Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
ТЕЛУШКИН
Павел Константинович
ИНСУЛИНОВАЯ ГИПОГЛИКЕМИЯ И МЕТАБОЛИЗМ МОЗГА
03.00.13 - физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Санкт-Петербург
2009
Работа выполнена в ФГОУ ВПО Санкт-Петербургском государственном
университете
Научный консультант:
Академик РАН Александр Данилович Ноздрачев
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Виктор Петрович Лапицкий
доктор биологических наук, профессор Юрий Петрович Пушкарев
доктор биологических наук Наталья Эдуардовна Ордян
Ведущее учреждение:
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН
Защита состоится У____Ф ___________ 2009 г. в ___часов
на заседании совета Д 212. 232. 10 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по
адресу:
199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд.90.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького Санкт-
Петербургского государственного университета
Автореферат разослан У____Ф __________ 2009 г.
Ученый секретарь совета
доктор биологических наук,
профессор Н.П. Алексеев
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Изучение гипогликемии и ее последствий для организма занимает важное место среди проблем современной биологии и медицины.
Гипогликемия - широко распространенное состояние, возникающее при инсуломе поджелудочной железы, алкогольной интоксикации, заболеваниях печени и желудочно-кишечного тракта, но чаще всего инсулиновая гипогликемия сопровождает лечение сахарного диабета (Балаболкин, 2000; Cryer,2004, 2006; Briscoe, Davis, 2006 и др.).
Эпизоды симптоматической гипогликемии наблюдаются у пациентов с инсулинодефицитом при интенсивной терапии около 10 раз в неделю, а тяжелой гипогликемии, сопровождающиеся временной утратой трудоспособности и госпитализацией - по крайней мере, один раз в год (Hepburn et al., 1993; Briscoe, Davis, 2006). По разным оценкам, от 2 до 7 % смертей пациентов с сахарным диабетом первого типа связано с гипогликемией (Cryer, 2004; Дедов, 2005).
Предшествующие эпизоды гипогликемии уменьшают нейроэндокринный, симтоматический и когнитивный ответы при последующих гипогликемиях не только при дефиците эффектов инсулина (Segel et al., 2002), но и у недиабетических пациентов (Davis et al., 1997). Компенсаторные реакции при последующих гипогликемиях возникают при меньших концентрациях глюкозы, т.е. при более тяжелой гипогликемии. Это приводит к развитию бессимптомных гипогликемий. Механизмы ослабления симпатоадреналового ответа при последующих гипогликемиях неизвестны (Cryer, 2004, 2005; Briscoe, Davis, 2006). Поскольку мозг исключительно зависим от глюкозы и является первым органом, повреждающимся при гипогликемии (McAuley et al., 2001; Cryer et al., 2003; Zammitt, Frier, 2005), нарушения в нем обмена могут быть причиной уменьшения симпатоадреналового ответа при последующих гипогликемиях (Cryer, 2005).
Инсулин крови сам по себе не влияет на обмен мозга в целом (Ames, 2000; Brown, 2004). Действие больших доз инсулина, вызывающее определенную неврологическую симптоматику и повреждение нейронов, опосредовано гипогликемией (Siesjo, Agardh, 1983; McAuley et al., 2001; Cryer et al., 2003; Zammitt, Frier, 2005 и др.). Купирование гипогликемического ступора и комы глюкозой приводит к сравнительно быстрому восстановлению электрофизиологических и метаболических показателей. Исследования нарушений гомеостазиса Са2+ при нейрогликопении (Kristian et al., 1993) привели к представлению о эксайтотоксической природе повреждения нейронов при гипогликемии (Wieloch, 1985; Nehlig, 1997).
Несмотря на обилие информации о нарушениях метаболизма в мозге собственно при гипогликемии, изменения, возникающие в восстановительном периоде после купирования гипогликемической комы глюкозой и сроки нормализации связанных с гипогликемией нарушений обмена в головном мозге, до настоящего времени достаточно не исследованы. Повреждение нейронов может возникать не собственно в состоянии гипогликемии, а в восстановительном периоде. Кроме того, купирование гипогликемической комы в реальных условиях часто сопровождается гипергликемией, которая сама по себе может служить причиной нарушений обмена в нервной ткани (Siesjo et al. 1988; Suh et al., 2007). Именно значительные колебания уровня глюкозы в крови приводят к большему развитию окислительного стресса, повреждению эндотелия сосудов и увеличивают риск развития кардиоваскулярных расстройств у пациентов с сахарным диабетом (Ceriello et al., 2008).
Состояния нейрогликопении в ходе лечения больных сахарным диабетом и при других заболеваниях, осложнением которых является гипогликемия, встречаются неоднократно. Поэтому изменения обмена, возникающие в мозге при нейрогликопении, могут создавать метаболический фон, усугубляющий течение последующих эпизодов гипогликемии; возможна "суммация" неблагоприятных изменений.
Гипогликемия увеличивает риск развития последующих гипогликемий. Вопросы о том, как мозг адаптируется к возобновляющимся гипогликемиям и как это может приводить к увеличению повреждаемости нервных клеток, и каким образом возможные индуцированные гипогликемией изменения метаболизма в мозге могут способствовать защите его от повреждения, остаются открытыми (Sherwin, 2008).
Поскольку состояния гипогликемии широко распространены в клинической практике и способны приводить к необратимому повреждению нейронов, исследование патохимии гипогликемии также имеет непосредственное практическое значение в отношении разработки способов защиты нейронов от гипогликемического повреждения.
Систематического изучения изменений метаболизма мозга, которые могут быть следствием неоднократного воздействия на него гипогликемии, не проводилось.
Цель и задачи исследования.
Цель исследования состояла в определение механизмов инсулиновой гипогликемии в патохимии нервных расстройств, связанных с нейрогликопенией.
Основные задачи исследования:
1. Определение принципиальной возможности и сроков восстановления основных биохимических параметров в мозге после купирования гипогликемической комы глюкозой.
2. Выявление изменений метаболизма в мозге при неоднократной нейрогликопении, способствующих развитию повреждения нейронов и постгипогликемической энцефалопатии.
3. Выяснение взаимосвязи различных изменений обмена в мозге крыс, возникающих в результате неоднократно перенесенной гипогликемии.
Научная новизна.
Впервые получены комплексные данные о состоянии энергетического обмена, метаболизма медиаторных аминокислот и процессов перекисного окисления липидов в различных отделах мозга животных при гипогликемии.
Установлено, что в отличие от однократной гипогликемии, неоднократно перенесенная гипогликемия вызывает серьезные нарушения энергетического обмена: снижение интенсивности гликолиза и гликогенолиза, активности ферментов энергетического обмена и нарушения распада гликогена в мозге.
Впервые выявлены стойкие нарушения метаболизма аминокислот в мозге животных, неоднократно перенесших гипогликемию: уменьшение активности глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы в больших полушариях и уменьшение уровня ГАМК в стволе мозга, увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы и уменьшение количества аспартата в больших полушариях мозга.
Впервые проведено комплексное исследование показателей, характеризующих интенсивность перекисного окисления липидов и систему антиоксидантной защиты в мозге при гипогликемии. Установлено, что неоднократно перенесенная гипогликемия приводит к снижению мощности антиоксидантных систем в мозге: уменьшению активности супероксиддисмутазы и продуцирующих восстановленную форму НАДФ дегидрогеназ.
Впервые проведена оценка общих показателей энергетического и азотистого обмена в организме экспериментальных животных при гиперинсулинизации. Установлено, что многократное введение высоких доз инсулина вызывает в организме в целом катаболические изменения, связанные с активацией конринсулярного аппарата.
Теоретическое и практическое значение работы. В процессе работы выявлены характерные для гипогликемии изменения метаболизма в головном мозге и в организме в целом. Проведена оценка фактора неоднократно возникающей гипогликемии в развитии нарушений обмена в головном мозге. В процессе исследования выявлены основные закономерности изменений показателей энергетического обмена, метаболизма нейромедиаторных аминокислот и перекисного окисления липидов в головном мозге при гипогликемии и оценено значение различных нарушений метаболизма в патохимии постгипогликемической энцефалопатии. Высказано предположение об увеличении потребления кетоновых тел мозгом крыс, неоднократно перенесших тяжелую гипогликемию. Установлено, что именно неоднократная нейрогликопения вызывает комплекс нарушений метаболизма, включающий в себя уменьшение гликолитической и митохондриальной энергопродукции, нарушения обмена гликогена, снижение активности ферментов синтеза ГАМК и активацию цикла пуриновых нуклеотидов в мозге, инициацию процессов перекисного окисления.
Полученные в работе данные необходимо учитывать при организации исследования нарушений обмена в головном мозге при различных патологических состояниях. Результаты работы могут служить основой для разработки профилактических и реабилитационных мероприятий в ходе лечения пациентов с сахарным диабетом, а также при других заболеваниях, сопровождающихся гипогликемией.
Положения, выносимые на защиту:
1. Изменения метаболизма, возникающие в мозге при однократной инсулиновой гипогликемии, обусловлены нейрогликопенией и имеют, в основном, обратимый характер.
2. Неоднократно перенесенная гипогликемия приводит к нарушению энергетического обмена, метаболизма нейротрансмиттерных аминокислот и активации процессов перекисного окисления липидов в мозге.
3. Большинство выявленных изменений энергетического, аминокислотного обмена и активация перекисного окисления липидов наблюдаются преимущественно в стволе мозга.
4. Общие нарушения метаболизма у животных, неоднократно перенесших инсулиновую гипогликемию, свидетельствуют об активации контринсулярного аппарата, увеличении катаболизма аминокислот и белков и сходны с таковыми при сахарном диабете.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференции УФизиологические механизмы развития экстремальных состояний Ф(Санкт-Петербург, 1995), на Первом Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием УПатофизиология органов и систем. Типовые патологические процессыФ (Москва, 1996), на конференции УСостояние и перспективы современного лекарствоведенияФ (Ярославль, 1997), на конференции УФундаментальные и прикладные аспекты современной биохимииФ, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 1998), на 12-м Международном конгрессе по нейрохимии (Санкт-Петербург, 1998), на конференции УАктуальные вопросы общей и военной патологической анатомииФ, посвященной 140-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 1999), на Всероссийской конференции УПроблемы медицинской энзимологииФ (Москва, 2002), на Всероссийской конференции УМеханизмы синаптической передачиФ (Москва, 2004), на 5-й науч.-практ. конф. с международным участием УДостижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медициныФ (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием (Новосибирск, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ, включая 14 статей в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из общего введения, описания основных методов (Глава 1), трех глав результатов собственных исследований (Главы 2-4), каждая из которых включает литературную справку, описание использованных методических приемов, результаты, обсуждение и краткое резюме. Работа заключается семью общими выводами и списком литературы, состоящим из 664 литературных источника. Работа изложена на 285 страницах, содержит 27 рисунков и 18 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты были поставлены на белых беспородных крысах массой 180-250 г. Животные содержались в обычных условиях вивария на стандартном пищевом рационе в условиях свободного доступа к корму и перед забоем были лишены пищи в течении 18-24 часов. Воду получали без ограничения во всех условиях эксперимента. Гипогликемическую кому вызывали внутримышечным введением инсулина (Actrapid MC, Actrapid HM, 40 ЕД/кг массы тела). Купирование гипогликемической комы производили путем внутрижелудочного введения 3.0 мл 40% раствора глюкозы.
При проведении опытов с неоднократной гипогликемией экспериментальные животные были разделены на 5 групп: 1 - интактные (контроль); 2а - крысы, находящиеся в состоянии гипогликемической комы; 3а - животные, обследованные через 48ачасов после купирования 1-й гипогликемической комы; 4а - крысы, перенесшие 7-9 гипогликемических ком с интервалом в двое суток во время последней из серии ком;а5аЦаживотные, перенесшие 7-9 гипогликемических ком через 48 часов после купирования последней комы.
Крыс забивали декапитацией под легким эфирным наркозом. Материалом для исследования служили большие полушария мозга и ствол мозга, сыворотка крови, печень, скелетная мышца.
Уровень субстратов энергетического и азотистого обмена в сыворотке крови определяли с использованием стандартных диагностических наборов.
Суммарную фракцию митохондрий и фракцию, содержащую растворимую часть цитоплазмы, получали общепринятыми методами дифференциального центрифугирования (Sottocasa, 1979; Прохорова, 1982). Все процедуры по выделению субклеточных фракций проводили при 0 - 4оС.
Активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41), НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.42), НАДФ-зависимой малат-дегидрогеназы, (Умалик-энзимФ, КФ 1.1.1.40), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ. 1.1.1.49), НАД-зависимой малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37), глутамат-дегидрогеназы (КФ 1.4.1.3), аланинаминотрансферезы (КФ 2.6.1.2), аспартат-аминотрансферазы (КФ 2.6.1.1), количество пирувата, цитрата, α-кетоглутарата, лактата, глутамата и гликогена определяли спектрофотометрически (Прохорова, 1982). Активность сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.99.1), -кетоглутарат-дегидрогеназы (КФ 1.2.4.2), пируватдегидрогеназы (КФ 1.2.4.1) и НАДН-дегидрогеназы (КФ 1.6.99.3) определяли с использованием 2,6-дихлорфенолиндофенола в качестве акцептора электронов (Кривченкова, 1977). Интенсивность гликолиза и гликогенолиза оценивали по накоплению лактата в среде инкубации (Панин и соавт. 1982), активность АТФаз исследовали по скорости образования неорганического фосфата (Филиппов, 1991).
Определение количества аминокислот и активности ГАМК- аминотрансферазы (КФ 2. 6. 1. 19) и глутаматдекарбоксилазы (КФ 4.1.1.15) проводили с использованием тонкослойной хроматографии (Розанов, 1980). Активности глутаминазы (КФ 3.5.1.2) и аденозинмонофосфатдезаминазы (КФ 3.5.4.6) оценивали по накоплению аммиака (Лебедевааи соавт., 1981). Активность моноаминооксидазы (КФ 1.4.3.4) определяли по накоплению аммиака, используя в качестве субстратов серотонин креатининсульфат, тирамин гидрохлорид, дофамин гидрохлорид и глюкозамин (Горошинская и соавт., 1989).
Скорость накопления малонового диальдегида оценивали по реакции с тиобарбитуровой кислотой, уровень диеновых коньюгатов - спектрофото-метрически (Никушкин и соавт., 1989). Активность супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.11) исследовали по торможению восстановления нитросинего тетразолия (Гуревич и соавт., 1990). Активности нейтральных и кислых протеаз определяли при рН соответственно 7.6 и 3.2 по накоплению тирозина (Мурти и соавт., 1985). Содержание белка определяли методом Lowry.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t - критерия Стъюдента после вычисления средней арифметической ряда (М), среднего квадратичного отклонения (σ) и средней ошибки средней ариф-метической (m). Также использовался непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Достоверными считали те результаты, для которых P<0.05. Исходные числовые данные обработаны в пакете статистических программ УBiotestФ, УStatistica 5.5Ф.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Уровень субстратов и активность ферментов энергетического и азотистого метаболизма в мозге крыс при однократной гипогликемии и в ранние сроки восстановительного периода.
В состоянии гипогликемической комы уровень глюкозы в крови крыс составлял 1.0-1.5 ммоль/л, введение глюкозы коматозным животным приводит к увеличению содержания глюкозы в крови: через 5, 15 и 30 мин величина гликемии составляет соответственно 2.0-3.0 ммоль/л, 6.0-7.0 ммоль/л и 10.0-15.0 ммоль/л.
Рис. 1. Изменения уровней энергетических субстратов в мозге крыс при инсулиновой гипогликемии и в ранние сроки восстановительного периода (Мm).
Примечание: Здесь и на рис.2-7. БПМ - большие полушария мозга, СМ- ствол мозга. Статистически достоверные по сравнению с контролем изменения обозначены: * - P < 0.05, ** - P < 0.01, *** - P < 0.001. Кома - животные в состоянии гипогликемической комы, 5, 15 и 30 мин - время после купирования комы глюкозой.
У животных в состоянии гипогликемической комы уровень исследованных субстратов энергетического обмена в мозге уменьшается (Рис. 1). Через 30 мин после купирования комы глюкозой происходит полное восстановление исследованных показателей. Расчет отношения НАД/НАДН в мозге крыс в состоянии гипогликемической комы указывает на резкое уменьшение уровня восстановленности пиридиновых нуклеотидов и свидетельствует о достаточном снабжении кислородом мозга крыс в состоянии гипогликемической комы.
Изменений интенсивности гликолиза и гликогенолиза, активности лактатдегидрогеназы, митохондриальных окислительных ферментов в больших полушариях и в стволе мозга крыс в состоянии гипогликемической комы и через 30 мин после купирования ее глюкозой не выявлено.
Рис. 2. Изменения уровней аминокислот в мозге крыс при инсулиновой гипогликемии и в ранние сроки восстановительного периода (Мm).
В состоянии гипогликемической комы в исследованных отделах мозга животных количество глутамата, ГАМК и аланина уменьшается, наблюдается увеличение уровня аспартата (Рис.2). Через 30 мин после купирования комы глюкозой происходит полное восстановление уровня исследованных аминокислот. Изменений активности глутаматдекарбоксилазы, ГАМК-, аланин- и аспартат-аминотрансфераз в мозге животных в этих экспериментах не выявлено.
Сам факт полного восстановления субстратного обеспечения гликолиза и цикла Кребса, уровня аминокислот, нормализация содержания гликогена в мозге при купировании комы глюкозой свидетельствует о сохранности ферментных систем и их регуляции после перенесенной однократной гипогликемии.
Общий вывод состоит в том, что изменения уровня исследованных субстратов отражают изменения уровня глюкозы в притекающей к мозгу крови и полностью обратимы при купировании комы глюкозой; изменения активности ферментов в состоянии однократной гипогликемической комы и в ранние сроки восстановительного периода практически отсутствуют. Таким образом, однократная гипогликемия в первом приближении представляет собою полностью обратимое в отношении исследованных показателей метаболизма состояние.
2. Общие показатели энергетического и азотистого обмена у крыс при неоднократной гипогликемии.
Время впадения крыс в первую кому и во все последующие было практически одинаковым, менялось случайным образом для каждого экспериментального животного, не зависело от количества ранее перенесенных коматозных состояний и составляло 2-3 часа. Содержание глюкозы в крови у крыс в состоянии 1-й и 7-й гипогликемических ком было практически одинаковым (Табл.1). У крыс 4-й группы концентрация свободных жирных кислот в сыворотке крови увеличивалась, а уровень кетоновых тел не отличался от нормы. У животных остальных экспериментальных групп оба эти показателя были значительно снижены.
Содержание мочевины в сыворотке крови в состоянии 1-й гипогликемической комы оставалось нормальным, а через 48 часов после купирования уменьшалось. У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, в состоянии последней комы уровень мочевины значительно повышен (на 63%, P<0.001). Концентрация мочевой кислоты в сыворотке уменьшалась у животных в состоянии первой гипогликемической комы и увеличивалась через 48 часов после купирования. У крыс 4-й группы показатель повышен по сравнению с нормой и оставался высоким через 48 часов после купирования последней комы.
Таблица 1.
Содержание энергетических субстратов, продуктов азотистого обмена в крови и гликогена в органах крыс при гиперинсулинизации (M m)
Показатель | Группы экспериментальных животных | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
Глюкоза, ммоль/л | 5.37 0.12 | 1.36 0.14*** | 5.63 0.17 | 1.76 0.23*** | 5.47 0.15 |
СЖК, мкмоль/л | 409 15 | 235 34*** | 125 11*** | 501 13*** | 245 16*** |
Кетоновые тела, мг/л | 34.8 1.6 | 18.6 2.3*** | 13.1 2.0*** | 36.9 2.5 | 25.7 1.0*** |
Мочевина, ммоль/л | 4.6 0.8 | 4.6 0.2 | 2.9 0.3** | 7.5 0.4*** | 4.4 0.7 |
Мочевая кислота, мкмоль/л | 210 4 | 168 3** | 245 5** | 244 14* | 250 10* |
Гликоген печени, мг/г | 25.9 1.6 | 17.1 1.8** | 49.3 2.5*** | 26.7 1.3 | 25.5 1.7 |
Гликоген скелет-ных мышц, мг/г | 9.5 0.6 | 5.6 0.4*** | 14.7 0.5*** | 11.2 0.9 | 13.0 1.9 |
Примечание. Здесь и в таблицах 2-8: M Ц среднее, m - ошибка среднего; статистически достоверные по сравнению с контролем изменения обозначены: * - P < 0.05, ** - P < 0.01, *** - P < 0.001. В каждой группе по 6Ц8 животных. СЖК - свободные жирные кислоты.
Количество гликогена в печени и скелетной мышце крыс в состоянии первой гипогликемической комы было снижено, через 48 часов после купирования комы количество гликогена в тканях увеличивается. У крыс, перенесших серию ком, таких изменений не обнаружено. Вне зависимости от конкретных механизмов, эти результаты однозначно свидетельствуют о нарушении распада и синтеза гликогена в тканях животных, неоднократно перенесших инсулиновую гипогликемию.
Таблица 2.
Интенсивность накопления лактата в печени крыс при гиперинсулинизации, нмоль/(мин мг белка) (M m)
Субстрат | Группы экспериментальных животных | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
Глюкоза | 12.7 1.2 | 12.3 1.1 | 12.1 1.4 | 19.0 0.8** | 14.2 1.4 |
Г6Ф | 23.2 1.4 | 21.2 1.8 | 24.6 1.7 | 25.4 2.0 | 27.8 1.3 |
Гликоген | 17.3 1.0 | 11.6 1.1** | 18.1 0.9 | 26.6 0.6*** | 16.8 2.1 |
Примечание. Г6Ф - глюкозо-6-фосфат.
Скорость образования лактата в печени крыс в состоянии 1-ой комы при использовании в качестве субстратов глюкозы и глюкозо-6-фосфата не изменялась, а интенсивность гликогенолиза снижалась на 33% (P<0.01) (Табл.2). У животных 4-ой группы интенсивность накопления лактата при использовании глюкозы и гликогена в качестве субстратов увеличивалась в 1.5 раза (в обоих случаях P<0.01), изменений скорости накопления лактата при использовании в качестве субстрата глюкозо-6-фосфата не выявлено.
Таблица 3.
Активность ферментов в печени крыс при гиперинсулинизации (M m)
Фермент | Группы экспериментальных животных | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
мкмоль / (ч мг белка) | |||||
АСТ | 5.9 0.1 | 5.6 0.3 | 6.2 0.2 | 6.8 0.1*** | 7.2 0.2*** |
АЛТ | 8.4 0.2 | 8.8 0.3 | 8.1 0.2 | 9.7 0.1*** | 9.3 0.3* |
нмоль / (ч мг белка) | |||||
ГЛТ | 171 13 | 179 6 | 84 12*** | 203 6* | 240 15** |
АМФ-Д | 37.8 1.8 | 36.1 1.8 | 37.2 5.2 | 35.5 3.3 | 25.5 2.2** |
мкмоль / (мин мг белка) | |||||
СДГ | 1.47 0.06 | 1.51 0.08 | 1.38 0.21 | 2.17 0.29* | 1.76 0.18 |
ГДГ | 0.53 0.02 | 0.51 0.04 | 0.50 0.03 | 0.66 0.05* | 0.49 0.04 |
нмоль / (мин мг белка) | |||||
ДГ | 573 44 | 582 50 | 644 29 | 698 18* | 587 32 |
Г6Ф-ДГ | 14.3 0.4 | 15.8 0.7 | 18.1 0.6*** | 38.1 1.5*** | 42.9 1.2*** |
ГР | 47.3 0.8 | 50.5 0.7* | 54.7 1.0*** | 66.9 2.3*** | 67.6 1.5*** |
НАДФ-ИЦДГ | 89.3 4.1 | 81.2 3.8 | 85.8 5.9 | 93.4 4.7 | 95.2 5.3 |
НАДФ-МДГ | 47.1 2.3 | 57.0 2.1** | 55.2 1.9* | 98.5 5.6*** | 117.7 4.9*** |
Примечание. АСТ - аспартатаминотрансфераза, АЛТ - аланинаминотрансфераза, ГЛТ - глутаминаза, АМФ-Д - аденозинмонофосфатдезаминаза, СДГ - сукцинатдегидрогеназа, ГДГ - глутаматдегидрогеназа, ЛДГ - лактатдегидрогеназа, Г6Ф-ДГ - глюкозо-6-фосфат Цдегидрогеназа, ГР - глутатионредуктаза, НАДФ-ИЦДГ и НАДФ-МДГ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимые соответственно изоцитрат- и малатдегидрогеназы.
У крыс, перенесших серию ком, в состоянии последней комы активности лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы в печени оказались увеличенными соответственно на 22%, 48 и 24% (во всех случаях P<0.01) по сравнению с контролем (Табл.3). У животных в состоянии 1-ой гипогликемической комы в печени возрастала активность глутатионредуктазы и НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы. Через 48 часов после купирования 1-ой комы повышалась активность глутатионредуктазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы соответственно на 16%, 28 и 17% (во всех случаях P<0.001). У животных 4-ой и 5-ой групп наблюдали еще более значительное увеличение активности этих ферментов.
У животных 4-ой и 5-ой групп обнаружено увеличение активности аминотрансфераз в печени на 11Ц22% (P<0.05) (Табл.3). Активность глутаминазы у крыс в состоянии 1-ой гипогликемической комы не отличалась от уровня контроля, а через 48 часов после купирования снижалась. У крыс 4-ой и 5-ой групп активность глутаминазы, напротив, увеличивалась. В печени и скелетной мышце крыс в состоянии 1-ой гипогликемической комы уменьшалась активность нейтральных протеаз, в скелетной мышце показатель оставался сниженным и через 48 часов после купирования комы (Табл.4). В состоянии комы у крыс, перенесших серию ком, обнаружено увеличение активности кислых протеаз в печени, изменения являются стойкими. В скелетной мышце активность кислых и нейтральных протеаз у крыс 5-ой группы также заметно повышена.
Таблица 4.
Активность кислых (рН 3.2) и нейтральных (рН 7.6) протеаз в печени и скелетной мышце крыс при гиперинсулинизации, нмоль /(мин г ткани) (M m)
Объект | Про-теазы | Группы экспериментальных животных | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
Печень | pH 3.2 | 52.1 3.0 | 51.7 1.6 | 52.5 1.2 | 73.8 3.3*** | 62.3 2.4* |
pH 7.6 | 19.7 0.8 | 13.5 1.5** | 18.3 1.4 | 21.7 2.7 | 20.8 0.7 | |
Мышца | pH 3.2 | 6.68 0.43 | 7.17 0.47 | 7.31 0.47 | 7.00 0.19 | 7.88 0.31* |
pH 7.6 | 18.0 0.5 | 14.7 0.9** | 13.5 0.4*** | 19.1 0.9 | 19.8 0.5* | |
Изменения большинства исследованных показателей в печени и крови у экспериментальных животных в состоянии 1-ой гипогликемической комы вызваны непосредственным действием инсулина (O`Brien et al., 2001; Belke et al., 2002). Этим обусловлено уменьшение гликогенолиза в печени (Gastaldelli et al., 2001). Снижение концентрации свободных жирных кислот и кетоновых тел в крови обусловлено ингибированием липолиза под действием инсулина (Timothy, 1996). Уменьшение концентрации конечных продуктов азотистого обмена в крови и активности протеаз в печени и скелетных мышцах у крыс 2-ой и 3-ей групп также связаны с эффектами инсулина и в целом отражают репрессию катаболизма аминокислот (Charlton, Nair, 1998).
Изменения метаболизма у животных, перенесших серию гипогликемических ком и находящихся в состоянии комы (4-ая группа), весьма значительны и связаны с активацией контринсулярного аппарата и увеличением уровней глюкагона, катехоламинов и глюкокортикоидов при гипогликемии (Bolli, Fanelli, 1999; Балаболкин, 2000). К таким изменениям относятся увеличение уровня свободных жирных кислот и мочевины в крови, сохранение нормального уровня кетоновых тел, повышение активности глутаминазы, глутаматдегидрогеназы и аминотрансфераз и в печени, поскольку глюкагон и глюкокортикоиды стимулируют липолиз в жировой ткани и глюконеогенез в печени (Timothy, 1996; Nissim et al., 1999). Инсулин не препятствует активации глюконеогенеза в печени, особенно при высокой концентрации свободных жирных кислот в крови (Staehr et al., 2003). Гормон ингибирует преимущественно гликогенолиз, а не глюконеогенез (Adkins et al., 2003) и инсулиновая гипогликемия может приводить к активации образования глюкозы (Edgerton et al., 2002). Значительное увеличение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ в печени крыс, перенесших серию гипогликемических ком, связано с действием инсулина (O`Brien, 2001).
3. Интенсивность гликолиза и гликогенолиза и активность окислительных ферментов в мозге крыс при неоднократной гипогликемии.
Количество гликогена в больших полушариях мозга и в стволе мозга у крыс в состоянии 1-ой гипогликемической комы уменьшалось соответственно на 55% и 45% (в обоих случаях (P<0.01) и не отличалось от уровня контроля у животных других групп (Рис. 3).
Рисунок 3. Содержание гликогена в мозге крыс при гиперинсулинизации (M m).
Примечание. Здесь и на рис.4-7 - 2,3,4,5 - группы экспериментальных животных.
У крыс, забитых в состоянии последней из серии гипогликемических ком, при использовании всех субстратов обнаружено уменьшение интенсивности дихотомического распада углеводов (Табл. 5). Наиболее выраженные изменения в исследованных отделах мозга наблюдаются при использовании в качестве субстрата глюкозо-6-фосфата (-62%, P<0.001).
Такие изменения могут быть связаны с уменьшением скорости фосфо-фруктокиназной реакции (Magen et al., 1995) и/или с повреждением дегидрогеназы 3-фосфоглицеринового альдегида в результате активации окислительного стресса (Ciolino, Levine, 1997; Miura et al., 1997). Отсутствие изменений уровня гликогена и уменьшение интенсивности гликогенолиза в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию, в состоянии последней комы, свидетельствует о нарушении утилизации полисахарида. Нарушение использования гликогена в мозге рассматривается как один из существенных патохимических маркеров в развитии энцефалопатий различного генеза (Magistretti, Pellerin, 1996; Brown, 2004).
Таблица 5.
Интенсивность накопления лактата в головном мозге крыс при гиперинсулинизации, нмоль/(мин мг белка) (M m)
Субстрат | Группы экспериментальных животных | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
Большие полушария мозга | |||||
Глюкоза | 53.6 1.1 | 55.1 1.0 | 55.4 1.2 | 40.02.1*** | 56.1 1.1 |
Г6Ф | 66.1 4.0 | 63.6 2.1 | 64.9 2.8 | 25.80.6*** | 65.8 2.5 |
Гликоген | 19.8 2.1 | 20.1 1.6 | 21.1 1.7 | 10.32.0* | 18.7 2.1 |
Ствол мозга | |||||
Глюкоза | 57.6 1.0 | 55.7 1.1 | 55.1 1.4 | 37.41.6*** | 57.4 1.3 |
Г6Ф | 73.7 5.5 | 67.4 4.0 | 69.7 3.4 | 28.32.6*** | 68.3 3.1 |
Гликоген | 18.7 1.5 | 21.3 1.2 | 19.5 0.9 | 11.40.8*** | 14.4 0.9* |
Примечание. Г6Ф - глюкозо-6-фосфат.
Угнетение гликолитической энергопродукции имеет существенное значение в нарушении функций мозга (Lipton, 1991; Ames, 2000; Korf, Gramsbergen, 2007). Гликолитическая энергопродукция в астроцитах обеспечивает работу Na+-, K+-АТФазы и удаление К+ из внеклеточной жидкости, поддерживая, тем самым, мембранный потенциала покоя нейронов, обеспечивает Na+-зависимый захват глутамата астроцитами (Pellerin, Magistretti, 1994), а также включение глутамата в состав синаптических везикул (Ikemoto et al., 2003). Образованный астроцитами лактат используется нейронами в качестве энергетического субстрата (Ames, 2000; Brown, 2004). Продукция молочной кислоты астроцитами имеет значение в регуляции концентрации Н+ во внеклеточной жидкости; Н+ уменьшает сродство NMDA-рецепторов к аспартату и глутамату (Tombaugh, Sapolsky, 1993). Лактат препятствует развитию эксайтотоксических эффектов глутамата (Ros et al., 2001), способствует выживанию нейронов в отсутствии глюкозы (Zeevalk, Nicklas, 2000).
Полученные данные позволяют предполагать, что в качестве источника энергии используются неглюкозные субстраты, в частности кетоновые тела плазмы крови и кетоновые тела, образующиеся в мозге в ходе окисления аминокислот с разветвленным радикалом (валина, лейцина, изолейцина) (Honegger et al., 2002; Greene et al., 2003).
В ходе экспериментов не было обнаружено изменений активности лактатдегидрогеназы, пируватдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы в мозге. В состоянии последней гипогликемической комы у крыс, перенесших серию ком, наблюдается снижение активности α-кетоглутаратдегидрогеназы в мозге. У крыс 4-ой и 5-ой групп наблюдается уменьшение активности НАДН-дегидрогеназы в стволе мозга. Активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы у животных 5-ой группы в стволе мозга увеличена (Табл. 6).
Таблица 6.
Активность ферментов нмоль / (мин мг белка) в головном мозге крыс при гиперинсулинизации (M m)
Фермент | Отдел мозга | Группы экспериментальных животных | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
НАД- ИЦДГ | БПМ СМ | 47.81.6 33.71.9 | 49.71.5 34.41.7 | 45.11.1 32.71.5 | 52.83.1 38.62.1 | 53.64.0 40.51.8* |
НАДН- ДГ | БПМ СМ | 83.31.8 54.12.1 | 80.12.2 51.51.7 | 85.22.0 57.31.4 | 78.11.7 44.71.9** | 84.43.1 46.01.2** |
α-КГЛ-ДГ | БПМ СМ | 53.92.4 53.83.7 | 48.72.5 45.83.1 | 51.62.6 49.73.3 | 45.62.1* 42.53.0* | 48.62.2 45.13.4 |
НАД- МДГ надосадок | БПМ СМ | 124640 141674 | 105339** 114137** | 119630 135155 | 102245** 120153* | 121947 134261 |
НАД-МДГ митохондр. | БПМ СМ | 4166 3888 | 43012 37110 | 44015 36914 | 40814 36012 | 4326 3547* |
Примечание. Здесь и в табл. 7-8: БПМ - большие полушария мозга, СМ - ствол мозга. НАД-ИЦДГ - никотинамидадениндинуклеотид-зависимая изоцитратдегидрогеназа, НАДН-ДГ - дегидрогеназа восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида, -КГЛ-ДГ - -кетоглутаратдегидрогеназа, НАД-МДГ - никотинамидадениндинуклеотид-зависимая малатдегидрогеназа.
Наиболее вероятной причиной уменьшения активности α-кетоглутарат-дегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы является их повреждение в ходе активации окислительного стресса (Lenaz et al., 1997; Kumar et al., 2003). Кроме того, α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс способен генерировать (а при окислительном повреждении особенно) активные формы кислорода (Starkov et al., 2004). Уменьшение активности НАДН-дегидрогеназы и α-кетоглутарат-дегидрогеназы в мозге животных, перенесших серию гипогликемических ком может приводить к уменьшению продукции и окисления восстановленной формы НАД и к нарушению продукции АТФ в нервной ткани. Увеличение активности НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы в стволе мозга у крыс 5-ой группы, по-видимому, связано с индукцией синтеза белка-фермента и свидетельствует об увеличении окисления кетоновых тел в мозге (Veech et al., 2001).
В больших полушариях и в стволе мозга активность Na+,K+-АТФазы была повышена у крыс, находящихся в состоянии гипогликемической комы (2-ая и 4-ая группы) в 1,5 раза (P<0.001) (Рис. 4). У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, увеличение активности фермента наблюдается и через 48 часов после купирования последней комы.
Рисунок 4. Активность Na,K+-АТФазы в мозге крыс при гиперинсулинизации (Мm).
Увеличение активности фермента при гипогликемии было найдено также и другими исследователями (Филиппов, 1991; Kaur, Arora, 1994). Нейрогликопения является фактором, приводящим к активации Na+,K+-АТФазы в мозге. Повышение активности фермента у животных, неоднократно перенесших гипогликемию, связано с увеличением синтеза белка-фермента. Гипогликемия приводит к увеличению продукции адренокортикотропного гормона и кортикостероидов (Bolli, Fanelli, 1999; Балаболкин, 2000), которые стимулируют синтез Na+,K+-АТФазы в мозге (Grillo et al., 1997). Увеличение активности Na+,K+-ATФазы также может быть вызвано обеспечением ее работы митохондриальным АТФ в условиях большего окисления кетоновых тел (Gribble et al., 2000; Gajewskiа et al., 2003).
В состоянии собственно нейрогликопении можно предполагать другие механизмы увеличения активности Na+,K+-ATФазы в мозге, а именно изменение скорости фосфорилирования-дефосфорилирования -субъединиц (Therien, Blostein, 2000; Kimura et al., 2007), дополнительную УсборкуФ молекул фермента из Увнутриклеточных запасовФ (Clausen, 2003), и/или изменение экспрессии регуляторных субъединиц семейства FXYD (Bguin et al., 2002; Dubyak, 2004).
5. Изменения уровня аминокислот и ферментов азотистого метаболизма в мозге крыс при неоднократной гипогликемии.
Направленность и выраженность изменений уровня исследованных аминокислот оказались практически одинаковыми у животных, подвергнутых однократной гипогликемии и у крыс, перенесших серию гипогликемических ком в состоянии последней гипогликемической комы (Рис.5). У животных 5-ой группы наблюдается уменьшение уровня аспартата в больших полушариях мозга (-10%, P<0.05) и ГАМК в стволе мозга (-29%, P<0.05). У крыс, 4-ой и 5-ой групп в больших полушариях мозга обнаружено уменьшение активности глутаматдекарбоксилазы на 11-12% (в обоих случаях P<0.01) (Табл.7).
У крыс, находящихся в состоянии 1-ой гипогликемической комы наблюдается снижение активности глутаминазы в больших полушариях и в стволе мозга (Табл. 7), изменения сохраняются и через 48 часов после купирования комы. Аналогичные изменения обнаружены и в экспериментах с многократной гипогликемической комой. У животных 2-ой, 4-ой и 5-ой групп выявлено увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы в мозге.
Уменьшение количества глутамата, аланина и ГАМК в мозге в состоянии гипогликемической комы является следствием снижения образования их из глюкозы и результатом использования этих аминокислот в качестве эндогенных субстратов окисления. Увеличение содержания аспартата обусловлено уменьшением уровня восстановленности клеточных редокс-систем и снижением гликолитического потока при нейрогликопении (Auer, Siesjo, 1993; Daikhin, Yudkoff, 1998).
Рис. 5. Изменения уровней аминокислот в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию (M m).
Уменьшение количества аспартата в сочетании с увеличением активности аденозинмонофосфатдезаминазы в больших полушариях мозга крыс, перенесших гипогликемию неоднократно свидетельствует об активации непрямого дезаминирования аспартата в реакциях пуринового цикла, что неизбежно приводит к образованию свободного аммиака (Marynissen et al., 1992; Borza et al., 2003). Увеличение уровня аммиака в мозге оказывает разнообразные неблагоприятные воздействия на метаболизм, гемоциркуляцию и синаптическую передачу и способно в конечном итоге приводить к повреждению и гибели клеток (Butterworth, 2002; Rose et al., 2005, 2006). Уменьшение уровня аспартата в нервной ткани также может быть связано с увеличение окисления кетоновых тел мозгом (Yudkoff et al., 2001; Greene et al., 2003).
Таблица 7.
Активность ферментов азотистого метаболизма в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию (M m)
Фермент | Отдел мозга | Группы экспериментальных животных | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
ГЛ-ДК | БПМ | 14.3а 0.3 | 13.4а 0.4 | 14.4 0.4 | 12.5 0.4** | 12.7 0.4** |
СМ | 16.4 1.0 | 15.7а1.3 | 15.9 1.0 | 15.4 0.9 | 16.5а 1.2 | |
ГЛТ | БПМ | 73.30.8 | 65.62.0** | 67.11.3** | 45.13.3*** | 49.43.2*** |
СМ | 64.71.3 | 58.32.0* | 63.41.9 | 56.83.0* | 55.32.7* | |
ГДГ | БПМ | 26718 | 27315 | 27515 | 25113 | 26511 |
СМ | 26415 | 26114 | 25921 | 26616 | 25018 | |
АМФ-Д Митохондрии | БПМ | 32.51.6 | 36.71.8 | 29.91.7 | 43.12.5** | 39.61.9* |
СМ | 29.31.2 | 33.61.5* | 28.51.6 | 38.31.9** | 37.31.5** | |
АМФ-Д Надосадок | БПМ | 30.21.4 | 35.31.7* | 34.11.8 | 40.41.8*** | 39.42.2** |
СМ | 28.51.1 | 34.21.4** | 30.51.3 | 39.72.1*** | 41.32.5*** | |
Примечание. ГЛТ - глутаминаза, ГДГ - глутаматдегидрогеназа, ГЛ-ДК - глутаматдекарбоксилаза, АМФ-Д - аденозинмонофосфатдезаминаза. Активности ГЛТ, ГДГ и АМФ-Д выражены в нмоль / (мин мг белка), ГЛ-ДК - в мкмоль / (ч г ткани).
Увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы может приводить к уменьшению общего пула адениловых нуклеотидов, к снижению энергообеспечения и нарушению межклеточных коммуникаций, обеспечиваемых нуклеотидами (Inoue et al., 2007). Образование и последующее окисление гипоксантина и ксантина в ксантиноксидазной реакции сопровождается продукцией супероксиданионрадикала (Desco et al., 2002) и тем самым способно стимулировать процессы перекисного окисления. Окислительный стресс, в свою очередь, приводит к увеличению активности аденозинмонофосфатдезаминазы путем окисления SH-групп в молекуле фермента (Tavazzi et al., 2001).
Причинами обнаруженного в наших исследованиях уменьшения активности глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы могут быть значительные колебания уровня субстратов (глутамина, глутамата и аммиака) при гипогликемии и купировании гипогликемической комы (Rao, Murthy, 1993; Butterworth, 1998), а также повреждение ферментов в результате активации окислительного стресса. Указанные изменения могут относиться именно к ГАМК-ергическим нейронам, поскольку эти нейроны обладают высокой фосфатзависимой глутаминазной активностью (Hogstag et al., 1988). Независимо от конкретных механизмов, снижение активности глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы может иметь значение в уменьшении потенциальных возможностей глутамат- и ГАМК-ергической передачи в ЦНС в результате перенесенной гипогликемии, так как основным источником глутамата и ГАМК, освобождаемых нервными окончаниями, является глутамин (Sonnewald et al., 1993; Honegger et al., 2002).
6. Перекисное окисление липидов и связанные с ним реакции в мозге крыс при инсулиновой гипогликемии.
У крыс в состоянии 1-ой гипогликемической комы изменений в накоплении малонового диальдегида в исследованных отделах мозга не выявлено. Активность супероксиддисмутазы снижалась в стволе мозга на 21% (P<0.001), активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и митохондриальной НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы была снижена в больших полушариях и в стволе мозга (на 9-12%, P<0.05). У крыс 3-ей группы изменений исследованных показателей не выявлено. У животных, перенесших серию гипогликемических ком, через 48 часов после купирования последней комы в стволе мозга обнаружено увеличение образования малонового диальдегида.
У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, наблюдалось уменьшение активности супероксиддисмутазы в больших полушариях мозга и в стволе мозга на 40-50% (P<0.05) (Табл.8). В обоих отделах мозга животных этой группы выявлено уменьшение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ, являющихся компонентами ферментативной антиоксидантной системы клеток.
В стволе мозга экспериментальных животных, перенесших серию гипогликемических ком, активность нейтральных протеаз увеличивается на 20% (P<0.001), а кислых протеаз на 28% (P<0.01) (Рис. 6).
Рис. 6. Активность протеаз в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию.
Таблица 8.
Уровень диеновых коньюгатов (Е232 . 1000) /мг ткани, активность СОД (ЕД / мг белка), НАДФ-зависимых дегидрогеназ нмоль/(мин мг белка) в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком, через 48 часов после купирования последней комы (Mа±аm)
Показатель | Отдел мозга | Контроль | Опыт |
ДК | БПМ | 1.80 ± 0.13 | 1.41 ± 0.11* |
CМ | 2.55 ± 0.05 | 1.57 ± 0.12* | |
СОД | БПМ | 210 ± 11а | 102 ± 12* |
СМ | 220 ± 12а | 135 ± 23* | |
Г6Ф-ДГ | БПМ | 12.2 ± 0.3а | 11.3 ± 0.2* |
СМ | 17.0 ± 0.4а | 17.2 ± 0.5 | |
ГР цитоплазматическая фракция | БПМ | 11.0 ± 0.2а | 9.7 ± 0.3* |
СМ | 13.1 ± 0.7а | 13.0 ± 0.6 | |
НАДФ-ИЦДГ цитоплазматическая фракция | БПМ СМ | 10.5 ± 0.3 13.1 ± 0.3 | 9.5 ± 0.3* 12.2 ± 0.2* |
НАДФ-ИЦДГ митохондриальная фракция | БПМ | 16.6 ± 0.8а | 16.5 ± 1.0 |
СМ | 14.3 ± 1.8 | 9.0 ± 0.5* | |
НАДФ-МДГ, цитоплазматическая фракция | БПМ | 6.8 ± 0.4 | 6.4 ± 0.3 |
СМ | 10.3 ± 0.5 | 8.0 ± 0.4* | |
НАДФ-МДГ митохондриальная фракция | БПМ | 33.6 ± 2.0а | 31.8 ± 1.6 |
СМ | 37.5 ± 1.6а | 34.7 ± 1.7 |
Примечание. ДК - диеновые коньюгаты, СОД - супероксиддисмутаза, Г6Ф-ДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, ГР - глутатионредуктаза, НАДФ-ИЦДГ и НАДФ-МДГ - соответственно никотинамидадениндинуклеотидфосфат-зависимые изоцитрат- и малат- дегидрогеназы.
Уакрыс, находящихся в состоянии гипогликемической комы, наблюдается уменьшение активности моноаминооксидазы (МАО) в больших полушариях мозга при использовании в качестве субстрата тирамина. Активность фермента в стволе мозга уменьшалась при использовании в качестве субстратов серотонина, тирамина и дофамина, и имела тенденцию к увеличению при инкубации с глюкозамином (Рис.7). На 2-е сутки после купирования 1-ой комы наблюдается уменьшение интенсивности образования аммиака при использовании в качестве субстратов МАО серотонина и тирамина. В то же время обнаружено увеличение моноаминооксидазной активности при использовании в качестве субстрата глюкозамина, в больших полушариях мозга в 2,2 раза, в стволе мозга в 2,7 раза.
У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, на 2е сутки после купирования последней комы в больших полушариях мозга уменьшается активность МАО при использовании в качестве субстрата тирамина; в стволе мозга снижается активность фермента при использовании в качестве субстрата серотонина, тирамина и дофамина (Рис.7). У животных этой экспериментальной группы наблюдается увеличение образования аммиака при инкубации митохондриальных фракций, полученных из больших полушарий мозга и ствола мозга с глюкозамином соответственно в 2,6 и в 3,5 раза.
Рис. 7. Активность МАО при использовании различных субстратов фермента в мозге крыс при гипогликемии. 2а- крысы, находящиеся в состоянии гипогликемической комы, 3а- через 12ачас после купирования гипогликемической комы глюкозой, 4а- через 48ачасов после купирования комыаиа5а-аживотные, перенесшие 7- 9 гипогликемических ком с интервалом 2адня на 2е сутки после купирования последней комы.
Увеличение скорости накопления малонового диальдегида свидетельствует об активации процессов перекисного окисления липидов в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию. Стимуляция перекисного окисления липидов при гипогликемии связана не только с дефицитом энергии, нарушениями кальциевого гомеостаза и относительной гипероксией, но и с нарушением системы антиоксидантной защиты. Уменьшение активности супероксиддисмутазы в мозге крыс при гипогликемии, следует рассматривать как неблагоприятный фактор, способный в конечном итоге приводить к повреждению клеток мозга, поскольку токсичность кислорода связана, прежде всего, с образованием супероксиданионрадикала (Lebovitz et al., 1996; Hinerfeld et al., 2004).
Выявленное в настоящем исследовании уменьшение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ у крыс, подвергнутых гипогликемии, также может быть связано с окислением сульфгидрильных групп белковой части молекул ферментов активными формами кислорода и азота (Halliwel, 1992; Gerlach et al, 1994). Увеличение активности протеаз также является результатом развития окислительного стресса, поскольку действие на геном продуктов перекисного окисления липидов приводит к индукции синтеза протеаз (Halliwel, 1992, 2006). Моноаминооксидаза обнаруживает высокую чувствительность к окислительному стрессу, которая выражается в снижении активности при использовании специфических субстратов и к расширению спектра относительной специфичности фермента (Горошинская и соавт., 1999). Уменьшение активности МАО, продемонстрированное в настоящем исследовании, может быть результатом окислительного стресса и окисления сульфгидрильных групп активного центра фермента (Sablin, Ramsay, 1988; Hubalek et al., 2003).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В наших исследованиях не удалось выявить существенных изменений интенсивности гликолиза и активности ферментов цикла Кребса, активности ферментов азотистого метаболизма, показателей перекисного окисления и связанных с ним реакций в мозге крыс в состоянии однократной гипогликемической комы, в ранние сроки после купирования ее глюкозой и через 48 час после перенесенного воздействия. Восстановление субстратного обеспечения гликолиза и цикла Кребса и нормализация уровня аминокислот при купировании комы глюкозой свидетельствует о сохранности ферментных систем и их регуляции после перенесенной однократной гипогликемии.
Изменения большинства исследованных показателей в печени и крови у экспериментальных животных в состоянии 1-ой гипогликемической комы вызваны непосредственным действием инсулина. При многократном воздействии высоких доз инсулина метаболическая реакция на введение гормона обусловлена активацией контринсулярного аппарата в ответ на гипогликемию. Такая реакция проявляется в увеличении уровня свободных жирных кислот и сохранении высокого уровня кетоновых тел в крови, существенном повышении содержания мочевины в крови и активности глутаминазы, глутаматдегидрогеназы, аминотрансфераз в печени, увеличении активности протеаз в печени и скелетной мышце. Таким образом, неоднократно перенесенная гипогликемия представляет собою стрессорное воздействие и вызывает комплекс патохимических изменений, сходный с таковым при сахарном диабете.
У животных, неоднократно перенесших гипогликемию, в мозге выявлена активация процессов перекисного окисления и нарушения системы антиоксидантной защиты: увеличение уровня малонового диальдегида, снижение активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы, а также ферментов продуцирующих восстановленную форму НАДФ. Свидетельствами активации процессов перекисного окисления являются также увеличение активности протеаз и изменения субстратной специфичности МАО в мозге этих животных.
Выявленные изменения не только являются следствием и свидетельством развития окислительного стресса, но и способствуют дальнейшей активации перекисного окисления. Уменьшение активности НАДФН-продуцирующих дегидрогеназ и глутатионредуктазы приводит к нарушению обезвреживания активных форм кислорода. Увеличение их образования является вероятной причиной изменения активности ферментов. Повреждение МАО приводит к расширению спектра ее субстратной специфичности. Окисление МАО веществ, в норме не являющихся ее субстратами, ведет к увеличению продукции активных форм кислорода и дальнейшей активации процессов перекисного окисления, ускорению катаболизма компонентов клеточных мембран, а также к дополнительному образованию аммиака в нервной ткани. Окислительное повреждение аденозинмонофосфатдезаминазы обусловливает увеличение ее активности и, как следствие Ц увеличение непрямого дезаминирования аспартата, снижение содержания аспартата и субстратного обеспечения малат-аспартатного шунта в мозге, увеличение образования аммиака в нервной ткани, катаболизма пуриновых нуклеотидов и дальнейшую продукцию активных форм кислорода в ксантиноксидазной реакции. Активация процессов перекисного окисления является вероятной причиной уменьшения интенсивности гликолиза и гликогенолиза, активности НАДН-дегидрогеназы и активности αЦкетоглутаратдегидрогеназы, глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы в мозге. Нарушения энергообеспечения, в свою очередь, способствуют развитию окислительного повреждения клеток.
Механизмы повреждения нейронов при гипогликемии имеют эксайтотоксическую природу. Угнетение энергопродукции, особенно гликолитической, является фактором, способствующим повреждению нейронов. К нарушениям, возникающим на уровне клетки, относятся изменения уровня субстратов и активности ферментов энергетического обмена в мозге и активация процессов перекисного окисления, вызываемые неоднократно перенесенной нейрогликопенией. Ряд выявленных изменений может быть связан с нарушениями, возникающими на уровне нейронных цепей. К последним можно отнести уменьшение активности глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы в больших полушариях и снижение уровня ГАМК в стволе мозга. Такие изменения могут быть связаны с повреждением нейронов базальных ганглиев и сокращением медиаторного пула ГАМК, выделяющегося окончаниями стрио- и паллидонигральных путей. Высокая уязвимость структур ствола мозга к повреждению при гипогликемии, связана с большим содержанием в них липидов и большим количеством ионов железа, накапливаемых меланином дофаминергических нейронов и освобождаемых при неблагоприятных воздействиях на мозг. Угнетение ГАМК-ергических тормозных воздействий на структуры ствола мозга также способно приводить к повреждению нейронов и явится одной из причин больших нарушений метаболизма в этом отделе мозга, выявленных в настоящем исследовании.
Изменения ряда показателей позволяют также высказать предположение о возможной метаболической адаптации мозга к возобновляющейся нейро-гликопении. Периодически возникающая гипогликемия в условиях высокого уровня кетоновых тел в крови способна приводить к уменьшению экспрессии генов гликолитических ферментов, увеличению экспрессии генов ферментов цикла Кребса и Na+,K+-ATPазы и к изменениям экспрессии генов транспортеров глюкозы и кетоновых тел через гематоэнцефалический барьер (Greene et al., 2003). У животных, неоднократно перенесших гипогликемию, содержание кетоновых тел и свободных жирных кислот в крови в состоянии гипогликемической комы поддерживалось на высоком уровне, в мозге уменьшалась интенсивность гликолиза и гликогенолиза и сохранялся высокий уровень гликогена, увеличивалась активность НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы и активность Na+,K+-ATPазы. С учетом литературных данных, такие изменения можно интерпретировать и как свидетельства увеличения окисления кетоновых тел мозгом животных, неоднократно перенесших инсулиновую гипогликемию.
Изменения метаболизма, наблюдаемые в головном мозге животных, неоднократно перенесших гипогликемию, по-видимому, являются следствием Усуммирования неблагоприятных измененийФ, в значительной мере обусловлены повреждениями, возникшим в результате предшествующего воздействия и снижающими толерантность к последующему неблагоприятному воздействию. Гипогликемическая кома в клинике внутренних болезней часто неоднократно наблюдается у больных сахарным диабетом. В этом случае патогенное воздействие (гипогликемическая кома) развивается у пациентов, a priori имеющих нарушения метаболизма, связанные с основным заболеванием. В экспериментах, выполненных на крысах с аллоксановым диабетом, уже однократная гипогликемия приводила к уменьшению интенсивности гликолиза и гликогенолиза в мозге. При этом в стволе мозга наблюдалось уменьшение активности окислительных ферментов.
В целом изменения метаболизма, выявленные в головном мозге животных, неоднократно перенесших гипогликемию, имеют неблагоприятный характер. Основной причиной таких изменений является возобновляющаяся нейрогликопения. Совокупность их складывается в комплекс, характеризующий повреждение нервных клеток при патогенном воздействии, включающий в себя нарушения энергетического обмена, метаболизма медиаторных аминокислот и активацию процессов перекисного окисления липидов.
ВЫВОДЫ
1. Нарушения энергетического обмена и метаболизма нейромедиаторных аминокислот в мозге, возникающие в состоянии однократной гипогликемии имеют в целом обратимый характер. Большинство выявленных изменений нормализуется через 30 мин после купирования гипогликемической комы глюкозой. Изменений активности ферментных систем гликолиза, цикла Кребса и ГАМК-шунта в состоянии гипогликемической комы, в ранние сроки восстановительного периода и через 48 часов после купирования однократной комы глюкозой не выявлено.
2. У животных, неоднократно перенесших тяжелую гипогликемию, наблюдаются снижение интенсивности гликолиза и гликогенолиза, активности α-кетоглутаратдегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы в больших полушариях и в стволе мозга. Выявленные изменения свидетельствуют о нарушении процессов энергопродукции в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком.
3. Нарушения распада гликогена в стволовых структурах мозга у животных, многократно подвергнутых воздействию гипогликемических доз инсулина, сохраняются длительное время после купирования гипогликемической комы. Такие изменения могут быть результатом развития окислительного стресса и иметь существенное значение в механизмах возникновения и развития постгипогликемической энцефалопатии.
4. Увеличение активности аденозинмонофосфатдезаминазы в больших полушариях и в стволе мозга и уменьшение количества аспартата в больших полушариях мозга животных, неоднократно перенесших гипогликемию, свидетельствует об активации цикла пуриновых нуклеотидов, чтоаспособствует увеличению образования аммиака в нервной ткани, катаболизма пуриновых нуклеотидов и продукции активных форм кислорода, нарушает субстратное обеспечение малат-аспартатного шунта в мозге. Уменьшение активности глутаминазы указывает на снижение потенциальных возможностей глутаматергической передачи в мозге. Уменьшение активности глутаматдекарбоксилазы в больших полушариях мозга и уровня ГАМК в стволе мозга свидетельствует о нарушении ГАМК-ергических тормозных воздействий на структуры ствола мозга.
5. Многократное воздействие гипогликемических доз инсулина приводит к активации процессов перекисного окисления липидов, увеличению активности протеаз, снижению активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ и к изменению субстратной специфичности моноаминооксидазы в мозге.
6. Нарушения энергетического обмена, метаболизма медиаторных аминокислот и активация процессов перекисного окисления липидов, вызываемые неоднократно перенесенной нейрогликопенией, более выражены в стволовых структурах мозга.
7. Общая метаболическая реакция на многократное воздействие высоких доз инсулина обусловлена активацией контринсулярного аппарата и свидетельствует об увеличении катаболизма белков и липидов и стимуляции глюконеогенеза в печени.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК.
1. Телушкин П.К., Потапов П.П. Интенсивность гликолиза и активность ферментов энергетического обмена в мозге крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Пробл. эндокринологии. 1994. Т.40. № 5. С.53-54.
2. Телушкин П.К., Потапов П.П. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ и уровень восстановленности пиридиновых нуклеотидов в мозге крыс при инсулиновой гипогликемии и в восстановительном периоде // Вопр. мед. химии. 1995. Т. 41. № 3. С.26-28.
3. Телушкин П.К., Шидловская Т.Е. Активность ферментов и содержание субстратов ГАМК-шунта в мозге крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Вопр. мед. химии. 1996. Т. 42. № 4. С.306-308.
4. Телушкин П.К. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов, активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ и протеаз в мозге крыс при многократном введении инсулина // Пробл. эндокринологии. 1998. Т. 44. № 3. С. 35-38.
5. Телушкин П.К. Глутамат и перекисное окисление в патогенезе заболеваний ЦНС // Вопр. мед. химии. 1998. Т. 44. № 6. C. 520-526.
6. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д. Гипогликемия и мозг: метаболизм и механизмы повреждения нейронов // Успехи физиол. наук. 1999. Т. 30. № 4. С. 14-27.
7. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П. Активность ферментов дезаминирования в мозге крыс в восстановительном периоде после инсулиновой гипогликемии // Пробл. эндокринологии. 2001. Т. № 5. С. 43-45.
8. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П., Лучкин А.А. Гликолиз в головном мозге крыс, подвергнутых одно- и многократной гиперинсулинизации // Вестн. С-Петербургского университета. Сер. 3. 2004. № 3. С. 50-54.
9. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П., Медведева Н.Б., Стельмах А.Ю. Гликолиз и активность окислительных ферментов в головном мозге крыс при инсулиновой гипогликемии на фоне аллоксанового диабета // Бюл. эксперим. биол. мед. 2005. Т.140. № 12. С.647-649.
10. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П., Медведева Н.Б. Показатели метаболизма у крыс при многократной инсулиновой гипогликемии // Пробл. эндокринологии. 2006. Т.52. № 5. С. 45-47.
11. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П. Изменение энергетического обмена и повреждение нервных клеток у крыс при многократном введении высоких доз инсулина // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2006. Т. 42. № 2. С. 125-129.
12. Потапов П.П., Стельмах А.Ю., Телушкин П.К., Медведева Н.Б. Изменения показателей энергетического обмена в сердце крыс при аллоксановом диабете и инсулиновой гипогликемии // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 2007. № 1. С. 24-26.
13. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П. Показатели энергетического и азотистого обмена у крыс при инсулиновой гипогликемии // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 3. С. 324-332.
14. Ноздрачев А.Д., Телушкин П.К. Активность глюкозо-6-фосфатазы в печени и уровень свободных жирных кислот в крови у крыс при инсулиновой гипогликемии // Доклады АН. 2008. Т. 422. № 2. С. 268-269.
Статьи в научных журналах и сборниках, тезисы докладов.
1. Телушкин П.К., Филиппов С.П., Шидловская Т.Е. Особенности обмена в мозге крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Мат. науч. конф. УФизиологические механизмы развития экстремальных состояний Ф. СПб, УНаукаФ. 1995. С.82.
2. Телушкин П.К., Потапов П.П., Шидловская Т.Е. Изменения обмена в различных отделах мозга крыс, вызываемые многократным воздействием гипогликемии // Первый российский конгресс по патофизиологии с международным участием УПатофизиология органов и систем. Типовые патологические процессыФ. М., 1996. С. 308.
3. Телушкин П.К. Активность супероксиддисмутазы в тканях крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Мат. науч. конф. УСостояние и перспективы современного лекарствоведенияФ. Ярославль, 1997. С. 203.
4. Телушкин П.К., Шидловская Т.Е., Редько С.Ф. Неоднократная гипогликемия как стрессорное воздействие // Cб. УСовременные проблемы естествознанияФ. Ярославль, 1997. С. 29-30.
5. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Филиппов С.П. Активность ферментов энергетического обмена в мозге крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Труды науч. конф. УФундаментальные и прикладные аспекты современной биохимииФ, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова. СПб. 1998. С. 320-323.
6. Telushkin P.K., Nozdrachev A.D. Metabolism alteration in the rat brain during repeated hypoglycemic doses of insulin exposure // J. Neurochem. 1998. V. 71. (Suppl.). S80D.
7. Неополитанский В.Ю., Телушкин П.К., Панченко К.И. Темные нейроны головного мозга крыс, неоднократно перенесших гипогликемию // Мат. Науч. Конф. УАктуальные вопросы общей и военной патологической анатомииФ, посвященной 140-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии. СПб. 1999. С. 109.
8. Потапов П.П., Телушкин П.К., Шидловская Т.Е., Лучкин А.А., Ноздрачев А.Д. Показатели азотистого метаболизма у крыс при воздействии высоких доз инсулина // Сб. У55 лет Ярославской государственной медицинской академииФ. Ярославль, ЯГМА, 1999. С. 109-112.
9. Потапов П.П., Телушкин П.К., Лучкин А.А. Интегральные показатели метаболизма у крыс при многократном введении высоких доз инсулина // Сб. УСовременные проблемы фармакогнозии и фитотерапииФ. Ярославль, 1999. С.141-145.
10. Телушкин П.К., Потапов П.П. Резистентность клеток нервной ткани при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Там же. С. 145-148.
11. Потапов П.П., Лучкин А.А., Телушкин П.К. Активность ферментов азотистого обмена у крыс при гиперинсулинизации //Труды Всероссийской конф. УПроблемы медицинской энзимологииФ. Международный симпозиум УПиридоксальзависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицинаФ. М., УАвиаиздатФ. 2002. С. 173-174.
12. Телушкин П.К., Потапов П.П. Неоднократно перенесенная гипогликемия вызывает метаболический стресс в нервной ткани // Там же. С.200 - 201.
13. Телушкин П.К., Медведева Н.Б., Потапов П.П., Стельмах А.Ю. Интенсивность гликолиза и активность некоторых окислительных ферментов в головном мозге крыс при инсулиновой гипогликемии на фоне аллоксанового диабета // Мат. Всероссийской конф. УМеханизмы синаптической передачиФ М.: Изд-во Икар, 2004. С. 92.
14. Стельмах А.Ю., Медведева Н.Б., Потапов П.П., Телушкин П.К., Шидловская Т.Е. Уровень метаболитов в крови и активность ферментов азотистого обмена в сердце при гипогликемии // Мат. 5-ой науч.-практ. конф. с международным участием УДостижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медициныФ Астрахань-Волгоград-Москва, Изд-во АГМА, 2006. С. 151-155.
15. Потапов П.П., Стельмах А.Ю., Телушкин П.К., Медведева Н.Б. Изменения некоторых показателей энергетического обмена в сердце крыс при инсулиновой гипогликемии // Биомедицинская химия. 2006. Т. 52. № 6. С. 615-619.
16. Телушкин П.К., Ноздрачев А.Д., Потапов П.П. Глутамат, аспартат, ГАМК, аланин и связанные с ними реакции в мозге крыс в восстановительном периоде после инсулиновой гипогликемии // Тез. докл. IV съезда биохимиков и молекулярных биологов с международным участием. Новосибирск, 2008. С. 446.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГАМК - гамма-аминомасляная кислота
МАО - моноаминооксидаза
НАД, НАДН - никотинамидадениндинуклеотид, соответственно окисленная и восстановленная форма
НАДФ, НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, соответственно окисленная и восстановленная форма
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии