Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

Коханенко Алина Андреевна

Изменение пространственной организации хромосомы 6 в ядрах трофоцитов и клеток слюнных желез Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera: Calliphoridae) в процессе политенизации

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Томск 2012

Работа выполнена в лаборатории эволюционной цитогенетики Научно-исследовательского института биологии и биофизики Томского государственного университета, г. Томск.

Научный руководитель:  доктор биологических наук,

Стегний Владимир Николаевич

Официальные оппоненты: Демаков Сергей Анатольевич

доктор биологических наук, заведующий лаборатории хромосомной инженерии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Баричева Элина Михайловна

кандидат биологических наук, заведующий лаборатории механизмов клеточной дифференцировки, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук,  г.аНовосибирск.

Ведущее учреждение:        Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук, г.аМосква

Защита диссертации состоится л______________2012 г. на заседании диссертационного совета Д.003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г.аНовосибирск, пр. ак. Лаврентьева, д. 10. тел/факс (383)3634906, факс (383)333-12-78; е-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан л______________2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук                                Хлебодарова Т.М.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Пространственная организация хромосом в ядре является одной из ключевых проблем современной клеточной биологии. Утверждение, что хромосомы занимают в интерфазном ядре определенные хромосомные территории в настоящий момент не подвергается сомнению и экспериментально доказано для клеток большинства животных (Cremer, 2001), растений (Pecinka et al., 2004; Berr et al., 2006), а также одноклеточных эукариот, таких как почкующиеся и делящиеся дрожжи (Bystricky et al., 2005; Molnar, Kleckner, 2008). В основе трехмерной организации интерфазного ядра эукариот лежит дифференциальное позиционирование различных районов хромосом относительно друг друга и ядерной оболочки. Известно, что гены, хромосомные сегменты и геном как целое, трехмерно упорядочены в пространстве ядра, и их специфические ассоциации, очевидно, позволяют регулировать позиции определенных генных продуктов внутри ядра и их транспорт в цитоплазму. Жёсткая пространственная организация и функциональность ядра обеспечиваются наличием двух типов связей - межхромосомных взаимодействий (Куличков, Жимулев, 1976) и хромосомно-мембранных (Стегний, 1979).

Муха Calliphoraаerythrocephala является интересным объектом с точки зрения изучения пространственной организации хромосом в ядре. У C.аerythrocephala политенные хромосомы обнаружены в ядрах клеток слюнных желез (Handa et al., 1981), клетках эпидермиса (Pearson, 1974), трофоцитах (Ribbert, Bier, 1969), трихогенных клетках (Ribbert, 1967), клетках мальпигиевых сосудов (Thomson, Gunson, 1970). Выявляются четкие тканеспецифичные особенности в степени политении и типе организации политенных ядер, что вероятно связано с разным функциональным значением этих тканей. В ядрах клеток слюнных желез C.аerythrocephala на всех этапах политенизации выявляются политенные хромосомы. Синапсис хроматид у таких хромосом ослаблен, хромосомы рыхлые. Поперечный рисунок сохраняется только в области наиболее крупных дисков. Организация ядер трофоцитов существенно отличается от стандартных типов организации политенного ядра. В ядрах трофоцитов политенные хромосомы в ходе эндоредупликации претерпевают ряд морфологических изменений (Bier, 1957). На начальных этапах политенизации ядра трофоцитов организованы в первичную ретикулярную структуру, далее в ходе эндоредупликации происходит формирование политенных хромосом, затем, помпоновидных хромосом. Помпоновидные хромосомы декомпактизуются и происходит формирование ядра с ретикулярной структурой, но только с высоким уровнем политении.

Столь существенные различия в характере организации хромосом в ходе политенизации в органах одного организма, вероятно, связаны с функциональной особенностью данных типов клеток и, следовательно, особенностью функционирования генома.

Ранее было показано, что в ядрах трофоцитов C.аerythrocephala взаиморасположение хромосом подчиняется определенным закономерностям. Центромерные районы хромосом трофоцитов не объединены в хромоцентр и рассредоточены в пространстве ядра. Хромосома 6 всегда связана тонким тяжом с хромосомой 2. Хромосома 4 располагается рядом с хромосомой 3 и 5, а 5 - с хромосомой 1. Таким образом, зачастую можно обнаружить следующее ассоциированное распределение хромосом: 6 - 2, 4 - 3, 5 - 1 (Стегний и др., 1999). Было показано, что хромосомы 3 и 6 сохраняют локальные хромосомные территории в объеме ядра на протяжении всего процесса политенизации ядер трофоцитов (Ананьина, 2005). Эти результаты по пространственной организации ядер трофоцитов С.аerythrocephala были получены на давленых препаратах ядер на стадии с политенными хромосомами. Как известно, ядро трехмерно и поэтому наиболее полное представление о расположении хромосом может быть получено только при изучении трехмерного пространства ядра.

В работах Бойса (Boyes at al., 1975) было показано, что хромосома 6 C.аerythrocephala содержит гены рРНК, транскрипция которых сопровождается образованием ядрышка. Однако, до сих пор не было получено данных относительно того, только ли хромосома 6 является ядрышкообразующей.

Ядрышко - эволюционно-консервативный и наиболее крупный структурный домен клеточного ядра, который принято называть фабрикой рибосом (Olson et al., 2002; Andersen et al., 2005). За последние годы получены убедительные доказательства того, что большое количество биологических процессов, таких как старение клеток, модификация РНК, контроль клеточного цикла и ответ на стрессирующие факторы регулируется ядрышком (Olson, 2002; Tschochner, 2003; Grummt, 2005; Boisvert, 2007; Mayer, 2005; Sirri, 2008; McKeown, Shaw, 2009). Эти наблюдения позволяют говорить о многофункциональности ядрышка и его основных белков. Кроме того, было показано, что в клетках человека ядрышко и ядерная оболочка являются своеобразным каркасом для организации ядра (Chubb et al. 2002). Не вызывает сомнения, что ядрышко играет важную роль в пространственной организации ядра. Однако, как происходит влияние ядрышка на архитектуру ядра все же остается не известно. Понимание законов организации хромосом в пространстве ядра и роли ядрышка в этом процессе существенно приблизит к разгадке принципов реализации генетического материала в ядре.

В настоящее время успехи молекулярной биологии в сочетании с развивающимися технологиями позволяют изучать организацию хромосом в трехмерном пространстве ядра. Это достигается путем получения серии оптических срезов ядра при помощи специальных микроскопических подходов. Дальнейшая их реконструкция и моделирование объемного изображения позволяют детально анализировать пространственную организацию хромосом в ядре.

Изучение организации хромосомы 6 и ядрышка в пространстве ядер трофоцитов и клеток слюнных желез C.аerythrocephala имеет большое значение для понимания особенностей организации и функционирования генома в ядрах соматических клеток и клеток генеративной системы, клеток с разной морфологической структурой политенных хромосом, выполняющих разные функции.

Цель работы

Целью исследования является анализ организации ядрышкообразующей хромосомы 6 и ядрышка в пространстве ядер трофоцитов и клеток слюнных желез С.аerythrocephala с разным уровнем политенизации. Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. В пространстве ядер трофоцитов C.аerythrocephala изучить организацию ядрышкообразующей хромосомы 6 и генов рРНК в ходе политенизации с помощью метода 3D флуоресцентной in situ гибридизации (3D FISH).

2. В пространстве ядер клеток слюнных желез C.аerythrocephala изучить организацию ядрышкообразующей хромосомы 6 и генов рРНК в ходе политенизации с помощью метода 3D флуоресцентной in situ гибридизации (3D FISH).

3. Определить локализацию кластера генов рРНК в пространстве ядер трофоцитов и клеток слюнных желез C.аerythrocephala.

4. Провести анализ пространственной организации ядрышка в ядрах трофоцитов и клеток слюнных желез C.аerythrocephala с разным уровнем политенизации с помощью окрашивания недавленных препаратов ядер азотнокислым серебром.

Научная новизна

Установлено, что ядрышкоорганизующей хромосомой у C.аerythrocephala является только хромосома 6, так как кластер генов рРНК локализован исключительно в пределах хромосомной территории хромосомы 6. Впервые показано, что в ходе политенизации ядер происходит изменение организации ядрышкоорганизующей хромосомы 6 как в ядрах соматических клеток, так и клеток генеративной системы C.аerythrocephala (клетки слюнных желез и трофоциты). Показано, что распад ядрышка, занимающего центральное положение в ядре на начальных этапах политенизации на микроядрышки, распределенные в пространстве ядра в высокополитенных ядрах, коррелирует с изменением организации ядрышкоорганизующей хромосомы 6.

Научно-практическая значимость работы

Результаты проведенного исследования позволяют расширить представления о закономерностях пространственной организации хромосом в ядре эукариотических организмов. Результаты данной работы могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии для студентов биологических факультетов.

Положения, выносимые на защиту

1. Ядрышкоорганизующей хромосомой у C.аerythrocephala является хромосома 6;

2. Процесс  политенизации ядер трофоцитов и клеток слюнных желез  сопровождается перемещением хромосомы 6 и рибосомных генов на периферию ядра и  распадом ядрышка на микроядрышки.

Апробация работы

Полученные результаты исследования были представлены: на международной научной студенческой конференции Студент и научно-технический прогресс (Новосибирск, 2009); на международной конференции Хромосома-2009 (Новосибирск, 2009); на международной конференции молодых ученых "Биология: от молекулы до биосферы" (Харьков, Украина, 2009); на международной конференции по кариосистематике KARYO V (Новосибирск, 2010); на международной научной конференции Молодежь и прогресс в биологии (International scientific conference Youth and progress of biology), (Львов, Украина, 2011); По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 5 статей в журналах перечня ВАК.

Вклад автора

Основные результаты работы были получены автором самостоятельно. Анализ ультраструктуры ядер трофоцитов C.аerythrocephala проводился совместно с А.А. Миллером (НПО Вирион, г.аТомск).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 118 страницах, содержит 16 рисунков. В списке литературы приведено 198 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.Объект исследования

Объектом настоящего исследования является муха Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera: Calliphoridae). Для исследования использовали слюнные железы личинок разных возрастов и трофоциты яичников имаго от 2 до 5 дней после выхода из пупария. Материал был взят из лабораторной культуры.

2. Получение хромосомоспецифичной ДНК хромосомы 6

ДНК хромосомы 6 была получена ранее Рубцовым Н.Б. методом микродиссекции материала политенных хромосом (Рубцов и др., 1999). FISH ДНК хромосомы 6 с политенными хромосомами показал, что зонд является хромосомоспецифичным (Вассерлауф и др., 2003; Ананьина и др., 2005).

3. Приготовление ДНК-зонда хромосомы 6 С. erythrocephala

ДНК-зонд для 3D FISH из микродиссектированной ДНК хромосомы 6 готовили прямым мечением с использованием частично вырожденного праймера MW6 (5Т-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3Т) в DOP-ПЦР (Рубцов и др., 1999). В качестве модифицированного нуклеотида использовали TAMRA-15-дУТФ.

4. Амплификация кластера рибосомных генов С.аerythrocephala

Рибосомная ДНК С.аerythrocephala была получена с помощью ПЦР геномной ДНК в присутствии олигонуклеотидных праймеров (СибЭнзим-Нск): 18 Sai F (5'-CCTGAGAAACGGCTACCACATC-3Т); 18 Sbi R (5Т-GAGTCTCGTTCGTTATCGGA-3Т). Праймеры фланкируют ген 18S рРНК (Whiting et al., 1997). Геномная ДНК была получена из яичников С.аerythrocephala с помощью набора для выделения ДНК Invisorb Spin Tissue Mini Kit (Invitek) по протоколу, рекомендованному производителем. Условия ПЦР включали: денатурацию ДНК 95 C - 3 минуты, затем 25 циклов: 95 C - 1 минута, 55 C - 45 секунд, 72 C - 2 минуты. Терминальная элонгация 72 C - 8 минут.

5. Получение ДНК-зонда рДНК С. erythrocephala

ДНК-зонд рДНК С. erythrocephala готовили в реакции ПЦР с использованием в качестве модифицированного нуклеотида биотин-11-дУТФ (Fermentas). Условия ПЦР были идентичны описанным в разделе 4.

6. Двуцветная 3D флуоресцентная in situ гибридизация (3D FISH) ДНК хромосомы 6 и генов рРНК с политенными хромосомами трофоцитов и клеток слюнных желез С.аerythrocephala

За основу методики 3D FISH, которая использовалась в работе, был взят описанный в литературе протокол (     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии