Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах рукописи

ЯКУШЕНКО

Елена Владимировна

Интерлейкин-18: биологические эффекты  и перспективы клинического применения

14.03.09 - клиническая иммунология,  аллергология

Автореферат

диссертации на соискание

ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор	Сергей Витальевич Сенников
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор	Владимир Сергеевич Кожевников
доктор медицинских наук, профессор	Юрий Геннадьевич Суховей
доктор медицинских наук, профессор	Иван Генрихович Козлов

 

Ведущее учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН

Защита состоится  л___________ 2012г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099 г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

Автореферат разослан  л_____________2011г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета

доктор медицинских наук О.П. Колесникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитокины, будучи эндогенными иммуномодуляторами,  имеют  универсальное значение в  регуляции практически всех систем организма. По сравнению с экзогенными модуляторами (химического, бактериального или растительного происхождения) цитокины оказывают свои эффекты через специфические рецепторы и являются естественными регуляторами функциональной активности различных типов клеток. Эти свойства обусловливают перспективы применения цитокинов в лечении и профилактике различных иммунопатологических заболеваний, а также для генерации различных типов клеток при проведении клеточной иммунотерапии. В настоящее время в клинической практике используется целый ряд лекарственных препаратов на основе цитокинов (ИФН, ФНО, ИЛ-1, ИЛ-2, ГМ-КСФ, Г-КСФ и т.д.). Вместе с тем, побочные эффекты цитокинов, связанные с плейотропным характером их действия и экспрессией  рецепторов на многих типах клеток отчасти ограничивают широкое внедрение указанных молекул в клиническую практику и диктуют необходимость всестороннего изучения биологических эффектов цитокинов.

Интерлейкин-18 (ИЛ-18) в ряду иммунорегуляторных медиаторов занимает особое положение, так как является одним из ключевых цитокинов, вовлеченных в формирование врожденного и приобретенного иммунного ответа. Обладая способностью стимулировать продукцию ИФН-, ГМ-КСФ [Dinarello C.A. et al., 1999; Udagawa N. et.al., 1997], ФНО [Fehniger T.A. et al., 1999; Moller B. et al., 2001], ИЛ-1 [Puren A.J., 1998], ИЛ-2 [Kohno K., 1997], молекул адгезии [Merendino R.A. et al. 2003; Wang J. et al., 2001] и факторов апоптоза Fas/FasL [Golab J., 2000], ИЛ-18 участвует в активации цитотоксических Т-лимфоцитов, НК-клеток, макрофагов, дендритных клеток и способствует формированию эффективного противоинфекционного и противоопухолевого иммунного ответа [Jablonska E. et al., 2006; Kito T. et al., 2003; Ueno N. et al.,  2005].

Способность ИЛ-18 активировать клеточный иммунитет обосновывает значительный интерес к данному цитокину в качестве потенциального индуктора протективного иммунитета при онкологических и  инфекционных процессах (вирусной и бактериальной природы). Действительно, многие заболевания сопровождаются снижением продукции иммунорегуляторных цитокинов и в частности ИЛ-18 [Vankayalapati R. et al.,  2000]. Важно отметить, что в функционально-активных участках промотора гена ИЛ-18 обнаружено несколько одиночных нуклеотидных полиморфизмов, которые могут влиять на  продукцию ИЛ-18. Поэтому уровень  продукции ИЛ-18  может быть обусловлен генетическими механизмами. Важную роль в регуляции ИЛ-18 играет также блокатор ИЛ-18 - ИЛ-18 связывающий белок (ИЛ-18СБ), представляющий собой физиологическую ловушку-рецептор. ИЛ-18СБ может являться перспективным фактором для отмены нежелательных действий ИЛ-18, поскольку нейтрализует его эффекторные функции [Novick D. et al.,  1999].

Учитывая перспективность клинического применения ИЛ-18 в лечении онкологических и инфекционных заболеваний, создание препаратов на основе ИЛ-18 и их тестирование является важной научно-практической задачей. Наиболее распространенными продуцентами, используемыми для получения генноинженерных форм цитокинов являются клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих. По сравнению с вышеупомянутыми системами экспрессии, растения, как продуценты иммунорегуляторных белков, имеют ряд преимуществ: гликозилирование и фолдинг белков схож с таковыми в клетках млекопитающих, культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы продукции гарантируют доступность рекомбинантного препарата. Однако сведения о биологических эффектах цитокинов и, в частности ИЛ-18, продуцируемых трансгенными растениями, практически отсутствуют.

Данные о значительной роли ИЛ-18 в регуляции большого числа иммунных реакций позволяют предположить, что ИЛ-18 и ИЛ-18СБ займут свое достойное место в арсенале препаратов для борьбы с множеством патологических состояний человека. Поэтому исследование биологических эффектов и механизмов действия рекомбинантного ИЛ-18, получаемого из различных источников (бактериальные и растительные продуценты) представляется чрезвычайно актуальным. При этом, учитывая особенности эффектов ИЛ-18, одним из востребованных направлений является разработка протоколов и схем использования этого белка не только в клинической практике, но и для регуляции функциональной активности  клеток иммунной системы in vitro, что может быть успешно использовано при создании новых клеточных технологий. Поскольку имеются  данные об эффективности перорального введения антигенов и цитокинов и использованию трансгенных растений, нам также представлялось актуальным оценить эффекты перорального применения трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека.

       В связи с вышесказанным была сформулирована цель работы: изучить биологические эффекты ИЛ-18 in vitro и на экспериментальных моделях животных in vivo, эффективность его использования  в клеточных технологиях, а также при пероральном применении в составе трансгенных растений.

В рамках поставленной  цели решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать иммунохимическую и биологическую активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18, полученного по оригинальной методике, в реакции иммуноанализа, по способности стимулировать продукцию ИФН-, ФНО мононуклеарными клетками in vitro и реакцию гиперчувствительности замедленного типа in vivo.
2. Охарактеризовать иммунохимическую и биологическую активность рекомбинантного ИЛ-18 связывающего белка, полученного по оригинальной методике, в реакции иммуноанализа, по способности отменять специфические эффекты эндогенного и рчИЛ-18 в экспериментах in vitro и в модели ЛПСЦиндуцированной летальности экспериментальных животных in vivo.
3. Изучить противоопухолевую активность рекомбинантных ИЛ-18 и ИЛ-18 связывающего белка в экспериментальных моделях перевиваемых опухолей (ортотопической солидной и гематогенной меланомы В16) у мышей.
4. Изучить ассоциированность аллельного полиморфизма промотора гена ИЛ-18 в  позициях -607 и - 137 с уровнем его продукции мононуклеарными клетками периферической крови человека.
5. Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов в промоторе гена ИЛ-18 в  позициях -607 и - 137 в мононуклеарных клетках здоровых доноров и больных вирусным гепатитом В.
6. Изучить эффективность использования рИЛ-18 для индукции специфического иммунного ответа в культуре мононуклеарных клеток в присутствии дендритных клеток, нагруженных антигенами  вируса гепатита В и M. tuberculosis.
7. Изучить биологические эффекты модифицированной по гену ИЛ-18 моркови Daucus carota L. в экспериментальных моделях на мышах при пероральном применении.

Научная новизна.

Впервые установлено, что блокирование ИЛ-18 с помощью ИЛ-18 связывающего белка полностью ингибирует продукцию ФНО КонА-стимулированными мононуклеарами человека (МНК). Установлено, что ИЛ-18 при введении in vivo оказывает разнонаправленный эффект на опухолевый рост в зависимости от модели опухолевого процесса, в частности ингибирует рост солидной опухоли и увеличивает количество метастатических очагов в модели гематогенной меланомы В16 у мышей. Получены новые данные о связи уровня продукции ИЛ-18 с аллельным полиморфизмом промотора гена в позиции -607 и - 137. Впервые выявлено снижение частоты встречаемости генотипов Ц607AA и Ц607AA/-137CG у больных хроническим вирусным гепатитом В и увеличение частоты встречаемости генотипа -607CC/-137CC, ассоциированного с низким уровнем спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-18 МНК.  Получены новые данные об эффективности использования рИЛ-18 для стимуляции иммунного ответа МНК  in vitro, в том числе, при совместном культивировании с дендритными клетками (ДК). В частности, добавление рИЛ-18 приводит к выраженной стимуляции антиген-индуцированной продукции ИФН-, достоверному повышению содержания ИФН-продуцирующих клеток. Впервые установлено, что ИЛ-18, экспрессируемый растительной клеткой, при пероральном применении оказывает характерные для него специфические эффекты в экспериментальных моделях на животных.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

       Блокирование продукции ФНО в культурах МНК в присутствии рИЛ-18 СБ свидетельствует о важной роли системы ИЛ-18/ИЛ-18СБ в регуляции провоспалительной активности мононуклеарных клеток. Способность ИЛ-18 ингибировать рост ортотопической солидной меланомы В16, а ИЛ-18СБ -  гематогенной метастатической меланомы указывает на существование различных механизмов подавления опухолевого роста указанными белками. Выявленная ассоциация продукции ИЛ-18 с аллельными вариантами промоторного региона гена ИЛ-18 в позициях -607 и -137 свидетельствует о генетической детерминированности уровня продукции ИЛ-18. В свою очередь установленное возрастание частоты встречаемости генотипов, ассоциированных с низким уровнем продукции ИЛ-18 при хроническом вирусном гепатите В указывает на патогенетическую значимость ИЛ-18 при данной патологии.

       Характеристика полученных по оригинальной методике белков ИЛ-18 и ИЛ-18СБ свидетельствует о возможности их использования в дальнейшей разработке лекарственных средств. Продемонстрированная эффективность  рИЛ-18 в подавлении роста солидных опухолей и ИЛ-18СБ в гематогенной метастатической модели обосновывает целесообразность применения этих белков для цитокиновой и антицитокиновой иммунотерапии при онкопатологии. Способность рИЛ-18 усиливать функциональную активность мононуклеарных и дендритных клеток in vitro свидетельствует об эффективности использования данного цитокина при разработке клеточных технологий, в том числе на основе дендритных клеток. Эффективность перорального применения трансгенной моркови, экспрессирующей ген ИЛ-18 человека, является экспериментальным обоснованием создания нового поколения иммуноактивных субстанций на основе трансгенных растений.

Положения, выносимые на защиту.

1. ИЛ-18 и ИЛ-18СБ оказывают противоопухолевые эффекты в зависимости от типа и стадии опухолевого процесса.
2. Полиморфные варианты в промоторном участке гена ИЛ-18 (в позициях -607 и -137) ассоциированы с различными уровнями продукции белка и частотой встречаемости у больных хроническим вирусным гепатитом В.
3. Использование рИЛ-18 эффективно для стимуляции клеточных иммунных реакций при взаимодействии ДК, презентирующих различные антигены, и мононуклеаров периферической крови.
4. Использование трансгенных растений, экспрессирующих ген ИЛ-18 человека, эффективно для модуляции иммунных реакций при пероральном применении.

ичный вклад автора в проведение исследования.

Все представленные результаты экспериментальных исследований полунчены лично автором или при его непосредственном участии.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г), 2) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2003г), 3) объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004г.), 4) 8-ом Всероссийского научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004г), 5)  конференции Технология и онкология (Санкт-Петербург, 2005г), 6) 4-ой конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005г), 7) Всероссийском научном симпозиуме Цитокины, стволовая клетка, иммунитет (Новосибирск, 2005г), 8) Всероссийской научно-практической  конференции посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. Дни  иммунологии в Сибири (Красноярск, 2005г), 9) Московской международной конференции Биотехнология и медицина (Москва, 2006г), 10) конференции Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике 7-ой отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2006г), 11) Московской международной конференции Биотехнология и медицина (Москва, 2006г), 12) Российской научно-практической конференции Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия (Курск, 2006г), 13) III Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск,  2007г), 14) Межрегиональной научно-практической конференции Дни иммунологии в Сибири (Омск, 2007г), 15) Межрегиональной научно-практической конференции Дни иммунологии в Сибири (Красноярск, 2010г), 16) Всероссийской научной конференции Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии (Новосибирск, 2010г), 17) Annual conference on cancer immunotherapy and vaccination (Czech Republic, Mikulov, 2011). Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании Проблемной комиссии МНС 55.07 Иммунология с участием сотрудников НИИ клинической иммунологии СО РАМН 30 июня 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 69 работ, из них  24 статьи, из них 14 статей в изданиях, включенных в системы цитирования, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертанционных работ. Получено 3 патента.

Структура и объем диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения полученнных результатов, заключения и выводов. Диссертация изложена на 210астраницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунками и 4атаблицами. Список цитируемой литературы включает 245 источников, из них 11 работ отечественных авторов.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммунологии  (руководитель лаборатории  д.м.н., проф. Сенников С.В.)  НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объекты исследования:

Лабораторные животные. В работе использовались мыши линии C57Bl/6, BALB/c и гибриды (CBA×C57Bl/6)F1 (CBF1). Мыши получены из лаборатории экспериментальных моделей НИИКИ СО РАМН.  Содержали животных в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.

Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови условно здоровых доноров в возрасте от 20 до 50 лет. МНК больных хроническим гепатитом В,  находящихся на лечении в Муниципальной инфекционной больнице №1 и Новосибирском областном центре по борьбе с ВИЧ-инфекцией (30 человек). МНК пациентов, больных туберкулезом легких, получающих стандартную терапию на базе Новосибирского НИИ туберкулеза (30 человек).

ДНК лейкоцитов периферической крови условно здоровых доноров в возрасте от 20 до 50 лет (147 человек) и доноров положительных по HbsAg (107 человек) в возрасте от 20 до 50 лет, сыворотка периферической крови условно здоровых доноров (147 человек) в возрасте от 20 до 50 лет.

Экспериментальные модели.

Перевиваемые опухолевые модели - Меланома В16. Для данных экспериментальных моделей использовалась перевиваемая клеточная линия мышиной меланомы В16. Клетки вводили подкожно в район холки - солидная опухоль, либо внутривенно - гематогенная модель - в количестве 2x 105 на мышь, в объеме 0,3 мл. Для проведения опытов использовались мыши линии С57Bl/6. На 23 день измеряли вес солидной опухоли. Опухолевый процесс в гематогенной модели оценивали, подсчитывая количество и измеряя диаметр метастазов в легких у каждого животного. Выживаемость оценивали ежедневно до последней мыши.

Канцероген-индуцированная аденокарцинома легких мыши. Индукция опухоли проводилась на мышах линии BALB/c, вес животных на момент начала опыта составлял 20-24гр. Раствор уретана (10%) вводили внутрибрюшинно (в/б), из расчета 0,7мг уретана на 1 грамм веса мыши в течение месяца с интервалом в 3 дня (8 раз) [Ложкин И.Д., 1996; Bentel J. et al.,  1989]. Выраженность опухолевого процесса оценивали путем подсчета количества аденоматозных образований и измерением среднего диаметра опухолевых узлов у каждого животного.

ипополисахарид-индуцированная летальность. Опыт проводили на мышах линии BALB/c в возрасте 2 месяцев. Мышам в/б вводили ИЛ-18СБ в дозе 5 мг/кг и затем через 10 минут в/б ЛПС (E.coli 0111:В4) в дозе 15 мг/кг. Выживаемость оценивали в течение недели ежедневно [Faggioni R. et al., 2001].

Пероральное применение Daucus carota L. Мыши получали дополнительно к стандартному рациону, в течение времени указанного для каждого опыта, морковь обычную или несущую ген ИЛ-18, в дозе 1,7-2 г/мышь ежедневно.

Оценка клеточного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ). Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [Yaoshikai Y. et al.,  1979].

Гистологическое и морфологические исследования меланомы. Солидную опухоль фиксировали в 10% нейтральном формалине, заключали в парафин. Срезы толщиной 5-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.  В тестовом поле определяли частоту встречаемости митозов опухолевых клеток, оценивали количественно и качественно инфильтрацию окружающих тканей, определяли размер некроза, оценивали ангиогенез опухоли. 

Методы выделения и культивирования клеток мыши и человека.

Получение и культивирование спленоцитов мышей. Селезенку выделяли в полустерильных условиях. Клетки выделяли путем ресуспендирования в среде RPMI-1640 и центрифугирования при 1000 оборотов/мин в течение 10 минут. Оценку жизнеспособности клеток проводили методом исключения трипанового синего или эритрозина [Гольдберг Е.Д., 1992]. Для стимуляции использовали Конканавалин А (КонА) (5 мкг/мл). Время культивирования - 48 и 72 часа во влажной атмосфере при температуре +37С и при концентрации СО2 5%.

Выделение и культивирование мононуклеарных клеток периферической крови человека (МНК). Для исследований использовали гепаринизированную венозную кровь (50 Ед на 1 мл крови). МНК выделяли стандартно, путем центрифугирования венозной крови в градиенте плотности фиколл-урографина (р=1,082 г/л) .  Для стимуляции МНК использовали КонА (5 мкг/мл). Время культивирования - 24, 48 или 72 часа во влажной атмосфере при температуре +37С и при концентрации СО2 5%.

Получение дендритных клеток (ДК).

Моноциты периферической крови выделялись методом адгезии на пластике. Прилипшую фракцию культивировали в 48-луночном планшете в количестве 1 млн/мл в полной среде RPMI-1640. Для презентации антигена незрелым дендритным клеткам (нДК) больных гепатитом В (ВГВ) использовали rHBcAg (НПО Диагностические Системы, Нижний Новгород) (5 мкг/мл, 2 часа), для нДК больных туберкулезом использовали специфический антиген M.аtuberulosis ESAT-6 (Statens Serum Institut, Дания) в дозе 3 мкг/мл.

Для генерации ДК использовали следующие протоколы:

Протокол 1 (для генерации ДК пациентов ВГВ): дифференцировка 50 нг/мл рчГМ-КСФ, 100 нг/мл рчИЛ-4 в течение 24 часов, презентация антигена 2 часа, созревание рчФНО- (25 нг/мл) в течение 24 часов.

Протокол 2 (для генерации ДК пациентов с туберкулезом легких): дифференцировка  50 нг/мл рчГМ-КСФ, 100 нг/мл рчИЛ-4 в течение 24 часов, презентация антигена 2 часа, созревание ЛПС (штамм 055:B5, Sigma) (5 мкг/мл) в течение 24 часов.

Совместное культивирование ДК и МНК проводилось в течение 48 часов, соотношение МНК:ДК=10:1. Для совместного культивирования использовали аутологичные МНК, истощенные по моноцитарной фракции. Совместное культивирование проводили в присутствии или отсутствии рчИЛ-18 - 40 нг/мл.

Оценка пролиферативной активности клеток проводилась по включению 3Н-тимидина в нуклеопротеидные фракции клеток с помощью прибора Cell Harvester (Flow Labs).

Определение количественного содержания цитокинов электрохемилюминесцентным методом (ЭХЛ). Исследование проводили по описанной ранее методике [Sennikov S.V. et al., 2000]. 

Определение цитокинов методом ИФА. Уровень ИЛ-18 (наборы Bender Med Systems, Австрия), ИЛ-4, ИНФ-, ФНО (Вектор-Бест, Россия) оценивали в сыворотке и супернатантах МНК согласно заводской инструкции.

ELISpot анализ. ELISpot анализ проводился согласно заводской инструкции (R&D system, США).

Определение содержания перфорин-позитивных клеток проводили методом проточной цитофлюорометрии с использованием лазерного клеточного сортера-анализатора FACSCalibur (Becton Dickinson, США) в общем лимфоцитарном регионе.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили с помощью набора Проба-НК (ДНК-технология, Россия) согласно заводской инструкции.

Определение генотипов ИЛ-18 проводили методом аллель специфической амплификации с флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени (Real-time PCR). Для проведения специфической амплификации использовали четыре праймера, два специфических к полиморфизму в позиции - 607 и два специфических к полиморфизму в - 137. ПЦР проводили в амплификаторе MiniOptocon (Bio-Rad, USA).

Статистическая обработка данных производилась при помощи методов параметрической (t-критерий Стьюдента) и непараметрической (тесты Манн-Уитни и Уилкоксона) статистики с использованием программ Statistica 6.0 и Epi Info. Для оценки выживаемости животных в экспериментальных моделях in vivo использовали тест log-rank. Для выделения качественно отличающихся между собой уровней продукции ИЛ-18 при изучении ассоциированности полиморфных вариантов с уровнем продукции ИЛ-18, использовали методы квантильно-ранговой классификации по алгоритму Мостеллера и Тьюки [Мостеллер Ф., 1982]. В процессе проведения анализа для  эмпирически наблюдаемых концентраций ИЛ-18 вычисляли вероятностные границы квантилей эмпирических распределений - X(qi). Число квантильных диапазонов (K), на которое разбивался общий размах вариации уровня ИЛ-18, вычисляли исходя из объема минимальной выборки (Nmin) по формуле Стерджеса [Лакин Г.Ф., 1990]. Для суждения о достоверности различий встречаемости качественных признаков и частоты событий в различных диапазонах варьирования уровня ИЛ-18, применяли критерий 2 (P) и точный метод Фишера для малых выборок (Pтмф) [Лакин Г.Ф., 1990; Гублер Е. В., 1978]. Для оценки частотного распределения генотипов по уровням секреции ИЛ-18 использовали квантильно-ранговый анализ. Расчет соответствия частот встречаемости генотипов распределению Харди-Вайнберга использовали критерий 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и характеристика рчИЛ-18

В ИХБФМ СО РАН (г. Новосибирск) по оригинальной методике было получено несколько партий рчИЛ-18, все они были протестированы на приборе ORIGEN методом ЭХЛ для выбора оптимального способа получения, выделения и хранения препарата. В качестве стандарта использовался рИЛ-18 фирмы PeproTech. В результате проведенных исследований был выбран рчИЛ-18, который сохранял свою иммунохимическую активность в течение 21 дня хранения при +40С (рисунок 1).

Рис. 1. Изучение иммунохимической активности рИЛ-18 при хранении.

Примечание: Для калибровочных кривых использовались: рИЛ-18 (ИХБФМ),  меченные рутением моноклональные антитела (PeproTech) и меченные биотином кроличьи поликлональные антитела.

1-сразу после разведения; 2 - 21 день хранения при +40С

       По литературным данным известно, что ИЛ-18 индуцирует продукцию ИФН-γ, причем следует отметить, что он способен активировать ее как самостоятельно, активируя АР-1 сайт промоторного региона ИФН-γ, так и совместно с ИЛ-12, который влияет на продукцию ИФН-γ только после активации костимуляторной молекулы CD28 на Т-лимфоцитах [Barbulescu K., 1998]. Нами было выявлено достоверное повышение продукции ИФН-γ МНК в ответ на моностимуляцию рИЛ-18 (40нг/мл). Также в нашем эксперименте показано, что рИЛ-18 способен увеличивать продукцию ФНО МНК по сравнению со спонтанной продукцией (рисунок 2). Интересно отметить, что рИЛ-18 значительно потенцирует стимулирующий эффект Т-клеточного митогена КонА на продукцию ФНО, причем наблюдается не суммирование эффектов этих эффекторных молекул (КонА - 414,3пг/мл; рИЛ-18 Ч 300,2пг/мл, КонА+рИЛ-18 - 1224 пг/мл), а именно суперпродукция ФНО МНК при совместной стимуляции КонА+рИЛ-18.

Рис.2. Влияние рИЛ-18 на продукцию ФНО и ИФНγ МНК человека.

Примечание: Клетки культивировали 24 и 48 часов, соответственно, в присутствии КонА (5 мкг/мл) и/или рчИЛ-18(40нг/мл). Данные представлены как медиана и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0.05.

       По результатам исследований [Kares R. et al., 2000] известно, что гомология человеческого и мышиного ИЛ-18 довольно высока, в частности 5'-фланкирующий регион гена ИЛ-18 идентичен на 75%, а аминокислотная последовательность на 65% [Ushio S. et al., 1996].  Исходя из этого мы посчитали возможным изучить отдельные эффекты биологической активности рчИЛ-18 в экспериментальных моделях на мышах.

       Показано, что у мышей с нокаутом гена ИЛ-18 развивается сниженный клеточный иммунный ответ, что выражается в снижении реакции ГЗТ [Kawakami K. et al.,  1997], при этом следует отметить, что при нокауте гена  ИЛ-12, ИЛ-18, тем не менее, стимулирует реакцию ГЗТ [Kitching A. R. et al., 2000]. Изучение клеточного иммунного ответа показало, что рИЛ-18 (1мкг/мышь) стимулирует реакцию ГЗТ (рисунок 3), что согласуется с данными, полученными рядом авторов в других экспериментальных моделях, и говорит о том, что полученный препарат рИЛ-18 обладает специфической активностью и способен сдвигать баланс иммунного ответа у интактных животных в сторону клеточного иммунного ответа.

Таким образом, рИЛ-18, полученный по оригинальной методике, обладает специфической иммунохимической активностью, стабилен при хранении и обладает биологической активностью,  стимулируя продукцию ФНО и ИФН-γ МНК человека in vitro, а также активируя реакцию гиперчувствительности замедленного типа в системе in vivo у мышей.

Получение и характеристика  ИЛ-18СБ

В ИХБФМ СО РАН был получен ИЛ-18 связывающий белок (ИЛ-18СБ). Установлено, что полученный по оригинальной методике рИЛ-18СБ калибровался в реакции иммуноанализа с использованием как набора состоящего из пары поликлональных кроличьих антител (полученных нами), так и набора состоящего из поликлональных кроличьих антител и поликлональных антител фирмы R&D (данные не приводятся).

Следует отметить, что человеческий ИЛ-18СБ также как и ИЛ-18 имеет высокую гомологию по аминокислотному составу с белком мыши и крысы [Im S. H. et al.,  2002]. Кроме того, существуют исследования и других авторов также с использованием рекомбинантного человеческого ИЛ-18СБ у мышей, где была показана его эффективность [Romero J. F. et al.,  2007].

Биологическая активность ИЛ-18СБ, который проявляет свое действие, блокируя эффекты ИЛ-18, была исследована в эксперименте по влиянию на продукцию ФНО культурой МНК человека. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что ИЛ-18СБ отменяет  стимулированную рчИЛ-18 продукцию ФНО культурой МНК человека. Более того, ИЛ-18СБ отменяет не только продукцию ФНО, стимулированную ИЛ-18, но и КонА и КонА+рчИЛ-18, который в свою очередь еще больше потенцирует продукцию ФНО, стимулированную этим митогеном.  Этот факт может свидетельствовать о том, что эндогенный ИЛ-18 в данной ситуации является одним из ключевых факторов, запускающих каскад реакций в ответ на КонА, поскольку продукция ФНО снижается во всех случаях до спонтанного уровня (рисунок 4).

Для исследования биологической активности рИЛ-18СБ in vivo была использована модель ЛПС-индуцированной летальности мышей [Faggioni R, 2001].  В нашем опыте рИЛ-18СБ (5мг/кг), введенный в/б за 10 минут до инъекции ЛПС (15 мг/кг, LD90), достоверно увеличивал выживаемость мышей по сравнению с контрольной группой (рисунок 5). Поскольку в этой модели ИЛ-18СБ показал себя эффективным блокирующим летальность мышей фактором, можно утверждать, что эндогенный ИЛ-18 является одним из центральных медиаторов, запускающих каскад реакций после введения липополисахарида.

Таким образом, полученный рчИЛ-18СБ обладает биологической активностью в тесте in vitro, отменяя влияние ИЛ-18 на продукцию ФНО мононуклеарами периферической крови, и в тесте in vivo значительно снижая уровень ЛПС-индуцированной летальности мышей. И, что немаловажно, следует отметить, что ИЛ-18СБ, являясь специфическим блокатором ИЛ-18, способен блокировать каскад событий, запускаемых КонА и ЛПС, что свидетельствует о важной роли ИЛ-18 в этих реакциях.

Рис.4. Влияние рИЛ-18СБ на продукцию ФНО в культуре МНК человека.

Примечание: Клетки культивировали 24 часа в присутствии различных стимуляторов. Данные представлены как медианы и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0,05.

Противоопухолевая активность рИЛ-18 и рИЛ18СБ

Механизмы противоопухолевой активности ИЛ-18 включают в себя: усиление продукции ряда провоспалительных цитокинов, экспрессии FasL на НК и Т-клетках [Tsutsui H. et al., 1996], увеличение цитотоксической активности НК и Т-клеток [Ushio S. et al., 1996], ингибирование ангиогенеза [Coughlin C.M. et al.,  1998], активацию экспрессии молекул адгезии и хемокинов, а также стимуляцию продукции ИФН-, который сам обладает рядом противоопухолевых свойств [Okamura H. et al., 1995]. Данные механизмы предполагают прямое и опосредованное влияние ИЛ-18 на опухолевый процесс.

       Мы исследовали биологическую активность полученного рИЛ-18 в опыте с перевиваемой ортотопической мышиной меланомой В16. Показано, что введение мышам рИЛ-18 (1мкг/мышь, в/в) 1-, 2- и 3-кратно через день после инокуляции опухолевых клеток приводит к снижению веса солидной меланомы В16, причем при двух- и трехкратном введении ИЛ-18 обнаружена тенденция к более выраженному снижению веса опухоли, чем при однократном (статистической достоверности не показано) (рисунок 6). Качественное гистологическое исследование опухоли показало, что исследуемый препарат рИЛ-18 подавляет митотическую активность опухолевых клеток меланомы В16, усиливает дегенеративные процессы, уменьшает васкуляризацию ткани опухоли и повышает ее инфильтрацию лимфоцитами и макрофагами. Продолжительность жизни экспериментальных животных при  1-, 2- и 3-кратном введении рИЛ-18 статистически достоверно увеличивалась в сравнении с контрольной группой. Статистически значимого влияния кратности введения рчИЛ-18 на вес опухоли и выживаемость экспериментальных животных не обнаружено.

Рис.6. Влияние рИЛ-18 на вес солидной меланомы В16 и выживаемость.

Примечание: Клетки меланомы В16 вводили п/к в район холки в количестве  200 тыс/мышь мышам линии С57BL6. ИЛ-18 (1мкг/мышь) или физ. раствор  вводили в/в через день. Взвешивание опухоли проводили на 23 день. Выживаемость оценивали ежедневно до последней мыши. Данные представлены как медиана и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены достоверные различия при р< 0.05.

Группы: 1- интактная; 2- контроль 3-кратно в/в (физ. раствор); 3- рИЛ-18  в/в 1-кратно; 4-  рИЛ-18  в/в 2-кратно; 5-  рИЛ-18  в/в 3-кратно

Несмотря на то, что ИЛ-18 активно участвует в противоопухолевой защите организма, некоторые его свойства могут проявлять двойственную активность. Например, стимулируя экспрессию молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1, ИЛ-18 может способствовать инфильтрации опухоли иммунокомпетентными клетками [Yamada M. et al.,  2005], однако это же качество может являться патогенетическим фактором при метастазировании злокачественных новообразований [Vidal-Vanaclocha F. et al.,  2000]. Исходя из этого, рчИЛ-18СБ, как блокатор эффектов ИЛ-18 и, в том числе, как ингибитор экспрессии молекул адгезии [Carrascal M. T. et al., 2003], был исследован в гематогенной модели мышиной меланомы В16.

Показано, что введение рИЛ-18 увеличивает интегративный количественный показатель (ИКП) опухолевого процесса, определяемый как произведение количества и диаметра метастазов. Введение рИЛ-18СБ как внутривенное, так и внутрибрюшинное статистически достоверно снижает этот показатель по сравнению с контрольной группой и группой с введением рИЛ-18 (рисунок 7).

Группы: контроль-введение В16 (200тыс/мышь) и физ. раствора (в/в 3х-кратно); 2-рИЛ-18 (в/в 1мкг/мышь 3х-кратно); 3- рИЛ-18СБ (в/в 3мкг/мышь 3х-кратно); 4- введение рИЛ-18СБ (в/б 3мкг/мышь 3х-кратно ежедневно после введения В16).

Исследование противоопухолевой активности рИЛ-18 и рИЛ-18СБ показало, что рчИЛ-18 снижает вес солидной меланомы В16 и увеличивает выживаемость животных, а рИЛ-18СБ уменьшает количество метастазов в легких мышей в модели гематогенной меланомы В16, т.е. оба полученных белка проявляют активность в различных экспериментальных моделях соответственно своим биологическими свойствам, что свидетельствует о существовании различных механизмов подавления опухолевого роста указанными белками.

Эндогенный ИЛ-18 участвует во многих процессах в организме, и наряду с участием в формировании иммунного ответа, этот белок является патогенетическим звеном многих заболеваний. Как известно, индивидуальная восприимчивость организма к инфекциям определяется патогенностью микроорганизма, факторами окружающей среды и состоянием иммунной системы. Различия в генах, контролирующих защитные реакции организма, могут определять различный характер протекания воспалительного ответа и специфических иммунологических реакций при внедрении патогенов. В первую очередь это касается генов регуляторных молекул, обеспечивающих начальные этапы развития воспалительной реакции: распознавание патогена, проведение внутриклеточного активационного сигнала и синтез медиаторов развития воспалительной реакции, в состав которых входят и цитокины [Agnese D. et al.,  2002]. Наиболее частым изменением структуры генов является так называемый полиморфизм единичных нуклеотидов, определяющий функциональный полиморфизм различных генов, связанный с количественными изменениями их функционирования. Эти генетические различия вносят важный вклад в индивидуальные особенности развития защитных реакций и предрасположенность к целому ряду заболеваний. В первую очередь это касается генов регуляторных молекул воспаления, к которым относится ИЛ-18. Полиморфизм генов цитокинов, в частности в промоторном регионе, может быть одним из механизмов, который участвует в формировании индивидуальной вариабельности уровня продукции белка. При патологии этот феномен может иметь значение, поскольку цитокины, и ИЛ-18, в частности, являются ключевыми факторами формирования эффективного  иммунного ответа.

Изучение полиморфизма промоторного региона гена ИЛ-18

Изучение ассоциированности продукции ИЛ-18 в культуре МНК ПК здоровых доноров  с генотипом  - 607 С→А  ИЛ-18.

       Известные полиморфные варианты промотора гена ИЛ-18  -607C→A и -137G→C, расположенные в сайтах связывания для транскрипционных факторов CREB, и H4TF-1 ядерного фактора, соответственно, могут влиять на экспрессию ИЛ-18 и приводить к изменению уровня его продукции [Giedraitis V. et al.,  2001].

Для исследования наличия ассоциированности аллельных вариантов гена ИЛ-18 и уровня его продукции было проведено исследование концентрации ИЛ-18 в кондиционных средах МНК здоровых доноров. Средний уровень продукции ИЛ-18 составил для спонтанной продукции 48,073,96 пкг/мл, для ЛПС-стимулированной -  80,424,56 пкг/мл. Далее при сопоставлении уровня продукции ИЛ-18 МНК здоровых доноров с вариантами генотипа ИЛ-18 в позиции - 607 были получены следующие данные. Показано статистически значимое увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК здоровых доноров несущих генотип СА по сравнению с генотипом СС в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 (рисунок 8). Поскольку сопоставление средних величин продукции не всегда отражает реальный уровень продукции белка у каждого конкретного индивида, мы исследовали различные уровни продукции ИЛ-18 МНК здоровых доноров в сопоставлении с генотипами промотора гена ИЛ-18. При исследовании частотных распределений генотипов ИЛ-18 в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 показано статистически значимое увеличение частоты встречаемости аллеля А в позиции - 607 промотора гена ИЛ-18 у лиц с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18 (данные не представлены).

Таким образом, показано увеличение частоты встречаемости носителей аллеля А среди доноров с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18 и статистически достоверное увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18, ассоциированное с генотипом -607СА по сравнению с генотипом -607СС.

Изучение ассоциированности продукции ИЛ-18 в культуре МНК ПК здоровых доноров  с генотипом  -137G→C  ИЛ-18.

Далее уровень продукции ИЛ-18 был сопоставлен с полиморфными вариантами -137 С→G промоторного участка гена ИЛ-18 (рисунок 9). Показан статистически значимо меньший уровень ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК у лиц несущих генотип СС относительно лиц с генотипом GG в позиции -137 промотора гена ИЛ-18. Для дальнейшего исследования провели анализ частотных распределений генотипов для различных уровней продукции ИЛ-18, оценив ассоциированность частоты встречаемости изучаемых аллельных вариантов с разными уровнями продукции ИЛ-18. Показано статистически значимое увеличение частоты встречаемости аллеля С в позиции - 137 промотора гена ИЛ-18 у лиц с низким уровнем ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18.

Таким образом, показана сниженная ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 у лиц с генотипом СС относительно доноров с генотипом GG в позиции -137 промотора гена ИЛ-18, так же наблюдается повышение частоты встречаемости доноров несущих аллель С в группе с низким уровнем стимулированной продукции ИЛ-18, т.е. аллель С в позиции -137 промотора гена ИЛ-18 ассоциирован с низким уровнем продукции ИЛ-18 МНК ПК.

Изучение влияния генотипа промотора гена ИЛ-18 на уровень продукции ИЛ-18 в культуре МНК.

Поскольку оба изучаемых нами полиморфизма находятся в неравновесном сцеплении, мы исследовали все возможные комбинации аллелей. Показано, что наличие минорного генотипа -607CN/-137GN ассоциировано с повышенной спонтанной продукцией ИЛ-18 в сравнении с минорными генотипами -607АА/-137GN и -607CN/-137СС. Увеличение ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 ассоциировано с минорным генотипом  -607CN/-137GN в сравнении с -607CN/-137СС (рисунок 10).

Рис. 10. Ассоциированность уровня продукции ИЛ-18 МНК с полиморфными вариантами -607/-137 промотора гена ИЛ-18

Примечание: Данные представлены в виде медианы и размаха квартилей. (n=143) Стрелками обозначены достоверные различия при р<0,05

Для исследования ассоциированности генотипов промотора ИЛ-18 с уровнем спонтанной и стимулированной продукции был проведен сравнительный анализ между каждым генотипом в сравнении с остальной популяцией, исключая исследуемый генотип. Показано: пониженная спонтанная продукция ИЛ-18 связана с генотипами -607СС/-137СС и -607АА/-137GC, сниженная стимулированная продукция связана с генотипом -607СС/-137СС.

Таким образом, показана сниженная ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-18 у лиц с генотипом СС относительно доноров с генотипом GG позиции -137 промотора гена ИЛ-18, так же показано повышение частоты встречаемости доноров несущих аллель С в группе с низким уровнем ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18. Показано статистически значимое увеличение уровня ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-18 МНК здоровых доноров несущих генотип СА по сравнению с генотипом СС в позиции -607. При исследовании частотных распределений генотипов ИЛ-18 в позиции -607 промотора гена ИЛ-18 показано увеличение частоты встречаемости носителей аллеля А и гапло-генотип -607CN/-137GN среди лиц с высоким уровнем спонтанной продукции ИЛ-18.

ИЛ-18, как один из ключевых факторов формирования врожденного и приобретенного иммунного ответа,  способствует формированию эффективного клеточного иммунного ответа, в частности противовирусного. Вирусный гепатит В - одно из самых распространенных инфекционных заболеваний в мире. Полиморфизм генов различных цитокинов (ИФН-, ИФН-, ФНО-, ИЛ-1 и др.) играет важную роль в заболеваемости и определении исхода ВГВ  [Ben-Ari Z., 2006].  Поскольку известно, что на течение вирусных заболеваний влияет не только особенности вируса, но и генетические особенности организма хозяина, мы исследовали особенности распределения аллельных вариантов гена ИЛ-18 (-607C/A  и -137G/C), ассоциированных с уровнем продукции белка ИЛ-18,  у здоровых доноров и больных хроническим вирусным гепатитом В (ВГВ).

Анализ распределения полиморфных вариантов гена ИЛ-18 среди здоровых доноров Юго-Западной Сибири и больных хроническим вирусным гепатитом В.

Распределение аллелей генов предрасположенности/резистентности, формирующие риск развития заболевания или устойчивости к нему, являются уникальными для каждой популяции, что может быть одной из причин разнообразного иммунного ответа на антиген. Исследование двух полиморфизмов промотора гена ИЛ-18 (-607C→A и -137G→C) было проведено в группе практически здоровых лиц (n=147) и больных хроническим ВГВ (n=103). В группе больных хроническим ВГВ выявлено снижение частоты встречаемости генотипа -607АА полиморфного участка гена ИЛ-18 по сравнению со здоровыми донорами. При анализе различий в распределении генотипов полиморфного участка -137 G→C гена ИЛ-18 между группами больных и здоровых лиц статистически значимые отличия не выявлены.

Для определения ассоциированности наличия заболевания хроническим ВГВ с определенным генотипом был проведен анализ распределения генотипов среди здоровых и больных индивидов. При сравнительном анализе встречаемости генотипов в двух изучаемых группах было выявлено снижение частоты встречаемости генотипа -607AA/-137CG (0%) и увеличение частоты встречаемости генотипа -607СС/-137СС до 6,8%  среди больных вирусным гепатитом В (по сравнению с 2,7% у здоровых).

Таким образом, среди больных хроническим ВГВ по сравнению со здоровыми донорами снижены частоты встречаемости генотипов Ц607AA и Ц607AA/-137CG и увеличена частота встречаемости генотипа -607CC/-137CC, ассоциированного со сниженной спонтанной и стимулированной продукцией ИЛ-18, что свидетельствует об участии ИЛ-18 в патогенезе вирусного гепатита В

Использование рИЛ-18 для индукции специфического иммунного ответа in vitro

ИЛ-18 являясь одним из ключевых провоспалительных цитокинов, индуцирует формирование приобретенного иммунного ответа. ИЛ-18 продуцируется антигенпрезентирующими клетками (макрофагами и дендритными клетками), участвует в их взаимодействии с клетками эффекторами. Кроме того, ИЛ-18 активирует функциональную активность клеток, непосредственно участвующих в формировании специфического ответа, в частности противоинфекционного (противовирусного и антибактериального). Однако, в связи с аллельными вариантами гена ИЛ-18 у некоторых индивидов продукция ИЛ-18 может быть сниженной, что может негативно отражаться на всех этапах формирования эффективного иммунного ответа. Кроме того, плейотропность ИЛ-18 может играть негативную роль в формировании иммунных реакций, может вызывать нежелательные в некоторых ситуациях эффекты, как например, продукцию молекул адгезии при метастатической болезни или запуск каскада воспалительных реакций при наличии воспаления в организме, что может приводить к повреждению тканей. Избежать системных тканевых воспалительных реакций и других нежелательных эффектов ИЛ-18 можно, используя его для стимуляции функций клеток in vitro. Существуют данные о том, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В наблюдается ослабление взаимодействия между ДК и Т-клетками [Zheng B. J. et al.,  2004]. В то же время показана возможность индукции с помощью ДК специфических иммунных реакций in vitro, в частности противовирусных, антибактериальных и  противоопухолевых [Mohamadzadeh M. et al., 2004]. Для перепрограммирования иммунных реакций используют стимуляцию ДК и собственно эффекторных клеток различными антигенами и цитокинами [O'Neill D.W. et al., 2004]. Поэтому мы предприняли попытку модулировать специфический иммунный ответ против антигена вирусного гепатита В и антигена туберкулеза с помощью цитотоксических клеток, полученных при культивировании совместно с антиген-презентирующими ДК и рекомбинантным ИЛ-18.

Влияние рчИЛ-18 на модуляцию функциональной активности мононуклеарных клеток периферической крови  больных хроническим гепатитом В, культивированных совместно с аутологичными  ДК.

Известно, что персистенция вируса гепатита В развивается в результате подавления индукции и реализации иммунного ответа, в частности, вследствие истощения антивирусных Т-клонов, блокирования представления антигенов и разобщения всех клеток иммунной системы. В связи с этим иммунокомпетентные клетки больных вирусным гепатитом являются функционально несостоятельными. В нашем исследовании при сравнении пролиферативного потенциала МНК здоровых доноров и больных хроническим ВГВ показано достоверное снижение уровня спонтанной и стимулированной с помощью ДК пролиферации МНК у больных хроническим вирусным гепатитом В (данные не приводятся). Также у больных хроническим вирусным гепатитом В наблюдается сниженная продукция ИНФ- МНК после совместного культивирования с аутологичными активированными ДК и отсутствие статистически значимой стимуляции продукции в ответ на совместное культивирование в отличие от здоровых доноров (данные не приводятся). То есть, аутологичные активированные ДК больных хроническим вирусным гепатитом В в отличие от аутологичных активированных клеток здоровых доноров обладают сниженным стимуляторным потенциалом в отношении МНК.

Поскольку известно, что ИЛ-18 способен стимулировать клеточный иммунный ответ Тх1типа и продукцию ИФН-γ, мы исследовали возможность и эффективность использования рИЛ-18 для модуляции противовирусного иммунного ответа с помощью дендритных клеток. В качестве активатора функциональной активности МНК и ДК мы использовали рИЛ-18 (40 нг/мл), добавленный при совместном культивировании клеток. Как видно из рисунка 11, наблюдается достоверное усиление пролиферативного ответа МНК на HBcAg, при этом рИЛ-18 достоверно более эффективно усиливает спонтанную и антиген-стимулированную пролиферативную активность МНК и МНК культивированных совместно с ДК.

Примечание: Совместное культивирование МНК и ДК рИЛ-18 проводилось в течение 48 часов. Пролиферацию оценивали по включению 3Н-тимидина на 72 часах культивирования (n=16). Данные представлены в виде медианы и размаха квартилей, pWilkoxon<0,05.

Эффективность использования рИЛ-18 в процессе индукции специфического иммунного ответа оценивалась с помощью методики ELISpot, в которой тестируется количество ИФН-продуцирующих клеток. Среди цитокинов, ИФН- один из самых важных медиаторов иммунной системы, кроме того, этот фактор способен проявлять прямой ингибирующий эффект в отношении репликации вируса [Farrar M. F. et al., 1993; Boehm U. et al., 1997]. Показано, что при индукции специфического иммунного ответа у больных хроническим ВГВ не наблюдается увеличения количества ИФН--продуцирующих клеток в ответ на совместное культивирование с ДК, презентирующих HbcAg, однако применение рИЛ-18 при культивировании МНК  и ДК достоверно увеличивает количество МНК продуцирующих ИФН- по сравнению как с МНК, культивировавшимися в отсутствии ДК, так и после совместного культивирования МНК и ДК или применения только одного рИЛ-18. Кроме того, количество ИНФ-γ продуцирующих клеток статистически значимо увеличивается в ответ стимуляцию HbcAg в группе МНК, культивированных с ДК в присутсвии рИЛ-18 (рисунок 12).

Примечание: С овместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Количество ИНФ-продуцирующих клеток оценивали через 72 часа культивирования (n=17). Количество ИНФ- продуцирующих клеток определялось с помощью технологии ELISpot (данные представлены в виде медианы и размаха квартилей) (pWilkoxon<0,05)

Так как ИЛ-18 может в том числе стимулировать и продукцию цитокинов Тх2 профиля, и в частности, продукцию ИЛ-4, было проведено исследование количества клеток, продуцирующих ИЛ-4 с помощью метода ELISpot и уровня продукции ИЛ-4 с помощью ИФА. Показано, что рИЛ-18 и ДК как по отдельности, так и вместе не влияют на количество клеток продуцирующих ИЛ-4 и уровень его продукции (данные не приводятся).

Кроме того, для определения направленности иммунных реакций мы исследовали продукцию ИНФ- МНК культивированных в присутствии ДК. Показано увеличение спонтанной и антигенстимулированной продукции ИНФ- МНК после совместного культивирования с аутологичными активированными ДК в присутствии рИЛ-18 по сравнению с МНК обработанных только рИЛ-18 или культивированными только с аутологичными ДК (табл.1).

Таким образом, показано, что присутствие рИЛ-18 при совместном культивировании МНК с аутологичными ДК, нагруженными антигеном ВГВ, у больных вирусным гепатитом В смещает профиль цитокинов в сторону медиаторов Тх-1 типа.

Для определения эффективности использования ИЛ-18 для индукции потенциальной цитотоксической активности лимфоцитов устанавливалось содержание клеток, экспрессирующих внутриклеточный белок перфорин. Показано, что HBcAg обладает выраженным индуцирующим эффектом на уровень экспрессии перфориновых гранул в МНК. При этом, добавление рИЛ-18 к совместному культивированию МНК и ДК приводит к достоверно значимому увеличению уровня экспрессии перфорина, как одними МНК, так и в ответ на HBcAg (рисунок 13).

Таблица 1.

Влияние рИЛ-18 на продукцию ИНФ- МНК больных хроническим ВГВ, культивированными с ДК.

	спонтанная	Hbcor Ag
МНК	12,3 пг/мл [6,1;15,1], (21,7)	14,8 пг/мл # [9,9;18,5], (77,1)
МНК+ИЛ-18	11,7 пг/мл # [4,3;18,6], (45,4)	15,5 пг/мл # [6,6;81,5]. (99,0)
МНК+ДК (полученные без HBcorAg)	13,8 пг/мл * [5,2;47,2], (57,2)	16,7 пг/мл # [2,6;74,2], (46,3)
МНК+ДК	17,4 пг/мл * [7,3;45,7], (67,5)	16,7 пг/мл #, & [3,7;69,7], (107,0)
МНК+ДК с ИЛ-18	16,8 пг/мл * [6,7;35,0], (57,9)	20,4 пг/мл *, & [2,9;171,6],(138,4)

Примечание: Совместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Продукция ИНФ- определялась методом ИФА через 72 часа культивирования (n=16). Данные представлены в виде медианы [размах квартилей] и (среднее).

* достоверные отличия от МНК; #- достоверные отличия от МНК+ДК+ИЛ18; &- достоверные отличия от спонтанного уровня (pWilkoxon<0,05)

Рис.13. Влияние рИЛ-18 на экспрессию перфорина МНК больных хроническим ВГВ, культивированными с ДК.

Примечание: Совместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Экспрессию перфорина определялась методом проточной цитометрии через 72 часа культивирования (n=16). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего, p<0,05.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что при совместном культивировании МНК и ДК для максимально эффективной активации специфического клеточного иммунного ответа у больных хроническим вирусным гепатитом В необходимо добавление рИЛ-18.

Поскольку известно, что ИЛ-18 принимает активное участие в формировании антибактериальной защиты организма, мы изучили влияние ИЛ-18 на функциональную активность МНК больных туберкулезом легких, после активации и представления специфического антигена ESAT6 в присутствии аутологичных, дифференцированных in vitro, дендритных клеток.

Влияние рИЛ-18 на эффекторные функции МНК, сокультивированных с ДК больных туберкулезом легких.

Для определения эффективности использования рИЛ-18 для модуляции противотуберкулезного иммунного ответа in vitro мы оценивали пролиферативную активность МНК, предварительно культивированных с антиген-нагруженными ДК, в ответ на специфический антиген M.аtuberculosis ESAT-6. Показано, что ДК, нагруженные и ненагруженные антигеном, способны активировать пролиферативный потенциал МНК пациентов, больных туберкулезом легких. Добавление рИЛ-18 при совместном культивировании дендритных и мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом не приводит к статистически значимому усилению пролиферативной активности МНК. То есть, совместное культивирование зрелых ДК и МНК приводит к активации пролиферативной активности МНК пациентов больных туберкулезом легких in vitro, однако использование рИЛ-18 не сопровождается в данных условиях усилением пролиферативной активности.

Для изучения эффективности использования рИЛ-18 при совместном культивировании ДК и МНК с целью стимуляции и поддержания направленной дифференцировки наивных Т-клеток в Т-хелперы первого типа исследовали секрецию ИФН МНК у больных туберкулезом легких.  С помощью технологии ELISpot показано, что ДК, нагруженные антигеном, эффективно повышают количество ИФНЦпродуцирующих клеток самостоятельно и еще более эффективно в ответ на антиген ESAT-6 по сравнению с исходной популяцией МНК. ДК, не нагруженные антигеном, также повышают количество ИФНЦпродуцирующих клеток, однако, не происходит прироста цитокин-продуцирующих клеток в ответ на антиген. Добавление рИЛ-18 при культивировании ДК и МНК повышает количество ИФНЦпродуцирующих клеток по сравнению с исходной фракцией МНК, при этом количество ИФН-продуцирующих клеток значительно увеличивается в присутствии рИЛ-18 и туберкулезного антигена ESAT-6 (рисунок 14).

Таким образом, совместное культивирование МНК и ДК больных туберкулезом легких в присутствии рИЛ-18 приводит к максимально эффективному увеличению количества ИФН--продуцирующих клеток по сравнению с культивированием в отсутствии рИЛ-18.

Примечание: Оценивалась спонтанная секреция ИФН- и секреция в ответ на антиген ESAT-6 (1мкг/мл) у интактных МНК и МНК, культивированных с ДК. (n=16).

Группы: 1. МНК; 2.  МНК +ИЛ-18; 3. МНК+ДК (без антигена); 4. МНК+ДК (ESAT-6); 5. МНК+ДК (ESAT-6)+ИЛ-18

Данные представлены в виде медианы и диапазона значений квартилей. Достоверность различий определена с помощью критериев Уилкоксона и Манна-Уитни. # - по сравнению с интактными МНК (как спонтанная, так и ESAT-6-стимулированная секреция). p<0,05.

Кроме того, культивирование МНК с аутологичными ДК приводит к достоверно более высокому уровню как спонтанной продукции ИФН, так и продукции в ответ на ESAT-6 по сравнению с исходной популяцией МНК. При добавлении рИЛ-18 при совместном культивировании МНК и ДК наблюдается максимальная секреция ИФН, достоверно отличающаяся от продукции цитокина МНК, культивированными с ДК без ИЛ-18 (рисунок 15).

Примечание: Группы: 1 - МНК; 2- МНК +ИЛ-18; 3-МНК+ДК (без антигена); 4- МНК+ДК (ESAT-6); 5-МНК+ДК (ESAT-6)+ИЛ-18.Данные представлены в виде медианы и диапазона значений квартилей. Достоверность различий определена с помощью критериев Уилкоксона и Манна-Уитни. p<0,05.

       При определении содержания ИЛ-4 в кондиционных средах МНК, культивированных с ДК и рИЛ-18 достоверных различий не выявлено (данные не приводятся).

Таким образом, использование ИЛ-18 при совместном  культивировании МНК и ДК больных туберкулезом легких приводит к выраженному увеличению уровня продукции ИФН по сравнению с культивированием в отсутствии этого активирующего фактора. При этом, рИЛ-18 не оказывает влияния на продукцию Tх2 цитокина ИЛ-4, что свидетельствует о влиянии ИЛ-18 на формирование Т-клеточного ответа первого типа.

       Для оценки эффективности использования рИЛ-18 с целью активации потенциальной цитотоксической активности МНК, культивированных с ДК больных туберкулезом, мы определяли содержание клеток, секретирующих внутриклеточный белок перфорин. Экспрессия перфорина мононуклеарными клетками, предварительно культивированными с ДК, как нагруженными, так и ненагруженными антигеном ESAT6, достоверно повышается по сравнению с интактными МНК. При этом добавление рИЛ-18 при совместном культивировании МНК и ДК более выражено стимулирует продукцию молекул перфорина (рисунок 16).

Примечание: Группы: 1-МНК; 2- МНК+ИЛ-18; 3-МНК+ДК (без антигена); 4-МНК+ДК (ESAT-6); 5-МНК+ДК (ESAT-6)+ИЛ-18

Данные представлены в виде медианы и диапазона значений квартилей. Достоверность различий определена с помощью критериев Уилкоксона и Манна-Уитни. p<0,05.

То есть, использование рИЛ-18 при совместном культивировании ДК и МНК приводит к достоверному и наиболее эффективному повышению содержания перфорин-позитивных клеток с потенциальной цитотоксической активностью.

Таким образом, в исследованиях in vitro показано, что использование рИЛ-18 при совместном культивировании специфических аутологичных дендритных и мононуклеарных клеток больных вирусным гепатитом В и туберкулезом легких является эффективным способом активацииклеток-эффекторов, что проявляется в значительно более выраженном усилении их пролиферативного потенциала, стимуляции продукции ИФН- и формировании цитотоксических клеток, экспрессирующих перфорин по сравнению с клетками, культивированными в тех же условиях, но без рИЛ-18. То есть, использование рИЛ-18 в клеточных технологиях для стимуляции клеточных иммунных реакций является обоснованным и целесообразным.

       Итак, использование рекомбинантного ИЛ-18 может быть эффективным как при введении в организм, так и при использовании в клеточных технологиях.

       Получение рекомбинантных белков для терапевтических целей - одно из наиболее приоритетных направлений современной биотехнологии. Традиционно для этих целей используются системы экспрессии рекомбинантных белков в клетках E.coli. Сегодня в связи с развитием биотехнологии стало возможным создание генетически модифицированных растений, экспрессирующих различные белковые молекулы и антигены, и создание на их основе съедобных вакцин, а также использование их в качестве альтернативного источника иммунорегуляторных молекул.

Биологическая  характеристика трансгенного растения Daucus carota L., несущего ген ИЛ-18 человека.

В своей работе в качестве нового источника рекомбинантных белков мы изучали растения Daucus carota L. (морковь обыкновенная), генетически модифицированного по гену ИЛ-18 человека, в экспериментах in vitro и in vivo.

Трансформация и получение растений Daucus carota L. была осуществлена при сотрудничестве трех институтов: ИХБФМ СО РАН, ИЦиГ СО РАН, ВНИИССОК РАСХН. В ИХБФМ СО РАН было подтверждено наличие гена ИЛ-18 в ДНК растений методом ПЦР.

Для изучения биологических эффектов генетически модифицированной моркови, несущей ген чИЛ-18, были использованы трансгенные растения поколения Т0 и Т1. На первом этапе исследования мы определили влияние перорального применения моркови, экспрессирующей ген ИЛ-18 человека, на пролиферативную активность и продукцию ИФНγ спленоцитами мышей. Экспериментальные животные содержались на стандартном рационе (интактная группа), либо с добавлением к рациону трансгенной (опытная группа) или обычной моркови того же сорта и выращенной в тех же условиях (контрольная группа).  Установлено, что прием в пищу трансгенной моркови в течение 16 дней не влияет на спонтанную и митоген-индуцированную пролиферативную активность спленоцитов. Функциональные свойства спленоцитов мышей, получавших трансгенную морковь, оценивали по способности к продукции ими ИФН-γ. Было показано, что пероральное применение трансгенной моркови увеличивает спонтанную продукцию ИФНγ спленоцитами мышей опытной и контрольной группы по сравнению с интактной группой. Стимулированная КонА продукция ИФНγ спленоцитами была достоверно выше у мышей опытной группы по сравнению с интактной и контрольной группами (рисунок 17).

Примечание: Мыши СBF1 получали к стандартному рациону  трансгенную или обычную морковь в дозе 1,7-2 гр/мышь в течение 16 дней. Клетки селезенки культивировали без или в присутствии КонА (5мкг/мл) 48 часов. ИФН-γ определяли в супернатантах методом ЭХЛ. Данные представлены как медиана и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0,05.

Таким образом, нами было выявлено влияние моркови, несущей ген ИЛ-18, на продукцию спленоцитами мыши регуляторного цитокина ИФНγ, что свидетельствует о наличии специфических для ИЛ-18 иммуномодулирующих свойств трансгенной моркови при пероральном применении.

Установлено, что добавление в пищу трансгенной моркови (в дозе 1,7-2 гр/мышь/сут)  в течение 16 дней достоверно стимулирует выраженность ГЗТ по сравнению с интактной и контрольной группами. При изучении формирования гуморального иммунного ответа не выявлено достоверного влияния перорального применения трансгенной моркови с ИЛ-18 на уровень первичного гуморального ответа на Т-зависимый антиген (эритроциты барана) (данные не представлены). Трансгенное растение, несущее ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении оказывает действие аналогичное рекомбинантному белку, то есть увеличивает продукцию ИФНγ иммунокомпетентными клетками и стимулирует выраженность реакции ГЗТ, что отражает влияние этого продукта на формирование клеточного иммунного ответа.

Для изучения противоопухолевых свойств трансгенного растения, несущего ген ИЛ-18, использовалась модель уретан-индуцированной аденокарциномы легких. В наших опытах показано, что употребление в пищу моркови, несущей ген ИЛ-18, приводит к достоверному уменьшению числа аденоматозных узлов у опытной группы по сравнению с контрольной и интактной группами, а также снижению среднего диаметра аденом у опытной и контрольной групп мышей по сравнению с интактной (рисунок 18).

Поскольку данная модель аденомы  легких является истинной опухолью и может служить моделью доброкачественного и злокачественного процесса [Bentel J.M., 1989], мы предполагаем, что ИЛ-18 человека, продуцирующийся в клетках трансгенного растения, может оказывать противоопухолевое действие через механизмы, описанные в литературе, а именно стимуляцию экспрессии FasL, увеличение цитотоксичности Т- и НК-клеток, ингибирование ангиогенеза, стимуляцию продукции иммунорегуляторных цитокинов и др. Кроме того, возможный механизм действия генетически модифицированной моркови, несущей ген ИЛ-18 человека,  при пероральном применении может осуществляться через иммунокомпетентные клетки слизистой кишечника.

Рис.18. Влияние перорального применения трансгенной моркови, экспрессирующей ген чИЛ-18 на  опухолевый процесс в модели уретан-индуцированной аденокарциномы легких.

Примечание: Мыши линии BALB/c получали трансгенную или обычную морковь в дозе 1,7-2 гр/мышь 16 дней ежедневно, и 2 месяца по 3 раза в неделю. Через 4 месяца  легкие фиксировали в 10% формалине и проводили подсчет количества и измерение диаметра аденоматозных образований при помощи бинокулярной лупы. Данные представлены как медиана и размах квартилей. n=36. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0,05.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что трансгенная морковь, несущая ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении обладает активностью, схожей с рекомбинантным белком, в частности, стимулирует продукцию ИФНγ иммунокомпетентными клетками и реакцию ГЗТ, а также проявляет противоопухолевую активность в модели уретан-индуцированной аденокарциномы легких.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

       Итак, в результате проведенных исследований нами показано, что рекомбинантный ИЛ-18, полученный по оригинальной методике, обладает иммунорегуляторной активностью, стимулируя продукцию ИФН и ФНО мононуклеарными клетками периферической крови, увеличивая выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа. Рекомбинантные ИЛ-18 и его антагонист ИЛ-18 связывающий белок обладают противоопухолевой активностью, но в разных моделях. Так, рИЛ-18 при внутривенном введении уменьшает вес солидной опухоли меланомы В16 и продолжительность жизни мышей, а ИЛ-18СБ уменьшает количество опухолевых очагов в  гематогенной метастатической модели меланомы В16, что свидетельствует о разных механизмах подавления опухолевых процессов для указанных белков и целесообразности их применения в цитокиновой и антицитокиновой терапии онкопатологии. ИЛ-18 также эффективен при использовании в клеточных технологиях для активации функций клеток-эффекторов противовирусного и антибактериального иммунного ответа. Кроме того, ИЛ-18 может участвовать в механизмах несостоятельности иммунного ответа при хронизации и прогрессии гепатита В, поскольку уровень продукции эндогенного ИЛ-18, являющегося одним из активных участников противовирусной защиты, связан с аллельными вариантами его гена, что может отражаться на формировании эффективного иммунного ответа у каждого конкретного индивида. При исследовании эффективности перорального использования генетически модифицированного растения моркови, несущей ген ИЛ-18 человека, показана принципиальная возможность использования этого продукта для стимуляции реакций клеточного иммунного ответа. Таким образом, рИЛ-18 является одним из перспективных иммунорегуляторных факторов для применения как в цитокинотерапии иммуноопосредованных заболеваний, так и в клеточных технологиях.

ВЫВОДЫ:

1. Рекомбинантный ИЛ-18 человека, полученный по оригинальной методике (продуцент  E.coli),  связывается с моно- и поликлональными анти-ИЛ-18 антителами, стимулирует продукцию ИФН, ФНО в культурах МНК человека и реакцию гиперчувствительности замедленного типа у экспериментальных животных in vivo, что свидетельствует о специфической иммунохимической активности выделенного белка и его способности активировать клеточный иммунитет.

2. Рекомбинантный ИЛ-18 связывающий белок человека, полученный по оригинальной методике (продуцент E.coli), взаимодействует с  поликлональными анти-ИЛ-18СБ антителами, в экспериментах in vitro отменяет стимулирующий эффект рИЛ-18 на продукцию ФНО мононуклеарными клетками человека и снижает ЛПСЦиндуцированную летальность экспериментальных животных in vivo, что подтверждает его специфические иммунохимические свойства и блокирующий эффект в отношении ИЛ-18.

3. Рекомбинантный ИЛ-18 связывающий белок снижает уровень продукции ФНО, стимулированный КонА, до спонтанного уровня, что свидетельствует о роли ИЛ-18 в регуляции провоспалительной активности мононуклеарных клеток.

4. Рекомбинантные белки ИЛ-18 и ИЛ-18СБ обладают противоопухолевой активностью в модели ортотопической солидной меланомы В16 и гематогенной метастатической меланомы В16, соответственно, что указывает на существование различных механизмов подавления опухолевого роста указанными белками.

5. Генотип СС, аллель С в позиции -137 промоторного участка гена ИЛ-18 и гапло-генотипы -607СС/-137СС и -607АА/-137GC у здоровых доноров сопряжены с низкой продукцией белка ИЛ-18,  генотип СА, аллель А в позиции -607 и гапло-генотип -607CN/-137GN ассоциированы с относительно высоким уровнем продукции ИЛ-18, что свидетельствует о генетической детерминированности уровня продукции белка ИЛ-18.

6. Больные хроническим ВГВ характеризуются снижением частоты встречаемости генотипов Ц607AA и Ц607AA/-137CG и увеличением частоты встречаемости генотипа -607CC/-137CC по сравнению со здоровыми донорами, что указывает на роль генетического фактора в патогенезе вирусного гепатита В. 7. ИЛ-18 в культурах МНК больных хроническим вирусным гепатитом В восстанавливает исходно сниженный Тх1 ответ и усиливает генерацию цитотоксических Т-клеток, о чем свидетельствует усиление пролиферативной активности МНК, продукции ИФНγ и возрастание доли Т-клеток с внутриклеточным содержанием ИФНγ и перфорина при сокультивировании с ДК, нагруженными антигеном вируса гепатита В.

8. Совместное культивирование ДК, нагруженных антигеном M. Tuberculosis (ЕSAT-6) и МНК больных туберкулезом легких в присутствии рИЛ-18 приводит к усилению антиген-специфических клеточных реакций, что подтверждается возрастанием продукции ИФНγ, а также увеличением количества ИФН-продуцирующих- и цитотоксических Т-лимфоцитов.

9. Пероральное применение трансгенной по гену ИЛ-18 моркови Daucus carota L. приводит к усилению продукции ИФН спленоцитами, увеличению реакции гиперчувствительности замедленного типа и угнетению опухолевого роста в уретан-индуцированной модели аденокарциномы легких у мышей, что свидетельствует о наличии биологического эффекта ИЛ-18 в составе трансгенного растения.

10. Рекомбинантный белок ИЛ-18 обладает рядом специфических биологических эффектов и может быть эффективен для стимуляции клеточных иммунных реакций при онкологических состояниях, а также в клеточных технологиях при разработке дендритно-клеточных вакцин для модуляции иммунного ответа при инфекционных процессах.

Список научных работ,  опубликованных по теме диссертации.

1. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Курамшин Д.Х., Лыков А.П., Ведина Л.В., Филипенко М.Л., Сенников С.В., Власов В.В., Козлов В.А. Биологическая активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18 // Материалы 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. 5-6 марта 2003 г. - с 256.

2. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Курамшин Д.Х., Лыков А.П., Ведина Л.В., Филипенко М.Л., Сенников С.В., Власов В.В., Козлов В.А. Биологическая активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18 // Материалы 7-го Всероссийского научного Форума с международным участием им. Акад. В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. 23-26 июня. Медицинская иммунология. - 2003. - Том 5, № 3-4. - С.429.

3. Якушенко Е.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Эритропоэтин в лечении канцериндуцированных анемий // Евразийский медицинский журнал. - 2003. - № 1. - С.19-25.

4. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Балданов Н., Жеребцова Н.О., Филиппенко М.Л., Сенников С.В., Козлов В.А. Интерлейкин-18: противоопухолевая активность // Материалы объединенного иммунологического форума, Екатеринбург 2004. Russian Journal of Immunology. - 2004. - V.9. - № 1. - Р. 49.

5. Якушенко Е.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Проблемы использования рекомбинантного эритропоэтина для лечения канцериндуцированных анемий // В сб.: Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты. - Новосибирск, Наука, 2004. - С. 286-296.

6. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. Характеристика  интерлейкин-18 и его роль в иммунном ответе // В сб.: Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты. - Новосибирск, Наука. 2004. - С. 125-140.

7. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов М.Л., Филипенко Е.А., Пустошилова Н.М., Закабунин А.И., Сенников С.В., Козлов В.А. Получение рекомбинантных цитокинов IL-18 и IL-18-связывающего протеина и исследование их биологической активности // Молекулярн. основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. VIII Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.И.Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. - Мед. иммунология. - 2004. - Т. 6, № 3-5. - С. 263-264.

8. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov E.A., Filipenko M.L., Pustoshilova N.M., Zakabunin A.L., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Biological and specific activity of recombinant human Interleukin-18 // Cytokine network, and Regulatory Cells. - 2004. - P. 423-428.

9. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov E.A., Filipenko M.L., Sennikov S.V., Vlasov V.V., Kozlov V.A. Preclinical trials of Recombinant Human Interleukin-18 // Clinical and Investigative Medicine. - 2004. - № 4. - P. 70B.

10. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. Интерлейкин-18 и его роль в иммунном ответе // Медицинская иммунология. - 2005 . - Т. 7, № 4. - С. 355-364.

11. Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Романов В.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Применение технологии ELTISpot для оценки специфического иммунного ответа на туберкулезный антиген ESAT-6 мононуклеарными клетками больных туберкулезом // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: Цитоки-ны. Стволовая клетка. Иммунитет, Новосибирск. 19-21 июля. - Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 2. - С. 103.

12. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Дейнеко Е.В., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Сенников С.В., Шумный В.К., Козлов В.А. Изучение иммунорегуляторных эффектов перорального применения трансгенной моркови несущей ген ИЛ-18 // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: Цитоки-ны. Стволовая клетка. Иммунитет, Новосибирск. 19-21 июля. - Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 2. - С. 119.

13. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Пустошилова Н.М., Закабунин А.И., Сенников С.В., Козлов В.А. Исследование биологической активности рекомбинантных IL-18 и IL-18 связывающего белка // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет, Новосибирск. 19-21 июля. - Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 2. - С. 120.

14. Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Закабунин А.И., Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В. и др. Получение рекомбинантного интерлейкина-18 человека в клетках E.coli. // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет, Новосибирск. 19-21 июля. - Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 2. - С. 125.

15. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Сенников С.В., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Власов В.В., Козлов В.А.  ИЛ-18: биологические свойства и противоопухолевая активность рекомбинантного белка итрансгенного растения DAUCUS CAROTA L // Дни иммунологии в Сибири: Матер. Всеросс. научно-практ. конф., посвящен. 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. (7-9 сентября 2005), Красноярск, 2005. - С. 134-136.

16. Сенников С.В., Филипенко М.Л., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Лопатникова Ю.А., Воронина Е.Н., Дейнеко Е.В., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Власов В.В., Козлов В.А. ИЛ-18 как стимулятор клеточного иммунитета // Сборник тезисов 1 Российско-американ-ской конференции Биотехнология и онкология. - Санкт-Петербург, 29-31 мая 2005. - С. 35.

17. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Задорожный А.В., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Сенников С.В., Козлов В.А. Экспрессия ИЛ-18 связывающего белка человека в клетках E. COLI. И изучение биологической активности рекомбинантного белка // Сборник тезисов 1 Российско-американ-ской конференции Биотехнология и онкология. - Санкт-Петербург 29-31 мая 2005. - С. 146-147.

18. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В.,  Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Филипенко Е.А., Пухначева Н.А., Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А., Шумный В.К., Козлов В.А. Трансгенная морковь, экспрессирующая ИЛ-18 и ее иммуномодулирующие свойства // Иммунология Урала. - 2005. - №1(4). - С. 140-141.

19. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Сенников С.В., Власов В.В., Козлов В.А. Рекомбинантный человеческий интерлейкин-18: биологическая активность и противоопухолевые свойства // Иммунология Урала. - 2005. - №1(4). - С. 162-163.

20. Храпов Е.А., Задорожный А.В., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Козлова Ю.Н., Литовченко Л.Л., Каньшина А.В., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В., Козлов В.А. Получение и изучение биологической активности рекомбинантного ИЛ-18 связывающего белка // Материалы Всероссийской конференции Фундаментальные науки - медицине. - Новосибирск, 2005. - С. 105.

21. Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В. Оценка специфического иммунного ответа на туберкулезный антиген ESAT-6 мононуклеарными клетками больных туберкулезом на основе технологии ELISPOT // Материалы ежегодной конкурса-конференции студентов и молодых ученых Авиценна - 2005. - Новосибирск, 2005. - С. 115-116.

22. Khrapov E.A., Lopatnikova J.A., Voronina E.N., Yakushenko E.V., Zakabunin A.I., Sennikov S.V., Pustoshilova N.M., Kozlov V.A., Filipenko M.L. Expression of human  interleukin-18 in E.coli  and biological activity of recombinant protein // Biotechnology in biology and medicine. Editors: A.M. Egorov and G. Zaikov, 2006, Nova Science Publishers, Inc., New York. - Р.13-24.

23. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov E.A., Deineko E.V., Filipenko M.L., Voronina E.N., Turchinovich A.A., Filipenko E.A., Pukhnatcheva N.A., Tukavin G.B., Schmikova N.A., Shumny V.K., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Use of transgenic carrot plants producing human interleukin-18 for modulation of mouse immune response // Biotechnology in biology and medicine. Editors: A.M. Egorov and G. Zaikov, 2006, Nova Science Publishers, Inc., New York. - Р. 97-107.

24. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Козлова Ю.Н., Пустошилова Н.М., Филипенко М.Л., Храпов Е.А. и др. Получение рекомбинантного интерлейкин-18 связывающего белка, изучение его биологической активности и антиметастатичекого действия // Московская междунарожная конференция Биотехнология и медицина материалы московской международной конференции. - 2006. - С. 150.

25. Сенников С.В., Жеребцова Н.О., Хрипко О.П., Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Облеухова И.А. и др. Модуляция специфического иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками in vitro // Материалы Московской международной конференции Биотехнология и медицина, 14-17 марта 2006.

26. Шевченко Ю.А., Хрипко О.П., Якушенко Е.В., Пронкина Н.В., Кожевников В.С., Романов В.В. и др. Оптимизация протоколов получения антиген-активированных дендритных клеток для стимуляции специфического иммунного ответа in vitro при туберкулезе легких // Материалы V конференции иммунологов Урала. 30 октября - 1 ноября. Оренбург, 2006. - Иммунология Урала. - 2006. - №1(5). - С. 181-182.

27. Хрипко О.П., Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Пронкина Н.В., Кожевников В.С., Сенников С.В., Козлов В.А. Индукция иммунного ответа против Hbcorag in vitro с помощью аутологичных активированных дендритных клеток // Материалы V конференции иммунологов Урала. 30 октября - 1 ноября. Оренбург, 2006. - Иммунология Урала. - 2006. - №1(5). - С. 32-33.

28. Sennikova N.S.,  Khripko Y.I. , Lopatnikova J.A., Yakushenko E.V., Filipenko M.L., Kozlov V.A. Single-nucleotide polymorphisms of the interleukin-18 gene promoter region in healthy donors of southwest siberian population // European Cytokine Network, (Abstracts 6th International Cytokine Conference). - 2006. - v. 17, Supplement. 02-13/P, - P.38-39.

29. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Sennikov S.V., Khrapov E.A., Voronina E.N., Filipenko M.L. и др. Expression of the human IL 18 binding protein in e. coli cells and study of  its  biological properties // European Cytokine Network, (Abstracts 6th International Cytokine Conference). - 2006. - v. 17,  Supplement. 14-05/P. - P.136

30. Сенникова Н.С., Хрипко Ю.И., Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Филипенко М.Л., Козлов В.А., Сенников С.В. Полиморфизм промоторного участка гена ИЛ-18 у здоровых доноров Юго-Западной Сибири // Материалы международной конференции Фундаментальные науки для биотехнологии и медицины. 3-7 сентября. - Новосибирск. - 2006. - С. 102.

31. Хрипко О.П., Сенникова Н.С., Лопатникова Ю.А., Хрипко Ю.И., Филиппенко М.Л., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Аллельный полиморфизм гена ИЛ-18 и уровень его продукция мононуклеарными клетками здоровых доноров Юго-Западной Сибири // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006. - №3,1(14). - С. 266-269.

32. Якушенко Е.В., Хрипко О.П., Пронкина Н.В., Красильникова И.В., Романов В.В., Романов В.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Модуляция противоинфекционного иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при гепатите и туберкулезе легких in vitro // Материалы Российской научно-практической конференции Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия. Russian Journal of Immunology. - 2006. - v. 9, suppl. 3.

33. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Сенников С.В., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Козлов В.А. ИЛ-18: биологические свойства и противоопухолевая активность рекомбинантного белка и трансгенного растения Daucus carotaL несущего ген ИЛ-18 человека // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. Материалы 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. - Новосибирск, 2006. - С. 61-67.

34. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Козлова Ю.Н., Пустошилова Н.М., Козлов В.А. Получение рекомбинантного интерлейкин-18 связывающего белка и исследование его биологической и специфической активности // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. Материалы 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. - Новосибирск, 2006. - С. 94-98.

35. Хрипко О.П., Якушенко Е.В., Красильникова И.В., Позднякова Л.Л., Толоконская Н.П., Сенников С.В., Козлов В.А. Использование интерлейкина-18 для генерации цитотоксических мононуклеарных клеток больных гепатитом в in vitro // 3rd International Confer. Basic Science for Medicine. - September 2-8, 2007. - Р. 91.

36. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.В., Дейнеко Е.В., Воронина Е.Н., Филиппенко М.Л., Шумный В.К., Сенников С.В., Козлов В.А. Иммунорегуляторные свойства перорального применения трансгенной моркови Daucus carota L., несущей ген интерлейкина-18 человека // 3rd International Confer. Basic Science for Medicine. - September 2-8, 2007. - Р. 42

37. Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Лаушкина Ж.А., Романов В.В., Свистельник А.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Аутологичные дендритные клетки как основа для модуляции специфического противотуберкулезного клеточного иммунного ответа in vitro // 3rd International Confer. Basic Science for Medicine. - September 2-8, 2007. - Р. 86

38. Хрипко О.П., Сенникова Н.С., Лопатникова Ю.А., Хрипко Ю.И., Филиппенко М.Л., Якушенко Е.В., Козлов В.А., Сенников С.В. Аллельный полиморфизм гена ИЛ-18 и уровень его продукции мононуклеарными клетками здоровых доноров Юго-Западной Сибири // Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. ХI Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.И.Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Мед. Иммунология. Ц 2007. Ц Т. 9, № 2-3. Ц С. 314-315.

39. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.В., Дейнеко Е.В., Воронина Е.Н., Филиппенко М.Л., Шумный В.К., Сенников С.В., Козлов В.А. Иммунорегуляторные свойства перорального применения трансгенной моркови Daucus carota L., несущей ген ИЛ-18 человека // Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. ХI Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.И.Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Мед. Иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 150.

40. Хрипко О.П., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Пронкина Н.В., Красильникова И.В., Позднякова Л.Л., Кожевников В.С., Козлов В.А. Модуляция противовирусного иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при гепатите в in vitro // Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. ХI Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.И.Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Мед. Иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 253.

41. Шевченко Ю.А., Сенников С.В., Якушенко Е.В., Лаушкина Ж.А., Романов В.В., Тугов А.А., Козлов В.А. Влияние аутологичных антиген-активированных дендритных клеток на формирование иммунного ответа in vitro при туберкулезе // Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. ХI Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.И.Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Мед. Иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 254.

42.  Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.В., Воронина Е.Н., Филиппенко М.Л., Козлова Ю.Н., Пустошилова Н.М., Шурлыгина А.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Получение рекомбинантного интерлейкина-18 и изучение его противоопухолевой активности // Бюлл. СО РАМН. - 2007. - № 2 (124). - С. 23-26.

43. Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Лаушкина Ж.А., Романов В.В., Свистельник А.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Индукция специфического противоинфекционного иммунного ответа с помощью аутологичных антиген-активированных дендритных клеток у пациентов, больных туберкулезом // Омский научный вестник. - 2007. - № 3, приложение 2. - С. 142-144.

44. Хрипко О.П., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Пронкина Н.В., Красильникова И.В., Позднякова Л.Л., Толоконская Н.П., Кожевников В.С., Козлов В.А. Модуляция противовирусного иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при гепатите в in vitro // Омский научный вестник. - 2007. - № 3, приложение 2. - С. 376-378.

45. Khripko O.P., Sennikova N.S., Lopatnikova Y.A., Khripko Y.I., Filipenko M.L., Yakushenko E.V., Kozlov V.A.Ю, Sennikov S.V. Allele polymorphism of IL-18 gene and level its production by mononuclear cells of healthy donors of Southwest Siberia // IMMUNORIO2007. 13th International Congress of Immunology, Rio de Janeiro, 2007. - P. 98.

46. Shevchenko Y.А., Sennikov S.V., Laushkina Z.A., Yakushenko E.V., Romanov V.V., Tugov A.A., Kozlov V. A. Modulation of the specific antituberculosis immune response in vitro by means of antigen-activated dendritic cells // IMMUNORIO2007. 13th International Congress of Immunology, Rio de Janeiro, 2007. - P. 183.

47. Хрипко О.П., Шевченко Ю.А., Облеухова И.А., Гончаров М.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Пронкина Н.В., Бровкина Г.И., Кожевников В.С., Козлов В.А. Модуляция противоопухолевого иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при раке яичника in vitro // Сибирский онкологический журнал. - 2007. - Приложение 2. - с. 120-121.

48. Хрипко О.П., Облеухова И.А., Гончаров М.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Пронкина Н.В., Бровкина Г.И., Кожевников В.С., Козлов В.А. Модуляция противоопухолевого иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при раке яичника in vitro // ДАктуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологииФ. Сборник материалов II региональной конференции молодых ученых им.академика РАМН Н.В. Васильева  27 апреля 2007 г. Томск. - С.75-76

49. Shevchenko Y., Sennikov S., Laushkina J., Yakushenko E., Romanov V., Tugov A., Kozlov V. Autologous dendritic cell for modulation of the specific antituberculosis immune response in vitro // World Immune Regulation Meeting. Final Programme and Abstracts. 11 - 15 April Davos, Switzerland. - 2007. - Р.143-144.

50. Якушенко Е.В., Шевченко Ю.А., Хрипко О.П., Жеребцова Н.О., Облеухова И.А, Силков А.Н., Сенников С.В., Козлов В.А. Методические подходы к оценке эффективности генерации дендритных клеток и модуляции специфического иммунного ответа // Тезисы объединенного иммунологического форума. Санкт-Петербург, 30 июняЦ5 июля, 2008. Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2(11), №2-3. - С. 126-127.

51. Сенникова Н.С., Хрипко О.П., Лопатникова Ю.А., Хрипко Ю.И., Филипенко М.Л., Якушенко Е.В., Козлов В.А., Сенников С.В. Влияния аллельного полиморфизма промотора гена интерлейкина-18 на уровень его продукции мононуклеарными клетками // Тезисы объединенного иммунологического форума. Санкт-Петербург, 30 июня-5июля, 2008. Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2(11), №2-3. - С. 136.

52. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В., Шаталина М.Н., Филиппенко Е.А., Дейнеко Е.В., Воронина Е.Н., Храпов Е.А., Филиппенко М.Л., Шумный В.К., Козлов В.А. Использование трансгенных растений моркови - продуцентов интерлейкина-18 человека для модуляции иммунных реакций у мышей // Бюлл. СО РАМН. - 2008. - № 3 (май-июнь). - С. 70-75.

53. Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Лаушкина Ж.А., Романов В.В., Свистельник А.В., Козлов В.А. Модуляция противотуберкулезного иммунного ответа in vitro с помощью антиген-активированных дендритных клеток // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2008. - №2. - С. 33-35.

54. Хрипко О.П., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Красильникова И.В., Козлов В.А. Использование дендритных клеток и интерлейкина-18 для модуляции иммунного ответа против HBcAg in vitro // Бюллетень СО РАМН. - 2008. - №5. - С. 109-113.

55. Khripko O.P., Sennikova N.S., Lopatnikova J.A., Khripko J.I., Filipenko M.L., Khrapov E.A., Gelfgat E.L., Yakushenko E.V., Kozlov V.A., Sennikov S.V. Association of Single Nucleotide Polymorphisms in the IL-18 Gene with Production of IL-18 Protein by Mononuclear Cells from Healthy Donors // Mediators of Inflammation. - 2008. - 2008:309721. Epub 2008 Oct 20.  6 pages.

56. Сенников С.В.,  Шевченко Ю.А., Хрипко О.П., Облеухова И.А., Якушенко Е.В., Лаушкина Ж.А., Лебедева В.А., Ласкавая Е.Г., Гончаров М.А., Свистельник А.В., Красильникова И.В., Позднякова Л.Л., Козлов В.А. Экспериментальные подходы к разработке клеточных протоколов модуляции специфических иммунных реакций с помощью дендритных клеток // Сб. науч. тр.: Клеточные технологии: Теоретические и прикладные аспекты / Под ред. В.А.Козлова, С.В.Сенникова, Е.Р.Черных, А.А.Останина. - Новосибирск: Наука, 2009. - С. 53-75.

57. Хрипко О. П., Якушенко Е. В., Сенникова Н. С., Хрипко Ю. И., Лопатникова Ю. А., Филиппенко М. Л., Козлов В. А., Сенников С. В. Аллельный полиморфизм промотора гена интерлейкина-18 при хроническом гепатите В // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2009. - №1. - С. 18-22.

58. Перминова Е.И., Гришина Л.В., Щепотина Е.Г., Голикова Е.А., Пашкина Е.А., Магаева А.А., Итин В.И., Терехова О.Г., Якушенко Е.В., Козлов В.А. Токсическое действие и распределение в организме оксида железа Fe3O4 // Материалы Всероссийской научно-практ. конф. с междунар. участием Дни иммунологии в Сибири, 1-3 марта 2010 г., Красноярск. - 2010. - С. 139-140.

59. Курилин В.В., Облеухова И.А., Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Якушенко В.К., Сенников С.В. Стимуляция цитотоксического ответа против опухолевых клеток больных колоректальным раком в культуре мононуклеарных клеток с помощью дендритных клеток // Материалы Всероссийской научно-практ. конф. с междунар. участием Дни иммунологии в Сибири, 1-3 марта 2010 г., Красноярск. - 2010. - С. 247-249.

60. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Филиппенко М.Л., Сенников С.В., Козлов В.А. Биологическая активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18-связывающего белка и перспективы его клинического применения // Материалы Всероссийской научно-практ. конф. с междунар. участием Дни иммунологии в Сибири, 1-3 марта 2010 г., Красноярск. - 2010. - С. 277-278.

61. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В., Козлов В.А. Биологическая активность интерлейкина 18 и интерлейкина 18-связывающего белка в тестах in vitro и in vivo. Перспективы клинического применения // Мат. Всеросс. научн. конф. Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии. Новосибирск, 15-17 сентября 2010 г. // Цитокины и воспаление. - 2010. - Т. 9, № 3. - С. 83-84.

62. Курилин В.В., Облеухова И.А., Якушенко Е.В., Якушенко В.К. Влияние дендритных клеток и цитокинов на стимуляцию цитотоксического ответа против опухолевых клеток больных колоректальным раком в культуре мононуклеарных клеток // Вестник  Уральской медицинской академической науки. - 2010. - №2/1(29). - С. 159-160.

63. Курилин В.В., Облеухова И.А., Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Якушенко В.К., Сенников С.В. Модуляция цитотоксического противоопухолевого ответа в культуре мононуклеарных клеток с помощью дендритных клеток // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - № S1. - С.64-65.

64. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Козлов В.А., Филиппенко М.Л., Сенников С.В. Биологическая активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18-связывающего белка // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т. 4(13), № 2. - С. 163-167.

65. Курилин В.В., Облеухова И.А., Куликова Е.В., Рябкова Ю.Н., Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Якушенко В.К., Сенников С.В., Карпенко Л.И., Нечаева Е.А., Ильичев А.А., Козлов В.А. Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике / Под ред. акад. РАМН В.А.Козлова и д.м.н., проф. С.В.Сенникова. Новосибирск, 2011. - С. 77-79.

66. Курилин В.В., Облеухова И.А., Куликова Е.В., Якушенко Е.В., Якушенко В.К., Сенников С.В. Модуляция опухолеспецифичной цитотоксической иммунной реакции в совместной культуре мононуклеарных и дендритных клеток больных колоректальным раком // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 2/1 (35).  - С. 164-165.

Патенты

67.Сенников С.В., Якушенко Е.В., Хрипко О.П., Козлов В.А. Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вируса гепатита В // Патент на изобретение №2366707 Российская Федерация. Приоритет от 11.03.2008 опубликовано 10.09.2009 Бюл №25.

  68.Сенников С.В., Якушенко Е.В., Шевченко Ю.А., Лаушкина Ж.А., Свистельник А.В., Козлов В.А. Способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных клеток // Патент на изобритение №2378373 Российская Федерация приоритет от 04.02.08. опубликовано 10.01.2010г. Бюл. №1.

69. Дейнеко Е.В., Шумный В.К., Филипенко Е.А., Загорская А.А., Сидорчук Ю.В., Филипенко М.Л., Власов В.В., Сенников С.В., Козлов В.А., Якушенко Е.В. Способ получения трансгенных растений моркови, продуцирующих интерлейкин-10 человека // Патент на изобретение №2374321 Российская Федерация. Приоритет от 12.12.2007, опубликовано 27.11.2009

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине