Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству
На правах рукописи
АХМЕТОВ ТАХИР МУНАВИРОВИЧ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ МАРКЕР-ВСПОМОГАТЕЛЬНОЙ СЕЛЕКЦИИ В МОЛОЧНОМ СКОТОВОДСТВЕ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН
06.02.01 - Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Казань - 2009
Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждение высшего профессионального образования Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана
Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор Кабиров Галимзян Фазылзянович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Пронин Борис Григорьевич доктор биологических наук, профессор Калашникова Любовь Александровна доктор сельскохозяйственных наук, профессор Родионов Геннадий Владимирович
Ведущая организация: Государственное научное учреждение Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии
Защита диссертации состоится л___ __________ 2009 г. в л___ часов на заседании диссертационного совета Д-220.034.02 при Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана по адресу: 420074, г. Казань, ул. Сибирский тракт, 35; тел. 273-96-17.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (420074, г.
Казань, ул. Сибирский тракт, 35).
Автореферат разослан л____ ___________2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета: доктор биологических наук, профессор Мухаметгалиев Нурвахит Нургалиевич 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Одной из основных задач в области молочного скотоводства является получение высокопродуктивных животных, молоко которых обладает оптимальными технологическими качествами. Однако селекционная работа, базирующаяся только на классических подходах, в настоящее время не обеспечивает высокого селекционного эффекта и не удовлетворяет потребностям сегодняшнего дня.
Опыт многих стран свидетельствует о важности селекции коров по белковомолочности, так как это во многом определяет пищевую ценность молока и его технологические свойства. В связи с возрастающими требованиями рынка к качеству молочной продукции, в частности к количеству и составу молочного белка, а также к сыродельным характеристикам молока, возникает насущная необходимость в выявлении и использовании в селекции генетических маркеров, связанных с качественными признаками молочной продуктивности. Одним из таких маркеров считается тестирование животных по локусу гена каппа-казеина.
Многие исследователи, изучавшие влияние аллелей гена каппа-казеина на качество молока, обнаружили устойчивую связь аллеля В каппа-казеина с технологическими свойствами молока, а также обильномолочностью. Так, Валлельный вариант каппа-казеина связан с наиболее коротким временем коагуляции и затвердения, соответствует лучшей консистенции и композиции сгустка при изготовлении твердых и полутвердых сыров.
Известно, что в сыроделии происходят значительные перебои в выработке сыра, связанные с низким качеством молока в переходный период (весенний), что сказывается на эффективности производства. При производстве того или иного продукта молоко должно отвечать определенным технологическим требованиям.
Так, при производстве сыров, особенно твердых его сортов, большое внимание уделяется составу молока. Содержание казеина в этом молоке должно быть не менее 75%, а таких фракций, как sСn, (альфа s-казеин), Сn (бета-казеин), Сn (каппа-казеин) 91% от общего его количества. Молоко должно хорошо свертываться под действием сычужного фермента, быть термостабильным, обладать хорошими синергическими свойствами и высоким выходом конечной продукции.
В селекционной работе с крупным рогатым скотом характеристика молока проводится в основном по удою, жиру и общему содержанию белка, однако полиморфизму белков молока пока не уделяется должного внимания.
В связи с возрастающими требованиями к качеству молока и молочной продукции, возникает необходимость использования в селекции генетических маркеров, связанных с признаками молочной продуктивности. В сложившейся ситуации требуется изменение в методах оценки признаков селекции животных.
К классическим методам селекции животных необходимо добавить новые подходы, связанные с достижениями генетики и биотехнологии. Одним из современных методов повышения продуктивных качеств животных является маркер-вспомогательная селекция, которая опирается на молекулярногенетические методы анализа, а именно ПЦР-ПДРФ анализ, который отличается высокой чувствительностью, быстротой, точностью и легкостью в исполнении.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является использование современных методов маркер-вспомогательной селекции ПЦРПДРФ и электрофорез в ПААГ для изучения молочной продуктивности и технологических свойств молока коров татарстанского типа с разными генотипами каппа-казеина в условиях Республики Татарстан. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Оптимизировать технику выделения ДНК из лейкоцитов крупного рогатого скота для молекулярно-генетических исследований;
2. Оптимизировать технику ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина, и разработать новые способы проведения ПЦР;
3. Определить частоту встречаемости аллельных вариантов и генотипов каппаказеина у крупного рогатого скота татарстанского типа с использованием ДНК-диагностики;
4. Изучить показатели молочной продуктивности (удой, содержание жира и белка, типы лактационных кривых) коров с разными генотипами каппаказеина;
5. Изучить качество и технологические свойства молока коров с разными генотипами каппа-казеина;
6. Изучить качество и технологические свойства молочных продуктов, изготовленных из молока коров с разными генотипами каппа-казеина;
7. Охарактеризовать воспроизводительные качества коров с разными генотипами каппа-казеина;
8. Изучить селекционно-генетические параметры молочной продуктивности коров с разными генотипами каппа-казеина;
9. Определить экономическую эффективность использования коров с разными генотипами каппа-казеина.
Научная новизна. Оптимизирована техника выделения ДНК и техника ПЦРПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина.
Разработана методика высокоточной ПЦР (Способ проведения ПЦР - патент РФ на изобретение №2299240) и способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппаказеина (патент РФ на изобретение №2337141) с оптимизированной техникой 2х стадийной ПЦР.
Выявлен полиморфизм и определена частота встречаемости аллельных вариантов по гену каппа-казеина у татарстанского типа крупного рогатого скота в Республике Татарстан. Изучена взаимосвязь генотипа каппа-казеина с молочной продуктивностью и технологическими свойствами молока. Установлено влияние генотипа животных по локусу гена каппа-казеина на показатели молочной продуктивности и технологические свойства молока при приготовлении полутвердого сыра, творога и йогурта.
Практическая значимость. Полученные данные о наличии взаимосвязи генотипа животных по локусу гена каппа-казеина с составом молока коров и его технологическими свойствами, которые открывают возможность для совершенствования татарстанского типа крупного рогатого скота по качеству получаемой от них молочной продукции. Увеличение численности животных, несущих в геноме желательные аллельные варианты гена каппа-казеина, приведет к увеличению производства белковомолочной продукции с оптимальными технологическими свойствами. Результаты научных исследований успешно внедрены в производство на примере ООО Серп и молот, ОАО Бирюлинский, ГПП Элита, ОАО Вамин-Татарстан Высокогорский молочный завод, Высокогорского района, СХПК им. Ленина Атнинского района, Чистопольский молочный комбинат Чистопольского района РТ, что привело к увеличению количества, улучшению качества животноводческой продукции, повышению экономической эффективности, на что имеются акты внедрения. По результатам исследований выпущены методические рекомендации по использованию новейших достижений ДНК-технологий в селекционноплеменной работе, направленной на улучшение технологических свойств молока (Казань, 2007), которые широко используются специалистами селекционных центров, племенных предприятий, а также зоотехниками селекционерами.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:
1. Республиканских научно-практических конференциях по проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 1994,1995,1996).
2. 2-й Республиканской научно-производственной конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1996).
3. 2-й Международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам животных (Киев, 1996).
4. Научно-производственной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов агропромышленного факультета посвященной к 80летию КГСХА (Казань,2002).
5. Материалах научных исследований сотрудников КГСХА (Казань, 2003).
6. Международной конференции Современные проблемы аграрной науки и пути их решения (Ижевская ГСХА, 2005).
7. Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 85-летию ТатНИИСХ и 1000-летию Казани (Казань, 2005).
8. Международной научной конференции Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства (Москва, Дубровицы, 2005).
9. Международной научно-практической конференции Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства (Иошкар-Ола, 2007).
10. Всероссийской научно-практической конференции Технологические и технические аспекты развития сельского хозяйства Посвящается 85-летию КГАУ (Казань.2007).
11. Конференции молодых ученых РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2007).
12. Годовых отчетах по науке КГАВМ (1992-2000), КГАУ (2001-2007), ГНУ ТатНИИСХ (2005-2007).
13. Всеросийской научно-практической конференции Современные подходы развития АПК посвященной 135-летию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2008).
Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований, выполненные по теме диссертации, опубликованы в 34 печатных работах. В том числе: журналах Зоотехния, Генетика, Ветеринарный врач, Ветеринарная практика, Ученые записки КГАВМ, Вестник КГАУ, методической рекомендации. Получено два патента на изобретение.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Оптимизация техники выделения ДНК и техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина и разработка новых способов проведения ПЦР.
2. Влияние генотипа каппа-казеина у коров татарстанского типа на молочную продуктивность, качество и технологические свойства молока.
3. Влияние генотипа каппа-казеина у коров татарстанского типа на качество и технологические свойства белковомолочных продуктов, изготовленных из молока таких животных.
4. Экономическая эффективность использования коров с разными генотипами каппа-казеина.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 2страницах компьютерного текста, содержит 57 таблиц, 25 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, предложений производству, списка литературы и приложений.
Библиографический список использованной литературы включает 5источников, в том числе 198 на иностранных языках. Прилагаются акты внедрения, патенты на изобретение, методические рекомендации и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования по теме диссертации проводились в период с 1990 по 2007 гг.
на кафедре генетики и селекции с.-х. животных ФГОУ ВПО Казанская государственная академия ветеринарной медицины, на кафедре технология производства и переработки продукции животноводства ФГОУ ВПО Казанский государственный аграрный университет, в лаборатории молекулярногенетических исследований ГНУ Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, в отделе генно-молекулярной диагностики ФГУ Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория, ООО Серп и Молот, ОАО Племзавод Бирюлинский, молочном заводе ОАО Вамин-Татарстан Высокогорского района, ОАО Чистопольский молочный комбинат Чистопольского района и в СХПК им. Ленина Атнинского района, а также в ГУП головном племенном предприятии Элита Высокогорского района Республики Татарстан.
Для исследования по принципу аналогов (А.И. Овсянников, 1976) были сформированы 3 группы коров-первотёлок татарстанского типа. В первую группу включены первотёлки с генотипом каппа-казеина АА (контрольная группа), во вторую - генотипом АВ, в третью - генотипом ВВ. Научно-хозяйственные опыты поставлены согласно схеме исследования (рис. 1).
Исследование полиморфизма у коров татарстаского типа гена каппа-казеина и белков молока с помощью методов ДНК-диагностики и электрофореза в ПААГ Выявление аллельных вариантов, оценка частоты встречаемости аллелей и генотипов, степени гетерозиготности, наличия генного равновесия быки-производители Ч/П и коровы татарстанского типа помесные по голштинской породе Группы Группы Генотип каппа-казеина Генотип каппа-казеина АА АВ ВВ АА АВ ВВ Оценка быков-производителей по Оценка влияния генотипов каппамолочной продуктивности (удой казеина на хозяйственно-полезные и содержание жира) их матерей признаки коров-первотелок татарстанского типа Молочная продуктивность коров татарстанского типа с разными генотипами каппа-казеина Удой за лактацию, динамика удоя за лактацию. Типы лактационных кривых, спадаемость и коэффициент постоянства лактационных кривых. Динамика изменения содержания белка и жира в молоке Оценка качества и технологических свойств молока коров татарстанского типа с разными генотипами каппа-казеина Состав, физико-химические показатели, белковые фракции, сыропригодность и термоустойчивость молока Оценка качества и технологических свойств молочных продуктов, изготовленных из молока коров с разными генотипами каппа-казеина Приготовление сыра, творога и йогурта из молока коров с разными генотипами каппа-казеина, определение качества продуктов Оценка воспроизводительных качеств коров татарстанского типа с разными генотипами каппа-казеина Продолжительность сервис-периода и межотельного периода, коэффициент воспроизводительной способности, индекс Дохи Экономическая эффективность использования коров с разными генотипами каппа-казеина Рис. 1. Схема исследований Для проведения исследований и оценки хозяйственно-полезных признаков в зависимости от генотипа каппа-казеина, было отобрано 225; 219 и 164 первотёлки татарстанского типа в ООО Серп и Молот, СХПК им. Ленина и ОАО Племзавод Бирюлинский, 70 быков-производителей ГУП ГПП Элита.
Объем выполненных исследований представлен в таблице 1.
Таблица 1. Объем выполненных исследований Вид исследований Количество проб Выделение ДНК 13Проведение ПЦР-ПДРФ 20Проведение высокоточной ПЦР 6Проведение аллель-специфичной ПЦР 6Определение состава и физико-химических показателей 6молока общепринятыми методами Анализ белкового состава молока методом гель 6электрофореза по 15 фракциям Оценка сыродельческих свойств молока по сычужной 6свертываемости Исследование термоустойчивости молока 6Приготовление и исследование сыра, творога и йогурта 6В работе наряду с экспериментальными материалами использовались данные зоотехнического и племенного учета данного хозяйства, то есть племенные карточки коров и быков (формы: 1-МОЛ, 2-МОЛ), а также каталоги и племенные свидетельства быков-производителей.
Исследуемые стада хозяйств ООО Серп и Молот, ОАО Племзавод Бирюлинский и СХПК им. Ленина представлены молочным скотом татарстанского типа, созданного путем скрещивания холмогорской, чернопестрой и голштинской пород (1/8 Х + 1/16 Ч-П + 13/16 Г).
Все животные в течение проведения опыта находились в одинаковых условиях кормления и содержания, а также были клинически здоровыми.
Обслуживающий персонал в период проведения исследований был постоянным, что исключало влияние данного стрессового фактора на хозяйственно-полезные признаки животных.
Коровам скармливали корма по принятым в хозяйстве рационам в соответствии с нормами ВАСХНИЛ. Рационы кормления подопытных коровпервотелок были сбалансированны по 23 показателям. Основные корма зимнего периода состояли из сена (разнотравного или лугового), сенажа (люцернового или вико-овсяного), силоса (кукурузного), соломы (пшеничной), которые коровы получали в одинаковом количестве, концентрированные корма и корнеплоды в зависимости от фактического удоя. Кормление коров в летний период обеспечивалось за счёт зелёного корма на пастбище и в виде зелёной подкормки при содержании в стойлах. Кроме того, давали концентрированные корма.
Первотёлкам скармливали концентраты в расчёте 330 - 370 г на 1 кг молока.
В структуре рациона по питательности в зимний период грубые корма составили 19-22%, сочные - 40-45%, концентрированные - 30-33%; в летний период - зелёные корма - 80-85%, концентраты - 15-20%. Затраты кормов составили: на 1 кг молока 0,94-0,99 ЭКЕ, в среднем за лактацию 4868-5061 ЭКЕ.
Высокий уровень кормления поддерживается на протяжении многих лет.
Выделение ДНК из крови.
Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с имеющимся 100 мМ раствором ЭДТА (pH 8,0), в соотношении 10:1.
ДНК из крови выделяли разработанным нами аммиачным и комбинированным щелочным способом.
Аммиачный способ: 100 мкл крови смешивали с 1000 мкл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 100 мкл 10 % раствора аммиака (25 - 37 0С) и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.
Комбинированный щелочной способ:
100 мкл крови смешивали с 1000 мкл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 600С в течение 15 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. Затем смешивали с 500 мкл 96% этанола осторожным покачиванием пробирки и выдерживали полученную смесь в морозильнике при -200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 10 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 15 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и повторяли процедуру термостатирования (600С, 15 мин). Полученный гомогенат инкубировали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.
Препараты ДНК хранили в условиях морозильника. Перед использованием пробы ДНК размораживали в термостате при 370С в течение 15 минут.
Условия проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина. Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену каппа-казеина была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров (табл. 2) по оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ.
Таблица 2. Серия праймеров для генотипирования кр.рог.ск.
по гену каппа-казеина, протестированных в данной работе ПЦР ПДРФ Праймеры продукт HinfI HindIII (bp) АА ВВ АВ АА ВВ АВ 326 426 426 453 351 4AB1: 5/-TGTGCTGAGTAGGTATCCTAGTTATGG-3/ 100 27 326 102 3АВ2: 5/-GCGTTGTCTTCTTTGATGTCTCCTTAG-3/ 427 100 1A. Barroso et al. (1998) 131 222 222 271 182 2К1: 5/-GAAATCCCTACCATCAATACC-3/ 91 49 131 89 1К2: 5/-CCATCTACGCTAGTTTAGATG-3/ 249 91 S. Kaminski (1990) 134 265 265 350 218 3JK5: 5/-ТСАТТТАТGGCCATTCCACCAAAG-3/ 131 85 134 132 2JK3: 5/-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3/ 385 131 1J.F. Medrano and E. Aguilar-Cordova (1990) ПЦР проводили на программируемом термоциклере Терцик (Россия) в объеме реакционной смеси 20 мкл, содержащей 60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ дНТФ, ед. Taq ДНК полимеразы, по 0,5 мкМ каждого из праймеров AB1 и АВ2, сконструированных A. Barroso et al. (1998) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 453 bp [(по 0,5 мкМ каждого из праймеров К1 и К2, сконструированных S. Kaminski (1990) для амплификации фрагмента гена каппаказеина длиной 271 bp), (по 0,5 мкМ каждого из праймеров JК5 и JКЗ, сконструированных J.F. Medrano and E. Aguilar-Cordova (1990) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 350 bp)], 1 мкл пробы ДНК в оптимизированных режимах:
1: 94 0С - 4 мин; 40: 94 0С - 10 сек, 63 0С - 10 сек, 72 0С - 10 сек;
1: 72 0С - 5 мин; хранение: 4 0С (для праймеров AB1+AB2 и JK5+JK3; рис. 2, 4).
1: 94 0С - 4 мин; 40: 94 0С - 30 сек, 61 0С - 30 сек, 72 0С - 30 сек;
1: 72 0С - 5 мин; хранение: 4 0С (для праймеров К1+К2; рис. 3).
Для ПДРФ-идентификации генотипов гена каппа-казеина 20 мкл ПЦР-пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Hinf I в 1буфере О фирмы СибЭнзим (Россия) или 10 ед. эндонуклеазы рестрикции HindIII в 1буфере W фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение ночи.
Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1ТВЕ буфере.
После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм и фотографировали с использованием оранжевого светофильтра. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам ПЦР-ПДРФ.
Разработанная методика высокоточной ПЦР протестирована в сравнении с классической ПЦР и ближайшим аналогом на предмет оценки аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота Классическую ПЦР проводили на программируемом термоциклере Терцик (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей 60 мM Трис-HCl (pH 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэтанол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ дНТФ, 0.5 ед. Taq ДНК полимеразы, 0.5 мкМ праймера JK5: 5/-ATCATT TATGGCCATTCCACCAAAG-3/ (расчетная Tm=60,80C), 0,5 мкМ праймера JK3: 5/-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3/ (расчетная Tm= 66,70C), сконструированных J.F. Medrano & E. Aguilar-Cordova (1990) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 350 пар нуклеотидов, 1 мкл пробы ДНК, выделенную из лейкоцитов крови крупного рогатого скота в режиме: 1: 940С - мин; 40: 940С - 30 сек, 600С - 30 сек, 720С - 30 сек; 1: 720С - 10 мин (рис. 5, трек 4), а также оптимизированном нами режиме: 1: 94 0С - 4 мин; 40: 940С - 10 сек, 630С - 10 сек, 720С - 10 сек; 1: 720С - 5 мин (рис. 4).
Предлагаемый способ ПЦР проводили на программируемом термоциклере Терцик (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей 60 мM Трис-HCl (pH 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэтанол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ дНТФ, 0.5 ед. Taq ДНК полимеразы, 0.5 мкМ праймера JK5-hs с 5/-некомплементарным участком (n) длиной 5 нуклеотидов и 3/-комплементарным участком (N) длиной 25 нуклеотидов: 5/- gggggATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3/ (расчетная nN Tm=700C; N Tm =60,80C), 0,5 мкМ праймера JK3-hs c 5/-некомплементарным участком (n) длиной 4 нуклеотида и 3/-комплементарным участком (N) длиной нуклеотидов: 5/-ccccGCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3/ (расчетная nN Tm=73,50C; N Tm=66,70C) (амплификация специфичного ПЦР продукта размером 359 bp), 1 мкл пробы ДНК, выделенную из лейкоцитов крови крупного рогатого скота в следующих режимах: 1: 940С - 4 мин; 40: 940С - 30 сек, 720С - 30 сек;
1: 720С - 10 мин (рис. 5, трек 1).
1: 940С - 4 мин; 40: 940С - 10 сек, 680С - 20 сек; 1: 720С - 5 мин (рис. 6).
1: 940С - 4 мин; 40: 940С - 10 сек, 720С - 20 сек; 1: 720С - 5 мин (рис. 7).
Также проводили ПЦР с использованием 0.5 мкМ праймера N-JK5 с 5/некомплементарным участком (n) длиной 12 нуклеотидов и 3/-комплементарным участком (N) длиной 20 нуклеотидов: 5/-gggcagaggtgaTTATGGCCATTCCACCAA AGЦ3/ (расчетная nN Tm=72,80C; N Tm=57,40C), 0,5 мкМ праймера N-JK3 c 5/некомплементарным участком (n) длиной 12 нуклеотидов и 3/-комплементарным участком (N) длиной 20 нуклеотидов: 5/-gggcagaggtgaTTCGCCTTCTCTGTAACA GA-3/ (расчетная nN Tm=72,40C; N Tm=57,20C) (амплификация специфичного ПЦР продукта размером 363 bp) в режиме предлагаемого способа: 1: 940С - 4 мин;
40: 940С - 30 сек, 680С - 30 сек; 1: 720С - 10 мин (рис. 5, трек 2), а также в режиме ближайшего аналога: 1: 940С - 4 мин; 5: 940С - 30 сек, 580С - 30 сек, 720С - 30 сек. 35: 940С - 30 сек, 720С - 30 сек. 1: 720С - 10 мин (рис. 5, трек 3).
Для анализа аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота методом ПДРФ, ПЦР-продукты амплификации фрагментов ДНК, инициированные праймерами JK5-hs+JK3-hs (рис. 6-7, трек 2, 5, 8) обрабатывались 5 ед. HinfI, а также 10 ед. HindIII при 370C в течение ночи (рис. 67, трек 3, 6, 9).
Детекция результатов ПЦР-ПДРФ проведена методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере ТBE (рН 8,0) содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (=310 нм). Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами (НПО СибЭнзим, Россия).
Разработанный способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и B гена каппа-казеина.
проводили на программируемом термоциклере Терцик (Россия) в объеме мкл, содержащей 60 мM Трис-HCl (pH 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэтанол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ дНТФ, 0.5 ед. Taq ДНК полимеразы, 2 пары аллель-специфичных праймеров: 1-ая пара B-аллельспецифичных праймеров = 0.5 мкМ праймера B-F-hs: 5/-сссссGTGAGCCTACA AGTACACCTACCAT-3/, 0,5 мкМ праймера B-R-hs: 5/-cCcccGA TGTCTCCTTA GAGTATTTAGACC-3/ (ПЦР амплификация В-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 156 bp); 2-ая пара Aаллель-специфичных праймеров = 0.5 мкМ праймера A-F-hs: 5/-gggggCTGTTC ACACACAAAAACAGTAAAG-3/, 0,5 мкМ праймера A-R-hs: 5/-gggGGGTGCCT AACCTTATACAGCCTTTCG-3/ (ПЦР амплификация A-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 242 bp); мкл пробы ДНК, выделенную из лейкоцитов крови крупного рогатого скота в следующем оптимальном режиме амплификации: 1: 940С - 4 мин; 40: 940С - мин, 720С - 1 мин; 1: 720С - 10 мин (рис. 8).
Визуализацию амплифицированной ДНК проводили методом гельэлектрофореза. Для этого продукты амплификации смешивали с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 40% (вес-объем) сахарозы в Н2О) в соотношении 6:1. Полученную смесь вносили в лунки 2,5% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА, рН 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл и подвергали горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 15 В/см в течение 1 часа с последующим просматриванием в УФ-трансиллюминаторе (290-330 нм).
Частоту встречаемости генотипов определяли по формуле:
n p =, где р - частота определения генотипа, n - количество особей, N имеющих определенный генотип, N - число особей.
Частоту отдельных аллелей определяли по формулам:
РА = (2nAA+nAB) : 2N и qB = (2nBB+nAB) : 2N где PА - частота аллеля А, qB - частота аллеля В, N - общее число аллелей.
По закону Харди-Вайнберга (В.Л. Петухов, А.И. Жигачёв, Г.А. Назарова, 1985) рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции.
Молочную продуктивность определяли ежемесячно путём проведения контрольных доек (3 раза в месяц). На основании контрольных доек рассчитывали общую молочную продуктивность за 305 дней лактации, а также за укороченную лактацию, но не меньше 240 дней. Содержание жира в молоке определяли кислотным методом по Гербергу, а содержание белка методом формольного титрования (П.В. Кугенев, Н.В. Барабанщиков, 1988).
Характер лактационных кривых изучали по методике А.С. Емельянова (1953), коэффициент постоянства лактации (КПЛ) - по Furhner (1959) в переработке А.А. Аксенниковой (1964). Вычисления проводили по следующей формуле:
КПЛ = (удой за 4 - 6 мес. лактации / удой за 1 - 3 мес. лактации) 100;
Определяли плотность молока с помощью ареометра (лактоденсиметра), кислотность молока - методом титрования, сортность (класс) молока по редуктазной пробе с резазурином по цветовой шкале, сухое вещество в молоке и молочных продуктах - методом высушивания в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре 105 0С, содержание жира в молоке и молочным продуктах - кислотным методом, содержание белка в молоке и молочных продуктах - методом измерения массовой доли общего азота по Кельдалю и определению массовой доли белка.
Для определения сыропригодности молока использовали сычужную и сычужно-бродильную пробы (ГОСТ 9225-84). В три пробирки отмеряли по 10 мл хорошо перемешанного молока одной и той же пробы. Пробирки с молоком ставили в водяную баню при 35С, в одну из пробирок помещали термометр, по которому следили за температурой воды. Доводили температуру молока до 35 - 36С и после этого в две пробирки вносили по 1 мл разбавленного сычужного раствора, температура которого была 35С. Содержимое пробирок быстро перемешивали и ставили их в водяную баню, замечая время. Температуру все время поддерживали на уровне 35С.
Продолжительность свертывания молока определяли в минутах, учитывая время с момента введения фермента до образования плотного сгустка.
Сыропригодность молока определяли по продолжительности его свертывания сычужным ферментом и делили на три типа:
- молоко первого типа свертывается менее чем за 15 мин;
- молоко второго типа - в течение 15 - 40 мин;
- молоко третьего типа - более чем за 40 мин, или же совсем не свертывается (Н.В. Барабанщиков,1990).
Для изготовления сыра больше всего подходит молоко второго типа и по нему отработаны технологические режимы производства. Молоко, медленно свертывающееся сычужным ферментом, считается несыропригодным.
Плотным считали сгусток без выделения сыворотки, пузырьков газа, трещин, пустот. При повороте пробирки на 180 сгусток не выпадал или выпадали лишь отдельные кусочки.
Рыхлым считали сгусток, имеющий немногочисленные глазки пузырьков газа, трещины. При повороте пробирки на 180 сгусток деформировался и выпадало до 50% от общего количества сгустка.
Дряблым считали сгусток, сильно пронизанный пузырьками газа, разорванный на куски, хлопьевидный. При повороте пробирки на 180 сгусток выпадал полностью или выпадало более 50% от общего количества сгустка.
Термоустойчивость молока определяли по тигловой пробе. В пробирки из молибденового стекла отмеряли по 2 мл молока. Затем пробирки с молоком ставили в ультратермостат и нагревали до температуры + 135 С, замечая время.
Если в течение 5 мин консистенция молока не изменялась, то оно считалось термоустойчивым. Определяли также термостабильность, т.е. промежуток времени от момента помещения пробирок в ультратермостат до появления первых признаков коагуляции белков.
У коров на 3 - 4 месяцах лактации методом электрофореза в полиакриламидном геле определяли абсолютное и относительное содержание белковых фракций: s'-, s0-, s1-, s2-, -, -, -, s - казеинов (Cn), F-фракции сыворотки, - лактоглобулина (Lg), - лактоальбумина (La), альбумина сыворотки крови (Al), протеозо-пептонной фракции (Pp), иммуноглобулина (Ig), и минорных фракций сыворотки.
Пробы молока для электрофоретического анализа и сычужной пробы брали из суточного удоя коров в стеклянные баночки объемом 100 мл. Для электрофореза отобранные пробы отделяли в пенициллиновые флаконы объемом 30 мл и консервировали 20%-м раствором тиамерсала, конечная концентрация, которого в молоке составляла 0,003%. Пробы молока нумеровали соответственно инвентарным номерам коров и хранили в холодильнике при + 4 С. Для электрофореза пробы были пригодны в течение 10 - 15 суток. Для постановки сычужной и тигловой пробы использовали не консервированное молоко. Его исследовали не позднее 3 дней после отбора проб и хранили также в холодильнике при + 4 С.
Для электрофоретического анализа использовали обезжиренное молоко. В пробирки наливали по 10 мл молока и центрифугировали их в течение 5 мин при 1000 об/мин. Затем шприцем отбирали обезжиренное молоко и переливали его во флаконы на 20 мл.
Получение казеинов и сыворотки осуществляли по Р.А. Хаертдинову (1989), для этого в пробирки наливали 5 мл обезжиренного молока и в них осаждали казеины путём добавления 0,25 мл ацетатного буферного раствора (25 мл уксусной кислоты, 35 г трехводного уксуснокислого натрия, 100 мл воды, pH 4,6).
Смесь перемешали и оставили в водяной бане при 38 - 40 С на 30 мин до полного осаждения казеинов, а затем центрифугировали 20 мин при 8000 об/мин.
Сыворотку сливали в другую посуду, а осажденные казеины, растворяли в буфере, состоящем из 86 мл уксусной и 25 мл муравьиной кислот, 4,5 М мочевины и 1 л воды, pH 3,0. Буфер доливали до прежнего объема молока. В таком же растворе готовили стандартный образец из казеинов по Гаммерстену в концентрации 2,5 г на 100 мл. Его перемешивали до полного растворения казеинов.
Для электрофореза казеинов использовали систему 7,5%-го полиакриламидного геля № 1 по Г. Мауреру (1971) с модификацией Р.А.
Хаертдинова (1989) применительно к белкам молока.
После электрофореза окрашенные амидо-черным 10В полосы казеинов идентифицировали по Р.А. Хаертдинову (1989). Электрофорез белков молочной сыворотки проводили в той же системе геля № 1, что и казеинов, но без мочевины и 2-меркаптоэтанола. Идентификацию белков сыворотки молока проводили согласно сообщению E.H. Reimerdes, H.A. Mehrens (1978).
Содержание белков в исследуемых образцах молока определяли методом денситометрирования полученных фореграмм на микрофотометре ИФО - 4(Хаертдинов Р.А., 1989). Количество белка во фракциях определяли путем сравнения со стандартными образцами (казеинами по Гаммерстену). По стандартным образцам вычисляли коэффициенты перевода условных единиц (мг бумаги под пиками соответствующих фракций). Для этого содержание белков в стандартном образце делили на массу бумаги под пиками всех фракций белка этого же образца. Далее массу бумаги под пиками соответствующей фракции белка в исследуемых образцах умножали на переводной коэффициент и получали содержание белка в г/100мл. Суммируя содержание белка во фракциях, находили общее количество казеинов, белков сыворотки и общего белка в исследуемой пробе молока.
Высокогорский молочный завод ОАО Вамин-Татарстан производит полутвердый сыр Костромской ИТ, при производстве которого используют бакпрепарат БП-Углич-5А. Препарат обладает направленным антагонистическим действием на бактерии группы кишечных палочек. После внесения бакпрепарата БП-Углич-5А в количестве 0,8 - 1,0% от объема молока вносили еще один вид закваски - мезофильные молочнокислые бактерии вида Lb. plantarum - 0,1-0,3%.
Оптимальная кислотность смеси перед свертыванием - 18-19 оТ, максимальная - не более 24 оТ. Температура свертывания молока для сыра Костромской ИТ составляет + 30-34оС. В качестве молокосвертывающего препарата использовали сычужный порошок в виде раствора в количестве 2,5% от объема молока. После внесения сычужного препарата молоко тщательно перемешивали и оставляли в покое до образования сгустка.
Продолжительность свертывания при выработке сыра Костромской ИТ составляет 355 мин. Разрезку сгустка и постановку зерна проводят в течение 205 мин. Основная часть зерен после постановки имела округлую форму и размер 81 мм. До 30% сыворотки сливали, зерно вымешивали.
Сыр Костромской ИТ относится к группе полутвердых сыров с низкой о температурой второго нагревания + 38-40 С. Продолжительность второго нагревания составляла 10 - 20 мин. Второе нагревание проводили медленно со о скоростью 1 С в минуту. Кислотность сыворотки после второго нагревания и о добавления воды должна составлять не более 13 Т. Кислотность сыворотки с момента втогоро нагревания до конца обработки должна нарасти от 1,0 до 1,5 оТ и составлять к концу обработки зерна не более 14 оТ. Прессовку пласта проводили в течении 205 мин. при давлении 1,0 - 1,5 кПа (0,01 - 0,015 кгс/см2), самопрессование - в течение 305 мин. Окончание этапа определяли по прекращению выделения сыворотки. Прессовку сыра Костромской ИТ проводили в течение 2,00,5 часа при постепенном повышении давлении 10 - кПа (0,1 - 0,5 кгс/см2). Продолжительность посолки сыра составляла 426 часа.
Время созревания сыра Костромской ИТ - 30 суток Для приготовления творога в заводских условиях ОАО Чистопольский молочный комбинат, брали от каждой опытной группы коров 10 кг молока.
Количество закваски на 10 кг молока составляло 0,5 кг. Температура нагревания - 58 - 600С.
Для приготовления молочно-сливочного йогурта брали 4 кг молока жирностью 3,2% и 1 кг сливок жирностью 20% в соотношении 4:1 (общий объем 5 кг). Полученную смесь жирностью 6,2% нагревали до 980С, добавляли сахар (1:20) - 250 г, выдерживали при 980С в течение 20 минут, охлаждали до 420С и добавляли закваску - 3,5% от объема смеси (180 мл). Молочно-сливочный иогурт приготавливали резервуарным способом, время выдержки при сквашивании длилось 4 часа при 420С. Кислотность составляла 850Т. Для приготовления закваски для йогурта к обрату добавляли маточный раствор закваски (сухая болгарская палочка + 2 кг молока).
Воспроизводительные качества первотёлок изучены по показателям, которые определяют и характеризуют плодовитость, это возраст первого отёла, коэффициент воспроизводительной способности (КВС), индекс плодовитости (И.
Дохи, 1961). Использовали следующие формулы:
КВС = 365 / МОП, где МОП - межотельный период, дн.
Индекс плодовитости = 100 - (К + 2 I), где К - возраст первого отёла, мес.; I - межотельный период, мес.
Генетические параметры продуктивности определены по общепризнанным формулам: коэффициенту изменчивости (Cv) и сопряжённости признаков (r).
Полученные результаты в ходе научных исследований обработаны биометрическим методом по Е.К. Меркурьевой (1970) с использованием ЭВМ и программного приложения Microsoft Excel. Уровень достоверности полученных результатов определяли по критерию Стьюдента.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Оптимизация техники выделения ДНК из лейкоцитов крупного рогатого скота для молекулярно-генетических исследований Разработанный нами аммиачный способ выделения ДНК из лейкоцитов крупного рогатого скота является экспрессивной техникой пробоподготовки нуклеиновых кислот для ДНК-анализа и полученные препараты ДНК целесообразно использовать в ближайшие 30 минут после выпаривания аммиака.
Нами оптимизирована техника выделения ДНК из лейкоцитов крупного рогатого скота для молекулярно-генетических исследований, где 10% раствор аммиака использовался в качестве растворителя осажденного нуклеопротеидного комплекса, предварительно экстрагированного 0,2M NaOH (см. л2. Материалы и методы исследований). Полученные препараты ДНК показали эффективность своего применения в ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина.
Комбинированный щелочной способ выделения ядерной ДНК из лейкоцитов крупного рогатого скота позволяет сохранить экстрагированные нуклеиновые кислоты для ДНК-диагностики по гену каппа-казеина в течение 6 месяцев с более чем 20 кратной заморозкой-разморозкой.
3.2. Оптимизация техники ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену каппа-казеина нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: AB1: 5/-TGTGCTGAGTAGGTATCCTAGTTATG3/ и АВ2: 5/-GCGTTGTCTTCTTTGATGTCTCCTTAG-3/, сконструированных Angel Barroso (1998); К1: 5/-GAAATCCCTACCATCAATACC-3/ и К2: 5/-CCATC TACGCTAGTTTAGATG-3/, сконструированных Kaminski S. (1993); JK5: 5/-ATCA TTTATGGCCATTCCACCAAAG-3/ и JK3: 5/-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACA GA-3/, сконструированных J.F. Medrano and E. Aguilar-Cordova (1990) по оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. л2. Материалы и методы исследований).
Праймеры AB1+AB2 инициируют амплификацию фрагмента гена-каппаказеина крупного рогатого скота длиной 453 bp, а ПДРФ-HinfI профиль (AA=326/100/27, BB=426/27 и AB=426/326/100/27) и ПДРФ-HindIII профиль (AA=453, BB=351/102 и AB=453/351/102) идентифицируют его генотипы (рис. 2).
Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами AB1+AB2 и последующего эндонуклеазного расщепления ферментом HinfI или HindIII Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим); 1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа BB гена каппа-казеина (453 bp); 2) генотип BB (426/27 bp (HinfI)); 3) генотип BB (351/102 bp (HindIII)); 4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (453 bp); 5) генотип АА (326/100/27 bp (HinfI)); 6) генотип АА (453 bp (HindIII)); 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа AB гена каппа-казеина (453 bp); 8) генотип AB (426/326/100/27 bp (HinfI)); 9) генотип AB (453/351/102 bp (HindIII)).
Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами AB1+AB2 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов. Слабый фон неспецифики по сравнению с сильным ПЦР-сигналом (453 bp) существенно не влияет на информативность интерпретации генотипов.
Праймеры K1+K2 инициируют амплификацию фрагмента гена-каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 271 bp, а ПДРФ-HinfI профиль (AA=131/91/49, BB=222/49 и AB=222/131/91/49) и ПДРФ-HindIII профиль (AA=271, BB=182/89 и AB=271/182/89) идентифицируют его генотипы (рис. 3).
Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами K1+K2 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов; а наличие димерности на одной длине с неинформативным фрагментом HinfI рестрикции (49 bp) не снижает эффективности генотипирования с данным протоколом реакции.
Рис. 3. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами K1+K2 и последующего эндонуклеазного расщепления ферментом HinfI или HindIII Обозначения: 1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа BB гена каппа-казеина (271 bp); 2) генотип BB (222/49 bp (HinfI); 3) генотип BB (182/89 bp (HindIII); 4) цельный ПЦРфрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (271 bp); 5) генотип АА (131/91/49 bp (HinfI));
6) генотип АА (271 bp (HindIII); 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа AB гена каппаказеина (271 bp); 8) генотип AB (222/131/91/49 bp (HinfI)); 9) генотип AB (271/182/89 bp (HindIII); М) ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим).
Праймеры JK5+JK3 инициируют амплификацию фрагмента гена-каппаказеина крупного рогатого скота длиной 350 bp, а ПДРФ-HinfI профиль идентифицирует его генотипы (AA=134/131/85, BB=265/85 и AB=265/134/131/84) (рис. 4).
Рис. 4. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5+JK3 и последующего эндонуклеазного расщепления ферментом HinfI Обозначения: 1-4) генотип BB (265/85 bp (HinfI); 5-6) генотип AA (134/131/85 bp (HinfI); 7-8) генотип AB (265/134/131/84 bp (HinfI); 9) цельный ПЦР-фрагмент генотипа AB гена каппа-казеина (350 bp); М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим).
Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5+JK3 являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов. Для базисной интерпретации генотипов следует ориентироваться на мажорные идентифицирующие ПДРФHinfI фрагменты: для генотипа BB = 265 bp, для AA = 134/131 bp, для AB = 265 и 134/131 bp, соответственно.
3.3. Разработка методики высокоточной ПЦР Целью данного раздела исследований являлась разработка эффективной методики высокоточной ПЦР для индикации и идентификации биологических объектов.
Нами разработан способ проведения ПЦР, схожий с разновидностями touch up ПЦР тем, что в качестве праймеров используют олигонуклеотиды, которые состоят из 3/-участка, комплементарного последовательности-мишени, и 5/участка, не комплементарного последовательности-мишени, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют олигонуклеотиды с потенциальной температурой гибридизации по всей длине, превышающей температуру отжига их 3/-комплементарного участка на 5-100С, а при проведении ПЦР отжиг ведут при температуре, соответствующей указанной потенциальной температуре гибридизации.
Стратегия выбранного подхода заключается в том, что, используя фиксированную температуру потенциального оптимума отжига праймеров по всей длине, связывание 3/-комплементарного участка олигонуклеотида с нуклеиновой кислотой исследуемого биологического объекта затруднительно в виду несоответствия температур гибридизации на 5-100С, однако неспецифичное праймирование находится в значительно более угнетенном состоянии, чем достигается более эффективная наработка только специфичных ампликонов, которые в дальнейшем являются мишенями для праймеров в системе 100% комплементарности.
Условия проведения реакции представлены в разделе л2. Материалы и методы исследований.
Разработанный способ проведения ПЦР протестирован в сравнении с классической ПЦР и ближайшим аналогом на предмет оценки аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота.
При проведении классической ПЦР для амплификации фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5+JK3 (J.F. Medrano, E.
Aguilar-Cordova, 1990) нами получен наряду со специфичным ПЦР продуктом размером 350 bp также неспецифичный фрагмент амплификации размером приблизительно 600-700 bp (рис. 5, трек 4).
При проведении ПЦР в режиме ближайшего аналога (F. Weighardt, G.
Biamonti, S. Riva, 1993) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота с модифицированными праймерами N-JK5+N-JK3 нами выявлены наряду со специфичным ПЦР продуктом размером 363 bp также слабые неспецифичные фрагменты амплификации размером приблизительно 600-700 bp (рис. 5, трек 3).
При проведении ПЦР в режиме разработанного способа для амплификации фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота с модифицированными праймерами N-JK5+N-JK3 и JK5-hs+JK3-hs амплифицировались только специфичные ПЦР продукты размером 363 bp (рис. 5, трек 2) и 359 bp (рис. 5, трек 1), соответственно.
Рис. 5. Электрофореграмма результата тестирования способов ПЦР на предмет индикации гена каппа-казеина кр.рог.ск.
Обозначения:
1) разработанный способ проведения ПЦР с праймерами JK5-hs и JK3-hs;
2) разработанный способ проведения ПЦР с праймерами N-JK5 и N-JK3;
3) способ проведения ПЦР с праймерами N-JK5 и N-JK3 в режиме ближайшего аналога;
4) классическая ПЦР с праймерами JK5 и JK3;
5) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим).
Следует отметить, что праймеры JK5 и JK3 (J.F. Medrano, E. Aguilar-Cordova, 1990) эффективно инициируют амплификацию фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 350 bp в оптимизированном нами режиме амплификации (1: 94 0С - 4 мин; 40: 94 0С - 10 сек, 63 0С - 10 сек, 72 0С - 10 сек;
1: 72 С - 5 мин), а ПДФР-HinfI профиль идентифицирует его генотипы (AA=134/131/85 bp, BB=265/85 bp и AB=265/134/131/84 bp).
Таким образом, исключение амплификации неспецифичных продуктов достигалось также, за счет уменьшения времени синтеза до 10 сек и повышения температуры отжига до 62-630С.
На основании положительного результата по исключению неспецифичной амплификации при использовании предлагаемого способа проведения ПЦР с модифицированными праймерами JK5-hs и JK3-hs (рис. 5, трек 1) нами были предприняты дальнейшие действия по оптимизации режима 2-х стадийной ПЦР с температурным совмещением стадий отжига и синтеза при 68/720С (рис. 6 и 7).
В режиме 2-х стадийной ПЦР модифицированные праймеры JK5-hs и JK3-hs эффективно инициируют амплификацию фрагмента гена каппа-казеина крупного рогатого скота длиной 359 bp, а ПДФР-HinfI профиль (AA=139/131/89 bp, BB=270/89 bp и AB=270/139/131/89 bp) и ПДФР-HindIII профиль (AA=359 bp, BB=222/137 bp и AB=359/222/137 bp) идентифицируют его генотипы (рис. 6 и 7).
Полученные результаты ПЦР-ПДРФ гена каппа-казеина крупного рогатого скота с праймерами JK5-hs +JK3-hs являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.
Рис. 6. ПЦР-ПДРФ-HinfI (HindIII) профиль гена каппа-казеина крупного рогатого скота, инициированный праймерами JK5-hs и JK3-hs при температуре 680С на стадии лотжиг-синтез Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим); 1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа BB гена каппа-казеина (359 bp); 2) генотип BB (270/89 bp (HinfI)); 3) генотип BB (222/137 bp (HindIII)); 4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (359 bp); 5) генотип АА (139/131/89 bp (HinfI)); 6) генотип АА (359 bp (HindIII)); 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа AB гена каппа-казеина (359 bp); 8) генотип AB (270/139/131/89 bp (HinfI)); 9) генотип AB (359/222/137 bp (HindIII)).
Рис. 7. ПЦР-ПДРФ-HinfI (HindIII) профиль гена каппа-казеина крупного рогатого скота, инициированный праймерами JK5-hs и JK3-hs при температуре 720С на стадии лотжиг-синтез Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим); 1) цельный ПЦР-фрагмент генотипа BB гена каппа-казеина (359 bp); 2) генотип BB (270/89 bp (HinfI)); 3) генотип BB (222/137 bp (HindIII)); 4) цельный ПЦР-фрагмент генотипа АА гена каппа-казеина (359 bp); 5) генотип АА (139/131/89 bp (HinfI)); 6) генотип АА (359 bp (HindIII)); 7) цельный ПЦР-фрагмент генотипа AB гена каппа-казеина (359 bp); 8) генотип AB (270/139/131/89 bp (HinfI)); 9) генотип AB (359/222/137 bp (HindIII)).
Таким образом, разработанный нами способ проведения ПЦР (лметодика высокоточной ПЦР) с оптимизированным протоколом 2-х стадийной ПЦР (температурное совмещение стадий отжига и синтеза при 68-720С) является действенным инструментарием генотипирования.
3.4. Разработка способа проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования кр.рог.ск. по аллелям А и В гена каппа-казеина Существуют различные способы ДНК-анализа аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота (J. F. Medrano, Е. Aguilar-Cordova, 1990; S. Kaminski, 1993; G. Rincon and J. F. Medrano, 2003), среди которых, является способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина.
В способе проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина, предложенном G.
Rincon and J. F. Medrano (2003) используется принцип тетра-праймерной ARMSPCR, где в реакции применяют 4 олигонуклеотида, два из которых являются внешними (общие праймеры JK5 и JK3), инициирующие при совместном фланкировании амплификацию фрагмента ДНК гена каппа-казеина любого из его аллелей, а остальные два - внутренними (аллель-специфичные праймеры INNERKCAS FORWARD и INNERKCAS REVERSE), каждый из которых при совместном фланкировании только с одним из внешних праймеров инициирует амплификацию соответствующего аллель-специфичного фрагмента ДНК. Следует отметить, что каждый внутренний праймер помимо рефрактерного 3/-терминального mismatch-нуклеотида имеет дополнительный некомплементарный ни к одному из аллелей гена каппа-казеина mismatchнуклеотид в позиции Ц2 от 3/-терминального нуклеотида (Ц 0 +) праймера.
Нами разработан способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина, схожий со способом, предложенным G. Rincon and J. F. Medrano, (2003), включающим подготовку пробы нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, 4-х праймеров; проведение ПЦР; детекцию амплифицированных фрагментов ДНК методом гель-электрофореза;
отличающийся тем, что, используются другие последова-тельности праймеров, все из которых являются аллель-специфичными, не имеющие дополнительных некомплементарных ни к одному из аллелей гена каппа-казеина крупного рогатого скота mismatch-нуклеотидов в позиции Ц2 от 3/-терминальных нуклеотидов праймеров, но имеющие 5/-некомплементарные участки (n) длиной 5-3 нуклеотидов: В-аллель-специфичные праймеры B-F-hs: 5/-cccccGTGAGCCTACA AGTACACCTACCAT-3/ и B-R-hs: 5/-cCcccGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACC-3/, которые инициируют амплификацию В-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 156 bp; А-аллель-специфичные праймеры A-F-hs: 5/-gggggCTGTTCACACACAAAAACAGTAAAG-3/ и A-R-hs:
5/-gggGGGTGCCTAACCTTATACAGCCTTTCG-3/, которые инициируют амплификацию А-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 242 bp; проводят 2-х стадийную ПЦР с совмещением температуры отжига и синтеза при 720С.
Предлагаемый способ проводили на термоциклере Терцик (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей 60 мM Трис-HCl (pH 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэтанол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ дНТФ; 0,5 ед. Taq ДНК полимеразы, 2 пары аллель-специфичных праймеров: 1-ая пара B-аллельспецифичных праймеров: 0,5 мкМ праймера B-F-hs, 0,5 мкМ праймера B-Rhs (ПЦР амплификация В-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппаказеина крупного рогатого скота размером 156 bp); 2-ая пара A-аллельспецифичных праймеров 0,5 мкМ праймера A-F-hs, 0,5 мкМ праймера A-R-hs (ПЦР амплификация A-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 242 bp); 1 мкл пробы ДНК, выделенную из лейкоцитов крови крупного рогатого скота в следующем оптимальном режиме амплификации: 1: 940С - 4 мин; 40: 940С - 1 мин, 720С - 1 мин; 1: 720С - мин (рис. 8).
Рис. 8. Электрофореграмма технического результата предложенного способа аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с праймерами B-F-hs+лB-R-hs+лA-F-hs+лA-R-hs Обозначения:
M) ДНК-маркеры 100-1000 bp (СибЭнзим); 1) генотип АА гена каппа-казеина кр.рог.ск (242 bp); 2) генотип ВВ гена каппа-казеина кр.рог.ск (156 bp); 3) генотип АВ гена каппаказеина кр.рог.ск. (242/156 bp) Разработанный нами способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с оптимизированным протоколом 2-х стадийной ПЦР, является более эффективным способом генотипирования гена каппа-казеина в сравнении с ПЦР-ПДРФанализом, в связи с тем, что не требует проведения обработки ПЦР-продукта эндонуклеазами рестрикции, таким образом, сокращая время анализа, более чем на 3-8 часов.
3.5. Оценка полиморфизма локуса гена каппа-казеина у животных 3.5.1. Полиморфизм гена каппа-казеина у коров Из 225 первотелок ООО Серп и молот Высокогорского района РТ 1коров имели генотип АА (ответственный за синтез белка А каппа-казеина), коровы - генотип АВ (данный генотип имеет неполное доминирование, при этом синтезируется каппа-казеиновый белок, характеризующийся промежуточными свойствами и сочетающий свойства вариантов А и В белков каппа-казеина), коров - генотип ВВ (ответственный за экспрессию белка В каппа-казеина).
Частота гомозиготного генотипа АА составляла 69,3%, гетерозиготного генотипа АВ - 28,0%, гомозиготного генотипа ВВ - 2,7%. Частота аллеля А достигла 0,83, аллеля В - 0,17 (табл. 3).
Тогда как из 219 первотелок СХПК им. Ленина Атнинского района РТ 1коров имели генотип АА, 99 коров - генотип АВ, 9 коров - генотип ВВ. Частота гомозиготного генотипа АА составила 50,7%, гетерозиготный генотип АВ - 45,2%, гомозиготный генотип ВВ - 4,1%. Частота аллеля А достигла 0,73, аллеля В - 0,27.
Из 164 первотелок ОАО Племзавод Бирюлинский Высокогорского района РТ 109 коров имели генотип АА, 52 коров - генотип АВ, 3 коров - генотип ВВ.
Частота гомозиготного генотипа АА составила 66,5%, гетерозиготный генотип АВ - 31,7%, гомозиготный генотип ВВ - 1,8%. Частота аллеля А достигла 0,82, аллеля В - 0,18.
Таблица 3. Полиморфизм гена каппа-казеина коров-первотелок Частота АА АВ ВВ Хозяйство n аллелей n % n % n % А В ООО Серп Н 156 69,3 63 28,0 6 2,225 0,83 0,17 0,и молот О 155 68,9 63 28,0 7 3,СХПК Н 111 50,7 99 45,2 9 4,219 0,73 0,27 5,34* им.Ленина О 117 53,4 86 39,3 16 7,ОАО П/з Н 109 66,5 52 31,7 3 1,Бирюлин- 164 0,82 0,18 1,О 111 67,8 48 29,1 5 3,ский Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов, * - P<0,Использование статистического метода Харди-Вайнберга и метода 2 для выявления отклонений эмпирического распределения частот генотипов от теоретического позволили установить, что в популяциях крупного рогатого скота ООО Серп и молот и ОАО Племзавод Бирюлинский нет статистически достоверного сдвига генетического равновесия ни по одному из трех генотипов локуса гена каппа-казеина, тогда как в СХПК им. Ленина идёт некоторое смещение в сторону генотипа АВ (2 = 5,34, P<0,05). Эти данные в популяциях коров татарстанского типа показывают, что в них не проводился искусственный отбор, затрагивающий генотипы животных по локусу гена каппа-казеина.
3.5.2. Полиморфизм гена каппа-казеина у быков-производителей В нашем исследовании использовались чистопородные и помесные по голштинской породе быки-производители, находящиеся в ГУП ГПП Элита. Все быки имели комплексный класс элита-рекорд.
В результате ДНК-диагностики по локусу гена каппа-казеина быковпроизводителей нами было исследовано 70 голов, из них 48 (68,6%) имели генотип АА; 18 (25,7%) - АВ и лишь 4 (5,7%) - ВВ. При этом частота аллеля А составила 0,81, а аллеля В - 0,19 (табл. 4).
Таблица 4. Полиморфизм гена каппа-казеина быков-производителей Частота АА АВ ВВ Хозяйство n аллелей n % n % n % А В ГУП ГПП Н 48 68,6 18 25,7 4 5,70 0,81 0,19 0,Элита О 46 65,7 21 30,0 3 4,Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов Статистический метод Харди-Вайнберга и метод 2 для выявления отклонений эмпирического распределения частот генотипов от теоретического показал, что в данной популяции быков-производителей не имеется статистически достоверного сдвига генетического равновесия ни по одному из трех генотипов локуса гена каппа-казеина. Следовательно, в данной популяции быков-производителей не проводился искусственный отбор, затрагивающий генотипы животных по локусу гена каппа-казеина.
3.6. Молочная продуктивность коров и факторы её обуславливающие 3.6.1. Молочная продуктивность коров с разными генотипами каппа-казеина Из таблицы 5, 6 и 7 видно, что разница между группами по продолжительности лактации незначительная и составила 2 - 7 дней. При этом первотёлки, имеющие в своём генотипе В аллель в большей части превосходили аналогов с генотипом АА. Тогда как в ОАО Племзавод Бирюлинский животные с генотипом АА превосходили сверстниц других групп на 6 - 7 дней, причем достоверная разница выявлена между коровами с генотипом АА и АВ и составила 7 дней (Р<0,05).
Таблица 5. Молочная продуктивность коров с разными генотипами каппа-казеина в ООО Серп и Молот Генотипы Показатели АА АВ ВВ В ААВВ n - 156 63 +6* +дойных дней 2861,7 2922,2 2907,+178 +3удой, кг 5068163,1 5246128,4 538496,+0,03 +0,жир, % 3,810,01 3,840,02 3,820,молочный +12,6* 193,11,19 201,41,93 205,75,66 +8,3*** жир, кг +0,30*** белок, % 3,190,02 3,280,03 3,490,01 +0,09* молочный +26,7*** 161,25,97 172,04,23 187,93,84 +10,белок, кг интенсивность +0,17* молокоотдачи, 1,860,01 1,940,02 2,030,08 +0,08*** кг/мин.
удой на 1 день +0,3 +0,9* 17,70,13 18,00,23 18,60,лактации, кг * - P0,05, *** - P<0,0Таблица 6. Молочная продуктивность коров с разными генотипами каппа-казеина в СХПК им. Ленина Генотипы Показатели АА АВ ВВ В ААВВ n - 111 99 -2 +дойных дней 2911,4 2891,6 2956,+387* удой, кг 5456145,3 5631163,2 5843134,3 +1+0,жир, % 3,910,02 3,900,02 3,920,04 -0,молочный +15,7* 213,32,41 219,62,10 229,06,48 +6,3* жир, кг +0,20*** белок, % 3,210,02 3,320,01 3,410,02 +0,11*** молочный +24,7*** 175,14,31 186,65,67 199,82,96 +11,белок, кг интенсивность +0,26** молокоотдачи, 1,990,02 2,180,02 2,250,09 +0,19*** кг/мин.
удой на 1 день +0,8** +1,1** 18,70,19 19,50,20 19,80,лактации, кг * - P0,05, *** - P<0,0 Таблица 7. Молочная продуктивность коров с разными генотипами каппа-казеина в ОАО Племзавод Бирюлинский Генотипы Показатели АА АВ ВВ В ААВВ n - 109 52 -7* -дойных дней 2881,7 2812,5 28210,+191 +1удой, кг 491771,0 5108101,8 5023197,+0,02 +0,жир, % 3,860,03 3,880,03 3,870,молочный +4,189,82,89 198,23,96 194,47,20 +8,жир, кг +0,23*** белок, % 3,220,01 3,340,02 3,450,04 +0,12*** молочный 15,158,32,32 170,63,56 173,38,73 +12,3** белок, кг интенсивность +0,молокоотдачи, 1,820,02 1,930,03 1,950,14 +0,11** кг/мин.
удой на 1 день +1,1** +0,7* 17,10,17 18,20,31 17,80,лактации, кг * - Р<0,05, ** - P<0,01, *** - P<0,0В среднем удой коров за лактацию в группе с генотипом каппа-казеина АА составил 4917-5456 кг, АВ - 5108-5631 кг, ВВ - 5023-5843 кг. Первотелки с генотипом каппа-казеина АА уступали сверстницам на 106-387 кг молока, причём достоверная разница выявлена между группами животными с генотипами АА и ВВ (387 кг, P<0,05) в СХПК им. Ленина.
По содержанию жира в молоке коровы с гомозиготным генотипом каппаказеина АА уступали сверстницам, имеющим в геноме аллельный вариант В в гетерозиготной или гомозиготной форме на 0,01 - 0,03%. Более высокое содержание жира в молоке в сочетании с более высоким удоем было у коров, имеющих аллель В каппа-казеина. При этом от них получено в среднем за лактацию на 6,3 - 15,7 кг (P<0,05 и 0,001) молочного жира больше, чем от коров с генотипом АА. В ОАО Племзавод Бирюлинский разница между группами животных была недостоверной и составила 4,6 - 8,4 кг молочного жира.
Полученные данные также показали, что первотелки, имеющие в своем геноме аллельный вариант В гена каппа-казеина, превосходили по содержанию белка в молоке животных с гомозиготным генотипом каппа-казеина АА на 0,09 - 0,30% (P<0,05 и 0,001). От коров с генотипом АА в ООО Серп и Молот и СХПК им. Ленина было получено за лактацию на 24,7 - 26,7 (P<0,001) кг молочного белка меньше, чем от коров с генотипом каппа-казеина ВВ, при этом наименьшая разница была в ОАО Племзавод Бирюлинский (15,0 кг). Животные с гетерозиготным генотипом АВ по содержанию белка и по выходу молочного белка за лактацию занимали промежуточное положение.
Достоверная разница (Р<0,05 - 0,001) получена между животными с генотипом каппа-казеина АА и первотёлками других генотипов по следующим показателям: удою на 1 день лактации и по интенсивности молокоотдачи почти во всех хозяйствах.
Из всего выше сказанного можно сделать вывод, что более высокая молочная продуктивность у коров-первотёлок татарстанского типа с генотипом каппаказеина АВ и ВВ. А более низкие показатели были получены от животных с генотипом АА, в целом первотёлки, имеющие в своем геноме аллельный вариант В гена каппа-казеина выгоднее отличались от сверстниц.
3.6.2. Лактационные кривые коров с разными генотипами каппа-казеина У коров татарстанского типа в ООО Серп и Молот и ОАО Племзавод Бирюлинский, имеющих генотип каппа-казеина АА и ВВ, пик наивысшей продуктивности (626 - 629 кг и 630 - 673 кг молока соответственно) приходится на 3-й месяц лактации. У коров с генотипом АВ наибольшая продуктивность отмечалась на 2-м месяце лактации и составила 620 - 659 кг молока. У животных СХПК им. Ленина наибольшие удои 662 - 704 кг были на 3-м месяце лактации.
Превышение среднемесячных удоев молока коров с генотипом ВВ над генотипом АА наблюдалось на протяжении почти всей лактации.
Коэффициент спадаемости лактационной кривой со II по V месяц лактации у коров этих групп составил соответственно 4,59 и 5,31% (ООО Серп и Молот), 4,33 и 6,32% (СХПК им. Ленина) и 5,04 и 7,60% (ОАО Племзавод Бирюлинский), в то время как у коров с генотипом АВ он был выше на 7,1 - 0,06% (табл. 8).
Таблица 8. Характеристика лактационных кривых коров с разными генотипами каппа-казеина Генотип n Коэффициент Коэффициент Хозяйство каппа- спадаемости лактаци- постоянства казеина онной кривой, % лактации АА 156 4,59 93,ООО Серп и АВ 63 11,69 91,Молот ВВ 6 5,31 92,АА 111 4,33 96,СХПК им.
АВ 99 6,38 95,Ленина ВВ 9 6,32 96,АА 109 5,04 92,ОАО П/з АВ 52 10,7 91,Бирюлинский ВВ 3 7,60 91,Для всех групп животных характерны высокие коэффициенты постоянства лактации (91,4 - 96,5%).
Таким образом, проведённые исследования показали, что анализируемые животные, имеющие разные генотипы каппа-казеина, относятся к I и 2 типу лактационной деятельности, характеризующиеся высокой устойчивой и плавно спадающей лактационной кривой.
3.7. Качество и технологические свойства молока коров с разными генотипами каппа-казеина 3.7.1. Состав молока и его физико-химические показатели у коров с разными генотипами каппа-казеина Молоко от коров с разными генотипами каппа-казеина было 100% пригодное для производства сыра, то есть по качеству I - сорта, с механической загрязненностью I - группы и бактериальной обсемененностью I - класса.
Молоко, производимое в перечисленных хозяйствах, по качеству и содержанию основных компонентов значительно превосходило требования ГОСТа 13264-70.
Анализ физико-химического состава молока сравниваемых групп животных позволил выявить определенные различия по некоторым показателям. Так из данных таблиц 9, 10 и 11 видно, что первотелки с генотипом АВ и ВВ имели более высокие показатели содержания сухого вещества в молоке (12,31 - 12,55% и 12,39 - 12,52%) и содержания СОМО (8,47 - 8,65% и 8,57 - 8,62%). При этом животные с генотипом АВ и ВВ превосходили коров с генотипом АА по содержанию сухих веществ в молоке и СОМО на 0,07 - 0,23% и 0,06 - 0,23% соответственно.
Наибольшим содержанием основных компонентов в молоке характеризовались коровы, имеющие в своем генотипе В аллель каппа-казеина, при этом у таких животных содержание компонентов в молоке составило: жира (3,82 - 3,92%), белка (3,28 - 3,49%) и лактозы (4,41 - 4,55%). Наименьшее значение этих показателей наблюдалось у первотелок с генотипом АА: жира (3,Ц 3,91%), белка (3,19 - 3,22%) и лактозы (4,34 - 4,46%). Группа животных с генотипом АА уступала аналогам других групп по жиру - на 0,01 - 0,03%, по белку - 0,09 - 0,30% (Р<0,05 и 0,001) и по лактозе - 0,01 - 0,12%.
Первотелки имеющие в своем геноме аллельный вариант В гена каппаказеина незначительно превосходили по показателям плотности молока коров с генотипом АА на 0,3 - 0,9 оА.
В молоке коров-первотелок с гомозиготным генотипом каппа-казеина АА наблюдался более высокий показатель титруемой кислотности (18,10 - 18,38 оТ).
Животные с генотипом АА превосходили по этому показателю сверстниц с генотипом АВ и ВВ на 0,04 - 0,14 оТ.
Таблица 9. Состав молока, его физико-химические показатели у коров с разными генотипами каппа-казеина в ООО Серп и Молот Генотипы Показатели АА АВ ВВ В ААВВ n 156 63 6 - сухое вещество, % 12,160,03 12,310,05 12,390,17 +0,15** +0,СОМО, % 8,340,03 8,470,04 8,570,15 +0,13** +0,содержание +0,3,810,01 3,840,02 3,820,03 +0,жира, % содержание +0,30*** 3,190,02 3,280,03 3,490,01 +0,09* белка, % содержание 4,340,01 4,410,02 4,460,08 +0,07** +0,лактозы, % плотность, оА 27,90,10 28,40,17 28,80,60 +0,5* +0,титруемая 18,380,05 18,310,10 18,240,31 -0,07 -0,кислотность, оТ * - P<0,05, ** - P0,01, *** - P<0,0Таблица 10. Состав молока, его физико-химические показатели у коров с разными генотипами каппа-казеина в СХПК им. Ленина Генотипы Показатели АА АВ ВВ В ААВВ n 111 99 9 - сухое вещество, % 12,450,04 12,550,04 12,520,12 +0,10 +0,СОМО, % 8,540,03 8,650,03 8,600,11 +0,11** +0,содержание +0,3,910,02 3,900,02 3,920,04 -0,жира, % содержание +0,20*** 3,210,02 3,320,01 3,410,02 +0,11*** белка, % содержание 4,440,01 4,500,02 4,470,06 +0,06** +0,лактозы, % плотность, оА 28,60,10 29,10,14 28,90,45 +0,5** +0,титруемая 18,100,07 18,060,09 18,020,21 -0,04 -0,кислотность, оТ ** - P0,01, *** - P<0,0 Таблица 11. Состав молока, его физико-химические показатели у коров с разными генотипами каппа-казеина в ОАО Племзавод Бирюлинский Генотипы Показатели АА АВ ВВ В ААВВ n 109 52 3 - сухое вещество, % 12,300,02 12,510,04 12,490,35 +0,21*** +0,СОМО, % 8,440,03 8,630,04 8,620,41 +0,19*** +0,содержание +0,3,860,03 3,880,03 3,870,07 +0,жира, % содержание +0,23*** 3,220,01 3,340,02 3,450,04 +0,12*** белка, % содержание 4,460,02 4,550,03 4,470,13 +0,09* +0,лактозы, % плотность, оА 28,10,06 28,70,19 29,00,58 +0,6** +0,титруемая 18,170,04 18,090,12 18,110,47 -0,08 -0,кислотность, оТ * - P<0,05, ** - P<0,01, *** - P<0,0Таким образом, общий анализ качества и состава товарного молока от коровпервотёлок с разными генотипами каппа-казеина показал, что молоко из представленных хозяйств высокого качества с содержанием основных компонентов, значительно превышающим требования ГОСТа 13264-70. При этом молоко наилучшего качества у животных несущим в своём геноме аллельный вариант В гена каппа-казеина.
3.7.2. Белковый состав молока коров с разными генотипами каппа-казеина У коров татарстанского типа в молоке определяли абсолютное и относительное содержание 15 белковых фракций: s'-, s0-, s1-, s2-, -, -, -, s- казеинов (Cn), F-фракции сыворотки, - лактоглобулина (Lg), - лактоальбумина (La), альбумина сыворотки крови (Al), протеозо-пептонной фракции (Pp), иммуноглобулина (Ig), и минорных фракций сыворотки.
Коровы имеющие в своем геноме аллельный вариант В гена каппа-казеина превосходили по содержанию белка в молоке животных с гомозиготным генотипом каппа-казеина АА на 0,089 - 0,301 г/100 мл (P<0,01 - 0,001).
Аналогичную тенденцию наблюдали по содержанию казеинов: повышенное содержание выявлено в молоке коров с генотипом ВВ (2,681 - 2,787 г/100 мл), пониженное (2,510 - 2,525 г/100 мл) - у коров с генотипом АА, а животные с генотипом АВ имели промежуточное значение (2,611 - 2,653 г/100 мл). Животные с генотипом АА уступали животным с другими генотипами на 0,092 - 0,277 г/1мл (Р0,001). Однако следует отметить, что коровы с генотипом АВ и ВВ имели наибольшее относительное содержание казеинов (78,60 - 79,90%).
s'- Казеин относится к минорным фракциям молочного белка и не оказывает сильного влияния на выход белковомолочных продуктов. Содержание этой фракции в молоке коров составило 0,028 - 0,128 г/100 мл, т.е. 0,80 - 3,99% от общего белка. Изменение этой фракции оказалось противоположно тому, что наблюдалось по общему белку и казеину, при этом животные с генотипом АА превосходили по данному показателю аналогов других групп на 0,018 - 0,0г/100 мл (P<0,01 - 0,001).
s0- Казеин относится к фракциям белков молока, имеющих средний уровень.
Более высокое содержание s0- казеина выявлено у помесей с генотипом АВ и ВВ (соответственно 0,197 - 0,245% и 0,227 - 0,253 г/100 мл), а животные с генотипом АА имели пониженное содержание этой фракции (0,182 - 0,202 г/100 мл;
P<0,001). Относительное содержание s0- казеина в молоке исследованных животных составило 5,68 - 7,33% от общего белка.
s1- Казеин - является главной белковой фракцией в молоке коров.
Наибольшую долю (25,33 - 26,13%) от общего белка и его количество (0,847 - 0,909 г/100 мл) было у коров, имеющих в своём генотипе В аллель. При этом у помесей с генотипом АА имелось более низкое содержание s1- казеина, как в абсолютных, так и в относительных величинах 0,811 - 0,832 г/100мл и 25,20 - 25,94% соответственно.
s2- Казеин по уровню белка уступает лишь s1- и - фракциям. Содержание s2- казеина в молоке исследованных коров составило 0,294 - 0,369 г/100 мл (8,Ц 10,69%). Следует отметить лишь несколько пониженное содержание s2- казеина в молоке помесных коров с генотипом АА (соответственно 0,294 - 0,3г/100 мл).
- Казеин по уровню белка занимает второе место после s1- фракции. В образцах молока доля - казеина составила 19,61 - 21,72% общего белка, а его абсолютное содержание 0,631 - 0,758 г/100 мл. Между исследованными группами животных с генотипом АА и АВ наблюдались слабые различия по этому белку.
Повышенным содержанием этой фракции (0,685 - 758 г/100 мл, P<0,01 - 0,001) в молоке отличались коровы с генотипом ВВ.
- Казеин - имеет большое значение при производстве белково-молочных продуктов, так как имеет технологическую ценность. Его содержание в молоке исследованных коров было 0,234 - 0,283 г/100 мл (7,30 - 8,25% от общего белка).
Повышенное содержание - казеина (0,264 - 0,283 г/100 мл) было характерно для молока коров с генотипом ВВ и пониженное содержание этой фракции (0,234 - 0,252 г/100 мл) для коров с генотипом АА, разница между этими группами составила 0,026 - 0,043 г/100 мл (P<0,001).
и S - Казеины относятся к минорным фракциям молочного белка и не оказывают сильного влияния на выход белково-молочных продуктов. Содержание этих фракций казеина оказалось на уровне 5,33 - 6,47% от общего белка.
Межгрупповые различия животных с генотипом АА и ВВ по -казеину составили 0,002 - 0,013 г/100 мл и по s-казеину 0,002 - 0,011. Влияние генотипа каппаказеина на содержание - и s-казеинов в молоке помесных коров было слабым.
В молоке исследованных коров сывороточные белки составили 0,660 - 0,7г/100 мл, т.е. 20,10 - 21,54% от общего белка. Наибольшее количество этих белков (0,694 - 0,727 г/100 мл) выявлено в молоке коров с генотипом ВВ, но при этом с низким их относительным содержанием (20,10 - 21,33%). Животные с генотипом ВВ по данному показателю превосходили аналогов с генотипом АА на 0,001 - 0,039 г/100 мл и в тоже время уступали по относительному содержанию на 0,12 - 1,44%. Таким образом, снижение общего белка в молоке у помесных коров связано с уменьшением количества казеинов, при этом напротив происходит увеличение доли сывороточных белков.
Содержание F - фракции в молоке коров очень незначительное и составило 0,66 - 1,47%, а его количество 0,023 - 0,050 г/100 мл. Животные с генотипом ВВ уступали аналогам с генотипом АА на 0,008 г/100 мл (P<0,001) в ООО Серп и Молот, тогда как в других хозяйствах они наоборот превосходили на 0,005 - 0,018 г/100 мл (Р<0,05 и 0,001).
- Лактоглобулин - представляет собой очень ценный компонент молока, необходимый, прежде всего для роста молодняка, поэтому и является главным белком молочной сыворотки. Помесные животные с генотипом АА и ВВ обладали повышенным содержанием - лактоглобулина (соответственно 0,329 и 0,329 - 0,352 г/100 мл, что в относительном содержании составило 10,26% и 9,Ц 10,09% от общего белка). Разница между этими группами составила 0,012 - 0,027 г/100 мл. Коровы с гетерозиготным генотипом (АВ) имели более низкий или промежуточный показатель этой фракции белка.
Схожая картина наблюдалась и по содержанию - лактоальбумина, так наибольшее количество этого белка было у коров с генотипом АА 0,112 - 0,1г/100 мл (3,48 - 3,65%) и ВВ 0,112 - 0,113 г/100 мл (3,24%). Разница между группой коров с генотипом АА и ВВ составила 0,008 - 0,015 г/100 мл (P<0,01 - 0,001), тогда как в ОАО Племзавод Бирюлинский разница по этому показателю отсутствовала.
Выявлено превосходство по содержанию альбумина крови коров с генотипом АА над аналогами с генотипом ВВ в ООО Серп и Молот и ОАО Племзавод Бирюлинский. Так, содержание этого белка у животных с генотипом ВВ 0,048 - 0,052г/100 мл, а с генотипом АА 0,056 - 0,054 г/100 мл, разница при этом составила 0,004 - 0,006 г/100 мл (P<0,01 - 0,001). В СХПК им. Ленина наоборот животные с генотипом ВВ (0,069 г/100 мл) превосходили по этому показателю сверстниц с генотипом АА (0,055 г/100 мл) на 0,014 г/100 мл (P<0,001).
Содержание протеозо-пептонов и других белков сыворотки в молоке коров исследуемых групп составило соответственно 0,039 - 0,051 и 0,039 - 0,056 г/1мл (1,22 - 1,68% и 1,13 - 2,18% от общего белка). Межгрупповые различия по этим фракциям были выражены слабо, т.е. коровы с разными генотипами каппаказеина имели примерно одинаковый уровень белка в этих фракциях.
В молоке коров с разными генотипами каппа-казеина уровень иммуноглобулина был в пределах 0,070 - 0,087 г/100 мл (1,43 - 2,99%). Следует отметить, что животные с генотипом ВВ по абсолютному содержанию этого белка превосходили аналогов с генотипом АА на 0,002 - 0,017 г/100 мл.
Таким образом, коровы, обладающие генотипом АВ и ВВ по гену каппаказеина имели более высокие показатели белковости молока и содержания казеина, чем животные с генотипом АА.
3.7.3. Сыропригодность молока коров с разными генотипами каппа-казеина Во всех группах коров выявлена отрицательная зависимость технологических свойств молока от генотипа АА каппа-казеина. От молока 46,8 - 48,6% коров с таким генотипом получен казеиновый сгусток рыхлого и дряблого состояния (табл. 12).
Таблица 12. Технологические свойства молока в зависимости от их генотипа по каппа-казеину Состояние казеи- В том числе с генотипом по Распреденового сгустка и каппа-казеину ление коров продолжитель- АА АВ ВВ ность свертывания n % n % n % n % молока ООО Серп и Молот плотное 141 62,7 82 52,6 53 84,1 6 1n=225 рыхлое 73 32,4 66 42,3 7 11,1 - дряблое 11 4,9 8 5,1 3 4,8 - 28,5 30,6 24,6*** 18,2*** время, мин 0,84 0,99 1,32 3,СХПК им. Ленина плотное 147 67,1 57 51,4 81 81,8 9 1n=219 рыхлое 56 25,6 43 38,7 13 13,1 - дряблое 16 7,3 11 9,9 5 5,1 - 27,2 31,3 23,6*** 16,9*** время, мин 0,34 0,46 0,93 3,ОАО Племзавод Бирюлинский плотное 104 63,4 58 53,2 43 82,7 3 1n=164 рыхлое 50 30,5 44 40,4 6 11,5 - дряблое 10 6,1 7 6,4 3 5,8 - 27,8 30,4 23,1*** 17,3*** время, мин 0,59 0,68 0,76 2,Разность между ВВ, АВ и АА: ***- P<0,0Присутствие В аллеля каппаЦказеина в генотипе животных значительно улучшило состояние казеинового сгустка. Доля молока с плотным состоянием сгустка у гомозиготных коров ВВ составила 100%, гетерозиготых (АВ) - 81,8-84,1%.
Показатели В сыроделии наиболее желательным считается молоко, у которого время свёртывания под действием сычужного фермента длится не более 15 - 40 мин.
Если свёртывание длится более 40 минут, это приводит к большой потере сырья и низкому выходу сыра, так как нарушаются технологические процессы его производства. Лучшими показателями по продолжительности свёртывания характеризовались коровы с генотипом каппа-казеина ВВ, у них свёртывание молока происходило за наименьшее время - 16,9 - 18,2 минут. У животных с генотипом АА эти показатели оказались несколько хуже и составили 30,4 - 31,минут (Р<0,001).
Таким образом, среди исследованных коров татарстанского типа наилучшими сыродельческими свойствами молока обладали животные с генотипом АВ и ВВ каппа-казеина, у них наибольший выход желательного плотного сычужного сгустка и наименьшая продолжительность свёртывания молока. Они по этим показателям значительно превосходят коров с генотипом АА.
3.7.4. Термоустойчивость молока коров с разными генотипами каппа-казеина Исследованиями установлено, что молоко коров татарстанского типа с генотипом ВВ каппа-казеина характеризовалось пониженной термостабильностью - 33,1 - 35,2 мин., с генотипом АА - повышенной - 60,1 - 65,8 мин., а с генотипом АВ она составляла 57,5 - 62,9 мин. (табл. 13).
Таблица 13. Термостабильность молока коров с разными генотипами каппа-казеина Термостабильность молока, мин.
Хозяйство Генотип каппа-казеина АА АВ ВВ n 156 63 ООО Серп и 65,80,72 62,91,27* 33,12,22*** Молот n 111 99 СХПК им. Ленина 63,71,10 60,31,25* 35,22,14*** n 109 52 ОАО Племзавод 60,11,82 57,52,86 34,83,35*** Бирюлинский Разность между ВВ, АВ и АА: *- P<0,05, ***- P<0,0Сравнение изменений белковости и термоустойчивости молока у коров с разными генотипами каппа-казеина показывает наличие определенной связи между этими признаками. Нами установлено (табл. 5, 6 и 7), что животные с генотипом ВВ имели более высокую белковость молока (3,408 - 3,490 г/100 мл), а с генотипом АА - более низкую (3,189 - 3,207 г/100 мл). При этом коровы, несущие в своем геноме аллельный вариант В гена каппа-казеина превосходили по содержанию белка в молоке животных с гомозиготным генотипом каппа казеина АА на 0,089 - 0,301 г/100 мл (P<0,01 - 0,001). Термоустойчивость молока у коров с разными генотипами каппа-казеина находилась в обратной зависимости - соответственно 33,1 - 35,2 мин. и 60,1 - 65,8 мин. Следовательно, снижение содержания белка в молоке приводит к повышению его термоустойчивости.
Таким образом, коровы, имеющие в своём геноме аллельный вариант А гена каппа-казеина превосходили аналогов с гомозиготным генотипом каппа-казеина ВВ по термостабильности молока и по доле (%) животных с данными характеристиками молока. По-видимому, это связано с качественным и количественным содержанием белка в молоке животных с разными генотипами каппа-казеина.
3.8. Качество и технологические свойства молочных продуктов, изготовленных из молока коров с разными генотипами каппа-казеина 3.8.1. Качество и технологические свойства сыра, изготовленного из молока коров с разными генотипами каппа-казеина Товарное молоко от коров татарстанского типа по содержанию общего белка и его технологически ценных фракций превышало требования, предъявляемых к молочной продукции для выработки сыров. В молоке содержалось повышенное содержание общего белка 3,189 - 3,490 г/100 мл, казеина 2,510 - 2,787 г/100 мл.
По требованиям ГОСТа 13264-70 эти показатели значительно ниже и составляли 3,0 и 2,5 г/100 мл.
Из молока каждой подопытной группы коров с разными генотипами каппаказеина был изготовлен сыр Костромской ИТ, согласно существующей технологии в ОАО Вамин-Татарстан Высокогорский молочный завод Республики Татарстан, в соответствии с требованиями ТУ-9225-041-046102092002.
Из таблицы 14 видно, что масса сыра после прессования, полученного из кг молока коров-первотелок с генотипом ВВ и АВ, составляла 4,021 кг и 3,947 кг, что было выше по сравнению с генотипом АА на 0,182 - 0,256 кг (0,6 - 0,8%).
Соответственно количество сыра после созревания также было выше у коров с генотипом ВВ и АВ (3,482 и 3,397 кг). Превосходство по массе готового сыра из молока животных с генотипом ВВ и АВ составляло по сравнению с генотипом АА - 0,069 - 0,154 кг (0,2 - 0,5%).
На получение 1 кг сыра из молока коров с генотипом ВВ потребовалось меньшее количество молока - 8,6 кг, в то время как для изготовления такого же количества сыра от животных, имеющих генотипы АВ и АА, было израсходовано соответственно 8,8 - 9,0 кг молока.
Таблица 14. Показатели качества сыра из молока коров с разными генотипами каппа-казеина Генотип каппа-казеина Показатели АА АВ ВВ n 376 214 количество молока, кг 30 30 масса сыра после прессования, кг 3,765 3,947 4,0выход сыра после прессования, % 12,6 13,2 13,масса сыра после созревания, кг 3,328 3,397 3,4выход сыра после созревания, % 11,1 11,3 11,расход молока на приготовление 9,0 8,8 8,1 кг сыра, кг состав сыра:
массовая доля влаги, % 43,9 43,5 42,содержание сухого вещества (СВ), % 56,1 56,5 57,массовая доля жира в СВ, % 44,9 44,2 43,массовая доля белка в СВ, % 52,6 53,3 53,Содержание сухого вещества в сыре, приготовленном из молока коров с генотипом ВВ, составляло 57,6%, что выше по сравнению с генотипами АВ и АА соответственно на 1,1 - 1,5%. Более высокое содержание белка в сухом веществе было отмечено в сыре у коров с генотипом АВ и ВВ (53,3% и 53,8%). Тогда как более высокое содержание жира в сухом веществе имелось в сыре, полученного из молока коров с генотипом АА (44,9%).
Нами также изучены органолептические свойства (внешний вид, вкус и запах, консистенция, цвет теста, рисунок) зрелого сыра, полученного из молока коров-первотелок с разными аллельными вариантами гена каппа-казеина.
Поверхность сыра, полученного из молока коров с генотипами каппа-казеина ВВ и АВ была ровная, тонкая, без повреждений и трещин. Корка сыра, полученного из молока коров с генотипом АА, была тонкая, неравномерная, также без видимых повреждений и трещин.
Более выраженным сырным вкусом и запахом обладал сыр, полученный из молока коров с генотипом ВВ. Сыр, изготовленный, из молока коров с генотипом АА отличался несколько слабовыраженным сырным вкусом и запахом.
Наиболее оптимальной консистенцией и рисунком, присущими для данных видов сыров, обладал сыр, приготовленный из молока коров с генотипом ВВ.
Тесто сыра отличалось нежностью, пластичностью, слегка плотное, однородное по всей массе. На разрезе сыр имел рисунок, состоящий из глазков круглой, слегка приплюснутой и неправильной формы, равномерно расположенных по всей массе.
Сыр, приготовленный из молока коров с АА генотипом, имел пластичное и однородное тесто, но несколько ломкое на изгибе. На разрезе сыра рисунок был неравномерный, состоял из часто расположенных глазков неправильной и угловатой формы разного диаметра.
Цвет теста сыра, изготовленного из молока всех групп животных с разными генотипами каппа-казеина был слабо-желтый, однородный по всей массе сыра.
Таким образом, молоко коров, несущих в своем геноме аллель В гена каппаказеина, является более пригодным к изготовлению полутвердого сыра Костромской ИТ, из такого молока можно приготовить больше на 0,2 - 0,5% сыра лучшего качества. Сыр из молока коров с генотипом каппа-казеина АВ и ВВ обладает более лучшими органолептическими свойствами и более благоприятной композицией.
3.8.2. Качество и технологические свойства творога, изготовленного из молока коров с разными генотипами каппа-казеина Количество творога, полученного из молока коров с генотипом ВВ и АВ превышало количество творога, полученного из молока сверстниц с генотипом АА на 0,052 - 0,162 кг (5,8 - 17,6%). При этом наибольшее количество сыворотки отделилось при производстве творога из молока животных с генотипом АА (9,0 - 9,4 кг), данная группа превосходила аналогов других групп на 0,2 - 0,7 кг (2,2 - 7,7%) сыворотки (табл. 15, 16, 17).
Зерно, полученное из молока коров с генотипом АА было очень мелким, мягким, местами хлопьевидным. Наличие хлопьев отмечалось в твороге, полученном из молока коров с генотипом АВ. Лишь из молока коров с генотипом ВВ было получено нормальное, упругое, крупное зерно и высококачественный творог. Изучение качества полученного зерна при створаживании молока показало значительные преимущества продукта, полученного из молока коров с желательным генотипом ВВ.
В связи с тем, что творог готовили из ненормализованного молока с различным содержанием жира и белка, мы также провели оценку процесса приготовления творога из молока коров с разными генотипами на основе показателей использования молочного жира и белка исходного продукта.
Таблица 15. Приготовление и оценка качества творога из молока коров с разными генотипами каппа-казеина в ООО Серп и Молот Генотип каппа-казеина Показатели АА АВ ВВ n 156 63 количество молока, кг 10 10 содержание жира, % 3,81 3,84 3,содержание белка, % 3,19 3,28 3,количество творога, кг 0,743 0,805 0,8количество сыворотки, кг 9,4 8,9 8,жирность сыворотки, % 2,29 2,31 2,белок сыворотки, % 1,24 0,79 0, Таблица 16. Приготовление и оценка качества творога из молока коров с разными генотипами каппа-казеина в СХПК им. Ленина Генотип каппа-казеина Показатели АА АВ ВВ n 111 99 количество молока, кг 10 10 содержание жира, % 3,91 3,90 3,содержание белка, % 3,21 3,32 3,количество творога, кг 0,771 0,823 0,9количество сыворотки, кг 9,0 8,8 8,жирность сыворотки, % 2,37 2,41 2,белок сыворотки, % 1,06 0,82 0,Таблица 17. Приготовление и оценка качества творога из молока коров с разными генотипами каппа-казеина в ОАО Племзавод Бирюлинский Генотип каппа-казеина Показатели АА АВ ВВ n 109 52 количество молока, кг 10 10 содержание жира, % 3,86 3,88 3,содержание белка, % 3,22 3,34 3,количество творога, кг 0,759 0,846 0,9количество сыворотки, кг 9,1 8,7 8,жирность сыворотки, % 2,33 2,39 2,белок сыворотки, % 1,03 0,85 0,Исследования показали, что при приготовлении творога степень использования жира и белка выше из молока коров, имеющих в своем геноме аллельный вариант В гена каппа-казеина. Так степень использования жира из молока коров с генотипом АВ и ВВ была выше на 0,2 - 3,0%, чем из молока коров с генотипом АА. Степень использования белка из молока коров с генотипом АВ и ВВ была выше на 7,0 - 15,1%, чем из молока коров с генотипом АА.
Таким образом, анализ процесса приготовления творога из молока коров с разными генотипами показал преимущества использования молока коров, содержащих в своем геноме аллель В гена каппа-казеина.
3.8.3. Качество и технологические свойства йогурта, изготовленного из молока коров с разными генотипами каппа-казеина Исследования йогурта позволили выявить различие качества продукта, полученного из молока коров с генотипами каппа-казеина АА, АВ и ВВ.
В йогурте, полученном из молока коров с генотипом каппа-казеина АА, отмечалось отслаивание большого количества сыворотки. Отслаивание или малое количество сыворотки наблюдалось в продукте, полученном из молока коров с генотипом каппа-казеина АВ. В йогурте, полученном из молока коров с генотипом каппа-казеина ВВ, сгусток был однородный и густой, отслаивание сыворотки не наблюдалось.
Таким образом, наиболее высокую оценку по густоте и вкусу имел молочносливочный йогурт, приготовленный из молока коров с генотипом каппа-казеина АВ и ВВ.
3.9. Воспроизводительная способность коров с разными генотипами каппа-казеина Результаты исследований показывают, что гомозиготные первотелки с генотипом ВВ имеют больший возраст при первом отеле, чем первотелки с генотипами АА и АВ на 1,0 - 1,8 и 0,5 - 1,2 месяца, соответственно. Животные с генотипами АА и АВ имели почти одинаковый возраст первого отела. Различия между возрастом первого отела у животных в СХПК им. Ленина с генотипами АА и АВ, ВВ по локусу гена каппа-казеина составили 0,6 - 1,8 месяцев (P<0,05 и 0,001).
Коровы с разными генотипами каппа-казеина имели незначительные различия по продолжительности сервис-периода (96 - 114 дней). Наиболее коротким он был у гомозиготных животных с генотипом АА (96 - 112 дней).
Сервис-период имеет тесную связь с интервалом между отелами, который является одним из важных факторов, определяющих экономическую эффективность использования молочного стада. Межотельный период включает в себя два признака плодовитости - длительность сервис-периода и продолжительность стельности. В идеале он должен быть равен одному календарному году. Так как продолжительность стельности - стабильный признак, имеющий низкую изменчивость (2 - 4%), то изменчивость межотельного периода в основном обусловлена вариацией сервис периода.
Как и по продолжительности сервис-периода, так и по продолжительности межотельного периода животные всех исследованных групп имели примерно одинаковые показатели (381 - 398 дней).
Таблица 18. Воспроизводительная способность коров с разными генотипами каппа-казеина в ООО Серп и Молот Признаки плодовитости Генотип Возраст 1-го Сервис- МОП, дн. КВС Индекс отела, мес. период, дн. Дохи АА 27,20,14 1093,32 3943,32 0,940,01 46,50,(n=156) AB 27,50,23 1104,57 3954,51 0,930,01 46,20,(n=63) BB 28,30,89 11221,83 39821,49 0,930,05 45,22,(n=6) АВ к АА +0,3 +1 +1 -0,01 -0,ВВ к АА +1,1 +3 +4 -0,01 -1, Таблица 19. Воспроизводительная способность коров с разными генотипами каппа-казеина в СХПК им. Ленина Признаки плодовитости Генотип Возраст 1-го Сервис- МОП, дн. КВС Индекс отела, мес. период, дн. Дохи АА 27,40,19 1124,72 3984,72 0,930,01 46,10,(n=111) AB 28,00,18 1146,17 3986,14 0,940,01 45,50,(n=99) BB 29,20,40 1119,29 3979,29 0,920,02 44,31,(n=9) АВ к АА +0,6* +2 0 +0,01 -0,ВВ к АА +1,8*** -1 -1 -0,01 -1,* - P<0,05, *** - P<0,0Таблица 20. Воспроизводительная способность коров с разными генотипами каппа-казеина в ОАО Племзавод Бирюлинский Признаки плодовитости Генотип Возраст 1-го Сервис- МОП, дн. КВС Индекс отела, мес. период, дн. Дохи АА 26,90,16 964,28 3814,28 0,970,01 47,70,(n=109) AB 27,40,29 1105,21 3965,20 0,930,01 46,20,(n=52) BB 27,91,28 10712,50 39412,81 0,930,03 45,92,(n=3) АВ к АА +0,05 +14* +15* -0,04** -1,5** ВВ к АА +1,0 +11 +13 -0,04 -1,* - P<0,05, *** - P0,Интегральным показателем плодовитости коров является коэффициент воспроизводительной способности, который определяется отношением количества дней календарного года к длительности межотельного периода. Оптимальным считается коэффициент воспроизводительной способности равный единице.
По нашим данным, коровы всех опытных групп, имели коэффициент воспроизводительной способности в пределах 0,92 - 0,97. В связи с тем, что полученные значения коэффициента воспроизводительной способности ниже 0,95, всех опытных животных следует отнести к проблемным в плане организации воспроизводства, за исключением коров с генотипом АА в ОАО Племзавод Бирюлинский, у которых этот показатель составил 0,97.
Для оценки воспроизводительной способности коров Дохи (1961) ввел формулу, которая объединяет возраст первого отела и продолжительность межотельного периода. Согласно индексу Дохи, плодовитость коров считается хорошей, если значение индекса более 48, средней - от 41 до 48, ниже 41 - плохой показатель плодовитости.
По результатам сравнительного изучения показателя Дохи, коровы всех групп имеют значение индекса от 44,3 до 47,7, что свидетельствует о среднем уровне плодовитости. Наименьшее значение индекса Дохи имели коровы с генотипом каппа-казеина ВВ (44,3 - 45,9). Наибольшее значение индекса Дохи было выявлено у коров с генотипом АА (46,1 - 47,7). Промежуточное значение индекса Дохи получено нами у животных с генотипом каппа-казеина АВ (45,5 - 46,2).
Таким образом, проведенные исследования воспроизводительной способности коров с разными генотипами каппа-казеина не выявили достоверных различий между опытными группами животных. Все животные имели среднее значение индекса Дохи.
3.10. Селекционно-генетические параметры продуктивности в группах коров с разными генотипами каппа-казеина 3.10.1. Изменчивость признаков молочной продуктивности Разница между группами животных с разными генотипами каппа-казеина по коэффициенту изменчивости продолжительности лактации незначительная и составляет 0,14 - 1,51%. В ООО Серп и Молот наибольший коэффициент был у коров с генотипом АА - 7,41%, а наименьший с генотипом АВ - 5,90%, тогда как в СХПК им. Ленина и ОАО Племзавод Бирюлинский наибольший коэффициент имелся у животных с генотипом АВ и ВВ (6,37 - 6,40%), а наименьший с генотипом АА (5,13 - 6,07%).
Степень вариабельности удоя была довольно низкой во всех группах.
Первотёлки c генотипом АА превосходили животных с другими генотипами на 0,49 - 8,25%. Причём наибольшая разница отмечена в ОАО Племзавод Бирюлинский между коровами с генотипом АА и ВВ (8,25%, Р<0,01).
Изменчивость содержания жира в молоке колебалась в пределах от 2,04% у помесных первотёлок с генотипом ВВ до 7,36% с генотипом АА. При этом животные с генотипом ВВ уступали аналогам, имеющие генотип АА на 0,85% и 2,06 - 4,23% (Р<0,01). Коэффициент вариабельности выхода молочного жира у коров с генотипом АА был выше, чем у сверстниц с генотипом АВ на 0,20 - 1,47% и 3,02% (Р<0,01) и ВВ на 0,97 - 4,05% и 9,50% (Р=0,001).
Характер изменчивости содержания белка у первотёлок с разными генотипами каппа-казеина находился на уровне от 1,17% до 3,61%. Животные ООО Серп и Молот и СХПК им. Ленина с генотипом АА превосходили по этому показателю сверстниц с генотипом ВВ на 0,77 - 1,05% (P<0,05 и P=0,01), тогда как в ОАО Племзавод Бирюлинский наименьший коэффициент изменчивости был у коров с генотипом АА - 1,82%, а наибольший с генотипом АВ - 3,61%. Коэффициент изменчивости молочного белка коров с генотипом АА превосходил животных с другими генотипами на 0,27 - 6,60%, но уступал аналогам в ОАО Племзавод Бирюлинский с генотипом АВ на 0,46%.
Более высокая разнородность по интенсивности молокоотдачи выявлена у животных с генотипом ВВ (10,02 - 12,45%). Они превосходили по данному показателю первотёлок с генотипом АА на 0,35 - 1,35%.
Коэффициент вариации по удою на один день лактации был в пределах от 2,35% до 12,50%. Наименьшая вариабельность по данному признаку была у первотёлок с генотипом ВВ (2,35 - 4,97%), при этом они уступали по этому признаку животным с генотипом АА на 4,53 - 8,29% (Р<0,01 - 0,001).
Таким образом, по всем признакам молочной продуктивности у помесных коров наибольшие коэффициенты изменчивости характерны для первотёлок, имеющие в своём геноме аллельный вариант А гена каппа-казеина.
3.10.2. Сопряженность признаков молочной продуктивности Корреляционная связь между удоем и содержанием жиром в молоке была в пределах от -0,36 до 0,05). Животные всех групп показали отрицательно направленную связь, за исключением первотёлок с генотипом АВ в СХПК им.
енина. У них корреляция была на уровне - r = 0,05.
Наибольшие коэффициенты корреляции между удоем и содержанием белка были у коров с генотипом ВВ (0,31 - 0,56), а наименьшие - с генотипом АА (0,Ц 0,11). Животные с генотипом АВ имели промежуточные значения (0,25 - 0,30).
Установлено, что коэффициенты корреляции между такими показателями, как удой-молочный жир, удой-молочный белок и жир-белок оказались положительными. Данные коэффициенты колебались в пределах от 0,57 до 0,99.
Причем связь этих показателей у всех групп животных была достоверной (Р<0,Ц 0,001), исключение составляет сопряженность между признаками молочной продуктивности у коров с генотипом ВВ в ОАО Племзавод Бирюлинский.
Таким образом, полученные данные показали, что величина и направленность корреляции между удоем-жиром и удоем-белком нестабильная, меняется в процессе селекции под влиянием отбора и факторов внешней среды.
Относительно хорошие показатели коэффициентов корреляции, то есть высокие и положительно направленные показали первотёлки, имеющие в своём геноме аллельный вариант В гена каппа-казеина.
3.11. Экономическая эффективность использования коров с разными генотипами каппа-казеина Эффективность производства продукции в основном определяется уровнем продуктивности молочных коров, то есть чем выше продуктивность, тем ниже затраты на единицу продукции и выше выручка и прибыль от реализации.
Экономическая эффективность разведения помесных животных разной селекции определялась согласно Методическим рекомендациям по определению экономической эффективности от внедрения результатов научноисследовательских работ в животноводстве (Ю.И. Шмаков, А.В. Черекаев, 1984) с учётом ГОСТа (2003 г.) молока по базисной общероссийской норме массовой доле жира (3,4%) и белка (3,0%).
От коров-первотёлок с генотипами каппа-казеина АА, АВ и ВВ получено молока базисной жирности и белковости в количестве 5992 - 6714 кг, 6478 - 71кг и 6575 - 7037 кг соответственно (табл. 21, 22 и 23).
В результате этого группы коров с генотипом АВ и ВВ по сравнению со сверстницами (генотип АА) выдали дополнительное количество молока в пределах 434 - 998 кг (6,5 - 16,5%).
Стоимость дополнительной продукции в расчёте на 1 голову по группам животных с генотипом АВ и ВВ составила 4860,52 - 5818,83 руб. и 6800,32 - 11658,29 руб. соответственно.
Таблица 21. Эффективность производства молока от первотелок с разными генотипами каппа-казеина в ООО Серп и Молот Генотипы Показатели АА (базовый АВ ВВ вариант) Молоко базисной жирности и 6039 6478 70белковости на 1 голову, кг Прибавка основной кг - 439 9продукции % - 7,3 16,Цена реализации 15,60 15,60 15,1 кг молока, руб.
Стоимость дополнительной продукции - 5157,91 11658,в расчёте на 1 голову, руб.
Таблица 22. Эффективность производства молока от первотелок с разными генотипами каппа-казеина в СХПК им. Ленина Генотипы Показатели АА (базовый АВ ВВ вариант) Молоко базисной жирности и 6714 7148 76белковости на 1 голову, кг Прибавка основной кг - 434 9продукции % - 6,5 14,Цена реализации 14,85 14,85 14,1 кг молока, руб.
Стоимость дополнительной продукции - 4860,52 10468,в расчёте на 1 голову, руб.
Таблица 23. Эффективность производства молока от первотелок с разными генотипами каппа-казеина в ОАО Племзавод Бирюлинский Генотипы Показатели АА (базовый АВ ВВ вариант) Молоко базисной жирности и 5992 6490 65белковости на 1 голову, кг Прибавка основной кг - 498 5продукции % - 8,3 9,Цена реализации 15,60 15,60 15,1 кг молока, руб.
Стоимость дополнительной продукции - 5818,83 6800,в расчёте на 1 голову, руб.
Расчёт экономической эффективности использования животных с разными генотипами каппа-казеина убедительно показал, что от первотёлок с генотипом АВ и ВВ получена прибыль (в расчете на 1 голову) на 4860,52 - 11658,29 руб.
больше, чем от сверстниц с генотипом АА.
ВЫВОДЫ 1. Аммиачный и комбинированный щелочной способ выделения нуклеиновых кислот, оптимизированные для экстракции ядерной ДНК из лейкоцитов крупного рогатого скота, являются эффективными инструментариями пробоподготовки.
2. Оптимизированный протокол ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина на основе праймеров AB1+AB2, К1+К2 и JK5+JK3 является эффективным средством ДНК-анализа.
3. Разработанная методика высокоточной ПЦР и способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с оптимизированной техникой 2-х стадийной ПЦР являются надежными способами эффективной наработки специфичных ампликонов 4. Методом ДНК-диагностики у коров татарстанского типа выявлено три генотипа по локусу гена каппа-казеина - АА, АВ и ВВ. Частота встречаемости наиболее распространенного гомозиготного генотипа АА составила 50,7 - 69,3%, частота генотипа АВ достигла 28 - 45,2%, генотипа ВВ - только 1,8 - 2,7%.
Частота встречаемости аллеля А составила 0,73 - 0,83%, аллеля В - 0,17 - 0,27%.
У чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей породы частота генотипа АА, АВ и ВВ каппа-казеина составила 68,6%; 25,7% и 5,8% соответственно. При этом частота аллеля А и В гена каппа-казеина составила 0,81 и 0,19.
5. Уровень удоя первотелок с генотипом ВВ и АВ за 305 дней лактации был выше, чем удой первотелок с генотипом АА на 106 - 387 кг. Содержание жира в молоке у первотелок с генотипом ВВ и АВ каппа-казеина было незначительно выше, чем у первотелок с генотипом АА на 0,01 - 0,03%. Выход молочного жира животных с генотипом ВВ и АВ составил 194,4 - 229,0 кг, что превышает выход молочного жира первотелок с генотипом АА на 4,6 - 15,7 кг. У первотелок имеющих в своем генотипе В аллель каппа-казеина содержание белка в молоке составило 3,28 - 3,49%, что выше, чем у первотелок с гомозиготным генотипом каппа-казеина АА на 0,09 - 0,30% (P<0,05 и 0,001). По выходу молочного белка животные с генотипом ВВ и АВ превосходили сверстниц с генотипом АА на 10,8 - 12,3 кг и 15,0 - 26,7 кг соответственно.
6. Проведенные исследования удоя по лактационным кривым и их характеристикам показали, что первотелки опытных групп с разными генотипами каппа-казеина характеризовались высокими коэффициентами постоянства лактации (91,4 - 96,5%) и низкими коэффициентами спадаемости лактационной кривой (4,33 - 11,69%). При этом наибольшие коэффициенты спадаемости лактационной кривой имели животные с генотипом АВ (6,38 - 11,69%).
7. Результаты оценки животных по качеству и технологическим свойствам молока показали, что наличие в геноме животных аллеля В гена каппа-казеина оказало положительное влияние на содержание в пробах молока сухих веществ на 0,07 - 0,23%, СОМО на 0,06 - 0,23% и лактозы на 0,01 - 0,12%.
Наибольшее содержание казеина и его фракций в молоке, оказывающих влияние на выход и качество белково-молочных продуктов имели коровы с генотипом АВ и ВВ каппа-казеина, они превосходили сверстниц с генотипом АА по содержанию казеина на 0,092 - 0,277 г/100 мл (Р0,001), s1- казеин на 0,030 - 0,086 г/100 мл, - казеин на 0,019 - 0,119 г/100 мл и - казеина на 0,022 - 0,0г/100 мл (P<0,05 и 0,001).
Результаты сычужной пробы показали, что молоко первотелок с генотипом АВ и ВВ по сравнению с молоком животных с генотипом АА имело наибольший выход желательного плотного сычужного сгустка (81,8 - 100%) и наименьшую продолжительность свёртывания (16,9 - 24,6 мин., P<0,001).
Уровень белка в молоке оказывает существенное влияние на термоустойчивость молока. При этом снижение содержания белков в молоке сопровождается повышением термоустойчивости, что подтверждается тем, что животные с генотипом ВВ каппа-казеина обладали более высокой белковостью молока (3,408-3,490 г/100 мл) и в тоже время более низкой термоустойчивостью молока (33,1 - 35,2 мин.). И наоборот, первотелки с генотипом АА имели более низкое содержание белка в молоке (3,189-3,207 г/100 мл) и более высокую термоустойчивость молока (60,1 - 65,8 мин., P<0,001).
8. Наибольшее количество сыра после созревания было получено из молока коров с генотипом АВ и ВВ (3,397 и 3,482 кг). Превосходство по массе сыра по сравнению с генотипом АА составило 0,069 - 0,154 кг (0,2 - 0,5%). На получение кг сыра из молок коров с генотипом АВ и ВВ было израсходовано меньше молока по сравнению с генотипом АА на 0,2 - 0,4 кг. По данным органолептической оценки консистенция, структура, запах, вкус и цвет сыра, полученного из молока коров с генотипом АВ и ВВ, были наилучшими.
Выход творога из молока коров с генотипом АВ и ВВ превышал количество творога, полученного от животных с генотипом АА. Из молока коров с генотипом АВ и ВВ было получено на 5,8 - 17,6% больше творога, чем из молока коров с генотипом АА. Степень использования жира и белка из молока коров, имеющих в своем геноме аллельный вариант В гена каппа-казеина, была выше. Из молока коров с генотипом ВВ было получено упругое, крупное зерно и творог наилучшего качества.
При изготовлении йогурта из молока животных, имеющих в своем геноме аллельный вариант В гена каппа-казеина отмечался плотный сгусток.
Отслаивание сыворотки не наблюдалось, и был получен густой однородный продукт наилучшего качества.
9. Изучение воспроизводительных качеств коров татарстанского типа с разными генотипами каппа-казеина по продолжительности сервис-периода и межотельного периода не выявили достоверных различий между опытными группами животных. При этом все коровы имели средние значения индекса плодовитости, что говорит о том, что генотип животных не оказал большого влияния на воспроизводительную способность стада.
10. Более высокие коэффициенты вариабельности по признакам молочной продуктивности отмечены у первотелок, несущие в своем геноме аллельный вариант А гена каппа-казеина. У этих животных коэффициенты изменчивости составили: по удою (7,12 - 15,07%), содержанию жира и белка (2,89 - 7,36% и 1,94 - 3,61%), выходу молочного жира и белка (7,52 - 15,92% и 7,81 - 15,31%) и удою на 1 день лактации (9,27 - 12,50%).
В группах коров с разными генотипами каппа-казеина установлена отрицательная по направлению связь между удоем-жиром, тогда как между удоем-белком наоборот - положительная. Наибольшие коэффициенты корреляции между удоем-белком имели животные с генотипом ВВ (0,31 - 0,56) и АВ (0,09 - 0,11).
11. Использование коров татарстанского типа, имеющих в своем геноме аллельный вариант В гена каппа-казеина в сравнении с аналогами (генотип АА) позволило дополнительно получить за лактацию 6,5 - 16,5% молока, что составляет в денежном выражении 4860,52 - 11658,29 рублей на 1 голову.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 1. Для объективной оценки генетической ситуации в стаде, популяции, породе использовать молекулярно-генетические маркеры, выявляемые методами ДНК-диагностики.
2. Так как аллельные варианты гена каппа-казеина оказывают значительное влияние на белковомолочность и технологические свойствами молока, специалистам племенных хозяйств и предприятий следует использовать генотип по каппа-казеину в качестве селекционных критериев при разработке программ по разведению и совершенствованию крупного рогатого скота татарстанского типа.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК:
1. Ахметов, Т.М. Генетическая структура венгерского голштино - фризского скота по белкам молока. / Р.А. Хаертдинов, Э.С. Губайдуллин, Т.М. Ахметов, М.П. Афанасьев // Тезисы доклада 1 съезда ВОГиС. Генетика.- 1994. ЦТ. 30. - С.
168-169.
2. Ахметов, Т.М. Генетическая структура и технологические свойства молока у холмогорской, венгерской голштино-фризской пород и их помесей. / Р.А.
Хаертдинов, М.П. Афанасьев, Т.М. Ахметов, В.Ф. Верещагин // Зоотехния. 1996.
№5. С.3-6.
3. Ахметов, Т.М. Генетическая изменчивость молочных белков у помесей холмогорская венгерская голштинская.зской пород и их помесей. / Р.А.
Хаертдинов, М.П. Афанасьев, Т.М. Ахметов // Зоотехния. 1998. -.№3.С.5-6.
4. Ахметов, Т.М. Разработка методики высокоточной ПЦР. / Р.Р. Вафин, Р.Х.
Равилов, Р.Р. Вафин, И.Х. Бакиров, Т.М. Ахметов, и др. // Ветеринарная практика №4(35), 2006/2007. Санкт-Петербург. С.43-51.
5. Ахметов, Т.М. Оптимизация способов генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина. / Р.Р. Вафин, Т.М. Ахметов, О.Г. Зарипов, и др. // Ветеринарная практика №2(37), 2007. Санкт-Петербург. С. 54-60.
6. Ахметов, Т.М. Характеристика быков производителей с различными комбинациями генотипов каппа-казеина, бета-лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей. / Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, С.В. Тюлькин, Т.М.
Ахметов, Р.Р. Вафин // Ветеринарная практика №4(39), 2007. Санкт-Петербург. С.
59-64.
7. Ахметов, Т.М. Молочная продуктивность и воспроизводительная способность голштинизированных коров в зависимости от генотипа каппаказеина. / Т.М. Ахметов, С.В. Тюлькин, Э.Ф. Валиуллина // Ветеринарный врач. - №4. - 2007. С.58-61.
8. Ахметов, Т.М. Технологические свойства сыра, произведенного из молока коров с разными генотипами каппа-казеина. / Т.М. Ахметов, С.В. Тюлькин, О.Г.
Зарипов, Э.Ф. Валиуллина // Ученые записки КГАВМ. - Казань. - 2009. Том.196.
Ц С. 8-12.
9. Ахметов, Т.М. Полиморфизм каппа-казеина в стадах крупного рогатого скота. / Т.М. Ахметов, С.В. Тюлькин, С.Ф. Шайдуллин, Р.Р. Муллахметов // Ученые записки КГАВМ. - Казань. - 2009. Том.196. - С. 12-18.
Патенты Российской Федерации:
10. Патент РФ на изобретение № 2299240 Способ проведение ПЦР / Рамиль Р. Вафин, Раиф Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Ш.К. Шакиров, Ф.Ф. Замалиева, И.В. Пикалова И.В., Р.Х. Равилов, И.Х. Бакиров. - Приоритет изобретения 21.02.2005. - Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 20.05.2007. - Бюл. № 14.
11. Патент РФ на изобретение № 2337141 Способ проведение аллельспецифичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина / Рамиль Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г.
Зарипов, Раиф Р. Вафин. - Приоритет изобретения 25.09.2006. - Зарегистр. в Гос.
реестре изобретений РФ 27.10.2008. - Бюл. № 30.
В материалах региональных и международных конференций и совещаний:
12. Ахметов, Т.М. Генетическая структура венгерского голштино Цфризского скота по белкам молока./ Р.А. Хаертдинов, Э.С. Губайдуллин, Т.М. Ахметов, М.П.
Афанасьев // Тезисы докладов республиканской научно-производственной конференции по проблемам ветеринарии и животноводства.Казань. 1994.- с.164165.
13. Ахметов, Т.М. Генетическая структура венгерского голштино-фризского скота и помесей холмогорская х венгерская голштино Цфризская по белкам молока. / Р.А. Хаертдинов, Э.С. Губайдуллин, М.П. Афанасьев, Т.М. Ахметов // Межвузовский сборник научных трудов. - Казань. 1995. - С. 39-43.
14. Ахметов, Т.М. Изменение генетической структуры холмогорского скота по белкам молока в результате скрещивания с голштинской породой. / Р.А.
Хаертдинов, М.П. Афанасьев, Т.М. Ахметов // Тезисы докладов научнопроизводственной конференции по проблемам ветеринарии и зоотехнии. - Казань, 1996. - С.275.
15. Ахметов, Т.М. Сыродельческие качества молока коров холмогорской и голштино фризской пород в зависимости от их генотипа по белкам молока. / М.П.
Афанасьев, Т.М. Ахметов // Тезисы докладов 2-й Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов. - Казань., 1996. Книга 1. - С.86.
16. Ахметов, Т.М. Изменение генетической структуры и технологических свойств молока холмогорского скота в результате скрещивания с венгерской гоштино-фризской породой. Р.А. Хаертдинов, М.П. Афанасьев, Т.М. Ахметов // Тезисы докладов 2-й международной конференции по молекулярно генетическим маркерам. Киев. 1996. С.42-43.
17. Ахметов, Т.М. Изменение генетической структуры и технологических свойств молока коров различных пород и их помесей. / Р.А. Хаертдинов, М.П.
Афанасьев, Т.М. Ахметов // Тезисы докладов производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии, Казань, 1996, С.202.
18. Ахметов, Т.М. Изменение генетической структуры белков молока у холмогор голштинских помесей. / Т.М. Ахметов, Р.З. Хамизуллин // Материалы научных исследований сотрудников агрофака КГСХА. Казань. - 2003. С.115-117.
19. Ахметов, Т.М. Селекционное улучшение молочного стада холмогорской породы и холмогор - голштинсих помесей. / Т.М. Ахметов // Научная конференция профессорско - преподовательского состава и аспирантов арономического факультета посвященной 80 - летию КГСХА. Казань. 2002. С.84.
20. Ахметов, Т.М. Продуктивные признаки помесных холмогор х голштинских первотелок с разными генотипами по локусу гена каппа - казеина. / Т.М.
Ахметов, Р.Р. Вафин, Ш.К. Шакиров // Селекция, кормление, содержание сельскохозяйственных животных и технология производства продуктов животноводства. Московская обл., Лесные поляны, ВНИИплем.,2005. С.45-46.
21. Ахметов, Т.М. Разработка эффективной методики высокоспецифичной ПЦР. / Т.М. Ахметов, Р.Р. Вафин, Ш.К. Шакиров, и др. // Материалы Всероссийской научно - практической конференции, посвященной 85 - летию ТатНИИСХ и 1000 - летию Казани. Казань. 2005. С.467 - 470.
22. Ахметов, Т.М. Использование методов маркер вспомогательной селекции для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. / Т.М.
Ахметов, Р.Р. Вафин, Ш.К. Шакиров // Материалы Всероссийской научно - практической конференции, посвященной 85 - летию ТатНИИСХ и 1000 - летию Казани. Казань. 2005. С.471 Ц475.
23. Ахметов, Т.М. Изучение хозяйственно полезных признаков продуктивности коров с разными генотипами по локусу гена каппа-казеина. / Т.М. Ахметов // Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России. - Дубровицы. - 2005. С.174-177.
24. Ахметов, Т.М. Освоение современных методов селекции для повышения белковомолочности и улучшения технологичеких свойств молка с использованием ДНК технологий. / Т.М. Ахметов, Р.Р. Вафин, Ш.К. Шакиров, Н.Н. Мухаметгалиев // Научно-производственный и публицистический журнал Нива Татарстана. Казань. - 2005. С.34-36.
25. Ахметов, Т.М. Использование метода полимеразно цепной реакции для генотипирования крупного рогатого скота по каппа-казеину. / Т.М. Ахметов // Современные проблемы аграрной науки и пути их решения. - Ижевская ГСХА.
2005. С.228-231.
26. Ахметов, Т.М. Разработка способа высокоспецифичной ПЦР. / Т.М.
Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, Р.Р. Вафин // Вестник КГАУ №3. 2006.
С.33-37.
27. Ахметов, Т.М. Проблема повышения качества молока. / Т.М. Ахметов, Р.Р.
Шайдуллин // Вестник КГАУ №4. - 2006. С.45-48.
28. Ахметов Т.М. Хозяйственно полезные признаки коров с различными генотипами каппа-казеина. / Т.М. Ахметов // Селекция, кормление, содержание сельскохозяйственных животных и технология производства продуктов животноводства. Выпуск 20. Московская обл., Лесные поляны. ВНИИплем. 2007.
С.12-18.
29. Ахметов, Т.М. Методы улучшения сыродельческих свойств молока. / Т.М.
Ахметов // Материалы Международной научно-практической коференции Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства. Мосоловские чтения. Выпуск 9. - Йошкар-Ола. Мар. Гос. Ун-т. 2007. Книга 2. С.187-193.
30. Ахметов, Т.М. Частота встречаемости генотипов каппа-казеина у разных пород крупного рогатого скота. / Т.М. Ахметов // Материалы всероссийской научно-практической конференции Технологические и технические аспекты развития сельского хозяйства. Посвящается 85-летию КГАУ. Тои 74, Часть3-4.
Казань. 2007. С 5-7.
31. Ахметов, Т.М. Характеристика быков производителей с различными генотипами бета лактоглобулина по молочной продуктивности их матерей. / Т.М.
Ахметов, О.Г. Зарипов, С.В. Тюлькин, Э.Ф. Валиуллина // Материалы всероссийской научно-практической конференции Технологические и технические аспекты развития сельского хозяйства. Посвящается 85-летию КГАУ. Тои 74, Часть3-4. Казань. 2007. С.7-10.
32. Ахметов, Т.М. Термоустойчивость молока коров с разными генотипами каппа-казеина. / Т.М. Ахметов С.В. Тюлькин, О.Г. Зарипов // Ученые записки КГАВМ. - Казань. - 2008. Том.193. - С.31-34.
33. Ахметов, Т.М. Белковый состав молока коров с разными генотипами каппаказеина. / Т.М. Ахметов С.В. Тюлькин, О.Г. Зарипов // Ученые записки КГАВМ. - Казань. - 2008. Том.193. - С.31-34.
34. Ахметов, Т.М. Высокоточный вариант ПЦР. / Р.Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Р.Х. Равилов, И.Х. Бакиров // Ветеринарная медицина домашних животных.
Сборник статей. - Выпуск. - 5. Казань. - 2008. - С.61-67.
35. Ахметов, Т.М., Муллагалеев Р.Р. Факторы влияющие на качество молока. / Т.М. Ахметов, Р.Р. Муллагалеев // Ученые записки КГАВМ. - Казань. - 2008.
Том.192. - С.28-31.
В методических рекомендациях:
36. Ахметов, Т.М. Методические рекомендации по использованию новейших достижений ДНК-технологии в селекционно-племенной работе, направленной на улучшение технологических свойств молока / Т.М. Ахметов, И.Р. Закиров, М.Г.
Нургалиев, и др. / Главное гос. с.-х. управление племенным делом в животноводстве МСХ и продовольствия РТ. - Казань, 2007. - 27 с.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству