже при низких температурах смещается в длинноволновую область более чем на 6 нм, что свидетельствует об изменении положения остатков триптофана в молекуле рековерина. Обобщая полученные данные, можно говорить о наличии выраженных структурных нарушений в случае мутантов Rc2-187, Rc2-186 и Rc2-184, вследствие чего они были исключены нами из дальнейших функциональных исследований.
2. Роль С-концевого сегмента в регуляции Са2+-зависимых свойств рековерина.
Для делеционных мутантов рековерина, сохранивших целостность структуры, мы определили Са2+-связывающие свойства методом прямого связывания радиоактивного изотопа Са2+. Были получены зависимости стехиометрии связывания ионов кальция рековерином от концентрации свободного катиона ([Са2+]своб.) в диапазоне 0,01-300 мкМ (рис. 4А). Полученные зависимости аппроксимировались уравнением Хилла с 4-мя параметрами, на основании чего рассчитывались эффективные константы диссоциации (KD) соответствующих комплексов (табл. 1). В то время как Са2+-связывающие свойства мутанта Rc2-196 (КD = 19,7 мкМ) остаются аналогичными рековерину дикого типа (КD = 19,2 мкМ), взаимодействие мутанта Rc2-190 с катионом характеризуется практически двукратным возрастанием значения соответствующей KD (36,8 мкМ). При этом дальнейшее укорочение C-концевого сегмента (мутант Rc2-188) не вызывает 1усиления эффекта. Таким образом, удаление участка QKVKEK196 С-концевого сегмента рековерина приводит к существенному снижению чувствительности рековерина к ионам кальция.
Поскольку одним из ключевых функциональных свойств рековерина, ассоциированных со связыванием кальция, является его способность взаимодействовать с фоторецепторными мембранами за счет работы Са2+-миристоильного переключателя, далее было изучено влияние удаления участков С-концевого сегмента на эту способность белка. С применением метода равновесного ультрацентрифугирования было найдено, что все исследуемые мутанты рековерина Рис. 4. Са2+-связывающие свойства С-концевых делеционных мутантов рековерина. (А) Связывание Са2+ с рековерином дикого типа и его С-концевыми делеционными мутантами. (Б) Связывание рековерина дикого типа и его С-концевых делеционных мутантов с фоторецепторными мембранами при различных значениях [Са2+]своб.. За 100% принято общее количество рековерина в пробе.
Таблица 1. Са2+-связывающие свойства С-концевых делеционных мутантов рековерина.
RcWT Rc2-196 Rc2-192 Rc2-190 Rc2-1Связывание 45Са2+ KD, мкМ 19,2 0,2 9,7 0,6 26,2 0,1 36,8 3,5 41,9 3,n 1,78 1,73 1,90 1,55 1,Связывание с фоторецепторными мембранами ЕC50 [Ca2+]своб., мкМ 3,5 0,2 3,3 0,2 4,1 0,3 5,9 0,6 5,3 0,n 2,0 2,2 1,75 1,27 0,KD - эффективная константа диссоциации; ЕC50 [Ca2+]своб. - концентрация свободного кальция, необходимая для полумаксимального связывания рековерина с фоторецепторными мембранами.
Значения KD и ЕC50 [Ca2+]своб. рассчитаны методом нелинейной регрессии экспериментальных данных уравнением Хилла; n - коэффициент Хилла.
сохраняют способность взаимодействовать с фоторецепторными мембранами, однако профили Са2+-зависимости этих взаимодействий существенно различаются (рис. 4Б). Если в случае Rc2-1концентрация свободного кальция, необходимая для его полумаксимального связывания с мембранами (EC50 [Ca2+]своб. = 3,3 мкМ), остается практически неизменной по сравнению с рековерином дикого типа (EC50 [Ca2+]своб. = 3,5 мкМ), то в случае Rc2-190 эта величина (5,9 мкМ) почти в 2 раза превышает соответствующее значение для RcWT (табл. 1). Таким образом, аминокислотные остатки последовательности 191QKVKEK196 С-концевого сегмента принимают участие в настройке чувствительности рековерина к ионам кальция, и, как следствие, в регуляции функционирования Са2+/миристоильного переключателя белка.
3. Роль С-концевого сегмента во взаимодействии рековерина с родопсинкиназой.
Как уже отмечалось, рековерин действует как Са2+-сенсор родопсинкиназы, связывая и ингибируя ее при относительно высоких концентрациях кальция. Для ответа на вопрос, принимает ли С-концевой сегмент рековерина непосредственное участие в образовании комплекса с родопсинкиназой, была изучена способность делеционных мутантов взаимодействовать с рекомбинантным фрагментом фермента, соответствующим его Nконцевому домену. Выбор этого фрагмента был продиктован тем, что он содержит 15-звенный участок, который отвечает за связывание с рековерином [Higgins et al., 2006]. Исследование проводили методом аффинного соосаждения мутантов рековерина с иммобилизованным на глутатионсефарозе химерным белком, состоящим из N-концевого домена родопсинкиназы и глутатион-S-трансферазы (GST-N-RK) (рис. 5А). В качестве контроля проводили эксперименты по соосаждению мутантов рековерина с GST дикого типа (данные не показаны). Оказалось, что все мутантные формы рековерина образуют комплекс с GST-N-RK в присутствии насыщающей концентрации кальция, однако поэтапное удаление участков С-концевого сегмента рековерина приводит к постепенному снижению сродства рековерина к родопсинкиназе (рис. 5Б).
Количественные характеристики этого эффекта были получены с помощью биосенсорного подхода - спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (Surface Plasmon Resonance, SPR). Было изучено взаимодействие между GST-N-RK, иммобилизованным на поверхности сенсорного чипа, и различными мутантами рековерина, подаваемыми в Рис. 5. Связывание С-концевых делеционных мутантов рековерина с N-концевым доменом родопсинкиназы (GST-N-RK). (А) Иммуноблот комплексов рековерина дикого типа или его Сконцевых делеционных мутантов с GST-N-RK, полученных методом аффинного соосаждения в присутствии (1 мМ СаСl2) или в отсутствие (1 мМ ЭГТА) ионов кальция. (Б) Диаграмма связывания рековерина дикого типа и его делеционных мутантов с GST-N-RK по результатам трех независимых экспериментов. За 100 % принят уровень связывания рековерина дикого типа. (В) SPR-сенсограммы, отражающие взаимодействие рековерина дикого типа или его С-концевых делеционных мутантов с иммобилизованным GST-N-RK. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе присутствует рековерин. (Г) Зависимости величины равновесного SPRсигнала от концентрации рековерина дикого типа или его С-концевых делеционных мутантов. Слева приведены значения KD комплексов различных форм рековерина и GST-N-RK, рассчитанные с помощью аппроксимации экспериментальных данных уравнением Ленгмюра.
подвижной фазе в присутствии (2 мМ Са2+) или в отсутствие (2 мМ ЭГТА) кальция. Для учёта неспецифического взаимодействия мутантов со всеми компонентами поверхности чипа параллельно проводились измерения их связывания с иммобилизованной GST дикого типа.
Итоговые сенсограммы, отражающие взаимодействие рековерина дикого типа или его делеционных мутантов с N-RK, были получены путем вычитания сигнала связывания этих белков с контрольной поверхностью, содержащей GST, из сигнала их связывания с опытной поверхностью, содержащей GST-N-RK (рис. 5В). Из зависимостей величины SPR-cигнала в равновесном (стационарном) состоянии от концентрации рековерина или его мутанта, варьируемой в диапазоне от 0,1 до 220 мкМ, были определены константы диссоциации соответствующих комплексов (рис. 5Г). Как видно, значение KD комплекса рековеринGST-NRK возрастает по мере удаления участков С-концевой последовательности рековерина, достигая в случае наиболее короткого из мутантов Rc2-188 величины 78 мкМ. Это значение почти в 8 раз превышает соответствующую величину, полученную для рековерина дикого типа (10 мкМ). Таким образом, по данным методов аффинного соосаждения и SPR-спектроскопии нами установлено, что С-концевой сегмент рековерина вовлечен в образование комплекса этого белка с его мишенью родопсинкиназой.
4. Роль С-концевого сегмента рековерина в ингибировании активности родопсинкиназы.
Очевидно, что если связывание делеционных мутантов рековерина с N-концевым доменом родопсинкиназы отражает их взаимодействие с полноразмерным ферментом, то удаление участков С-концевого сегмента, приводящее к снижению сродства рековерина к ответному участку родопсинкиназы, должно сказаться на регуляторной активности рековерина как Са2+-зависимого ингибитора этого фермента. Для того чтобы оценить, насколько изменится ингибирующая эффективность рековерина при удалении участков его С-концевого сегмента, была измерена активность родопсинкиназы в присутствии мутантных форм рековерина в Рис. 6. Ингибирование активности родопсинкиназы под действием С-концевых делеционных мутантов рековерина. (А) Относительная активность родопсинкиназы в присутствии рековерина дикого типа или его делеционных мутантнов. За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина. (Б) Зависимости относительного ингибирования родопсинкиназы от концентрации рековерина дикого типа или его мутанта Rc2-188. За 100% принято полное ингибирование (отсутствие активности) родопсинкиназы. Значения концентрации рековерина, необходимой для полумаксимального ингибирования, (IC50), рассчитывались с помощью аппроксимации экспериментальных данных уравнением Ленгмюра. Все эксперименты проводились при насыщающей концентрации кальция.
реконструированной системе, состоящей из отмытых мочевиной темновых фоторецепторных мембран, содержащих родопсин, и очищенного препарата фермента. Эксперименты проводили при насыщающих концентрациях кальция (1,26 мМ Ca2+) или в присутствии его хелатора (1 мМ ЭГТА). Согласно полученным данным эффективность Са2+-зависимого ингибирования родопсинкиназы под действием рековерина снижается вслед за уменьшением длины его Сконцевого сегмента (рис. 6А). Например, в случае мутанта Rc2-188 полумаксимальное ингибирование наблюдается при десятикратном увеличении концентрации белка (IC50 = мкМ) по сравнению с рековерином дикого типа (IC50 = 8 мкМ) (рис. 6Б). Этот результат полностью согласуется с соответствующим эффектом по связыванию исследуемых мутантов рековерина с N-концевым доменом родопсинкиназы.
Снижение способности С-концевых делеционных мутантов рековерина связывать и ингибировать родопсинкиназу может возникать вследствие различных причин. Наиболее вероятно, что оно вызвано отсутствием в структуре мутантов рековерина аминокислотных остатков С-концевого сегмента, которые принимают непосредственное участие во взаимодействии с родопсинкиназой, оказывая стабилизирующий эффект на связывание фермента с гидрофобным карманом рековерина. В то же время, нельзя исключить, что отсутствие С-концевого сегмента может приводить к нарушению способности рековерина в ответ на связывание кальция претерпевать конформационные перестройки, приводящие к экспонированию гидрофобного кармана. В последнем случае введение делеционных мутаций в С-концевой сегмент рековерина должно вызывать потерю способности белка Са2+-зависимым образом взаимодействовать с различными неспецифическими гидрофобными носителями, такими как фенилсефароза. Однако связывание С-концевых мутантов рековерина с фенилсефарозой происходит на уровне рековерина дикого типа, вне зависимости от добавления катиона (рис. 7). Таким образом, аминокислотные остатки С-концевого сегмента рековерина (те из них, которые с учетом первичной структуры мутантов расположены после остатка пролина190) непосредственно контактируют с ответным участком родопсинкиназы. Этот результат вызывает особый интерес, поскольку до настоящего времени считалось, что образование комплекса между рековерином и родопсинкиназой происходит исключительно с участием консервативных неполярных аминокислотных остатков из N-концевого домена рековерина, входящих в состав его гидрофобного кармана. По-видимому, именно установление дополнительных контактов с участием С-концевого сегмента Рис. 7. Связывание С-концевых делеционных является необходимым условием для мутантов рековерина с фенилсефарозой. За 100% принято общее количество рековерина в пробе. эффективного ингибирования фермента под Рис. 8. Химерный белок рековерина и GCAP2 (УRGФ). (А) Первичная структура С-концевого сегмента рековерина, GCAP2 и химерного белка RG. (Б) Электрофореграмма очищенных препаратов рековерина, GCAP2 и химерного белка RG в присутствии (1 мМ СаCl2) и в отсутствие ионов кальция (1мМ ЭГТА).
действием рековерина.
Поскольку аминокислотная последовательность С-концевого сегмента рековерина существенно отличается от соответствующих последовательностей в других НКС, можно предположить, что структура этого регуляторного элемента настроена таким образом, чтобы обеспечивать не только эффективность, но и специфичность ингибиторной активности рековерина в отношении родопсинкиназы. В этом случае замена С-концевого сегмента в рековерине на соответствующую последовательность из любого другого НКС должна негативно повлиять на регуляторную активность рековерина. Для проверки этого предположения мы сконструировали химерный белок RcG2-A178-GCAP2D177-F204 (УRGФ), представляющий собой рековерин, в котором удаленный С-концевой сегмент восстановлен с помощью введения аналогичной последовательности из другого фоторецепторного НКС - белка активатора гуанилатциклазы 2 (guanylate cyclase-activating protein 2, GCAP2) (рис. 8).
Проведенная замена С-концевого сегмента в рековерине не оказывает существенного влияния на целостность структуры белка.
Положение максимума собственной флуоресценции RG по сравнению с рековерином дикого типа несколько смещается в длинноволновую область, однако это смещение в равной степени наблюдается в широком диапазоне температур и обусловлено введением в структуру рековерина двух дополнительных остатков триптофана из С-концевого сегмента GCAP2, не меняющих своего положения в процессе Рис. 9. Ингибирование активности родопсинтепловой денатурации белка. При этом киназы под действием RG. Относительная активность родопсинкиназы в присутствии температура плавления рековерина после рековерина дикого типа, GCAP2 дикого типа или введения С-концевого сегмента GCAPхимерного белка RG. За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина. остается неизменной (данные не показаны). В то же время RG оказывается существенно менее эффективным ингибитором родопсинкиназы, по сравнению с рековерином дикого типа (рис. 9). Таким образом, ингибиторная способность рековерина подавляется не только при удалении С-концевого сегмента, но и в результате его замены на аналогичный участок из другого НКС. Суммируя полученные результаты, можно заключить, что С-концевой сегмент является встроенным регуляторным элементом в молекуле рековерина, который обеспечивает эффективность и специфичность функционирования белка.
5. Поиск аминокислотных остатков С-концевого сегмента рековерина, вовлеченных в образование комплекса с родопсинкиназой.
Обнаруженная регуляторная роль С-концевого сегмента рековерина, по всей видимости, осуществляется за счет установления прямых контактов между аминокислотными остатками, входящими в его состав, и остатками ответного участка родопсинкиназы. Однако для того, чтобы утверждать это, прежде всего, необходимо ответить на вопрос о реализуемости таких межмолекулярных контактов с учетом структурной организации исследуемых белков. Данные о пространственной организации комплекса Са2+-связанной формы рековерина и N-концевого 16-звенного участка родопсинкиназы (RK-N1-16), полученные с помощью метода ЯМРспектроскопии (PDB 2I94), не содержат ответа на этот вопрос, поскольку структура Сконцевого сегмента рековерина в составе такого комплекса является неразрешенной. Чтобы восполнить этот пробел было проведено молекулярное моделирование структуры комплекса полноразмерного рековерина (включающего С-концевой сегмент) и ответного участка родопсинкиназы. Создание модели проводили на основе ЯМР-структуры комплекса рековерина и RK-N1-16 (PDB 2I94). В молекулу рековерина был встроен С-концевой сегмент из кристаллической структуры белка дикого типа (PDB 1OMR) с помощью суперпозиции участков 1EEILRLIQ187, после чего проводилась процедура пошаговой минимизации энергии полученного комплекса по алгоритму наискорейшего спуска с величиной шага 0,001 ккал/моль.
В полученной модели (рис. 10А) амфипатическая -спираль N-концевого 16-звенного участка родопсинкиназы погружена в экспонированный гидрофобный карман рековерина таким образом, что ее первые аминокислотные остатки, в частности, фенилаланин-3, находятся в непосредственной близости от С-концевого сегмента рековерина, а значит, действительно могут образовывать контакты с этим структурным элементом белка. С использованием полученной модели был проанализирован энергетический вклад различных участков С- концевого сегмента в стабилизацию комплекса рековеринRK-N1-16. Для этого была проведена молекулярная стыковка (докинг) пептида RK-N1-16 и С-концевых делеционных мутантов рековерина Rc2-196, Rc2-192, Rc2-190 и Rc2-188, полученных in silico путем простого удаления соответствующих участков в молекуле рековерина. Стыковку проводили из различных исходных положений пептида родопсинкиназы, используя допущение, что образование комплекса происходит без конформационных изменений в обоих белках. В каждом случае было А Б Рис. 10. Молекулярное моделирование комплексов рековерина дикого типа или его делеционных мутантнов с N-концевым 16-звенным пептидом родопсинкиназы. (А) Пространственная структура комплекса полноразмерного рековерина дикого типа, включая С-концевой сегмент, с 16-звенным пептидом родопсинкиназы. (Б) Сопоставление значений оценочного индекса докинга различных форм рековерина с 16-звенным пептидом родопсинкиназы и экспериментальных значений KD соответствующих комплексов, рассчитанных по данным SPR-спектроскопии.
Таблица 2. Параметры молекулярного докинга С-концевых делеционных мутантов рековерина и N-концевого пептида родопсинкиназы.
Мутант Количество Ранжирование решений Средние значения оценочных рековерина решений* по энергии* индексов докинга** WT 648 (5,4%) 1; 1; 1 37,68 0,Rc 2-1594 (5,0%) 1; 1; 1 37,25 0,Rc 2-1596 (5,0%) 1; 1; 1 35,92 0,Rc 2-1617 (5,1%) 3; 7; 3 34,71 0,Rc 2-1406 (3,4%) 44; 64; 94 33,67 0,Rc *Данные относятся к выборке решений Уподобных исходной структуреФ (см. объяснения в тексте).
** Приведены средние значения оценочного индекса докинга, рассчитанные для решений Уподобных исходной структуреФ по результатам трех серий моделирования.
получено три набора решений (координат атомов), которые характеризуются значениями оценочного индекса докинга, описывающими энергетическую выгодность образования соответствующего комплекса. По результатам анализа полученных данных оказалось, что выгодность образования комплекса с RK-N1-16 в случае мутантов Rc2-196 и Rc2-192 остается примерно на уровне рековерина дикого типа, однако в случае мутантов Rc2-190 и Rc2-188 она существенно понижается (табл. 2). Во-первых, для мутантов Rc2-190 и Rc2-188 снижается доля решений Уподобных исходной структуреФ, т.е. тех, в которых среднее квадратичное отклонение положения -атомов углерода по сравнению с исходной моделью не превышает 1 . Во-вторых, в случае этих мутантов решения, оптимальные по координатам атомов (т.е. Уподобные исходной структуреФ), не являются наиболее энергетически выгодными. В-третьих, для каждого из этих мутантов понижается среднее значение оценочного индекса докинга - величины, линейно связанной с изменением свободной энергии Гиббса (G) соответствующего белкового комплекса. На основании проведенных расчетов можно заключить, что аминокислотные остатки рековерина, важные для образования комплекса с RKN1-16, отсутствуют в мутантах Rc2-190 и Rc2-188, оставаясь не затронутыми в мутантах Rc2-196 и Rc2-192, т.е. локализуются внутри последовательности 189EPQK192 С-концевого сегмента белка.
Отметим, что по результатам проведенных расчетов для всех исследуемых комплексов наблюдается линейная корреляция (R2 = 0,87) между значениями среднего оценочного индекса докинга и величинами lnKD, рассчитанными по данным SPR-спектроскопии (рис. 10Б). Такая корреляция теоретических и экспериментальных данных подтверждает результаты молекулярного докинга и, как следствие, достоверность исходной модели.
6. Роль аминокислотных остатков С-концевого сегмента в регуляторной активности рековерина.
Для окончательной локализации контактов между С-концевым сегментом рековерина и родопсинкиназой методом сайт направленного мутагенеза были сконструированы точечные мутанты обоих белков, содержащих замены аминокислотных остатков внутри предсказанной с помощью молекулярного моделирования области взаимодействия (рис. 11). Были получены Рис. 11. Точечные мутанты С-концевого сегмента рековерина и N-концевого домена родопсинкиназы. Схематическое изображение точечных мутантов С-концевого сегмента рековерина RcP190G, RcQ191A, RcK192A и RcV193G (А), а также мутанта N-концевого домена родопсинкиназы N-RKF3A, в виде химерного белка с GST (GST-N-RKF3A) (Б). Электрофореграммы очищенных препаратов RcP190G, RcQ191A, RcK192A и RcV193G (В) и GST-N-RKF3A (Г).
мутанты рековерина RcP190G, RcQ191A, RcK192A и RcV193G, а также мутант GST-N-RKF3A, который представляет собой химерный белок глутатион-S-трансферазы и N-концевого домена родопсинкиназы, содержащего замену F3A. Ключевые структурные и функциональные свойства точечных мутантов рековерина были проанализированы с применением того же набора подходов, что и в случае делеционных мутантов рековерина (разделы 1-4). Оказалось, что введение указанных точечных мутаций не оказывает влияния на такие характеристики белка, как термостабильность, способность связывать ионы Са2+, а также способность выполнять функцию Са2+-миристоильного переключателя (данные не приведены). В то же время большинство точечных мутантов рековерина, за исключением RcQ191A, демонстрируют более низкое сродство к GST-N-RK (рис. 12) и более низкую ингибиторную эффективность в отношении полноразмерной родопсинкиназы (рис. 13). При этом эффекты являются наиболее выраженными в случае мутанта RcK192A, для которого константа диссоциации комплекса с GSTN-RK (34,1 мкМ) повышается более чем в три раза, а концентрация, необходимая для полумаксимального ингибирования родопсинкиназы (58 мкМ) - более чем в 7 раз по сравнению с соответствующими значениями, полученными для рековерина дикого типа. Эти результаты однозначно указывают на ключевую роль остатка лизина-192 рековерина во взаимодействии этого белка с родопсинкиназой. Более того, замена остатка фенилаланина-3 в ответном участке родопсинкиназы (мутант GST-N-RKF3A) также приводит к существенному повышению константы диссоциации аналогичного комплекса с рековерином дикого типа. Значение KD (65,мкМ) в этом случае оказывается сравнимым со значением, зафиксированным для наиболее короткого из делеционных мутантов (Rc2-188), в котором функциональная Рис. 12. Связывание С-концевых точечных мутантов рековерина с N-концевым доменом родопсинкиназы (GST-N-RK). (А) Иммуноблот комплексов рековерина дикого типа или его Сконцевых точечных мутантов с GST-N-RK, полученных методом аффинного соосаждения в присутствии (1 мМ СаСl2) или в отсутствие (1 мМ ЭГТА) ионов кальция. (Б) Зависимости величины равновесного SPR-сигнала от концентрации рековерина дикого типа или его С-концевых точечных мутантов. Слева приведены значения равновесных констант диссоциации (KD) комплексов различных форм рековерина и GST-N-RK, рассчитанные с помощью аппроксимации экспериментальных данных уравнением Ленгмюра.
Рис. 13. Ингибирование активности родопсинкиназы под действием C-концевых точечных мутантов рековерина. (А) Относительная активность родопсинкиназы в присутствии рековерина дикого типа или его С-концевых точечных мутантнов. За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина. (Б) Зависимости относительного ингибирования родопсинкиназы от концентрации рековерина дикого типа или его мутанта RcK192A. За 100% принято полное ингибирование (отсутствие активности) родопсинкиназы. Значения концентрации рековерина, необходимой для полумаксимального ингибирования (IC50), рассчитывались с помощью аппроксимации экспериментальных данных уравнением Ленгмюра. Все эксперименты проводились при насыщающей концентрации кальция.
зона C-концевого сегмента вообще полностью удалена. Полученные данные свидетельствуют о том, что остатки лизина192 в рековерине и фенилаланина-3 в родопсинкиназе играют ключевую роль в образовании стабильного комплекса между этими белками, в составе которого обеспечивается высокая эффективность ингибирования фермента. Этот результат согласуется с проведенным нами структурным анализом. В модели комплекса рековеринRK-N1-16 (рис. 12) положительно заряженный остаток лизина192 может образовывать достаточно прочное катион- взаимодействие с ароматической системой остатка Рис. 12. Пространственная структура комплекса рековерина дикого типа с N-концевым 16фенилаланина-3. Кроме этого, остаток звенным пептидом родопсинкиназы. Показана лизина-192 образует солевой мост с область контактов с участием остатков K192 и E1рековерина, и F3 родопсинкиназы. остатком глутаминовой кислоты-189, что является одним их условий, обеспечивающих оптимальную геометрию катион- взаимодействия. Эти контакты играют важную роль в связывании амфипатической -спирали RK-N1-16 с экспонированным гидрофобным карманом рековерина. Таким образом, результаты этой части работы позволяют заключить, что эффективность Са2+-зависимой регуляторной активности рековерина обеспечивается, в том числе, за счет контактов между аминокислотными остатками С-концевого сегмента белка и ответным участком родопсинкиназы, включая катион- взаимодействие K192Rc-F3RK. Образование этих контактов стабилизирует комплекс рековерина с родопсинкиназой, что повышает эффективность ингибирования фермента.
Основываясь на результатах проведенного исследования с учетом анализа кристаллической структуры рековерина дикого типа (PDB 1OMR) можно предположить, как именно на структурном уровне происходит настройка Са2+-зависимой регуляторной активности белка с участием его С-концевого сегмента (рис. 14). Как уже упоминалось, С-концевой сегмент рековерина отличается от соответствующих последовательностей других НКС тем, что содержит кластер из шести остатков лизина и по своей вторичной структуре образует дополнительную 11-ю -спираль K. Введение различных мутаций в С-концевой сегмент приводит либо к нарушению, либо к полной потере контактов между -спиралью К и участком, соединяющим Са2+-связывающие центры EF3 и EF4, которые в присутствии катиона находятся в открытой конформации (открытая конформация нефункционального EF4 индуцируется связыванием кальция в EF3). В частности, нарушаются электростатические взаимодействия с участием остатков K198 и K194 из упомянутого выше кластера, а также гидрофобные контакты, образованные остатками L197 и V193 С-концевого сегмента.
Одновременная потеря всех этих контактов, происходящая в случае мутантов Rc2-190 и Rc2-188, оказывает негативное влияние на Са2+связывающие свойства рековерина, Рис. 14. Пространственная структура комплекса рековерина (показан только С-концевой домен) с Nпоскольку приводит к частичной концевым 16-звенным пептидом родопсинкиназы по дестабилизации открытой данным молекулярного моделирования. Внизу приведена первичная структура С-концевого сегмента конформации обоих Са2+рековерина. Отмечены аминокислотные остатки, связывающих центров его Спринимающие участие в образовании внутримолекулярных и межмолекулярных контактов. концевого домена. В то же время, отсутствие только одного (мутант RcV193G) или двух (мутант Rc2-196) из этих контактов, повидимому, оказывается недостаточным для того, чтобы нарушилась правильная укладка спирали К и, как следствие, изменились Са2+-связывающие свойства белка. Введение мутаций в С-концевой сегмент приводит также к нарушению его функции как регуляторного элемента, контролирующего образование комплекса между рековерином и родопсинкиназой. Этот эффект, зафиксированный нами практически для всех С-концевых мутантов рековерина, в каждом конкретном случае происходит вследствие различных причин. Основной причиной является потеря прямых контактов между С-концевым сегментом рековерина и ответным участком родопсинкиназы - катион- пары K192Rc-F3RK, а также, возможно, катион- пары K196Rc-F3RK (существование второго контакта может быть предсказано на основании данных молекулярного докинга RK-N1-16 и мутанта RcK196A). Частичная или полная потеря этих контактов происходит в случае мутантов Rc2-188, Rc2-190, Rc2-192, химеры RG, а также мутанта RcK192A. Кроме этого, существенное негативное действие на регуляторную функцию Сконцевого сегмента рековерина вызывают мутации, оказывающие влияние на оптимальную геометрию указанных катион- взаимодействий, в частности, те из них, введение которых меняет положение -спирали К в молекуле белка или просто повышает ее подвижность.
Последнее может быть вызвано не только удалением протяженных участков С-концевой спирали (все делеционные мутанты), но даже потерей единичных стабилизирующих контактов.
Это происходит, например, в случае мутанта RcV193G, в котором отсутствует внутримолекулярный гидрофобный контакт V193-I133, а также в случае мутанта RcP190G, в котором остаток пролина-190, задающий направление -спирали К, заменяется на остаток глицина.
Описанные механизмы, с помощью которых происходит настройка Cа2+чувствительности, а также эффективности функционирования рековерина, реализуются только в случае этого белка и обусловлены особенностями строения его С-концевого сегмента. В целом же, структура С-концевого сегмента у НКС, по всей видимости, сформирована таким образом, чтобы придавать специфичность Са2+-зависимой регуляторной активности каждого их белков семейства, что имеет важнейшее физиологическое значение. Именно с помощью уникального С-концевого сегмента НКС в условиях in vivo могут обеспечиваться различия в способности этих белков реагировать на широкий спектр сигналов кальция и в ответ на это селективно модулировать активность эффекторных мишеней.
ВЫВОДЫ 1. Удаление участка С-концевого сегмента рековерина, состоящего из 14-ти С-концевых аминокислотных остатков, не приводит к нарушению целостности структуры белка.
12. Аминокислотные остатки QKVKEK196 в С-концевом сегменте рековерина принимают участие в настройке его чувствительности к ионам кальция и, как следствие, в регуляции Са2+-миристоильного переключателя белка.
3. Образование контактов между С-концевым сегментом рековерина и N-концевым 15звенным участком родопсинкиназы, включая катион- взаимодействие K192Rc-F3RK, стабилизирует связывание родопсинкиназы с гидрофобным карманом рековерина, тем самым обеспечивая эффективное ингибирование фермента.
4. Замена С-концевого сегмента рековерина на соответствующую последовательность другого нейронального кальциевого сенсора, GCAP2, ослабляет ингибирование родопсинкиназы рековерином.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Zernii, E.Y., Komolov, K.E., Permyakov, S.E., Kolpakova, T., Dell'orco, D., Poetzsch, A., Knyazeva, E.L., Grigoriev, I.I., Permyakov, E.A., Senin, I.I., Philippov, P.P. and Koch, K.W.
(2011) Involvement of recoverin C-terminal segment in recognition of the target enzyme rhodopsin kinase. Biochem. J. 435 (2), 441-450.
2. Сенин, И.И., Тихомирова, Н.К., Чурюмова, В.А., Григорьев, И.И., Колпакова, Т.В., Зинченко, Д.В., Филиппов, П.П. и Зерний, Е.Ю. (2011) Последовательности двух иммунодоминантных эпитопов рековерина принимают участие в Са2+/рековеринзависимом ингибировании фосфорилирования родопсина. Биохимия 76 (3), 406-413.
3. Permyakov, S.E., Zernii, E.Y., Knyazeva, E.L., Denesyuk, A.I., Nazipova, A.A., Kolpakova, T.V., Zinchenko, D.V., Philippov, P.P., Permyakov, E.A. and Senin, I.I. (2012) Oxidation mimicking substitution of conservative cysteine in recoverin suppresses its membrane association. Amino Acids 42 (4), 1435-1442.
4. Колпакова, Т.В., Зерний, Е.Ю., Григорьев, И.И., Сенин, И.И., Зинченко, Д.В., Пермяков, С.Е. и Князева, Е.Л. Роль С-концевого сегмента в регуляции Са2+-зависимых свойств рековерина. Международный молодежный научный форум УЛомоносов-2010Ф, Москва, 1315 апреля 2010 г. Электронный ресурс УМатериалы международного научного форума Ломоносов-2010Ф, секция 28, подсекция 10, 23210.
5. Колпакова, Т.В., Зерний, Е.Ю, Князева, Е.Л., Пермяков, С.Е., Пермяков, Е.А., Зинченко, Д.В., Григорьев, И.И., Сенин, И.И. и Филиппов, П.П. С-концевой сегмент в регуляции функционирования нейронального кальциевого сенсора рековерина. 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых УБиология - наука XXI векаФ, Пущино, 19-23 апреля 2010 г. Сборник тезисов т.1, с. 33-34.
6. Kolpakova, T.V., Zernii, E.Y., Komolov, K.E., Permyakov, S.E, Knyazeva E.L., Zinchenko D.V., Grigoriev I.I., Permyakov E.A., Senin, I.I, Koch K.-W. and Philippov, P.P. C-terminal segment of recoverin as a built-in modulator of neuronal calcium sensor functioning. 11th Meeting of the European Calcium Society, Warsaw, Poland, September 6thЦ9th 2010. Acta Biochim. Pol. (Supplement 2), 38.
7. Зерний, Е.Ю., Колпакова, Т.В., Пермяков, С.Е., Назипова, А.А., Зинченко, Д.В., Комолов, К.Е., Шольтен, А., Григорьев, И.И., Пермяков, E.A., Кох К.-B., Филиппов, П.П. и Сенин, И.И. C-концевой сегмент как встроенный модулятор функционирования белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров. V российский симпозиум УБелки и пептидыФ, Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г. Сборник тезисов, с.114.