Geum.ru
   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

  На правах рукописи

СУХОВА

  Галия Керимовна

ИНТЕРМИТТИРУЮЩАЯ (ПЕРИОДИЧЕСКАЯ) ГИПОКСИЯ: ПРИРОДА, НЕКОТОРЫЕ СИСТЕМНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

  03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

  доктора биологических наук

Санкт-Петербург

  2008

Работа выполнена в ФГОУ ВПО Санкт-Петербургском  государственном университете

Научный консультант: 

академик РАН Александр Данилович Ноздрачев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Нина Павловна Александрова

доктор медицинских наук, профессор Петр Дмитриевич Шабанов

доктор биологических наук, профессор Юрий Федотович Пастухов

Ведущее учреждение:

ГУ Научно-исследовательский институт  экспериментальной медицины РАМН 

Защита состоится л__ ________  2008 г. в ___ часов

на заседании совета Д 212.232.10 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:

199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан л___ ________  2008г.

Ученый секретарь совета

доктор биологических наук,

профессор        Н.П.Алексеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение гипоксии и ее последствий для организма занимает важное место среди проблем современной биологии и медицины.

В исследованиях гипоксических состояний традиционно рассматривались эффекты  постоянной гипоксии, в том числе гипобарической. Однако, во многих своих проявлениях гипоксия может носить эпизодический характер. Болеее того, на начальных этапах сопряженных с гипоксией заболеваний она является не постоянной, а интермиттирующей (ИГ) или прерывистой. Особый интерес вызывает гипоксия, сопутствующая синдрому обструктивного апноэ/гипопноэ сна (ОАС), встречающемуся у 2-4 % населения (Yang et al., 1993) и характеризующемуся остановками  дыхания (апноэ) длительностью более 10 секунд с частотой более 15 раз в час либо его ослаблением (гипопноэ) вследствие полного или частичного  коллапса верхних дыхательных путей воавремя сна (Guilleminault, 1975; Бреслав, Ноздрачев, 2005, 2007).

Связанные с периодическими апноэ хроническая интермиттирующая гипоксия и повышенный уровень свободных кислородных радикалов рассматриваются как факторы нарушения регуляции автономного статуса организма, что ассоциируется с повышенным риском развития артериальной гипертензии, нарушений ритма сердца, инфаркта миокарда, инсульта и внезапной смерти во сне (Hung et al., 1990; Fletcher, 2000; Peppard et al., 2000; Phillips, Somers, 2002). Гипертония является наиболее частым следствием, встречающимся почти у 50% людей, страдающих от обструктивного апноэ сна (Law et al., 2002).

Апноэ недоношенных, обструктивные апноэ сна, бронхо-легочная дисплазия являются причинами интермиттирующей гипоксии у детей. Известно, что ранний онтогенез представляет собой  критической период развития с повышенной восприимчивостью к внешним факторам, в том числе, интермиттирующей гипоксии, что может создать предпосылки для сердечно-сосудистой патологии взрослого периода. Однако потенциальная возможность таких последствий не была исследована. Данный вопрос тесно связан с изучением влияния ИГ на пластичность механизмов регуляции сердечно-сосудистой, а также  других висцеральных систем организма, что важно для оценки адаптационных возможностей в условиях ИГ (Fletcher et al., 1992; Wilcox, 2002; Touyz, 2003, 2004; Zimmerman and Davisson, 2004; Hamilton et al., 2004; Zarubina, Nurmanbetova, Shabanov, 2005; Бреслав и Ноздрачев, 2005, 2007). 

Важное теоретическое и практическое значение имеет понимание принципов действия ИГ на различных уровнях от молекулярного до поведенческого в контексте  различных функциональных систем. Понятно, что такой фактор как оксидантный стресс на уровне организма, вызванный  интермиттирующей гипоксией и опосредованный свободно-радикальными реакциями, может затрагивать частные и системные  механизмы, определяющие функциональную целостность организма. Однако, на сегодняшний день не имеется единого представления о значении ИГ для состояния различных висцеральных систем. Настоящая работа представляет шаг в этом направлении и на примере исследования ряда регуляторных механизмов трех важнейших систем - сердечно-сосудистой, дыхательной (легочно-рецепторные рефлексы) и половой демонстрирует патогенетическую роль коротко-интервальной ИГ и ее конкретных  механизмов.

Цель и задачи исследования.

Цель исследования: Дать концептуальную оценку роли интермиттирующей гипоксии в  механизмах контроля висцеральных функций организма на примере сердечно-сосудистой, дыхательной и половой систем.

Были сформулированы следующие задачи:

  1. Дать оценку последствиям  пре- и постнатальной интермиттирующей гипоксии для системных механизмов контроля сердечно-сосудистой функции взрослых крыс (барорефлекторный парасимпатический контроль частоты сердечных сокращений).
  2. Исследовать влияние постнатальной интермиттирующей гипоксии на симпатические рефлекторные и нейроэндокринные механизмы сердечно-сосудистого контроля (эфферентную активность почечного симпатического нерва, обмен катехоламинов норадреналина и дофамина в симпатических ганглиях, надпочечниках и каротидных тельцах у крыс Sprague-Dawley).
  3. Исследовать сердечно-сосудистые эффекты постнатальной интермиттирующей гипоксии в контексте  генетической модели гипертензии  (спонтанно гипертензивные крысы).
  4. Дать оценку роли легочно-рецепторных механизмов в кардио-респираторных реакциях на оксидантный стресс и свободно-радикальную активацию.
  5. Исследовать  роль интермиттирующей гипоксии для  механизмов эректильной функции и паттернов поведенческой сексуальной активности у мышей in vivo c использованием новой авторской телеметрической модели.

Научная новизна. В работе впервые представлены свидетельства роли перинатальной интермиттирующей гипоксии в формировании сердечно-сосудистой патологии взрослых, что имеет особую важность в связи с высокой встречаемостью нарушений регулярного дыхания и оксигенации крови у новорожденных и детей раннего возраста. Показана роль неонатальной интермиттирующей гипоксии в нарушениях функциональной пластичности механизмов сердечно-сосудистого контроля, связанных с долгосрочными эффектами, затрагивающими барорефлекторный контроль сердечного ритма, симпатический баро- и  хеморефлексы, ремоделирование проекций блуждающего нерва на сердце. Впервые приведена сравнительная оценка эффектов интермиттирующей и постоянной гипоксии на катехоламинэргические механизмы и показано, что хотя оба вида гипоксии достоверно  повышают содержание дофамина и норадреналина в каротидных тельцах, эффекты интермиттирующей гипоксии являются более слабыми и отсроченными. Данный механизм интермиттирующей гипоксии может лежать в основе усиленного хеморецепторного входа и развития гипертензии (Benot and Lopez Barneo, 1990; Overholt and Prabhakar, 1999). Впервые показано, что фенотипически выраженные отсроченные повышения АД, связанные с неонатальной интермиттирующей гипоксией, имеют место при наличии генетической предрасположенности к развитию гипертензии, и что свободные кислородные радикалы и L-Са2+ каналы вовлечены в эти механизмы на ранних этапах онтогенеза. Миметики супероксиддисмутазы и блокаторы L-Са2+ каналов, примененные в раннем постнатальном периоде, могут быть эффективны в плане предотвращения гипертензивных последствий неонатальной интермиттирующей гипоксии.

Показано, что одним из механизмов нарушения барорефлекторной чувствительности у взрослых крыс вследствие ИГ является нарушение глутаматэргической трансмиссии  с вовлечением НМДА рецепторов сердечных моторных нейронов nucleus ambiguus. Впервые продемонстрирована возможность прямой активации легочных рецепторов свободными кислородными радикалами (Н2О2), в ходе которой повышается центральная инспираторная активность, полностью угнетается возбуждение экспираторных мышц и отмечается небольшое повышение АД. Данные эффекты опосредованы волоконами в  блуждающих нервах.

Впервые показано, что интермиттирующая гипоксия нарушает половую функцию, демонстрируя широкий диапазон влияний - от поведенческого до молекулярного уровня. ИГ снижает число спонтанных эрекций, подавляет психогенные эрекции и изменяет  паттерны сексуального поведения. ИГ затрудняет расслабление сосудов в эректильной ткани и ее кровенаполнение вследствие повышения активности симпатических вазоконстрикторов, а также вследствие подавления образования еNOS протеина, влияющего на продукцию NO и расширение сосудов. Показана положительная роль тадалафила, ингибитора фосфодиэстеразы 5, в терапии эректильной дисфункции, вызванной ИГ.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа носит фундаментально-прикладной характер. Исследования эффектов коротко-интервальной интермиттирующей гипоксии в экспериментальной модели обструктивного апноэ сна  выявило их патогенетическую направленность, что было показано на примере трех висцеральных систем Ц сердечно-сосудистой (нарушения в механизмах контроля АД) , дыхательной (инспираторно-возбуждающие легочные рефлексы при отсутствии адекватного метаболического обеспечения) и половой (эректильная дисфункция, нарушение психогенных механизмов эрекций и полового поведения). Эффекты хронической коротко-интервальной ИГ связаны со снижением пластичности реакций ЦНС и периферических систем  и носят дезадаптивный характер. Применение кислородного профиля, имитирующего нарушения дыхания и кислородо-транспортной функции по типу обструктивных апноэ, воспроизводило основные характерные признаки синдрома обструктивного апноэ сна - такие как гипертония, сердечная недостаточность, импотенция. Этот факт указывает на то, что ИГ является ведущим патогенетическим фактором данного состояния и превентивные меры по сохранению физиологических механизмов функций в первую очередь должны быть нацелены на коррекцию гипоксического статуса и устранение свободных кислородных радикалов.

Одним из важных теоретических результатов диссертационного исследования явилось представление концептуального положения о роли коротко-интервальной интермиттирующей гипоксии в постнатальном программировании сердечно-сосудистой патологии - гипертонии и сердечной недостаточности взрослых. Эти эффекты имеют фенотипическое проявление, либо обнаруживаются  в условиях острой ИГ и определяются усилением хеморефлексов и симпатической активности и снижением роли барорефлексов и блуждающего нерва в контроле сердечной деятельности.  Результаты исследования позволяют отнести перинатальную периодическую гипоксию к числу факторов риска раннего программирования сердечно-сосудистой дисфункции. Примененные в работе миметики супероксиддисмутазы и блокаторы L-Са2+ каналов могут быть эффективны для предотвращения гипертензивных последствий неонатальной ИГ. Возможность долгосрочных последствий ИГ детского возраста нужно учитывать при анамнезе сердечно-сосудистых заболеваний у взрослых с целью правильной диагностики, выбора методов лечения и/или профилактики.

Во второй части работы при оценке роли легочных рецепторов в кардиореспираторных реакциях в условиях свободно-радикальной активации и использовании брадикинина было установлено, что афферентные импульсы от рецепторов легких могут проводиться в составе блуждающих нервов и других, не связянных с вагусом,  висцеральных афферентов. Принадлежность чувствительных волокон к определенному проводнику определяет  и соответствующие эфферентные компоненты рефлекторных ответов.  Эти факты расширяют представление об афферентной системе легких и вносят вклад в  теорию физиологии дыхания.

В третьей части работы показано, что ИГ, оксидантный стресс и свободные радикалы  являются важнейшей причиной эректильной дисфункции, что может иметь прямое отношение к механизмам импотенции у мужчин при синдроме обструктивного апноэ сна. Учитывая, что психогенные механизмы эрекций чувствительны к ИГ, отсутствие либидо и недооцененность проблемы является одним из факторов,  усложняющих диагностику нарушений сексуальной сферы при оксидантном стрессе.

  Многосторонность последствий интермиттирующей гипоксии указывает на необходимость комплексного подхода и оценки терапевтических вмешательств  при коррекции связанных с интермиттирующей гипоксией состояний. 

В работе продемонстрирована применимость антиоксидантной терапии и блокады L-Са2+ каналов в целях минимизации или устрания связанных с ИГ проблем дисфункций в ряде висцеральных систем.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Хроническая коротко-интервальная интермиттирующая гипоксия изменяет структурно-функциональные  характеристики автономных рефлекторных механизмов контроля сердечно-сосудистой функции.
  2. Неонатальная интермиттирующая гипоксия является фактором программирования нарушений механизмов контроля артериального давления у взрослых крыс.
  3. Свободно-радикальные реакции  при оксидантном стрессе стимулируют рецепторный аппарат легких и вызывают рефлекторные изменения дыхания и повышение АД посредством системы блуждающих нервов.
  4. Интермиттирующая гипоксия является фактором нарушения эректильной функции и  паттерна половой активности у мышей.

Апробация работы. Experimental Biology Meeting, Washington DC, 1999; ALA/ATS International Conference, San Diego, CA 1999; Experimental Biology Meeting, Orlando, FL, 2001; Experimental Biology Meeting, San-Diego, CA, 2000; Experimental Biology Meeting, San Diego, CA,  2000; XXXIV International Congress of Physiological Sciences, Wellington, New Zealand, 2001; 16th APSS Meeting, 2002; SFN Meeting, Washington, DC, 2002; 33rd SFN Meeting, 2003, New Orleans, LA; 34th SFN Meeting, San Diego, CA, 2004; 18th APSS Meeting, Philadelphia, PA, 2004; Experimental Biology Meeting, Washington, DC, 2004; XXXV International Congress of Physiological Sciences, APS Meeting, San Diego, CA, 2005; SFN Meeting, Washington, DC, 2005; 19th APSS Meeting, 2005; VI Всероссийская конференция с международным участием УМеханизмы функционирования висцеральных системФ, CПб, 2008.

Исследования поддержаны персональным грантом National Institutes of Health USA/ National Research Service Award (2001-2004) Суховой Г.К.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 работ, включающих 14 статей из списка, рекомендованного ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из общего введения; описания основных методов (Глава 1); девяти глав результатов собственных исследований (Главы 2-10), каждая из которых включает литературную справку, описание использованных методических приемов,  результаты, обсуждение и краткое резюме. Работа заключается одиннадцатью общими выводами и списком литературы, состоящим из 416 литературных источников. Работа изложена на  330 страницах, содержит 67 рисунков и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные.  В работе были использованы крысы линий Sprague-Dawley, спонтанно гипертензивные крысы (SHR),  крысы Fisher 344, мыши C57BL/6 и кролики New Zealand White. При проведении хирургических процедур у крыс и мышей применяли нембуталовый наркоз (50 мг/кг) В острых экспериментах у кроликов применяли нембутал (35 мг/кг) с последующим переходом на смесь 1% -хлоралозы  и 10% уретана (1.6мл/час).  В эхокардиографических обследованиях крыс использовали кетамин (22 мг/кг в/м) и ксилазин (2.7 мг/кг в/м).

Интермиттирующая гипоксия. Животных подвергали действию ИГ в камерах (Oxycycler  A44XO; Biospherix, Redfield, NY, USA), снабженных системой компьютеризированного контроля подачи N2 и воздуха для  поддержания  в них уровня О2 в соответствии с заданным профилем (FIO2 8 %, 90 сек, сменяющиеся FIO2 = 21%., 90 сек , 12 часов в день с 7 до 19 часов). Остальное время FIO2 = 21%. Профиль оксгенации/деоксигенации имитировал условия обструктивного апноэ во сне у животных (экспериментальная модель ОАС, Fletcher et al, 1992). Уровень СО2  соответствовал 0.03% , температура в камере - 22-24С. Продолжительность хронической интермиттирующей гипоксии составляла 30-35 дней, острой -18 мин.

Электрофизиологические исследования. Электрическую активность симпатического, диафрагмального нервов и электромиограмму мышц живота регистрировали с помощью биполярных платиновых  и игольчатых металлических (миограмма) электродов, соединенных с высоко импедансным устройством входа (Grass Instruments). Сигналы были усилены (дифференциальный усилитель, модель 511, Grass Instruments, пропущены через фильтр (30-3000 Гц) и проинтегрированы  (1/RC=50 мс; Grass P10F кумулятивный интегратор), записаны с помощью полиграфа (Grass, модель 7; Astro-Med, Dash IV) Аналоговые сигналы оцифровывали (Buxco Electronics) для последущего анализа.

Измерения артериального давления и ЧСС. 1) В острых экспериментах у крыс при исследовании барорефлексов  и у кроликов АД регистрировали в бедренной артерии. Использовали преобразователь давления и усилители (Grass, модель 7; модель P23db; Statham Laboratories, Hato Rey, Puerto Rico или Buxco Electronics, Troy, NY)  и полиграф Astro-Med, Dash IV. ЧСС измеряли тахографом  (модель 7Р4Н, Grass Instrument, Quincy, MA). 2) Для регистрации АД, ЧСС и ЭКГ у свободно перемещающихся крыс в бодрствующем состоянии и  во время сна  применяли телеметрию (Data Sciences Int. Inc., St. Paul, MN, USA). 3)Неинвазивные измерения АД  и ЧСС в серии онтогенетических исследований у бодрствующих крыс производили в хвостовой артерии с помощью окклюзионной и плетизмографической манжеток и компьютеризированной системы обработки сигнала (CODA2; Kent Scientific Corp., Torrington, CT, USA).

Исследование барорефлекторной функции.  Барорефлекторная чувствительность - интегральный показатель статуса автономной системы контроля АД.  Чувствительность барорефлекторного механизма, контролирующего ЧСС, а также активность почечного симпатического нерва, определяли при в/в введении фенилэфрина и нитропруссида натрия (6-12 мкг/мин; 1-2 мин). Определяли ЧСС - исходные и на уровне плато реакции АД. Показатели ЧСС и АД усредняли по данным 2-3 измерений отрицательных и положительных хронотропных эффектов соответственно для каждого животного. Определяли изменения амплитуды интегрированной за 1 с активности нерва при смещениях АД на величины 25 и 50 мм рт.ст. По результатам измерений для каждой группы экспериментальных животных расчитывали  уравнения регресcии у=ах+в (Origin 6.0), где коэффициент а (наклон линии регресии; уд/мин мм рт.ст.) характеризовал барорефлекторную чувствительность (Kent et al., 1972).

Исследование вариабельности сердечного ритма  Проводили спектральный анализ длительностей R-R интервалов, полученых на основе телеметрической записи ЭКГ у крыс Sprague-Dawley и SHR,  на основе частотного домена. Делали 5-ти минутные записи ЭКГво время сна животных.  R-R интервалы ЭКГ выделяли при помощи программы Анализ основного программного пакета (DSI), переводили в текстовый формат (ASCII) и экспортировали в программу анализа ВСР (Университет Куополо, Финляндия). Программа позволяла провести параметрический (ауторегрессивный) анализ наряду с непараметрическим (быстрые преобразования Фурье) и  вычислить пиковые частоты и мощности частотных компонентов - ОНЧ (очень низкие частоты; 0,004-0,05 Гц), НЧ (низкие частоты; 0,05-0,15 Гц) и ВЧ (высокие частоты; 0,15-0,35 Гц), а также соотношение мощностей НЧ/ВЧ. Показатели ВСР исследовали у взрослых Sprague-Dawley а также у спонтанно гипертензивных крыс, подвергавшихся в постнатальном онтогенезе действию интермиттирующей гипоксии.

Телеметрия. Применяли систему Dataquestо A.R.T. Gold (Data Science International, Inc., St. Paul, MN, USA) для регистрации АД, ЧСС и ЭКГ у крыс и давления в bulbus penis у мышей в условиях свободного перемещения животных. Cистема включала референтный монитор внешнего давления (APR-1), устройство обмена данных (Data Exchange Matrix), воспринимающие устройства (RPC-1), на которых располагались индивидуальные контейнеры с животными. Телеметрические датчики моделей DSI PhysioTelо и  ТА11С50-РХТ и ТА11PA-C40 (для крыс) размещали внутрибрюшинно, кончик катетера  для измерения АД  располагали в аорте. Электроды  для ЭКГ, связанные с телеметрическим трансмиттером, подкожно подшивали к  участкам тела  в соответствии с положением  2-го стандартного отведения.

Для исследования половой функции у мышей использовали оригинальную авторскую модель телеметрии эректильной функции in vivo. Трансмиттер ТА11РА-С20 располагался внутрибрюшинно, кончик катетера для измерения давления при эрекциях полового члена мыши  вводили в bulbus penis. Исследовали давление в ходе спонтанных эрекций, а также в поведенческих тестах с самками (контактных и бесконтактных).  Проводили непрерывный мониторинг спонтанных эрекций 2 дня/нед в условиях хронической ИГ в течение 8 недель. Контактные и бесконтатные тесты с самками проводили через 5-8 недель применения ИГ.  В условиях ИГ исследовали влияние на половую функцию тадалафила (Сialis; 0.014мг /25г веса тела мыши, что соответствует 40 мг/70кг веса человека; Eli Lilly , Indianapolis). 

Конфокальная микроскопия. Для морфологического исследования эфферентных окончаний блуждающего нерва в правом предсердии крысам была сделана серия унилатеральных инъекций трейсера родамина (№ 3886; Molecular Probes, Eugene, OR) в nucleus ambiguus (NA) в девяти точках (-1,600 до + 1,600 мкм, с шагом 400 мкм; общий объем 22.5-112.5 нл). Флюорохром (1 мл, 2мг/мл в/б; Fluoroсhrome LLC, Denver, Co) был введен для контрастной окраски клеток интрамуральных предсердных ганглиев. Количественно оценивали эфференты блуждающего нерва с помощью конфокального микроскопа Lieca и цифровой системы оценки параметров изображения Neurolucida (MicroBright Field, Colchester, VT, USA).

Исследования содержания катехоламинов в плазме крови, нейроэндокринных тканях и симпатических ганглиях. Содержание катехоламинов - адреналина и норадреналина, а также дофамина, дигидроксифенилуксусной кислоты и 5-гидрокситриптамина в экстрактах каротидных телец, краниального шейного симпатического ганглия и надпочечников  у крыс определяли  методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. 

Исследование ферментов синтеза катехоламинов в экстрактах каротидных тел, надпочечников и краниального шейного симпатического ганглия. Экспрессию тирозин гидроксилазы и ее фосфорилированных форм, дофамин-гидроксилазы, фениэтаноламин N-метилтрансферазы и ГТФ циклогидролазы-1 определяли методом иммуноблота (Western Blot).

Cтатистика.  Применяли общепринятые методы вариационной статистики, результаты варажали  как среднее m. При оценке различий использовали парный и непарный тест Стьюдента-Фишера, тест ANOVA, тест WilcoxonТa, регрессионный анализ, спектральный анализ сердечного ритма. Различия считали статистически значимыми при P<0.05. Использовали пакеты программ DSI Analysis (DSI, St. Paul, MN), Buxco Analysis (Buxco Electronics Inc., Troy, NY), Мicrosoft Excel, Origin 6.0 (OriginLab Corp.,Northampton, MA), Neurolucida (MBF Neuroscience, Сolсhester, VT), SoftMax Pro (GMI, Inc, Ramsay, MN).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пре- и постнатальная интермиттирущая гипоксия и сердечно-сосудистая функция

  1.1  Барорефлекторная чувствительность взрослых крыс после перинатальной интермиттирущей гипоксии.

  Барорефлекс представляет собой механизм поддержания постоянного АД, определяемый активностью барорецепторов при колебаниях АД. Его механизм включает афферентное звено (барорецепторы), центральное звено (ядро nucleus ambiguus и симпатические центры, связанные с ростральной вентролатеральной медуллой), эфферентные блуждающие нервы и симпатические вазоконстрикторы и эффекторные органы - сердце и сосуды.  Чувствительноть барорефлекса Ц интегральный показатель, отражающий статус механизмов контроля сердечно-сосудистой функции.

  Парасимпатическая иннервация сердца играет ведущую роль в рефлекторной регуляции ЧСС в покое. Отсроченные сердечно-сосудистые эффекты перинатальной интермиттирующей гипоксии изучали на крысах Sprague-Dawley, которых подвергали действию гипоксии в постнатальные дни 1-30 или пренатальные гестационные дни 5-21 (беременные крысы). Барорефлекторную чувствительность (БРЧ) и сердечные хронотропные эффекты измеряли в возрасте 3.5 - 5 мес у анестезированных животных, при в/в введении фенилэфрина и нитропруссида натрия (6-12 мкл/мин, 1-2 мин). Контролем служили животные, постоянно содержавшиеся в условиях нормоксии. БРЧ измеряли до и после применения 18 - мин острой ИГ. Постнатальная ИГ приводила к нарушению (снижению) барорефлекторной чувствительности у взрослых крыс, которая, по сравнению с контрольными,  была наполовину ниже в покое и не изменялась после острой ИГ (Рис. 1). У контрольных животных после острой гипоксии БРЧ снижалась на 42% (Р<0.05). Реакция ЧСС на введение фенилэфрина у крыс с постнатальной ИГ была меньше, чем у контрольных (Р<0.05) и не изменялась после острой ИГ.

Рис. 1.  Барорефлекторная функция 3.5-5-месячных крыс, выращенных в условиях нормоксии (контроль), постнатальной и пренатальной интермиттирующей гипоксии (n=6/группу).

Барорефлекторная чувствительность у крыс с пренатальной ИГ была сходной с  величинами у контрольных крыс (Рис. 1), однако хронотропные влияния на сердце были снижены.  Представленные данные свидетельствут о долгосрочных последствиях интермиттирующей гипоксии перинатального периода для контроля сердечно-сосудистой функции.

1.2 Исследование проекций блуждающего нерва к сердцу.

Нейроморфологичекие исследования эфферентных проекций вагуса к сердцу при введении родамина  в левый nucleus ambiguus у крыс показали, что пучок эфферентных волокон блуждающего нерва в предсердном ганглии формирует гроздь окончаний, обхватывающих ганглионарные нейроны  множеством  варикозных терминалей наподобие корзинки. В отличие от контрольных животных, меченые родамином корзинчатые окончания у крыс, подвергавшихся постнатальной ИГ представлены более редко. Вставки на левой панели B (нормоксия) и правой панели A (ИГ) представляют собой составленные с помощью программы Neurolucida изображения-реконструкции корзинчатых окончаний вокруг нейронов, показанных стрелкой (Рис. 2).

.

Рис. 2. Примеры конфокальных изображений иннервации ганглионарных клеток предсердий у 2-месячных крыс - контрольной (правые панели) и после 30-дневной постнатальной интермиттирующей гипоксии (левые панели). Шкала: 50 мкм.

ИГ в первые 35 дней постнатальной жизни вызвала у 2-месячных крыс  уменьшение числа корзинчатых контактов на 17% (Р<0.001) и число варикозных окончаний аксонов вагуса на 56% (Р<0.001) по сравнению с контролем. Такие изменения эфферентной иннервации сердца могут определять барорефлекторные дефициты и лежать в основе долгосрочных модификаций барорефлекторной функции, обусловленных постнатальной интермиттирующей гипоксией.

1.3  Влияние интермиттирующей гипоксии на  центральные механизмы  барорефлекса.

У взрослых крыс Fischer 344, подвергавшихся 30-55 - дневной ИГ, микроинъекции L-глутамата (10мМ; 20 нл) в область nucleus ambiguus вызывали менее выраженные снижения ЧСС, чем у контрольных крыс. Электрическая стимуляция  дистального участка перерезанного блуждающего нерва (1-30 Гц, 0.5 мА, 20с) у  крыс после ИГ показала уменьшение времени  достижения 50%  максимального хронотропного эффекта  по сравнению с контролем, что  позволяло исключить возможность нарушений кабельной функции нерва и указывало на изменения в центральных нейротрансмиттерных механизмах ядра вагуса как на причину снижения барорефлекторной чувствительности. Действительно, показано, что  ИГ приводит к эксайтотоксичности глутамата, что может нарушать НМДА-рецепторно-Са2+канальцевые комплексы на мембранах нейронов, приводя к  усилению поступления Са2+ в клетку и последующей ее гибели (Ikonomidou et al., 1999). Количественная оценка окрашенных по Нисслю преганглионарных кардиомоторных нейронов nucleus ambiguus  на 5 корональных срезах продолговатого мозга показала достоверное снижение их числа у крыс после ИГ (Таблица 1).

  Таблица 1

Число окрашенных по Нисслю нейронов в Nucleus Ambiguus после 30-дневной интермиттирующей гипоксии

              -800         -400                 0       +400  +800       Общее

          Лев  Прав Лев Прав Лев Прав  Лев  Прав Лев  Прав

Контроль  55.3 57.1  60.3  59.5  45.6 44.5  68.2 70.4 82.7  83.8  627.4

  2.1 2.6 5.3  6.5  3.4  3.2  10.5  8.7  9.7 10.8  23.5

ИГ  34.7  35.7  36.1  33.9  31.2 32.3 35.6 36.5 45.1  46.7 367.8

  3.0* 4.1* 3.7*  2.6* 2.8*  2.1* 4.0*  5.1* 4.8**  3.5**  11.6**

**, P<0.01; *, P<0.05 при сравнении с контрольными (среднее m). Срезы мозга относительно obex.

  1.4 Интермиттирующая гипоксия и симпатические механизмы контроля АД.

              Каротидные хеморецепторы, реагирующие на гипоксию, связаны с механизмами контроля активности симпатической нервной системы и продукции катехоламинов мозговым веществом надпочечников.  Были исследованы отсроченные эффекты постнатальной ИГ на  показатели  активности  симпатической нервной системы.

У взрослых крыс, подвергавшихся ИГ в первые 30 дней постнатальной жизни, и контрольных не было различий в коцентрации катехоламинов (норадреналина и адреналина) в плазме крови.  При регистрации активности почечного симпатического нерва в условиях 18-мин острой ИГ отмечалось изменение амплитуды сигнала  нерва , которое модулировалось меняющимся хеморецепторным входом. Амплитуда сигнала в нерве на протяжении действия острой ИГ  в нормоксических и гипоксических эпизодах превышала фоновую  (Рис. 3, левая панель). У крыс, подвергавшихся неонатальной ИГ, реактивность симпатического нерва на оксидантный стресс - острую ИГ была повышенной. У этих крыс увеличение  фоновой амплитуды более чем  на 30% происходило в 3 раза чаще, чем у контрольных крыс, при этом она сохранялось повышенной в течение не менее десятка мин после окончания стимула, что свидетельствует об измененной пластичности ответов. Управление активностью симпатического нерва посредством барорефлекторного механизма сразу после применения острой ИГ изменялось (Рис. 3, правая панель). Полученные путем  регрессионного анализа характеристики ответов представлены в виде графиков, описываемых уравнениями:  Контрольные крысы:  y= -2.71x+57.5 (острая ИГ); y= -1.18x+1.97 (нормоксия);  ИГ (крысы, подвергавшиеся 30-дневной постнатальной ИГ): y= -1.26x-10.2 (острая ИГ);  y= -1.38x-11.5 (нормоксия).  Барорефлекторная чувствительность (в уравнениях - это коэффициент при х) у контрольных крыс после острой ИГ повышалась (Р<0.01), однако у крыс, подвергавшихся постнатальной ИГ она не изменилаcь при том, что фоновая активность почечного симпатического нерва была повышена. Эти данные свидетельствуют о долгосрочных прогипертензивных изменениях в системе симпатического контроля АД у данных нормотензивных крыс.

1.5 Обмен катехоламинов в звеньях автономной дуги в условиях ИГ. 

Применение ИГ у взрослых крыс в течение 35 дней приводит к повышению АД (Fletcher et al., 1992). Механизмы симпатоактивации  контролируются ИГ при непоседственном участии хеморецепторов. Для исследования влияния ИГ на автономную дугу, включающую  каротидные хеморецепторы, надпочечники и симпатические ганглии был проведен анализ содержания катехоламинов - норадреналина и дофамина, а также фермента их синтеза тирозингидроксилазы и фосфорилирования ее участков Ser19, Ser31,Ser40. Сравнение с эффектами постоянной гипоксии показало более выраженную латентность и меньший уровень синтеза катехоламинов в каротидных тельцах в условиях ИГ (Рис. 4).  Данные показатели могут восить вклад в усиление хеморецепторного входа при ИГ, так как катехоламины в каротидных тельцах подавляют их активность (Overholt and Prabhahar,1999).  Роль симпатических ганглиев, равно как и надпочечников, в синтезе биогенных аминов в условиях ИГ была незначительной.  Усиление хемоафферентных влияний, определяемое ИГ, может посредством повышения активации  симпатической нервной системы приводить к  гипертензивным  состояниям  у взрослых.

                         

Рис. 3.  Изменения в фоновой активности почечного симпатического нерва у крысы, подвергавшейся неонатальной ИГ: эффект острой ИГ (левая панель); барорецепторный контроль активности почечного симпатического нерва  после  острой ИГ (правая панель).

       Ср АД - среднее артериальное давление; АПСН -  электрическая активность почечного симпатического нерва, интегрированная за секунду. Изменения  активности почечного симпатического нерва (% от фона) для каждой крысы были расчитаны при сдвигах АД от среднего на 25 и 50  мм рт.ст.

1.6  Постнатальная интермиттирующая гипоксия и гипертензия.

  Перманентные  нарушения в контроле ЧСС, определяемые нарушениями в центральном, вагусном и симпатических механизмах контроля сердечно-сосудистой функции, являются показателем снижения пластичности нервных механизмов контроля АД и уменьшения компенсаторных возможностей в покое и при острой ИГ. Интересным наблюдением было то, что указанные изменения прогипертензивной направленности  в барорефлекторных механизмах у взрослых крыс Sprague-Dawley, подвергавшихся ИГ в раннем постнатальном периоде,  тем не менее, не привели  к  повышению АД  (Рис. 5).  Для оценки возможности  гипертензивных последствий постнатальной  ИГ  были использованы  спонтанно гипертензивные крысы (SHR) - модель генетической  гипертонии. ИГ, примененная  у SHR с 4-го по 30-ый дни жизни явилась 

Рис. 4. Эффекты 14-дневной постоянной и интермиттирующей гипоксии на концентрацию в каротидном тельце дофамина (A), норадреналина (B), дигидроксифенилуксусной кислоты (C) и серотонина (D).

Среднееm, *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (нормоксические пробы: n =6; гипоксические пробы: n=15).

пусковым  стимулом  в  развитии  более выраженного гипертензивного статуса в постнатальном онтогенезе  (Рис. 5). Эхокардиографическое исследование левого

Рис. 5. Изменение систолического давления в постнатальном онтогенезе у крыс Sprague-Dawley и SHR (среднееm).

(1) SHR (n=5) и (3) Sprague-Dawley (n=6), подвергавшиеся неонатальной интермиттирующей гипоксии в первые 30 дней жизни (пунктирная линия); (2) Контрольные SHR (n=6) и (4) Sprague-Dawley (n=7), развивались в нормоксии.  * - Р<0.001 для соответствующих значений на графиках 1 и 2. SHR - спонтанно гипертензивные крысы.

желудочка у крыс, перенесших постнатальную ИГ, выявило ремоделирование сердца  по концентрическому типу  - гипертрофию левого желудочка (Табл. 2).

  Одним из информативных методов оценки тонуса вегетативной нервной системы является анализ вариабельности сердечного ритма. Спектральный анализ R-R интервалов ЭКГ во время сна у спонтанно гипертензивных крыс,  показал увеличение отношения спектральной мощности низкочастотного и  высокочастотного компонентов (НЧ/ВЧ) в 1.4 раза (P<0.01) у крыс, подвергавшихся постнатальной хронической ИГ по сравнению с контрольными. Так как НЧ компонент ассоциирован с симпатическим, а ВЧ - с парасимпатическим отделом нервной системы (Task force of the ESC and NASPE, 1996), повышение соотношения спектральной мощности НЧ/ВЧ указывает на повышенный тонуса симпатической нервной системы в покое у SHR после ИГ по сравнению с контролем.  Это могло определять повышенное систолическое и диастолическое давление у данной группы крыс во время сна, достоверно не отличавшееся от значений АД во время бодрствования. Достоверного изменения мощности НЧ/ВЧ компонентов спектра у нормотензивных крыс, подвергавшихся постнатальной ИГ, не наблюдалось.  Таким образом, существенно возросший тонус симпатической нервной системы в покое после неонатальной ИГ присутствовал у  взрослых SHR, но не у  крыс Sprague Dawley, что могло определяться генетически.

  Примененные в неонатальном периоде  одновременно с протоколом ИГ фармакологические         методы коррекции гипертензии  с использованием  миметика

 

Рис. 6. Изменение АД в онтогенезе SHR  после неонатальной интермит-тирующей гипоксии.

Крысы находились постоянно в условиях нормоксии (К, контроль) либо интермиттирующей гипоксии с 4-го по 30-ый день жизни (ИГ).  Крысы К и ИГ получали один из видов инъекций: полиэтиленгликоль (К), миметик супероксиддис-мутазы [Mn(III) Tetrakis(1-methyl-4-pyridyl) porphyrin pentachloride] - MnTMPyP пентахлорид 10 мг/кг в сут (СОДм) или блокатор L-Ca2+ каналов нифедипин 5мг/кг в сут. Данные представлены как среднее m;  n=8/ группу; *P< 0.001 при сравнении с соответствующими величинами систолического давления в других группах.

супероксиддисмутазы, блокирующего свободно-радикальные реакции и нифедипина,

антигипертензивного агента, блокирующего L-Са2+ каналы, обеспечило нормализацию систолического и диастолического АД и только частичное восстановление сердечной функции с  большим компенсаторным участием нифедипина (Рис. 6; Табл. 2).

Таким образом, у генетически предрасположенных к гипертензии крыс, присутствие ИГ в раннем онтогенезе является пусковым фактором для развитии долговременных отсроченных эффектов или Упрограммирования У выраженной гипертензии, что связано с активацией  L-Са2+ каналов сердечно-сосудистой системы в условиях оксидантного стресса. Сигнальные механизмы, вовлеченные в изменения сердечной функции в условиях оксидантного стресса, моделирующего обструктивное апноэ сна, могли  приводить к  последствиям, имеющим необратимый характер, что при указанном синдроме проявляется в виде сердечной недостаточности, ишемической болезни, инфарктов  миокарда. 

  1. Влияние свободно-радикальной активации рецепторов легких на кардио-респираторную функцию.

В условиях оксидантного стресса, вызываемого ИГ, продукция свободных кислородных радикалов (О2, Н2О2, и ОН) повышена. В целях исследования

  Таблица 2

Изменения в функции левого желудочка взрослых спонтанно  гипертензивных крыс после неонатальной интермиттирующей гипоксии

Эхокардио-                                        

графические                               Г  Р У П П Ы  К Р Ы С

показатели                      

и               К         ИГ ИГ-СОДм       ИГ-Ниф

Различия (%)                       cр. с К         ср. с ИГ ср. с ИГ

КДД  (мм)  8.880.15       6.880.21         7.350.22  7.750.31

                            (-22.5) *         (НД)         (12.7) З

КСД  (мм)         5.510.19       3.480.22       4.180.27       .310.30

                              (-36.8) *        (НД)  (НД)

Тпслж (мм) 1.680.02               1.940.10       1.700.05 1.690.06                                               (15.5) З         (НД)       (НД)

Тзслж (мм)  1.660.02                 2.020.12       1.730.05         670.06

(21.7) З         (НД) (-17.2) З

ОТслж 0.380.01               0.580.04       0.470.02  0.440.03                                         (54.2) Ж       (-19.3) З       (-14.5) З

                               

ФУ         0.380.01               0.500.02  0.440.02  0.45 0.02        

  (30.3) *  (НД)  (НД)

Vcf  (с-1)         4.190.1 5.110.3         4.520.05 3.930.14

  (21.9) З  (НД) (-23.0) Ж

                                               

Среднее m;  Обозначения групп как на Рис. 6; КСД - конечно-систолический диаметр левого желудочка сердца; КДД - конечно-диастолический диаметр левого желудочка; Тзслж - толщина задней стенки левого желудочка сердца; Тпслж - толщина передней стенки левого желудочка сердца; ОТслж - относительная толщина стенки левого желудочка сердца; ФУ - фракционное укорочение; Vcf  - средняя скорость  циркулярного сокращения волокон левого желудочка.  *P<0.001; ЖP<0.01; ЗP<0.05; НД - не достоверно.

возможности их влияния на  рецепторный аппарат легких и индуцирование кардиореспираторных рефлексов  проводили прямое введение Н2О2 (1 моль в 0.1 мл 0.9% NaCl)  в периферические участки легких у искусственно вентилируемых кроликов со вскрытой грудной клеткой. Такая техника, в отличие от традиционного введения веществ через малый круг кровообращения, обеспечивает стимуляцию рецепторных образований легких и исключает возникновение других рефлексов из сердечно-сосудистой системы или с хеморецепторов.

Н2О2 приводила к усилению центральной инспираторной активности (Рис. 7), выражавшейся в увеличении амплитуды и частоты вспышек дыхательных разрядов в нейрограмме диафрагмального нерва, и угнетала активнсть экспираторных мышц. Интересно, что реакция на Н2О2  была сходна с ранее описанной реакцией на местную инъекцию 0.1 мл 8.1% NaCl (Yu et al., 1998), оказывающей влияния исключительно через механизм блуждающего нерва путем деполяризации его рецепторных окончаний. Латентный период ответов составил 2-10 с. Влияния Н2О2  на среднее артериальное давление было слабым. АД в среднем повышалось на 5.5 0.7 и 6.7 0.6 мм рт.ст., соответственно, в ответ на инъекции Н2О2 и 8.1% NaCl (n = 20; p < 0.01).  Эффекты Н2О2 и 8.1% NaCl устранялись билатеральной ваготомией (n=5). Таким образом, рецепторы легких в условиях свободно-радикальной активации не оказывают симпато-активирующих влияний, а их роль ограничивается пределами участия блуждающих нервов. Сопоставление эффектов Н2О2 и классического медиатора воспаления брадикинина (20М в 0.1 мл NaCl 0.9%; В6026, Sigma), вводимого локально в легкое, показало разнообразие дыхательных и гемодинамических эффектов и их сочетаний под действием брадикинина. Наиболее типичным было снижение АД, повышение тонуса экспираторных мышц, усиление центральной инспираторной активности с резким укорочением длительности вдоха и выдоха и характерной динамикой развития ответа (латентный период составлял 14 с, max амплитуда ЭНГ достигалась через ~ 40 c) (Рис. 8).

.

Рис. 7. Одинаковые дыхательные и гемодинамические реакции на инъекцию  0.1 мл 8.1% NaCl (верхняя панель) или 1 мкмоль Н2О2 (нижняя панель) в периферическую область правого легкого у анестезированных искусственно  вентилируемых кроликов с открытой грудной клеткой.

ЭНГ- электронейрограмма левого диафрагмального нерва; ЭНГ - интегрированная электронeйрограмма; Pтр - давление в трахее; АД - среднее артериальное давление. Три отметки наверху указывают на моменты введения иглы в легкое, начало и окончание инъекции.

Рис. 8. Пример типичного дыха-тельного и сердечно-сосудистого эффектов брадикинина.

Обозначения - как на Рис.7.

  Эффекты брадикинина определялись волокнами проводников двух видов Ц  вагуса  и невагусных висцеральных нервов. Снижение АД под действием брадикинина было связано с уменьшением активности симпатических нервных волокон. Эффект сохранялся после ваготомии (Рис. 9). Рецепторы легких, таким образом, в условиях их активации свободными  кислородными радикалами не играют контролирующей роли в отношении симпатической нервной системы. Рефлекторные реакции в этих условиях осуществляются только  через блуждающие нервы.

Рис. 9. Активность волокон почечного симпатического нерва (АПСН) в ответ на локальную инъекцию брадикинина (1 мкг в 0.1 мл 0.9% NaCl) в легочную паренхиму до (A) и после (B) шейной билатеральной ваготомии у кролика.

Обозначения - как на Рис. 7.

3. Исследование эффектов интермиттирующей гипоксии на эректильную функцию и половое поведение у мышей  методом телеметрии.

У взрослых мышей с имплантированными в bulbus penis телеметрическими датчиками исследовали эректильную и половую поведенческую активность после 5-8 недель ИГ и последущего  применения тадалафила (Табл. 3; Рис. 10).  Тадалафил (Сialis), стимулятор эректильной функции, ингибирует фосфодиэстеразу 5 и повышает уровень цГМФ, необходимого для нормальных эрекций.

  ИГ вызвала снижение числа спонтанных эрекций на 40% через 1 неделю, которое сохранялось в течение всего периода ИГ и  оставалось ниже фонового уровня после 6 недель нормоксии. Нарушения были компенсированы тадалафилом. Это может свидетельствовать.о вовлечении быстрого нервного  механизма подавления спонтанных эрекций.

  Таблица 3

Число спнтанных эрекций за сутки и давление в  bulbus penis  у самцов мыши во время копулятивного теста после  5 недель интермиттирующей гипоксии и  применения Тадалафила

Показатели                         Фон                 ИГ                 ИГ+ Тадалафил

Спонтанные эрекции/сут (n)          282  172 *  252*

Давление покоя (мм рт.ст.)                 92               113                 91

(Flaccid)

Давление наполнения (мм рт.ст.)       613               557         775 *

(Tumescence)

Мax давление         (мм рт.ст.)  37625  34548 38911

*P<0.05 при ср. с ИГ; среднееm

Под влиянием 30 Цдневной ИГ существенно изменилась поведенческая активность мышей в контактных тестах с самками (Рис.10). Применение тадалафила у мышей после ИГ восстанавливало поведенческий паттерн (Рис. 10).

  ИГ достоверно снижала пики давления в bulbus penis, регистрируемые в ходе 20 мин бесконтактного теста с самками, что указывало на резкое снижение психогенной

Рис.10. Латентные периоды для садок (С), интромиссий

(И), эякуляции и индекс И/(С+И), измеренные во время контактных тестов с самками.

К - контроль (нормоксия), ИГ - интермиттирующая гипоксия; Тадалафил был использован в дозе 0.014 мг/25г веса тела; n=6/группу.* - P<0.001 ИГ и ИГ+ тадалафил; Ж - ИГ и К. ИГ=8 недель.

сексуальной активности (Рис.11). Тадалафил, примененный в этом тесте, существенно ее повышал (Рис. 11).

Рис. 11. Эффекты хронической периодической гипоксии и тадалафила на число пиков давления (80-120 мм рт.ст. и длительностью 0.4-0.5 с), зарегистри-рованных у самцов мышей в bulbus penis при бесконтактных тестах с самками.

Одной из важных причин ухудшения эректильной функции было влияние ИГ на функцию эндотелия сосудов полового члена, где было обнаружено снижение еNOS-протеина, что снижало продукцию NO и нарушало вазодилятацию и кровенаполнение полового члена (Рис. 12). Повышение активности симпатических нервных волокон, показанное при ИГ, также способствует вазоконстрикции и снижению эректильной функции.

Рис. 12. Влияние хронической интермиттирующей гипоксии на содержание изоформ NO-синтазы в эректильной ткани мыши.

А - Примеры иммуноблота для контрольной (К) мыши и мыши после 8 недель ИГ. Для количественной стандартизации проб был использован -актин и моноклональные антитела. В - Количественная оценка иммунореактивности в эректильной ткани, полученной от мышей, находившихся в условиях нормоксии и периодической гипоксии. Иммунореактивность выражена в средних денситометрических единицах, откорректированных по -актину (относительные единицы); eNOS (эндотелиальная  NO-синтаза) - пустые столбики, nNOS (нейрональная NO-синтаза - серые столбики, iNOS (индуцируемая NO-синтаза) - черные столбики. К - контроль (нормоксия); ИГ- интермиттирующая гипоксия.

 

  ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интермиттирующая гипоксия является фактором, сопутствующим обструктивному апноэ сна  и другим нарушениям дыхания, которые  могут встречаться  в онтогенезе в разные его периоды.  Нарушения дыхания во сне связывают с сердечно-сосудистой патологией, наиболее частыми проявлениями которой являются системная артериальная гипертония, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность. В целях моделирования нарушений дыхания по типу периодического обструктивного апноэ была предложена модель, основанная на использовании интермиттирующей, или прерывистой, коротко-интервальной гипоксии (Fletcher, 1992). Данная  модель была применена  в настоящем исследовании с целью  изучения последствий ИГ для функциональных характеристик  висцеральных систем  на примере сердечно-сосудистой,  дыхательной (легочно-рецепторная функция) и  половой.

        Результаты исследований показали, что влияния коротко-интервальной интермиттирующей гипоксии носят дисфункциональный и дезадаптивный характер, способствуя инициированию хронических перманентных изменений в различных звеньях механизмов регуляции висцеральных систем организма. 

  В работе исследовались вопросы влияния ИГ на пластичность механизмов контроля висцеральных функций, которые рассматривались, в том числе, и в онтогенетическом аспекте. Среди изучаемых вопросов были долгосрочные последствия пренатальной и постнатальной ИГ и возможность программирования  сердечно-сосудистой патологии взрослого периода. Исследования, проведенные на крысах, подвергавшихся 30-дневному воздействию ИГ в раннем постнатальном периоде, показали  ряд нарушений контроля сердечно-сосудистой функции, которые уже в возрасте 3.5-5 мес,  соответствовали показателям более старых животных (18-20 мес). Барорефлекторная чувствительность, как интегральный показатель статуса механизмов регуляции сердечно-сосудистой функции, был снижен у животных с постнатальной ИГ на 50%, причем  эти изменения носили перманентный характер.  Снижение барорефлекторной чувствительности могло объясняться изменениями в различных звеньях барорефлекса, в частности, снижением под влиянием ИГ  числа эфферентных парасимпатических волокон и варикозных окончаний на ганглионарных клетках правого предсердия. Другой выявленной причиной нарушения  механизмов барорефлекса под действием хронической ИГ явилась гибель части кардиомоторных нейронов в nucleus ambiguous и снижение глутаматергической трансмиссии в этом ядре. У крыс, подвергавшихся постнатальной ИГ, отмечалась повышенная индуцируемость активности почечного симпатического нерва при острой ИГ, происходившая одновременно со снижением барорефлекторного контроля симпатической активности. Была показана  роль усиленного хеморецепторного входа в этих реакциях. Эти факты ясно указывают на про-гипертензивную направленность механизмов коротко-интервальной ИГ. 

  Однако, следует подчеркнуть, что применение ИГ в неонатальном периоде имело гипертензивные последствия только у крыс, с генетической предрасположенностью к гипертензивному статусу.  Данная реакция у спонтанно гипертензивных крыс была обусловлена устойчивым повышением симпатической активности в покое и во время сна, что выявлено при спектральном анализе вариабельности сердечного ритма. Повышенному уровню гипертензии сопутствовала выявленная эхокардиографически дисфункция левого желудочка.

  Оценивая регулирующую роль рецепторов легких в условиях оксидантного стресса важно отметить, что рецепторный аппарат легких при активации его свободными радикалами не обнаружил связи с повышением активности в симпатических нервах. Реакцией рецепторов легких являлась  опосредованная исключительно блуждающим нервом рефлекторная стимуляция центральной инспираторной активности, угнетение экспираторной активности мышц и несильно обозначенная  тенденция к гипертензивным эффектам. Таким образом, можно полагать, что в  условиях ИГ ведущей причиной активации симпатической нервной  системы остаются  рефлексы с каротидных телец. Действительно,  в ходе 18- минутной острой ИГ было показано модулирование активности в почечном симпатическом нерве в соответствии с изменяющейся активацией хеморецепторов с последующим длительным  эффектом  последействия. 

Коротко-интервальная интермиттирующая гипоксия имела выраженные последствия для половой системы на уровнях от молекулярного до поведенческого. Одним из механизмов снижения эректильной функции у мышей в условиях ИГ могла явиться активация симпатической нервной системы.  Вызываемая повышением симпатической активности вазоконстрикция сосудов полового члена  усугублялась снижением сосудорасширяющих эффектов под действием эндотелиальной NOS, содержание которой в эректильной ткани падало в условиях ИГ.  Изменению сексуального поведения и эректильной дифункции могли способствовать также изменения под влиянием ИГ высшей нервной  деятельности, контролирующей эрекции (в частности психогенные).

Таким образом, на примере исследованных систем было показано, что коротко-интервальная ИГ сопровождается комплексом нарушений в функциях висцеральных систем, охватывающим изменения активности центральной и периферической нервной системы, функции хеморецепторов, состоянии периферических тканей. Действие ИГ в неонатальном периоде, характеризующемся повышенной чувствительностью к внешним воздействиям, сопряжено с постнатальным программированием сердечно-сосудистой патологии. В целом, показанные нарушения вносят ограничения в нормальное функционирование организма уменьшая резервные возможности его функций и  характеризуют коротко-интервальную ИГ как фактор, снижающий пластичность висцеральных функций и их адаптивные возможности. 

ВЫВОДЫ

  1.   Хроническая интермиттирующая гипоксия в неонатальном периоде приводит к нарушениям сердечно-сосудистой функции у взрослых крыс. Чувствительность барорефлекторного механизма контроля частоты сердечных сокращений в покое при этом наполовину снижается и не изменяется при последующих применениях острой интермиттирующей гипоксии. В то же время, у контрольных животных барорефлекторная чувствительность при острой гипоксии снижается почти на 50%.
  2.   Нейроморфологические исследования у крыс, подвергавшихся действию 30-дневной неонатальной интермиттирующей гипоксии, указывают на наличие долгосрочных повреждений в эфферентной иннервации сердца блуждающим нервом. Плотность проекций аксонов блуждающего нерва в интрамуральных сердечных ганглиях снижается на 172%, плотность варикозных терминалей аксонов на ганглионарных клетках составляет 443% от общего их числа у контрольных крыс. 
  3.   Взрослые крысы, подвергавшиеся интермиттирующей гипоксии в неонатальном периоде, характеризуются повышенной реактивностью симпатической нервной системы в ответ на стимуляцию хеморецепторов в условиях острой интермиттирующей гипоксии. Повышенная фоновая симпатическая активность сохраняется после окончания действия гипоксического стимула. Сочетание повышенной активности в симпатическом почечном нерве с ограничениями барорефлекторного контроля в условиях острой интермиттирующей гипоксии может приводить в к сверхактивации симпатической нервной системы и гипертензивным последствиям.
  4. Хроническая интермиттирующая гипоксия вызывает дегенерацию сердечных моторных нейронов в области nucleus ambiguus и нарушает глутамат-зависимую трансмиссию, что может влиять на снижение чувствительности барорефлекторного контроля частоты сердечных сокращений.
  5.   Сравнение эффектов интермиттирующей и постоянной гипоксии показывает, что оба вида гипоксии достоверно повышают содержание дофамина и норадреналина в каротидных тельцах, но не изменяют их содержания в симпатических ганглиях или надпочечниках. В каротидных тельцах оба вида гипоксии увеличивают общее содержание тирозингидроксилазы,  фосфорилирование ее сериновых остатков в положениях 19, 31, 41, а также содержание гуанидин трифосфат циклогидролазы-1. Эффекты периодической гипоксии на катехоламинэргические механизмы оказываются более слабыми и  отставленными во времени, по сравнению с  эффектами постоянной гипоксии.
  6.   Взрослые спонтанно гипертензивные крысы, генетическая модель развития гипертензии, подвергавшиеся действию периодической гипоксии в  неонатальном периоде, характеризутся существенным повышением артериального давления  во время бодрствования и отсутствием его снижения во время сна. У этих крыс обнаруживается патологическое ремоделирование левого желудочка сердца по концентрическому типу, сопровождающееся увеличением фракции выброса примерно на 20%,  достоверным уменьшением конечно-систолического и конечно-диастолического диаметров, увеличением толщины передней и задней стенки левого желудочка и его относительного размера по сравнению с контрольной группой.
  7.   Спектральный анализ вариабельности сердечного ритма в период сна  (R-R интервалы ЭКГ) у спонтанно гипертензивных крыс, подвергавшихся постнатальной  интермиттирующей гипоксии, обнаруживает увеличение отношения мощности низкочастотного симпатического (НЧ)  к высокочастотному вагусному (ВЧ) компоненту - НЧ/ВЧ, указывающие на изменение симпато-вагусного баланса в сторону относительного преобладания в покое симпатического возбужения, что может определять более выраженную гипертонию у этой группы крыс.
  8. Применение нифедипина (блокатора L-Ca2+ каналов) и миметика супероксиддисмутазы MnTMPyP пентахлорида у спонтанно гипертензивных крыс в период действия интермиттирующей гипоксии в неонатальном возрасте, устраняет вызванные гипоксией повышения систолического и диастолического давления, что указывает на прямую роль свободных кислородных радикалов и L-Ca2+ каналов в механизмах неонатального программирования гипертензивных реакций.
  9. Активная форма кислорода и медиатор воспаления Н2О2 при введении его в периферический участок легкого у искусственно вентилируемого кролика с открытой грудной клеткой  вызывает опосредованный блуждающим нервом инспираторно-возбуждающий рефлекс с латентным периодом около 2 с, угнетает активность экспираторных мышц,  слабо повышает артериальное давление. В отличие от Н2О2, медиатор воспаления брадикинин при введении в легкое стимулирует две афферентные системы - в составе блуждающего нерва и вневагусные висцеральные аффренты через специфические В1 и В2 рецепторы. Типичный эффект невагусных афферентов включает гипотонию, брадикардию, инспираторно и экспираторно- возбуждающие рефлексы с укорочение длительностей вдоха и выдоха и характерным временным ходом дыхательной реакции с максимумом эффекта через 40 с.
  10. Хроническая интермиттирующая гипоксия нарушает эректильную функцию и половое поведение мышей, вызывая снижение числа спонтанных эрекций, увеличение латентных периодов половой активности, угнетение психогенных механизмов половой активности, что показано с помощью новой телеметрической модели in vivo в контактных и бесконтактных тестах с самками мышей. В числе молекулярных механизмов эректильных дисфункций при интермиттирующей гипоксии показано снижение еNOS в эректильной ткани. Полученные данные демонстрируют роль интермиттирующей гипоксии в центральных и периферических механизмах половых дисфункций.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В ЖУРНАЛАХ, РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК (УКАЗАННЫЕ В SCIENCE CITATION INDEX EXPANDED):

  1. Сухова Г. К., Ноздрачев А. Д. Неонатальная интермиттирующая гипоксия уско-ряет развитие возрастных нарушений барорефлекторной чувствительности и вариабельности сердечного ритма // Доклады АН. 2008. Т. 420 №3. С. 421-423.
  2. Soukhova G.K., Ahmed M., Yu J., and Fletcher E.C. Hydrogen peroxide in the lung parenchyma stimulates vagally mediated phrenic activity // Chest. 1999. Vol. 116. P. 1365-1368.
  3. Yu J., WangY., Soukhova G., Collins L.C., and Falcone J.C. Excitatory lung reflex may stress inspiratory muscle by suppressing expiratory muscle activity // J. Appl. Physiol. 2001. Vol. 90. P. 857-864.
  4. Soukhova G., Wang Y., Ahmed M., Walker J.F., Yu J. Bradykinin stimulates respiratory drive by activating pulmonary sympathetic afferents in the rabbit // J. Appl. Physiol. 2003. Vol. 95. P. 241-249.
  5. Wang Y., Soukhova G., Proctor M., Yu J. Bradykinin causes hypotension by activating pulmonary sympathetic afferents in the rabbit // J. Appl. Physiol. 2003. Vol. 95. P. 233-240.
  6. Hui A.S., Striet J.B., Gudelsky G., Soukhova G.K., Gozal E., Beitner-Johnson D., Guo S.Z., Sachleben Jr. L.R., Haycock J.W., Gozal D., and Czyzyk-Krzeska M.F. Regulation of catecholamines by sustained and intermittent hypoxia in neuroendocrine cells and sympathetic neurons // Hypertension. 2003. Vol. 42. P. 1130-1136.
  7. Soukhova-OТHare G.K., Lei Z.M., Falcone J.C., Barati M.T., Feitelson J.B.A., Rao Ch.V., Fleming J.T. Bone medullary arterioles from ovariectomized rats have smaller baseline diameters but normal eNOS expression and NO-mediated dilation // Life Sci-ences. 2005. Vol. 77. P. 1799-1812.
  8. Soukhova-OТHare G.K., Roberts A.M., Gozal D. Impaired control of renal sympathetic nerve activity following neonatal intermittent hypoxia // Neurosci. Letters. 2006. Vol. 399. P. 181-185.
  9. Soukhova-OТHare G.K., Cheng Z., Zhang H., Roberts A.M, Gozal D. Postnatal inter-mittent hypoxia alters baroreflex function in adult rats // Am. J. Physiol. 2006. Vol. 290. P. H1157-H1164.
  10. Soukhova-OТHare G.K., Zhang J.W, Gozal D., Yu J. Bradykinin B2 receptors mediate pulmonary sympathetic afferents induced reflexes in rabbits // Life Sciences. 2006. Vol. 78. P. 1990-1997.
  11. Soukhova-O'Hare G.K., Schmidt MH, Nozdrachev AD, Gozal D. A novel mouse model for assessment of male sexual function // Physiol. & Behav. 2007. Vol. 91. P. 535Ц543. 
  12. Soukhova-OТHare G.K., Ortines R.V., Gu Y., Nozdrachev A.D., Prabhu S.D., Gozal D. Postnatal intermittent hypoxia and developmental programming of exaggerated hyper-tension and cardiac remodeling in SHR: potential role of ROS and L-Ca2+ channels // Hypertension. 2008. Vol. 52. P. 1-7.
  13. Soukhova-OТHare G.K., Shah Z.A., Lei Z., Nozdrachev A.D., Rao Ch.V., Gozal D. Erectile dysfunction in a murine model of sleep apnea (Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2008 Jun 5. [Epub ahead of print] PMID: 18535258 [PubMed - as supplied by publisher].
  14. Yan B., Soukhova-O'Hare G.K., Li L., Lin Y., Gozal D., Wеаds W.B., Wurster R., and Cheng Z. Effect of chronic intermittent hypoxia on nucleus ambiguus (NA) in young adult Fischer 344 rats: attenuation of heart rate control and neural degeneration.  Neuroscience. 2008.  Vol. 153(3). P. 709-720.

СТАТЬИ И СООБЩЕНИЯ В НАУЧНЫХ ЖУРНАЛАХ И СБОРНИКАХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

15. Сухова Г.К., Федин А.Н., Ноздрачев А.Д., Пушкарев Ю.П. Об участии механизмов обратной связи верхних и нижних дыхательных путей в регуляции дыхания// Пути оптимизации дыхательной функции при нагрузках, патологии и экстремальных условиях. Тверь.123-133, 1993.

16. Жданов В.А., Сухова Г.К. Иннервация ирритантных рецепторов у кошки// 30 лет ЦНИЛ СПб педиатр. Акад. 1994. СПб. С. 25.

17.  Пашкевич Б.П., Сухова Г.К. Влияние холиномиметиков на постинспираторный цикл у кошек при быстром уменьшении объема легких// 30 лет ЦНИЛ СПб. педиатр. Акад. 1994. СПб. С. 39-40.

18. Шумилова Т.Е., Сухова Г.К., Давыдова О.П., Авербух А.Г. Адаптация кардиоре-спираторной системы к умеренной ступенчатой нагрузке у нетренированных субъектов// Биохим. и биофиз. механизмы физиол. функций. 1995. С-Петербург. С. 205.

19. Yu J., Soukhova G.K., and Fletcher E.C. Unclassified pulmonary afferent may be responsible for excitatory pulmonary reflex // Abstr. Conf. Experimental Biol., San Fransisco, CA FASEB J. 1998.  Vol. 12, N. 5. P. A 782.

20. Soukhova G.K., Ahmed M., Fletcher E.C., Wang Y. and Yu J. Hydrogen peroxide (H2O2) can initiate excitatory lung reflex (ELR) // Abstr. Conf. Experimental Biol.,, Washington DC. FASEB J. 1999. Vol. 13, N. 5. P. A 636.5.

21. Ahmed M., Soukhova G.K., Fletcher E.C., and Yu J. Mechanism of hypertonic saline in activating excitatory reflex //  Abstr. ALA/ATS Int. Conf. April 23-28, 1999. San Diego, CA.

22.Yu J., Wang Y., Soukhova G.K., and Collins L. Excitatory lung reflex promotes inspiratory muscle fatigue by stimulating inspiration and by suppressing expiration // Abstr. Conf.  Experim. Biol. San-Diego, CA. FASEB J. 2000. Vol. 14. N.4. Axx.

23. Soukhova G.K., Wang Y., Ahmed M., and Yu J. Bradykinin alternates breathing stimulating both vagal and non vagal lung afferents // Abstr. Conf. Experim. Biol., San Diego, CA.  FASEB J. 2000. Vol. 14, N.4. P. A 781.

24. Yu J., Roberts A.M., Wang Y., and Soukhova G.K. Does hypertonic saline evoke the expiratory lung reflex by increasing fluid flux? // Abstr. Conf.  Exp. Biol.. San Diego, CA.  FASEB J. 2000. Vol. 14, N. 4. P. A 389.

25. Soukhova G.K., Wang Y., and Yu J. H2O2 may activate pulmonary vagal afferents and reflexly promote inspiratory muscle fatigue // Abstr. XXXIV Int. Congress of Physiol. Sci. 2001. Wellington, New Zealand.

26.  Wang Y., Soukhova G., and Yu J. Suppressive effects on hemodynamics by activation of pulmonary sympathetic afferents // Abstr. Conf. Experim. Biol. 2001. Orlando.

27.  Soukhova G.K., Fleming J.T., Rao Ch. V. Bone arterioles of young ovariectomized rats dilate more to acetylcholine than arterioles of control rats. Abstr. Conf. Experim. Biol. 2001. Orlando, FL.

28. Soukhova G.K., Roberts A.M., Lipton A.J., Gozal E., Gozal D. Early postnatal exposure to intermittent hypoxia attenuates baroreflex sensitivity in adult rats // Sleep. 2002. Vol. 25. P. 335.

29.  Soukhova G.K., Roberts A.M., Brittain K.R., Gozal D. Intermittent hypoxia during the first month of life is associated with long-lasting alterations in renal sympathetic nerve responses to subsequent hypoxia in male rats // Program No. 224.2.2002. Abstract Viewer. Washington, DC: Society for Neuroscience. 2002. CD-ROM.

30.  Cheng Z., Zang Z., Soukhova G.K., Yu J., Gozal D. Morphological remodeling and functional reduction of nucleus ambiguous (NA) axon terminals in the cardiac ganglia of aging F344 rats // Program No.116.12.2002. Abstract Viewer. Washington, DC: SFN Meeting. 2002. CD-ROM.

31. Soukhova G.K., Gozal D. Long-lasting plasticity of baroreceptor function following postnatal intermittent hypoxia in normotensive and hypertensive rats // 33rd Annual Meeting of the Society for the Neurosciences. 7-12 November, 2003. New Orleans, LA, Program No. 341.2.

32. Cheng Z., Zhang H., Soukhova G.K., Gozal D. Morphological changes of nucleus ambiguus (NA) projections to the cardiac ganglia in rats following postnatal intermittent hypoxia (IH) // 33rd Annual Meeting of the Society for the Neurosciences. 7-12 Nov. 2003. New Orleans, LA, Program No. 501.7.

33. Soukhova-OТHare G.K., Schmidt M.H., and Gozal D. A novel chronic mouse model for study of erectile dysfunction in sleep apnea syndrome // 34th SFN Meeting, San Diego, CA. 2004.

34. Schmidt M.H., Soukhova G., Chen E., Guo S.Z., Cheng Z., Shah Z., and Gozal D. Intermittent  hypoxia and erectile dysfunction in adult male rats // 34th SFN Meeting, San Diego, CA. 2004.

35.  Schmidt M.H., Soukhova G., Chen E., Guo S.Z., Cheng Z., and Gozal D. Intermittent hypoxia induces erectile dysfunction in adult male rats // 18th APSS Meeting. Philadelphia, PA. June 5-10, 2004.

36.  Soukhova G.K., Zhang J.W., Gozal D., Yu J. B2 bradykinin receptor mediates pulmonary sympathetic afferents induced reflex in rabbits // FASEB J. 2004.

37.  Soukhova-OТHare G.K., Siddiqui A.F., Gu Y., Ortines R.V., Prabhu S.D., Gozal D. Reactive oxygen species and calcium channels are involved in the cardiovascular effects following postnatal intermittent hypoxia in adult SHR rats // APS Meeting, San Diego, CA. 2005.

38.  Li Y., Yan B., Soukhova G., Gozal D., Cheng Z. Cellular loss in the nucleus ambiguus (NA) in F344 rats during aging and following chronic intermittent hypoxia (CIH) // SFN Meeting, Washington, DC. 2005.

39. Schmidt M.H., Soukhova G., Culp E., Gervasoni D., and Gozal D. Intermittent hypoxia causes deficits in copulatory erections without affecting serum testosterone levels //а19th APSS Meeting, 2005.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление

БРЧ - барорефлекторная чувствительность;

ВСР - вариабельность сердечного ритма;

ИГ Ц интермиттирующая гипоксия;

ОАС - обструктивное апноэ сна;

ЧСС - частота сердечных сокращений;

SHR  - спонтанно гипертензивные крысы;

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии