Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

ГАРИПОВА МАРГАРИТА ИВАНОВНА

Инсулин-транспортирующие системы крови

человека  в норме и при  сахарном  диабете  первого  типа.

Теоретические  и  прикладные  аспекты.

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации  на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Уфа Ц 2008

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии

ГОУ ВПО Башкирский государственный университет

Научный консультант	доктор биологических наук, профессор
	Киреева  Наиля  Ахняфовна
Официальные оппоненты:	доктор биологических наук, профессор опина Ольга Дмитриевна Московский государственный университет
	доктор биологических наук, профессор Мединцев Александр Григорьевич Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН
	доктор биологических наук, профессор Мустафина Ольга Евгеньевна Институт биохимии и генетики УН - РАН
Ведущая организация	Казанский государственный университет

Защита состоится л___ __________200__г.  в _______ часов

на заседании  Объединенного Диссертационного совета ДМ 002.133.01

при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.

Адрес: 450054, Уфа, пр. Октября, 71.  Институт биохимии и генетики УН - РАН,

www.anrb.ru/molgen/dissov.html.

       

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан У__ У ______________ 200_ г.

Ученый секретарь

диссертационного совета -                                         Бикбулатова С. М.

 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Инсулин - первый белок с доказанной гормональной активностью (Abel, 1926), однако механизм его транспорта в крови во многом остается неясным до настоящего времени. Из данных литературы следует, что в транспорте инсулина принимают участие два механизма. Первый  механизм заключается в доставке инсулина к периферическим тканям плазмой крови, в которой инсулин транспортируется в составе двух фракций: УсвязанногоФ и УсвободногоФ инсулина (Касаткина, 1996). Состав и свойства белков, формирующих фракцию связанного инсулина, изучены недостаточно; по мнению Н.К. Грачевой и соавторов (1972), эта фракция формируется за счет взаимодействия гормона с трансферином. Однако, ввиду использования авторами физико-химических методов выделения содержащих инсулин фракций, возникает сомнение в том, что были выделены все из них. Что касается свободного инсулина, то до настоящего времени не ясно, находится ли он в истинно свободном состоянии или формирует лабильный комплекс с белками крови (Старосельцева и др., 1983, Марри и др., 1993, Касаткина, 1996, Покровский, 2007).

Второй механизм транспорта инсулина заключается в доставке гормона к периферическим тканям в комплексе со специфическими рецепторами плазматической мембраны эритроцитов (Govin et. al., 1972; Сандуляк, 1972). В работах ряда авторов показано, что эритроциты крови человека и животных участвуют в транспорте инсулина наряду с плазмой и формируют его депо, из которого инсулин поступает в плазму крови и ткани в ответ на повышение уровня глюкозы, молочной кислоты и под влиянием физико-химических факторов (Доломатов, 1999; Картун и др., 2000; Запорожан и др., 2001).

Соотношение между двумя системами транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете до настоящего времени  не получило своей оценки.

В то же время, несмотря на успехи в изучении этиологии сахарного диабета и создание новых препаративных форм инсулина, сахарный диабет продолжает занимать третье место среди причин смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и рака (Старосельцева и др., 1983; Касаткина, 1996; Покровский, 2007; Chan, 2007; Neumiller et. al, 2008). Это свидетельствует о необходимости углубления знаний о механизмах синтеза, транспорта и биологического действия инсулина.

Доказано, что диабет первого типа имеет аутоиммунную природу. Разрушение продуцирующих инсулин β-клеток осуществляют собственные лимфоциты организма (Atkinson, 1990; Bach, 1994; Hom et. al., 1998;  Espe et. al., 2007; Stefan et. al., 2007). По данным литературы, аутоиммунная реакция специфична ко многим антигенам β-клеток, в том числе к инсулину (Atkinson, 1990). Однако, механизм формирования аутоиммунных реакций к антигенам β-клеток, не выявлен. Известно, что развитие иммунного ответа к антигенным детерминантам зависит от свойств носителя, распознаваемого лимфоцитами (Галактионов, 2004). Роль носителя при антигенном распознавании инсулина могут играть молекулы, транспортирующие его к клеткам-мишеням. Из этого вытекает важность идентификации и изучения свойств компонентов крови, принимающих участие в транспорте инсулина к периферическим тканям в норме и при сахарном диабете.

Цель работы - изучение инсулин-транспортирующих систем крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа с использованием аффинных методов.

Задачи исследования:

1. Оценить соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточной систем в транспорт инсулина в сопоставлении с аналогичными соотношениями ряда гидрофильных и гидрофобных гормонов.
2. Разработать новый носитель для аффинной хроматографии, отличающийся повышенной стабильностью по сравнению с традиционно используемыми полисахаридными носителями.
3. Изучить свойства полученных на основе нового носителя аффинных сорбентов при использовании в условиях лаборатории, биотехнологического производства и в аффинных диагностических системах.
4. Создать диагностическую систему для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.
5. Разработать метод количественного определения связывающих инсулин белков сыворотки крови человека и провести сравнение их концентрации в норме и при сахарном диабете первого типа.
6. Синтезировать аффинный сорбент с иммобилизованным инсулином на основе предложенного носителя и провести аффинное выделение связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа.
7. Определить роль ионов цинка и других двухвалентных катионов во взаимодействии инсулина и транспортных белков сыворотки крови.
8. Оценить гетерогенность инсулинсвязывающих белков крови и провести идентификацию в их составе известных транспортных соединений методами электрофореза, гельхроматографии, иммунохимии и классической биохимии в норме и при сахарном диабете первого типа.
9. Количественно оценить содержание липидов и гормонов первой и второй групп  в составе связывающего инсулин комплекса.
10. Изучить иммуномодулирующие свойства инсулин-связывающих белков сыворотки крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом.

Научная новизна

Впервые установлено, что особенность транспорта инсулина, по сравнению с транспортом других белковых гормонов, заключается в равноценном использовании сывороточного и эритроцитарного механизмов. При сахарном диабете происходит достоверное снижение вклада сывороточной системы в транспорт инсулина, соответственно, возрастает вклад эритроцитарного транспорта.

Разработан и запатентован новый метод синтеза матрицы для аффинной хроматографии, позволяющий получить сорбент с иммобилизованным инсулином, не загрязняющий выделенные связывающие инсулин белки продуктами расщепления полисахаридной матрицы и иммобилизованного лиганда.  На основе предложенной матрицы синтезирован и запатентован сорбент с иммобилизованной аминофенилбороновой кислотой, использованный при создании диагностической системы для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.

Впервые показано, что в плазме крови человека инсулин взаимодействует со сложным комплексом белков, формирующих при физиологических значениях рН ядро транспортирующего гормоны комплекса. Для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие ионов цинка. Показано, что в крови здоровых доноров в состав связывающего инсулин комплекса входят белки с доказанной транспортной функцией: альбумин, α-фетопротеин и трансферин.

Установлено, что при сахарном диабете первого типа состав белков транспортного комплекса достоверно изменяется: альбумин и α-фетопротеин, входящие в ядро комплекса в норме, замещаются в нём белком острой фазы воспалительной реакции - α1-кислым гликопротеином.

Доказано, что транспортирующий гормоны комплекс плазмы крови человека является общим для гормонов различной природы: наряду с инсулином, он содержит как гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон), так и гидрофильные гормоны (лютеинизирующий гормон, тиреотропный гормон, пролактин).

Показано, что гликопротеиды, формирующие комплекс с инсулином в крови здоровых доноров, обладают способностью снижать иммунный ответ при добавлении к антигенам при иммунизации.

Практическая значимость работы

Разработан и запатентован метод получения носителя для аффинной хроматографии на основе поливинилового спирта. Новый носитель (Поливиналь) не уступает по плотности активных групп бромциан-Сефарозе 4В, обладает лучшими, по сравнению с полисахаридными матрицами, колоночными свойствами и превосходит их по химической стабильности (Гарипова М.И. и др. Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений. Авторское свидетельство № 1789532, 22.09.1992).

Иммуноаффинный сорбент, синтезированный на основе предложенного носителя, испытан в условиях производства человеческого лейкоцитарного интерферона в Отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи на стадии удаления антигенных примесей из полуфабрикатов интерферона. По результатам производственных испытаний, принято Дополнение к регламенту Лейкинферон для инъекций. Стадия ВР-5.4. Иммобилизация иммуноглобулинов. Сорбент для очистки лейкоцитарного интерферона человека, синтезированный на основе запатентованного носителя, с ноября 1991 года до настоящего времени используется на производстве инъекционного препарата лейкоцитарного интерферона в отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи согласно утвержденному производственному регламенту (Акт об использовании предложения от 23 января 1992 года).

Создана диагностическая система для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека, включающая микроколонки с иммобилизованной на предложенном носителе мета-аминофенилбороновой кислотой (Гарипова и др. Сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина. Патент на изобретение № 20935525.2002). Диагностическая система разрешена к применению для диагностики сахарного диабета в лечебно-профилактических учреждениях Республики Башкортостан решением Научно-технического Совета Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан от 28 июля 1992 года.

На основе нового носителя получен сорбент с иммобилизованным инсулином и впервые проведено аффинное выделение связывающих инсулин белков сыворотки крови (транспортирующего гормоны комплекса) здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа. Выделенный аффинно транспортирующий гормоны комплекс крови может быть использован в качестве препарата, корректирующего гормональные нарушения, а также при создании новых препаративных форм инсулина с повышенной эффективностью доставки гормона к периферическим тканям.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Особенность транспорта инсулина к периферическим тканям в сравнении с транспортом большинства других белковых гормонов, заключается в равноценном вкладе в доставку гормона двух транспортных систем крови: системы сывороточных транспортных белков и эритроцитарной системы транспорта.
2. При сахарном диабете первого типа снижается роль сывороточного и повышается роль эритроцитарного транспорта в доставку инсулина к периферическим тканям.
3. Предложена новая матрица для аффинной хроматографии, позволяющая получить сорбент с иммобилизованным инсулином, не загрязняющий выделенные инсулин-связывающие белки продуктами расщепления полисахаридной матрицы и иммобилизованного лиганда. На основе новой матрицы синтезирован сорбент с иммобилизованной аминофенилбороновой кислотой, использованный при создании диагностической системы для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.
4. В плазме крови человека инсулин включается в общий для гидрофильных и гидрофобных гормонов транспортный комплекс, ядро которого формируют альбумин, α-фетопротеин, α2-глобулины и β- глобулины (в том числе трансферин), для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие ионов цинка.
5. При сахарном диабете первого типа состав белков транспортного комплекса  изменяется: из него исчезают альбумин и α-фетопротеин, снижается содержание α2 Цглобулинов, появляется фракция α1-глобулинов (в том числе кислый  α1- гликопротеин).
6. Белки транспортирующего гормоны комплекса крови в норме обладают иммуносупрессивным действием.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на I Всесоюзной конференции Аффинная хроматография антител - теоретические и прикладные аспекты (Москва, 1983), на V Всесоюзной конференции Новые направления в биотехнологии (Пущино, 1984), на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на V конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино,1988), на I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), на 33 Международном съезде физиологов (Санкт-Петербург, 1997), на III съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), на Всероссийской конференции Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей (Санкт-Петербург, 2001), на конференции Экологические, морфологические особенности и современные методы исследования живых систем (Казань, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием Достижения биологической функционологии и их место в практике образования (Самара, 2003), на региональной конференции Проблемы экологии Южного Урала (Оренбург, 2007), на конференции Проблемы биоэкологи и пути их решения (Саранск, 2008).

Публикации. Основные материалы диссертации обобщены в монографии и изложены в 49 печатных работах, в том числе в 10-ти статьях в журналах, рекомендованных ВАК, а также защищены 2 патентами и 2 авторскими свидетельствами.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 336 страницах, содержит 20 рисунков, 24 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего  536 работ.

Благодарности. Выражаю глубокую признательность научному консультанту - профессору, д.б.н. Наиле Ахняфовне Киреевой за плодотворное сотрудничество, консультации и ценные советы, способствовавшие совершенствованию работы; за подробный анализ работы и доброжелательное отношение к.б.н. Ольге Борисовне Кузовлевой и к.м.н. Маю Яковлевичу Корну, за ценные консультации профессору, д.б.н. Станиславу Юрьевичу Веселову, профессору, д.б.н. Сергею Владимировичу Сибиряку и всем моим коллегам, оказавшим неоценимую помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Формирование группы здоровых доноров, из крови которых аффинно выделяли связывающие инсулин белки, проводили на основании заключения эндокринолога об отсутствии отклонений от нормы в регуляции углеводного обмена. В качестве второго критерия отбора использовано процентное содержание гликозилированного гемоглобина (% Ггб) в капиллярной крови обследуемых, отражающее средний уровень гликемии за 2 месяца, предшествующие взятию пробы (Brownlee et.al., 1980; Garlick et. al., 1983; Hubbuch, 1983). Для количественного определения белков, связывающих инсулин, в плазме крови и их аффинного выделения были отобраны пробы крови 800 здоровых добровольцев 20-25 лет с содержанием Ггб от 4 до 7,5%, что соответствует нормальному уровню гликемии.

Определение коэффициентов распределения гормонов проведено в пробах крови 100 здоровых доноров 25-35 лет со средним содержанием гликогемоглобина в капиллярной крови 5,20,41%.

Для количественного определения белков, связывающих инсулин, в плазме крови и их аффинного выделения были отобраны пробы крови 800 больных сахарным диабетом первого типа (8 серий по 100 пациентов), находившихся на стационарном лечении в эндокринологических отделениях больниц г. Уфы. Процентное содержание гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови обследованных колебалось от 10,3 % до 18,6 %, что соответствует стадии заболевания с неудовлетворительной компенсацией нарушений углеводного обмена. Эта стадия заболевания была выбрана в связи с тем, что именно в стадии декомпенсации следовало ожидать проявления наиболее выраженных изменений транспорта инсулина.

В работе использованы следующие методы. Аффинное выделение связывающих инсулин белков крови проводили на сорбентах, синтезированных на основе предложенного носителя. Иммуноферментное определение альбумина крови человека, α-фетопротеина, овальбумина, и антител к овальбумину проводили по стандартному методу (Engval et. al., 1971) с использованием наборов для иммуноферментного анализа производства Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИ им. Н.Ф. Гамалеи. Иммуноферментное определение гормонов, альбумина и α-фетопротеина проводили с использованием диагностических наборов фирмы НВО Иммунотех (Россия). Иммунолюминесцентное определение гормонов на автоматическом анализаторе Amerham (Англия), проводили при помощи наборов Amerlite. Иммунонефелометрическое определение α1-кислого гликопротеина и трансферина проведено при помощи диагностических наборов фирмы НВО Иммунотех (Россия). Электрофорез белков на ацетатцеллюлозных пленках проводился c использованием системы Microtech 648 PC фирмы Interlab, предназначенной для полностью автоматизированного проведения электрофореза. Иммуномодулирующие свойства инсулин-связывающих белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом изучены в эксперименте по иммунизации белых лабораторных мышей дифтерийным анатоксином. Для определения концентрации противодифтерийных антител и связывающих инсулин белков крови использовали реакцию пассивной гемагглютинации с диагностикумом, приготовленным по ранее описанному методу (Гарипова и др., 2005). Изоэлектрическое фокусирование связывающих инсулин фракций крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом проводили по ранее описанному методу (Гарипова и др., 1984) с использованием амфолинов фирмы Pharmacia (Швеция). Спектры поглощения выделенных фракций в ультрафиолетовой области получены при помощи Спектрофотометра СФ-123 (Россия). Расчет статистических ошибок, применение критериев сравнения и корреляционный анализ проводили с использованием статистического пакета Statistica for Windows версии 5,5

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточной систем в транспорт инсулина и ряда гормонов первой и второй групп. Проведено экспериментальное определение коэффициентов распределения между поверхностью эритроцитов и плазмой крови здоровых доноров инсулина и ряда гормонов первой  и второй  групп. Величина коэффициента распределения определялась двумя методами. В крови здоровых доноров коэффициент распределения рассчитывался как отношение концентрации гормона, элюированного с поверхности эритроцитов к его концентрации в плазме крови. Определение концентрации гормона проводили иммунолюминесцентным методом. Коэффициент распределения инсулина в крови больных сахарным диабетом и здоровых доноров определяли по соотношению активности пероксидазы, конъюгированной с инсулином, связанной с поверхностью эритроцитов, к её активности в плазме крови (*). Коэффициент распределения инсулина в крови здоровых доноров определен при использовании каждого из указанных методов. Сопоставление значений коэффициента распределения инсулина в норме, полученных двумя методами, показало, что использованные методы дают статистически тождественные результаты (0,490,0132 и  0,470.0159*, табл. 1). Обследовано 100 здоровых доноров 20-35 лет.

Из данных таблицы 1, следует, что для всех исследованных гормонов второй группы (как простых белков, так и гликопротеидов), характерно резкое преобладание связанной с эритроцитами фракции гормона по сравнению с гормоном, присутствующим в плазме крови. Величина определенных в эксперименте коэффициентов распределения гормонов второй группы, за исключением инсулина, превышает 100. Очевидно, это свидетельствует, о наличии на поверхности эритроцитов специфических рецепторов к этим гормонам и о чрезвычайно низкой концентрации в плазме крови связывающих эти гормоны белков.

Установлено, что коэффициенты распределения гормонов первой группы (прогестерона, кортизола, трийодтиронина, тироксина) близки к 0 (таблица 1). Следовательно, гидрофобные гормоны транспортируются в основном плазмой крови, что согласуется с данными литературы о присутствии в плазме транспортирующих эти гормоны гликопротеидов (Godovac-Zimmermann ; 1988; Марри,1993; Kengni et.al., 2007).

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что в норме коэффициент распределения инсулина составляет 0,490,0053. Очевидно, это свидетельствует о том, что в отличие от других гормонов второй группы, инсулин  доставляется к периферическим тканям при равноценном участии двух механизмов, характерных как для гормонов второй, так и первой групп.

Таблица 1

Распределение гормонов между поверхностью эритроцитов и плазмой крови здоровых доноров

Гормон	группа	Поверхность эритроцитов	Плазма	Коэффициент распределения эритроциты/ плазма
Кортизол	I	0	148,53,52 нмоль/л	0
Прогестерон	I	0	0,88 0,041 нмоль/л	0
Т3	I	0	1,1 0,05 нмоль/л	0
Т4	I	0	57,9 2,64 нмоль/л	0
Тиреотропный гормон	II	65,7 2,98 мкМЕ/мл	0,55  0,027 мкМЕ/мл	119,45453,56
ютеинизирующий гормон	II	200 8,36 МЕ/мл	0,49 0,025 МЕ/мл	408,16338,64
Фолликулостимулирующий гормон	II	360 17,55 МЕ/мл	3,56 0,182 МЕ/мл	101,1217,56
Пролактин	II	132,4 6,74 нг/мл	1,3 нг/мл	101,8
Инсулин норма	II	33,031,66%	66,971,56%	0,490,0132
		31,801,25%*	66,971,56%*	0,470.0159*
Инсулин сахарный диабет	II	41,961,84% *	58,04 1,42%*	0,730,0165*

Таким образом, согласно полученным данным, своеобразие транспорта инсулина, в сравнении с транспортом других белковых гормонов, заключается в том, что в него  вносит значительный вклад система транспорта, типичная для гидрофобных гормонов - система транспортных белков плазмы крови.

Для выявления изменений в транспорте инсулина, происходящих при сахарном диабете, обследована группа 100 больных сахарным диабетом первого типа с неудовлетворительной компенсацией заболевания (процентное содержание фракции гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови обследованных в среднем составило 9,360,52%). Среднее значение коэффициента распределения инсулина между эритроном и плазмой в пробах крови больных диабетом составило 0,730,0065, то есть было достоверно выше аналогичного показателя, определенного в пробах крови здоровых доноров (таблица 1, t=2,176, p=0,036). На основании результатов сравнения коэффициентов распределения инсулина в норме и при сахарном диабете первого типа, был сделан вывод о том, что при диабете наблюдается достоверное увеличение вклада эритроцитарной системы в доставку инсулина к периферическим тканям. Увеличение эритроцитарного транспорта инсулина при сахарном диабете, вероятно, носит компенсаторный характер и обусловлено снижением его взаимодействия с транспортными белками крови. Эти данные согласуются с полученными ранее результатами титрования активности связывающих инсулин сывороточных белков в крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом, из которых следует, что связывание инсулина белками плазмы крови снижается при сахарном диабете первого типа (Гарипова и др., 2005).

Снижение роли сывороточного транспорта инсулина при сахарном диабете первого типа свидетельствует о необходимости изучения состава и свойств инсулин-транспортирующих белков. Наиболее полное выделение всего спектра взаимодействующих с инсулином белков крови возможно при использовании  аффинной хроматографии. В предварительных экспериментах установлено, что аффинные сорбенты с инсулином, иммобилизованным на  основе активированной бромцианом Сефарозы-4В, не позволяют выделить связывающие инсулин белки крови, свободные от примесей продуктов разложения полисахаридной матрицы. В связи с этим, на первом этапе исследований была поставлена задача разработать носитель для аффинной хроматографии, отличающийся повышенной стабильностью по сравнению с традиционно используемыми полисахаридными носителями.

Разработка носителя для аффинной хроматографии на основе поливинилового спирта. Выделение специфически взаимодействующих с инсулином белков крови с последующим определением их состава и структуры предъявляет повышенные требования к матрице аффинного сорбента, использованной для синтеза сорбента с иммобилизованным инсулином.

В 80-х годах 20 века коммерческие носители повышенной стабильности на основе поливинилового спирта были получены фирмой Toyo Soda и использованы для синтеза широкого спектра аффинных сорбентов и ионообменников (Matsumoto et al., 1982). Метод получения  гелей поливинилового спирта с ковалентно сшитыми цепями, использованный фирмой  Toyo Soda,  в литературе не описан.  В связи с этим, метод формирования геля поливинилового спирта и способ его активации разработаны в отдельной серии экспериментов (Гарипова и др., 1989, 1993, Гарипова 1998).

Формирование геля поливинилового спирта, устойчивого в широком диапазоне температур и рН, проводили за счет реакции внутримолекулярного ацеталирования гидроксильных групп полимера карбонильными группами, образовавшимися при окислении раствора поливинилового спирта натриевой солью перийодной кислоты. Ранее  этот метод получения стабильного геля поливинилового спирта использовался в текстильной промышленности и для синтеза сорбентов не применялся (Ушаков, 1960). В качестве катализатора при проведении реакции ацеталирования применяли соляную кислоту и соли трехвалентного железа (Гарипова и др., 1993). Качество полученных гелей оценивали по гидродинамическим свойствам и проницаемости для белковых маркеров фирмы  Serva.

Известно, что гель, полученный за счет реакции ацеталирования гидроксилов поливинилового спирта образовавшимися в результате окисления альдегидными группами, не является достаточно стабильным из-за обратимого перехода гель-золь (Matsumoto et al., 1982). Из этого вытекает необходимость дополнительной стабилизации геля, полученного этим методом, перед использованием его в аффинной хроматографии. В связи с этим, были испытаны два метода стабилизации гелей поливинилового спирта: за счет создания поперечных сшивок в реакции с эпихлоргидрином и глутаровым альдегидом. Условия стабилизации, необходимые для получения стабильного геля поливинилового спирта, выдерживающего кипячение при контрастных значениях рН, были подобраны экспериментально (табл. 2).

Таблица 2

Оптимизация стабилизации геля поливинилового спирта эпихлоргидрином и глутаровым альдегидом

Реагент для стабилизации	Эффективность стабилизации*	Количество активных групп в 1 мл геля
15% эпихлоргидрин	+ + + +	20 мкМ
10% эпихлоргидрин	+ + + +	14 мкМ
5% эпихлоргидрин	+ + + +	9 мкМ
1% эпихлоргидрин	+ + +	4,5 мкМ
10% глутаровый альдегид	+ + + +	100-120 мкМ
5% глутаровый альдегид	+ + + +	100-120 мкМ
2,5% глутаровый альдегид	+ + + +	60-80 мкМ
1% глутаровый альдегид	+ + + +	40-50 мкМ
0,5% глутаровый альдегид	+ + +	10-15мкМ

*Эффективность стабилизации определяли в баллах (++++ - полученные гели выдерживают кипячение при крайних значениях рН; +++ - гели стабильны во всем диапазоне рН при нормальных условиях; ++ - гели нестабильны при крайних значениях рН, +- гели нестабильны во всем диапазоне рН).

Как следует из данных, приведенных в таблице 2, достаточная стабилизация геля происходит при использовании как глутарового альдегида, так и эпихлоргидрина. Полученные гели превосходят по стабильности широко используемые в аффинной хроматографии полисахаридные носители, так как выдерживают кипячение при крайних значениях рН. Однако, наиболее удобной оказалась стабилизация глутаровым альдегидом, так как в этом случае одновременно со стабилизацией происходит достаточная активация геля: в расчете на 1 мл геля в ходе реакции вводится 100 и более микромолей активных альдегидных групп, в то время как при использовании эпихлоргидрина в гель вводится не более 20 микромолей эпоксидных групп на 1 мл геля. Таким образом, использование метода формирования геля поливинилового спирта после его частичного окисления периодатом натрия в сочетании со стабилизацией полученного геля глутаровым альдегидом позволяет получить носитель для аффинной хроматографии, имеющий крупнопористую структуру, обладающий хорошими гидродинамическими свойствами, содержащий не менее 100 мкМ/мл активных альдегидных групп. Предложенный метод синтеза носителя для аффинной хроматографии защищен авторским свидетельством (Гарипова и др., Авторское свидетельство № 1789532 22.09.1992).

Для лабораторных исследований свойств полученного носителя получены аффинные сорбенты с иммобилизованным протеином А. Staphylococcus aureus, овальбумином и глобулиновой фракцией кроличьей антисыворотки к овальбумину (анти-ОВА). Проводили параллельное сравнение свойств сорбентов, полученных на основе предложенного носителя (Поливиналя) и бромциан-Сефарозы 4В фирмы Pharmacia fine chemicals (Швеция). Как следует из данных, приведенных в таблице 3, аффинные сорбенты на основе нового носителя обладают специфической емкостью, сравнимой с емкостью сорбентов на основе Сефарозы 4В, низким неспецифическим связыванием и лучшими, по сравнению с сорбентами на основе Сефарозы, гидродинамическими свойствами (Гарипова, 1998; Хайбуллина и др., 2003).

В условиях производства инъекционных препаратов интерферона проведено испытание иммуноаффинного сорбента на основе нового носителя с иммобилизованными антителами к примесям, подлежащим удалению из полуфабрикатов препарата. По результатам производственных испытаний, проведенных в Отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, принято Дополнение к производственному регламенту УЛейкинферон для инъекций. Стадия ВР-5.4. Иммобилизация иммуноглобулиновФ и получен Акт об использовании предложения.

Предложенный носитель был использован для иммобилизации инсулина в эксперименте по выделению связывающих инсулин белков крови человека. Для иммобилизации использован инсулин Хумулин Р фирмы Lilly из расчета 10 единиц гормона на 1 мл сорбента.

Табица 3

Сравнение удельной емкости аффинных сорбентов на основе

бромциан-Сефарозы 4В и Поливиналя

Носитель	иганд	Среднее значение удельной емкости* мг/мл		Неспецифическое связывание БСА**		Замедление тока буфера в 10 цикле
		1 цикл	2-10 циклы	мг/мл	%***
BrCN-Сефароза	протеин А	11,00± 0,40	10,20± 0,37	0,16± 0,02	3,20± 0,15	В 1,5 раза
Поливиналь	протеин А	9,2± 0,40	8,5± 0,36	0,15± 0,02	3,00± 0,16	Нет
BrCN-Сефароза	овальбумин	3,8 ± 0,20	3,2 ± 0,19	0,13 ± 0,01	2,60± 0,09	В 1,5 раза
Поливиналь	овальбумин	3,3± 0,21	2,8±0,19	0,1± 0,04	2,00± 0,06	Нет
BrCN-Сефароза	анти-ОВА	1,3± 0,06	1,1± 0,05	0,2± 0,01	4,00± 0,14	В 1,5 раза
Поливиналь	анти-ОВА	0,8± 0,035	0,6± 0,025	0,2± 0,010	4,00± 0,20	Нет

*- мг белка, элюированного с 1 мл сорбента;

**- бычий сывороточный альбумин (БСА);

***- процент от нанесенного количества БСА

Создание диагностической системы для определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека. Гликозилированная фракция гемоглобина является своеобразной УпамятьюФ о среднем уровне гликемии за время жизни эритроцита, составляющем 2-3 месяца. Образование этой фракции обусловлено неферментативным связыванием глюкозы молекулами исходно негликозилированного гемоглобина за счет реакции между альдегидной группой глюкозы и аминогруппой гемоглобина (Guthrow et. al., 1979, Day et. al., 1980, Higgins et.al., 1982, Hubbuch, 1985, Morris et. al., 1985,  Мазовецкий, 1991). Существует ряд методов определения процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина. Наиболее популярными из них являются ионообменная хроматография (Hubbuch, 1985), аффинное определение на сорбенте с иммобилизованной фенилбороновой кислотой (Dean et. al., 1980) и колориметрическое определение с тиобарбитуровой кислотой (Guthrow et. al., 1979). В 80-х годах двадцатого века фирма Pierce Chemical Company начала  выпуск диагностического набора, содержащего микроколонки с аффинным сорбентом, представляющим собой мета-аминофенилбороновую кислоту (м-АФБК), иммобилизованную на 6% агарозе. Принцип аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина основывается на свойстве фенилбороновой кислоты избирательно связывать молекулы, содержащие цис-диольную группировку, в том числе, гликозилированный  гемоглобин (Weith et. al.,1970, Okayama et. al., 1978, Reed et. al., 1986). Набор содержит 25 колонок, каждая из которых рассчитана на 3-6 определений. Небольшое количество достоверных определений, которое можно провести на одной колонке фирмы Pierce Chemical Company объясняется недостаточной стабильностью использованного при синтезе аффинного сорбента носителя. Для повышения количества достоверных определений гликозилированной формы гемоглобина на одной микроколонке с аффинным сорбентом, проведена иммобилизация м-АФБК на носителе Поливиналь. Полученный сорбент с иммобилизованной аминофенилбороновой кислотой использован в диагностической системе для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека (Гарипова, 1996). Предложенная диагностическая система является аналогом диагностической системы фирмы Pierce Chemical Company.         Для количественного определения гликозилированной формы гемоглобина использована методика определения, рекомендованная фирмой Pierce Chemical Company с некоторыми изменениями. Клинические испытания предложенной диагностической системы, проведенные в клинико-диагностических лабораториях больниц г. Уфы, показали, что при ее использовании ошибка определения не превышает 5% (табл. 4). За счет повышенной стабильности аффинного сорбента, использование новой диагностической системы позволило увеличить количество определений процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина в пробе с 3-6 (при использовании набора фирмы Pierce Chemical Company) до 20.

Таблица 4.

Вариабельность определения гликозилированного гемоглобина

на протяжении 20 циклов использования сорбента Поливиналь-мета-АФБК

Гемолизат	Hb1c (%)	№ цикла	% Ггб	Среднее значение % Ггб
1	11,6	1	14,0	13,70,503
		4	13,5
		7	14,8
		10	14,2
		13	12,8
		16	13,5
		19	13,2
2	12,4	2	15,2	15,810,297
		5	16,1
		8	15,8
		11	16,4
		14	15,6
		17	16,0
		20	15,6
3	7,0	3	7,8	7,740,275
		6	7,2
		9	8,2
		12	7,4
		15	8,1
		18	7,6
		21	7,9

В лаборатории клинической биохимии Эндокринологического научного Центра РАМН проведено параллельное определение процентного содержания гликогемоглобина с использованием предложенного аффинного сорбента и определение основной фракции гликозилированного гемоглобина  Нв А  1с  методом высокоэффективной ионообменной хроматографии при помощи хроматографа  AUTO A1CTMHA (фирма Kyoto Kagaku Co, LTD, Япония). Коэффициент корреляции между полученными значениями показателей составил +0,95, р=0,0136.

Обследовано 380  больных сахарным диабетом и 125 больных с другими диагнозам. Установлена положительная корреляция среднего значения гликемии натощак при взятии крови 2 раза в неделю в течение месяца со значением процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина (% Ггб), определенным в конце этого периода. Коэффициент корреляции между средними значениями гликемии натощак за один месяц наблюдения и %Ггб, определенным в конце периода наблюдения, составил +0,945,p=0,0001 (рис. 1) .

Рис. 1. Взаимосвязь среднего за период наблюдения значения гликемии и процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина, определенного в конце периода наблюдения (r=+0,945, p=0,0001). 

Таким образом, в ходе клинических испытаний диагностической системы на основе предложенного аффинного сорбента, показано, что полученные значения % Ггб соответствуют клинической картине течения заболевания и динамике гликемии. Установлено, что при оценке полученных результатов следует использовать критерии, предложенные А. Habbuch и соавторами (Habbuch, 1985).

Использование предложенной диагностической системы позволило провести объективную оценку состояния углеводного обмена обследуемых при формировании групп здоровых доноров и больных сахарным диабетом в стадии декомпенсации заболевания при изучении инсулин-транспортирующих систем крови человека.

Сравнение инсулинсвязывающей активности плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа. На первом этапе изучения транспорта инсулина в плазме крови проведено сравнение количества связывающих инсулин белков плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа. Количественное определение белков сыворотки, специфически связывающих инсулин, проводили методом титрования в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитами барана, сенсибилизированными инсулином. Эритроциты сенсибилизировали инсулином из расчета 0,4мг гормона на 1 мл 50% стабилизированных формалином эритроцитов по методике, описанной ранее (Гарипова и др., 2005; 2007).

Показано, что в сыворотках крови здоровых доноров и больных сахарным  диабетом присутствуют компоненты, агглютинирующие эритроциты барана, сенсибилизированные инсулином. Агглютинация происходила только при введении в реакционную среду ионов цинка и специфически подавлялась при добавлении в реакционную среду свободного инсулина. Внесение в рабочий буферный раствор эквимолярных количеств солей кальция и магния не замещало действия ионов цинка. Агглютинация несенсибилизированных эритроцитов не выявлена.

Как следует из данных, приведенных в таблице 5, средний логарифм титра (log2) связывающих инсулин белков в плазме крови здоровых доноров составляет 6,98±0,61, по сравнению 3,86±0,47 в крови больных сахарным диабетом. Следовательно, концентрация связывающих инсулин белков плазмы крови здоровых доноров достоверно выше, чем в крови больных сахарным диабетом первого типа (t=5,76; p=0,0023, n=64).

Таблица 5

Результат титрования инсулинсвязывающей активности сывороток

здоровых доноров и больных сахарным диабетом

% гликогемоглобина, норма				log2 титра в РПГА, норма				% гликогемоглобина, сахарный диабет				log2 титра в РПГА, сахарный диабет
4,4 4,0 4,5 5,1 6,3 4,5 5,4 4,7 5,3 5,0 4,6 4,8 5,4 6,6 4,8 5,4	6,5 5,1 4,4 6,0 5,2 4,3 5,9 4,1 5,8 5,5 6,0 4,4 4,8 6,2 5,3 4,9	4,4 5,6 5,4 4,2 5,8 6,2 4,6 4,4 5,9 4,9 4,3 5,9 4,5 5,5 4,3 6,2	4,0 6,6 5,2 4,9 4,7 5,8 6,2 4,8 5,3 6,4 5,5 4,8 5,7 5,3 6,2 6,1	7 6 10 7 6 6 7 10 7 7 6 7 9 7 6 9	9 8 6 8 7 9 7 6 6 5 6 6 7 8 7 7	9 6 5 6 5 11 5 7 5 10 8 8 6 6 8 6	7 5 6 9 5 6 6 5 6 7 6 7 6 11 7 8	7,4 8,6 9,5 10,1 8,3 10,5 7,4 6,7 9,3 11,0 10,6 7,8 8,4 10,6 7,8 8,4	10,0 11,6 8,2 6,9 8,7 8,8 9,2 6,8 11,3 8,4 9,5 9,8 8,7 9,3 8,2 10,1	8,4 7,6 8,4 9,2 8,8 9,2 7,6 9,4 7,9 8,9 10,3 7,9 8,5 7,5 9,3 11,2	8,5 9,1 8,4 9,0 10,2 9,3 8,9 9,1 8,8 8,5 8,0 9,4 8,8 10,2 9,3 8,9	6 6 4 4 5 5 3 4 4 3 4 4 5 5 5 5	3 4 4 3 4 4 5 5 5 5 4 2 3 3 2 2	3 3 4 3 3 4 4 3 4 5 4 5 4 3 5 4	3 4 3 4 3 3 2 2 3 3 2 2 4 4 3 4
5,23±0,21%				6,98±0,61				8,95±0,27%				3,86±0,47

Хроматографическое выделение и анализ гетерогенности связывающих инсулин компонентов сыворотки человека. На основании результатов сравнения концентраций специфичных к инсулину белков в крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом, высказано предположение о том, что аффинные к инсулину белки плазмы крови играют важную роль в доставке инсулина к тканям и  снижение их титра в крови больных диабетом связано с формированием заболевания. На втором этапе исследований проведено  выделение специфичных к инсулину белков из сывороток крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом на сорбенте с иммобилизованным инсулином, синтезированным на основе Поливиналя. Для изучения роли ионов цинка в формировании комплекса инсулина с белками плазмы, аффинную хроматографию проводили в присутствии (опыт) и в отсутствии (контроль) ионов цинка в буфере связывания.  В опытной серии в состав 0,01М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 0,14 М хлорида натрия вводили 0,007 мМ хлорида цинка. Как следует из хроматограмм, приведенных на рисунке 2, связывание сывороточных транспортных белков с иммобилизованным инсулином происходит только в том случае, если в состав буфера связывания входят ионы цинка. При добавлении эквимолярных количеств хлорида кальция и магния связывания сывороточных белков с сорбентом не происходило.

ОП280

v (мл)

Рис. 2. Влияние ионов цинка на эффективность взаимодействия транспортных белков крови с инсулином. Хроматограммы выделения инсулинсвязывающих компонентов сывороток здоровых доноров на сорбенте с иммобилизованным инсулином а) в присутствии ионов цинка в буфере связывания; б) в отсутствии ионов цинка в буферном растворе. I - сорбат; II - элюат.

В выделенных аффинно фракциях связывающих инсулин белков, полученных из 1 мл сывороток здоровых доноров, содержание белка составило 0,0620,003 мг/мл. В аналогичных фракциях, выделенных из сывороток крови больных сахарным диабетом, концентрация связывающих инсулин белков была достоверно ниже - 0,0420,0025 мг/мл (t=4,35; p=0,008). Таким образом, в пробах, выделенных аффинно на иммобилизованном инсулине из сывороток здоровых доноров, количество связывающих инсулин белков достоверно выше, чем в пробах больных сахарным диабетом. Полученные данные согласуются с результатами титрования инсулинсвязывающей активности исследованных сывороток (табл. 5).

Сравнительный анализ состава связывающих инсулин фракций сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом. При сравнении спектров поглощения в ультрафиолетовой области выделенных аффинно  связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом установлено, что пробы, выделенные из крови больных сахарным диабетом, имеют более выраженное поглощение в области 260 нм (рис. 3).

  ОПλ

λ

Рис. 3. Спектры поглощения в ультрафиолетовой области связывающих инсулин фракций 1-здоровых доноров, 2- больных сахарным диабетом.

Соотношение оптических плотностей в области 260 и 280 нм (ОП260/ОП280 ) в пробах больных сахарным диабетом составило 1,2090,042 по сравнению с 1,0950,034 в норме. Проведение качественных реакций, выявляющих нуклеиновые кислоты и их компоненты, показало, что в связывающих инсулин фракциях плазмы крови эти соединения отсутствуют. В связи с этим было высказано предположение о том, что для инсулинсвязывающих белков больных  сахарным диабетом  характерно более высокое содержание углеводов.

Для оценки молекулярного веса и степени гетерогенности веществ, формирующих комплекс с инсулином, полученные пробы были разделены  гельхроматографией  на  колонке  с Сефадексом G-75, откалиброванной при помощи маркеров молекулярного веса фирмы Serva (Швеция). Гельхроматографию проводили при рН 2,8 (элюаты без нейтрализации) и при физиологическом значении рН. Как следует из хроматограммы, приведенной на рисунке 4 (I) , при рН 2,8 связывающие инсулин компоненты разделились по молекулярному весу на два пика. Первый пик имеет объем выхода, соответствующий молекулярному весу около 100 тысяч дальтон, и, вероятно, представлен сывороточными глобулинами. Соотношение ОП260/ ОП280 этой фракции в норме составило 1,109, что свидетельствует о высоком содержании углеводов в веществах, формирующих эту фракцию. Второй пик представлен соединениями, молекулярный вес которых близок к 50 тысячам дальтон. Соотношение ОП260/ ОП280 , равное 0,98 свидетельствует о меньшем содержании углеводов в этой фракции. Таким образом, данные гельхроматографии на Сефадексе-G-75 свидетельствуют о гетерогенности сывороточных компонентов, формирующих специфические комплексы с инсулином.

При хроматографии на той же колонке проб, полученных методом аффинной  хроматографии после плавного доведения рН до 7,2, получен один пик, имеющий молекулярный вес более 100 тысяч Д. Вероятно, это свидетельствует о том, что при физиологических значениях рН связывающие инсулин белки ассоциируют, формируя единый комплекс (рисунок 4 II).

       Для оценки степени гетерогенности  и идентификации в пробах  известных транспортных веществ сыворотки крови по их электрофоретической подвижности,  проведено электрофоретическое  разделение  полученных аффинно проб при рН 8,6 на ацетатцеллюлозных пленках.  В таблице 6 приведен фракционный состав связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом.

  I                                                                II

Рис. 4. Оценка гетерогенности связывающих инсулин белков крови методом гельхроматографии. Хроматограммы  разделения инсулинсвязывающих белков, выделенных из сыворотки здорового донора (  ) и  больного диабетом - (  ), на сефадексе G-75. I - при рН 2,8; II - при рН 7,2.

Как следует из данных, приведенных в таблице 6, в связывающих инсулин белках сывороток больных сахарным диабетом в 2 раза больше γ-глобулинов (41±1,83%) по сравнению с их количеством в связывающих инсулин белках здоровых доноров (21±0,95%). Возможно, это обусловлено повышенным содержанием  специфичных к инсулину антител в крови больных сахарным диабетом. Полученные результаты согласуются с данными литературы о появлении в крови больных сахарным диабетом антител к инсулину (Atkinson et al., 1990). Присутствие в составе связывающих инсулин белков значительного количества γ-глобулинов может свидетельствовать о том, что выделенная инсулин - связывающая фракция представлена иммунными комплексами. Для проверки этого предположения, провели рехроматографию выделенных фракции на сорбенте с иммобилизованным протеином А золотистого стафилококка, специфически связывающим иммуноглобулины. Как следует из хроматограмм, приведенных на рисунке 5, связывающие инсулин белки крови содержат две фракции: взаимодействующую (2)  и не взаимодействующую (1) с протеином А.

Таблица 6.

Относительное содержание (%) белковых фракций связывающих инсулин белков крови, полученное методом электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках

Белковая  фракция	I	II
Альбумин	25,9±1,75	0,0
α1-глобулин	0,0	21,5±1,12
α2  -глобулин	33,0±1,54	18,9±0,87
β -глобулин	20,0±1,26	18,5±1,07
γ - глобулин	21,1±0,95	41,1±1,83

Содержание фракций в инсулинсвязывающих белках крови (%) I - здоровых доноров; II - больных сахарным диабетом;

Взаимодействующая с протеином А фракция инсулинсвязывающих белков здоровых доноров составляет не более 20% от их общего содержания, в то время как в пробах инсулинсвязывающих белков больных сахарным диабетом она достигает 50% (различие доказано с использованием критерия Стьюдента, t=3,43; p=0,028). Вероятно, эта фракция представлена иммунными комплексами. Фракция невзаимодействующих с протеином А белков, вероятно, представляет собой белки крови, осуществляющие транспорт инсулина.

Обращает на себя внимание тот факт, что в норме значительная часть связанного с инсулином белка сыворотки (25,9±1,75%, табл. 6) представлена  альбумином, или белком, имеющим ту же электрофоретическую подвижность.

Рис. 5. Выделение иммунных комплексов из связывающих инсулин белков здоровых доноров на протеине А Staphylococcus аureus. I - первый цикл выделения взаимодействующей с протеином А фракции; II - рехроматография сорбата, полученного в первом цикле. 1 Цсорбат, 2- элюат, содержащий иммунные комплексы.

При сахарном диабете первого типа этот транспортный белок в связывании с инсулином участия не принимает: в комплексе связывающих инсулин веществ, выделенном из сывороток больных сахарным диабетом альбумин не выявлен. Электрофоретически наиболее подвижной фракцией связывающих инсулин  гликопротеинов больных сахарным диабетом является α1-глобулин, содержание которого составило 21,5±1,12%. В нормальных сыворотках инсулинсвязывающие вещества с этой электрофоретической подвижностью отсутствуют.

В инсулинсвязывающей фракции здоровых доноров выявлено примерно двукратное превышение содержания фракции с подвижностью α2-глобулина по сравнению со связывающей инсулин фракцией больных сахарным диабетом (32,2±1,54% по сравнению с 18,1±1,07%, табл. 6). Различие связывающих инсулин компонентов сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом в содержании β -глобулина оказалось не достоверным (20,8±1,26% в пробах здоровых доноров по сравнению с 18,9±1,07% в пробах больных сахарным диабетом).

На основании анализа электрофореграмм было сделано предположение о присутствии в пробах связывающих инсулин белков здоровых доноров альбумина и транспортных белков крови с подвижностью α2  -глобулинов и β-глобулинов. Кроме того, было высказано предположение о том, что связывающие инсулин фракции больных сахарным диабетом содержат белки острой фазы воспалительной реакции, обладающие подвижностью  α1-глобулинов, и транспортные белки с подвижностью β-глобулинов. Для проверки высказанных предположений использованы методы иммуноферментного анализа и иммунонефелометрии.

Методом иммуноферментного анализа установлено, что в пробах здоровых  доноров содержится 0,0150,0007 мг/мл альбумина, во фракциях связывающих инсулин белков крови больных диабетом этот транспортный белок не выявлен, что согласуется с данными электрофоретического разделения полученных проб. По данным иммуноферментного анализа, пробы, выделенные из крови здоровых доноров содержат 6,70,3 нг/мл α-фетопротеина - гликопротеина крови с подвижностью α-глобулинов с доказанной транспортной, иммуномодулирующей и детоксицирующей функцией (Parmelee et. al., 1978; Hirohashi et. al., 1979; Savu et. al., 1981; Tyner et. al., 1990; Melbye et. al., 2000; Smith et.al., 2006; Mizejewski et. al., 2007). Присутствие α-фетопротеина в пробах, выделенных из крови больных сахарным диабетом не выявлено. Методом иммунонефелометрии в пробах связывающих инсулин белков больных диабетом и здоровых доноров обнаружен трансферин - транспортный белок крови с подвижностью β-глобулинов, что согласуется с результатами Н.К. Грачевой и соавторов (1972). Достоверных различий содержания трансферина в пробах больных сахарным диабетом и здоровых доноров не выявлено. Трансферин, согласно современным представлениям, относится к классу липокалинов и принимает участие в транспорте широкого спектра биологически активных соединений (Flower et al., 1996). При помощи метода иммунонефелометрии также показано, что в выделенных аффинным методом комплексах связывающих инсулин белков сыворотки крови больных сахарным диабетом присутствует белок острой фазы воспалительной реакции - α1-кислый гликопротеин (орозомукоид). В норме α1-кислый гликопротеин содержится в связывающих инсулин фракциях лишь в следовых количествах.

Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод о том, что в крови здоровых доноров в состав связывающего инсулин комплекса входят транспортные белки, в том числе, альбумин, α-фетопротеин и трансферин (Гарипова, 2007 б). Установлено, что состав белков связывающего инсулин комплекса при сахарном диабете первого типа достоверно изменяется. Альбумин и α-фетопротеин присутствующие в комплексе в норме, в пробах, выделенных из крови больных диабетом, выявляются лишь в следовых количествах и замещаются α1-кислым гликопротеином и, возможно, другими, не идентифицированными белками.

Различия состава белков, формирующих комплекс с инсулином, в норме и при диабете подтверждаются различием их аминокислотного состава и различным содержанием углеводного компонента в их молекулах. Установлено, что в гликопротеидах, взаимодействующих с инсулином в крови больных сахарным диабетом, снижено по сравнению с нормой, содержание ароматических аминокислот. При использовании в качестве стандарта раствора фенилаланина, установлено, что в пробах здоровых доноров содержание ароматических аминокислот составляет 0,00640,0002 мг/мг, по сравнению с 0,000360,0005 мг/мг во фракциях больных сахарным диабетом. Аналогичный результат был получен при сравнении в связывающих инсулин фракциях здоровых доноров и больных сахарным диабетом количества серосодержащих аминокислот. Содержание цистеина в пробах из сывороток здоровых доноров было достоверно выше, чем в пробах больных сахарным диабетом (0,00480,00008 мг/мг, по сравнению с 0,000210,00007 мг/мг). Таким образом, белковый компонент связывающих инсулин фракций плазмы крови больных сахарным диабетом, очевидно, обладает небогатым разнообразием аминокислотного состава, что характерно для транспортных гликопротеидов крови (Марри, 1993). В составе белковой части молекул, образующих комплекс с инсулином в сыворотке крови здоровых доноров, присутствует  больше ароматических и серосодержащих аминокислот. Это, вероятно, подтверждает предположение о присутствии в комплексе связывающих инсулин белков здоровых доноров, наряду с транспортными гликопротеидами, альбумина. Проведено количественное определение углеводов в пробах связывающих инсулин фракций крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом. Установлено, что в пробах здоровых доноров содержание углеводов составляет 0,001280,0004 мг (около 20% по отношению к содержанию белка в пробе), в пробах больных сахарным диабетом - 0,001920,0002 мг (40%).

Выявление в связывающем инсулин комплексе липидов и гормонов первой и второй групп. Наличие у связывающих инсулин белков свойств, характерных для липокалинов, послужило основанием для изучения содержания в полученных фракциях липидных структур и гидрофобных гормонов. В полученных аффинно связывающих инсулин фракциях проведено определение холестерола и триглицеридов. В пробах здоровых доноров содержание холестерола составило 0,07±0,0004 ммоль/л, в пробах больных сахарным диабетом - 0,08±0,0007 ммоль/л. В связывающих инсулин фракциях здоровых доноров выявлено 0,1010±0,003 ммоль/л триглицеридов, во фракциях больных диабетом -0,0944±0,0025 ммоль/л. Установлено, что в связывающих инсулин фракциях сыворотки крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом присутствуют следующие гидрофобные гормоны: тироксин (11,00,5 нмоль/л), трийодтиронин (1,3 0,06 нмоль/л), тестостерон (7,00,03 нмоль/л). Достоверного различия в содержании липидов и гидрофобных гормонов во фракциях здоровых доноров и больных сахарным диабетом не выявлено.

В то же время, в составе связывающих инсулин фракций выявлены незначительные количества белковых гормонов: 1МЕ/мл лютеинизирующего гормона, 0,03 мкМЕ/мл тиреотропного гормона, 0,5 МЕ/мл пролактина (Гарипова, 2007). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что выделенные на иммобилизованном инсулине белки, формируют ядро транспортного комплекса, переносящего в плазме крови не только гидрофобные соединения, но и белковые гормоны. Биологическое значение существования выявленного транспортного комплекса может заключаться в повышении надежности доставки гормонов к клеткам-мишеням за счет использования дублирующего механизма их связывания с клетками-мишенями с участием транспортных гликопротеидов и их клеточных рецепторов.

Изучение иммуномодулирующих свойств связывающих инсулин белков  сыворотки крови. Присутствие в связывающих инсулин фракциях α-фетопротеина и 1-кислого гликопротеина, обладающих иммуномодулирующим действием (Lester et. al., 1976, Sheppard et. al., 1977, Sell et. al., 1977, Lu et. al., 1984, Fleischer et.al., 1988, Pinheiro et. al., 1992, Mizejewski, 2004, Cavin et. al., 2004, Smith et.al., 2006), послужило основанием для изучения иммуномодулирующих свойств выделенных фракций. Исследование проведено на модели иммунизации белых лабораторных мышей дифтерийным анатоксином. Проведена иммунизация трех групп белых лабораторных мышей: двух опытных и контрольной. Мышей всех групп трехкратно иммунизировали дифтерийным анатоксином. В опыте 1 мышей иммунизировали анатоксином с добавлением инсулинсвязывающих гликопротеидов, выделенных из сывороток крови здоровых доноров, в опыте 2 - при добавлении аналогичной фракции из крови больных сахарным диабетом. Полученные антисыворотки к дифтерийному анатоксину оттитрованы в реакции пассивной гемагглютинации с диагностикумом, выявляющим антитела к дифтерийному анатоксину. Как следует из данных, приведенных на рисунке 6, среднее значение титра антител к дифтерийному токсину в опыте 1 достоверно ниже этого показателя, определенного в контроле. Среднее значение логарифма (log2) титра в опыте 1 составило 3,760,31, в контроле - 6,440,39 (различие достоверно с p=0,00035, t1=10,55). Достоверного влияния связывающих инсулин белков крови больных сахарным диабетом на концентрацию антител к дифтерийному анатоксину не выявлено: концентрация противодифтерийных антител в опыте 2 составила  6,200,34 по сравнению с 6,440,39 в контроле (t2 =1,43; р=0,159). Таким образом, концентрация антител к дифтерийному анатоксину в опытной группе с проведением иммунизации на фоне связывающих инсулин белков крови здоровых доноров достоверно ниже, чем в группе контрольных мышей. Следовательно, транспортные белки, на фоне которых проводилась иммунизация, вызвали достоверное снижение иммунного ответа к дифтерийному анатоксину. Вероятно, это свидетельствует о наличии у них иммуносупрессирующих свойств.

Рис. 6. Исследование иммуномодулирующего действия связывающих инсулин фракций крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом. Средняя концентрация противодифтерийных антител: 1 - в контрольной группе мышей; 2 - в опыте 1 (иммунизация мышей дифтерийным анатоксином на фоне связывающих инсулин белков здоровых доноров); 3 - в опыте 2 (иммунизация мышей дифтерийным анатоксином на фоне связывающих инсулин белков больных сахарным диабетом).

Биологическое значение подавляющего иммунный ответ действия  изучаемых белков крови, очевидно, заключается в предотвращении аутоиммунных реакций к гормонам и биологически активным веществам, входящим в состав транспортного комплекса. Возможно, иммуносупрессирующие свойства белков транспортирующего гормоны комплекса объясняются присутствием в их составе  α-фетопротеина, в норме выполняющего функцию защиты инсулина и других присутствующих в комплексе гормонов от распознавания клетками иммунной системы. Вероятно, отсутствие иммуносупрессивного действия белков транспортного комплекса при сахарном диабете первого типа объясняется замещением в его составе α-фетопротеина белком острой фазы воспалительной реакции кислым α1- гликопротеином.

*****

Экспериментально доказано, что в крови человека при участии ионов цинка инсулин вовлекается в сложные межмолекулярные взаимодействия с транспортными белками крови и связывается с поверхностью эритроцитов. Таким образом, инсулин транспортируется в крови при участии двух механизмов: сывороточного и эритроцитарного. Значение коэффициента распределения инсулина между эритроном и плазмой крови, в норме составляющее 0,490,005, свидетельствует о преобладании в крови здоровых доноров транспорта гормона плазмой крови. Значительно больший вклад сывороточного транспорта в доставку инсулина по сравнению с транспортом других белковых гормонов, свидетельствует о биологической целесообразности снижения его связывания с эритроцитами и включения в транспортирующий гормоны комплекс сыворотки.

Показано, что в норме связывающие инсулин белки плазмы крови обладают иммуносупрессирующими свойствами. Вероятно, биологическое значение включения инсулина в сывороточный комплекс заключается в его защите от аутоиммунного распознавания и в повышении эффективности доставки гормона к клеткам-мишеням. Необходимость взаимодействия инсулина с транспортными белками плазмы крови, возможно, объясняется наличием в его структуре антигенных детерминант, хорошо распознаваемых собственной иммунной системой. Это предположение подтверждается существованием в крови человека  транспортных молекул у антигенно родственных инсулину гормонов релаксина (Tager, 1984) и инсулиноподобных факторов роста 1 и 2 (Suikkari et.al., 1988; Lee et.al., 1989).

Установлено, что транспортирующие инсулин белки плазмы крови при физиологических значениях рН формируют транспортный комплекс, ядро которого в норме формируют альбумин, α- фетопротеин и трансферин. Выявленный транспортный комплекс является общим для ряда гидрофильных и гидрофобных гормонов. Комплекс, наряду с инсулином, включает примерно 50% всего содержащегося в сыворотке трийодтиронина, значительный процент тестостерона и других гидрофобных гормонов, а также некоторое количество белковых (пролактина) и гликопротеидных (лютеинизирующего и тиреотропного) гормонов. Можно предположить, что транспортный комплекс содержит оптимальное для клеток соотношение гормонов и его биологическое значение заключается в обеспечении дублирующего механизма доставки гормонов за счет клеточных рецепторов к транспортным белкам.

Наряду с транспортирующим гормоны комплексом, инсулин включается также в иммунные комплексы, количественно более представленные в связывающей инсулин фракции больных сахарным диабетом. Показано, что при сахарном диабете первого типа альбумин и α-фетопротеин замещаются в транспортном комплексе сыворотки крови α1-глобулинами, в частности, белком острой фазы воспалительной реакции  α1-кислым гликопротеином. Это приводит к практическому исчезновению иммуносупрессирующих свойств белков ядра транспортного комплекса. Изменение состава белков транспортного комплекса при сахарном диабете, вероятно, является также причиной снижения включения в него инсулина и компенсаторного возрастания связывания инсулина с эритроном.

Так как инсулин включается в транспортный комплекс наряду с другими гормонами, правомерно предположить, что при сахарном диабете первого типа  нарушается доставка к клеткам-мишеням не только инсулина, но и других входящих в комплекс гормонов. Возможно, это объясняет многочисленные примеры из клинической практики, свидетельствующие о том, что сахарный диабет первого типа часто сочетается с другими аутоиммунными поражениями эндокринной системы.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что особенность транспорта инсулина в крови человека в сравнении с транспортом других белковых гормонов, заключается в равноценном вкладе в доставку гормона к клеткам - мишеням эритроцитарной и сывороточной транспортных систем.
2. При сахарном диабете первого типа наблюдается достоверное увеличение вклада эритроцитарной системы в доставку инсулина к периферическим тканям, обусловленное снижением его взаимодействия с транспортными белками крови.
3. Разработан и запатентован новый метод синтеза матрицы для аффинной хроматографии, позволяющий получить сорбент с иммобилизованным инсулином, не загрязняющий выделенные связывающие инсулин белки продуктами расщепления полисахаридной матрицы.
4. Показано, что сорбенты, синтезированные на основе нового носителя, обладают высокой специфической емкостью, низкой неспецифической сорбцией, лучшими, по сравнению с бромциан-Сефарозой 4В, гидродинамическими свойствами и повышенной стабильностью.
5. Синтезирован и запатентован сорбент с иммобилизованной фенилбороновой кислотой, на его основе создана диагностическая система для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.
6. Разработан метод определения концентрации связывающих инсулин белков сыворотки крови в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитами, сенсибилизированными инсулином.
7. Показано, что транспортирующие инсулин белки плазмы крови при физиологических значениях рН формируют транспортный комплекс, ядро которого в норме формируют альбумин, α- фетопротеин и трансферин, для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие  ионов цинка.
8. При сахарном диабете первого типа альбумин и α- фетопротеин замещаются в транспортирующем инсулин  комплексе сыворотки крови белком острой фазы воспалительной реакции кислым α1- гликопротеином.
9. Показано, что наряду с инсулином, в сывороточный транспортный комплекс включаются гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон) и гидрофильные (тиреотропный гормон, пролактин, лютеинизирующий гормон) гормоны, а также триглицериды и холестерол.
10. Доказано, что белки транспортирующего инсулин комплекса здоровых доноров обладают иммуносупрессивным действием.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Гарипова М.И., Фазлыева В.А., Беишев Я.Х., Хавкин Ю.А. Высокочувствительный вариант изоэлектрического фокусирования с иммунопроявлением. // Лабораторное дело (Клиническая и лабораторная диагностика).-1984.-№3.-С.159-162.
2. Зайцев Е.М., Свиридов В.В., Гарипова М.И., Титова Н.Г., Лебедев В.С. Исследование молекулярной гетерогенности моноклональных и поликлональных антител к дифтерийному токсину. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-1985.-№2.-С.37-41.
3. Гарипова М.И.,  Фролова И.С., Клеева О.Б., Кузнецов В.П. Новый иммуносорбент на основе поливинилового спирта для очистки интерферона. // Доклады академии наук России.-1993.- Т.328.-№6.-736-739.
4. Гарипова М.И., Фролова И.С., Клеева О.Б., Кузнецов В.П. Иммуносорбент для очистки интерферона. // Вопросы вирусологии.-1993.-Т.38.-№3.-С.129.-132.
5. Гарипова М.И. Применение аффинных сорбентов повышенной стабильности в биотехнологии. // Вестник Башкирского университета.-1998.-№1.-С.41-44.
6. Хайбуллина С.Ф., Морзунов С.П., Веселов С.Ю., Гарипова М.И. Ранняя диагностика геморрагической лихорадки с почечным синдромом на основе использования рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса пумала. // Микробиология.- 2003.-№1.-с.55-59.
7. Гарипова М.И., Баранова М.В.,  Штыкова Л.И. Аффинное выделение инсулинсвязывающего компонента сыворотки крови человека и изучение его биохимической природы. // Вестник Башкирского университета.-2005.-№2.-С. 46-48.
8. Гарипова М.И., Умнова В.Ю., Штыкова Л.И. Инсулинсвязывающий компонент сыворотки человека в норме и при заболевании сахарным диабетом первого типа. // Вестник Башкирского университета.-2005.-№4.-С.44-46.
9. Гарипова М.И. Изучение механизмов транспорта инсулина в крови человека. // Вестник Оренбургского государственного университета .-2007.-№ 75.-С.72-74.
10. Гарипова М.И., Ибрагимов Р.И., Умнова В.Ю., Штыкова Л.И. Инсулинсвязывающий компонент сыворотки крови человека в норме и при заболевании сахарным диабетом первого типа. // Клиническая и лабораторная диагностика. -2008.-№4.-С. 44-45.

Монография

11. Гарипова М.И. Транспорт инсулина в крови человека. -Уфа.- РИ - БашГУ.-2007.-127 С.

Патенты и авторские свидетельства

12. Гарипова М.И.,  Леплянин Г.В., Антонова Л.Ф., Хавкин Ю.А. Способ получения иммобилизованных белков. Авторское свидетельство № 1500670.-1989.
13. Гарипова М.И., Басченко И.А., Еркеева И.А., Шигапова А.И. Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений.  Авторское свидетельство № 1789532 22.09.1992.
14. Гарипова М.И., Толстиков Г.А., Монаков Ю.Б., Басченко И.А., Юсупова Ф.Г. Сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина.- Патент на изобретение № 20935525.2002.
15. Гарипова М.И., Давидович  М.Г. Пористый силикагель, модифицированный глицерилпропилсиланом и эпихлоргидрином с иммобилизованной мета- аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина. Изобретения и полезные модели.- 2004.-N17.-C.564-565. Патент на изобретение № 2231059, зарегистрирован 20.06.2004.

Статьи, материалы,  тезисы

16. Гарипова М.И. Изучение изоэлектрических спектров иммуноглобулинов класса Д больных множественной миеломой. // Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР-Уфа.-1983.-С.185.
17. Гарипова М.И. Антигенные варианты иммуноглобулинов класса Д человека.- // Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР-Уфа.-1983.-С.186.
18. Гарипова М.И.,  Киреева Т.А., Басченко И.А., Хавкин Ю.А.-Изучение влияния заряда антигена на спектротип антител. // Аффинная хроматография антител-теоретические и прикладные аспекты. 1 Всесоюзная конференция .-Москва-1983.-с.253.
19. Гарипова М.И., Хавкин Ю.А., Свиридов В.В., Зайцев Е.М. Принципы конструирования иммунопрепаратов на основе моноклональных (гибридомных) антител. //Новые направления в биотехнологии. 1 Всесоюзная конференция.-Пущино.-1984.-с.107.
20. Гарипова М.И. Изучение влияния заряда антигена на спектротипы антител. //Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР.-Уфа.-1985.-С.152.
21. Гарипова М.И. Методы повышения чувствительности изоэлектрического фокусирования. // Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР.-Уфа.-1985.-С.153.
22. Гарипова М.И. Формирование пористой структуры поливинилового спирта с заданными свойствами. // Конференция молодых ученых Башкирского филиала АН СССР.-Уфа.-1985.-С.154.
23. Гарипова М.И.,  Киреева Т.А., Хавкин Ю.А. Исследование молекулярной гетерогенности моноклональных и поликлональных антител. // 5 Всесоюзный биохимический съезд.-1986.-С.34.
24. Гарипова М.И., Басченко И.А., Смирнова Н.Н. Особенности биоаффинных взаимодействий на ферромагнитных носителях. // 5 конференция молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии.-Пущино.-1988.-С.138.
25. Гарипова М.И., Басченко И.А., Сысоева Л.Б. Аффинные сорбенты на основе поливинилового спирта. // Изучение и рациональное использование природных ресурсов.-Уфа.-1991.-С.95.
26. Гарипова М.И., Еркеева И.А., Басченко И.А., Сысоева Л.Б. Выделение и очистка на иммобилизованной гиалуроновой кислоте гиалуронидазы семенников северного оленя. // Изучение и рациональное использование природных ресурсов.-Уфа.-1991.-С.97.
27. Гарипова .И.. Басченко И. А., Юсупова Ф.Г., Маннанова Г.В. Определение гликогемоглобина аффинным методом и его диагностическое значение для выявления сахарного диабета. // Изучение и рациональное использование природных ресурсов.-Уфа.-1991.-С.98.
28. Гарипова М.И., Басченко И.А., Монаков Ю.Б. Иммуносорбент на основе поливинилового спирта. // 1 съезд иммунологов России.-Новосибирск.-1992.-с.86.
29. Гарипова М.И. Разработка аффинной диагностической системы для определения гликогемоглобина в капиллярной крови человека. // Сб. Современные проблемы эволюционной морфологии и физиологии.-Уфа.-1996.-С.59-63.
30. Гарипова М.И. Аффинные сорбенты повышенной стабильности и их использование в биотехнологии и медицинской диагностике. // Сб. Современные проблемы эволюционной морфологии и физиологии.-Уфа.-1996.-С.85-89.
31. Гарипова М.И. Бобкова Е.В. Использование сорбента, устойчивого к биодеградации, для аффинного выделения гамма-интерферона. // Сб. Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1996.-с.56.
32. Хафизова Л.Г., Гарипова М.И.,  Бобкова Е.В. Выделение фактора переноса, имеющего сайты аффинного связывания с поверхностными антигенами Candida Albicans. // Сб. Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1996.-С.57.
33. Гарипова М.И. Проблемы и перспективы применения аффинной хроматографии в биотехнологии. // Сб. Результаты научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1997.-С.7-9.
34. Гарипова М.И. Информативность и методы определения гликозилированного гемоглобина при состояниях, не связанных с сахарным диабетом. // Сб.  Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1997.-С.101-103.
35. Гарипова М.И., Басченко И.А., Зарудий Ф.Х., Давлетов Э.Г. Разработка аффинного метода определения гликозилированного гемоглобина в крови человека. // Здравоохранение Башкортостана.-1997.-№6.-С.55-57.
36. Гарипова М.И. Использование интегральных методов для выявления нарушений углеводного обмена. // Конференция по научно-техническим программам минобразования России.-1997.-С.58-61.
37. Garipova M.I., Kalimullina L.B. Estimation of tissue metabolism damage and approach to itТs correction. // 33 International Congress of Physiologica Science.-St.Petersburg.-1997.-p.543.
38. Гарипова М.И., Басченко И.А. Метод оценки влияния экологияческих факторов на организм человека. // 3-й съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока-Новосибирскю-1997.-С.36
39. Хафизова Л.Г., Гарипова М.И., Бобкова Е.В. Повторное использование лейкоцитов после вирусиндуцированного синтеза интерферона для получения препарата с активностью фактора переноса. //Сб. Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1998.-С.140-142..
40. Гарипова М.И., Габдуллина З.З., Веселов С.Ю. Иммуноопределение с использованием метки коллоидным золотом с серебряным усилением. //Сб. Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.-1998.-С.126-1129.
41. Гарипова М.И. Метод оценки влияния экологических факторов на организм человека. // 3-й съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока-Новосибирск. -1997.-С. 36.
42. Гарипова М.И. Сб. Применение интегральных методов оценки состояния углеводного обмена для раннего выявления дезадаптаций человека. //Сб. Экология человека в свете проблем городской антропоэкосистемы.-Уфа.-1998.-С.42-61.
43. Гарипова М.И., Сысоева Л.Б. Применимость аффинного определения гликозилированного гемоглобина для диагностики сахарного диабета. // Сб. Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского гос. университета.- Уфа-1999.-С. 171-173.
44. Гарипова М.И., Луканин А.С. Показатель, позволяющий прогнозировать тип заживления послеоперационных ран. // Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей.-2001.-С.Петербург.- С.25-26.
45. Гарипова М.И. Применение интегральных показателей состояния углеводного обмена в исследованиях по экологии человека. // Материалы конференции Экологические, морфологические особенности и современные методы исследования живых систем.- Казань.-2003.-С.62-63.
46. Гарипова М.И., Ибрагимов Р.И., Умнова В.Ю., Штыкова Л.И. Инсулинсвязывающий компонент сыворотки человека в норме и при заболевании сахарным диабетом. // Материалы Всероссийской конференции с международным участием Достижения биологической функционологии и их место в практике образования.- Самара.-2003.-С.62-63.
47. Гарипова М.И., Киреева Н.А., Баранова М.В., Елисеева О.С., Першина А.С., Набиуллина Р.Р. Аффинное выделение связывающих инсулин  сывороточных гликопротеидов человека и изучение их разнообразия в норме и при сахарном диабете. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им.  Ю.А. Овчинникова.- 2007.-т.3.-№1.-С 7-16.
48. Елисеева О.С., Киреева Н.А., Гарипова М.И. Состав связывающих инсулин транспортных белков крови человека. // Материалы международной научной конференции Проблемы биоэкологи и пути их решения.-Саранск.-2008.-С.303-305.
49. Першина А.С., Киреева Н.А., Гарипова М.И. Соотношение эритроцитарного и сывороточного транспорта инсулина. // Материалы международной научной конференции Проблемы биоэкологи и пути их решения.- Саранск.-2008.-С.318-319.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии