Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Земченкова Ольга Владимировна
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ УФ-СВЕТА НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ И МЕТАБОЛИЗМ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Специальность 03.01.02. - Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Воронеж - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Воронежский государственный университет (ФГБОУ ВПО ВГУ)
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Артюхов Валерий Григорьевич
Официальные оппоненты: Попова Татьяна Николаевна доктор биологических наук, профессор, Воронежский государственный университет, заведующий кафедрой медицинской биохимии и микробиологии Брагина Вера Александровна кандидат биологических наук, Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, ассистент кафедры патологической физиологии
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет
Защита состоится 27 декабря 2012 года в 13 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 212.038.03. при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.
Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.
Автореферат разослан 26 ноября 2012 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, Грабович доктор биологических наук Маргарита Юрьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Одним из широко распространенных методов терапии является аутотрансфузия УФ-облученной крови (АУФОК). Ведущее место в лечебном эффекте АУФОК принадлежит перестройке иммунной системы организма.
Объектами непосредственного воздействия УФ-света являются все компоненты крови, в том числе иммунокомпетентные клетки и гуморальные факторы иммунитета.
Для нормального протекания иммунного ответа в организме необходима сбалансированная активность взаимодействующих иммуннорегуляторных клеток. В большинстве случаев В-лимфоциты для обеспечения гуморального иммунного ответа нуждаются в помощи Т-лимфоцитов. Взаимосвязь и взаимная регуляция этих клеток опосредованы цитокинами, а также поверхностными костимулирующими и адгезионными молекулами (И.С. Фрейдлин, А.А. Тотолян, 2001).
Ключевым этапом функционирования иммунной системы является экспрессия поверхностных рецепторов, которые обеспечивают восприятие клеткой внешних сигналов. На поверхности мембран лимфоцитов в большом количестве экспрессируются молекулы рецепторных комплексов, принимающих участие в антигенраспознающей функции Т- (CD3-TCR, корецепторы CD4 и CD8) и В-лимфоцитов (костимулирующие молекулы BCR - CD19, CD20 маркеры) (А.А. Ярилин, 1999; Р.М. Хаитов, 2006). Под воздействием различных агентов клетки приспосабливаются и отвечают на это изменением экспрессии тех или иных мембранных и внутриклеточных маркеров.
Однако до настоящего времени остаются малоизученными многие аспекты физико-химических механизмов лечебного эффекта фотомодифицированной крови. Предполагается, что передача вызванных светом изменений от фотомодифицированных клеток к интактным является следствием образования облученными лейкоцитами активных форм кислорода (АФК) и немедленной инициации каскада АФК-образующих реакций в объеме всей циркулирующей крови (В.И. Карандашов и др., 2001; Е.Е. Дубинина, 2001). Известно, что ключевым моментом в фотомодификации клеток УФ-излучением является индукция пероксидного фотоокисления липидов (ПФОЛ). Это приводит к изменению структуры мембран и нарушению их целостности (Ю.А.
Владимиров, А.И. Арчаков, 1972).
Естественно, что изменения функционирования иммуноцитов не могут не иметь метаболической основы. Применение УФ-света как модулятора функциональной активности лимфоцитов ведет к изменению метаболизма клеток, переключая субстратные потоки с одного метаболического пути на другой, влияя на энергетические и синтетические процессы в них.
В настоящее время недостаточно изучено влияние УФ-облучения на катаболизм клеток, в частности лимфоцитов. С энергетическим метаболизмом тесно связана функциональная активность иммунокомпетентных клеток.
Именно обеспеченность или недостаток энергии определяет дальнейшую цепь регуляторных, метаболических и структурных изменений в организме (С.Н. Игнатьева, Р.В. Кубасов, 2009).
Сообщения о токсическом действии АФК (повышение уровня ПОЛ, инактивация ферментов) вызывают неоднозначное отношение к методу АУФОК (А. Morita et al., 1997). К настоящему времени установлено, что УФсвет является потенциальным индуктором апоптоза в клетках различных типов, в том числе и иммунокомпетентных (И.Ф. Лонская и др., 1997). Известно, что апоптоз иммунокомпетентных клеток в условиях УФ-В-излучения запускается CD95 (Fas/Apo-1)-рецепторно/лигандной системой (R. Caricchio et al., 1998). Было выявлено (В.Г. Артюхов и др., 2011) образование фрагментов ДНК неодинакового размера при действии на лимфоциты УФ-света и АФК, что может быть связано с запуском различных путей апоптоза, осуществляемых с участием фактора AIF и транскрипционного фактора р53.
В связи с вышеизложенным возникает необходимость проведения исследований, направленных на изучение молекулярно-клеточных механизмов, лежащих в основе изменений структурно-функциональных свойств и метаболизма лимфоцитов, УФ-облученных в терапевтическом диапазоне доз. Это позволит в дальнейшем модифицировать их функциональные свойства для достижения прогнозируемых эффектов коррекции иммунных расстройств.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функционального состояния компонентов Т- и В-клеточного звена иммунитета человека, метаболических изменений и путей гибели лимфоцитарных клеток после воздействия УФ-излучения при различных условиях инкубации.
В связи с вышесказанным перед нами были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние УФ-света (240Ц390 нм) в дозах 151 и 755 Дж/м2 на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и уровень экспрессии основных мембранных маркеров рецепторного комплекса Т- и Влимфоцитов.
2. Оценить уровень ПОЛ мембран фотомодифицированных лимфоцитарных клеток, инкубированных в отсутствие и в присутствии антиоксидантов и аутологичной плазмы крови.
3. Рассмотреть действие УФ-света на активность ферментов дихотомического пути окисления глюкозы - лактатдегидрог еназы, сукцинатдегидрогеназы и цитохром с оксидазы, ответственных за энергообеспечение лимфоцитов крови человека.
4. Изучить влияние УФ-света на активность Са2+-АТФазы плазматических мембран иммунокомпетентных клеток.
5. Оценить влияние УФ-света в широком диапазоне доз (151 - 30Дж/м2) на характер гибели лимфоцитов периферической крови доноров.
6. Изучить влияние аутологичной плазмы крови на метаболизм и структурно-функциональные свойства лимфоцитарных клеток.
Научная новизна. Работа представляет собой систематическое исследование структурно-функциональных изменений лимфоцитарных клеток человека после воздействия УФ-излучения.
Впервые исследованы изменения абсолютного количества иммуноцитов, их субпопуляционного состава и изменения уровня экспрессии CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, CD95 маркеров в условиях комплексного воздействия УФизлучения (240-390 нм) в дозах 151 и 755 Дж/м2 и аутологичной плазмы крови.
Установлено, что УФ-свет в дозах 151 и 755 Дж/м2 вызывает снижение числа CD3+- и CD19+-клеток в ходе суточной инкубации суспензии лимфоцитов в отсутствие аутологичной плазмы крови; в то время как в присутствии плазмы популяционный состав лимфоцитов достоверно не отличается от их исходного количества.
Выявлено, что УФ-свет в дозах 151 и 755 Дж/м2 повышает экспрессию CD3, CD19, CD8, CD25 и CD95 рецепторов при одновременном снижении экспрессии CD4 маркеров. Увеличение уровня экспрессии тестируемых показателей обусловлено в основном синтезом данных рецепторов de novo.
Обнаружено, что в фотомодифицированных лимфоцитах наблюдается активация аэробного пути окисления глюкозы, что позволяет клеткам восстановить через сутки уровень внутриклеточного АТФ после его снижения через 4 часа после УФ-облучения.
Выявлено, что УФ-свет в дозах 151 и 755 Дж/м2 вызывает гибель клеток путем рецептор-опосредованного апоптоза. Использование высоких доз облучения (1510 и 3020 Дж/м2) приводит к массовой гибели клеток путем некроза.
Использование аутологичной плазмы при инкубации фотомодифицированных лимфоцитов позволяет снизить количество и апоптотических, и некротических клеток за счет содержащихся в плазме антиоксидантов и ростовых факторов.
Предложены схемы возможных процессов действия УФ-света на структурно-функциональное состояние и метаболизм лимфоцитов.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о механизмах действия УФ-излучения на функционирование клеток иммунной системы.
Данные, полученные при исследовании влияния УФ-света на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и уровень экспрессии CD3, CD4, CD8, CD25 маркеров на поверхности Т-лимфоцитов и CD19 рецепторов на поверхности В-клеток, необходимо учитывать при разработке способов регулирования межклеточных взаимодействий иммунных клеток организма человека.
Результаты изучения индуцированных УФ-светом изменений метаболизма, уровня энергообеспеченности и путей реализации клеточной гибели иммуноцитов важны для понимания тонких механизмов регуляции и функционирования компонентов иммунной системы в норме и при патологии.
Полученные экспериментальные данные могут способствовать разработке новых подходов к иммунокоррекции отдельных звеньев иммунного ответа при различных патологических состояниях организма.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 5 Международном конгрессе Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине (Санкт-Петербург, 2009); 13ой Международной Пущинской школе-конференции Биология - наука XXIвека (Пущино, 2009); 8ой Международной конференции Биоантиоксидант (Москва, 2010); Международной научной конференции Современные проблемы радиобиологии (Гомель, 2010); 21 Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); Международной научной конференции Рецепторы и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 2011); 4 Всероссийском с международным участием конгрессе Симбиоз-Россия 2011 (Воронеж, 2011); 16ой Международной Пущинской школе-конференции Биология - наука XXIвека (Пущино, 2012), а также на Научных отчетных конференциях преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2011, 2012).
Публикации. По теме диссертационной работы имеется 15 публикаций: 7 статей и 8 тезисов, в том числе 4 статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.
На защиту выносятся следующие положения:
1. УФ-свет (151Ц755 Дж/м2) вызывает активацию пероксидного окисления липидов, что приводит к изменению структурного состояния лимфоцитарных мембран, уровня экспрессии молекул рецепторного комплекса Тклеток (CD3, CD4, CD8, CD25) и В-лимфоцитов (CD19).
2. УФ-свет (151 - 755 Дж/м2) модулирует изменение энергетического метаболизма лимфоцитов.
3. УФ-свет (151 - 755 Дж/м ) активирует апоптотическую гибель лимфоцитов, УФ-свет (1050 - 3020 Дж/м2) приводит к некрозу иммуноцитов.
4. Использование аутологичной плазмы крови при инкубации лимфоцитов способствует нормализации метаболических и структурных фотоиндуцированных изменений и предотвращает гибель иммунокомпетентных клеток.
5. Схемы возможных процессов действия УФ-света на структурнофункциональное состояние и метаболизм лимфоцитов в отсутствие и присутствии аутологичной плазмы крови.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа включает 175 страницы машинописного текста; состоит из Введения, 7 глав, Заключения, Выводов. Список литературы содержит 293 источника. Иллюстрационный материал включает рисунка.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Характеристика лимфоцитарных клеток человека, их участие в многоуровневой системе иммунной защиты В главе изложены современные представления о структурнофункциональных свойствах лимфоцитов человека и их субпопуляций, рассмотрены вопросы регуляции функционирования лимфоцитов цитокинами и факторами роста, а также особенности метаболизма лимфоцитов.
Глава 2. Механизмы действия УФ-излучения на структурнофункциональное состояние компонентов иммунной системы Рассмотрены УФ-индуцированные изменения компонентов иммунной системы в изолированном состоянии и в составе цельной крови.
Глава 3. Пути гибели клетки: современное состояние проблемы Представлен анализ литературных данных о биологическом и соответствующем ему клиническом значении апоптоза и некроза. Рассмотрены общая схема передачи сигналов, приводящих к апоптозу, рецепторный и митохондриальный пути активации каспазного каскада и каспазонезависимая индукция апоптоза.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 4. Объект и методы исследования Объектом исследования явились лимфоцитарные клетки, полученные путем центрифугирования гепаринизированной крови доноров в градиенте плотности фиколл-урографина (Дж. Клаус, 1990).
УФ-облучение суспензии лимфоцитов в объеме 1 мл осуществляли сверху при ее непрерывном перемешивании в стеклянной термостатируемой (при температуре 201С) кювете полусферической формы с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм. Интенсивность излучения - 151 Дж/(м2мин) с учетом расстояния до облучаемого образца 0,23 м.
Инкубация суспензии лимфоцитов (0,5 мл) осуществлялась в питательной среде RPMI-1640 при температуре 37 С в атмосфере СО2 (5 %). К опытным пробам в различных сериях экспериментов добавляли: циклогексимид (10-3 моль/л), аутологичную плазму (18 % от общего объема), супероксиддисмутазу (210-7 моль/л) и каталазу (10-6 моль/л). Лимфоциты инкубировали в течение 4 и 24 часов.
Для определения активности ферментов клетки лизировали путем гипоосмотического шока. Митохондрии выделяли общепринятым способом (G.H. Hoogeboom et al., 1948), в них определяли активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) (T.G. Cooper, H.J. Beevers, 1969) и цитохром с оксидазы (ЦО) (I.P. Schwitzguebel, P.A. Siegenthaler, 1984). Надосадочную жидкость использовали для определения активности цитоплазматического фермента - ла ктатдегидрогеназы (ЛДГ) (H.U. Berg-Meyer, 1974). Активность Са2+-АТФазы плазматических мембран определяли по количеству продукта гидролиза АТФ - фосфата (Г. Н. Никулин, 1965). Измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-2401 РС. Концентрацию АТФ определяли с помощью люциферазной биолюминесцентной реакции с использованием стандартного набора реагентов (Люмтек, Россия). Об интенсивности процессов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) судили по уровню спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции. Регистрацию проводили на биохемилюминометре БХЛ-06М.
Для определения уровня экспрессии CD3, CD19, CD4, CD8, CD25, CD95 маркеров на поверхности нативных и фотомодифицированных клеток использовали цитофлуориметр CyFlow space (Partec, Германия). Одинарное и двойное окрашивание клеток проводили, используя моноклональные антитела: CD95-FITC, CD3-FITC - CD19-PE, CD4-FITC - CD8-PE, CD3-FITC - CD25-PE и соответствующие изотипические контроли (все Beckman Coulter, США). В каждой пробе анализировали не менее 104 клеток.
Использование двойного окрашивания клеток посредством аннексина V-FITC (для обнаружения фосфатидилсерина на внешней стороне клеточной мембраны) и пропидия иодида - PI (для регистрации целостности клеток) позволило с помощью проточной цитометрии отличить апоптоз исследуемых клеток от их некроза.
Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью прикладных программ УStatistuca 6.0Ф. Отличия величин тестируемых показателей в контрольных и опытных сериях экспериментов оценивали с помощью метода попарной статистики, используя t-критерий Стьюдента.
Различия считали достоверными при р 0.05.
Глава 5. Исследование влияния УФ-света на фенотип лимфоцитов донорской крови Непосредственно после УФ-облучения суспензии лимфоцитов в дозах 151 и 755 Дж/м2 происходит дозозависимое увеличение уровня спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции за счет фотоиндуцированного образования АФК (рис. 1).
В ходе суточной инкубации нативных и фотомодифицированных в дозах 151 и 755 Дж/м2 лимфоцитов в отсутствие аутологичной плазмы крови наблюдается незначительное повышение светосуммы хемилюминесценции, в то время как в присутствии аутологичной плазмы происходит снижение интенсивности и светосуммы хемилюминесценции соответственно используемым дозам облучения (рис. 1 А, Б). Таким образом, можно говорить о том, что при инкубации клеток в присутствии плазмы крови (а, следовательно, ростовых факторов и антиоксидантов) снижается интенсивность протекания процессов окисления компонентов мембран клеток крови. Использование ферментов антиоксидантной защиты (СОД и каталазы) при УФ-облучении и инкубации лимфоцитов позволяет снизить интенсивность процессов ПОЛ (рис. 1).
Рис. 1. Изменение интенсивности (А) и светосуммы (Б) хемилюминесценции лимфоцитов при различных условиях инкубации (1 - лимфоциты после выделения; 2, 3 - лимфоциты после 24-часовой инкубации в отсутствие и в присутствии плазмы соответственно; 4, 5- клетки, инкубированные в присутствии СОД и каталазы соответственно; 6, 7 - клетки, облученные в пр исутствии СОД и каталазы соответственно) Следовательно, можно предположить, что плазма проявляет такие же антиоксидантные свойства, как и внесение в суспензию клеток в физиологических концентрациях ферментов антиоксидантной защиты - каталазы и СОД.
Популяционный состав лимфоцитов в количественном соотношении представлен 13,23,0 % В-лимфоцитами и 67,24,0 % Т-лимфоцитами (рис. А). Уровень экспрессии CD3 и CD19 маркеров не изменяется непосредственно после воздействия на суспензию лимфоцитов УФ-света в дозах 151 и 755 Дж/м2 у всех исследованных доноров (рис. 3 А, Б).
В ходе инкубации лимфоцитов в отсутствие аутологичной плазмы происходит снижение количества CD3+ и CD19+-клеток (рис. 2 Г), что может быть связано с их гибелью, обусловленной отсутствием в среде инкубации факторов роста и антиоксидантов, содержащихся в плазме.
После суточной инкубации в отсутствие плазмы крови фотомодифицированных в дозах 151 и 755 Дж/м2 лимфоцитов выявлено повышение уровня экспрессии CD3 и CD19 маркеров (рис. 3 А. Б). Использование ингибитора синтеза белка - циклогексимида, позволило нам установить, что увеличение уровня экспрессии тестируемых маркеров после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 151 и 755 Дж/м2 связано с синтезом данных рецепторов de novo (рис.
3 А, Б).
При инкубации фотомодифицированных лимфоцитов в присутствии плазмы крови выявлено, что количество Т- и В-клеток достоверно не отличается от их исходного уровня (рис. 2 Д). При этом уровень экспрессии CD3 и CD19 рецепторов у фотомодифицированных клеток повышается относительно исходного уровня данного параметра (рис. 3 А, Б).
Рис. 2. Распределение количества лимфоцитов по параметрам флуоресценции при окраске антителами к CD3/CD19, CD4/CD8, CD3/ CD25 маркерам (А - интактные лимфоциты непосредственно после выделения; Б, В - интактные лимфоциты после суточной инкубации в отсутствие и в присутсвии плазмы крови соответственно; Г, Д - фотомодифицированные в дозе 755 Дж/м2 лимфоциты, инкубированные в течение суток в отсутствие и в присутствии плазмы соответственно) Таким образом, УФ-свет в используемом диапазоне доз облучения усиливает экспрессию CD3 комплексов Т-лимфоцитов и CD19 рецепторов Влимфоцитов, тем самым способствуя реализации лимфоцитами иммунного ответа.
Субпопуляционный состав нативных Т-лимфоцитов включал в себя 52,32,5 % Т-хелперов (CD4+-лимфоцитов), 22,82,0 % Т-киллеров (CD8+клеток) и достоверно не изменялся непосредственно после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 151 и 755 Дж/м2 (рис. 2 А). В ходе суточной инкубации без плазмы в Т-клетках наблюдается изменение соотношения клеток - процентное содержание CD4+-лимфоцитов уменьшается, при этом увеличивается данный показатель для CD8+-клеток (рис. 2 Г). В результате иммунорегуляторный индекс (ИР) - соотношение количества CD4+-клеток к количеству CD8+-клеток, снижается и составляет 1,47 и 1,29 соответственно дозам облучения (в нативных клетках это соотношение составляет 2,29).
После суточной инкубации в отсутствие аутологичной плазмы крови фотомодифицированных в дозах 151 и 755 Дж/м2 лимфоцитов наблюдается снижение уровня экспрессии CD4 рецепторов при одновременном повышении уровня экспрессии CD8 маркеров (рис. 3 В, Г). Выявленное увеличение экспрессии CD8 рецепторов связано с синтезом данного рецептора de novo:
при инкубации клеток в присутствии циклогексимида наблюдается статистически достоверное снижение уровня экспрессии CD8 маркеров до уровня исходных (нативных) лимфоцитов (рис. 3 Г).
Рис. 3. Изменение уровня экспрессии CD3(А), CD19 (Б), CD(В), CD8 (Г), CD25 (Д) маркеров УФоблученных лимфоцитов в ходе суточной инкубации (1 - клетки после выделения; 2, 3 - клетки после суточной инкубации в отсутствие и присутствии плазмы соответственно; 4 - клетки, инкубированные в присутствии циклогексимида) При использовании аутологичной плазмы в ходе инкубации фотомодифицированных лимфоцитов количество клеток с исследуемыми маркерами достоверно не отличается от данных параметров, характерных для нативных клеток непосредственно после их выделения (рис. 2 Д). При этом наблюдается повышение уровня экспрессии и CD4-, и CD8-рецепторов (рис. 3 В, Г).
Таким образом, нами установлено иммуностимулирующее действие УФ-излучения (151 и 755 Дж/м2) на субпопуляцию CD8+ Т-лимфоцитов, что, вероятно, может способствовать усилению антигенраспознающей способности TCR за счет повышения эффективности его взаимодействия с комплексом антиген-МНС I класса и активации ряда иммунных реакций, зависимых от данной субпопуляции клеток, в процессе реализации иммунного ответа.
В то же время уровень экспрессии CD4+ фотомодифицированных Тлимфоцитов зависит от условий их инкубации. Инкубация клеток в отсутствие плазмы крови является сигналом к апоптозу, что подтверждается снижением количества Т-хелперов через 24 часа после УФ-облучения.
Выявленное снижение уровня экспрессии, по-видимому, связано со снижением количества CD4+-клеток. В ходе инкубации лимфоцитов в присутствии аутологичной плазмы наблюдается повышение экспрессии CD4маркера, при этом количество CD4+-клеток достоверно не отличается от начального. Данное увеличение уровня экспрессии CD4 антигенов на поверхности мембран Т-лимфоцитов может способствовать усилению антигенраспознающей способности TCR.
Присутствие в культуре лимфоцитов человека клеток, несущих маркер CD25, свидетельствует о том, что в поверхностной мембране лимфоцитов экспонирована -субъединица рецептора к ИЛ-2.
В популяции Т-лимфоцитов, выделенных из крови здоровых доноров, доля CD25+ клеток составляет 3,01,2% (рис. 2 А). УФ-облучение суспензии лимфоцитов не приводит к достоверно значимому изменению процентного содержания CD25+-клеток непосредственно после облучения. Количество нативных CD25+-клеток в ходе суточной инкубации без плазмы крови увеличивается с 3,01,2 % до 16,92,0 %, в то время как в фотомодифицированных лимфоцитах уровень CD25+-клеток составил 33,63,1 % (рис. 2 Б, Г); при этом происходит повышение уровня экспрессии CD25 рецепторов по отношению к контролю (рис. 3 Д).
Использование блокатора белкового синтеза - циклогексимида, выявило, что данное повышение связано в основном с синтезом анализируемого рецептора de novo. Видимо, наблюдаемое повышение числа CD25+-молекул в ходе инкубации лимфоцитов направлено на защиту Т-клеток от развития АФК-опосредованного апоптоза.
Использование аутологичной плазмы при инкубации фотомодифицированных лимфоцитов показало, что уровень экспрессии CD25-маркера на 18 % ниже, чем у лимфоцитов, инкубированных в отсутствие плазмы (рис. Д). При этом количество CD25+-клеток повышается не так значительно, как при инкубации лимфоцитов в отсутствие плазмы крови (рис. 2 Д), что, повидимому, связано с присутствием ростовых факторов и антиоксидантов в плазме крови.
Таким образом, УФ-свет (151, 755 Дж/м2) оказывает активирующее влияние на экспрессию CD25-рецепторов и на количество CD25+-клеток. Это необходимо для успешной активации лимфоцитов, финальным событием которой является их пролиферативный ответ.
Глава 6. Влияние УФ-света на метаболическую активность лимфоцитов Установлено, что непосредственно после УФ-облучения суспензии лимфоцитов в дозах 151 и 755 Дж/м2 происходит снижение активности ферментов- ЛДГ, СДГ и ЦО (рис. 4).
Рис. 4. Изменение активности ЛДГ (А), СДГ (Б) и ЦО (В) фотомодифицированных лимфоцитов в ходе суточной инкубации (1 - клетки после выделения; 2, 3 - клетки после суточной инкубации в отсутствие и присутствии плазмы соответственно; 4 - клетки, инкубированные в присутствии цикл огексимида) Это приводит к снижению как аэробного, так и анаэробного путей окисления глюкозы, а, следовательно, снижается энергообеспечение клеток, что подтверждается уменьшением концентрации АТФ через 4 часа после УФ-облучения (рис. 5).
Рис. 5. Изменение концентрации АТФ в ходе суточной инкубации лимфоцитов (1 - нативные клетки; 2, 3 - фотомодифицированные в дозе 755 Дж/мклетки, инкубированные в отсутствие и присутствии плазмы соответственно) Выявлено, что при инкубации нативных клеток в присутствии плазмы активность исследуемых ферментов достоверно не отличается от исходного уровня активности. В то же время в результате суточной инкубации необлученных лимфоцитов в отсутствие плазмы крови происходит повышение активности ЛДГ, с одновременным снижением активности митохондриальных ферментов (рис. 4), что указывает на активацию анаэробного пути окисления глюкозы. Данные изменения активности ферментов дихотомического пути окисления глюкозы позволяют клеткам поддерживать необходимый для жизнедеятельности уровень АТФ (рис. 5).
В облученных клетках, инкубируемых в отсутствие плазмы, наблюдается резкое увеличение активности митохондриальных ферментов (рис. 4 Б, В). В то же время в лимфоцитах, инкубированных в присутствии плазмы, значения активности ЛДГ, СДГ и ЦО приближаются к исходному уровню в нативных клетках (рис. 4 А, Б, В).
Как следует из результатов проведенных исследований, в фотомодифицированных лимфоцитах (в сравнении с необлученными) наблюдается преобладание аэробного пути окисления глюкозы, что позволяет клеткам (в присутствии плазмы) не только сохранить исходный уровень АТФ (рис. 5), но и снизить потребление глюкозы в энергетических целях, тем самым способствуя ее участию в синтетических процессах. Таким образом, способность клеток к восстановлению уровня внутриклеточного АТФ после его падения отражает адаптационные возможности клеток и свидетельствует об их функциональной активности.
Для выяснения причин активации ферментов были проведены исследования с использованием блокатора белкового синтеза - циклогексимидом.
Выявлено, что в ходе инкубации необлученных клеток синтез митохондриальных ферментов - СДГ и ЦО, не активируется (рис. 4 Б, В). В то время как в фотомодифицированных клетках отмечается активация синтеза белка: в присутствии циклогексимида уровень активности СДГ и ЦО достоверно не отличается от данного параметра непосредственно после облучения лимфоцитов (рис. 4 Б, В).
Обнаружено, что каталитическая активность Са2+-АТФазы увеличивается после облучения клеток в дозе 755 Дж/м2. В фотомодифицированных лимфоцитах, инкубированных с плазмой крови, снижение активности Са2+АТФазы через 4 часа после УФ-облучения менее выражено, чем для клеток, инкубированных в отсутствие аутологичной плазмы (рис. 6).
Рис. 6. Изменение активности Са2+АТФазы лимфоцитов в присутствии плазмы крови доноров (1 - нативные клетки; 2, 3 - фотомодифицированные в дозе 755 Дж/мклетки, инкубированные в отсутствие и присутствии плазмы соответственно) Наблюдаемое через 4 часа снижение активности фермента (рис. 6), по всей видимости, связано с обратимым ингибированием Са2+-АТФазы, в основе которого лежит обеднение микроокружения фермента полиеновыми фосфолипидами в результате ПОЛ. Повышение активности Са2+-АТФазы у облученных клеток, инкубированных в течение суток, обусловлено процессами биосинтеза белка, о чем говорит снижение активности фермента в присутствии циклогексимида (рис. 7).
Рис. 7. Изменение активности Са2+-АТФазы лимфоцитов в присутствии циклогексимида (1 - клетки после выделения; 2, 3 - клетки, инкубированные в течение 4 часов без циклогексимида и в его присутствии соответственно; 4, 5 - клетки, инкубированные в течение 24 часов без циклогексимида и в его присутствии соответственно) Глава 7. Апоптоз лимфоцитов, индуцированный УФ-излучением Выявлено, что через 1 час после УФ-облучения в дозах 151 и 755 Дж/мпроисходит увеличение уровня экспрессии рецепторов CD95 (рис. 8). В ходе суточной инкубации в отсутствие аутологичной плазмы в фотомодифицированных лимфоцитах уровень экспрессии CD95 увеличился на 42 и 59 % соответсвенно дозам облучения (рис. 8).
Рис. 8. Влияние УФ-света на уровень экспрессии CD95 маркеров (- клетки через 1 час после выделения;
2, 3 - клетки после суточной инкубации в отсутствие и в присутствии плазмы соответственно; 4 - клетки, инкубированные в присутствии циклогексимида) При добавлении в исследуемую систему ингибитора белкового синтеза - циклогексимида, уровень экспрессии CD95 был значительно ниже по сравнению с таковым для облученных образцов в отсутствие этого агента, но при этом выше контроля (рис. 8). Следовательно, увеличение уровня экспрессии CD95 в условиях инкубации фотомодифицированных лимфоцитов осуществляется не только вследствие экспонирования на поверхность плазматических мембран ранее недоступных маркеров, но и синтеза их новых молекул.
Однако и в необлученных клетках в ходе суточной инкубации без плазмы выявлено повышение уровня CD95 на мембране, связанное с активацией синтеза этих рецепторов. Известно, что гибель клетки путем апоптоза (а повышение экспрессии рецепторов смерти CD95 на мембране указывает на возможность запуска рецептор-опосредованного пути апоптоза) может быть обусловлена не только негативной сигнализацией, но и отсутствием позитивных сигналов извне.
Установлено, что важную роль в межклеточной сигнализации играют полипептидные факторы роста, дефицит которых воспринимается клеткой как сигнал к апоптозу: происходит дефосфорилирование проапоптотического белка Bad, внедрение его в наружную мембрану митохондрий, высвобождение цитохрома с и последующая активация каспазы-9 (M. Takamatsu et al., 2001).
При добавлении аутологичной плазмы в ходе инкубации нативных и фотомодифицированных лимфоцитов наблюдается снижение уровня экспрессии CD95 рецепторов (рис. 8). Так, в случае инкубации необлученных образцов данный параметр уменьшается до значения, характерного для свежевыделенных лимфоцитов.
Использование ферментов антиоксидантной защиты (СОД и каталазы) как при фотомодификации, так и в ходе инкубации УФ-облученных образцов приводит к снижению уровня экспрессии рецептора CD95 по сравнению с лимфоцитами, облученными или инкубируемыми в отсутствие данных ферментов.
В реализации апоптоза лимфоцитов, УФ-облученных в дозах 151 и 1510 Дж/м2, принимают участие рецепторопосредованный (Fas-зависимый) и р53-зависимый пути (В.Г. Артюхов и др., 2011). Инициация апоптоза в условиях воздействия УФ-света обусловлена рядом процессов, индуцируемых фотохимическими превращениями биомембран и ДНК клеток.
Поскольку транслокация фосфатидилсерина наблюдается на ранней стадии апоптоза, окрашивание клеток с помощью аннексина V-FITC позволяет выявить более раннюю стадию апоптоза, чем исследования, основаные на повреждении ядра (ДНК-фрагментации).
Выявлено, что через 1 час после УФ-облучения количество апоптотических клеток составляет 2,3 и 5,3 % соответственно используемым дозам облучения (рис. 9 Г, Ж). Это может быть связано с нарушением фосфолипидного бислоя мембран в результате активации процессов ПФОЛ, вследствие чего фосфатидилсерин экспонирован в наружном слое мембраны.
В ходе суточной инкубации нативных лимфоцитов, инкубированных без плазмы крови, доля апоптотических клеток увеличивается до 9,2 % (рис.
9 Б), что связано с отсутствием в среде инкубирования факторов роста: это является сигналом к активации программы апоптоза. В фотомодифицированных в дозах 151 и 755 Дж/м2 количество клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза, возрастает до 16,2 и 30,8 %, при этом число некротических клеток составляет 4,3 и 18,3 % соответственно (рис. 9 Д, З).
Рис. 9. Цитограммы распределения лимфоцитов при окрашивании аннексином V-FITC и пропидиум иодидом (А, Г, Ж - нативные и фотомодифицированные клетки через час инкубации;
Б, В - нативные клетки, инкубируемые 24 часа в отсутствие и в присутствии плазмы; Д, Е - фотомодифицированные в дозе 151 Дж/м2 клетки после суточной инкубации в отсутствие и в присутствии плазмы крови соответственно; З, И - фотомодифицированные в дозе 755 Дж/м2 клетки после суточной инкубации в отсутствие и в присутствии плазмы крови соответственно) При использовании высоких доз облучения (1510 и 3020 Дж/м2) наблюдается массовый характер гибели клеток путем некроза (рис. 10 А, В).
Рис. 10. Двухпараметрические цитограммы распределения клеток, УФоблученных в дозах 1510 и 3020 Дж/м2, в ходе суточной инкубации лимфоцитов (А, Б - фотомодифицированные в дозе 15Дж/м2 клетки, инкубированные в отсутствие и в присутствии плазмы соответственно; В, Г - фотом одифицированные в дозе 30Дж/м2 клетки, инкубированные в отсутствие и в присутствии плазмы соответственно) Использование аутологичной плазмы крови в ходе инкубации как нативных, так и фотомодифицированных клеток, позволяет снизить количесво и апоптотических, и некротических клеток (рис. 9, 10). Образующиеся в результате УФ-облучения АФК могут изменять микроокружение клеток и таким образом вовлекать в реакцию на световой стимул целые сообщества клеток и биомолекул. Плазма крови, обладая мощной антиокислительной способностью, снижает уровень ПФОЛ, тем самым предотвращая гибель клеток.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ С помощью методов лазерной проточной цитофлуориметрии, спектрофотометрирования, хеми- и биолюминесцентного анализа исследовано воздействие УФ-излучения (240-390 нм) в дозах 151 и 755 Дж/м2 на структурнофункциональное состояние, метаболическую активность, уровень энергообеспеченности Т- и В-клеточного звена иммунитета человека при различных условиях инкубации лимфоцитов.
Было выявлено, что УФ-облучение вызывает дозозависимое повышение уровня люминолзависимой хемилюминесценции, что свидетельствует об интенсификации процессов ПФОЛ. Следствием усиления ПОЛ является изменение структурного состояния мембран лимфоцитов, что отражается на уровне экспрессии мембранных маркеров иммунокомпетентных клеток.
С помощью проточной цитометрии показано изменение уровня экспрессии молекул рецепторных комплексов на поверхности как Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD25), так и В-клеток (CD19) крови человека после воздействия УФ-света (151 и 755 Дж/м2). Выявленные изменения носят неоднонаправленный характер и зависят от условий инкубации лимфоцитов.
Установлено, что УФ-свет (240Ц390 нм) в терапевтическом диапазоне доз повышает уровень экспрессии CD3, CD4, CD8, CD19 и CD25 рецепторов в ходе суточной инкубации лимфоцитов в присутствии аутологичной плазмы крови. При этом количество анализируемых клеток с экспрессированными на них рецепторами достоверно не отличается от их исходного количества.
При инкубации клеток в отсутствие аутологичной плазмы зарегистрировано повышение экспрессии CD8 маркеров с одновременным снижением экспрессии CD4 рецепторов: это связано с апоптотической гибелью CD4+ Tхелперов, что подтверждается снижением количества CD4+-клеток через часа инкубации.
Облучение клеток в присутствии обладающих антиоксидантной активностью ферментов (СОД и каталазы) не выявило достоверно значимых изменений в уровнях экспрессии изучаемых рецепторов, что доказывает ведущую роль АФК в изменении экспрессии молекул клеточной поверхности и, следовательно, в регуляции синтеза данных белковых маркеров.
Основным механизмом фотоиндуцированных изменений экспрессии изучаемых трансмембранных маркеров на поверхности иммуноцитов является синтез рецепторов de novo; возможны также конформационные перестройки, вызывающие их переориентировку в мембране, открытие предсуществующих антигенных структур, локализованных в толще липидного бислоя, ранее не доступных для определения (экстернализация).
Обнаружено, что УФ-свет (151 и 755 Дж/м2) приводит к изменению метаболизма лимфоцитов. Для фотомодифицированных лимфоцитов характерно преобладание аэробного пути окисления глюкозы, что позволяет клеткам в присутствии плазмы крови поддерживать необходимый для проявления их функциональной активности уровень внутриклеточного АТФ. Повышение активности митохондриальных ферментов (СДГ и ЦО) обусловлено их синтезом de novo.
Инкубация УФ-облученных лимфоцитов в отсутствие плазмы крови приводит к более выраженной интенсификации ПФОЛ, нарушению целостности мембраны митохондрий и, как следствие, к разобщению дыхания и фосфорилирования. В результате клетки не могут восстановить исходный уровень АТФ.
Использование аутологичной плазмы крови при инкубации как нативных, так и фотомодифицированных лимфоцитов, позволяет снизить интенсивность ПОЛ, сохранить интактность митохондриальной мембраны, что приводит к защите клеток от развития окислительного стресса. В результате активность ферментов дихотомического пути окисления глюкозы достоверно не отличается от показателей, характерных для нативных клеток непосредственно после их выделения.
УФ-свет в используемом диапазоне доз приводит к увеличению концентрации внутриклеточного кальция, являющегося одним из ключевых сигнальных мессенджеров фактически во всех типах живых клеток.
Выявлено, что УФ-излучение индуцирует экспрессию CD95 рецептора как за счет экстернализации, так и за счет синтеза данного маркера de novo. В результате, через 24 часа инкубации лимфоцитарных клеток наблюдается их гибель преимущественно апоптотическим путем. Использование аутологичной плазмы при инкубации лимфоцитов позволяет снизить интенсивность ПОЛ и гибель клеток, как за счет содержащихся в ней антиоксидантов, так и за счет ростовых факторов, которые предотвращают гибель клеток путем апоптоза или некроза.
По-видимому, в реализации гибели лимфоцитов, инкубируемых в отсутствие плазмы, играет роль и рецептор-опосредованный, и митохондриальный пути реализации апоптоза. При использовании плазмы можно исключить митохондриальный путь (так как интактность митохондрий не нарушена).
Таким образом, регистрируемые нами изменения вносят существенный вклад в модификацию функциональной активности иммунокомпетентных клеток и, соответственно, в реализацию иммунного ответа на воздействие УФ-света. Это необходимо учитывать при прогнозировании эффектов АУФОК-терапии в клинике лечения заболеваний различной этиологии.
На основании анализа результатов проведенных экспериментов и данных литературы предложены схемы процессов, протекающих при УФоблучении лимфоцитов, инкубированных в отсутствие (схема 1) и в присутствии (схема 2) плазмы крови.
После УФ-облучения суспензии лимфоцитов возможны три пути ответной реакции клеток на внешнее воздействие: гибель клеток путем апоптоза или некроза или же сохранение (и даже возрастание) функциональной активности иммуноцитов. Реализация того или иного пути зависит, повидимому, от исходного состояния клетки, от степени развития в ней окислительного стресса. Антиоксиданты, содержащиеся в плазме крови, защищают лимфоциты от окислительного стресса, а ростовые факторы предотвращают развитие апоптоза по р53-зависимому пути. В то же время, по-видимому, с участием АФК и ионов Са2+ активируется синтез ряда белков, в том числе СОД, ИЛ-1, ИЛ -2 (И.Е. Савостина, 2005), CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, СДГ, ЦО.
ВЫВОДЫ 1. В результате воздействия на смесь лимфоцитов УФ-света (240Ц3нм) в дозах 151 и 755 Дж/м2 популяционный (67,24 % CD3+, 13,23,0 % CD19+-клеток) и субпопуляционный составы нативных Т-лимфоцитов (52,32,5 % CD4+, 22,82,0 % CD8+, 3,01,2 % CD25+ клеток) не изменяются непосредственно после их облучения.
2. УФ-облучение лимфоцитов в дозах 151 и 755 Дж/м2 вызывает дозозависимое повышение уровня спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции и, соответственно, уровня пероксидного фотоокисления липидов, что, в свою очередь, отражается на уровне экспрессии поверхностных рецепторов, их локализации и переориентировке в мембране лимфоцитарных клеток.
3. Установлено, что при инкубации фотомодифицированных лимфоцитов в отсутствие аутологичной плазмы происходит снижение количества CD3+-, CD4+-, CD19+- при одновременном повышении числа CD8+- и CD25+клеток. При этом наблюдается повышение экспрессии CD3, CD8, CD19 и CD25 рецепторов при одновременном снижении экспрессии CD4 маркеров.
4. Показано, что в ходе суточной инкубации лимфоцитов в присутствии плазмы крови УФ-облучение в дозах 151 и 755 Дж/м2 индуцирует повышение уровня экспрессии CD3, CD4, CD8, CD19 и CD25 рецепторов. При этом число позитивных по данным маркерам клеток статистически значимо не отличается от их исходного количества.
5. Выявлено, что увеличение уровня экспрессии тестируемых маркеров после облучения лимфоцитов УФ-светом в дозах 151 и 755 Дж/м2 обусловлено синтезом данных рецепторов de novo.
6. Облучение лимфоцитов в присутствии СОД и каталазы не приводит к статистически значимому изменению популяционного и субпопуляционного составов лимфоцитов, а также уровня экспрессии исследуемых маркеров, что указывает на ведущую роль активных форм кислорода в изменении экспрессии рецепторов плазматических мембран.
7. УФ-облучение лимфоцитов в дозах 151 и 755 Дж/м2 вызывает фотоинактивацию ферментов - ЛДГ, СДГ и ЦО, что приводит к ослаблению как аэробного, так и анаэробного путей окисления глюкозы и, следовательно, к снижению энергообеспеченности клеток.
8. Установлено, что УФ-свет в дозе 755 Дж/м2 вызывает повышение активности Са2+-АТФазы плазматических мембран лимфоцитов непосредственно после облучения.
9. Снижение активности Са2+-АТФазы через 4 часа после УФмодификации лимфоцитов с последующим возвратом к исходному значению через 24 часа инкубации направлено на регуляцию внутриклеточной концентрации Са2+, который является одним из модуляторов функциональных свойств лимфоцитов в условиях воздействия УФ-излучения.
10. В фотомодифицированных в дозах 151 и 755 Дж/м2 лимфоцитах обнаружено значительное повышение активности митохондриальных ферментов (СДГ и ЦО), что обусловлено их синтезом de novo в ходе суточной инкубации в отсутствие плазмы крови 11. В лимфоцитах, инкубируемых в присутствии аутологичной плазмы крови, значения активности ЛДГ, СДГ и ЦО приближаются к исходному уровню в нативных клетках, что позволяет клеткам сохранить высокий уровень АТФ.
12. Выявлено, что УФ-облучение лимфоцитов в дозах 151 и 755 Дж/мповышает уровень экспрессии мембранных маркеров смерти (CD95) по сравнению с таковым для интактных клеток.
13. УФ-свет в дозах 151 и 755 Дж/м2 вызывает гибель лимфоцитарных клеток преимущественно путем апоптоза через сутки инкубации в отсутствие плазмы крови.
14. Использование высоких доз УФ-облучения (1510 и 3020 Дж/м2) приводит к массовой гибели лимфоцитарных клеток путем некроза.
15. Использование аутологичной плазмы при инкубации УФмодифицированных лимфоцитов позволяет снизить количество и апоптотических, и некротических клеток.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТЦИИ 1. Земченкова О.В. Метаболическая активность УФ-облученных лимфоцитов / О.В. Земченкова, О.В. Башарина, В.Г. Артюхов // Биология - наука XXI века: сборник тезисов 13ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009. - Пущино, 2009. - С.
138-139.
2.Земченкова О.В. Метаболизм фотомодифицированных в присутствии каталазы лимфоцитов / О.В. Земченкова, В.Г. Артюхов, О.В. Башарина // Биоантиоксидант: тезисы докладов 8ой Международной конференции, Москва, 4-6 октября 2010. - М., 2010. - С. 167-169.
3. Земченкова О.В. Влияние УФ-облучения на функционирование митохондрий лимфоцитов / О.В. Земченкова, В.Г. Артюхов, О.В. Башарина // 21 съезд физиологического общества им. И.П. Павлова: тезисы докладов, Калуга, 1925 сентября 2010. - М.; Калуга, 2010. - С. 230.
4. Изучение активности Са2+-АТФазы в фотомодифицированных лимфоцитах / О.В. Башарина, О.В. Земченкова, Я.В. Ким, В.Г. Артюхов // Современные проблемы радиобиологии: материалы международной научной конференции, Гомель, 14-15 октября 2010. - Минск, 2010. - С. 21-22.
5. Особенности метаболизма УФ-облученных лимфоцитов / В.Г. Артюхов, О.В. Земченкова, О.В. Башарина, Я.В. Ким // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2011. - Т.51, № 2. - С. 252-257.
6. Земченкова О.В. Изменение энергетического обмена УФ-облученных лимфоцитов / О.В. Земченкова, О.В. Башарина, В.Г. Артюхов // Рецепторы и внутриклеточная сигнализация: международная конференция: сборник статей, Пущино, 24-26 мая 2011. Т. 2. - Пущино, 2011. - С. 500-504.
7. О регуляции уровня АТФ в УФ-облученных лимфоцитах / О.В. Земченкова, В.Г. Артюхов, О.В. Башарина, Я.В. Ким, М.А. Наливкина // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - Воронеж, 2011. - № 1. - С. 80-84.
8. Регуляция интенсивности пероксидного окисления липидов в нативных и фотомодифицированных лимфоцитах / О.В. Земченкова, О.В. Башарина, М.А. Наливкина, В.Г. Артюхов // Организация и регуляция физиологобиохимических процессов: межрегиональный сборник научных работ. - В оронеж, 2011. - Вып. 13. - С. 79-83.
9. Активность Са2+-АТФазы плазматических мембран фотомодифицированных лимфоцитов в присутствии ферментов антиоксидантной защиты / О.В.
Земченкова, В.Г. Артюхов, О.В. Башарина, С.И. Позднякова // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - Воронеж, 2011. - № 2. - С. 92-96.
10. Изменение уровня экспрессии CD95 рецепторов лимфоцитов под действием УФ-радиации / О.В. Земченкова, В.Г. Артюхов, О.В. Башарина, С.В. Рязанцев // Радиация и Чернобыль: наука и практика: материалы международной научной конференции, Гомель, 13-14 октября 2011. - Минск, 2011. - С.
63-66.
11. Изменение уровня экспрессии CD95 и CD25 рецепторов лимфоцитов под действием УФ-облучения / О.В. Земченкова, В.Г. Артюхов, О.В. Башарина, С.В. Рязанцев // Биология - наука XXI века: сборник тезисов 16ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 16-апреля 2012. - Пущино, 2012. - С. 313-314.
12. Влияние УФ-света на уровень экспрессии CD4 и CD8 рецепторов Тлимфоцитов при различных условиях инкубации / О.В. Земченкова, О.В. Башарина, В.Г. Артюхов, С.В. Рязанцев, С.И. Позднякова // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегиональный сборник научных работ. - Воронеж, 2012. - Вып. 14. - С. 77-81.
13. Башарина О.В. Механизмы действия УФ-света на лимфоциты / О.В. Башарина, В.Г. Артюхов, О.В. Земченкова // 4 съезд биофизиков России, Нижний Новгород, 20-26 августа 2012: материалы докладов, Т. 5. - Н. Новгород, 2012. - С. 13.
14. Структурно-функциональные изменения фотомодифицированных лимфоцитов / В.Г. Артюхов, О.В. Земченкова, О.В. Башарина, С.В. Рязанцев // съезд биофизиков России, Нижний Новгород, 20-26 августа 2012: материалы докладов, Т. 5. - Н. Новгород, 2012. - С. 14.
15. Влияние УФ-света на рецепторный профиль лимфоцитов донорской крови / В.Г. Артюхов, О.В. Земченкова, О.В. Башарина, С.В. Рязанцев // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2012. - Т.52, № 5. - С. 534-541.
Статьи № 5, 7, 9, 15 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.