Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Дерюгина Анна Вячеславовна
Исследование типовых изменений электрокинетических свойств эритроцитов в норме и при альтерации функций организма
03.03.01 - физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Нижний Новгород 2012
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского - Национальном исследовательском университете
Научный консультант:
заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Крылов Василий Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Копытова Татьяна Викторовна доктор биологических наук, профессор Гелашвили Давид Бежанович доктор медицинских наук, профессор Левин Григорий Яковлевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития
Защита состоится л___ _____________2012г. в_____часов на заседании диссертационного совета Д.212.166.15 при Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр.Гагарина, д.23, корп.1, биологический факультет. Факс: (8312)65-82-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.
Автореферат разослан л___ ___________________2012г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент С.В.Копылова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы Проблема изучения и профилактики стресса на современном этапе развития общества является одной из важных проблем физиологии и медицины. Количество физиологических и психоэмоциональных стресс-факторов в современных условиях постоянно возрастает. Это обстоятельство приводит к развитию нарушения адаптационных возможностей в организме, что, в свою очередь, может привести к развитию заболеваний различной этиологии (Chrousos, Gold, 1992; Барабой, 2006). В современной науке прослеживается тенденция выявления специфических изменений организма при его альтерации. Логично предположить, что множественность реакций в каждом конкретном случае является отражением единого общебиологического процесса, связанного с развитием типовых защитных и компенсаторно-приспособительных реакций организма в ответ на альтерирующее воздействие. В связи с изложенным, актуальность приобретает изучение общих закономерностей, происходящих в организме человека и животных процессов, что связанно как с развитием теоретических представлений о развитии адаптационного процесса, так и при поиске эффективных корригирующих способов воздействия на организм при альтерации его систем. Адаптивный или повреждающий эффект любого фактора, а тем более комплекса факторов, как стресс, реализуется в условиях целостного организма опосредованно - через мембранные системы клеток. Состояние мембраны во многом определяет протекание физиологических и биохимических процессов и тем самым является исходным звеном в сложной цепи приспособительных модификаций на всех уровнях (Рязанцева и др., 2004). В этом плане эритроцитарные мембраны представляют собой удобный объект исследования, поскольку отражают общие принципы структуры мембран клеток организма. Кроме того, они обладают такими преимуществами как простота выделения, стабильность в искусственной среде, своеобразие организации, не усложненной внутриклеточными мембранами, вследствие отсутствия органелл и ядерного аппарата (Гильмутдинов, 1994;
Takakuwa, 2001; Новицкий и др., 2006).
Биологическое состояние мембраны клетки напрямую связано с поверхностным зарядом, о наличии которого можно судить по электрофоретической подвижности клеток (Харамоненко, Ракитянская, 1974; Козинец и др., 2007). В последнее время анализу электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ) как одному из жизненно важных параметров гомеостаза человека уделяется повышенное внимание (Nihei et al., 2008). Это связано с тем, что регистрация перемещения клеток крови в электрическом поле позволяет оценить не только их электрокинетический потенциал и, следовательно, морфофункциональное состояние мембран, но и состояние гомеостаза организма в целом.
Например, снижение отрицательного заряда и, как следствие, ЭФПЭ определяет повышение агрегабельности эритроцитов (Левин, Шереметьев, 1981; Vicant, 1994), свидетельствуя о нарушении реологических свойств крови (Викулов и др., 2003), изменяя не только вязкость и структуру крови, но и инициируя процесс тромбообразования (Stoltz, Donner, 1991). Установлены выраженные изменения ЭФПЭ крови у больных при различных видах патологии органов и систем организма (Козинец, 2008). Важно отметить, что анализ литературных данных свидетельствует об однообразной реакции подвижности эритроцитов - ее снижении при самых разных заболеваниях: у пациентов, страдающих хронической почечной недостаточностью (Бирюкова и др., 2003), с заболеваниями органов дыхания (Аладашвили и др., 2003), при интоксикациях (Dobrzynska et al, 2006;
Козинец и др., 2007), ишемической болезни сердца (Махнева, 2011), сердечно-сосудистых (Шилов и др., 2004; Пантюхина и др., 2010) и онкологических заболеваниях (Veshapidze et al, 2007), физических нагрузках и психическом напряжении (Шамратова, 2002).
Однонаправленность изменения ЭФПЭ при различных видах заболеваний позволяет предположить, что изменение ЭФПЭ является отражением общих закономерностей изменения гомеостаза организма. В связи с тем, что в основе многих патологических процессов лежит развитие разной степени выраженности стресса, можно ожидать, что изменение ЭФПЭ является ранним критерием стресс-реакции и возникающей альтерации.
Однако процессы, происходящие на мембранном уровне, и механизмы, вызывающие изменения ЭФПЭ, связанные с тем или иным видом патологии, мало изучены.
Очевидно, что развитие различных по патогенезу патологических процессов и состояний сопровождается молекулярными изменениями плазматических мембран клеток, являющихся как непосредственной мишенью повреждающего действия патогенных факторов, так и вовлеченных в патологический процесс, в связи с инициацией универсальных механизмов повреждения клетки (Kiefer, Snyder, 2000). Между тем традиционный анализ структурно-функционального состояния клеток, проводимый сразу после воздействия стресс-фактора, не только не дает исчерпывающей информации о состоянии организма, но и нередко маскирует реальную картину происходящих изменений. С позиций развития общего адаптационного синдрома, следует подчеркнуть, что электрокинетический потенциал эритроцитов, отражающий морфофункциональное состояние их мембран, зависит от состояния организма в целом и требует исследования морфофункциональных характеристик клеток в динамике развития адаптационного процесса, с учетом последовательного включения стресс-реализующих систем организма, в частности симпато-адреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (Меерсон, Малышева,1993; Kamal еt all., 2001). Проведение комплексного анализа изменения электрокинетических свойств клеток и их морфофункциональных свойств позволит получить обобщающие положения о базисных механизмах и общих закономерностях реагирования клеточных систем при патологии разного генеза, развитии стресс-реакции и адаптационных процессов. Раскрытие ключевых универсальных механизмов адаптационных перестроек клеточных мембран крайне важно при разработке диагностики развития патологического процесса, и патогенетически обоснованной стратегии восстановления функциональных свойств клеток при патологии.
В связи с вышеуказанным, целью работы явилось изучение электрокинетических свойств эритроцитов крови человека и животных, их взаимосвязь со структурнофункциональным состоянием мембран эритроцитов в норме и при альтерации функций организма.
Для достижения данной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить динамику изменения электрокинетических свойств эритроцитов по ЭФПЭ в процессе развития стресс-реакции организма человека и животных при действии различных экстремальных факторов.
2. Провести сравнительное исследование ЭФПЭ крови животных разных таксономических групп при развитии у них стресс-реакции.
3. Выявить закономерности изменения электрокинетических и структурнофункциональных трансформаций мембран эритроцитов при активации симпатоадреналовой и гипофизарно-надпочечниковой систем организма.
4. Исследовать модификацию белок-липидного спектра мембран, изменение процесса ПОЛ и состояния системы глутатиона в эритроцитах, активность Na-К-АТФазы, трансформацию морфометрических показателей клеток при различных видах альтераций организма.
5. Оценить взаимосвязь ЭФПЭ со структурно-функциональными свойствами эритроцитарных мембран на фоне общих неспецифических адаптационных реакций организма при изучаемых видах воздействия.
6. Изучить морфофункциональные характеристики эритроцитов крови животных и человека в динамике восстановления нарушенных функций организма фармакологическими и физиотерапевтическими средствами.
7. Проанализировать возможность использования исследования ЭФПЭ в качестве раннего и значимого критерия развития стресс-реакции в организме, характеристики тяжести и динамики альтерационного процесса и эффективности корригирующих воздействий.
Научная новизна Впервые проведен комплексный анализ изменения электрокинетических свойств эритроцитов и их взаимосвязь с модификацией морфофункциональных характеристик мембраны на различных экспериментальных моделях напряжения и нарушения функций организма крыс разного патогенеза, а также при исследовании патологии у людей.
Впервые выявлена фазность изменения ЭФПЭ, зависящая от включения ведущих нейрогормональных систем организма, таких как симпатоадреналовая и гипоталамогипофизарно-надпочечниковая. На основании результатов исследования сформулирована концепция о закономерностях изменения ЭФПЭ, реализующихся через структурнофункциональную модификацию мембран, связанных с изменением рецепторной реактивности клеток в ходе развития стресс-реакции, позволяющая рассматривать эритроцит как биологическую систему, отражающую гомеостаз организма в целом.
Впервые показано, что изменение ЭФПЭ является универсальным маркером развития не только патологического процесса в ходе действия альтерирующего фактора, но и включения адаптационных процессов в организме при развитии резистентности в ответ на действие адаптогенов. Доказана возможность использования ЭФПЭ в качестве метода диагностики стресс-реакции организма при его альтерации и степени развития адаптационных процессов в ответ на действие адаптогенов.
Теоретическая и практическая значимость работы Работа выполнена в соответствии с плановыми НИР кафедры. Часть работы выполнена в рамках реализации ФЦП Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы (Государственный контракт № П604).
Работа является экспериментальным исследованием с перспективным практическим выходом, позволяющим разработать новые диагностические методы в медицине.
Результаты исследования используются в учебном процессе кафедры физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И.
обачевского и кафедры неврологии, психиатрии и наркологии факультета повышения квалификации врачей Нижегородской государственной медицинской академии.
Полученные результаты позволяют обосновать эффективность и целесообразность использования фармакологических и физиотерапевтических средств в динамике восстановления нарушенных функций. Полученные результаты исследования внедрены в практику в неврологической клинике Нижегородской Областной больницы им.
Н.А.Семашко. По результатам исследования предложен способ оценки функциональной активности коры надпочечников организма, основанный на измерении электрофоретической подвижности эритроцитов крови (патентная заявка № 2011101256/001560 от 19.09.2011.) и внедрен в практику способ исследования ЭФПЭ в качестве критерия оценки степени адаптационных процессов организма у больных с хронической ишемией головного мозга (патент на изобретение № 2371193 от 27.10.2009).
Положения, выносимые на защиту 1. Изменения ЭФПЭ человека и животных носят однотипный характер независимо от вида воздействующего фактора и его длительности: первоначальное уменьшение ЭФПЭ с последующим ее увеличением, превышающим исходные значения, и восстановление по мере отмены действия стрессора. Межгрупповые различия имеют лишь количественный характер и варьируют по времени, определяясь спецификой альтерационного воздействия.
2. Закономерности изменения ЭФПЭ при различных экстремальных воздействиях и патологии являются отражением общей неспецифической реакции организма на раздражитель, связаны с развитием стресс-реакции и вовлечением стресс-реализующих систем, таких как симпатоадреналовая и гипофизарно-надпочечниковая, определяющих структурно-функциональную модификацию эритроцитов на действие чрезвычайных раздражителей. Типовые изменения ЭФПЭ, реализующиеся через морфофункциональную модификацию мембран, связаны с изменением рецепторной реактивности клеток.
3. ЭФПЭ зависит от мембранно-клеточных характеристик эритроцитов и опосредована перестройками белок-липидной составляющей мембран при изменении баланса про- и антиоксидантных систем клетки. Динамика ЭФПЭ при трансформации структурно-функциональных свойств эритроцитов обусловлена изменением активности Na-К-АТФазы, перестройками метаболизма клеток, вызывающих морфологическую модификацию эритроцитов в ответ на стрессовое воздействие.
4. Изменения ЭФПЭ и морфофункциональных показателей эритроцитов при моделировании повторяющегося и хронического стресса у животных и патологии у людей однотипны с острым стрессом, что подтверждает целесообразность изучения ЭФПЭ как модели исследования развития не только стресс-реакции в организме, но и модели, позволяющей исследовать развитие патологического процесса. Степень изменения ЭФПЭ при патологии определяется восстановлением морфофункциональных характеристик эритроцитов на фоне развития адаптационных процессов у больных в ходе терапии и показывает эффективность фармакологических и физиотерапевтических средств в качестве адаптогенов.
5. ЭФПЭ, связанная с универсальными изменениями структурно-функционального состояния клеток, позволяет рассматривать эритроциты как биологическую систему, отражающую гомеостаз организма в целом, позволяющую проанализировать механизмы, по которым реализуется стадийность, общность и специфичность того или иного патологического процесса.
Апробация работы Основные положения работы были доложены и обсуждены на IV,V, VI VII научнопрактических конференциях по апитерапии Апитерапия сегодня, Рыбное, 1994, 1997, 1998, 2000; на XXXIV международном конгрессе по пчелокультуре, Лозанна, 1995; на Российской конференции Экология, здоровье и природопользование, Саратов, 1997; на Втором Европейском конгрссе Акупунктурные Белые Ночи, Санкт-Петербург, 1997; на XXXV международном конгрессе по пчелокультуре, Антверпен, Бельгия, 1997; на Всероссийской научной конференции с международным участием, посвящ.150-летию акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, 1999; на XXXVI международном конгрессе по пчелокультуре, Ванкувер, Канада, 1999; на. X Международной научно-практической конференции по апитерапии. Рязань, 2002; на 4-й Международной научно-практической конференции Пчеловодство -XXI, Москва, 2003; на IX Всероссийском съезде неврологов, Ярославль, 2006; на VIII Международном конгрессе по адаптационной медицине, Москва, 2006, на II Международной конференции Человек и электромагнитные поля, Саров, 2007, на XIII Всероссийской научно-практической конференции Успехи апитерапии, Адлер, 2008; на 9-й научно-практической конференции Интермед, Москва, 2009; на XIV Международном симпозиуме Экологофизиологические проблемы адаптации, Москва 2009; на XIV Международном симпозиуме Эколого-физиологические проблемы адаптации, Москва 2009; на международной конференции Пчеловодство XXI век. Пчеловодство, апитерапия и качество жизни, Москва 2010; на XXI съезд физиологического общества им. И.П.
Павлова, Калуга, 2010; на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Актуальные проблемы современной науки и образования Башкирия, Сибай, 2010; на II Межрегиональной научно-практической конференции неврологов и нейрохирургов Приволжского федерального округа Высокие технологии в медицине, Н.Новгород, 2011; на IV Международной конференции по АСМ в науке и медицине, Париж, 2011; на Международной научно-практической конференции Пути развития пчеловодства в России через успешный опыт регионов России, стран СНГ и Дальнего Зарубежья, Ярославль, 2011. Апробация работы проведена на заседании кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ им. Н.И. Лобачевского.
Публикации По теме диссертации опубликовано 74 работ, из них 22 - в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК МО РФ; получен 1 патент РФ, 1 патентная заявка.
Объем и структура диссертации Работа изложена на 248 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 428 источников, из которых 267 отечественных и 161 иностранных; содержит 74 таблицы и 30 рисунков.
ичный вклад соискателя В исследованиях, которые положены в основу диссертационной работы, соискатель ставил проблему, подбирал методы исследования, планировал и принимал участие в проведении экспериментальных исследований, в оценке результатов и формулировке выводов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского (зав. кафедрой - д.б.н., профессор Крылов В.Н.). Клинический материал получен в Областной больнице им. Н.А. Семашко (исследования проведены с к.м.н., доц. кафедры неврологии, психиатрии и наркологии ФПКВ ГОУ ВПО НижГМА Антипенко Е.А.), в Дорожной клинической больнице Горьковской железной дороги МПС РФ (исследования проведены с врачом гастроэнтерологического центра, к.м.н. Артемовой А.В.) и в Нижегородском научно-исследовательском кожно-венерологическом институте МЗ РФ (исследования проведены с врачом отделения хронических дерматозов Клеменовой И.А.). Схема проведенных исследований представлена в таблице 1.
Таблица Характеристика исследований Экспериментальная часть Этапы Направление исследований Количество экспериментального материала Острый стресс ЭФПЭ, МДА, глутатион, электрофорез белков в 440 крыс ДСН-ПААГ, разделение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии, измерение активности Na-К-АТФазы, определение 2,3ДФГ и АТФ в эритроцитах, процентное распределение эритроцитов по диаметру, морфометрия эритроцитов методом сканирующей зондовой микроскопии, лейкограмма Сравнительно-видовое ЭФПЭ 50 крыс, 50 мышей, действие стресса 50 лягушек Действие стресс- ЭФПЭ, МДА, глутатион, электрофорез белков в 280 крыс реализующих систем ДСН-ПААГ, разделение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии, измерение активности Na-К-АТФазы, морфометрия методом сканирующей зондовой микроскопии Адреналэктомия ЭФПЭ, МДА 50 крыс Действие стресс- ЭФПЭ, МДА Образцы крови 1факторов на клетки крыс in vitro Повторяющийся ЭФПЭ, МДА, глутатион, лейкограмма 80 крыс стресс Хронический стресс ЭФПЭ, МДА, глутатион, лейкограмма 150 крыс Действие ЭФПЭ, МДА, лейкограмма 200 крыс стрессмодулирующих средств после альтерации Клиническая часть Виды патологии Направление исследований Количество пациентов Дисциркуляторная ЭФПЭ, МДА, лейкограмма 126 человек энцефалопатия 1, 2, стадии (ХЦВН) Язвенная болезнь ЭФПЭ, МДА, разделение фосфолипидов методом 70 человек двенадцатиперстной тонкослойной хроматографии кишки Псориаз ЭФПЭ, МДА, разделение фосфолипидов методом 70 человек тонкослойной хроматографии Вертеброгенная ЭФПЭ, МДА 40 человек люмбоишиалгия Нервно-мышечные ЭФПЭ, МДА 40 человек заболевания Экспериментальные исследования проведены на 1450 животных, из них 12нелинейных белых крыс-самок массой 200 - 250 г., 150 самцов белых крыс линии Вистар весом 250-300 г., 50 белых нелинейных лабораторных мышей массой 16-20 г., 50 лягушек рода Rana. Содержание и оперативные вмешательства осуществляли в соответствии с нормативами, данными в руководстве Guide for care and use of laboratory animals. ILAR publication, 1996, National Academy Press и требованиями Приказа Минздрава России № 267 от 19.06.03 Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации. Ряд исследований осуществлен на изолированных эритроцитах животных.
Забор крови для анализа проводили: у крыс из подъязычной вены, у мышей и лягушек после декапитации.
Острый стресс у животных моделировали физической нагрузкой, гипоксией, иммобилизацией, воздействием экзотоксинов, адреналином, ЭМИ. Физическая нагрузка заключалась в однократном плавании животных в течение 15 мин. с грузом 10% от массы тела животного при температуре 26-28С. Иммобилизационный стресс создавали 3-х часовой фиксацией крыс на планшетах за 4 конечности на спине. Гипоксию моделировали, помещая животных в барокамеру и поднимая на высоту 11000 м в течение 5 мин. Токсический стресс вызывали внутрибрюшинным введением крысам яда пчелы (0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг) и яда жабы (0,1мг/кг). Адреналиновую токсемию создавали внутрибрюшинным введением адреналина-гидрохлорида (0,1 мг/кг). Воздействие ЭМИ осуществляли путем влияния НИЛИ, ИМП и КВЧ-воздействия на затылочную область крыс, с расстояния 2-5 мм от аппликаторов, в течение 10 минут. В качестве источника лазерного излучения применяли аппарат лазерный терапевтический Успех (ГП Восход), работающий в импульсном режиме, с длиной волны излучения 0,8-0,9 мкм, частотой следования импульсов 415Гц, минимальное значение плотности средней мощности излучения в плоскости выходного окна аппликатора 193 мкВт/кв.см. В качестве источника излучений крайне высокой частоты применяли аппарат АМФИТ-0,2/1001(ООО ФизТех) с шумовым спектром, мощностью 1 мкВт, частотой 53,57-78,33 ГГц.
ИМП создавали аппаратом, генерирующим прямоугольные импульсы магнитного поля с частотой 20Гц, длительностью импульса 100 мкс и напряженностью 100 мТл.
Воздействие проводилось на затылочную область крыс, помещенных в открытую камеру, с расстояния 2-5 мм от аппликаторов, в течение 10 минут. Контролем служили интактные крысы. В опытах с введение инъекционных препаратов контролем были крысы после внутрибрюшинного введения 0,9% хлорида натрия.
Сравнительно-видовое исследование ЭФПЭ в ответ на действие стресс-фактора проведено на лягушках, мышах и крысах. В качестве стресс агента использован яд пчелы в дозе 0,1мг/кг. Яд вводили внутрибрюшинно. Контрольным животным проводили внутрибрюшинную инъекцию физиологического раствора.
Для выяснения роли симпатоадреналовой и гипофизарно-надпочечниковой систем на изменение электрокинетических и морфофункциональных свойств эритроцитов было изучено: действие адреналина (0,1мг/кг), кортизола (0,4мг/кг), блокатора адренорецепторов (пропранолола, 0,2мг/кг), адреналина (0,1 мг/кг) или пчелиного яда (0,мг/кг) (в качестве стресс-фактора) на фоне пропранолола (0,2 мг/кг). Препараты вводили внутрибрюшинно. Адреналин и пчелиный яд после инъекции пропранолола вводили спустя 10 мин. Контролем служил физиологический раствор введенный внутрибрюшинно.
Кроме того, группе животных производили двухстороннюю адреналэктомию (Лазарев, 1954). Исследовали действие пчелиного яда (0,5мг/кг) параллельно на адреналэктомированных и интактных крысах.
С целью выявления непосредственного действия стресс-факторов на клетки красной крови были проведены исследования in vitro. Исследовали действие стресс-факторов как физической (ЭМИ), так и химической (зоотоксины, адреналин, кортизол) природы на предварительно отмытые эритроциты. Эритроциты крыс инкубировали с пчелиным ядом (110-6-110-7г/мл), адреналином (110-9-110-10г/мл), кортизолом (110-7-510-7г/мл), жабьим ядом (110-7г/мл) или воздействовали различными видами ЭМИ (ИМП, НИЛИ, КВЧизлучения) в течение 10 мин. В опытах с ЭМИ контролем служили интактные клетки, в опытах с инкубацией с различными химическими соединениями - клетки, инкубированные с физиологическим раствором.
Для модификации структуры клеток эритроциты фиксировали глютаровым альдегидом, используя методику H.Walter и J.Krob (1989). Взвесь эритроцитов инкубировали при t22-24С в течение 30 мин. в 0,1% растворе глютарового альдегида.
После трехкратной отмывки физиологическим раствором, обработанные эритроциты инкубировали с зоотоксинами, адреналином, кортизолом, либо воздействовали различными видами ЭМИ.
Состояние стресса, вызванного повторяющимися в течение нескольких дней однотипными видами воздействия, было изучено на моделях повторяющихся токсического и физического стрессов. Токсический стресс вызывали внутрибрюшинным введением животным яда пчелы (0,1 мг/кг) на протяжении 7 дней. Физический стресс воспроизводили, вынуждая животных плавать в течение 15 мин. с грузом 10% от массы тела животного при температуре 26-28С в течение 7 дней. Контролем служили интактные крысы.
Хронический стресс изучали на моделях локальной и глобальной ишемии головного мозга крыс. Глобальную ишемию головного мозга моделировали путем необратимой одномоментной двусторонней окклюзии общих сонных артерий. Локальную ишемию головного мозга вызывали путем необратимой окклюзии левой ветви средней мозговой артерии и подходящей к ней вены с одновременной перевязкой ипсилатеральной сонной артерии. Окклюзия достигалась путем электрокоагуляции аппаратом электрохирургическим высокочастотным ФОТЕК Е81. Работу проводили под нембуталовым наркозом (нембутал внутрибрюшинное введение 35 мг/кг). После операции рану обрабатывали сухой калийной солью пенициллина, кожу ушивали, шов обрабатывали 2% раствором йода.
Изучение электрокинетических и структурно-функциональных показателей мембраны эритроцитов при развитии адаптационных процессов исследовали при действии фармакологических и физиотерапевтических средств после альтерации функций организма:
1 серия. Острый стресс моделировали 3-х часовой иммобилизацией в положении на спине с фиксацией конечностей. После иммобилизации животным в течение 10 дней, в зависимости от серии эксперимента, внутрибрюшинно вводили пчелиный яд (0,1мг/кг), скармливали маточное молочко (100мг/кг), маточное молочко и мед (100мг/кг), прополис и мед (100мг/кг). Контролем служили крысы, не подвергнутые стрессу и получавшие те же препараты. Дополнительно исследовалась кровь интактных животных и животных после стресса.
2 серия. Животные подвергались общему однократному -облучению в дозе 3 Гр (модель костно-мозговой формы лучевой болезни средней тяжести). Затем животным проводили курс 7-дневной терапии продуктами пчеловодства. Первой группе животных внутрибрюшинно вводили Солапивен - иньекционный раствор пчелиного яда в дозе 0,мг/кг. Вторая группа животных перорально получала мед в дозе 30 мг/кг, третья - смесь меда и маточного молочка (Апитонус) в дозе 30 мг/кг, четвертой группе поводилась ингаляция препаратом Апингалин (водно-спиртовая суспензия прополиса и маточного молочка). Контролем служили облученные животные без введения каких-либо препаратов.
3 серия. Острый стресс моделировали внутрибрюшинным введением животным адреналина-гидрохлорида в дозе 0,1 мг/кг. Через 30 минут после введения адреналина начинали низкоинтенсивное лазерное излучение и излучение крайне высокой частоты.
Воздействие проводилось на затылочную область крыс, помещенных в открытую камеру, с расстояния 2-5 мм от аппликаторов, в течение 10 минут. Контрольную группу составляли интактные крысы.
4 серия. На моделях тотальной и локальной ишемии головного мозга крыс исследовали действие препаратов: кавинтон (0,7мг/кг), пирацетам (200 мг/кг), цитофлавин (0,16 мл/кг), дельтаран (150 мкг/кг) и геримакс (0,7мг/кг), которые вводили животным через 10 суток после операции. Повторное введение препаратов осуществлялось ежедневно в течение последующих 9 суток ишемии головного мозга. Группу интактных животных составили не оперированные крысы.
В клинической части работы исследовали кровь пациентов с хронической ишемией головного мозга, вертеброгенной люмбоишиалгией, нервно-мышечными заболеваниями, язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБДПК) и псориазом. Диагноз формулировался врачом в соответствии с общепринятыми клиническими критериями, на основании собранного анамнеза, и подтверждался лабораторными и клиническими исследованиями. Группу контроля при каждой патологии составили практически здоровые люди (по 20 добровольцев в каждой группе контроля сопоставимых по возрасту и полу с больными). Исследовали кровь пациентов до и после проведенного курса лечения.
В соответствии с отечественной классификацией, степень цереброваскулярной недостаточности определялась как стадия дисциркуляторной энцефалопатии (ДЭ). Все пациенты получали базовую терапию. Дополнительно при данных видах патологии проводилось исследование адаптогенных препаратов. Пациенты с вертеброгенной люмбоишиалгией и нервно-мышечными заболеваниями дополнительно к базовой терапии получали инъекционный раствор пчелиного яда (апитерапия). Больные с ДЭ были распределены на четыре группы. 1 группа (30 пациентов) получали только базовую терапию. 2 групп (32 человека) получала на фоне базовой неспецифическую цитопротективную терапию - цитофлавин. 3 группа (31 пациента) получала на фоне базовой стресслимитирующую терапию - дельтаран. 4 группа (33 пациента) - на фоне базовой - природный адаптоген геримакс.
У пациентов с ЯБДПК проводили традиционную противоязвенную терапию с проведением контроля эрадикации через 6 недель после рубцевания язвы. Анализ крови производился в период обострения заболевания (острую стадию развития язвы) и в период ремиссии (стадия красного рубца) - через 6 недель после проведенного курса лечения.
Больные псориазом получали стандартную терапию (1 группа), а также дополнительно к стандартной терапии проводили КВЧ-воздействие (2 группа).
Методы исследования включали измерение ЭФПЭ методом микроэлектрофореза (Харамоненко, Ракитянская, 1974), определение концентрации МДА в эритроцитах (Владимиров, Арчаков, 1972), определение глутатиона в эритроцитах (Sedlak, Lindsey, 1968), разделение липидов методом тонкослойной хроматографии (Шаршунова М.В. и др., 1980), электрофорез белков в ДСН-ПААГ (Laemmli, 1970), определение активности Na,K-AТФазы (Иващенко, Бушнева, 1981), определение 2,3ДФГ и АТФ в эритроцитах (Виноградова и др., 1980), морфометрию эритроцитов методом сканирующей зондовой микроскопии (Pleskova et al, 2001), измерение диаметра эритроцитов и подсчет лейкоцитарной формулы в мазках крови (Меньшиков и др., 1987).
В работе применялись следующие приборы: аппарат для электрофореза (Москва);
атомно-силовой микроскоп Accurex 2100 (США); микроскоп БИОМЕД-4 (Москва); pHметр Мультитест ИПЛ-311 (Новосибирск); фотометр Мультискан ЕХ (Финляндия);
мультицентрифуга СМ-6М (Латвия), фотометр фотоэлектрический КФК-3 (Москва);
термостат Binder BD 240 (Германия); автоматическая система для высокоэффективной жидкостной хроматографии Biologic Duo-Flow Basic (Bio-Rad, U.S.A); камера Mini - PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, U.S.A). Стандартные образцы фосфолипидов (Sigma, U.S.A) и белков (Bio-Rad, U.S.A).
Полученные экспериментальные данные обрабатывали с использованием параметрического (критерий Стьюдента, в том числе с поправкой Бонферрони) метода статистики. За величину уровня статистической значимости различий принимали p0,05.
Обработка результатов хроматографического анализа липидов и электрофоретического разделения белков проводилась с помощью программы Onedescan для Windows 98.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование электрокинетических и структурно-функциональных характеристик мембран эритроцитов при различных видах альтерации 1.1. Исследование электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ) при различных видах альтерации функций организма животных На разных экспериментальных моделях напряжения и нарушения функций организма крыс, таких как: иммобилизация, гипобарическая гипоксия, физическая нагрузка, действие различных видов ЭМИ, гамма-облучение, токсический стресс (внутрибрюшинное введение зоотоксинов), введение продуктов пчеловодства, адреналовая токсемия, была выявлена однотипная динамика изменения ЭФПЭ, проявляющаяся в первоначальном снижении с последующим повышением данного показателя относительно значений контроля (рис. 1). Так, в течение часа после воздействия ЭФПЭ уменьшалась во всех изучаемых группах. К 60-120 мин эксперимента регистрировалось повышение ЭФПЭ при всех видах альтерации, кроме животных, у которых воспроизводилась адреналовая токсемия. К 1 суткам - 1 неделе эксперимента повышенные значения ЭФПЭ регистрировались при действии экзотоксинов (пчелиный, жабий яды) и продуктов пчеловодства относительно контрольных значений, при остальных видах воздействия наблюдалось восстановление показателя до уровня контроля, за исключением ионизирующего излучения, вызывающего резкое падение ЭФПЭ к 1 неделе эксперимента.
Таким образом, установлена однотипная двухфазная реакция клеток на стрессор, проявляющаяся в изменении их ЭФПЭ: уменьшение ЭФПЭ (1-я фаза) с последующим ее увеличением (2-я фаза). Межгрупповые различия носили лишь количественный характер и варьировали по времени, отражая специфику наносимого стресс-воздействия.
Адреналин, гипоксия, иммобилизация и ионизирующее излучение провоцировали развитие первой фазы изменения ЭФПЭ. Для экзотоксинов, продуктов пчеловодства характерна более продолжительная 2-я фаза изменения ЭФПЭ, что проявлялось в ее существенном увеличении, превышающем уровень контрольных значений. При этом физическая нагрузка и действие на организм НИЛИ и КВЧ - облучения вызывали незначительные колебания ЭФПЭ.
Рис. 1. Изменение ЭФПЭ при различных альтерирующих воздействиях Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными.
Сравнительно-видовое исследование ЭФПЭ крови животных разных таксономических групп (крыс, мышей и лягушек) при действии пчелиного яда также выявило однотипную реакцию клеток на стрессор, проявляющуюся в изменении их электрокинетических свойств (рис.2). Это отражалось в снижении ЭФПЭ в течение первого часа эксперимента с последующим увеличением показателя, превышающим уровень контрольных значений (p<0,05).
Рис. 2. Изменение ЭФПЭ крови мышей и лягушек при действии пчелиного яда Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии закономерных изменений электрокинетических свойств эритроцитов в ответ на протекающие в организме стрессовые реакции.
1.2. Роль симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем в изменении ЭФПЭ Учитывая, что при стрессе ведущими нейро-гормональными системами являются симпатоадреналовая и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая, можно полагать, что на клеточном уровне реализуется последовательное включение процессов, опосредованное действием изменяющихся концентраций катехоламинов и кортикостероидов в периферической крови. Так, в следующей серии экспериментов, стрессовая реакция, вызванная введением крысам стресс-агента - пчелиного яда, приводила к появлению типичной двухфазной реакции ЭФПЭ (рис. 3). Внутрибрюшинное введение адреналина в организм животных вызывало снижение ЭФПЭ, напротив, введение кортизола определило рост ЭФПЭ во всех точках наблюдения (p<0,05). Введение адреналина и пчелиного яда на фоне блокады -адренорецепторов пропранололом снижало или полностью отменяло реакцию снижения ЭФПЭ, но не изменяло фазу повышения ЭФПЭ в ответ на введение пчелиного яда.
Рис. 3. Изменение ЭФПЭ при различных стрессовых воздействиях.
Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными Исследование взаимосвязи изменения ЭФПЭ и уровня гормона коры надпочечников (кортизола) в плазме крови при внутрибрюшинном введении крысам пчелиного яда иммуноферментативным способом показало, что рост ЭФПЭ сочетался с увеличение концентрации кортизола (табл.2).
Таблица Динамика изменения ЭФПЭ и уровня кортизола в крови при внутрибрюшинном введении пчелиного яда.
Время после Изучаемые показатели воздействия, ЭФПЭ (мкмсм/Вс) Концентрация кортизола (нмоль/л) мин 0 1,010,01 47,775,60 1,280,02* 122,208,28* 180 1,320,04* 140,408,37* Примечание: * - статистически значимые различия (р<0,05) со значениями до воздействия.
Результаты исследований свидетельствуют, что регистрируемое первичное уменьшение ЭФПЭ при стрессовых воздействиях связано с повышением уровня циркулирующих катехоламинов в крови и (или) повышением чувствительности к ним адренорецепторов клеток. Отмечено, что в реакциях на стресс концентрация адреналина в плазме возрастает в десятки раз уже через несколько минут (Тюрмина и др., 1997), в частности, при внутрибрюшинном введение пчелиного яда собакам на 1-5 минут (Vick et al., 1972). В процессе развертывания стресс-реакции катехоламины, активируя выброс АКТГ, стимулируют нарастание в крови уровня гормонов коры надпочечников. В то время как катехоламины отражают возникновение срочного пускового эффекта, для кортикостероидов характерно долгосрочное действие (Сапронов, 1998; Sunanda at al., 2000). Экскреция кортикостероидов, направленная на лимитирование 1-й фазы стрессреакции, вероятно, определяет повышение ЭФПЭ (2-я фаза).
С целью подтверждения указанного положения нами проведены исследования ЭФПЭ при внутрибрюшинном введении пчелиного яда адреналэтомированными крысам с ограниченным выбросом адреналина и кортизола. Введение пчелиного яда животным с удаленными надпочечниками не вызывало изменения ЭФПЭ, выявленного при действии апитоксина на интактных крыс (табл. 3) Таблица Динамика изменения ЭФПЭ (мкмсм/Вс) интактных и адреналэктомированных крыс при внутрибрюшинном введении пчелиного яда Группа животных До инъекции Время после инъекции 1 час 1 сутки 1неделя Контрольная группа 1,140,03 1,130,03 1,110,03 1,120,Интактные+ пчелиный яд 1,160,04 1,090,03* 1,260,03* 1,200,03 Адреналэктомия+ пчелиный яд 1,180,06 1,140,07 1,120,07 1,070,Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными (до инъекции); - статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными.
Таким образом, показана высокая чувствительность ЭФПЭ к основным стрессреализующим гормонам. Опыты на эритроцитах доноров in vitro подтвердили данное положение. Отмечено, что использование адреналина в концентрации, соответствующей его концентрации в крови в условиях физиологической нормы (110-10г/мл), не вызывало достоверных изменений ЭФПЭ. Добавление адреналина в концентрации, соответствующей его уровню при стрессовых реакциях организма (110-9 г/мл), проявлялось в необратимом уменьшении ЭФПЭ (p<0,05). В отличие от опытов с адреналином, инкубация эритроцитов с кортизолом (110-7-510-7 г/мл) определила увеличение ЭФПЭ в интервале от 30 мин. до 2 часов в зависимости от примененной концентрации (рис. 4).
Рис. 4. Изменение ЭФПЭ при действии адреналина (110-9 г/мл) и кортизола (110-7 г/мл) в опытах in vitro Примечание: * - статистически значимые различия (р<0,05) со значениями до воздействия.
В соответствии с выдвинутыми положениями, можно объяснить количественные различия фазности изменения показателя ЭФПЭ при изученных типах стрессового воздействия. При гипобарической гипоксии, адреналовой токсемии, иммобилизации, ИМП и гамма-облучении наиболее выражена активация симпатоадреналовой системы с высоким уровнем адреналина в крови. Для зоотоксинов, продуктов пчеловодства характерна более длительная фаза активации коры надпочечников. Плавание, НИЛИ и КВЧ-излучение, по-видимому, вызывая стресс меньшей выраженности, приводят к менее значительным изменениям ЭФПЭ.
1.3. Роль биохимической модификации эритроцитов в изменении ЭФПЭ Было установлено, что через 15-30 минут после альтерации в эритроцитах крыс всех групп наблюдалось увеличение содержания МДА, показателя традиционно характеризующего ПОЛ (Кирпатовский и др., 1996). Наиболее значимые изменения концентрации МДА регистрировались при действии гипобарической гипоксии, иммобилизации, адреналина и ИМП по сравнению с контрольной группой животных (рис.5). Гамма-облучение вызывало двухфазное увеличение концентрации МДА, с ростом данного параметра к 15 мин. эксперимента и к 1 неделе относительно контрольной группы животных. Зоотоксины, а также продукты пчеловодства приводили к снижению уровня МДА с 30Ч60-й мин. относительно значений контроля (p<0,05) с постепенным восстановлением к первой неделе наблюдения. Физическая нагрузка, действие НИЛИ и КВЧ - облучения не вызывали значимых изменений концентрации МДА. Введение кортизола определило снижение данного метаболита относительно контрольных значений во всех точках наблюдения (р<0,05). На фоне блокады -адренорецепторов пропранололом выявлено ослабление эффектов связанных с действием адреналина.
Рис. 5. Изменение концентрации МДА в эритроцитах при различных видах воздействия.
Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными.
Проведенное исследование динамики изменения уровня МДА при исследуемых видах воздействия на организм показало, что интенсивность ПОЛ пропорциональна тяжести альтерации, что согласуется с литературными данными (Kiefer, Snyder, 2000).
При этом анализ активности ПОЛ в эритроцитах выявил зависимость между степенью изменения концентрации МДА в клетках и интенсивностью и вектором изменения ЭФПЭ от вида стрессового воздействия. Так, первоначальное снижение ЭФПЭ сочеталось с активацией процессов ПОЛ при действии стресс фактора, тогда как рост уровня ЭФПЭ сопровождался уменьшением концентрации МДА. Наиболее сильное увеличение концентрации МДА вызывало наибольшее уменьшение ЭФПЭ, что характерно для адреналовой токсемии, иммобилизации, гипобарической гипоксии и гамма-облучения.
Уменьшение интенсивности процессов ПОЛ сопровождалось развитием 2-й фазы ЭФПЭ, наиболее выраженной при действии зоотоксинов и продуктов пчеловодства.
Изменение оксидантых процессов приводит к изменению состояния системы глутатиона, являющейся буферной системой, поддерживающей в восстановленном состоянии сульфгидрильные группы белков, определяющих глюкокортикоидсвязывающую способность рецепторов (Килесса, 2010), проницаемость мембраны и состояние гемоглобина (Колесниченко, 2003) Исследование концентрации общего глутатиона позволило установить нарастание его уровня в динамике эксперимента при всех видах альтерации, за исключение действия на организм ионизирующего излучения (рис. 6). При воспроизведении адреналовой токсемии, иммобилизации и гипоксии отклонения от нормы содержания общего глутатиона в эритроцитах сохранялись на практически неизменном высоком уровне во всех точках наблюдения (p<0,05). Введение животным кортизола не вызывало значимых изменений данного параметра. Введение адреналина и пчелиного яда на фоне блокады адренорецепторов пропранололом снижало или полностью отменяло рост данных показателей, наблюдаемый при действии адреналина и пчелиного яда на интактный организм.
Рис. 6. Изменение концентрации общего глутатиона в эритроцитах при различных стрессовых воздействиях.
Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными.
Рассматривая динамику изменения содержания восстановленной и окисленной форм системы глутатиона в эритроцитах крыс сформированных групп, необходимо отметить, что тенденция вариации восстановленного глутатиона практически идентична обнаруженной для общего глутатиона, тогда как концентрация окисленной формы глутатиона увеличивалась при иммобилизации животных, гипобарической гипоксии и введении адреналина.
Полученные результаты свидетельствуют, что рост содержания глутатиона, по всей видимости, связан с активацией компенсаторно-приспособительных реакций в эритроцитах, приводящих к индукции синтеза глутатиона на фоне повышения активности ПОЛ. Так, наиболее сильные стрессовые воздействия приводили к наиболее длительному увеличению показателей антиоксидантного глутатионового статуса. При этом увеличение концентрации, как общего, так и восстановленной формы глутатиона сочеталось с первоначальным уменьшением ЭФПЭ. Дальнейшее изменение вектора направленности (рост ЭФПЭ) не было сопряжено с изменением направленности в состоянии системы глутатиона.
В то же время следует отметить, что регистрируемое в опытах первичное уменьшение ЭФПЭ сочетающееся с ростом концентраций МДА и глутатиона при альтерации организма, нивелировалось при действии стресс-агента на фоне блокады адренорецепторов, что может говорить о влиянии стрессоров через изменение адренореактивности клеток. Поскольку адренорецептор представляет белок и при взаимодействии с медиатором образует комплексное соединение, следует ожидать непосредственного его влияния на структурную модификацию белков эритроцитарной мембраны. При этом необходимо учитывать, что 90% отрицательного заряда клетки определяют сиаловые кислоты, входящие в основном в состав гликопротеинов (Seaman, 1983; Wojcicki, Beth, 1993). Поэтому следующая часть исследований связана с изучением белкового профиля эритроцитарных мембран при различных видах воздействия.
В ходе проведенных экспериментов была установлена общая тенденция изменения динамики основных белковых фракций эритроцитарной мембраны при действии альтерирующих факторов. На фореграммах к 15 мин после воздействий регистрировалось снижение относительного содержания спектрина, анкирина, белка полосы 3 и гликофоринов при увеличении фракции белков полос 4.1, 4.2, 4.9 и тропомиозина относительно уровня значений данных фракций контрольных животных (рис.7).
% 2* * 2* * * * * 1* * 1* * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 пчелиный яд адреналин иммобилизация Рис. 7. Изменение спектра белков эритроцитов при различных стрессовых воздействиях к 15 мин.
после альтерации 1- спектрин; 2 - анкирин; 3- б.п.3; 4 - б.п.4.1.; 5 - б.п.4.2; 6 - гликофорин А; 7 - б.п.4.9; 8 - актин;
9 - ГАФД; 10 - тропомиозин; 11 - гликофорин В По оси ординат - % изменения концентрации белковых фракций к 100 % - уровню значений контроля.
Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными.
Введение кортизола определило рост концентрации спектрина при отсутствии достоверных изменений других белковых фракций эритроцитов к 15 мин. эксперимента (рис. 8). При действии пчелиного яда на фоне блокады -адренорецепторов, также как и при действии кортизола, наблюдалось увеличение концентрации спектрина, а эффекты, связанные с действием пчелиного яда, существенно нивелировались, что выражалось лишь увеличением концентрации белка п. 2.2. и снижении гликофорина В (р<0,05).
Блокатор -адренорецепторов не вызывал достоверного изменения белкового состава мембран эритроцитов.
Кортизол Пчелиный яд Адреналин Рис. 8. Изменение спектра белков эритроцитов к 15 минуте после воздействий Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными.
К 120 мин при действии различных альтерирующих факторов наблюдалось модификация процентного соотношения белковых фракций, что выражалось в росте концентрация белка полосы 3, гликофоринов, снижении содержания спектрина относительно концентраций данных белков на 15 мин. эксперимента, при восстановлении состава белков полос 4 и тропомиозина относительно контроля. Следует отметить, что динамика изменения белковых фракций при действии кортизола и пчелиного яда на фоне блокады -адренорецепторов к 120 мин. опыта носила сходный характер с действием других исследованных факторов (рис.9).
Рис. 9. Изменение спектра белков эритроцитов к 120 минуте после воздействий.
Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными.
Результаты исследований показали, что изменение ЭФПЭ при действии экстремальных факторов на организм сопряжено с модификацией белковой фазы мембраны. При этом механизм снижения ЭФПЭ при развитии стресс-реакции связан с действием катехоламинов на белки эритроцитарной мембраны, что проявлялось в первоначальном снижении процента интегральных белков на фоне постепенного снижения уровня спектрина. Дополнительный вклад в уменьшение ЭФПЭ, по всей видимости, оказывало изменение белков полос 4 и тропомиозина, которые участвуют в укреплении белков цитоскелета. Рост ЭФПЭ сочетался с относительным увеличением основных сиалогликопротеинов эритроцитарной мембраны, и, может быть опосредован преобразованиями цитоскелета, в частности, относительным уменьшением концентрации спектрина, составляющего 75% всей массы цитоскелета, определяющим увеличение латеральной подвижности гликопротеинов (Koppel, D.E. 1991). В свою очередь, перераспределение зарядов интегральных белков по глубине гликокалекса, влияющее на увеличение ЭФПЭ, вероятно обусловлено развитием стресс-реакции в организме и увеличением концентрации глюкокортикоидов в крови. Действие стероидных гормонов реализуется через взаимодействие их с внутриклеточными рецепторами, расположенными в цитозоле и в ядрах клеток. (Морозова и др., 1990). При этом стероидные гормоны могут встраиваться в липидный бислой, способны уменьшать подвижность полярных группировок мембранных фосфолипидов, оказывают тормозящее действие на ПОЛ (Сергеев, 1984).
Учитывая, что фосфолипиды составляют основную часть мембранных липидов и в комплексе с белками выполняют структурообразующую функцию, нами было проведено исследование фосфолипидного профиля мембран эритроцитов при действии различных стрессоров.
В результате исследования установлено, что введение зоотоксинов, воспроизведение адреналовой токсемии, иммобилизация и гипоксическое воздействие вызывали значимые уменьшение доли ФЭА с 15-120 мин. относительно контроля (рис.10). Адреналовая токсемия, гипоксия и иммобилизация сохраняли статистически значимые различия концентрации ФЭА с уровнем контроля на всех этапах наблюдения, в том числе в его последней точке (1 сутки, p<0,05), восстановление значений до контроля регистрировалось при введении зоотоксинов. Исследование содержания ФХ в мембранах эритроцитов показало, что внутрибрюшинное введение пчелиного яда, адреналина, гипобарическая гипоксия и иммобилизация крыс приводили к нарастанию концентрации данного соединения в период 30-120 минут эксперимента. Исследование фракции ЛФ показало значительный рост концентрации данной фракции фосфолипидов при воздействии гипобарической гипоксии, иммобилизации, зоотоксинов и адреналина. К суткам наблюдалась тенденция восстановления показателей к исходным значениям при действии зоотоксинов. Внутрибрюшинное введение пчелиного яда, адреналина, гипобарическая гипоксия и иммобилизация определили достоверное снижение концентрации СМ мембран эритроцитов по сравнению с контролем. НИЛИ, КВЧвоздействие и физическая нагрузка в виде плавания не оказывали статистически значимого влияния на концентрацию фосфолипидов эритроцитарных мембран на протяжении всего периода наблюдения. Исключение составило увеличение концентрации ФХ к 30-60-й мин. после воздействия НИЛИ.
% 100 %120 * * * * * * * * * * * * * * 1* * * * 15 мин 60 мин 120 мин 1 сутки 15 мин 60 мин 120 мин 1 сутки иммобилизация адреналин гипоксия пчелиный яд иммобилизация адреналин гипоксия пчелиный яд А Б % % 350 1* * 31* * * * * * * * * 2* * * * * * * * * * * 2* * * * 1115 мин 60 мин 120 мин 1 сутки 15 мин 60 мин 120 мин 1 сутки иммобилизация адреналин гипоксия пчелиный яд иммобилизация адреналин гипоксия пчелиный яд В Г Рис. 10. Динамика изменения различных фракций фосфолипидов (% от общего содержания фосфолипидов) при различных стрессовых воздействиях.
А - фосфотидилэтаноламин, Б - фосфотидилхолин, В - лизоформы, Г - сфингомиелин По оси ординат - % изменения концентрации липидных фракций к 100 % - уровню значений контрольной группы животных.
Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными.
Анализ полученных результатов свидетельствует, что в организме при различных видах экстремального воздействия происходит последовательное взаимопревращение отдельных фосфолипидов, целесообразность которых, очевидно, связана с необходимостью развития адаптационных преобразований на уровне клетки. В частности, уменьшение ФЭА и накопление лизоформ а клетке, сопряжено с активацией процессов ПОЛ. В норме лизоформы быстро подвергаются дальнейшему расщеплению. Главный путь утилизации лизофосфатидов - гидролитическое отщепление ЖК при участии лизофосфолипаз (фосфолипаза В). Кроме того, при конденсации двух молекул ЛФХ происходит образование ФХ (Грибанов, 1991, Клебанов, 1992.). ФЭА и ФХ метаболически связаны друг с другом, и восстановление концентрации ФЭА может идти за счет ФХ. При этом ФХ изменяет плотность поверхностного заряда мембраны (Березов, 1983) и именно поэтому снижение его концентрации может снижать чувствительность клеток-мишеней к лизису. В тоже время, СМ принимает участие в реализации внешних воздействий на клетку (Merrill 1990). Так, внешние факторы через клеточные рецепторы оказывают влияние на сфингомиелазу, которая расщепляет СМ до церамида, который в цитоплазме клетки при действии церамидазы расщепляется до сфингозина. Сфингозин активирует протеинкиназу С, которая фосфорилирует белки мембран и цитоскелета, обеспечивая таким образом физиологический ответ клетки на внешнее воздействие (Генис, 1998).
Рассматривая влияние изменения фосфолипидного состава на ЭФПЭ следует учитывать, что исследованные фракции фосфолипидов относятся к нейтральным и могут опосредованно действовать на ЭФПЭ, определяя специфичность укладки полипептидных цепей белков и, в частности, сиалогликопротеинов.
В тоже время, увеличение ЭФПЭ может быть следствием стабилизирующего действия стероидных гормонов на липидный слой. Проведенное нами исследование действия кортизола на липидную составляющую эритроцитарной мембраны показало, что достоверные изменения регистрировались только к 15 мин. эксперимента в отношении СМ и ФХ, что выражалось в росте СМ на 14% (от 22,10,8% до 25,41,8 % от общего содержания фосфолипидов) и уменьшении ФХ на 15% (от 39,82,5% до 34,21,4% от общего содержания фосфолипидов). Доля ЛФ и ФЭА относительно общего содержание фосфолипидов достоверно не изменялась. В дальнейшем содержание фосфолипидных фракций восстанавливалось до контрольных значений.
Реорганизация липидов закономерно приводит к изменению работы мембрансвязанных энзимов (Конторщикова, 2000; Андреев, 2005). Na-K-АТФаза является липидзависимым ферментом, изменение активности которой влияет на поверхностный потенциал клеток (Schoner,2003).
Результаты экспериментов показали, что активность Na-K-АТФазы при действии экстремальных факторов первоначально увеличивалась относительно значений интактной группы животных, к 120 минуте - ингибировалась с постепенным восстановлением в ходе эксперимента, и только гамма-облучение вызвало рост активности Na-K-АТФазы к суткам (рис. 11). При действии кортизола и -адреноблокатора активность Na,К-АТФазы ингибировалась во всех точках наблюдения, тогда как воздействие пчелиного яда на фоне блокатора показало нивелирование проявления фазности изменения активности Na-KАТФазы по сравнению с действием пчелиного яда на данный показатель.
Рис. 11. Динамика изменение активности Na-K-АТФазы при различных видах воздействия Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными Анализ результатов свидетельствует о зависимости активности Na-K-АТФазы от развития стресс-реакции в организме на действие альтерирующих факторов. Стрессовое воздействие, первично приводя к мобилизации энергетических возможностей организма и возрастанию концентрации АТФ в клетках, обеспечивает дополнительную активацию NaK-АТФазы (Болдырев, 1997). В дальнейшем, нарушение взаимодействия между белковыми молекулами в олигомерном ансамбле Na-K-АТФазы и модификация липидной структуры мембраны, вероятно, ингибируют активность Na-K-АТФазы. Угнетение активности Na-K-АТФазы приводит к увеличению концентрации внутриклеточного Са2+ (вследствие активации Na+/Ca2+ обменного механизма), который, в свою очередь, участвует в регуляции клеточного метаболизма (Forman at el, 2004).
Результаты экспериментов позволяют говорить, что динамика изменения активности Na-K-АТФазы взаимосвязана с изменением ЭФПЭ: уменьшение ЭФПЭ сопряжено с повышением активности фермента, а при росте ЭФПЭ работа Na-K-АТФазы ингибируется. Таким образом, изменение активности Na-K-АТФазы, в ответ на перестройку мембранного компонента и функциональную активность клеток, может оказывать влияние на модификацию ЭФПЭ при действии различных экстремальных факторов на организм.
Исследование уровня органических фосфатов в клетки (АТФ и 2,3ДФГ), по которым можно судить о состоянии метаболизма клеток, в наших экспериментах было проведено при действии пчелиного яда и иммобилизации животных. В результате измерения был выявлен рост концентрации АТФ в клетках к 15-120 мин эксперимента и уменьшение ее уровня к 1 суткам после альтерации организма крыс. Концентрация 2,3ДФГ постепенно увеличивалась в ходе эксперимента (табл. 4).
Таблица Динамика изменения концентрации АТФ и 2,3ДФГ (мкмольФн/мл клеток) в эритроцитах при различных видах воздействиях на крыс Вид воздействия Показатель 15 мин 120 мин 24 часа Иммобилизация АТФ 0,640,09 0,310,11* 1,300,10 * 2,3ДФГ 1,800,0,920,33 * 3,180,29* Пчелиный яд АТФ 0,730,13* 0,420,1,130,14 * 2,3ДФГ 2,800,1,500,28* 3,810,24* Примечание: уровень АТФ интактных крыс - 0,520,10 мкмольФн/мл клеток, уровень 2,3 ДФГ интактных крыс - 2,600,12 мкмольФн/мл клеток; *- статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными Необходимо учитывать, что АТФ служит донором фосфата для протеинкиназных реакций, осуществляющих фосфорилирование мембранных белков. Результатом увеличения уровня фосфорилирования белковых компонентов цитоскелета является уменьшение сродства между их молекулами (Казеинов, Маслова, 1991, Сторожок и др., 2009). Истощение эритроцитов по АТФ ведет за собой усиление белок-белковых взаимодействий (Палек и др, 1980). Вероятно, фосфорилирование мембранных белков может быть причиной изменения морфологии эритроцитов, связанной с перестройкой молекулярной архитектоники поверхности эритроцита, приводящей к перераспределению эффективного отрицательного заряда.
1.4. Морфометрические характеристики эритроцитов при стрессовом воздействии Результаты исследований показали, что у изученных образцов крови интактных животных размеры эритроцитов составили: диаметр клетки 7,400,09 мкм, толщина в области краев клетки 1,330,05 мкм. При сравнении АСМ-изображений нормальных эритроцитов и эритроцитов, полученных после исследуемых видов воздействия, были выявлены изменения как размеров клеток, так топографии и рельефа поверхности мембраны эритроцитов (Рис. 12, 13). После стрессового воздействия диаметр клеток и толщина в области краев уменьшались, а размер центральной зоны увеличивался. При этом действие адреналина вызывало рост сферичности клеток, регистрируемый до конца эксперимента. Другие виды стрессового воздействия определили обратимые изменения формы клеток (рис. 12).
гиперадреналинемии иммобилизация пчелиный яд физиологический раствор Рис. 12. Морфология эритроцитов при различных способах воздействия на организм крыс к минуте после альтерации.
К 120 минуте адреналин при сохранении сферичности клеток определил появление сфероэхиноцитов. Внутрибрюшинное введение пчелиного яда, кортизола и иммобилизация животных приводили к появлению эхиноцитов (рис 13).
введение адреналина введение кортизола введение пчелиного яда иммобилизация пчелиный яд иммобилизация Рис.13. Морфология эритроцитов при различных способах воздействия на организм крыс к 1минуте после альтерации.
Показано, что необратимый сфероэхиноцитоз индуцируется увеличением внутриклеточного кальция (Andrews, 2002). В тоже время, изменение формы обратимо, если уровень внутриклеточного ионизированного Са2+ не увеличивается выше 3мМ.
Увеличение концентрации внутриклеточного кальция в эритроцитах приводит к:
изменению в архитектуре скелета эритроцитов через взаимодействие с кальмодулином;
активации трансглутаминазы, перекресно сшивающей белки мембраны; стимуляции мембранных фосфолипаз С и А; активации различных протеинкиназ; активации скрамблазы, что приводит к экспозиции фосфотидилсерина на внешнюю поверхность эритроцитов. Выход фосфотидилсерина на внешнюю поверхность эритроцитов приводит к образованию эхиноцитов (Schwarz, 1999). В процессе образования эхиноцитов на мембране эритроцитов происходит перераспределение отрицательного заряда. В результате перераспределения заряда на мембране эритроцита образуются дискретные области с сильным отрицательным зарядом (Marikovsky, 1996).
Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствует, что изменение ЭФПЭ носит однотипный характер и связанно с типовой модификацией структурнофункциональных и морфометрических показателей эритроцитов при развитии стрессреакции в организме. Изменения ЭФПЭ реализуются через повышение содержания в крови стресс-реализующих гормонов - адреналина и кортизола. Однако следует учитывать, что стресс-факторы среды могут воздействовать на рецепторы и непосредственно. Ярким примером этого является воздействие на опиоидные рецепторы человека не только эндогенных опиоидных пептидов, но и экзогенных растительных опиоидов. Поэтому для понимания механизмов выявленной типовой реакции ЭФПЭ на стрессовые воздействия представляло интерес изучение действия разных стресс-факторов на ЭФП изолированных эритроцитов.
1.5. Исследование изменения ЭФПЭ при действии альтерирующих факторов в опытах in vitro Для обоснования зависимости ЭФПЭ от вида воздействующего фактора нами проведены опыты in vitro с пчелиным ядом, жабьим ядом и различными видами ЭМИ на эритроциты. В результате проведенных опытов было установлено, что обработка суспензии эритроцитов низкоинтенсивными ЭМИ, так же, как и инкубация в растворе пчелиного яда или адреналина приводила к однообразному изменению ЭФПЭ:
первоначальное снижение с последующим повышением. При этом различия характеризовали лишь степень выраженности и длительность реакции. В отличие от этой картины, инкубация суспензии эритроцитов в растворе жабьего яда или кортизола приводила только к повышению ЭФПЭ (рис. 14).
А В Рис. 14. Изменение ЭФПЭ при действии различных факторов в опытах in vitro на интактные (А) и глутарфиксированные (В) эритроциты Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) со значениями контрольной группы Из полученных результатов следует, что изменение ЭФПЭ при воздействии на изолированные эритроциты разных стресс-факторов (за исключением яда жабы и кортизола) имеет ту же типичную картину, что и при их действии на целостный организм, установленную нами в выше приведенных экспериментах. Мы полагаем, что специфика эффекта яда жабы определяется сходством его компонентов с кортизолом - основная часть яда - буфадиенолиды имеют ту же стероидную (циклопентанапергидрофенантрен) структуру (Крылов, 1990; Лопина, 2005).
Таким образом, выявленные изменения ЭФПЭ при исследуемых видах воздействия в опытах in vitro согласуются с полученными нами данными для различных видов стрессоров в исследованиях in vivo, связанными с закономерными изменениями электрокинетических свойств эритроцитов в ответ на развивающуюся в организме стрессреакцию, реализующуюся, в частности, через модификацию адренорецепторов.
Из приведенных данных логично предположить, что действие стресс-факторов в опытах на изолированных эритроцитах приводит к непосредственной модификации их рецепторного аппарата. Принимая во внимание, что важнейшими структурными составляющими этого аппарата являются белки, следует заключить, что именно они являются мишенью действующих стресс-факторов.
Для подтверждения роли белков в модификации активности клеточных рецепторов при действии выбранных видов воздействия мы провели эксперименты с предварительной обработкой эритроцитов глутаровым альдегидом, фиксирующим белковые молекулы за счет образования сшивок по ЦNН2-группам (Walter, Krob, 1989). Было показано, что преинкубация эритроцитов с глутаровым альдегидом приводила к практически полной отмене первой фазы (уменьшение ЭФПЭ) реакции линтактных эритроцитов на стрессовое воздействие ЭМИ, пчелиного яда и адреналина. Вместе с тем, в сериях опытов с жабьим ядом и кортизолом было установлено, что выявленная в предыдущей серии опытов фаза повышения ЭФПЭ сохранялась (рис. 14).
Следует отметить, что при длительной фиксации (18 ч) отменялась как фаза падения, так и фаза увеличения ЭФПЭ. Варьирование времени фиксации влияет на глубину распространения фиксации за счет ковалентного связывания белков. Показано, что фиксация глутаровым альдегидом в течение 10 мин. не оказывает заметного влияния на структурные характеристики (Исаев-Иванов и др., 2010), тогда как полная фиксация образцов глутаровым альдегидом достигается в течение 18-24 часов (Загорулько 2002;
Головченко, 2006).
Результаты исследования свидетельствуют, что на фоне фиксации белковых молекул глютаровым альдегидом отменяется реакция падения ЭФПЭ в ответ на стрессвоздействие. Можно утверждать, что механизм ответной реакции клетки реализуется сходным образом и связан с изменением рецепторной реактивности клеток. При этом, если первая фаза - снижение ЭФПЭ связана с модификацией адренорецепторов на мембране, то вторая фаза - повышение ЭФПЭ, может быть обусловлена модификацией внутриклеточных рецепторов стероидов, расположенных в цитозоле.
1.6. Зависимость ЭФПЭ от состояния эритроцитарной популяции и неспецифических адаптационных реакций организма Различия ЭФПЭ при действии экстремальных факторов на уровне организма может быть результатом перераспределения клеток в общем пуле по их диаметру. В результате проведенных исследований выявлено, что действие пчелиного яда, адреналина, а так же КВЧ-излучение и НИЛИ сопровождалось увеличением гетерогенности популяции эритроцитов по диаметру (рис. 15). Так, данные виды воздействия на протяжении всего срока наблюдения (1 сутки) вызывали существенный рост количества эритроцитов с повышенным диаметром клеток и незначительное количественное, но статистически значимое появление эритроцитов с уменьшенным диаметром клеток. Физическая нагрузка в виде плаванья не приводила к существенному изменению процентного распределения эритроцитов по диаметру клеток по сравнению с интаткными образцами.
1физ.раствор плавание * пчелиный яд 40 * * адреналин * * * * * 3-4мкм 5-6мкм 7-8мкм 9-10мкм 11-12мкм 13-14мкм а 1физ.раствор плавание * * пчелиный яд адреналин * 20 * * * * 0 * * 3-4мкм 5-6мкм 7-8мкм 9-10мкм 11-12мкм13-14мкм в Рис. 15. Динамика распределение диаметра эритроцитов при различных видах воздействиях на крыс, по оси ординат - % распределения эритроцитов по диаметру: а - 15 минут после воздействия, в - 1 сутки после воздействия * - статистически значимые различия (р<0,05) с животными, получавшими физиологический раствор Увеличение эритроцитов с пониженным диаметром клеток, вероятно, обусловлено появлением в кровотоке депонированных форм эритроцитов. В свою очередь, существенный рост субпопуляции эритроцитов с повышенным диаметром связан, по всей видимости, с усилением выброса молодых эритроцитов, которые обладают более высоким электрокинетическим потенциалом (Xie L. et al, 2002). Сопоставление ЭФПЭ с распределением клеток по диаметру не выявило строгой зависимости между данными показателями. Соотношение баланса субпопуляций эритроцитов, при котором проявлялась тенденция роста эритроцитов с повышенным диаметром, на начальном этапе не сочеталась с суммарной величиной ЭФПЭ, сниженной относительно уровня ЭФПЭ контроля.
Таким образом, исследование распределения эритроцитов по диаметру показало отсутствие прямой зависимости ЭФПЭ от изменения диаметра клеток, что позволяет говорить о роли именно структурного компонента в изменении ЭФПЭ. При этом следует учитывать, что восстановление электроотрицательности эритроцитов в постальтерационный период может быть результатом восстановительных процессов на уровне всего организма, приводящих к увеличению ломоложения возрастного состава эритрона с повышенный ЭФПЭ.
Анализ типа общей неспецифической адаптационной реакции (Гаркави,1995) свидетельствует, что иммобилизация животных и облучение крыс гамма-излучением приводили к развитию стресс-реакции уже на начальном этапе после воздействия, что проявлялось к 15 мин. снижением уровня лимфоцитов ниже уровня нормы - до 50% (у крыс липфоцитарный тип кроветворения). Моделирование гипоксического состояния у животных приводило к развитию стрессовой реакции к 120 мин. наблюдения. Действие зоотоксинов и физической нагрузки определили развитие реакции активации, число лимфоцитов находилось в верхней половине зоны нормы (60-70%), тогда как действие адреналина на организм вызывало реакцию переактивации (выше 80%). Соотношение форменных элементов белой крови свидетельствовало об отсутствии признаков напряженности адаптационных процессов при действии НИЛИ и КВЧ-излучении, поскольку все они находились в пределах нормы. В остальных случаях, выявленные процентные изменения остальных параметров лейкоцитарной формулы свидетельствовало о развитии напряженности реакции и снижении уровня реактивности.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что в ответ на действие острого стресса клеточная система отвечает целым комплексом стереотипных изменений, выраженность которых зависит от интенсивности воздействия, что проявляется в изменении общих неспецифических реакций на уровне организма.
1.7. Исследование повторяющегося и хронического стрессового воздействия на морфофункциональные показатели эритроцитов Исследование действия повторяющегося стрессового воздействия на ЭФПЭ и концентрацию в них МДА показало сходную тенденцию изменения данных показателей с действие острого стресса. Так, ЭФПЭ к 1 часу после последнего воздействия на животных, как при действии пчелиного яда, так и при физической нагрузке в виде плавания, уменьшалась и возрастала к 1 суткам-1 неделе эксперимента. Пчелиный яд вызывал более значимые изменения как увеличения, так и уменьшения уровня ЭФПЭ (рис.16). При этом исследование концентрации МДА показало, что рост ЭФПЭ сочетался со снижением концентрации МДА. Рассматривая динамику изменения содержания общего, GSН и GSSG в эритроцитах крыс после повторяющегося стрессового воздействия, необходимо отметить, что во всех группах наблюдалось снижение концентрации общего глутатиона, как за счет GSSG, так и за счет GSН. Анализ лейкоцитарной формул крыс после повторяющегося стрессового воздействия показал развитие лимфопении и нейтрофилеза, наиболее ярко выраженных на 1 сутки наблюдения, свидетельствующих о развитии стресс-реакции в организме.
Рис. 16. Изменение ЭФПЭ, концентрации МДА и общего глутатиона при повторяющихся стрессовых воздействиях По оси ординат - % изменения уровня исследуемых показателей к 100 % - уровню значений интактной группы животных, по оси абсцисс - время после воздействия: 1 - 1 час; 2 - 1 сутки; 3 - 1 неделя.
Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными Таким образом, установлено, что повторяющееся стрессовое воздействие, так же как и острый стресс на фоне развития стресс-реакции вызывает первоначальное уменьшение ЭФПЭ с последующим ее ростом. При этом вторая фаза существенно более продолжительна во времени при повторяющимся стрессе, по сравнению с действием острого стресса. По-видимому, этот факт объясняется тем, что при многократном воздействии происходит суммирование эффектов в силу того, что в течение суток сдвиги, вызванные ими в состоянии гомеостаза организма, не успевают полностью исчезнуть. Данное положение сочетается с данными литературы (Горизонтов и др., 1983).
Однако следует подчеркнуть, что изменения в системе глутатиона при действии острого и повторяющегося стрессов носят неоднозначный характер. Так, при остром стрессе рост общего и восстановленного глутатиона свидетельствует о мобилизации резервов низкомолекулярных антиоксидантов, при которой развиваются метаболические перестройки, направленные как на усиление синтеза, так и восстановление окисленной формы глутатиона. Вместе с тем, внутриклеточные ресурсы системы глутатиона ограничены и, вероятно, при действии повторяющегося стресса, емкость данной системы уменьшается.
Дальнейшее исследование изменения ЭФПЭ было проведено при исследовании развития хронического стресса на моделях локальной и глобальной ишемии головного мозга крыс.
В ходе исследования крови крыс было выявлено, что ЭФПЭ животных в течение первых суток изменялась недостоверно с последующим понижением в течение 10 дней после альтерации организма относительно значений интактных крыс. Через 60 суток после моделирования как глобальной, так и локальной ишемии головного мозга ЭФПЭ была существенно повышена по сравнению с интактными животными (p<0.05) (рис. 17).
Исследование концентрации МДА эритроцитов выявило постепенное нарастание уровня данного показателя в ходе развития как глобальной, так и локальной ишемий головного мозга относительно уровня значений интактной группы крыс. Максимальный рост концентрации МДА был выявлен на 10 сутки после альтерации. Наиболее выраженные изменения регистрировались при развитии глобальной ишемии головного мозга. Состояния системы глутатиона характеризовалось снижением общего глутатиона и ГSН, при увеличении концентрации ГSSГ относительно контроля. При исследовании лейкоцитарной формулы у животных после моделирования локальной ишемии головного мозга развивалась реакция переактивации. К 10 дню после альтерации при обоих видах воздействия наблюдался рост сегментоядерных нейтрофилов и уменьшение количества лимфоцитов относительно интактных крыс. К 60 суткам количество лимфоцитов сохранялось пониженным при глобальной ишемии головного мозга, тогда как при локальной ишемии наблюдалась тенденция к восстановлению данного показателя до контрольных значений.
Рис. 17. Изменение ЭФПЭ, концентрации МДА и общего глутатиона при хронической ишемии головного мозга крыс По оси ординат - % изменения уровня исследуемых показателей к 100 % - уровню значений интактной группы животных, по оси абсцисс - время после воздействия, сутки.
Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными Полученные результаты свидетельствуют, что при моделировании ишемии головного мозга у животных наблюдается первичное уменьшение с последующим увеличением ЭФПЭ, что согласуется с полученными данными изменения ЭФПЭ при действии острого и повторяющегося стрессов. Анализ лейкоцитарной флрмулы при локальной ишемии соответствует реакции активации, при глобальной ишемии - реакции стресса. При этом развивающиеся моноцитопения и сдвиг лейкограммы влево свидетельствуют о напряженности реакций адаптации, нарушении гармоничности в функционировании подсистем организма и снижении уровня реактивности в ходе усугубления ишемии головного мозга.
1.8. ЭФПЭ крови больных с заболеваниями разной этиологии Изучение крови больных ХЦВН показало следующую картину изменения исследуемых параметров. Было выявило, что при поступлении в стационар у пациентов при 1 и 2 стадиях заболевания ЭФПЭ была повышена по сравнению с возрастной нормой.
В отличие от этого, 3 стадия заболевания характеризовалась понижением данного показателя относительно ЭФПЭ возрастной нормы (рис. 18). Отмечалось повышение активности перекисного окисления липидов, наиболее выраженное у пациентов с 3-й стадией ДЭ. Уровень общего глутатиона был снижен относительно здорового контроля у всех пациентов с ДЭ, в наибольшей степени это было выражено в 3-й стадии. Различалось и соотношение ГSН и ГSSГ у пациентов с разной степенью ХЦВН. При первой стадии ДЭ происходила значительная активация глутатионового звена антиоксидантной системы, что приводило к трансформации ГSН в ГSSГ. Во второй стадии его активность несколько снижалась, но соотношение ГSН и ГSSГ, тем не менее, значимо отличалось от нормального уровня. При 3-й стадии происходило резкое падение уровня ГSН, что, в сочетании со значительным снижением общего глутатиона, указывало на истощение резервов данной антиоксидантной системы.
При исследовании лейкоцитарной формулы выявлены достоверные изменения количества моноцитов, лимфоцитов, эозинофилов, базофилов относительно возрастной нормы, наиболее выраженные при 3-й стадии заболевания. Для пациентов со 2-й и 3-й стадиями был характерен сдвиг лейкоцитарной формулы влево.
Таким образом, в ходе проведенных исследований было выявлено, что хронический стресс у больных в зависимости от стадии заболевания характеризуется ростом ЭФПЭ на 1 и 2 стадиях и ее падением на 3 стадии заболевания, с увеличением концентрации МДА и уменьшением уровня глутатиона на всех стадия болезни.
Рис. 18. Изменение ЭФПЭ, концентрации МДА и общего глутатиона больных ДЭ По оси ординат - % изменения уровня исследуемых показателей к 100 % - уровню значений возрастной нормы.
Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с возрастной нормой Результаты экспериментальных и клинических данных показали, что динамика изменения исследуемых показателей при моделировании хронической ишемии головного мозга в эксперименте были аналогичны клиническим данным, что подтверждает целесообразность изучения ЭФПЭ как модели исследования развития не только стрессреакции в организме, но и модели позволяющей исследовать развитие патологического процесса.
Подтверждение сказанному являются проведенные исследования крови больных псориазом, ЯБДПК, вертеброгенной люмбоишалгией, нервно-мышечными заболеваниями. Было показано, что не зависимо от этиологии заболевания ЭФПЭ снижена у всех групп больных (табл. 5). На основании полученных результатов следует заключить, что снижение ЭФПЭ носит общий характер, так как проявляется при разных заболеваниях и является закономерным изменением в ответ на текущий патологический процесс, родственный по развивающимся механизмам с элементами стрессовой реакции.
Таблица ЭФПЭ и концентрация МДА при различных видах заболеваний Вид заболевания Показатель Псориаз ЯБДПК Люмбоишалгия Нервно-мышечные заболевания ЭФПЭ, 1,02+ 0,01* 1,09+0,07* 1,11+ 0,02* 1,04+0,04 мкмсм/ Вс МДА, 5,85+0,12* 5,010,22* 5,490,14* 5,560,26* нМоль/л Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) по сравнению с нормой. ЭФПЭ доноров 1,31+0,02 - 1,40+0,03 мкмсм/Вс, концентрация МДА доноров 3,850,14 - 4,340,нмоль/л Анализ состава липидных фракций мембран эритроцитов при псореазе и ЯБДПК показал, что в период болезни и, соответственно, в фазу максимального снижения ЭФПЭ, у обеих групп больных однотипно изменялись уровни фракций сфингомиелина (СФ) и фосфоэтаноламина (ФЭА) - их содержание снижалось, и фракции лизифосфотидилхолина (ЛФХ) - ее содержание, напротив, повышалось. В отличие от выявленной типичности изменений для названных фракций, фракция фосфотидилхолина (ФХ) претерпевала разнонаправленные изменения. При псориазе содержание ФХ уменьшалось, а при ЯБДПК - увеличивалось (табл.6).
Таблица Содержание фосфолипидных фракций (%) в мембранах эритроцитов больных псориазом Показатель Псориаз ЯБДПК Контроль Больные Контроль Больные Лизофосфотидилхолин 1,13+0,27 2,87+0,19* 4,2+0,2 12,6+0,3* Сфингомиелин 13,26+0,20 10,86+0,25* 29,4+0,9 16,4+0,7* Фосфотидилхолин 41,61+0,28 38,65+0,24* 34,8+0,6 43,6+0,8* Фосфотидилэтаноламин 44,00+0,38 37,48+0,25* 31,6+0,6 27,4+1,2* Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контролем Полученные результаты совпадают с литературными данными (Рязанцева, Новицкий, 2004), где аналогичное изменение фракций фосфолипидов было установлено у пациентов при соматической и психической патологии: при однотипном изменении фракций ФЭА, СМ и ЛФХ концентрация ФХ изменялась разнонаправлено. Таким образом, типичность изменений фосфолипидов мембран эритроцитов отражает типичность структурных изменений их мембран при разных заболеваниях и, соответственно, их влияния на суммарный заряд эритроцитов. Наблюдаемые изменения ЭФПЭ опосредованы реорганизацией физико-химической структуры мембраны эритроцитов, которая во многом определяется процессами ПОЛ. Концентрация МДА в эритроцитах показала усиление активности ПОЛ при всех видах патологии (табл. 5).
Таким образом, изменения ЭФПЭ однотипны для изученных видов патологии и стрессе, и находятся в тесной взаимосвязи с изменениями структурно-функционального состояния мембран.
2. Исследование электрокинетических и структурно-функциональных показателей мембран эритроцитов при развитии адаптационных процессов 2.1 Исследование продуктов пчеловодства и ЭМИ на морфофункциональные показатели эритроцитов на фоне острого стресса у животных В предыдущих разделах выявлено, что изменение ЭФПЭ отражает степень активации симпатоадреналовой и гипофизарно-надпочечниковой систем. Целесообразно ожидать, что воздействия, приводящие к более продолжительной активации гипофизарнонадпочечниковой системы, будут оказывать стресслимитирующее действие и определят повышение сопротивляемости организма к внешним стресс-факторам, а также могут использоваться в качестве терапевтических средств, при различных патологических состояниях. Основываясь на наших данных к таким факторам можно отнести продукты пчеловодства и различные ЭМИ. Поэтому на данном этапе работы проводилось исследование восстановления нарушенных показателей гомеостаза продуктами пчеловодства и ЭМИ при моделировании альтерации функций организма животных.
Результаты проведенных исследований при использовании продуктов пчеловодства при моделировании стрессовой реакции путем иммобилизации и гамма-облучения показали, что как при иммобилизации животных, так и при гамма-облучении развивается типичная картина стресс-реакции, которая частично или полностью купируется продуктами пчеловодства. Так, в опытах как с иммобилизацией, так и с гамма-облучением животных было установлено, что иммобилизационный стресс и развитие лучевой болезни у крыс сопровождается ухудшением морфофункционального состояния эритроцитов, что отражалось в виде уменьшения ЭФПЭ и повышения интенсивности ПОЛ - увеличения уровня МДА. Исследование лейкоцитарной формулы свидетельствовало о развитии стресс-реакции.
Использование продуктов пчеловодства после облучения животных приводило к определенному лечебному эффекту по тесту морфофункционального состояния эритроцитов. В отличие от контроля, начиная со второй недели после облучения, во всех опытных группах происходило восстановление ЭФПЭ, наиболее значимое для меда с маточном молочком, и наименее - для меда (табл.7). Наиболее значимое влияние оказывали пчелопродукты на ПОЛ эритроцитов. Как видно из таблицы 8, все пчелопродукты снижали уровень ПОЛ (уменьшение МДА), по сравнению с контролем, в котором он оставался повышенным до конца экспериментов. Следует отметить, что наиболее эффективно повышенный уровень ПОЛ эритроцитов снижали пчелиный яд и Апингалин (суспензия прополиса и маточного молочка), практически восстанавливая уровень МДА до уровня интактных животных.
Таблица 7.
Изменение ЭФПЭ крыс (мкмсм/Вс) при использовании пчелопродуктов после гамма-олбучения крыс Группы Время эксперимента (недели) животных 1 2 Контроль 1,20+ 0,06 0,80+ 0,12* 0,80+ 0,13* Ингаляция (Апингалин) 1,04+ 0,06 1,02+ 0,08 1,04+ 0,06 Мед 1,04+ 0,10 0,90+ 0,08* 1,00+ 0,06* Мед+маточное молочко 1,03+ 0,06 1,01+ 0,06 1,30+ 0,05* Пчелиный яд 1,08+ 0,08 1,05+ 0,10 1,12+ 0,06 Примечание: - статистически значимые различия (р<0,05) с контролем, * - статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными. Значение ЭФПЭ интактных животных 1,15+0,05 мкмсм/Вс Таблица 8.
Изменение концентрации МДА (нмоль/мл) в эритроцитах крыс при использовании пчелопродуктов после гамма-олбучения крыс Группы Время эксперимента (недели) животных 1 2 Контроль 5,85 + 0,65* 11, 20+ 1,25* 11,18 +1,07* Ингаляция (Апингалин) 9,18+ 1,02* 5,40 +0,40 4,42 +0,55 Мед 8,60 + 1,02* 8,58 +0,66* 8,10 +1,01* Мед+маточное молочко 8,50 + 1,06* 6,32 +0,28* 6,00 +1,22 Пчелиный яд 6,90 + 1,07* 4,50 +0,82 4,20 +0,38 Примечание: - статистически значимые различия (р<0,05) с контролем, * - статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными. Значение МДА у интактных животных 4,000,20 нмоль/мл.
Эксперименты, связанные с использованием продуктов пчеловодства в ходе развития иммобилизационного стресса у крыс также выявили улучшение исследуемых маркерных характеристик морфофункционального состояния мембран. Использование продуктов пчеловодства приводило к ограничению продолжительности протекания первой фазы ЭФПЭ, вызванной иммобилизационным стрессом и удлинению второй фазы ЭФПЭ, характеризующей повышение резистентности организма (табл.9). Исследование концентрации МДА эритроцитов крыс после воздействия на их организм продуктов пчеловодства на фоне развития стресса, вызванного иммобилизацией, показало достоверное уменьшение данного показателя относительно значений, полученных для иммобилизированных животных. Наиболее значимое снижение концентрации МДА регистрировалось при использовании маточного молочка и меда с маточным молочком (табл.10).
Таблица Динамика изменения ЭФПЭ (мкмсм/Вс) при действии продуктов пчеловодства на фоне иммобилизации крыс Время воздействия Вид воздействия 15 мин 1сутки 1неделя Иммобилизационный стресс 1,15+0,04* 1,10+0,05* 1,45+0,07* Контроль 1,330,04 1,390,04 1,350,Иммобилизационный стресс+пчелиный яд 1,22+0,06* 1,37+0,06 1,39+0,Пчелиный яд 1,25+0,03* 1,42+0,05 1,52+0,04* Иммобилизационный стресс+маточное молочко 1,330,08 1,250,10 1,260,Маточное молочко 1,320,10 1,660,10* 1,470,10* Иммобилизационный стресс+мед+маточное 1,400,06 1,500,10 1,510,06* молочко Мед+маточное молочко 1,440,05* 1,540,10 1,400,Имобилизационный стресс+мед+прополис 1,380,07 1,400,09 1,400,Мед+прополис 1,390,10 1,440,09 1,360,Имобилизационный стресс+мед 1,260,05 1,250,08 1,300,Мед 1,300,08 1,340,09 1,360,Примечание: * - статистически значимые различия (р<0,05) с контролем, - статистически значимые различия (р<0,05) с иммобилизированными животными. Значения ЭФПЭ интактных животных - 1,360,10 (мкмсм/Вс) Использование лейкограммы в качестве показателя адаптационных реакций организма при действии продуктов пчеловодства на фоне стресс-реакции подтвердило эффективность их использования на моделях гамма-облучения и иммобилизации животных, что выражалось в ограничении стресс-реакции и снижении напряженности с увеличение резистентности организма.
Таблица Динамика изменения концентрации МДА в эритроцитах (нмоль/мл) при действии продуктов пчеловодства на фоне иммобилизации крыс Время воздействия Вид воздействия 15 мин 1сутки 1неделя Иммобилизационный стресс 5,41+0,12* 6,06+0,10* 3,46+0,Контроль 3,28+0,10 4,73+0,18 3,30+0,Иммобилизационный стресс+пчелиный яд 5,32+0,14* 5,64+0,16* 3,36+0,Пчелиный яд 3,71+0,17* 3,90+0,10* 3,19+0,10 Иммобилизационный стресс+маточное молочко 3,520,25 3,760,90* 3,340,Маточное молочко 3,190,17 3,320,82* 3,170,Иммобилизационный стресс+мед+маточное 3,830,34* 3,890,12* 3,270,молочко Мед+маточное молочко 3,760,30 3,460,31* 2,970,18 Имобилизационный стресс+мед+прополис 3,970,37 3,510,29* 3,750,Мед+прополис 3,080,30 2,950,18* 3,140,Имобилизационный стресс+мед 4,390,37 * 4,940,29 3,760,Мед 3,880,30 4,220,32 3,740, Примечание: * - статистически значимые различия (р<0,05) с контролем, - статистически значимые различия (р<0,05) с иммобилизированными животными. Значения МДА интактных животных - 3,010,45 (нмоль/мл) Таким образом, продукты пчеловодства в исследуемых концентрациях вызывают развитие адаптационных процессов в организме, обеспечивающих приспособление его функционального состояния в условиях стрессового воздействия на всех уровнях.
Действие продуктов пчеловодства, приводя к активации гипофизарно-надпочечниковой системы, стимулирует адаптивные механизмы в эритроцитах, что проявляется в повышении их ЭФПЭ, свидетельствующей о снижении деструктивных изменений эритроцитарных мембран, развивающихся при воздействии на организм иммобилизационного стресса и гамма-облучения. Следует подчеркнуть, что эффективность продуктов пчеловодства зависит от вида стрессового воздействия. Так, на фоне радиооблучения организма пчелиный яд и мед+прополис определяют поддержание уровня ЭФПЭ, приближенного к значениям интактных животных, мед с маточным молочком вызывают даже рост ЭФПЭ. При этом наиболее значимо тормозят повышенную активность ПОЛ пептиды пчелиного яда и флаваноиды прополиса, являясь известными ловушками свободных радикалов (Корягин, 2007). Кроме того, именно яд и прополис как наиболее чужеродные для организма соединения, наиболее активно стимулируют выброс кортикостероидов, соответственно, наиболее активно тормозят процессы клеточной пролиферации, что в условиях радиопоражения (на ранней стадии) также может оказать радиопротекторный эффект (Крылов и др., 2008). Именно этим можно объяснить вывяленную в опытах определенную неэффективность примененных пчелопродуктов в 1-ю неделю после облучения. При этом иммобилизация, являясь стрессом менее сильным по сравнению с гамма-облучение, вызывает менее значимые как по вектору, так и по продолжительности отклонения ЭФПЭ и концентрации МДА, и наиболее эффективным оказывается использовании в качестве терапевтического средства меда с маточным молочком - продукта, который по всей видимости, вызывает общетонизирующее действие на организм, что приводит к повышению общей резистентности организма, опосредованной активацией гипофизарно-надпочечниковой системы.
Исследование воздействия ЭМИ на организм крыс в вышеприведенных исследованиях позволяют предположить возможность их использования в терапевтических целях. Результаты проведенных исследований показали, что воздействие изучаемых ЭМИ - как НИЛИ, так и КВЧ, на интактных животных не оказывало влияния на исследуемые показатели гомеостаза. В отличие от действия ЭМИ, введение животным адреналина приводило к существенным сдвигам гомеостаза, свидетельствующим о выраженной стресс-реакции организма. Было установлено, что эта реакция затрагивала все исследованные системы.
Воздействие изученных ЭМИ на фоне адреналиновой стресс-реакции вызывало полное или частичное восстановление нарушенных адреналином всех изучаемых показателей. НИЛИ, так и КВЧ-излучение, на альтерированный организм способствовали переходу гомеостаза из состояния переактивации в состояние повышенной активации.
Одновременно с этим происходило восстановление сниженной ЭФПЭ. Действие НИЛИ на данный показатель было более выражено по сравнению с КВЧ излучением (рис.19).
1,# # # # # # # * 0,* * o * 0,0,0,30 60 1время после воздействия, мин интактные адреналин НИЛИ адр+НИЛИ КВЧ адр+КВЧ Рис. 19. Динамика изменения ЭФПЭ при действии ЭМИ на фоне адреналовой токсемии Примечание: * - статистически значимые различия (р< 0,05) с интактным; # - статистически значимые различия (р< 0,05) с введением адреналина; - статистически значимые различия (р< 0,05) с КВЧ облучением.
45 40 # * # # ** * # * * # # # o * * * * 35 # * ** * o # o # # # * # 30 * ** * 25 15 5 30 60 120 время после воздействия, мин 30 60 1время после воздействия, мин А В # * # # * # # * # * # ** ** ** * * o * * o * * * 12 * # o + * # * o + * # * # * # o 10 ** * # ** 8 ** # # # # # # 30 60 130 60 1время после воздействия, мин вре мя после возде йствия, мин инт акт ные адреналин НИ ЛИ адр+НИ ЛИ КВЧ адр+КВЧ С D Рис. 20. Динамика изменения фосфолипидов в эритроцитах при действии ЭМИ на фоне адреналовой токсемии: А - ФЭА, В - ФХ, С - СМ, D - ЛФ.
Примечание: * - статистически значимые различия (р< 0,05) с интактным; # - статистически значимые различия (р< 0,05) с введением адреналина; - статистически значимые различия (р< 0,05) с КВЧ облучением. ** - статистически значимые различия (р< 0,05) с НИЛИ мкмсм/Вс доля фосфолипида,% доля фосфолипида,% доля фосфолипида, % доля фосфолипида,% При действии ЭМИ сниженные альтерацией показатели ФТЭА, СМ и повышенное содержание ФХ, а также ЛФ восстанавливались, приближаясь к значениям у интактных животных (рис.20).
Отмеченное в наших опытах восстановление ЭФПЭ при действии ЭМИ на альтерированный организм животных можно связать с активацией 2-й фазы стресс реакции и повышением уровня в крови гормонов коры надпочечников. Повышение уровня кортикостероидов, для которых характерно долгосрочное действие, определяет увеличение ЭФПЭ за счет влияния гормонов на фосфолипиды мембран эритроцитов, способствуя восстановлению их электроотрицательности.
Соответственно, анализ полученных результатов свидетельствует, что при остром стрессе, проявляющееся коррекция гомеостаза, как продуктами пчеловодства, так и ЭМИ может быть объяснена развитием в организме относительно продолжительной компенсаторной реакции, опосредованной активацией гипофизарно-надпочечниковой системы, приводящей к повышению уровня циркулирующих глюкокортикоидов и направленных на элиминацию патогенного стресс-фактора.
2.2. Действие стрессмодулирующих средств на ЭФПЭ при развитии у животных хронического стресса Длительное действие стресс фактора, в частности хроническая ишемия головного мозга, может вызывать развитие адаптационного процесса в организме, который при благоприятном течении приводит к развитию адаптации, при неблагоприятном - дизадаптации. При этом в процессе хронического стресса наблюдается вовлечение гипофизарно-надпочечникового звена, поэтому представляется целесообразным исследование адаптационных возможностей организма при применении препаратов, влияющих на уровень адаптационного резерва и активирующих стрессреализующие механизмы.
Исследование ЭФПЭ при ишемических нарушениях головного мозга животных выявило, что используемые препараты (пирацитам, кавинтон, цитофлавин, геримакс) на фоне глобальной ишемии головного мозга крыс вызывали увеличение данного показателя относительно контроля, за исключением комплексного воздействия с дельтараном, определяющего понижение ЭФПЭ (табл. 11). В тоже время, исследуемые препараты на фоне локальной ишемии головного мозга, характеризующейся существенным ростом ЭФПЭ, либо не оказывали влияния на ЭФПЭ (пирацитам, кавинтон, цитофлавин), либо понижали ее, приближая к уровню показателей интактной группы животных.
Таблица 11.
ЭФПЭ крови крыс (мкмсм/Вс) при применении стрессмодулирующих препаратов на фоне ишемии головного мозга к 60 суткам наблюдения.
Группы интактные контрольная пирацетам и пирацетам и пирацетам и пирацетам животные группа кавинтон кавинтон+ кавинтон+ и кавинтон животных цитофлавин дельтаран +геримакс Глобальная 1,310,05 1,460,06" 1,620,07"* 1,600,07"* 1,430,06 1,510,05" ишемия Локальная 1,320,06 1,630,06" 1,600,06" 1,750,06" 1,400,03* 1,360,04* ишемия Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) с контрольными животными, "- статистически значимые различия (р<0,05) с интактными животными Таким образом, на фоне снижения адаптационных возможностей организма при глобальной ишемии головного мозга животных применение препаратов вызывало дополнительную активацию стрессреализующих систем, за исключением дельтарана, который оказывал стресслимитирующее действие. Напротив, при избыточном напряжении механизмов адаптации на фоне локальной ишемии головного мозга используемые препараты приближали адаптационные реакции к уровню физиологической нормы и восстанавливали баланс стрессреагирующих и стресслимитирующих систем.
При исследовании лейкоцитарной формулы крови крыс, динамика показателей во всех группах кроме контрольной была однонаправленной: повышение количества лимфоцитов и снижение нейтрофилов до уровня интактных животных, что свидетельствовало о снижении уровня напряженности и повышении реактивности организма.
В ходе экспериментальных исследований показана возможность воздействия стрессмодулирующих препаратов на состояние адаптационного резерва в целях повышения неспецифической резистентности организма, что позволяет обосновывать целесообразность включения стрессмодулирующей терапии в комплекс лечения больных ХЦВН. Поэтому дальнейшие исследование посвящено изучению изменения ЭФПЭ при проведении терапевтических мероприятий у больных ХЦВН.
2.3. Исследование ЭФПЭ крови больных в динамике терапии Исследование изменения ЭФПЭ больных ХЦВН после проведенной курсовой терапии показало, что она зависит как от тяжести заболевания, так и выбора препаратов лечения. Применение базовой терапии больным ДЭ 1-й стадии заболевания, так же как и дополнительно дельтарана и цитофлавина приводило к тенденции восстановления (снижения) ЭФПЭ к уровню показателей ЭФПЭ здоровых (доноров), указывая на приближение адаптационных реакций к уровню физиологической нормы и восстановлению баланса стрессреагирующих и стресслимитирующих систем (табл.12).
Наиболее значимые изменения ЭФПЭ регистрировались при использовании дельтарана. В отличие от дельтарана и цитофлавина, применение геримакса, наоборот, приводило к повышению ЭФПЭ больных по сравнению с нормой, что отражало переактивацию адаптационных процессов.
Таблица ЭФПЭ крови больных дисциркуляторной энцефалопатией (мкмсм/Вс) Терапевтическое Время Стадии заболевания воздействие исследования II III I До лечения 2,0+ 0,03* 1,90+ 0,03 1,70+ 0,Базовое лечение После 1,90+ 0,05 2,40+ 0,04* 1,96 +0,02* До лечения 2,0+ 0,02* 1,90+ 0,01* 1,70 +0,Дельтаран После 1,75+0,06 1,80+ 0,04 1,78+ 0,До лечения 2,50+0,01* 2,10 + 0,04* 1,77+0,Цитофлавин После 1,90+ 0,07 2,40+0,04* 1,90+ 0,До лечения 2,0+0,02* 2,0+0,04* 1,70+ 0,03* Геримакс После 2,20+0,04* 2,30+0,03* 2,10+0,04* Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) к значениям ЭФПЭ здоровых (доноров). Значение ЭФПЭ крови здоровых (доноров) 1,78+0,02 мкмсм/Вс В отличие от результатов, полученных при изучении ЭФПЭ больных 1-й группы, у больных на 2-й стадии заболевания применение препаратов базового комплекса и дополнительно цитофлавина и геримакса приводило только к увеличению ЭФПЭ по отношению к уровню ЭФПЭ здоровых доноров. Динамика изменений ЭФПЭ свидетельствовала об активизации адаптационных процессов при действии данных препаратов, что, по всей видимости, обусловлено недостаточной активностью гипофизарно - надпочечниковой системы на второй стадии. Однако отмеченное избыточное нарастание показателя отражало переактивацию адаптационных процессов. В то же время дельтаран, так же, как и при 1 стадии заболевания, вызывал уменьшение исходно повышенного показателя ЭФПЭ.
На третьей стадии заболевания, восстановление к норме исходно пониженного уровня ЭФПЭ происходило только при дополнительном использовании дельтарана и цитофлавина, тогда как базовое лечение, в большей степени, - с геримаксом, наоборот, приводило к увеличению уровня ЭФПЭ.
Таким образом, анализ ЭФПЭ больных ДЭ свидетельствует об активации гипофизарно-надпочечниковой системы на 1 стадии заболевания с постепенным ее истощением в ходе усугубления патологического процесса. По всей видимости, степень включения адаптационных процессов при развитии хронической цереброваскулярной недостаточности определяет различное влияние препаратов на разных стадиях заболевания, отражаемое в изменении ЭФПЭ. На 1 стадии заболевания использованные препараты вызывали восстановление исходного статуса организма, на 2 и на 3 стадиях определяли дополнительную активацию. В то же время, на основе анализа ЭФПЭ продемонстрирована возможность целенаправленного воздействия на течение адаптационно-приспособительных процессов при применении стрессмодулирующей терапии. Так, включение в комплексную терапию регуляторного пептида дельтарана, оказывало корригирующее воздействие на течение адаптационного процесса на всех стадиях ДЭ. Применение стресстренирующей терапии (геримакса) и цитофлавина, препарата обладающего цитопротективным действием, оказывало активирующее влияние на адаптационные механизмы, отражая активацию адренало-гипофизарнонадпочечниковой оси для реализации механизмов адаптации.
Анализ результатов экспериментальных и клинических данных свидетельствует о возможности регулирующего действия различных препаратов на развитие адаптационных реакций при ишемии головного мозга, что подтверждает целесообразность исследования ЭФПЭ как критерия адаптационных резервов организма в целях повышения эффективности проводимой терапии.
Для подтверждения возможности использования ЭФПЭ как маркера развития патологии и степени включения адаптационных резервов организма нами проведены исследования крови больных псориазом, ЯБДПК, вертеброгенной люмбоишалгией, нервно-мышечными заболеваниями после проведения терапевтических мероприятий.
Проведенные исследования показали, что в ходе лечения больных различными заболеваниями, ЭФПЭ увеличивалась, приближаясь к уровню физиологической нормы (Табл.13). При этом уровень малонового диальдегида уменьшался по сравнению с показателями до лечения и концентрация фосфолипидных фракций мембран эритроцитов восстанавливалась (Табл. 14,15,16). Следует отметить, что у больных псориазом при включении в стандартный курс лечения КВЧ-терапии показатели ЭФПЭ восстанавливались до уровня контроля, так же как у больных вертеброгенной люмбоишалгией и нервно-мышечными заболеваниями при дополнительном использовании апитерапии (введение пчелиного яда). Выше описанные эксперименты при использовании как КВЧ-излучения, так и пчелиного яда при развитии стресса у животных показали возможность стимуляции данными физиотерапевтическими и фармакологическими средствами гипофизарно-надпочечниковой системы. Значимое увеличения ЭФПЭ при включении в терапию больных адаптогенов, по всей видимости, свидетельствует о развитии адаптационных процессов в организме, связанных с запуском нейрогормональной системы, ответственной за восстановление нарушенного гомеостаза.
Изменение ЭФПЭ сочеталось с динамикой основной симптоматикой болезни.
Таблица 13.
Изменение ЭФПЭ (мкмсм/Вс) при различных видах заболеваний Показатель Время Вид заболевания исследовани Псориаз ЯБДПК Люмбоишалгия Нервноя мышечные заболевания Стандартная До лечения 1,02+ 0,01 1,09+0,07 1,11+ 0,02 1,07+0,терапия После 1,10+ 0,01* 1,46+0,07* 1,30+ 0,07* 1,16+ 0,08* Стандартная До лечения 1,04+ 0,01 _ 1,10+ 0,02 1,05+0,терапия + После 1,30+ 0,01* _ 1,38+ 0,05* 1,24+ 0,08* адаптогены Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) к значениям до лечения.
Таблица 14.
Изменение концентрации МДА в эритроцитах (нмоль/л) при различных видах заболеваний Показатель Время Вид заболевания исследовани Псориаз ЯБДПК Люмбоишалгия Нервноя мышечные заболевания Стандартная До лечения 5,85+0,06 5,010,22 5,490,14 5,620,терапия После 4,20+0,05* 4,420,20* 5,040,18* 5,020,20* Стандартная До лечения 5,70+0,06 _ 5,380,17 5,560,терапия + После 3,85+0,03* _ 4,640,20* 4,480,14* адаптогены Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) к значениям до лечения.
Таблица Содержание фосфолипидных фракций (% от общего содержания фосфолипидов) в мембранах эритроцитов больных псориазом Показатель Контроль До лечения После лечения (стандартная терапия) Лизофосфотидилхолин 1,13+0,27 2,87+0,19* 1,20+0,15 Сфингомиелин 13,26+0,20 10,86+0,25* 14,00+0,19 Фосфотидилхолин 41,61+0,28 38,65+0,24* 41,65+0,27 Фосфотидилэтаноламин 44,00+0,38 37,48+0,25* 43,54+0,20 Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) к контролю, - статистически значимые различия (р<0,05) к значениям до лечения.
Таблица Содержание фосфолипидных фракций (% от общего содержания фосфолипидов) в мембранах эритроцитов больных ЯБДПК Показатель Контроль До лечения После лечения Лизофосфотидилхолин 4,2+0,2 12,6+0,3* 6,3+0,8* Сфингомиелин 29,4+0,9 16,4+0,7* 22,6+0,9* Фосфотидилхолин 34,8+0,6 43,6+0,8* 39,4+1,1* Фосфотидилэтаноламин 31,6+0,6 27,4+1,2* 31,7+1,6 Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05) к контролю, - статистически значимые различия (р<0,05) к значениям до лечения.
Таким образом, полученные данные демонстрируют зависимость изменения ЭФПЭ от состояния организма. Положительная динамика ЭФПЭ в процессе лечения больных при разных заболеваниях отражает восстановление функциональных свойств эритроцитарной мембраны, что обусловлено нормализацией ПОЛ и их липидного спектра.
В свою очередь процессы, связанные с мембранными характеристиками опосредованы восстановительными процессами в организме, что позволяет рассматривать ЭФПЭ в качестве диагностического и прогностического критерия эффективности проводимой терапии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате проведенного исследования установлен ряд принципиально новых фактов свидетельствующих, что однонаправленность изменения ЭФПЭ при различных экстремальных воздействиях и патологии, является общей неспецифичной реакцией организма. Анализ закономерностей изменения ЭФПЭ при различных экстремальных воздействиях и патологии свидетельствует, что данный показатель является отражением общей неспецифической реакции организма на раздражитель и связан с развитием стрессреакции и вовлечением стресс-реализующих систем на действие чрезвычайных раздражителей (рис. 21).
Проведенное исследование позволяет заключить, что разные альтетрирующие воздействия вызывают запуск универсального ответа клеточной системы, связанный с развитием стресс-реакции организма, которая включает стадию активации, стадию резистентности и стадию истощения. При этом на клеточном уровне реализуется последовательное включение адаптацинных процессов, опосредованное развитием общего адаптационного синдрома на уровне организма. Так, в ответ на любое стрессовое воздействие в эритроците, как в биологической системе, развивается своеобразная стадия тревоги, которая характеризуется всплеском процессов свободнорадикального окисления, приводящих к модификации фосфолипидного и белкового состава и уменьшению электроотрицательности мембран, сочетающееся с увеличением активности Na,К-АТФазы. Эта стадия способствует повышению активности антиоксидантной системы, лимитирующей развитие процессов перекисного окисления липидов, и обуславливает развитие стадии адаптации клеточной системы, сопряженной с ингибированием активности Na,К-АТФазы, восстановлением электроотрицательности мембраны и ее фосфолипидного и белкового спектров, а также с мобилизацией резервов низкомолекулярных антиоксидантов, в частности, глутатиона. При благоприятном течении адаптационного процесса происходит повышение резистентности организма, при неблагоприятном течении развиваются процессы, приводящие к дизадаптации организма и развитием патологии, проявляющейся в снижении ЭФПЭ, сопряженной с усилением деструктивных процессов на уровне клетки, проявляющихся развитием дисбаланса про- и антиоксидантных процессов.
Таким образом, ЭФПЭ является маркером стрессовой реакции, характеризующим вовлечение адаптационных систем организма, анализ которой дает возможность целенаправленно воздействовать на механизмы компенсации, способные повысить неспецифическую устойчивость организма.
Стрессовое воздействие Активация симпатоадреналовой системы катехоламины Стадия тревоги (активации) Активация гипофизарно-надпочечниковой системы глюкокортикоиды Стадия резистентности (адаптации) Стадия истощения (дизадаптации) Рис. 21. Взаимосвязь ЭФПЭ с их структурно-функциональными показателями в ходе развития стресс-реакции в организме.
ВЫВОДЫ 1. Изучение ЭФПЭ при действии разных альтерирующих факторов как химической, так и физической природы, а также сравнительно-видовое исследование ЭФПЭ холоднокровных и теплокровных животных показало сходство в динамике изменения ЭФПЭ, что выражалось в уменьшении ЭФПЭ (1-я фаза) с последующим ее увеличением (2-я фаза). Выраженность фаз ЭФПЭ зависела от интенсивности и типа воздействия на организм;
2. Динамика изменения ЭФПЭ опосредовалось последовательной активацией стресс-реализующих систем. Первичное уменьшение ЭФПЭ при стрессовых воздействиях связано с активацией выделения эндогенных катехоламинов и их действии на мембрану клеток. Вторая фаза - увеличение ЭФПЭ, имеет долгосрочное действие и обусловлена нарастанием в крови глюкокортикоидов. Механизм изменения ЭФПЭ под влиянием адреналина и кортизола реализуется через модификацию мембраны при изменении реактивности организма;
3. Уменьшение ЭФПЭ при остром стрессе сочеталось с увеличением концентрации МДА, изменением состава фосфолипидов - снижение содержания фракции ФЭА, СМ, возрастание лизоформ, и изменением белкового спектра - уменьшение концентрации силогликопротеинов, спектрина и увеличении белков полос 4.1, 4.2, 4.9, тропомиозина. Рост ЭФПЭ был сопряжен с увеличением концентрации общего и восстановленного глутатиона, уменьшением концентрации МДА, восстановлением фосфолипидного и белкового статуса эритроцитарных мембран;
4. ЭФПЭ при различных видах альтерации снижалась на фоне повышения активности Na-K-АТФазы, роста концентрации АТФ в клетках и увеличения их сферичности. Проявление второй фазы ЭФПЭ сопровождалось ингибированием работы Na-K-АТФазы, понижением концентрации АТФ, ростом 2,3ДФГ и обратимой эхиноцитарной трансформацией эритроцитов;
5. Повторяющееся стрессовое воздействие (физическое и токсическое), и хронический стресс в виде локальной и глобальной ишемии головного мозга крыс вызывали первоначальное уменьшение ЭФПЭ с последующим ее ростом. Начальный этап ЭФПЭ при действии альтерирующих факторов был обусловлен развитием окислительного стресса, увеличением концентрации МДА, снижением общего и восстановленного глутатиона, приводящего к изменению структуры мембраны. Фазность проявления ЭФПЭ была более продолжительна во времени при повторяющимся и хроническом стрессах по сравнению с действием острого стресса. Исследование различных видов патологии организма человека показало, что снижение ЭФПЭ носило общий характер не зависимо от вида заболевания и являлось закономерным изменением в ответ на текущий патологический процесс, родственный по развивающимся механизмам с элементами стрессовой реакции;
6. Анализ ЭФПЭ и ОНАР свидетельствовал, что различные альтерирующие воздействия вызывают запуск универсального ответа клеточной системы, связанный с последовательным включением адаптацинных процессов, опосредованных развитием общего адаптационного синдрома на уровне организма. При этом первую фазу - снижение ЭФПЭ можно рассматривать как стадию тревоги системы, вторую - стадию напряжения системы, - характеризуется возвращением сниженной функции к исходному состоянию, или, если стрессовое воздействие продолжается, к повышенной функции системы в новых условиях;
7. Фармакологические и физиотерапевтические средства на фоне альтерации функций у крыс (гамма-облучение, иммобилизация, ишемия головного мозга) и терапия больных с различными видами патологии (ХЦВН, вертеброгенная люмбоишалгия, нервно-мышечные заболевания, ЯБДПК, псориаз) вызывали восстановление ЭФПЭ до показателей физиологической нормы.
8. Использование ЭФПЭ в качестве раннего и значимого критерия развития стресс-реакции в организме позволяет проанализировать тяжесть альтерационного процесса и эффективность корригирующих воздействий с учетом развития адаптационных реакций.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК 1. Крылов В.Н., Густов А.В. Дерюгина А.В. Электрофоретическая подвижность эритроцитов и стресс // Физиология человека, 1998. Т.24, №6. С.108-111.
2. Хомутов А.Е., Орлов А.В., Калашникова Л.М., Дерюгина А.В., Зимина Т.А.
Средство от ужалений // Пчеловодство, 1999. №1. С.60-61.
3. Шереметьев Ю. А., Суслов Ф.Ю., Шереметьева А.В., Дерюгина А.В. Влияние нейроминидазы и протеолитических ферментов на электрофоретическую подвижность эритроцитов и их агрегацию, индуцируемую Lа2+// Биофизика, 2000. Вып.1. С.79-82.
4. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Костина О.В. Влияние солапивена на реологические свойства крови ожоговых больных // Пчеловодство, 2002. №5. С.55.
5. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Сравнительный анализ действия различных видов ЭМИ на электрофоретическую подвижность эритроцитов // Вестник Нижегородского унив. им. Н.И.Лобачевского. Серия Биология, 2004. Вып.1, №7. С.16-21.
6. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Типовые изменения электрофоретической подвижности эритроцитов при стрессовых воздействиях // Бюлл. эксп. биол. и мед., 2005.
Т.139, №4. С. 364-366.
7. Дерюгина А.В., Крылова Е.В., Лукьянова Л.Д. Влияние убихинона-10 и янтарной кислоты на функциональные характеристики эритроцитов крыс при адреналовой токсемии // Бюлл. эксп. биол. и мед., 2006. Т. 141, №4. С.397-400.
8. Антипенко Е.А., Густов А.В., Дерюгина А.В., Крылов В.Н., Паренко М.К.
Комплексная оценка адаптационных возможностей пациентов с хронической церебраваскулярной недостаточностью // Практическая неврология и нейрореабилитация, 2008. №4. С.6-10.
9. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Стресс-реакция организма при апитерапии пчелиным ядом // Пчеловодство, 2009. №2. С.56-57.
10. Антипенко Е.А., Густов А.В., Григорьева В.Н., Артемина Е.Е., Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Николаев И.Н. Использование препарата геримакс энерджи для оптимизации адаптационного процесса при дисциркуляторной энцефалопатии //Неврологический журнал, 2009. Т.14, №2. С.55-58.
11. Дерюгина А.В., Копылова С.В., Таламанова М.Н., Чигарова О.А., Крылов В.Н.
Изменение реактивности крови крыс при различных способах введения пчелиного яда //Вестник Ниж университета им. Н.И.Лобачевского, 2009. №2. С.107-110.
12. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Антипенко Е.А. Типовые изменения электрофоретической подвижности эритроцитов и их фосфолипидный состав при разных заболеваниях //Клиническая лабораторная диагностика, 2009. №9. С.37-40.
13. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Лобкаева Е.П., Ошевенский Л.В. Изменение электрофоретической подвижности эритроцитов при действии низкоинтенсивного импульсного магнитного поля // Биофизика, 2010. Т.55,Вып. 4. С.652-657.
14. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Гришина А.А. Изменение электрофоретической подвижности эритроцитов и липидного спектра их мембран при различных стрессовых воздействиях // Гематология и трансфузиология, 2010. №3. С.40-15. Дерюгина А.В., Захарова О.А., Крылов В.Н. Влияние пчелиного яда на адаптивные реакции эритроцитов при иммобилизационном стрессе // Вестник Нижегородского университета им. Н.И.Лобачевского, 2010. №4. С.627- 616. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Захарова О.А., Антипенко Е.А. Неспецифические адаптационные реакции крови при хронической ишемии головного мозга // Клиническая лабораторная диагностика, 2010. №12. С.28-17. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Плескова С.Н. Электрофоретическая подвижность и морфометрия эритроцитов крыс при стрессовых воздействиях // Современные медицинские технологии, 2010. №4. С.23-27.
18. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Адаптационные реакции системы крови крыс при действии низкоинтенсивных электромагнитных излучений // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2010. Вып. 96, №6. С.582-589.
19. Дерюгина А.В., Крылов В.Н., Кондратьева Е.В. Взаимосвязь электрофоретической подвижности и спектра белков эритроцитов у крыс // Вестник Ниж университета им.
Н.И.Лобачевского, 2010. №6. С.119-123.
20. Антипенко Е.А, Трошин В.В., Густов А.В., Дерюгина А.В. Неспецифическая резистентность организма при хронической ишемии головного мозга // Медицинский альманах, 2011. № 1. С.60-21. Дерюгина А.В., Крылова Е.В., Антипенко Е.А. Исследование электрофоретической подвижности эритроцитов при использовании апитерапии // Традиционная медицина, 2011. №5. С.342-322. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Изменение электрофоретической подвижности изолированных эритроцитов при действии стресс-факторов // Гематология и трансфузиология, 2011. №5. С.18-21.
Изобретения 23. Антипенко Е.А., Густов А.В., Дерюгина А.В., Мокина Т.В. Способ выбора тактики лечения у больных с хронической ишемией головного мозга. Заявка № 2371193 от 13.10.2009.
24. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Антипенко Е.А. Способ оценки функции коры надпочечников. Заявка № 2011101256/001560 от 19.09.2011.
Статьи в региональных изданиях и материалы конференций 25. Дерюгина А.В., Ошевенский Л.В., Крылов В.Н. Влияние солапивена на кровь при электрофоретическом введении // Матер. IV научно-практич. конф. по апитерапии Апитерапия сегодня, Рыбное, 1994. С.63.
26. Troitskaya V.T., Derugina A.V., Krylov V.N. The influence of the electrophoretic mobility of erythrocytes // XXXIV intermational apicultural congress of apimondia, Lausanne, 1995. Р.405-406.
27. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Дезагрегирующее действие пчелиного яда // Матер. V научно-практич. конф. по апитерапии Пчелы и ваше здоровье, Рыбное, 1997. С.97.
28. Дерюгина А.В., Густов А.В., Дудкина О.В., Крылов В.Н. Солапивен в лечении больных вертеброгенной люмбоишалгией // Матер. V научно-практич. конф. по апитерапии Пчелы и ваше здоровье, Рыбное, 1997. С.130.
29. Антипенко Е.А., Анисимова Л.М., Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Николаев И.Н.
Апипунктура у пожилых больных хронической цереброваскулярной недостаточностью // Матер. V научно-практич. конф. по апитерапии Пчелы и ваше здоровье, Рыбное, 1997.
С.131.
30. Дерюгина А.В. Свертываемость крови и перекисное окисление в условиях действия на организм гепарина и пчелиного яда //Матер. Рос. науч-практич. конф.
Экология, здоровье и природопользование, Саратов, 1997.С.31. Антипенко Е.А., Анисимова Л.М., Дерюгина А.В., Густов А.В., Крылов В.Н.
Эффективность апипунктуры в нейропедиатрической практике // Матер. Второго Европейского конгр. Акупунктурные Белые Ночи, Санкт- Петербург, 1997. С.27-32. Дерюгина А.В. Анализ изменения электрофоретической подвижности и агрегации эритроцитов при действии пчелиного яда // Вторая Нижегородская сессия молодых ученых: тезисы докладов. Н.Новгород, 1997. С.233. Derugina A.V., Krilov V.N., Dudkina O.V., Gustov A.V. Solapiven in the treatment of patients with vertebral lumboischialgesis // XXXV intermational apicultural congress, Antwerp, Belgium, 1997. Р. 234. Дерюгина А.В., Хомутов А.Е., Зимина Т.А. Стабилизация показателей гемостаза при действии пчелиного яда и гепарина // Кислотно-основной и температурный гемостаз:
физиология, биохия клиника: Матер. конф., Сактывкар, 1997. С.175-135. Антипенко Е.А., Анисимова Л.М., Густов А.В., Дерюгина А.В., Крылов В.Н. Опыт применения апитерапии у пожилых больных дисциркуляторной энцефалопатией// Неврологический вестник, 1997. Вып. 3/4. С.95-36. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Влияние пчелиного яда и его компонентов на электрофоретическую подвижность эритроцитов // Укр. биохим. журн., 1998. Т.70, №2.
С.36-41.
37. Дерюгина А.В. Влияние гепарина на коагулирующие свойства крови в условиях действия на организм пчелиного яда // Регуляция и управление в биосистемах: сборник трудов молодых ученых биол. фак. ННГУ, 1998. С.34-38. Дерюгина А.В., Дудкина О.В. Изменение гематологических показателей при использовании солапивена в патологии // Регуляция и управление в биосистемах: сборник трудов молодых ученых биол.фак. ННГУ, 1998. С.43-39. Дерюгина А.В. Исследование терапевтического действия пчелиного яда на систему крови при радиационном поражении организма // Третья Нижегородская сессия молодых ученых: тезисы докл., Н.Новгород, 1998. С.201-240. Дерюгина А.В., Попов М.В., Крылов В.Н. Влияние солапивена на электрокинетические свойства эритроцитов // Материлы VI Научо-практич. конф. по апитерапии: тезисы докл. Рыбное, 1998. С.57-41. Орлов А.В., Хомутов А.Е., Дерюгина А.В. Усиление токсического действия пчелиного яда антагонистами гепарина // Апитерапия сегодня. Материалы 6-й научнопрактической конференции. Рязань, 1998.С.73-74.
42. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Электрофоретическая подвижность эритроцитов (ЭФПЭ) как индикатор регуляции гомеостаза //Всероссийск. научн. конф. с межд.
участием, посвящ.150-летию акад. И.П.Павлова/Матер. конф. С.-Пб.,1999. С.143. Krilov V.N., Derugina A.V. Electrophoretic mobility of erythrocytes and stress-reaction by bee venom // XXXVI intermational apicultural congress, Vancouver, Canady, 1999. С.244. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Антипенко Е.А. Апитерапия и электрофоретическая подвижность эритроцитов//Апитерапия сегодня / Матер. 7 научно.-практич. конф. Рыбное, 2000. С.118-145. Крылов В.Н, Капустина Н.Б., Максимов Г.А., Дерюгина А.В. Влияние КВЧвоздействия на электрофоретическую подвижность эритроцитов // Миллиметровые волны в биологии и медицине. Вестник Нижегородского унив. №2 (18), 2000. С.5-46. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Костина О.В. Влияние Солапивена на реологические свойства крови ожоговых больных //Апитерапия сегодня / Матер. X Междунарю научнопракт. конф. по апитерапии. Рязань, 2002.С.45-46.
47. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Густов А.В. Роль реологических механизмов в апитерапии неврологических заболеваний //Матер. 4-й Межд. науч.-практич. конф.
Пчеловодство -XXI, М., 2003. С. 112-113.
48. Преснухина Н.А., Крылов В.Н, Дерюгина А.В. Влияние электромагнитных волн миллиметрового диапозона на морфо-функциональные показатели периферической крови // Миллиметровые волны в биологии и медицине. Вестник Нижегородского унив., 2003.
№1(6). С.51-49. Артемова А.В., Панова Т.М., Дерюгина А.В. Особенности электрофоретической подвижности эритроцитов и фосфолипидного спектра их мембран при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга, 2004. №2-3. С.6.
50. Antipenko E.A., Belokopytova O.N., Gustov A.V., Kornouhov A.E.,Derugina A.V.
Cytoflavinum adaptic effect at chronic cerebral ischemia // International Society of adaptive Medicine (ISAM) VIII World Congress, Moscow, 2006.Р.183.
51. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Болдырев А.Ф., Одинцов Г.В. Изменение электрофоретической подвижности эритроцитов in vitro при действии низкоинтенсивного лазерного излучения // Электромагнитные поля и излучения в биологии и медицине:
Межвузовский сборник научных трудов, Н.Новгород, 2006. С. 10-52. Антипенко Е.А, Белокопытова А.В., Густов А.В., Паренко М.К., Дерюгина А.В., Щербаков В.И. Критерии оценки адаптационного процесса при хронической ишемии головного мозга // Матер. IX всероссийский съезд неврологов, Ярославль, 2006. С.336.
53. Антипенко Е.В., Густов А.В., Давыдова К.С., Дерюгина А.В., Крылов В.Н. Уровень эритроцитарного глутатиона на разных стадиях хронической цереброваскулярной недостаточности // Научные труды VII междун. научно-практич. конф. Здоровье и образование в XXI, М., 2006. С.35.
54. Антипенко Е.А., Густов А.В, Белокопытова О.Н., Корноухов А.Е, Дерюгина А.В.
Неспецифическая цитопротективная терапия при хронической ишемии головного мозга // Вестник Санкт-Петербург. мед. академии им. И.М. Сеченова, 2007. №1. С.240-244.
55. Антипенко Е.А., Густов А.В, Григорьева В.Н., Белокопытова О.Н.,Дерюгина А.В.
Опыт применения адаптогена Геримакс-энерджи при хронической ишемии головного мозга // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Приложение к журналу Инсульт. Спецвыпуск: Материалы II Российского Международного конгресса Цереброваскулярная патология и инсульт, 2007. С. 358-356. Дерюгина А.В., Крылова Е.В. Влияние НИЛИ на структуру и функции крови крыс //Тезисы доклада 2-й Межд. конф. Человек и электромагнитные поля, Саров, ФГУП РФЯИ-ВНИИЭФ, 2007. 37-38.
57. Антипенко Е.А., Хватова Е.М., Николаев И.Н., Дерюгина А.В. Стресслимитирующий эффект нейропептида дельта-сна при хронической ишемии головного мозга // Научные труды VIII междунеродной конференции научно-практической конференции Здоровье и образование в 21веке, Москва.2007. С.158. Дерюгина А.В., Крылова Е.В Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на структуру и функции крови крыс // II Межд. конф. Человек и электромагнитные поля, Саров, 2007. С. 66-72.
59. Krylov V.N., Derugina A.V., Goustov A.V., Antipenko E.A. Erythrocytes functional parametres changing under apitherapy of neurological patients // Mellifera, 2007. V.7. Р. 27-32.
60. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Корягин А.С. Сравнительный анализ радиозащитного действия продуктов пчеловодства при моделировании лучевой болезни у крыс // Мат. XIII Всеросс. научно-практ. конф. Успехи апитерапии, Адлер. 2008. 43-61. Антипенко Е.А., Густов А.В., Григорьева В.Н., Дерюгина А.В., Крылова Е.В., Давыдова К.С., Кузнецова Е.В., Паренко М.К., Щербаков В.И. Психофизиологическая адаптация при хронической цереброваскулярной недостаточности // Нижегородский медицинский журнал, 2008. №4. С. 90-94.
62. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Антипенко Е.А., Обухова Л.М. Пчелиный яд в геронтологии // Новое в науке и практике пчеловодства: материалы координационного совещания и 9-й научно-практической конф Интермед, Москва, 2009. С. 223-263. Антипенко Е.А., Густов А.В., Белякова О.А., Дерюгина А.В., Крылов В.Н.
Адаптивные реакции крови в ходе лечения хронической ишемии мозга (клиникоэкспериментальное исследование) // Матер.XIV Междунар.симпозиума Экологофизиологические проблемы адаптации,Москва. 2009. С. 48-50.
64. Дерюгина А.В., Гришина А.А., Крылов В.Н. Влияние пчелиного яда на электрофоретическую подвижность и оксидантную систему эритроцитов у крыс Апитерапия сегодня. // Материалы XIV Всеросс. Научно-практической конф. Успехи апитерапии. Рыбное. 2009. С.43-65. Дерюгина А.В., Захарова О.А., Обухова Л.М., Крылов В.Н. Метод клиновидной дегидратации при оценке возрастных, гормональных и альтерационных изменений организма // Материалы междунар.конф. Пчеловодство XXI век. Пчеловодство, апитерапия и качество жизни, Москва 2010, С. 56-58.
66. Захарова О.А., Дерюгина А.В Сравнительно-видовое изучение электрофоретической подвижности при стрессовом воздействии // Материалы Пущинской Межвузов. Школы-конференции молодых ученых, Пущино, 2010, С. 123-124.
67. Дерюгина А.В., Сенюрина А.И. Активность Na,K-АТФазы эритроцитов при действии продуктов пчеловодства на фоне иммобилизационного стресса у крыс // Мат. III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов Симбиоз-Россия 2010, 2010. С.128.
68. Захарова О.А, Дерюгина А.В. Влияние маточного молочка и убихинона на функциональные характеристики эритроцитов крыс при развитии иммобилизационноболевого стресса // Мат. III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов Симбиоз-Россия 2010, Н.Новгород, 2010, С. 131.
69. Дерюгина А.В., Захарова О.А. Электрофоретическая подвижность эритроцитов при действии различных экзотоксинов на организм. // Мат. ХХI Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова,. Москва- Калуга 19-25 сентября 2010. С. 226-227.
70. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Электрофоретическая подвижность эритроцитов как диагностический тест альтерационных состояний организма // Мат.первой международной научно-практической конференции Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине, СанктПетербург, 2010. С. 261.
71. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Захарова О.А. Влияние пчелиного яда на адаптивные реакции эритроцитов крыс при экспериментальном стрессе // Мат. Международного форума пчеловодов, Саранск, 2010. С. 9-12.
72. Дерюгина А.В., Сенюрина А.И. Активность Na,K-АТФазы эритроцитов крыс при различных стрессовых воздействиях // Мат. IV Всероссийской с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов Симбиоз-Россия 2011, Воронеж, 2011, С. 69-71.
73. Drrjugina A., Goshkova E., Pleskova s., Krylov V. Morphological and electrokinetic indicator erythrocytes of rat at stressful influences estimated by AFM //Fourth international meeting of AFM in life sciences and medicine, Paris, France, 2011.Р. 79/168.
74. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Влияние продуктов пчеловодства на адаптационные реакции крови крыс при различных видах стресса // Мат. Международной научнопрактич. Конференции Пути развития пчеловодства в России, стран СНГ и дальнего зарубежья, Ярославль, 2011, С. 147-150.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ GSН глутатион восстановленный GSSG глутатион окисленный ДЭ дисциркуляторная энцефалопатия КВЧ-излучение излучение крайне высокой частоты ИМП импульсное магнитное поле ЛФ лизофосфолипиды ЛФХ лизофосфотидилхолин МДА малоновый диальдегид НИЛИ низкоинтенсивное лазерное излучение ПОЛ перекисное окисление липидов ДСН-ПААГ полиакриламидный гель в присутствии додецилсульфата натрия ФЛ фосфолипиды ФХ фосфотидилхолин ФЭА фосфотидилэтаноламин ЭМИ электромагнитное излучение ЭФП электрофоретическая подвижность эритроцитов Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность специалистам, коллегам и соавторам, помогавшим в проведении исследований в ходе выполнения работы. Автор благодарен д.б.н. Корягину А.С. к.б.н. Ошевенскому Л.В., к.б.н. Миронову А.А. и сотрудникам кафедры за помощь, советы, и конструктивные предложения. Автор благодарен к.м.н. Антипенко Е.А. и к.м.н. Артемовой А.В за проведение совместных клинических исследований. Автор искренне признателен своему научному консультанту д.б.н., профессору В.Н. Крылову.