Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ
На правах рукописи
Сокуева Наталья Александровна
Изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в модельных системах
03.01.04 Биохимия
03.02.07 Генетика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2012
Работа выполнена на кафедре биологической химии медицинского факультета Российского университета дружбы народов
Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор Сяткин С.П.
доктор биологических наук, профессор Шишкин С.С.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Гурвиц Белла Яковлевна, ведущий научный сотрудник
Федерального государственного бюджетного учреждения науки
Института Биохимии им. А.Н. Баха РАН
доктор медицинских наук, профессор Ижевская Вера Леонидовна, заместитель директора
Федерального государственного бюджетного учреждения
Медико-Генетического Научного Центра РАМН
Ведущая организация: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук.
Защита состоится нн21 декабря 2012 г. в л___ ч. на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, медицинский факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.
Автореферат разослан л___ ноября 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор Е.В. Лукашева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
Природные полиамины (ПА) и их синтетические аналоги изучаются уже не одно десятилетие как биологически активные вещества, способные оказывать существенное влияние на рост и развитие самых разных организмов путем регуляции клеточной пролиферации у микроорганизмов, растений и животных, включая человека [Wallace H.M., Niiranen K. 2007; Huang Y., et al. 2009; Carmo A.M., et al. 2011] Установлено, что полиамины вовлечены в целый ряд важнейших внутриклеточных процессов, например, в обеспечение стресс-устойчивости, регуляцию определенных метаболических реакций, развитие апоптоза [Huang Y. et al. 2009; Marco F.,et al 2011; Minois N. et al. 2011]. При этом некоторые полиамины нарушают функционирование клеточных геномов на разных уровнях, в частности, отдельные соединения указанного ряда способны достаточно специфично изменять экспрессию генов и влиять на активность ферментов [Huang Y., et al. 2009; Marco F.,et al 2011; Wu Y. et al. 2012]. Естественно, большой интерес вызывают вопросы, связанные с изучением роли полиаминов в регуляции различных молекулярных процессов у человека и возможностей целенаправленного влияния на эти процессы синтетическими полиаминами. В настоящее время практически ежегодно появляются сообщения о создании новых синтетических полиаминов и использовании различных подходов к определению проявлений их биологической активности [Ignatenko N.A. et al. 2009; Carta F. et al. 2010; Yoon Y.J. et al. 2011; Wu Y. et al. 2012]. Как следствие, возникают объективные потребности в стандартизации условий для определения и сравнительного анализа цитостатических и других функциональных свойств синтетических аналогов полиаминов в рамках доклинических испытаний.
Имеются убедительные данные, свидетельствующие о том, что природные полиамины и их синтетические аналоги способны целенаправленно влиять на определенные этапы биосинтеза белков. В частности, были опубликованы статьи, в которых эффективно использовались протеомные технологии для определения конкретных клеточных белков, подвергающихся различным изменениям после воздействий полиаминов [Yohannes E. et al. 2005; Ignatenko N.A. et al. 2009; Kuo W.L. et al. 2009 и др.]. Таким образом, применение протеомного анализа открывает широкие возможности для получения новых сведений о молекулярных эффектах, которые способны вызывать различные синтетические аналоги полиаминов, а также о потенциальных белках - мишенях.
Наконец важно отметить, что синтетические аналоги полиаминов могут найти применение как лекарственные средства или попадать в организм человека с пищевыми продуктами. Соответственно, представляется весьма актуальным проведение разработок стандартизированных биотест-систем на основе культивируемых клеток человека, что позволит оптимизировать программы доклинических исследований новых синтетических аналогов полиаминов и уменьшит риск возможных осложнений при последующем изучении.
Цель и задачи исследования.
Основной целью данной диссертационной работы стало изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в различных модельных системах.
В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать в условиях модельной бесклеточной системы влияние ряда синтетических аналогов полиаминов (ДФМО, МГБГ и др.) на общий пул природных полиаминов и некоторые показатели их обмена.
2. Проанализировать цитостатическую активность у отдельных синтетических аналогов полиаминов с помощью модельной системы на культивируемых клетках лабораторных животных.
3. Разработать биотест-систему на основе быстро пролиферирующих, культивируемых клеток человека и с её помощью изучить биологические эффекты ряда синтетических аналогов полиаминов
4. Провести сравнительный протеомный анализ белков в культивируемых клетках человека под действием отдельных синтетических аналогов полиаминов.
5. Исследовать возможность ассоциации отдельных полиморфных вариантов в двух генах, кодирующих ключевые ферменты метаболизма полиаминов, а также в гене одного из актин-связывающих белков с риском рака предстательной железы у этнических русских.
Научная новизна.
Получены новые данные о влиянии ряда синтетических аналогов полиаминов (ДФМО, МГБГ, О-замещенных гидроксиламинов, алифатических гомологов природных полиаминов) на общий пул природных полиаминов, а также на соотношение спермидин / спермин и синтез полиаминов в условиях бесклеточной системы.
Для обеспечения определения цитостатической биологической активности синтетических аналогов полиаминов разработана клеточная биотест-система, использующая в качестве тестируемого объекта быстро пролиферирующие культивируемые клетки рака простаты человека (PC-3 и LNCaP). С помощью этой биотест-системы охарактеризованы четыре новых синтетических аналога полиаминов дифенил-содержащих аминов (ДФСА-1 - ДФСА-4) по их способности подавлять рост опухолевых клеток человека.
По результатам протеомного анализа в клетках линии PC-3 определены шесть белков, количественно изменяющихся под действием ДФСА-1 и 2. При этом, впервые установлено присутствие в этих клетках двух безымянных белков - белка, который зарегистрирован в базе данных Protein NCBI под №193783699 (по данным анализа кДНК из ткани матки, локус BAG53610 в Genbank) и считается родственным аспартатаминотрансферазам, а также белка, идентифицированного как безымянный белок из семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом (№16552153 в Protein NCBI).
Впервые установлено, что у этнических русских по результатам изучения полиморфизма сайты rs61748925 SAT1 и rs1139915 PAOX являются мономорфными и они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; в отличие от этого для сайта rs11072170 в гене FMN1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% - по аллелю A, и 52.8% - являлись гетерозиготными, Таким образом, можно считать, что полиморфизм rs11072170 в гене FMN1 является перспективным для дальнейшего изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.
Научно-практическая значимость.
Апробировано несколько модельных систем для определения биологической активности синтетических аналогов природных полиаминов и разработана биотест-система, позволяющая оценивать цитостатические (цитотоксические) свойства указанных соединений (биотест-объекты - клетки LNCaP и РС-3; метод тестирования - витальная система регистрации количества клеток).
Изучены показатели биологической активности 15-ти синтетических аналогов природных полиаминов, включая антипролиферативные свойства у 6-ти соединений на разработанной биотест-системе, использующей быстро пролиферирующие клетки рака простаты.
При протеомном анализе белков из клеток PC-3 проведена масс-спектрометрическая идентификация 52 белковых фракций в результате чего расширен информационный модуль в отечественной базе данных Протеомика рака простаты (версия 2012 г.), которая предназначена для оптимизации поисков белковых биомаркеров этого заболевания.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Из 13 новых синтетических аналогов полиаминов три соединения (1-аминоокси-3-аминопропан, S-(5′-дезоксиаденозил)-S-метил-β-тио-этилгидроксиламин, этилендиамин) обладают наибольшими биоэффектами в бесклеточной тест-системе.
2. В модельных условиях (на культивируемых L-клетках) 1-аминоокси-3-аминопропан и 5′-дезоксиаденозил-5′-метилтиоэтил-гидроксиламин показали себя как антипролиферативные агенты.
3. С помощью биотест-системы на основе быстро пролиферирующих клеток человека определены биологические эффекты ДФМО и МГБГ, а также 4-х новых синтетических дифенил-содержащих аминов (ДФСА 1-4).
4. Показано, что ДФСА-1 является наиболее перспективным цитотоксическим агентов, поскольку для него выявлено наиболее выраженное антипролиферативное действие.
5. Протеомный анализа белков клеток РС-3 выявил два новых (лбезымянных) белка человека и позволил расширить информационный модуль Белки РС-3 в базе данных Протеомика рака простаты.
6. Показано, что у этнических русских сайт в гене SAT1 (rs61748925) и сайт в гене PAOX (rs1139915) являются мономорфными, т.е. они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; а для сайта rs11072170 в гене FMN1 существует полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% - по аллелю A, и 52.8% - являлись гетерозиготными, что позволяет считать его перспективным для изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.
Апробация работы.
Материалы работы докладывались на международных, российских конференциях и на научных съездах, в том числе: XVIII Межд. конф. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, 2010. Украина, Ялта-Гурзуф; Intern. polyamine confer., 2010, Gotemba, Japan; I Межд. научно-практ. конф. Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы, 2010, Москва; Intern. Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, 2012 и др.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, среди которых 3 статьи в рецензируемых профильных журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также 14 тезисов докладов на отечественных и международных научных конференциях.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 128 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (289 ссылок на публикации отечественных и зарубежных авторов). Работа содержит 10 таблиц и 39 рисунков
Материалы и методы ИССЛЕДОВАНИй
Материалами для исследований служили линии культивируемых клеток рака предстательной железы (РПЖ) человека (LNCaP, РС-3), линия гепатомы человека Г-27, и L-клетки крыс.
Бесклеточные тест-системы получали из образцов регенерирующей печени здоровых крыс, а также из пролиферирующей ткани гепатомы крыс линии Г27. В полученных образцах определяли активности ОДК и уровень полиаминов методом ВЭЖХ на аппарате AKTABASIC 10 HPLC (Amersham Pharmacia Biotech., Milan, Италия). Для расчета удельных активностей орнитиндекарбоксилазы (ОДК), выраженных в нанокаталах на миллиграмм белка, определяли концентрации белка в каждой пробе ткани гепатомы Г-27. Определение проводили по фармакопейному методу [Государственная Фармакопея СССР, XI, 1998] по Лоури (1951) в модификации С.П. Сяткина (1981).
В работе проводили исследование биологических эффектов 13 новых синтетических аналогов полиаминов (α-дифторметил-орнитин (ДМФО), метилглиоксальбис-(гуанилгидразон) (МГБГ), 1-аминоокси-3-аминопропан, I, 1,2-диаминооксиэтан, II, S-(5′-дезоксиаденозил)-S-тиоэтилгидроксиламин, III, S-(5′-дезокси-аденозил)-S-метил-β-тиоэтилгидроксиламин, IV, Этилендиамин, V, 1,3-диаминопропан, VI, 1,5-диамино-3-азапентан, VII, 1,9-диамино-3,7-диазанонан, IX, 2-хлоро-N-[(3Z)-3-гидразинилиден-3-фенилпропил]анилин, ДФСА-1, 1-фенил-3-{[3-(трифтор-метил)-фенил]амино}пропан-1-он, ДФСА-2, 3-[(2-фторфенил) амино]-1-фенилпропан-1-он, ДФСА-3, 3-[(4-метилфенил)амино]-1-фенилпропан-1-он, ДФСА-4).
Оценку пролиферативной активности веществ на клетках определяли с помощью набора WST-1 фирмы Millipore (США) по прописям фирмы-изготовителя. Количество метаболически активных клеток в пробах коррелировало с концентрацией формазана, которую измеряли спектрофотометрически с использованием планшетного ридера при 500 нм.
Для определения цитотоксического действия исследуемых веществ использовали флуоресцентный автоматизированный планшетный ридер CellReporterTM (Genetix/Molecular Devices, Англия). Определение цитотоксического эффекта проводили на основании количественного соотношения популяций живых и мертвых клеток в каждой лунке анализируемого планшета. С этой целью в каждую лунку планшета добавляли красители DAPI, и йодистый пропидий (окрашивает только мертвые клетки), по протоколам, рекомендуемым производителем.
Фракционирование белков проводили двумерным электрофорезом по О'Фарреллу в модификации [Kovalyov L.I. et al. 1995]. Детекция белков на гелевых пластинах осуществляли Кумасси голубым R-250, азотнокислым серебром и красителем Sypro Ruby.
Для идентификации белковых фракций обработку гелей, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов выполняли по протоколам Центра протеомных исследований при Институте биомедицинской химии РАМН [Говорун В.М. с соавт. 2003]. Идентификацию белков проводилась с помощью MALDI-TOF MS , а также в отдельных случаях с помощью MALDI-TOF MS/MS.
Материалами для ДНКЦисследований служили образцы венозной крови жителей России - пациентов с РП (n=79) и здоровых мужчин (n=36), охарактеризованных как этнические русские. Препараты ДНК выделяли фенол-хлороформной экстракцией. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-PCR) в модификации метода выщепления 5' концевой метки проводили в приборе фирмы Applera (США), модель 7300, используя наборы реактивов - SNP Genotyping Assay Mix (каталожные номера C__8339558_10, C_25966232_20, C_1895217_10), а также набор TaqMan Universal PCR Master Mix.
Результаты ИССЛЕДОВАНИЙ и ИХ обсуждение
Биотест-системы на основе тканей и культивируемых клеток животных
Бесклеточные тест-системы представляли собой цитозольную фракнцию (20 000 g x 20 мин при 4С) 33% -го гомогената регенерирующей печени или ткани гепатомы белых беспородных крыс - самцов массой 100 - 130 г, содержащихся на стандартном рационе вивария РУДН со свободным доступом к воде, с добавлением необходимых компонентов для проявления активности ОДК. Количество белка в пробах исследуемых тканей определяли по методу Лоури.
Первую группу исследуемых веществ составили оксиамино аналоги декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина. Вторую группу сформировали из алифатических гомологов путресцина (Пут), спермидина (Сд) и спермина (См).
Эффективность антипролиферативного действия соединений оценивали по степени торможения синтеза ПА, а также по величине суммарного пула ПА (ПА) и коэффициента молярного отношения спермидина к спермину (Сд/См), который положительно коррелирует со скоростью пролиферации как нормальной, так и опухолевой ткани [Morgan DM, 1999], после одного часа инкубации. Результаты этих исследований представлены в Таблице. 1.
В первой группе тестируемых веществ наиболее активными оказались соединения I и IV. Они не уступали по эффективности действия, а по некоторым показателям даже превосходили ДФМО и МГБГ (Табл. 1).
Соединения второй группы ингибировали синтез ПА в обеих системах с разной степенью эффективности. Но этилендиамин (V) проявил сильные антипролиферативные свойства по всем выбранным показателям (Сд/См, ∑ПА и уровень Сд), в особенности по отношению к опухолевой ткани.
Таблица. 1. Скорость образования путресцина и ПА на фоне действия синтетических аналогов субстратов и продуктов реакции декарбоксилирования орнитина и S-аденозилметионина в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс.
В-во | ОДК | Эффект в % | Синтез спермидина | Эффект в % | Синтез спермина | Эффект в % |
Бесклеточная тест-система из регенерирующей печени крыс | ||||||
- | 2.7±0.1 | 0 | 1.29±0.04 | 0 | 0.48±0.01 | 0 |
ДФМО | 1.7±0.1* | 37 | 0.87±0.02* | 33 | 0.21±0.01* | 56 |
МГБГ | 2.7±0.1 | 0 | 0.9±0.02* | 26 | 0.31±0.01* | 35 |
I | 1.1±0.1* | 59 | 0.57±0.01* | 56 | 0.1±0.01* | 79 |
IV | 1.7±0.1* | 37 | 0.63±0.02* | 51 | 0.26±0.07* | 46 |
V | 2.3±0.1* | 15 | 0.98±0.02* | 24 | 0.32±0.09 | 33 |
Бесклеточная тест-система из гепатомы Г-27 крыс | ||||||
- | 2.6±0.2 | 0 | 1.1±0.04 | 0 | 0.4±0.01 | 0 |
ДФМО | 2.0±0.1* | 23 | 1.1±0.1 | 0 | 0.2±0.01* | 50 |
МГБГ | 2.7±0.2 | 4 | 0.97±0.02* | 22 | 0.35±0.02* | 25 |
I | 2.0±0.1* | 23 | 1.2±0.04 | +9а | 0.35±0.02* | 25 |
IV | 1.5±.01* | 42 | 0.8±0.01* | 27 | 0.4±0.01* | 0 |
V | 1.6±0.1* | 38 | 0.45±0.01* | 59 | 0.2±0.03* | 50 |
Примечание. Скорость биосинтеза путресцина и ПА представлена в мккат/кг белка. Результаты даны в виде M±m для 6 параллельных измерений. * - достоверные отличия от контроля, Р≤0.05. а - знак У+Ф обозначает увеличение скорости биосинтеза путресцина и ПА.
Сравнительный анализ степени эффективности двух групп тестируемых соединений, проведенный на двух модельных бесклеточных системах с различными биологическими, но с одинаково высокими пролиферативными свойствами, показал, что потенциально сильные антипролиферативные агенты должны одновременно существенно снижать ΣПА, отношение Сд/См и уровень Сд до критического значения (70%). Из числа исследуемых соединений этим требованиям удовлетворяют 1-аминоокси-3-аминопропан (АПА), S-(5′-дезоксиаденозил)-S-метил-β-тиоэтилгидроксиламин (АПА) и этилендиамин.
В дальнейшем характер действия АПА и АМА был изучен на L-клетках. Эти вещества индивидуально и в сочетании одного с другим показали эффект, сходный с ДФМО и МГБГ, но менее выраженный.
Данные, полученные на бесклеточных тест-системах и на культурах клеток, указывают на перспективность дальнейших исследований данной группы оксиаминопроизводных как новых потенциальных противоопухолевых веществ.
Биотест-система на основе быстро пролиферирующих клеток человека.
Для тестирования функциональной активности препаратов полиаминов использовались быстро пролиферирующие культивируемые клетки рака простаты человека линий LNCaP и PC-3.
Оценку пролиферативной активности клеток определяли с помощью набора WST-1. Адекватность работы данной биотест-системы была проверена с помощью акриламида - маркерного амина, для которого известен выраженный цитотоксический эффект. На данной системе препарат акриламида в концентрациях 300 и 350 мкг/мл после 24 часов инкубации оказывал выраженное цитотоксическое действие на клетки LNCaP, проявляющееся в 2-х и 3-х кратном снижении количества метаболически активных клеток, соответственно.
В дальнейшем эту биотест-систему использовали для определения биологических эффектов, вызываемых двумя известными аналогами полиаминов - ДФМО и МГБГ.
Препарат ДФМО в концентрациях 0,1-200 мкМ после 48 часов инкубации не оказывал выраженного действия на культивируемые клетки рака простаты линий LNCaP и PC-3. С другой стороны, для препарата МГБГ выявлен достоверный цитотоксический эффект на данных клеточных линиях в диапазоне концентраций 100-200 мкМ.
На клетках линии РС-3 было проведено тестирование биологических эффектов четырех новых дифенил-содержащих аналогов полиаминов - препаратов ДФСА-1-4. Для проведения тестирования готовили стоковые растворы препаратов с концентрацией 40 мМ на 0,5% растворе ДМСО, стерилизовали в условиях культурального бокса с использованием 0,22 мкм фильтров. Из стерильного стокового раствора на культуральной среде RPMI-1640, содержащей 5% ЭТС, готовили растворы с концентрацией 0,1-400 мкМ. *
Рис. 1. А. Биологическое действие препаратов ДФСА-1 и ДФСА-2 на клетки линии РС-3. Б. Биологическое действие препаратов ДФСА-3, ДФСА-4 на клетки линии РС-3. По оси абсцисс - концентрация препарата в мкМоль.
* - достоверные отличия от контроля, Р≤0.05
Из представленных данных (рисунок 1А, Б) видно, что препараты ДФСА-1, ДФСА-2 и ДФСА-4 оказываю цитотоксический эффект при концентрации 10 мкМ и выше, в то время как для препарата ДФСА-3 цитотоксическое действие отмечается при концентрации 50 кМ и выше.
Изучение апоптотического действия полиаминов ДФМО и МГБГ также проводилось на клеточном сортере CellReporterЩ с использованием дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток.
Количественный анализ доли мертвых клеток в контрольных лунках и в лунках с добавлением ДФМО показал отсутствие значимых различий, что сопоставимо с данными, полученными при окраске клеток красителем WST-1, в то время как после воздействия МГБГ регистрировалось дозозависимое увеличение доли умерших клеток при концентрациях МГБГ 100 и 200 мкМ.
Сформированная биотест-система пригодна для определения функциональной активности синтетических полиаминов и с использованием наборов WST-1, и с помощью флуоресцентного клеточного ридера CellReporterЩ, что позволило использовать ее для изучения 4-х новых синтетических аналогов полиаминов.
Протеомный анализ клеток линии РС-3 и изучение биологических эффектов синтетических аналогов полиаминов.
Учитывая полученные данных о способности изучаемых синтетических аналогов полиаминов ингибировать клеточную пролиферацию, представлялось целесообразным исследовать изменения протеомного профиля клеток рака простаты. На первом этапе данного цикла исследований был проведен протеомный анализ белков в культивируемых клетках линии РС-3. Типичная двумерная электрофореграмма (ДЭ) суммарных белков, экстрагированных из клеток линии РС-3, представлена на Рис. 2.
Как видно из этих данных, на ДЭ суммарных белков, экстрагированных из клеток линии РС-3, удавалось регистрировать более 500 белковых фракций при окраске нитратом серебра. Основные из них обладали Мм в диапазоне 170 - 11 кДа и pI от 4,5 до 11,5. С помощью масс-спектрометрических методов (MALDI-TOF MS и MS/MS) удалось идентифицировать 52 белковые фракции.
Среди идентифицированных белков, в первую очередь, надо отметить № 18, который оказался фактически новым белком человека, поскольку для него ранее был обнаружен только соответствующий транскрипт. Сведения об этом транскрипте, присутствующем в матке, трижды представили японские исследователи по результатам изучения cDNA [запись 193783699 Protein NCBI; прямое представление - KawakamiB. et al. и Isogai T. and Yamamoto J.)].
Вероятный продукт, который может образоваться при считывании информации с указанного транскрипта, включен в базу данных Protein NCBI под названием неназванный белковый продукт (unnamed protein product). Анализ его предполагаемой аминокислотной последовательности выявил сходство с митохондриальной аспартатаминотрансферазой (ген - GOT2), что дало основание предполагать принадлежность этого неназванного белкового продукта к семейству аминотрансфераз.
Среди идентифицированных белков оказалась также дисульфид изомераза белков или ER-протеаза, которая ранее была включена в перечень потенциальных биомаркеров РП [Шишкин С.С. с соавт. 2010].
В целом, полученные результаты протеомного анализа суммарных белковых экстрактов из клеток линии РС-3 были использованы для расширения информационного модуля Белки РС-3 в отечественной базе данных Протеомика рака простаты (версия 2012 г.), которая размещена на сайте Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, зарегистрирована в Государственном реестре баз данных (регистрационный номер 2012620676 от 13.07.2012) и доступна для пользователей сети Интернет (адрес: ef.inbi.ras.ru).
Эти результаты стали основой для проведения следующего цикла исследований, направленных на определение изменений протеомного профиля этих клеток после воздействия двумя синтетическими аналогами полиаминов ДФСА-1 и 2.
Рис. 2. Результаты протеомного анализа суммарных белков клеточной линии РС-3. Типичная ДЭ, окрашенная нитратом серебра. Слева показаны белки-маркеры Мм в кДа (набор ) Фиолетовыми стрелками и цифрами обозначены фракции, идентифицированные методами масс-спектрометрии.
В этих экспериментах клетки РС-3 сначала культивировали в пластиковых матрацах в среде RPMI-1620 с 20% ЭТС. По достижении 80% монослоя проводили смену среды на среду с 5% ЭТС, содержащей исследуемые препараты ДФСА-1 или ДФСА-2 в конечных концентрациях 10 мкМ, в которых они обладают цитостатическим эффектом.
После 96 часов инкубации со сменой среды со свежеприготовленными аналогами полиаминов по истечении 48 ч инкубации матрацев клетки отмывали трехкратно холодным фосфатно-солевым буфером и снимали с поверхности культурального пластика скребком для клеток (23 см, Thermo Fisher Scientific, США). Получившуюся клеточную суспензию центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин (Elmi, Латвия), супернатант удаляли. Осадок количественно (около 40 млн. клеток) переносили в пробирки Эппендорф и замораживали при -20С.
При сравнении полученных ДЭ белковых экстрактов из клеток, обработанных ДФСА-1, с ДЭ контрольных экстрактов были обнаружены существенные изменения в распределении белков на двух участках, обозначенных А и Б. Для проведения дальнейшего сравнительного анализа с помощью компьютерной денситометрии требовалось выявить на этих участках общие белковые фракции с помощью масс-спектрометрической идентификации ряда белковых фракций, расположенных на выбранных участках.
Важно отметить, что по результатам масс-спектрометрического анализа (MALDI-TOF MS и MS/MS) один из белков на ДЭ экстрактов из РС-3 клеток, обработанных ДФСА-1, был идентифицирован как безымянный белок из семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом (16552153 Protein NCBI). Из Рис. 3 видно, что, несмотря на сравнительно небольшое покрытие предсказанной аминокислотной последовательности выявленными триптическими пептидами (17%), полученный высокий показатель счёта очков (Score = 235) позволяет считать проведенную идентификацию вполне достоверной.
Регистрация в базе данных Protein NCBI (№16552153) рассматриваемого безымянного белка как представителя семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом состоялась по материалам изучения кДНК, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови [Isogai T. et al. 24-OCT-2001].
Таким образом, полученные результаты протеомного исследования клеток РС-3 являются первой прямой регистрацией человека белка с указанными свойствами, которые подтверждают сделанное ранее предположение японских авторов по материалам изучения кДНК.
Рис. 4. Результаты сравнительного протеомного анализа фрагментов Б на ДЭ белковых экстрактов из клеток без воздействия (контроль) и белковых экстрактов из клеток, подвергавшихся воздействию ДФСА-1 и ДФСА-2. Справа изображения ДЭ, слева трехмерные модели, построенные с помощью программы ImageMaster 2D Platinum 7.0 (фирма Genebio, Швейцария).
Синими стрелками и символами показаны основные реперные белки (SFPQ - фактор сплайсинга, содержащий пролин-глутаминовый тракт; PABP - поли(А)-связывающий цитоплазматический белок 1; зелеными стрелкам и символами SNW - SNW домен содержащий белок 1, количественно увеличившиеся под действием ДФСА-2; фиолетовыми стрелками - белки №8 и 9, появившиеся под действием ДФСА-1 и ДФСА-2. Пунктирными овалами (фиолетового цвета) выделены области на контрольной ДЭ, где отсутствуют белковые фракции, индуцируемые ДФСА-1 и ДФСА-2.
В целом, сравнительный протеомный анализ указанных фрагментов А и Б на ДЭ белковых экстрактов из клеток, не подвергавшихся воздействию синтетическими аналогами полиаминов (контроль) и белковых экстрактов из клеток, подвергавшихся воздействию ДФСА-1 и 2, пока зал несколько специфичных изменений в белковых профилях, вызванных этими соединениями.
Во-первых, ДФСА-1, обладающий значимым цитостатическим эффектом при концентрации 10 мкМ, существенно индуцировал синтез винкулина, тогда как ДФСА-2 в той же концентрации с небольшим цитостатическим действием) не оказывал влияния на содержание винкулина. Во-вторых, под действием ДФСА-1 в клетках РС-3 появлялась дополнительная белковая фракция, которая была идентифицирована как АТФ-аза транзита эндоплазматического ретикулума. В-третьих, этот синтетический аналог полиаминов приводил к исчезновению неидентифицированного белка, располагавшегося между HSPD1 и HSPA9 на контрольных ДЭ. При этом белок с близкими электрофоретическими свойствам выявлялся после воздействия ДФСА-2. На фрагментах Б под действием ДФСА-1 (а также и ДФСА-2) появлялись два дополнительных по сравнению с контролем белка №8 и 9 (Рис. 4). ДФСА-2 обладал более выраженным индуцирующим эффектом в отношении белков №8 и 9. Кроме того, регистрировалось количественное увеличение ещё одной фракции, идентифицированный как SNW домен содержащий белок 1.
Интересно то, что все три изменяющиеся белковые фракции, которые удалось идентифицировать на фрагментах Б, связаны (или могут быть связаны) с процессами созревания мРНК, включая сплайсинг. Тем самым эти данные позволяют думать, что ДФСА-1 и ДФСА-2 способны влиять на биосинтез белков.
По результатам модельных экспериментов и протеомного анализа белков клеток РС-3 определены шесть белков, количественно изменяющихся под действием ДФСА-1 и 2.
Изучение полиморфизма генов PAOX, SAT1 и FMN1 в выборке пациентов c раком простаты и у здоровых россиян.
Изучение однонуклеотидных замен в трех генах - SAT1 и PAOX, кодирующих ключевые ферменты метаболизма полиаминов (спермидин/спермин N-ацетилтрансферазу и полиаминоксидазу, соответственно) и FMN1, кодирующего формин 1, проводили методом дискриминации аллелей на амплификаторе в реальном времени фирмы Applied Biosystems RT-PCR 7300 с использованием наборов TaqMan (C__25966232_20, C__8339558_10, С_16193337_10) и набора для амплификации TaqMan Universal PCR Master Mix, No Am-pEraseUNG.
Проведенное исследование, охватившее более ста лиц (т.е. более 200 соответствующих генов) показало, что в изученных выборках в сайте rs61748925 присутствовал только аллель G, а в сайте rs1139915 только аллель T. Было установлено, что у этнических русских сайты rs61748925 SAT1 и rs1139915 PAOX являются мономорфными и не пригодны для изучения ассоциаций с РП. В отличие от этого для сайта rs11072170 в гене FMN1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% - по аллелю A, и 52.8% - являлись гетерозиготными. Соответственно, полиморфный сайт rs11072170 представляется перспективным для изучения у русских возможных ассоциаций его аллелей с РП.
ВЫВОДЫ
1. Изучено влияние на общий пул природных полиаминов, на соотношение спермидина к спермину и синтез полиаминов в условиях бесклеточной системы у ряда синтетических аналогов полиаминов: ДФМО, МГБГ, o-замещенных гидроксиламинов и алифатических гомологов природных полиаминов. Показано, что соединения 1-аминоокси-3-аминопропан, S-(5′-дезоксиаденозил)-S-метил-β-тиоэтилгидроксиламин и этилендиамин обладают максимальным эффектом по изучавшимся критериям.
2. В модельных условиях (на культивируемых L-клетках) О-замещенные производные гидроксиламины (1-аминоокси-3-аминопропан и 5′-дезоксиаденозил-5′-метилтиоэтилгидроксиламин) показали себя как антипролиферативные агенты.
3. Разработана биотест-система на основе быстро пролиферирующих, культивируемых клеток человека (биотест-объекты - клетки LNCaP и РС-3; метод тестирования - витальная система регистрации количества клеток). С её помощью определены биологические эффекты, вызываемые двумя известными синтетическими полиаминами (ДФМО и МГБГ) и четырьмя новыми синтетическими дифенил-содержащими аминами (ДФСА 1-4).
4. Наиболее выраженное антипролиферативное действие выявлено у ДФСА-1 (80% ингибирование роста клеток при 10 мкМ концентрации), тогда как ДФМО (в диапазоне концентраций 10-400 мкМ) не проявлял функциональной активности, а у МГБГ был зарегистрирован цитотоксический эффект только в концентрациях 200-400 мкМ, что позволяет рассматривать ДФСА-1 как наиболее перспективный цитотоксический агент.
5. По результатам протеомного анализа белков клеток РС-3:
а) выявлено два новых (лбезымянных) белка человека; б) определены шесть белков, количественно изменяющихся под действием ДФСА-1 и ДФСА-2; в) расширен информационный модуль в отечественной базе данных Протеомика рака простаты.
6. По результатам изучения полиморфизма (однонуклеотидных замен) установлено, что у этнических русских сайты rs61748925 SAT1 и rs1139915 PAOX являются мономорфными и они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; в отличие от этого для сайта rs11072170 в гене FMN1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% - по аллелю A, и 52.8% - являлись гетерозиготными, что позволяет считать его перспективным для изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.
Работа выполнялась в рамках Государственных контрактов № 2.1.1./ 5939 и № 2.1.1./ 11377 Исследование технологий по созданию новых классов противоопухолевых средств на базе обмена полиаминов как системы опосредованной регуляции химическими веществами процессов клеточной и опухолевой пролиферации и дифференцировки аналитической ведомственной целевой программы УРазвитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)Ф
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ:
1. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Гридина Н.Я., Неборак Е.А., Шевкун Н.А., Сокуева Н.А., Устинова Е.В., Сокуев Р.И. Влияние химических аналогов полиаминов, декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина на скорость синтеза полиаминов в тест-системах из тканей с повышенной пролиферацией // Вестник РУДН. Серия МЕДИЦИНА. - 2010. - № 3, С. 9-14.
2. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Гридина Н.Я. Неборак Е.А., Шевкун Н.А., Сокуева Н.А., Устинова Е.В., Сокуев Р.И. Влияние химических аналогов декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина на рост L-клеток в культуре ткани // Вестник РУДН. Серия МЕДИЦИНА. - 2010. - № 4, С. 26-31.
3. Сяткин С.П., Неборак Е.В., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Левов А.Н., Р.И., Сокуева Н.А. Прогнозирование антипролиферативных свойств производных анилинового ряда диоксаборининопиридина путем оценки их влияния на скорость окислительного дезаминирования путресцина и полиаминов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, , 2011. - №10, С. 53-56.
Другие печатные материалы:
4. Сяткин С.П., Левов А.Н., Федорончук Т.В., Неборак К.В., Шевкун Н.А., Устинова Е.В., Сокуев Р.И., Сокуева Н.А. Прогноз канцерогенных и антипролиферативных свойств производных диоксаборенинопиридина и анилина // Труды XVIII Международной конференции и дискуссиионного научного клуба Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. ТОМ 1. IT + M&Ec`2010. Украина, Ялта-Гурзуф, c 31 мая по 9 июня 2010 года.
5. Syatkin, S.P., Fedoronchuk, T.V., Gridina. N.Ya., Neborakh, E.A., Shevkhun, N.A., Sokueva, N.A., Ustinova, E.V., Sokuev, R.I. The influence of chemical polyamines analogues, decarboxylated ornithine and S-(adenosyl)-methionine on the polyamine synthesis velocity in test-systems from tissues with high proliferation // International polyamine conference. Gotemba, Shizuoka, Japan, June 14 - June 18, 2010. P. 102-103.
6. Syatkin S, Shevkun N, Fedorontchuk T, Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Ustinova E. Activators of polyamine oxidative deamination as the potential antitumor agents // 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases, Rome, Italy, December, 2010. Р. 213-214
7. Syatkin S, Shevkun N, Levov A, Golomazova K, Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Fedorontchuk T, Ustinova E. Prediction of carcinogenic and antiproliferative properties of benzimidazole, azofluorene, dioxaboreninopyridine and aniline derivatives by their effects on the polyamine oxidative deamination // 2nd International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and other Diseases, Rome, Italy, December, 2010. Р. 209-210
8. Shevkun N., Neborak E, Sokueva N, Sokuev R, Golomazova K, Fedoronchuk T. Screening of N-heterocyclic compounds and aniline derivatives for their effects on the aminooxidases in vitro // IV International Scientific Conference Science4health, Moscow, Russia, April, 2012. P. 53.
9. Shevkun N, Fedoronchuk T, Neborak E, Sokueva N, Sokuev R. Targeting polyamine catabolism in malignant hepatic tissue // IV International Scientific Conference Science4health, Moscow, Russia, April, 2012. P. 54.
10. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Сокуева Н.А. Противоопухолевая активность активаторов окислительного дезаминирования полиаминов. // XX Юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 5 - 15 июня 2012 г. - c. 98-99.
11. Syatkin S., Neborak E., Shevkun N., Sokueva N., Sokuev R., Golomazova K., Fedoronchuk T. Screening of n-heterocyclic compounds and aniline derivatives fro their effects on the amine oxidases in vitro as useful tools for prediction of carcinogenic and antiproliferative activity // International Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, 2012. - P. 34.
12. Syatkin S., Fedoronchuk T., Neborak E., Sokueva N., Sokuev R., Shevkun N. Antitumor activity of activators of polyamine oxidative deamination during hepatocarcinogenesis // International Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, 2012. Abstract book. - p. 225 - 226.
13. Cяткин С.П., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Сокуева Н.А. Противопухолевая активность активаторов окислительного дезаминирования полиаминов // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. 2012. С. 19.
14. Шевкун Н., Неборак Е., Сокуева Н., Сокуев Р., Голомазова К., Федорончук Т. Скрининг N-гетероциклических и анилиновых производных по влиянию на аминооксидазы in vitro. // SCIENCE4HEALTH 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины.: Материалы IV Международной научной конференции. 18 - 21 апреля 2012 г., РУДН, Москва. - М.: РУДН. 2012. - C. 57-58.
15. Шевкун Н., Федорончук Т., Неборак Е., Сокуева Н., Сокуев Р. Катаболизм полиаминов при карциногенезе печени как мишень для поиска новых противораковых соединений // SCIENCE4HEALTH 2012. Клинические и теоретические аспекты современной медицины.: Материалы IV Международной научной конференции. 18 - 21 апреля 2012 г., РУДН, Москва. - М.: РУДН. 2012. - 58-59 сс.
16. Сяткин С.П., Федорончук Т.В., Шевкун Н.А., Неборак К.В., Сокуев Р.И., Сокуева Н.А. Активаторы окислительного дезаминирования как потенциальные противоопухолевые агенты // Scientific and educational journal: Материалы конференции Health and education millenium: 2012. РУДН. Москва. - М.: РУДН. 2012. - Т. 14 [2]. С. 58.
17. Сокуева Н.А., Крахмалева И.Н., Лисицкая К.В., Шишкин С.С. Изучение полиморфизма генов PAOX, SAT1 и FMN1 // Материалы XIV Всемирного конгресса Здоровье и образование в XXI веке, 2012. РУДН. Москва. - М.: РУДН. 2012. - С. 58.
Сокуева Наталья Александровна
Изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в модельных системах
В данной работе проводилось изучение биологических эффектов ряда синтетических аналогов полиаминов на бесклеточной тест-системе, полученной из регенерирующей печени и клеток гепатомы крыс и на клеточных тест-системах (клетки линий рака простаты PC-3 и LNCaP). C помощью протеомного анализа было показано влияние 2-х препаратов синтетических аналогов полиаминов на белковый профиль клеток линии PC-3.
Sokueva Natalia Aleksandrovna
The study of cytostatic and other biological effects of some synthetic polyamines in model systems
This work is devoted to the study of biological effects of a number of synthetic polyamine analogues on cell-free test systems obtained from regenerating liver and hepatoma cells of rats, as well as on cellular test systems (the cells of prostate cancer cell lines PC-3 and LNCaP). The influence of two preparations of synthetic polyamine analogues on the protein profile of PC-3 cells was studied using proteomic analysis.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии