Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах рукописи

Сидехменова Анастасия Витальевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОЗИЦИИ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА И ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Томск - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ	Плотников Марк Борисович
Научный консультант: доктор медицинских наук, доцент	Носарев  Алексей Валерьевич

Официальные оппоненты:

Суслов Николай Иннокентьевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория фитофармакологии, заведующий лабораторией

Афанасьев Сергей Александрович, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт кардиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория молекулярно-клеточной патологии и генодиагностики, заведующий лабораторией

Ведущее учреждение: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития России

Защита состоится Ф____Ф_____________2012 г. в У_____Ф часов на заседании диссертационного совета Д.001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан У______Ф____________2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Амосова Е. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хроническая венозная недостаточность нижних конечностей - распространенное заболевание, представляющее собой большую медицинскую и социальную проблему, особенно в индустриально развитых странах, где встречаемость этой патологии среди взрослого населения достигает 50% [Савельев В.С., 2001; Allan P.L., 2000; Bergan J.J., 2007]. Высокая социально-экономическая значимость хронической венозной недостаточности нижних конечностей обусловлена большим количеством больных, высокой стоимостью лечения, а также снижением качества жизни и потерей трудоспособности. Несмотря на развитие новых эффективных методов диагностики и терапии, проблема хронической венозной недостаточности в полной мере не разрешена и усугубляется тем, что данное заболевание является прогрессирующим и имеет склонность к рецидивам [Chiesa R., 2007; Forssgren A., 2008]. Ежегодные затраты на лечение хронической венозной недостаточности в западноевропейских странах составляют 1Ц2% от всего бюджета здравоохранения [Beebe-Dimmer J.L., 2005; Hafner J., 2010].

В патогенез хронической венозной недостаточности нижних конечностей вносят свой вклад множество факторов: оксидативный стресс, нарушение проницаемости капилляров и лимфооттока, расстройства реологических свойств крови, гемостаза и микроциркуляции, дисфункция эндотелия, воспалительные реакции [Allegra C., 2003; Bergan J.J., 2007]. Поэтому актуальной проблемой является разработка эффективных флеботропных средств, обладающих широким спектром фармакологической активности, с целью повышения качества терапевтических мероприятий при лечении данной группы больных.

Исходя из современных представлений о механизмах формирования хронической венозной недостаточности нижних конечностей целесообразно использование веществ, способных уменьшать оксидативный стресс и ингибировать воспалительный каскад, что может предотвращать прогрессирование повреждения функций венозных клапанов. Известно, что антиоксиданты способны проявлять противовоспалительную, гемореологическую, ангиопротекторную и капиляропротекторную активность [Менщикова Е.В., 1994; Cadenas E., 2002; Packer L., 2007]. Ввиду этого перспективным является разработка новых флеботропных средств на основе антиоксидантов.

Цель работы: исследовать фармакологическую активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на модели хронической венозной недостаточности и выявить механизмы ее флеботропного действия.

Задачи исследования:

1. Изучить антиоксидантную, капилляропротекторную, лимфокинетическую и гемореологическую активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты в сравнении с эффектами отдельных компонентов композиции.
2. Исследовать влияние дигидрокверцетина и липоевой кислоты на тонус вен.
3. Изучить влияние композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на показатели отека, воспаления, микроциркуляции и гемостаза в условиях модели хронической венозной недостаточности.
4. Исследовать антитромбогенную активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на модели венозного тромбоза.

Научная новизна. Получены данные об усилении общей антиоксидантной активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты по сравнению с отдельными компонентами в модельной системе in vitro. Выявлена капилляропротекторная, лимфокинетическая и гемореологическая активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты. Впервые проведено исследование влияния дигидрокверцетина и липоевой кислоты на тонус вен. Разработана оригинальная модель хронической венозной недостаточности, которая заключается в частичной окклюзии каудальной полой вены. На модели хронической венозной недостаточности установлено, что композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты проявляет противоотечный и противовоспалительный эффекты, улучшает показатели микроциркуляции и гемостаза. Новыми являются данные о наличии у композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты антитромбогенного эффекта, выявленного в условиях модели венозного тромбоза.

Практическая значимость. Полученные данные о флеботропной активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты позволяют рекомендовать ее в качестве основы для разработки средства лечения хронической венозной недостаточности. Оригинальная модель хронической венозной недостаточности у крыс может быть рекомендована для доклинических исследований флеботропных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на научно-практической конференции Вопросы сохранения и развития здоровья населения севера и Сибири (Красноярск, 2010); Annual Russian-Korean Conference Current issues of natural products chemistry and biotechnology (Novosibirsk, 2010); VIII Всероссийской конференции с международным участием Химия и медицина (Уфа, 2010); VI Всероссийской конференции Химия и технология растительных веществ (Санкт-Петербург, 2010); Научно-практической конференции Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения (Новый Свет, Крым, Украина, 2011); I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых Сибирский медико-биологический конгресс (Барнаул, 2011); Всероссийской молодежной научной конференции Химия и технология новых веществ (Сыктывкар, 2011).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, получены 3 патента на изобретения.

Объем и структура работы: Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 230 источников, из них 59 отечественных и 171 зарубежных. Иллюстративный материал представлен 5 рисунками и 12 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 172 аутбредных крысах-самцах сток Вистар массой 250Ц300 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ НИИ фармакологии СО РАМН г. Томск. Животные находились в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе и свободном доступе к воде и пище. Массу животных контролировали еженедельным взвешиванием для коррекции вводимой дозы препаратов. Условия содержания и манипуляции с животными соответствуют стандартам, указанными в нормативных документах регламентирующих работу с лабораторными животными [ГОСТ 53434, 2010; ГОСТ Р ИСО 10993-2, 2009].

В работе использовали дигидрокверцетин (ООО Флавир, Россия), липоевую кислоту (ООО Марбиофарм, Россия), гесперидин+диосмин (Детралекс о, Лаборатория Сервье Индастри, Франция)

Хирургические процедуры выполняли под общим наркозом (тиопентал натрия 60 мг/кг внутрибрюшинно или диэтиловый эфир ингаляционно).

Препараты в виде суспензий в 1% крахмальной слизи вводили внутрижелудочно однократно или курсом в зависимости от условий эксперимента.

Моделирование хронической венозной недостаточности осуществляли путем ограничения кровотока в полой вене. Для этого у животных в асептических условиях под эфирным наркозом проводили лапаротомию, выделяли участок каудальной полой вены проксимальнее правой почечной вены. Подводили под сосуд лигатуру после чего в бедренную вену вводили гепарин в дозе 250 ЕД/кг и осуществляли частичную окклюзию каудальной полой вены. Для этого на участок полой вены помещали иглу диаметром 0,8 мм и перевязывали полую вену. Затем иглу удаляли, частично восстанавливая просвет сосуда. Рану послойно ушивали и проводили обработку операционного поля антисептиками (0,02% раствор фурацилина, порошок стрептоцида). Для снижения риска послеоперационных инфекций перед операционным вмешательством животным внутримышечно вводили гентамицин (4 мг/кг). У ложнооперированных животных полностью повторяли оперативное вмешательство, исключая этап окклюзии сосуда.

Венозный тромбоз моделировали через час после последнего введения композиции методом, описанным I. Reyers et al. [1989]. Для этого животных наркотизировали тиопенталом натрия, вскрывали брюшную полость, выделяли полую вену, очищали ее от прилежащих тканей и полностью лигировали хлопковой нитью ниже левой почечной вены. После чего брюшную полость послойно ушивали. Через 2 часа проводили лапаротомию, участок вены (длинной 7 мм) иссекали. Тромб выделяли из просвета сосуда, избыток крови удаляли фильтровальной бумагой. Оценивали массу влажного тромба [H. Gerhard 2008].

Определение общей антиоксидантной активности in vitro проводили с использованием спектрофотометрического метода, описанного P. Prieto et al [1999]. В данном методе присутствие антиоксидантов в реакционной среде сопровождается увеличением оптической плотности, которое отражает выраженность антиоксидантной активности веществ.

Исследование капилляропротекторной активности проводили с использованием метода И.А. Ойвина и К.М. Монаковой [1953]. Критерием сосудистой проницаемости служило время выхода красителя в очаг воспаления, вызванного внутрикожным введением 0,02 мл ксилола. В качестве индикатора проницаемости (красителя) капилляров использовали синий Эванса.

При оценке лимфокинетической активности определяли скорость оттока лимфы (мкл/кгмин), выделившейся из катетерезированной млечной цистерны (cisterna chili) животных. Лимфу стабилизировали гепарином в конечной концентрации 50 ЕД/мл.

Для исследования гемореологической активности забор проб цельной крови осуществляли из общей сонной артерии крыс. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1.

Гемореологическую активность оценивали на модели гипервязкости крови in vitro [Плотников М.Б., 1996]. Модель гипервязкости крови воспроизводили инкубацией проб крови при температуре 221 С в течение 60 минут. Абсолютные значения вязкости крови измеряли на ротационном вискозиметре АКР-2 [Левтов В.А., 1982]. В кювету вискозиметра объемом 0,8 мл помещали стабилизированную кровь. Вязкость крови регистрировалась при скоростях сдвига 3 с-1, 5 с-1, 7 с-1, 10 с-1, 50 с-1, 100 с-1 и 300 с-1 [Добровольский Н.А., 1997].

Для исследования сократительной функции вен эвтаназию животных проводили без применения медикаментозного наркоза методом декапитации. После этого вскрывали брюшную полость, выделяли участок воротной вены. Максимальный промежуток времени между забором материала и началом эксперимента не превышал 15 минут. Для изучения сократительной активности приготавливались кольцевые сегменты воротной вены шириной 1Ц2 мм. При исследовании сократительной активности сегментов воротной вены использовали метод механографии. В качестве механоэлектрического преобразователя применяли прецизионный датчик силы FT10g (Украина), что позволяло проводить эксперимент в условиях, близких к изометрическим. В качестве регистрирующего устройства использовали персональный компьютер с 14-битным АЦП L791 (Л-Кард, Россия). Данные обрабатывали с помощью программы Lgraph 2. Эффекты дигидрокверцетина, липоевой кислоты и норадреналина  оценивали в процентах от амплитуды контрольного сокращения сегментов (100%) на стандартную концентрацию КCl, которая составляла 40 мМ. После 30-минутной инкубации сегментов с дигидрокверцетином (25 мкМ) или липоевой кислотой (25 мкМ) оценивали амплитуду сокращения сегментов на норадреналин гидротартрат (110-6 М). В отдельной серии экспериментов оценивали реакцию сосудов на последовательное введение дигидрокверцетина и липоевой кислоты в нарастающих концентрациях (7,2 мкМ, 12,5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ). Липоевую кислоту и дигидрокверцетин растворяли в растворе Кребса с добавлением диметилсульфоксида (1,3 мМ).

Давление в каудальной полой вене регистрировали прямым методом с использованием аппаратного комплекса для электрофизиологических исследований Biopac (США) на уровне впадения в нее подвздошной вены с помощью датчика давления TSD104A. Перед измерением давления крыс наркотизировали диэтиловым эфиром, затем внутривенно вводили гепарин в дозе 250 ЕД/кг. Доступ осуществлялся через бедренную вену.

Противоотечный эффект оценивали по изменению объема стопы задних конечностей онкометрическим методом и морфологически. На гистологических препаратах мышцы голени, окрашенных гематоксилином и эозином, с помощью программы Adobe Photoshop CS2 измеряли площадь интерстициального пространства по отношению к стандартной площади ткани (в %) в полях зрения при десятикратном увеличении1.

Состояние микроциркуляции задней конечности оценивали у животных под эфирным наркозом методом лазерной допплеровской флоуметрии, используя анализатор микроциркуляции крови ЛАКК-02. В качестве показателя характеризующего состояние микроциркуляции использовали коэффициент вариации (Кv) [Крупаткина А.И., 2005].

Для оценки показателей гемостаза пробы крови забирали у крыс из общей сонной артерии под эфирным наркозом. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 после чего центрифугировали для получения плазмы. Исследование показателей свертывающей системы крови проводили на коагулометре КG-4 (Cormay, Польша). Концентрацию фибриногена в плазме оценивали методом тромбообразования Клауса с использованием набора реагентов для определения концентрации фибриногена Фибриноген-тест. Определение активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени и протромбинового времени проводили с помощью наборов АПТВ (АЧТВ)-тест и Техпластин-тест (Технология-стандарт, Россия) соответственно.

Для оценки адгезионной активности лейкоцитов пробы крови забирали у крыс из общей сонной артерии под эфирным наркозом и стабилизировали гепарином 25 ЕД/мл. Суспензию лейкоцитов получали центрифугированием в градиенте плотности (фиколл-верографиновый буфер; 30 мин при 1500 об./мин). Лейкоциты дважды отмывали раствором Хэнкса, центрифугируя при 1000 об./мин в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в 5 мл раствора Хенкса [Гольдберг Е.Д., 1992]. Полученную суспензию лейкоцитов (40 мкл) помещали в капилляр с внутренним диаметром 1 мм, предварительно обработанный раствором Дюльбекко. Клетки инкубировали при 37 оС в течение 60 мин. Клеточную взвесь удаляли из капилляра при напряжении сдвига, создаваемом давлением 0,05 кгс/см2. После чего капилляр заполняли раствором Дюльбекко и освобождали от содержимого уже при напряжении сдвига, создаваемом давлением 0,225 кгс/см2. Число клеток подсчитали в исходной суспензии, а также первом (неадгезировавшие и с малой силой сцепления) и втором (со средней силой сцепления) смыве, используя камеру Горяева. Из полученных данных рассчитывали число клеток, оставшихся в капилляре (с большой силой сцепления) [Mege J., 1989].

С-реактивный белок в сыворотке крови определяли методом латекс-агглютинации с помощью набора С-реактивный белок латекс тест (Ольвекс диагностикум, Россия).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ Statistica 8.0. Данные представлены в виде Mm, где M - среднее значение, m - стандартная ошибка среднего значения. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметрическиe критерии Mann-Whitney U test и метод -квадрата.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании антиоксидантных свойств дигидрокверцетина, липоевой кислоты и их композиции in vitro выявлено, что общая антиоксидантная активность дигидрокверцетина в концентрации 0,002% была выше, чем у липоевой кислоты в аналогичной концентрации в 1,5 раза.

Рис. 1. Общая антиоксидантная активность дигидрокверцетина (ДКВ), липоевой кислоты (ЛК) и их композиции (ДКВ+ЛК). OD695 - оптическая плотность растворов.

# - р<0,05 по сравнению со значениями в пробах с липоевой кислотой (0,002%); & - р<0,05 по сравнению со значениями в пробах с дигидрокверцетином (0,002%) и липоевой кислотой (0,002%).

При добавлении в реакционную смесь композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты в концентрации каждого компонента 0,002% установлено, что общая антиоксидантная активность превышала значения, полученные при добавлении дигидрокверцетина в концентрации 0,002% (в 1,6 раз) и липоевой кислоты в концентрации 0,002% (в 2,4 раза) (рис.1).

Таким образом, общая антиоксидантная активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты в соотношении 1:1 превышала активности компонентов смеси в отдельности, т.е. наблюдалось явление суммированного синергизма в модельной системе in vitro.

При изучении капилляропротекторной активности установлено, что дигидрокверцетин в дозе 20 мг/кг при курсовом введении в течение 7 дней увеличивал время выхода красителя на 27% по сравнению с контрольными значениями. Возрастание времени выхода красителя при введении липоевой кислоты в дозе 20 мг/кг по аналогичной схеме было не достоверно (табл. 1). Следовательно, дигидрокверцетин в отличие от липоевой кислоты проявляет выраженную капилляропротекторную активность, существенно снижая проницаемость капилляров у крыс.

Таблица 1

Влияние курсового (7 суток) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина, липоевой кислоты и их композиций на проницаемость капилляров у крыс Вистар

Группы животных	Время выхода красителя, с
Контроль, n=6	1485
Дигидрокверцетин (20 мг/кг), n=6	1884+
ипоевая кислота (20 мг/кг), n=6	1606
Дигидрокверцетин (20 мг/кг) и липоевая кислота (10 мг/кг), n=6	1939+
Дигидрокверцетин (20 мг/кг) и липоевая кислота (20 мг/кг), n=6	22412+ #
Дигидрокверцетин (20 мг/кг) и липоевая кислота (40 мг/кг), n=6	1674+

Примечание: + - р<0,05 по сравнению с контролем; # - р<0,05 по сравнению со значениями у животных, получавших дигидрокверцетин (20 мг/кг).

Композиция дигидрокверцетина (20 мг/кг) и липоевой кислоты (10 мг/кг) при курсовом введении увеличивала время выхода красителя на 30% по сравнению с контролем. В группе животных, получавших композицию дигидрокверцетина (20 мг/кг) и липоевой кислоты (20 мг/кг) время выхода красителя на 51% превышало контрольное значение и на 19% - значения у крыс, получавших один дигидрокверцетин. В группе животных, получавших дигидрокверцетин (20 мг/кг) и липоевую кислоту (40 мг/кг), время выхода красителя превышало контрольные значения на 13% (табл. 1).

Таким образом, липоевая кислота способна усиливать капилляропротекторные свойства дигидрокверцетина. Наиболее эффективным соотношением дигидрокверцетина и липоевой кислоты является 1:1. Одним из механизмов капилляропротекторной активности может быть повышение общей антиоксидантной активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты, так как в основе капилляропротекторного действия биофлавоноидов, в частности дигидрокверцетина, лежит их способность прямо или косвенно влиять на биомембраны, что, в свою очередь, связано с ингибированием в них свободнорадикальных процессов [Плотников М.Б. и соавт., 2005].

Инкубирование крови в течение 60 минут при температуре 221 С приводило к достоверному повышению вязкости крови в диапазоне скоростей сдвига от 3 с-1 до 300 с-1 на 13Ц29%, что свидетельствовало о формировании гипервязкости крови.

В группе крыс, получавших дигидрокверцетин в дозе 50 мг/кг в течение 7 суток, вязкость крови до инкубации во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига была ниже на 6Ц16% по сравнению с контрольными значениями. После инкубации вязкость крови у животных этой группы на скоростях сдвига 3Ц10 с-1 и 50Ц300 с-1 была ниже значений контроля на 11Ц14% и 8Ц10% соответственно.

У животных, получавших липоевую кислоту в дозе 50 мг/кг в течение 7 суток, исходные значения вязкости крови как в диапазоне скоростей сдвига 3Ц10 с-1, так и при скорости сдвига 50 с-1 были ниже значений в контроле на 16Ц19% и 9% соответственно. Вместе с тем, липоевая кислота практически не сдерживала возрастание вязкости крови после инкубации в течение часа по сравнению с контролем, значимые изменения наблюдались лишь на скорости сдвига 300 с-1.

Введение композиции дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) в течение 7 суток приводило к достоверному снижению исходных значений вязкости крови на скоростях сдвига 3Ц300 с-1 по сравнению с контролем на 6Ц17%. Кроме того, рассматриваемая композиция эффективно ограничивала увеличение вязкости крови после инкубации в диапазоне скоростей сдвига 3Ц10 с-1 на 16Ц18% и в диапазоне скоростей сдвига 50Ц300 с-1 на 8Ц13% по сравнению со значениями в контрольной группе (рис. 2).

Рис. 2. Влияние курсового (7 суток) внутрижелудочного введения композиции дигидрокверцетина с липоевой кислотой (по 50 мг/кг) на вязкость крови (мПас) через 1 ч после инкубации при температуре 221 оС у крыс Вистар. По оси ординат - вязкость крови; по оси абсцисс - скорость сдвига; 1 - контроль; 2 Цкомпозиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты;

+ - р<0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, установлено, что курсовое внутрижелудочное введение композиции дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) снижает вязкость крови у крыс и препятствует ее увеличению в условиях модели гипервязкости крови in vitro.

При изучении лимфокинетической активности дигидрокверцетина, липоевой кислоты и их композиции установлено, что в контрольной группе скорость лимфооттока составила 1064 мклкг/мин. Детралекс при однократном введении в дозе 50 мг/кг статистически достоверно увеличивал скорость лимфооттока на 38%. В группе крыс, получавших однократно липоевую кислоту в дозе 50 мг/кг, значимых изменений скорость лимфооттока по сравнению с контрольными значениями не выявлено. У животных, получавших однократно дигидрокверцетин в дозе 50 мг/кг, скорость лимфооттока превышала значения в контрольной группе на 25%. Результатом совместного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг), явилось усиление лимфокинетического эффекта дигидрокверцетина: скорость лимфооттока в этой группе животных достоверно превосходила показатель в контроле на 38% (рис. 3).

Таким образом, установлено, что дигидрокверцетин обладает лимфокинетической активностью, которая сохраняется в композиции с липоевой кислотой. Наблюдаемый лимфокинетический эффект композиции дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) сопоставим с эффектом детралекса.

Рис. 3. Влияние однократного внутрижелудочного введения детралекса (50 мг/кг), дигидрокверцетина (50 мг/кг), липоевой кислоты (50 мг/кг) и композиции дигидрокверцетина с липоевой кислотой (по 50 мг/кг) на скорость лимфооттока (мкл/кгмин) у крыс Вистар.

+ - р<0,05 по сравнению с контролем.

При изучении влияния дигидрокверцетина на сократительную активность изолированных сегментов воротной вены (n=8) было установлено, что данный препарат в нарастающих концентрациях (7,2 мкМ, 12,5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ) не влиял на тонус сосудов (рис. 4).

Механическое напряжение, мН

  Время, мин

Рис. 4. Сократительная активность изолированных сегментов воротной вены печени крыс при добавлении в омывающий раствор дигидрокверцетина в нарастающих концентрациях. Стрелкой указан момент добавления дигидрокверцетина.

При последовательном введении липоевой кислоты в нарастающих концентрациях (7,2 мкМ, 12,5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ) тоническое напряжение сегментов воротной вены (n=8) не менялось (рис. 5).

Механическое напряжение, мН

Время, мин

Рис. 5. Сократительная активность изолированных сегментов воротной вены печени крыс при добавлении в омывающий раствор липоевой кислоты в нарастающих концентрациях. Стрелкой указан момент добавления липоевой кислоты.

Поскольку имеются данные о способности ряда веществ повышать венозный тонус, продлевая стимулированную норадреналином активность венозной стенки, в следующей серии экспериментов было исследовано влияние дигидрокверцетина (25 мкМ) и липоевой кислоты (25 мкМ) на сокращение сегментов воротной вены, вызываемое добавлением в инкубационный раствор норадреналина гидротартрата (110-6 М).

В качестве предсокращающего фактора, вызывающего полумаксимальное сокращение сегментов воротной вены, использовали KCl в конечной концентрации 40 мМ.

Норадреналина гидротартрат (110-6 М) вызывал сокращение сегментов воротной вены (n=10). Амплитуда этого сокращения составила 11212% от контрольного гиперкалиевого предсокращения (табл. 2).

Аналогичные опыты были проведены после предварительной 30-минутной инкубации сегментов воротной вены с дигидрокверцетином (25 мкМ) и липоевой кислотой (25 мкМ). Как и в предыдущей серии экспериментов, наблюдалось сокращение сегментов воротной вены в ответ на добавление норадреналина гидротартрата (110-6 М) в инкубационный раствор. Однако амплитуда сокращения сегмента воротной вены в ответ на добавление норадреналина после инкубации с дигидрокверцетином составила 4611%, а после инкубации с липоевой кислотой - 4411% от контрольного предсокращения (табл. 2).

Таблица 2

Влияние дигидрокверцетина (25 мкМ) и липоевой кислоты (25 мкМ) на амплитуду сокращения сегментов воротной вены, вызванного норадреналином 10-6 М

Серия экспериментов	Амплитуда, %
Контроль, n=6	11212
После 30-минутной инкубации с дигидрокверцетином (25 мкМ), n=6	4611*
После 30-минутной с липоевой кислотой (25 мкМ), n=6	4411*

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями в контроле.

Амплитуду сокращения сосуда в ответ на добавление KCl в конечной концентрации 40 мМ принимали за 100%.

Следовательно, на изолированных сегментах воротной вены крыс дигидрокверцетин и липоевая кислота не проявляют венотонического эффекта и снижают стимулированную норадреналином сократительную активность.

Таким образом, в результате первого этапа исследования было установлено, что композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты в соотношении 1:1 обладает капилляропротекторной, гемореологической, антиоксидантной и лимфокинетической видами активности. В экспериментах по изучению антиоксидантной и капилляропротекторной активности выявлено усиление эффекта композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты по сравнению с эффектами ее компонентов в отдельности.

Полученные результаты явились основанием для выбора композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты в соотношении 1:1 в качестве объекта для дальнейшего углубленного исследования на модели хронической венозной недостаточности у крыс.

Модель хронической венозной недостаточности, воспроизводимая частичной окклюзией каудальной полой вены у крыс приводила к ограничению кровотока в полой вене и повышению венозного давления до 105,07,2 мм вод.ст., что значительно превышало показатели у ложнооперированных животных (38,47,2 мм вод. ст.). Венозная гипертензия являлась стойкой, что свидетельствует о стабильности модели. Наряду с развитием гипертензии у животных с частичной окклюзий каудальной полой вены на 14-е сутки наблюдалось увеличение объема стопы задних конечностей на 8% по сравнению с ложнооперированными животными (табл. 3).

Таблица 3

Влияние курсового (14 дней) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) на объем стоп задних конечностей у крыс с хронической венозной недостаточностью

Группы животных	Исходный объем, мл		Объем на 14-е сутки, мл
	евая лапа	Правая лапа	евая лапа	Правая лапа
ожнооперированные, n=5	1,900,03	1,920,02	1,870,02	1,910,01
Контроль, n=5	1,860,04	1,890,04	2,010,03*#	2,050,04* #
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, n=5	1,850,04	1,930,02	1,900,02+	1,930,03+

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению с контролем; # - р<0,05 по сравнению с исходными значениями.

При гистологическом исследовании выявлено увеличение интерстициального пространства на 20% по сравнению с ложнооперированными животными, что свидетельствует о признаках отека мышечной ткани (рис. 6).

Рис. 6. Мышцы голени крыс. Ложнооперированные животные (а), животные с хронической венозной недостаточностью (б) и животные с хронической венозной недостаточностью, получавшие внутрижелудочно композицию дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) (в). Отек интерстициального пространства. Окраска гематоксилином и эозином, х 10.

Таким образом, частичная окклюзия каудальной полой вены вызывала развитие стойкой венозной гипертензии, сопровождающейся отеком задних конечностей.

Борьба с отеком конечностей, который обусловлен как венозным, так и лимфатическим компонентами имеет чрезвычайно важное значение в лечении больных с хронической венозной недостаточностью. Появление отека в условиях венозного стаза и гипертензии, связано с дисбалансом между процессом транскапиллярной фильтрациии и процессами реабсорбции межтканевой жидкости и лимфатического дренажа [Низамов Ф.Х., 2008].

Введение композиции дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) в условиях модели хронической венозной недостаточности не влияло на венозное давление. Вместе с тем, исследуемая композиция значимо ограничивала увеличение объема конечностей и препятствовала формированию тканевого отека.

Объем стоп задних конечностей в группе животных, получавших дигидрокверцетин и липоевую кислоту, был достоверно ниже по сравнению со значениями в контроле и не отличался от величин у ложнооперированных животных (табл. 3). При этом площадь интерстициального пространства в опытной группе была меньше значений в контроле на 4% (рис. 6).

Таким образом, композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты при курсовом введении крысам с моделью хронической венозной недостаточности способна снижать выраженность отека в мышечной ткани и уменьшать объем задних конечностей.

В настоящее время ведущее значение в возникновении отека и прогрессировании трофических изменений на фоне хронической венозной гипертензии отводится нарушениям, происходящим на микроциркуляторном уровне [Junger M., 2000]. В данной работе для оценки микроциркуляции использовали коэффициент вариации: соотношение величин среднего потока крови в интервалах времени регистрации и среднего колебания перфузии. Увеличение этого параметра отражает улучшение микроциркуляции, так как это повышение обусловлено лучшей вазомоторной активностью микрососудов.

У животных в условиях модели хронической венозной недостаточности выявлено нарушение микроциркуляции, отразившееся в снижении коэффициента вариации на 14% по сравнению с ложнооперированными животными. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты препятствовала нарушению микроциркуляции в этих условиях: коэффициент вариации у животных, получавших композицию дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) в течение 14 суток был выше значений в группе контроля на 11% (р<0,05) (табл.4).

Таблица 4

Влияние курсового (14 дней) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) на коэффициент вариации (Кv) в условиях модели хронической венозной недостаточности у крыс

Группа животных	Кv, %
ожнооперированные, n=5	11,820,10
Контроль, n=5	9,140,04*
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, n=5	10,160,09*+

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у контрольных животных.

Таким образом, композиция на основе дигидрокверцетина и липоевой кислоты улучшает микроциркуляцию в условиях модели хронической венозной недостаточности у крыс.

При исследовании системы гемостаза у животных с хронической венозной недостаточностью обнаружено укорочение протромбинового времени на 14 % по сравнению с ложнооперированными животными. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты нормализовала данный показатель до уровня значений, наблюдаемых в группе ложнооперированных животных (р<0,05) (табл.5).

Таблица 5

Влияние курсового (14 дней) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) на показатели гемостаза у крыс с хронической венозной недостаточностью

Группа животных	АПТВ, с	ПВ, с	ФГ, г/л
ожнооперированные, n=7	11,80,7	22,20,6	3,20,1
Контроль, n=6	11,00,6	19,01,3*	3,40,2
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, n=7	11,20,3	22,90,8+	3,10,2

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных;

+ - достоверные различия по сравнению со значениями у контрольных животных (р<0,05).

В последние годы большинство авторов придерживаются мнения, что в основе патогенеза хронической венозной недостаточности нижних конечностей лежит венозная гипертензия и стаз венозной крови, активация и адгезия лейкоцитов, дисфункция эндотелия и выделение медиаторов воспаления [Bergan J.J., 2006; Ojdana D., 2009; Pascarella L., 2005; Stvrtinova V., 2001; Takase S., 2004]. При этом активация лейкоцитов и их адгезия к эндотелию является основным пусковым механизмом воспалительных реакций.

В наших исследованиях было выявлено, что моделирование хронической венозной недостаточности у крыс приводит к достоверному повышению доли лейкоцитов с большой силой сцепления в 2,6 раза и снижение доли неадгезировавших лейкоцитов и лейкоцитов с малой силой сцепления в 1,6 раза по сравнению с ложнооперированными животными (табл. 6).

Таблица 6

Влияние курсового (14 дней) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) на адгезионную способность лейкоцитов у крыс с хронической венозной недостаточностью

Группа животных	Неадгезировавшие лейкоциты и лейкоциты с малой силой сцепления, %	ейкоциты со средней силой сцепления, %	ейкоциты с большой силой сцепления, %
ожнооперированные, n=5	60,35,2	22,42,7	17,46,1
Контроль, n=6	37,64,1*	20,33,5	42,74,6*
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, n=5	54,35,9+	26,02,1	19,73,9+

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению с контролем.

У животных в условиях хронической венозной недостаточности наблюдалось достоверное повышение С-реактивного белка. В группе ложнооперированных крыс лишь у одного животного концентрация С-реактивного белка составила 5Ц10 мг/л, а у остальных - <5 мг/л. На 14-е сутки после создания модели хронической венозной недостаточности у всех животных контрольной группы содержание С-реактивного белка находилось в диапазоне 5Ц10 мг/л (табл. 7). Полученные нами данные свидетельствуют о развитии процесса воспаления при моделировании хронической венозной недостаточности.

Таблица 7

Распределение животных в группах по содержанию С-реактивного белка

Группа животных	С-реактивный белок 5Ц10 мг/л	С-реактивный белок <5 мг/л	p
ожнооперированные, n=5	1	6
Контроль, n=5	7	0	р<0,05
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, n=5	2	5	р1<0,05

Примечание: р<0,05 - по сравнению с распределением в группе ложнооперированных животных; р1<0,05 - по сравнению с распределением в группе контрольных животных.

Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты при курсовом введении уменьшала в 2,2 раза число лейкоцитов с большой силой сцепления и увеличивала число неадгезировавших лейкоцитов и лейкоцитов с низкой силой сцепления в 1,2 раза, по сравнению со значениями в контроле (табл. 6).

Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты достоверно снижала уровень С-реактивного белка по сравнению с контролем: лишь у двух животных содержание С-реактивного белка находилось в диапазоне 5Ц10 мг/л, а у остальных значения показателя не превышали 5 мг/л (табл. 7).

Таким образом, композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты проявляет противовоспалительную активность, снижая адгезионную активность лейкоцитов и уровень С-реактивного белка.

Замедление кровотока, дисфункция эндотелия, повышение коагуляционного потенциала крови составляют триаду Вирхова и являются пусковыми механизмами венозного тромбоза [Lopez J.A., 2004]. Данные нарушения наблюдаются при хронической венозной недостаточности. Следовательно, у пациентов с хронической венозной недостаточностью повышается риск возникновения венозного тромбоза [Дибиров М.Д., 2004].

Стаз - важнейший механизм, предрасполагающий к тромбообразованию. Используемая нами модель стаз-индуцированного тромбоза, сопровождается быстрой дилатацией полой вены и образованием тромба.

Профилактическое введение композиции дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) в течение 7 суток ограничивало тромбообразование. Масса тромба у животных, получавших композицию дигидрокверцетина и липоевой кислоты, была меньше на 46% по сравнению с массой тромба животных контрольной группы (табл. 8).

Таблица 8

Влияние курсового (7 дней) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) на тромбообразование

Группы животных	Масса тромба, мг
Контроль, n=6	3,190,38
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, n=5	1,450,22+

Примечание: + - р<0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, композиция дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) проявляет антитромбогенную активность, ограничивая тромбообразование у крыс на модели венозного тромбоза.

Дигидрокверцетин и липоевая кислота в композиции проявляют эффект синергизма в модельной системе in vitro при определении общей антиоксидантной активности. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты обладает капилляропротекторной и гемореологической активностью и по лимфокинетическому эффекту не уступает детралексу. Компоненты исследуемой композиции не проявляют венотонического эффекта.

Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты на модели хронической венозной недостаточности, вызванной частичной окклюзией каудальной полой вены, устраняет проявления отека, воспалительных реакций, нарушения гемостаза и микроциркуляции.

Профилактическое введение композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты снижает тромбооброзование в условиях модели тормбоза, индуцированного стазом.

Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты может быть рекомендована, как основа для разработки нового флеботропного средства.

ВЫВОДЫ

1. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты проявляет суммированный синергизм в отношении антиоксидантной активности.
2. Капилляропротекторный эффект композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты превышает эффекты ее компонентов в отдельности. Наиболее выраженным капилляропротекторным эффектом обладает композиция с соотношением компонентов 1:1.
3. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты обладает гемореологической и лимфокинетической активностью.
4. В условиях in vitro дигидрокверцетин и липоевая кислота не оказывают венотонического действия влияния на тонус изолированных сегментов воротной вены крыс и уменьшают амплитуду сокращения сегментов вен под действием норадреналина.
5. На модели хронической венозной недостаточности у крыс композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты снижает выраженность отека задних конечностей, проявляет противовоспалительный эффект, улучшает микроциркуляцию и нормализует протромбиновое время.
6. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты при профилактическом введении проявляет антитромбогенную активность, ограничивая тромбообразование на модели венозного тромбоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. имфокинетическая активность дигидрокверцетина // Вопросы сохранения и развития здоровья населения севера и Сибири: Материалы итоговой научно-практической конференции, Красноярск, 2010. - Вып. 9. - С. 261.
2. Investigation of capillary-protective composition on the base of dihydroquercetin and lipoic acid // Book of Аbstracts 2nd Annual Russian-Korean Conference Current issues of natural products chemistry and biotechnology. - Novosibirsk, 2010. - P. 75 (соавт. Ivanov I.S., Anischenko A.M., Plotnikov M.B.).
3. Гемореологическая активность композиции липоевой кислоты и дигидрокверцетина // Химия и медицина: Тез. VIII Всероссийской конференции с международным участием, Уфа, 2010. - С. 221 (соавт. Иванов И.С., Плотников М.Б.).
4. имфокинетическая активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты // Химия и полная переработка биомассы леса: Тезисы докладов VI Всероссийской конференции, Санкт-Петебург, 2010. - С. 247Ц248 (соавт. Иванов И.С., Алиев О.И., Плотников М.Б.).
5. Фармакологическая активность композиции на основе дигидрокверцетина и липоевой кислоты // Бюл. сиб. мед. - 2011. - № 1. С. 43Ц47. (соавт. Иванов И.С., Алиев О.И., Анищенко А.М., и др.).
6. Эффекты антиоксидантной композиции на модели хронической венозной недостаточности // Medline.ru - 2010. - Т. 11. - С. 590Ц595 (соавт. Иванов И.С., Алиев О.И., Фомина Т.И. и др.).
7. Изменения в системе гемостаза на модели хронической венозной недостаточности нижних конечностей у крыс // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых Сибирский медико-биологический конгресс, Барнаул, 2011 - С. 30Ц31 (соавт. Иванов И.С.).
8. Влияние липовертина на внешний путь свертывания крови на модели хронической венозной недостаточностью нижних конечностей у крыс // Тезисы докладов научно-практической конференции Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения, Киев, 2011. - С. 501Ц502 (соавт. Иванов И.С., Плотников М.Б.).
9. Влияние антиоксидантной композиции на основе дигидрокверцетина на уровень С-реактивного белка на модели хронической венозной недостаточности нижних конечностей у крыс // Химия и технология новых веществ и материалов: Тезисы докладов Всероссийской молодежной научной конференции, Сыктывкар, 2011. - C. 65 (соавт. Иванов И.С.).
10. Противоотечный эффект антиоксидантной композиции в условиях модели хронической венозной недостаточности // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2011. - Т. 152, № 7. - С. 28Ц31 (соавт. Иванов И.С., Алиев О.И., Фомина Т.И. и др.).
11. Влияние композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на показатели гемостаза в условиях модели хронической венозной недостаточности нижних конечностей у крыс // Бюл. сиб. мед. - 2012. - Т. 27, № 1. - С. 122Ц124 (соавт. Плотников М.Б., Иванов И.С.).
12. Патент на изобретение (RU) № 2414230 Средство, обладающее капилляропротекторной активностью. Зарегистрирован в Госреестре РФ 20.03.2011 (соавт. Плотников М.Б., Тюкавкина Н.А., Алиев О.И. и др.).
13. Патент на изобретение (RU) № 2423138 Средство, обладающее лимфокинетической активностью. Зарегистрирован в Госреестре РФ 10.06.2011 (соавт. Плотников М.Б., Алиев О.И., Иванов И.С. и др.).
14. Патент на изобретение (RU) № 2438686 Средство для лечения хронической венозной недостаточности. Зарегистрирован в Госреестре РФ 10.01.2012 (соавт. Плотников М.Б., Алиев О.И., Иванов И.С.и др.).

---

1 Выражаем искреннюю благодарность к.м.н., старшему научному сотруднику отдела лекарственной токсикологии НИИ фармакологии СО РАМН Фоминой Т. И. за помощь в проведении эксперимента.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине