Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
Цынкаловский Олег Ростиславович
ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ СУТОЧНЫЕ РИТМЫ, В ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ И КЛЕТКАХ-ПРЕДШЕСТВЕННИКАХ КОСТНОГО МОЗГА
14.00.36 - аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Москва - 2008 г.
Работа выполнена в Центре по исследованию стволовых клеток Института им. Гаде Бергенского университета (г. Берген, Норвегия) и в АНО Институт иммунофизиологии (г. Москва).
Научные консультанты:
MD, PhD, профессор Лярум Оле Дидрик доктор медицинских наук, профессор Сепиашвили Реваз Исмаилович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Балмасова Ирина Петровна доктор медицинских наук, академик РАН Петров Рэм Викторович доктор медицинских наук, профессор Кадагидзе Заира Григорьевна
Ведущая организация:
ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава
Защита диссертации состоится л24 декабря 2008 г. в л___ часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.26 при ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.10а
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6).
Автореферат разослан л_____________________2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Т.А. Славянская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Суточные (циркадные) ритмы сформировались в процессе эволюции для координации большинства важнейших функций организма (Reppert and Weaver 2001;
Dunlap and Loros 2004; Okamura 2004). Циркадные ритмы в организме млекопитающих координируются влияниями нейронов супрахиазматических ядер головного мозга (Asai, Yoshinobu et al. 2001; Koukkari and Sothern 2006), однако клетки периферических тканей и органов способны генерировать собственные ритмы и изменять их соответственно локальным потребностям (Balsalobre 2002; Albrecht and Eichele 2003; Hastings, Reddy et al.
2003). Гены, контролирующие суточные ритмы, так называемые clock гены, описаны во многих периферических тканях и органах (Balsalobre 2002), однако в кроветворной ткани они детально не изучались. Нужно также отметить, что только несколько работ в этой области выполнены на клетках человека (Bjarnason, Jordan et al. 2001). Суточные ритмы в периферических тканях и органах формируются не только при получении координирующих сигналов от гипоталамических центров, но и при локальном воздействии факторов внешней среды, мобилизующих адаптационные процессы в данной ткани или органе (Balsalobre, Damiola et al. 1998; Balsalobre, Brown et al. 2000). Сlock гены формируют оптимальные ритмы, координируя основные циркадные ритмы организма с локальными потребностями периферических тканей (Holzberg and Albrecht 2003). Таким образом, эти гены выполняют важную роль в поддержании клеточного и тканевого гомеостаза и непосредственно участвуют в регуляции многих процессов в клетках (Stokkan, Yamazaki et al. 2001). Поэтому, изучение активности clock генов в клетках кроветворной ткани представляет несомненный интерес.
До сих пор не проводились исследования суточных ритмов в кроветворных стволовых клетках (СК). Отсутствие данных об организации системы регуляции циркадных процессов в СК связано прежде всего с методическми сложностями изучения этих клеток. СК составляют очень небольшой процент ( 0.1 - 0.01 %) клеток костного мозга (Spangrude, Heimfeld et al. 1988; Weissman, Anderson et al. 2001), что вызывает медодические трудности в выделении за короткий период времени достаточного числа клеток без потери качества РНК для детального молекулярного анализа. Поэтому, задача разработки методики анализа циркадных генов в высокоочищенных популяциях кроветворных СК представляется безусловно актуальной.
Белки, кодируемые clock генами, и образуемые белковые гетеродимеры являются транскрипционными факторами, экспрессия которых меняется в соответствие с клеточными циркадными ритмами. За счет измененния активности транскрипционных факторов может ритмично меняться и экспрессия подконтрольных им генов (clockcontrolled genes) и соответственно клеточные процессы, этими генами опосредуемые.
Такой механизм позволяет клеткам периферических тканей и органов быстрее и лучше адаптироваться к местным изменениям окружающей среды. Использование высокопродуктивных методов анализа экспрессии генов позволило получить представоение об эффекторном звене клеточных часов (Reppert and Weaver 2001). Так, при масштабном сравнительном анализе суточной экспрессии более 12000 генов в клетках печени и сердца удалось обнаружить, что активность около 10 % исследуемых генов меняется ритмично (Storch, Lipan et al. 2002). Интересно отметить, что процент одинаковых генов, изменяющихся ритмично в обоих органах, был небольшим.
Эффекторное звено системы clock генов в кроветворной ткане до сих пор не исследовалось. Всвязи с этим, изучение молекулярно-генетических основ формирования суточных ритмов в кроветворной ткане - в стволовых клетках и клеткахпредшественниках костного мозга, представляется безусловно актуальным.
Цель работы - изучение активности генов, контролирующих суточные ритмы кроветворения, в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга мышей и человека, сравнение особенностей формирования ритмов в кроветворных клетках разной степени дифференцировки.
Основные задачи работы:
1. Разработать методический подход для исследования экспрессии генов в редких популяциях стволовых клеток лабораторных моделей и человека.
2. Оценить экспрессию ключевых генов, контролирующих суточные ритмы -clock генов, в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга мышей и человека.
3. Изучить изменение экспрессии clock генов в смешаной популяции клеток костного мозга мышей и популяции стволовых клеток, изолированных с помощью анализа методом проточной цитометрии и высокоскоростной сортировки.
4. Изучить изменение экспрессии генов, контролирующих суточные ритмы, в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека.
5. Провести сравнительный анализ особенностей формирования суточных ритмов в кроветворных клетках разной степени дифференцировки.
Научная новизна Впервые проведена сравнительная оценка активности ключевых clock генов в кроветворной ткани костного мозга мышей и человека и исследованы изменения экспрессии этих генов в теченние суток. Показано, что регуляции ритмов в кроветворной ткани характеризуется особенностями, отличными от других тканей и органов. Впервые исследована система формирования суточных ритмов на молекулярно-генетическом уровне в стволовых клетках. Полученные результаты свидетельствуют о том, что экспрессия генов, контролирующих суточные ритмы гемопоэза в костном мозге, зависит от степени зрелости кроветворных клеток.
Теоретическая и практическая значимость Разработан новый методологический подход, сочетающий использование высокоскоростной проточной цитометрической сортировки и методы молекулярной биологии, для оценки суточных ритмов в редких популяциях кроветворных клетках.
Использование этого подхода позволило впервые изучить организацию системы контроля суточных ритмов в кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга у мышей и человека.
Результаты работы используются в лекционном курсе Общие представления о системе иммунитета еа кафедре аллергологии и иммунологии ФПК МР ГОУ ВПО Российский Университет Дружбы Народов (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.10а).
Положения, выносимые на защиту 1. Сочетание высокоскоростной проточно-цитометрической сортировки и методов молекулярной биологии, позволяет изучать изменение активности различных генов в течение суток в редких популяциях кроветворных стволовых клеток.
2. Ключевые clock гены выявляются как в стволовых клетках мышей и клеткахпредшественниках костного мозга человека, так и в неочищенных популяциях клеток костного мозга, однако регуляция ритмов в кроветворной ткане зависит от степени зрелости клеток.
3. Впервые показано наличие достоверных суточных ритмов в 3-х ключевых clock генах (hPer1, hPer2 и hCry2) клеток-предшественников костного мозга человека.
4. Экспрессия Bmal1 в течение суток в разных популяциях кроветворных клеткок мышей и человека, измененяется неритмично.
5. Изменение экспрессии генов, регулирующих суточные ритмы кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга, имеет особый характер, отличный от других периферических тканей и органов.
Апробация работы Результаты исследований по диссертационной работе представлены на российских и международных конференциях и конгрессах: Международном конгрессе по иммунофизиологии (Дагомыс, 2003); International meeting on advanced flow cytometry (Paris, 2003); Danish meeting on flow cytometry (Copenhagen, 2004); Norwegian Stem Cell Network meeting (Rosendal, 2005); Norwegian Stem Cell Network meeting (Oslo, 2006), International Congress on Stem Cells (Cancun, 2006), Объединенном иммунологическом форуме - 20(Санкт-Петербург, 2008); Международной конференции по физиологии и патологии иммунной системы (Москва, 2008); Royan International Twin Congress on Regenerative Biomedicine and Stem Cell Biology and Technology (Tehran, 2008).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ (из них 9 - в международной печати), включающих 1 монографию, 1 главу книги, 7 журнальных статей и 9 материалов российских и международных конференций.
Объем и структура диссертаци Диссертация изложена на 247 страницах, содержит 27 рисунков и 9 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 7 глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 317 источников (из них 293 - зарубежных).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы Для выявления СК клетки костного мозга мышей С57Bl, окрашенные Hoechst 33342, анализировали на проточном цитофлуориметре. СК, характеризующиеся слабой флуоресценцией из-за низкого содержания красителя (Hoechst Уside populationФ), выделяли с помощью высокоскоростной сортировки. После выделения РНК из очищенных СК и исходной популяции клеток костного мозга определяли активность ключевых циркадных генов mPer1, mPer2, mBmal1, mCry1, mClock и mRev-erb относительно активности m36B4, выбранного в качестве контроля, методом количественной оценки полимеразной цепной реакции в реальном времени. Функциональную активность изолированных СК и клеток костного мозга, взятых до и после сортировки, оценивали по способности клеток образовывать колонии in vitro.
Забор клеток проводили каждые 4 часа - 7 раз в течение суток. До начала этой процедуры животные в течение 3 недель находились в стандартных световых Рис.1. Основные харакеристики ритма условиях (12 часов при свете / 12 часов в темноте). Для оценки основных суточных ритмов организма измеряли ректальную температуру и анализировали содержание кортикостерона и мелатонина крови.
Результаты работы Разработка методического подхода для исследования экспрессии генов в редких популяциях стволовых клеток лабораторных моделей.
Для выделения кроветворных СК мышей был использован метод окрашивания КМ флуоресцентным красителем Hoechst (Goodell, Brose et al. 1996). Эта стратегия выделения СК, разработанная M. Goodell с коллегами, основана на различной способности клеток КМ окрашиваться Hoechst. Исследователи обнаружили, что небольшая популяция клеток костного мозга мышей, характеризующаяся низкой флуоресценцией при окрашивании Hoechst (Hoechst флуоресценцией), в значительной степени обогащена стволовыми клетками, которые были способны полностью восстанавливать кроветворение у летально облученных мышей (Goodell, Brose et al. 1996). При анализе окрашенных клеток на проточном цитометре на двухпараметрной гистограмме популяция располагается вдоль, в стороне от основной массы клеток с высокой Hoechst флуоресценцией (Рис. 1А) и поэтому получила название side population (буквально, боковая популяция), или SP.
В наших экспериментах клетки SP составляли 0.05 - 0.07 % клеток костного мозга и были чувствительны к воздействию верапамила (Рис. А и Б). От 75 % до 85 % клеток SP экспрессировали поверхностные антигены Sca-1 и c-kit, являющиеся маркерами кроветворных стволовых клеток костного мозга мышей (Tsinkalovsky, Rosenlund et al. 2005).
Клетки SP также обладали значительно более высокой по сравнению с неочищенной популяцией клеток костного мозга способностью образовывать колонии кроветворных клеток in vitro и проявляли мультипотентность (Таблица ). Так, среднее соотношение количества колоний к количеству посеянных клеток для SP составляло 1/3.2, тогдато есть клетки остного мозга это соотнршение было 1/244.9. То есть колониеобразующая способность клеток SP в 76.5 раз превышала таковую для смешаной популяции клеток костного мозга (Таблица 1 ).
Высокоскоростная сортировка на проточном цитометре не вызывает повреждение СК, деградации РНК и изменений экспрессии генов Для получения достаточного для последующих анализов количества клеток SP клетки сортировались на проточном цитометре со скоростью до 30000 событий/с. Этот метод позволял за относительно короткий период времени получить чистую ( 94 - 97 %) популяцию СК (Рис. Г), из которой можно было выделить достаточно РНК для анализа ключевых clock генов. Анализ выделенной РНК на Agilent Bioanalyzer с использованием Nano LabChip также показали, что сортировка даже с такой высокой скоростью не вызывает деградацию РНК в изолированных клетках: все образцы выделенной РНК были высокого качества (Рис. ).
Hoechst staining for SP 2Sorting cell populations of interest using a MoFlo 1Preparing of cell suspension from R1bone marrow 264 SP R10 64 128 192 2FLHoechst Red 1Surface marker analysis 210 R0 64 128 192 2FSC 1Forward scatter Re-analysis of sorted cells 0 64 128 192 2(see Figure 2) FLSca-1 fluorescent Morphology RNA purification, analysis DNase-treatment cDNA Q-RT-PCR RNA quality and quantity control In vitro and 28S 18S in vivo cell studies Cycle Рис. 1. Диаграмма, иллюстрирующая методический подход для изучения экспрессии генов в редких популяциях стволовых клеток.
Серия дополнительных экспериментов подтвердила что высокоскоростная сортировка также не отражается на экспрессии тестируемых генов. Как показано на Рис.., уровень экспрессии ключевых clock генов был практически одинаковым в клетках костного мозга, взятых до или после сортировки на проточном цитометре.
Так как при исследовании циркадных изменений экспрессии clock генов необходимо получать образцы клеток в разное время суток, окрашивание и анализ некоторых образцов может происходить с задержкой. Всвязи с этим было важно определить, не может ли такая задержка отразиться на уровне экспрессии генов. В специально проведенных экспериментах клетки костного мозга окрашивались Hoechstб и FLSSC FLHoechst Blue Side scatter C-kit fluorescent Rn SP клетки сортировались сразу после выделения костного мозга, или с задержкой в 12 ч или 24 ч. Результаты этих опытов показали, что такого рода задержка не оказывает влияния на качество выделенной мРНК (данные не иллюстрированы) или на уровень экспрессии гена (mPer1 на Рис. ).
Из-за большого количества тестируемых образцов и генов необходимо было провести несколько десятков серий реакций Q-RT-PCR. Для того, чтобы оценить, насколько сопоставими (и воспроизводимы) результаты Q-RT-PCR, полученные в разных реакциях, мы провели два контрольных анализа экспрессии mPer1 и m36B4 в10 одинаковых образцах РНК в двух различных реакциях Q-RT-PCR. Вычисленный коэффициент вариации (CV) для mPer1 (n=30) составил для реакций 1 и 2 соответственно 0.43 % и 0.26 %, а для m36B(n=30) - 0.43 % и 0.45 %. Распределение относительной экспрессии mPer1 (%) в образцах, полученной в двух разных реакциях показано на Рис.. Приведенные данные свидетельствуют об аккуратности и надежности метода Q-RT-PCR, что позволяет использовать его для сравнения экспрессии исследуемых генов в разных образцах клеток, полученных в течение суток.
Таким образом, разработанная нами методика комбинирования высокоскоростной сортировки на проточном цитометре клеток SP костного мозга с последующим выделением РНК и анализом экспрессии генов методом Q-RT-PCR может с успехом использоваться для изучения изменения экспрессии ключевых clock генов в небольших популяциях СК.
Использование разработанной методики для анализа кроветворных стволовых клеток рыб Danio rerio Аквариумные рыбы Danio rerio (или рыбки-УзебрыФ) за последние десятилетия стали также популярны во многих научных лабораториях. Связано это с тем, что данный вид рыб является удобной моделью для генетических исследований, в том числе и для изучения гемопоэза. Геном Danio rerio в значительной степени похож на геном человека (Davidson and Zon 2004), у рыб несложно вызывать и изучать мутации (Zon 1999).
Эмбриогенез рыб протекает достаточно быстро, потомство первое время прозрачно и развивается ex utero, что делает Danio rerio очень удобной моделью для изучения фенотипических проявлений экспериментальных манипуляций с генами. Гемопоэз этих рыб очень похож на гемопоэз млекопитающих как видами клеток, так и ключевыми регуляторными генами (Traver, Herbomel et al. 2003). Наконец, Danio rerio характеризуются малыми размерами и быстро размножаются, т.е. затраты на содержание рыб невелеки. Кроме того, Danio rerio также является удобной моделью для исследования ритмов в экспрессии clock генов. Однако, до недавнего времени кроветворные СК рыб не изучались, так как не были опробованы методы, позволяющие из выделять. Антитела, специфичные для СК до сих пор синтезировать не удалось (Traver, Paw et al. 2003).
Нашей задачей было применение разработанного нами методического подхода для выявления и анализа СК на клеточном и генетическом уровнях. Применив описанную выше методику окрашивания клеток флуоресцентным красителем Hoechst с проточной цитометрией для изучения кроветворных клеток Danio rerio, мы описали популяцию SP клеток, обладающих свойствами СК. При анализе клеток на проточной цитометре эта популяция характеризовалась низкими показателями светорассеивания и объединяла маленькие клетки с низким содержанием цитоплазмы (Рис..). Опыты с введением рыбам миелосупрессора 5-флуоурацила, токсичного для делящихся клеток, показали, что большинство клеток SP находились в интерфазе клеточного цикла (Рис..). Как показано на Рис.. содержание SP уменьшалось в присутствие ингибиторов транспортных насосов ABCG2. Этот факт указывает на то, что формирование популяции, как и в СК костного мозга млекопитающихся, связано с активностью белков группы ABC, ответственных за траспорт Hoechst 33342 из клеток.
Для оценки экспрессии генов SP клеток Danio rerio, мы использовали протокол, описанный выше для кроветворных клеток костного мозга мышей. Из отсортированных клеток выделяли РНК и определяли активность генов методом Q-RT-PCR. Для тестового анализа мы выбрали гены, которые являются маркерами кроветворных СК Danio rerio - scl, lmo2, c-myb ( ), аналогами генов, активно экспрессирующихся в неделящихся кроветворных СК мышей - tob1a, tie1, stat3 (Venezia et al., 2004) и tie2 (Arai et al., 2004) или в CD34+CD38- клетках человека - c-fos (). Сравнительный молекулярный анализ выявил значительно более высокий уровень экспрессии генов, специчных для СК млекопитающихся, в клетках SP по сравнению с остальными клетками.
В целом, результаты нашего исследования указывают на возможность обогащения кроветворных СК рыб, а к также подтвержают удобство и надежность использования разработанной нами методика комбинирования высокоскоростной сортировки с методом QRT-PCR для изучения СК разных видов. Применение описанного методического подхода для кроветворных клеток Danio rerio позволит использовать преимущества этой удобной модели для анализа регуляции циркадных ритмов в СК на молекулярном уровне.
Анализ изменения экспрессии циркадных генов, контролирующих суточные ритмы кроветворения, в стволовых клетках костного мозга Используя описанную выше методику у мышей мы впервые смогли оценить активность ключевых clock генов в кроветворных клетках костного мозга. Все тестируемые clock гены экспрессировались и в смешаной популяции костного мозга, и в SP, причем можно отметить как сходства, так и различия в относительном уровне экспрессии (Рис. ).
Так, относительный уровень активности mPer2, Bmal1 и Clock был одинаковым в обеих популяциях клеток. Вместе с тем, экспрессия mPer1 в SP клетках оказалась почти в 3 раза выше относительно других генов, тогда как в смешанной популяции костного мозга она не отличалась от mPer2, Bmal1 и Clock (Рис. ). Экспрессия mCry1 в смешаной популяции клеток костного мозга оказалась самой высокой по отношению к другим clock генам, а в клетках SP не отличалачь от экспресси других генов (за исключением mPer1 ).
Экспрессия генов, контролирующих суточные ритмы гемопоэза в костном мозге, зависит от степени зрелости кроветворных клеток Результаты 3-х экспериментов, проведенных на 84 мышах B6D2F1, выявили ритмичность в суточных изменениях экспрессии mPer2 в клетках обеих популяций костного мозга и печени. Активность mPer1 и mRev-erb изменялась ритмично в течение суток в клетках смешаной популяции костного мозга и печени, но не в обогащенной популяции СК. Выявленные в клетках печени четкие ритмичные суточные изменения экспрессии mBmal1 отсутствовали в клетках обеих популяций костного мозга.
Полученные данные свидетельствуют об особой организации системы регуляции ритмов гемопоэза и позволяют предположить, что экспрессия циркадных генов в костном мозге может определяться степенью зрелости кроветворных клеток.
Оценка изменений экспрессии генов, контролирующих суточные ритмы гемопоэза, в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека Данные, полученные за последние годы, свидетельствуют о том, что процесс кроветворения у млекопитающих подвержен суточным (циркадным) ритмам, но у человека clock гены до сих пор не исследовались. В данной серии экспериментов мы изучили активность ключевых циркадных генов hPer1, hPer2, hCry1, hCry2, hBmal1, hRev-erb альфа и hClock в смешаной популяции клеток костного мозга (КМ) и в изолированной популяции стволовых клеток и клеток-предшественников, экспрессирющих поверхностный антиген CD34 (CD34+ клетки).
Забор КМ и анализы крови у 10 добровольцев проводили 6 раз в течение 24-х часов.
Параллельный анализ концентраций кортизола, гормона роста и тестостерона плазмы и общего количества лейкоцитов периферической крови доноров показал стандартные сут очные ритмы изменений данных показателей, характерные для большинства здоровых людей. В клетках обеих популяций КМ Однако суточные ритмы были обнаружены только в экспрессии hPer1, hPer2 и hCry2 в CD34+ клетках, и hPer1 в смешаной популяции клеток КМ. Результаты данной серии экспериментов указывают на особую организацию системы регуляции ритмов в КМ, которая может зависеть от степени зрелости кроветворных клеток.
Изменение экспрессии mBmal1, контролирующего циркадные ритмы, в кроветворных клетках костного мозга мышей происходит неритмично Согласно данным молекулярно-генетических исследований система контроля суточных ритмов млекопитающих в головном мозге регулируется по принципу обратной связи двумя группами циркадных генов: Bmal1 и частично Rev-erb представляют стимулирующий компонент, а гены Per и Cry составляют ингибирующий компонент системы. Ритмичные изменения активности Bmal1, противоположные по направленности изменениям Per, был выявлены и в некоторых периферических тканях, например печени.
Для характеристики системы контроля суточных ритмов в кроветворной ткане мы провели сравнительный анализ изменений экспрессии mBmal1 и mPer2 в смешаной популяции клеток костного мозга и высокоочищенной популяции кроветворных стволовых клеток и параллельно в клетках печени. Эксперименты проведены на мышах B6D2F1, содержавшихся в течение трех недель до начала опытов в стандартизованных световых условиях. Заборы клеток костного мозга и печени проводились каждые 4 часа в течение суток. Анализ полученных данных выявил ритмичные изменения экспрессии mPer2 во всех типах клеток, при этом амплитуда колебаний активности этого гена была значительно более выражена в клетках печени по сравнению с кроветворными клетками. Изменения экспрессии mBmal1 в клетках печени также были ритмичны и находились в противофазе по отношению к изменениям mPer2, что совпадало с данными других исследователей. Однако, ни в смешаной популяции клеток костного мозга, ни в кроветворных стволовых клетках не удалось обнаружить ритма в колебаниях активности mBmal1. Отсутствие ритма в изменениях экспрессии mBmal1, одного из ключевых регуляторов системы циркадных ритмов, на любой стадии гемопоэза может свидетельс твовать об особой организации этой системы в кроветворной ткане.
Суточные ритмы в изменении экспрессии hBmal1 в стволовых клетках и клеткахпредшественниках костного мозга человека отсуствуют В экспериментах на мышах нами было показано отсутствие ритмичных изменений экспрессии mBmal1 в разных популяциях кроветворных клеток костного мозга. При этом в клетках печени циркадные изменения активности mBmal1 были ритмичны. Ранее были описаны циркадные ритмы изменения экспрессии hBmal1 в клетках эпителия ротовой полости человека, однако в кроветворых клетках активность этого гена до сих пор не изучалась. В данной серии экспериментов мы исследовали суточные изменения активности hBmal(паралелльно с другими ключевыми цикадными генами) в смешаной популяции клеток костного мозга человека и в стволовых клетках/клетках-предшественниках, экспрессирющих поверхностный антиген CD34 (CD34+ клетки). Забор костного мозга и выделение CD34+ клеток проводили 6 раз в течение 24-х часов у 10 добровольцев. Хотя суточные ритмы, особенно выраженные в CD34+ клетках, были выявлены в генах hPer и hCry, в изменении экспрессии hBmal1 в течение суток ритмы отсутствовали. Результаты представленной работы созвучны данным, полученным на клетках костного мозга мышей, и указывают на особую организацию системы регуляции ритмов в кроветворных клетках костного мозга млекопитающих.
Суточная экспрессия mDll1 и mHes1 сигнальной системы Notch, участвующей в регуляции гемопоэза, зависит от степени зрелости кроветворных клеток Так как в в кроветворной ткане до сих пор не изучалось способность clock генов регулировать через подконтрольные гены гемопоэз, мы исследовали изменения активности генов mDll1 и mHes1 сигнальной системы Notch, влияющей на самоподдержание, пролиферацию и выживаемость кроветворных СК, в клетках костного мозга в течение суток. Используя метод количественной оценки полимеразной цепной реакции в реальном времени мы провели сравнительный анализ суточной экспрессии mDll1 и mHes1 в костном мозге и в изолированных популяциях, обогащенных СК. Результаты 3-х экспериментов, проведенных на 84 мышах B6D2F1, выявили четкую ритмичность в суточных изменениях экспрессии mDll1 и mHes1 в смешаной популяции клеток костного мозга, но не в обогащенной популяции СК (Рис.7). Такое различие позволяет предположить, что экспрессия генов сигнальной системы Notch, участвующей в гемопоэзе, зависит от степени зрелости кроветворных клеток и может регулироваться сlock генами.
Figure 7. Изменение активности mDll1 и mHes1 происходит ритмично в неочищенной популяции клеток костного мозга (правая колонка), но не стволовых клетках SP (левая колонка).
ВЫВОДЫ 1. Методический подход, сочетающий использование высокоскоростной проточно- цитометрической сортировки и методы молекулярной биологии, позволяет изучать суточные ритмы в редких популяциях кроветворных стволовых клеток.
2. Впервые описана экспрессия ключевых clock генов в стволовых клетках мышей и клетках-предшественниках костного мозга человека.
3. Отсутствие суточных ритмов в изменении экспрессии большинства clock генов (кроме mPer2) в стволовых клетках костного мозга мышей позволяет предположить, что регуляция ритмов в кроветворной ткане зависит от степени зрелости кроветворных клеток.
4. Впервые показано наличие достоверных суточных ритмов в 3-х из 8-ми ключевых clock генов (hPer1, hPer2 и hCry2) клеток-предшественников костного мозга человека.
5. Отсутствие ритмов в изменениях экспресси Bmal1 в течение суток в разных популяциях кроветворных клетках мышей и человека, позволяет предположить, что изменение активности этого гена в кроветворной ткани происходит неритмично.
6. Изменение экспрессии clock генов в течение суток в кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозна имеет особый характер, отличный от других органов и тканей.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Цынкаловский О.Р., Розенлюнд Б., Эйкен Х.Г., Лярум О.Д. Разработка методики оценки экспрессии циркадных генов, контролирующих суточные ритмы кроветворения, в стволовых клетках костного мозга.// Аллергология и иммунология. -2008.- 9 (1) - 4.
2. Цынкаловский О.Р., Розенлюнд Б., Сотерн Р.Б., Смоланд Р., Хирт А., Лярум О.Д.
Оценка изменений экспрессии генов, контролирующих суточные ритмы гемопоэза, в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека.// Российский иммунологический журнал. -2008.- 2 (11) (2-3) - 116.
3. Цынкаловский О.Р., Розенлюнд Б., Сотерн Р.Б., Смоланд Р., Хирт А., Лярум О.Д.
Суточные ритмы в изменении экспрессии hBmal1 в стволовых клетках и клеткахпредшественниках костного мозга человека отсуствуют // Аллергология и иммунология. -2008.- 9 (3) - 258.
4. Цынкаловский О.Р., Розенлюнд Б., Сотерн Р.Б., Лярум О.Д. Изменение экспрессии mBmal1, контролирующего циркадные ритмы, в кроветворных клетках костного мозга мышей происходит неритмично.// Аллергология и иммунология. -2008.- (3) - 258.
5. Цынкаловский О.Р., Розенлюнд Б., Сотерн Р.Б., Лярум О.Д. Суточная экспрессия mDll1 и mHes1 сигнальной системы Notch, участвующей в регуляции гемопоэза, зависит от степени зрелости кроветворных клеток.// Российский иммунологический журнал. -2008.- 2 (11) (2-3) - 116.
6. Цынкаловский О.Р., Розенлюнд Б., Сотерн Р.Б., Лярум О.Д. Экспрессия генов, контролирующих суточные ритмы гемопоэза в костном мозге, зависит от степени зрелости кроветворных клеток.// Аллергология и иммунология. -2008.- 9 (1) - 175.
7. Цынкаловский О.Р., Лярум О.Д., 3айденов В.А. Молекулярно-генетические основы формирования суточных ритмов клеток.// Аллергология и иммунология. -2008.- (4).
8. Цынкаловский О.Р., Зайденов В.А., Пахотных А.С., Андрианов В.А. Использование Уside populationФ для выделения стволовых клеток в нормальных и опухолевых тканях.// Медицинская иммунология. -2008.- 10 (4-5) - 319-326.
9. Цынкаловский О.Р., Вик-Мо А., Ферейра С., Лярум О.Д., Фьюсо А. Использование проточной цитометрии для определения кроветворных стволовых клеток рыб Danio rerio.// Российский иммунологический журнал. -2008.- 2 (11) (2-3) - 116.
10. Tsinkalovsky O., Rosenlund B., Laerum O.D., Eiken H.G. Clock gene expression in purified mouse hematopoietic stem cells.// Exp Hematol. -2005.- 33 (1) - 100-7.
11. Tsinkalovsky O., Vik-Mo A.O., Ferreira S., Laerum O.D., Fjose A. Fishing for stem cells:
isolation of hematopoietic stem cells in zebrafish.// Stem Cells: Abstracts - Cancun, 2006.- 12. Tsinkalovsky O., Filipski E., Rosenlund B., Sothern R.B., Eiken H.G., Wu M.W., Claustrat B., Bayer J., Levi F., Laerum O.D. Circadian expression of clock genes in purified hematopoietic stem cells is developmentally regulated in mouse bone marrow.// Exp Hematol. -2006.- 34 (9) - 1249-61.
13. Costea D.E., Tsinkalovsky O., Vintermyr O.K., Johannessen A.C., Mackenzie I.C. Cancer stem cells - new and potentially important targets for the therapy of oral squamous cell carcinoma.// Oral Dis. -2006.- 12 (5) - 443-54.
14. Tsinkalovsky O., Vik-Mo A.O., Ferreira S., Laerum O.D., Fjose A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties.// Differentiation. -2007.- 75 (3) - 175-83.
15. Tsinkalovsky O., Smaaland R., Rosenlund B., Sothern R.B., Hirt A., Steine S., Badiee A., Abrahamsen J.F., Eiken H.G., Laerum O.D. Circadian variations in clock gene expression of human bone marrow CD34+ cells.// J Biol Rhythms. -2007.- 22 (2) - 14050.
16. Tsinkalovsky O.R., Time-dependent clock gene expression in mouse and human stem cells and progenitor cells. 2007, University of Bergen: Bergen. p. 82.
17. Laerum O.D., Tsinkalovsky O., Huang T.-S. Cellular clocks and light effects on man.// Solar radiation and human health /Ed. E. Bjertness.- Oslo: The Norwegian Academy of Science and Letters, 2008. - 47-56.
18. Tsinkalovsky O., Vik-Mo A.O., Ferreira S., Laerum O.D., Fjose A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties.// Yakhteh (The Cell). -2008.- 10 (Suppl. 1) - 93.
Список сокращений ABCG2 (ATP-binding cassette transporter G2) - белок-переносчик G2, использующий для транспортировки веществ энергию АТФ;
КМ Цкостный мозг;
Hoechst - Hoechst 33342;
Q-RT-PCR - количественная оценка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени;
LIN- (lineage negative) - клетки, которые не экспрессируют поверхностные маркеры, характерные для дифференцированных клеток;
SCN - suprachiasmatic nucleus;
SP - side population, популяция клеток, характеризующаяся низкой интенсивностью флуорисценции после окрашивания Hoechst 33342.
Albrecht, U. and G. Eichele (2003). "The m am m alian circadian clock." Current Opinion in Genetics & Developm ent 13(3): 27 1-277.
Asai, M., Y. Yo shin obu, et al. (20 01). " Circadian profile of P er gene m RNA expression in the supra-chiasm atic nucleus, paraventricular nucleus, and p ineal body of aged rats." Jo urnal of Neuroscience Research 66(6): 1133-1139.
Balsalobre, A. (2002). "C loc k genes in m am m a lian peripheral tissues." Cell Tiss ue Res 309(1): 193 9.
Balsalobre, A., S. A. Brown, et al. (200 0). "Resetting of circadian tim e in peripheral tis sues by glucocorticoid signal ing. " Scie nce 289(548 8): 2344-23 47.
Balsalobre, A., F. Dam iola, et al. (1998). "A Serum Shoc k Induce s C irc adian Gene Expre ssion in Mam malian Tissue Cu lture Cells." Cell 93(6): 929-cy c le pha ses." Am erican Journal of Pathology 158(5): 1793-1801.
Bj arnason, G. A., R. C. K. Jordan, e t al. (2001). "Circadian expressio n of cloc k genes in hum an oral m ucosa and skin: A ssociatio n with specific ce ll- 9 37.
Davidson, A. J. and L. I. Zon (2004). "T he 'de finitive' (and 'prim itive' ) guide to zebrafish hem atopoiesis. " Oncogene 23(43): 7 233-46.
Dunlap, J. C. and J. J. Loros (20 04). "The neuros pora circadian sy stem." J Biol Rhy thm s 19(5): 414-em cells that are replicating in vivo. " J. E xp. Med. 1 83(4): 179 7-1806.
2 4.
Goodell, M., K. Bro se, et al. (1996). "Isolati on and functi onal properties of m urine hem atopoietic s t Goodell, M. A., K. Brose, et al. (1996). "Isolat ion and functional properties of murine hem atopoietic stem cells that are replicating i n vivo." J E xp Me 83(4): 179 7-806.
Hastings, M., A. Reddy, et al. (2003). "A cloc kw ork web: circadian tim ing in brain and periphe ry, in health and disease." Nat Rev Neurosci 4(8): 64 9 61.
Holzberg, D. and U. Albrecht (2003). "The Circa dia n Cloc k: A Manager of Biochem ical P rocesses Within the Organism." J Neuroendocrino l 15 39- 343.
Kou kkari, W. L. and R. B. So thern (2006). C hronobi om etry : analy zing for rhy thm s. Introducing Biol ogical hy thm s. New York, Sprin ger: 577-(4): 3-d Okam ura, H. (2004). " Cloc k genes in ce ll c loc ks: role s, ac tion s, and m y steries." J B iol Rhy thm s 19(5): 388- R 602.
99.
Reppert, S. M. and D. R. Weaver (2001). "Mo lec ula r Analy sis of Mam m alian Circadian Rhy thm s." Annu. Rev.Phy siol.(63): 647-76.
Spangrude, G. J., S. Heimfeld, et al. (198 8). "Purific ation and characterization of m ouse hem atopoietic s tem cells." Science 241(486 1): 58-62.
Sto kkan, K.-A., S. Yam aza ki, et al. (2001). " Entrainm e nt of the circadian cloc k in the liver by feeding." Science 291(5503): 49 0-493.
Storch, K., O. L ipan, et al. (20 02). "Ex tensive and d iverge nt circadian gene expression in liver and heart." Nature 417(68 84): 78.
Traver, D., P. Herbomel, et al. (2003). "The zebrafish a s a m ode l organism to s tudy developm ent of the im m une sy stem." Adv I-m m unol 81: 253-unol 4(12):
330.
Traver, D., B. H. Paw, et al. (2003). "Transp la nta tion and in v ivo im aging of multil ineage engr aftm e nt in zebrafish blo odless m utan ts." Nat Im m 1238-46.
Tsin kalov s ky, O., B. Rosenlu nd, et al. (200 5). " Cloc k gene expression in purif ied m ouse hem atopoietic stem cells." E xp Hem atol 33(1): 10 0-107.
Weissm an, I. L., D. J. Anderson, et al. (2001). " Ste m and progeni tor cells: ori gins, phenoty pes, lineage com mitm ents, and transdifferentiation s." Ann u Rev Cell De v Bio l 17: 387-403.
Zon, L. I. (1999). "Zebrafish: a new m odel for hum an disease." Genom e Res 9(2): 99-10 0.