Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
на правах рукописи Камынина Анна Владимировна ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФРАГМЕНТОВ АЛЬФА7СУБЪЕДИНИЦЫ АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА И ПРИОННОГО БЕЛКА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки РАН Научные руководители:
доктор химических наук, профессор Вольпина О.М.
кандидат биологических наук Бобкова Н.В.
Официальные оппоненты:
Зинченко Валерий Петрович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, заведующий лабораторией внутриклеточной сигнализации Ярилин Александр Александрович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ ГН - Институт иммунологии ФМБА России, заведующий отделом клеточной иммунологии
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН
Защита диссертации состоится л27 сентября 2012 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.002.038.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ИБК РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН.
Автореферат разослан л___ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Т.И.Смолихина ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) - тяжелое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующим снижением интеллекта и расстройством памяти. На лечение болезни тратятся огромные средства, при этом существующие лекарственные средства оказывают лишь симптоматическое действие. В настоящее время не достигнуто полное понимание причин и механизмов развития БА, и поэтому не разработаны методы радикальной терапии заболевания. Таким образом, актуальным остается поиск новых подходов к лечению БА.
Один из предполагаемых механизмов развития БА заключается в связывании патогенного пептида бета-амилоида с каким-либо белком на поверхности клеток мозга, что вызывает ряд процессов, приводящих к гибели нейронов. В литературе описаны 2 белка, являющихся мишенями для действия бета-амилоида, - 7-тип ацетилхолинового рецептора (АХР) [Wang et al., 2000] и прионный белок [Lauren et al., 2009]. В настоящей работе предложен новый подход к терапии БА, основанный на индукции специфических антител к мишеням бета-амилоида. Мы предположили, что антитела к 7-типу АХР или к прионному белку будут препятствовать связыванию этих белков с бета-амилоидом и гибели нейронов и, таким образом, оказывать иммунопротективное действие в модели БА. Для индукции специфических антител были использованы синтетические фрагменты 7-субъединицы АХР и прионного белка.
Цель работы. Цель диссертационной работы состояла в исследовании активности синтетических фрагментов альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка, а также антител к ним, в in vivo и in vitro моделях БА.
В соответствии с поставленной целью задачами исследования являлись:
1. Выбор потенциально активных фрагментов 7-субъединицы АХР и прионного белка и изучение их иммунотерапевтической активности на животных с экспериментально индуцированной формой БА.
2. Выявление наиболее активных фрагментов 7-субъединицы АХР и прионного белка и получение аффинноочищенных антител к ним.
3. Исследование протективного действия аффинноочищенных антител к выбранным фрагментам 7-субъединицы АХР и прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой БА.
4. Исследование действия аффинноочищенных антител к выбранным фрагментам 7-субъединицы АХР и прионного белка на клеточной модели БА, а также изучение механизма их протективного действия.
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе выявлены ранее не описанные пептидные фрагменты - фрагмент 173-193 7субъединицы АХР и фрагмент 95-123 прионного белка, иммунизация которыми оказывала иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой БА. Впервые показано, что пассивная иммунизация аффинноочищенными антителами к фрагменту 173-193 7-субъединицы или к фрагменту 95-123 прионного белка предотвращает потерю пространственной памяти мышей с экспериментально индуцированной формой БА. Было также впервые продемонстрировано, что аффинноочищенные антитела к фрагменту 173193 7-субъединицы или к фрагменту 95-123 прионного белка препятствуют индуцированной бета-амилоидом гибели клеток в первичной культуре нейронов и астроцитов, понижают скорость продукции активных форм кислорода, а также ингибируют вызванную действием бета-амилоида активацию каспазы 3.
Апробация работы и публикации. Результаты настоящей работы были представлены на VIII чтениях, посвящнных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), VIII и IX и X международной конференции Болезнь Альцгеймреа и Паркинсона (Австрия, 2007; Чехия, 2009, Испания, 2011), XV международной конференции Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармаколоии и экологии (Украина, 2007), III Российском симпозиуме Белки и пептиды (Пущино, 2007), 50-ой юбилейной научной конференции МФТИ (Москва, 2007), XX зимней международной молодежной научной школе Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии (Москва, 2008), Международной конференции Ломоносов-2008 (Москва, 2008), 2-ой Московской международной конференции Иммунофизиология:
естественный аутоиммунитет в норме и патологии (Москва, 2008), международной конференции Пептиды 2008 (Финляндия, 2008), на 34ом конгрессе FEBS (Чехия, 2009), на международной конференции Молекулярные механизмы нейрологических и психических заболеваний (Словакия, 2009), на X международном конгрессе по нейроиммунологии (Испания, 2010), V Российском симпозиуме Белки и пептиды (Петрозаводск, 2011), на международной конференции Биология - наука 21 века (Москва, 2012).
Материалы диссертационной работы изложены в 23 публикациях, в числе которых 3 статьи в рецензируемых научных журналах.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на ___ страницах с использованием __ рисунков, ___ таблиц и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ___ ссылки.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Исследование иммунотерапевтической активности фрагментов 7субъединицы АХР на животных с экспериментально индуцированной формой БА Для выработки специфических антител к 7-типу АХР, препятствующих связыванию рецептора с бета-амилоидом, в качестве иммуногенов было предложено использовать синтетические фрагменты N-концевого экстрацеллюлярного домена 7-субъединицы АХР, аминокислотные последовательности которых приведены в Таблице 1. На первом этапе исследований были выбраны 2 фрагмента: пептид последовательности 1-23 (АХРI), соответствующий N-концевому -спиральному экспонированному участку молекулы 7-субъединицы АХР, и пептид последовательности (159-168)-(179-188) (АХР-II), объединяющий два гидрофильных экспонированных участка 159-168 и 179-188. В качестве контрольного соединения был выбран пептид, соответствующий фрагменту 197-213 белка VP1 вируса ящура (К1). Для получения у животных стабильно высокого уровня антител пептиды были конъюгированы с высокомолекулярным носителем - гемоцианином улитки (KLH), который усиливает продукцию антител.
Таблица 1. Аминокислотные последовательности фрагментов 7-субъединицы АХР.
Выделены подчеркиванием Пептид Аминокислотная последовательность теоретически расчитанные ТGEFQRKLYKELVKNYNPLERPVA23* АХР-I хелперные эпитопы.
1QMQEADISGY168-179IPGKRSERFY1АХР-II 1Q5W554 в базе EWDLVGIPGKRSERFY1АХР-III UniProtKB/Swiss-Prot.
1EWDLVGIPGKRSERFYECCKE1АХР-IV 1К1 SQDRHKQKIIAPAKQLL21KSIYTLRYYTDKTNNNLTLVPAVVGKPGS1КЧтобы исследовать терапевтический эффект иммунизации фрагментами 7субъединицы АХР, в качестве животной модели БА были использованы мыши линии NMRI, которым проводили операцию ольфакторной бульбэктомии.
Бульбэктомированные (БЭ) мыши демонстрируют признаки, схожие с проявлениями спорадической формой БА, а именно у БЭ мышей происходит нарушение пространственной памяти, повышение уровня бета-амилоида в мозгу и развитие других признаков БА [Бобкова и соавт., 2001]. В качестве контроля были использованы ложнооперированные (ЛО) мыши, которым проводили все те же манипуляции, что и БЭ мышам, но не удаляли обонятельные луковицы.
Исследовали влияние иммунизации выбранными фрагментами 7-субъединицы АХР, конъюгированными с белком-носителем, на состояние пространственной памяти БЭ мышей в водном лабиринте Морриса. Тестирование пространственной памяти проводили совместно с сотрудниками Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино.
Схема иммунизации БЭ мышей была разработана таким образом, чтобы на момент развития признаков БА и на момент исследования терапевтического эффекта иммунизации выбранными фрагментами у мышей был наивысший уровень антител. Мыши были иммунизированы препаратами АХР-I-KLH, АХР-II-KLH или К1-KLH дважды. Между первой и второй иммунизациями проводили операцию ольфакторной бульбэктомии. Через месяц после операции животных обучали пространственному навыку в водном лабиринте Морриса и тестировали память, которую оценивали по способности животного выделять сектор обучения №3 от секторов №1, 2 и 4 по времени нахождения и числу заходов.
Результаты проведенных исследований показали, что неиммунизированные ЛО животные статистически достоверно выделяли 3-ий сектор обучения (рис.1). БЭ неиммунизированные мыши, или БЭ мыши, иммунизированные К1-KLH, не выделяли 3-ий сектор обучения, что свидетельствовало о нарушении памяти.
Иммунизация АХР-II-KLH приводила к сохранению памяти БЭ животных: эти мыши статистически достоверно выделяли 3-ий сектор по числу заходов и по времени нахождения в нем. В группе БЭ мышей, иммунизированных АХР-I-KLH, была выявлена лишь тенденция к сохранению памяти, поскольку не было отмечено статистически достоверных различий между анализируемыми показателями в 3-ем секторе и остальными отсеками.
Рис.1. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, иммунизированных KLHконъюгатами фрагментов АХР-I и АХР-II.
Здесь и далее 1-4 - сектора водного лабиринта, 3 - сектор обучения.
*, ** и *** доверительная вероятность p<0,05, p<0,01 и p<0,001, соответственно.
По результатам тестирования сывороток крови методом иммуноферментного анализа было выявлено, что у всех иммунизированных БЭ животных наблюдался высокий уровень противопептидных антител (титры в индивидуальных образцах сывороток крови варьировали от 3,7 до 5,7; титр антител выражен в Цlg максимального разведения сыворотки).
В Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино был определен уровень бета-амилоида в образцах гиппокампа и коры мозга БЭ и ЛО животных, иммунизированных конъюгатми пептидов. Было показано, что операция бульбэктомии приводит к шестикратному увеличению уровня бетаамилоида (рис.2). Иммунизация KLH-конъюгатом фрагмента АХР-I и АХР-II предотвращала рост уровня бета-амилоида в объединенных образцах мозга БЭ мышей, причем в группе, иммунизированной АХР-II-KLH, уровень бета-амилоида был ниже, чем в группе, иммунизированной АХР-I-KLH. Иммунизация данными фрагментами не изменяла уровень бета-амилоида в мозгу ЛО животных.
Рис.2. Уровень бета-амилоида в мозгу БЭ и ЛО мышей, иммунизированных KLHконъюгатами АХР-I и АХР-II.
* p<0,05.
Таким образом, наибольшую иммунопротективную активность проявил фрагмент последовательности (159-168)-(179-188), иммунизация которым в конъюгированном с KLH виде приводила к улучшению показателей состояния пространственной памяти, а также к торможению роста уровня бета-амилоида в мозгу БЭ мышей.
Для разработки подходов к иммунотерапии БА наиболее перспективным является использование свободных иммуногенов, не конъюгированных с белком-носителем.
Существенное преимущество свободных пептидов перед конъюгатами состоит в их способности индуцировать образование антител строгой направленности. В связи с этим была исследована способность пептидных фрагментов 7-субъединицы АХР в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем, индуцировать выработку специфических антител и оказывать иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой БА. Были выбраны два изученных ранее фрагмента: АХР-I и АХР-II. Поскольку предыдущие испытания показали, что наибольшей терапевтической активностью обладал KLH-конъюгат пептида АХР-II, для дальнейших исследований были выбраны еще два пептида АХР-III (173-188) и АХР-IV (173-193), являющиеся удлиненными аналогами участка (179-188) пептида АХР-II (Табл.1). В качестве контрольного соединения был выбран аналог фрагмента 171-199 белка OMP1 из Neisseria meningitides (К2).
Все выбранные фрагменты содержали расчетные Т-хелперные эпитопы, необходимые для стимуляции иммунного ответа у животных. Для расчета Тхелперных эпитопов был использован алгоритм, согласно которому потенциально иммуногенные пептиды должны содержать девятичленный фрагмент, в первом положении которого находится гидрофобный, а в девятом - положительно заряженный аминокислотный остаток [Вольпина и соавт., 2002].
Для исследования способности пептидов индуцировать образование антител мыши были дважды иммунизированы выбранными фрагментами. Анализ сывороток крови показал, что иммуногенными в свободном виде оказались только фрагменты АХР-I (титр пула сывороток составил 2.8) и АХР-IV (титр пула составил 3,7), а также контрольный пептид К2 (титр пула составил 3,4). Дальнейшие испытания по выявлению иммунотерапевтической активности в животной модели БА были проведены только с АХР-I, АХР-IV и с К2.
БЭ мышей иммунизировали иммуноактивными пептидами по схеме, разработанной для иммунизации KLH-конъюгатами. Тестирование пространственной памяти животных показало, что иммунизация фрагментом АХРIV приводила к сохранению памяти у БЭ мышей (рис.3): они статистически достоверно выделяли 3-ий сектор обучения по числу заходов в него. В то же время иммунизация фрагментом АХР-I и контрольным пептидом К2 не оказывала эффекта на состояние памяти БЭ животных - мыши не выделяли отсек обучения ни по времени пребывания, ни по числу заходов.
Таким образом, был выявлен фрагмент АХР-IV, иммунизация которым приводила к статистически достоверному сохранению памяти мышей с экспериментально индуцированной формой БА.
Рис.3. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, иммунизированных фрагментами АХР-I и АХР-IV.
* и ** p<0,01 и p<0,001 соответственно.
Мишенью для выработанных антител является 7-тип АХР, который находится в мозгу, поэтому важно было показать, что антитела проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). В связи с этим было проведено исследование спинномозговой жидкости (смж) иммунизированных БЭ и ЛО мышей на наличие противопептидных антител. У БЭ мышей, иммунизированных АХР-IV и К2, противопептидные антитела были обнаружены в смж (титр пула составил 2,5 и 1,соответственно), а у БЭ животных, иммунизированных АХР-I, - нет (титр был ниже 1,6). У иммунизированных АХР-I, АХР-IV и контрольным фрагментом ЛО мышей антитела не были обнаружены в смж. Таким образом, было выяснено, что антитела проходили ГЭБ только у БЭ мышей, иммунизированных АХР-IV и контрольным пептидом, при этом терапевтической активностью на память БЭ животных обладал только фрагмент АХР-IV.
В рамках совместной работы в Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино было показано, что уровень бета-амилоида в объединенной пробе гиппокампа и коры мозга БЭ мышей, иммунизированных фрагментом АХР-IV, был в 4 раза ниже уровня бета-амилоида неиммунизированных БЭ животных (рис.4). Уровень бета-амилоида ЛО мышей, иммунизированных фрагментом АХР-IV, был немного выше уровня бета-амилоида контрольных ЛО животных. Для объяснения полученных результатов на ЛО животных требуется проведение дополнительных исследований.
Рис.4. Уровень бета-амилоида в мозгу БЭ и ЛО мышей, иммунизированных АХРIV.
* p<0,05.
Известно, что у пациентов с БА наблюдается снижение уровня 7-типа АХР в мозгу [Banerjee et al., 2000]. В связи с этим в Лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН был исследован уровень экспрессии 7-типа АХР в коре мозга неиммунизированных БЭ мышей и БЭ животных после иммунизации фрагментом АХР-IV. Было показано, что операция бульбэктомии приводила к значительному снижению уровня рецептора. Иммунизация фрагментом АХР-IV приводила к восстановлению уровня рецептора БЭ мышей до уровня здоровых животных.
Таким образом, было показано, что иммунизация БЭ мышей фрагментом 7субъединицы АХР последовательности 173-193 приводила к сохранению пространственной памяти и количества 7-типа АХР в коре мозга, а также к торможению роста уровня бета-амилоида. Индуцированные антитела к фрагменту 173-193 проходили ГЭБ.
2. Исследование действия антител к фрагменту 173-193 7-субъединицы АХР на животных с экспериментально индуцированной формой БА Мы предполагаем, что наблюдаемый протективный эффект активной иммунизации фрагментом АХР-IV в значительной степени обусловлен действием именно антител к 7-типу АХР. Чтобы доказать это на следующем этапе было изучено действие пассивного введения антител к фрагменту АХР-IV на состояние памяти мышей с экспериментально индуцированной формой БА. Для этого на пептиде АХР-IV, конъюгированном с CNBr-активированной сефарозой, были получены мышиные аффинноочищенные моноспецифические антитела, направленные к фрагменту АХР-IV (АХРат), которые вводили БЭ мышам после проведения операции бульбэктомии, а затем тестировали пространственную память в водном лабиринте Морриса. Были использованы 2 дозы антител - 2,5 и 5 мкг на животное.
Показано, что мыши, получившие наименьшую дозу - 2,5 мкг, статистически достоверно больше времени проводили в 3-ем секторе обучения (рис.5). В группе БЭ мышей, получавших 5 мкг АХРат, не наблюдалась достоверного выделения отсека обучения.
Рис.5. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, пассивно иммунизированных мышиными аффинноочищенными антителами к пептиду АХР-IV.
АХРат 2,5 и 5 мкг - дозы мышинных аффинноочищенных антител к фрагменту АХР-IV.
* и ** p<0,01 и p<0,0соответственно.
В результате проведенных исследований выявлено, что пассивная иммунизация аффинноочищенными антителами к фрагменту последовательности 173-193 7субъединицы АХР оказывала иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой БА.
3. Исследование иммунотерапевтической активности фрагментов прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой БА Для выработки специфических антител к прионному белку, препятствующих связыванию белка с бета-амилоидом, были выбраны два фрагмента последовательности 95-123 (PrP-I) и 203-229 (PrP-II) (Табл.4). Ранее было показано, что антитела к данным фрагментам способны связываться с рекомбинантным прионным белком, а также с нормальной изоформой природного приона [Oboznaya et al., 2007]. Последовательность PrP-I находится в N-концевой части молекулы приона, последовательность PrP-II является частью третьей -цепи (200-223) прионного белка. В качестве контроля был использован К1 (Табл.1). Для исследования иммунотерапевтического эффекта выбранные фрагменты прионного белка, а также контрольный пептид были конъюгированы с KLH ввиду их низкой иммуногенной активности в свободном виде.
Таблица 4. Аминокислотные последовательности фрагментов прионного белка.
PrP фрагмент Аминокислотная последовательность P04156 в базе UniProtKB/Swiss-Prot.
PrP-I (95-123)-KLH THGQWNKPSKPKTNMKHVAGAAAAGAVVG Была использована последовательность PrP-II (203-229)-KLH IKMMERVVEQMCITQYQRESQAYYQRG PrP быка.
Последовательности PrP быка и мыши различаются на две аминокислоты в пептиде 95-123 и на пять аминокислот и две вставки - в последовательности 203-229. Ранее было показано, что эти замены не влияют на связывание антител к выбранным фрагментам с мышиным рекомбинантным прионным белком.
Для исследования влияния иммунизации прионными фрагментами на память животных с экспериментально индуцированной формой БА БЭ мыши были иммунизированы PrP-I-KLH и PrP-II-KLH, а также контрольным соединением К1KLH по разработанной схеме. Было показано, что иммунизация БЭ мышей только PrP-I-KLH приводила к сохранению пространственной памяти по обоим показателям - числу заходов и времени нахождения в отсеке обучения, в то время как иммунизация PrP-II-KLH не предотвращала ухудшение памяти у БЭ мышей (рис.6). Контрольные БЭ мыши, иммунизированные К1-KLH, также не выделяли сектор обучения ни по времени пребывания, ни по числу заходов. Таким образом, было показано, что иммунизация только PrP-I-KLH сохраняла память мышей с экспериментально индуцированной формой БА.
Рис.6. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, иммунизированных KLHконъюгатами фрагментов PrP-I и PrP-II.
*p<0,001.
Было изучено наличие противопептидных антител в сыворотке крови и смж БЭ и ЛО мышей. Высокие титры антител были выявлены в сыворотках крови всех животных (титр варьировал от 3,3 до 4,6). Интересно, что в смж противопептидные антитела были выявлены как у БЭ мышей, так и у ЛО животных (титр варьировал от 1,9 до 2,5). По-видимому, иммунизация конъюгированными с высокомолекулярным белком-носителем фрагментами приводила к нарушениям в проницаемости ГЭБ у здоровых ЛО мышей, в результате чего антитела проникали в смж.
В Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино был определен уровень бета-амилоида в объединенных образцах гиппокампа и коры мозга и исследовано морфо-функциональное состояние нейронов гиппокампа (САи СА3 зоны) и коры мозга ЛО и БЭ мышей, иммунизированных препаратами PrP-IKLH и PrP-II-KLH. Было показано, что у иммунизированных обоими фрагментами прионного белка БЭ мышей уровень бета-амилоида снижен практически в два раза по сравнению с контрольными БЭ животными, иммунизированными KLH (рис.7).
Рис.7. Уровень бета-амилоида в мозгу БЭ и ЛО мышей, иммунизированных KLHконъюгатами PrP-I и PrP-II.
* p<0,05.
Было также показано, что иммунизация только фрагментом PrP-I-KLH достоверно предохраняла нейроны от патологических изменений, вызванных операцией бульбэктомии, и не вызывала изменений в нейронах ЛО мышей.
Таким образом, установлено, что наибольшую иммунопротективную активность проявил прионный фрагмент последовательности 95-123, иммунизация которым в конъюгированном с KLH виде приводила к улучшению показателей состояния пространственной памяти, к торможению роста уровня мозгового бета-амилоида, а также к улучшению морфофункционального состояния нейронов БЭ мышей.
4. Исследование действия антител к фрагменту 95-123 прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой БА Для исследования протективного эффекта аффинноочищенных антител к PrP-I были проведены опыты по пассивной защите БЭ мышей. Для этого на пептиде PrPI, конъюгированном с CNBr-активированной сефарозой, были получены мышиные моноспецифические аффинноочищенные антитела (PrPат), которые вводили БЭ и ЛО мышам, и затем тестировали пространственную память экспериментальных животных. Были использованы 3 дозы (0,8, 2,5 и 7,5 мкг) аффинноочищенных антител. Выявлено, что БЭ мыши, пассивно иммунизированные тремя дозами PrPат, демонстрировали сохранение памяти (рис.8). Следует отметить, что достоверно выделяли сектор обучения по обоим показателям только группы БЭ животных, получивших 0,8 и 7,5 мкг PrPат.
Рис.8. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, пассивно иммунизированных аффинноочищенными антителами к фрагменту PrP-I.
*, ** и *** p<0,05, p<0,01 и p<0,001 соответственно.
В Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино был определен уровень бета-амилоида БЭ мышей, пассивно иммунизированных PrPат.
Проведенные исследования показали, что введение аффинноочищенных антител в трех дозах приводило к статистически достоверному блокированию роста уровня бета-амилоида в объединенных образцах гиппокампа и коры мозга БЭ животных (рис.9). Пассивная иммунизация ЛО мышей тремя дозами мышиных PrPат не вызывала изменений уровня мозгового бета-амилоида.
Рис.9. Уровень бета-амилоида в мозгу БЭ и ЛО мышей, пассивно иммунизированных тремя дозами антител к фрагменту PrP-I.
PrPат 0,8, 2,5 и 7,5 мкг - дозы мышинных аффинноочищенных антител к фрагменту PrP-I.
* p<0,05.
Таким образом, пассивная иммунизация мышиными аффинноочищенными антителами к фрагменту прионного белка последовательности 95-123 оказывала иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой БА.
5. Исследование действия антител к фрагменту 173-193 7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка в клеточной модели БА Результаты терапевтической активности антител к фрагменту 173-193 7субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка в животной модели БА необходимо было подтвердить в in vitro модели БА. Данная часть работы была проведена на смешанной первичной культуре нейронов и астроцитов гиппокампа или коры мозга новорожденных крыс. Для проведения этого этапа работ на пептидах АХР-IV или PrP-I, конъюгированных с CNBr-активированной сефарозой, были получены кроличьи моноспецифические аффинноочищенные антитела (АХРат или PrPат соответственно).
Исследование действия аффинноочищенных кроличьих антител к фрагментам 173-193 7-субъединицы АХР и 95-123 прионного белка на клеточную гибель, вызванную бета-амилоидом Исследование токсического действия бета-амилоида на смешанной культуре нейронов и астроцитов гиппокампа показало, что 24-часовая обработка культуры бета-амилоидом 25-35 приводила к усилению гибели клеток по сравнению с контрольными не обработанными бета-амилоидом культурами (рис.10).
Предварительная обработка клеток АХРат или PrPат в концентрации 20 мкг/мл приводила к значительному снижению гибели клеток, обработанных бетаамилоидом 25-35. Таким образом, было установлено, что АХРат и PrPат обладают ярко выраженным защитным эффектом против действия бета-амилоида в первичных культурах клеток.
Рис.10. Защитное действие аффинноочищенных антител к АХР-IV и к PrP-I на проявления бета-амилоидной токсичности в смешанной культуре нейронов и астроцитов гиппокампа крыс.
А 25-35 - бета-амилоид 2535.
Контроль - не обработанные бета-амилоидом культуры нейронов и астроцитов.
* p<0,05.
За 100% принято суммарное количество клеток на каждом стекле.
Исследование действия аффиноочищенных кроличьих антител к фрагменту 173193 7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка на Са2+-сигнал в астроцитах и нейронах Токсическое действие бета-амилоида на клетки мозга сопряжено с такими дегенеративными процессами, как нарушения во внутриклеточной ионов Са2+сигнализации, а также образование свободных радикалов. Было сделано предположение, что протективный эффект антител, направленных к 7-типу АХР или к прионному белку, может быть вызван блокированием индуцированных бетаамилоидом изменений внутриклеточной концентрации кальция (Са2+-сигнала) в клетках мозга. Были проведены эксперименты по выявлению влияния АХРат или PrPат на индуцированный бета-амилоидом Са2+-сигнал в смешанной культуре нейронов и астроцитов коры мозга крыс. В целях исследования Са2+-сигнала использовали ацетоксиметильное производное Са2+-чувствительного зонда fura-(fura-2 AM). Отношение его связанной с Са2+ формы (длина волны возбуждения 340 нм) к свободной форме (длина волны возбуждения 380 нм) показывает реальные изменения внутриклеточной концентрации Са2+.
Проведенные исследования показали, что обработка культуры нейронов и астроцитов 50 М бета-амилоида 25-35 приводила к значительному повышению внутриклеточной концентрации Са2+ в астроцитах, но не в нейрональных клетках (рис.11) (нейрональные клетки были выявлены добавлением 50 мМ KCl, который вызывал деполяризацию плазматической мембраны и активацию потенциал зависимых Са2+-каналов, которые экспрессированы на нейронах, но не на астроцитах). Астроциты, в свою очередь, отвечали на добавление бета-амилоида по-разному: индивидуальные кривые изменения внутриклеточной концентрации Са2+ не имели постоянной формы и могли быть охарактеризованы как одиночные пики, осциляции или высокий сигнал, переходящий в плато.
Рис.11. Действие бета-амилоида 25-35 на уровень A 25-35, 10 мкM 4,цитозольного Са2+ в астроцитах.
3,3,2,5 Здесь и далее время воздействия бета-амилоида или 2,0 других соединений указано горизонтальной чертой.
1,5 Здесь и далее кривые описывают сигнал флуоресценции 1,в индивидуальных клетках.
0,0 10 20 30 40 Время (мин) Преикубация клеток с 20 мкг/мл АХРат (рис.12,А) или PrPат (рис.12,Б) не влияла на способность бета-амилоида 25-35 индуцировать Са2+-сигнал в астроцитах, при этом форма и величина бета-амилоид индуцированного Са2+-сигнала изменялась незначительно.
Флуоресценция Fura-2, 340/3Рис.12. Действие антител к фрагменту АХР-IV (А) и к фрагменту PrP-I (Б) на Са2+сигнал, индуцированный бета-амилоидом 25-35.
А Б АХРат, 20 мкг/мл PrPат, 20 мкг/мл 1,A 25-35, 50 мкM A 25-35, 50 мкM 2,1,2,2,1,1,1,1,1,4 1,1,0,1,0,0,0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 Время (мин) Время (мин) Следует отметить, что добавление АХРат к нейронам и астроцитам индуцировало небольшой Са2+-сигнал (рис.13,А), что позволяет сделать предположение, что антитела действуют подобно агонисту данных рецепторов. Чтобы подтвердить это предположение, мы провели серию экспериментов по изучению Са2+-сигнала на клетках, обработанных ацетилхолином. Было показано, что добавление ацетилхолина клеткам вызывало повышение внутриклеточной концентрации Са2+ в астроцитах (рис.13,Б). Предварительная обработка АХРат не блокировала стимулированный ацетилхолином Са2+-сигнал в культуре клеток (рис.13,В).
Следовательно, АХРат действуют на Са2+-сигнал астроцитов, как агонисты рецептора.
Рис.13. Влияние антител к фрагменту АХР-IV на индуцированный ацетилхолином Са2+-сигнал астроцитов.
А Б В АХРат, 20 мкг/мл АХРат, 20 мкг/мл Aх, 10 мкM 1,1,Aх, 10 мкM 3,1,1,2,1,1,1,2,1,1,0,1,0,0,0,1,0,0,0,-2 0 2 4 6 8 10 12 14 0 10 20 30 40 0 5 10 15 Время (мин) Время (мин) Время (мин) А - действие антител к АХР-IV на Са2+-сигнал в астроцитах. Б - действие ацетилхолина (Ах) на Са2+-сигнал в астроцитах. В - действие антител к АХР-IV на индуцированный ацетилхолином Са2+-сигнал в астроцитах.
Чтобы выяснить, участвует ли АХР 7-типа в индуцируемом бета-амилоидом Са2+ответе, был проведен эксперимент по изучению изменений внутриклеточной концентрации Са2+ под действием бета-амилоида после добавления специфического антагонистa 7-типа АХР - -бунгаротоксина. Было показано, что предварительная обработка смешанной культуры -бунгаротоксином не блокировала Са2+-сигнал, индуцированный бета-амилоидом 25-35 в астроцитах Флуоресценция Fura-2, 340/3Флуоресценция Fura-2, 340/3Флуоресценция Fura-2, 340/3Флуоресценция Fura-2, 340/3Флуоресценция Fura-2, 340/3(рис.14). Следует отметить, что в некоторых клетках, предварительно обработанных -бунгаротоксином, наблюдалась задержка индуцированного бетаамилоидом Са2+-ответа по сравнению с клетками, обработанными только бетаамилоидом 25-35. Можно предположить, что наблюдаемый Са2+-ответ астроцитов на добавление бета-амилоида опосредован не только связыванием бета-амилоида с АХР 7-типа, но и реализацией других путей, таких как связывание бета-амилоида с другими типами АХР или встраивание бета-амилоида в мембраны астроцитов и образование Са2+-каналов [Demuro et al., 2011].
Рис.14. Действие антагониста 7-типа АХР на индуцированный бета-амилоидом 25-35 Са2+-сигнал в кортикальных астроцитах.
-Bgtx, 0,5 мкM -Bgtx - -бунгаротоксин.
2,4 A 25-35, 50 мкM 2,2,1,1,Таким образом, предварительная обработка 1,1,нейронов и астроцитов антителами к 71,типу АХР и к прионному белку не 0,блокировала Са2+-сигнал в астроцитах, 0,0 5 10 15 20 25 стимулированный бета-амилоидом 25-35.
Время (мин) Изучение Са2+-ответа показало, что защитное действие АХРат или PrPат не связано напрямую с Са2+-сигналом, а, возможно, обусловлено запуском других протекторных механизмов в клетке в ответ на токсичность бета-амилоида.
Исследование действия аффиноочищенных кроличьих антител к фрагменту 173193 7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка на скорость производства активных форм кислорода в астроцитах и нейронах Известно, что токсическое действие бета-амилоида на клетки мозга сопровождается продукцией активных форм кислорода (АФК) в астроцитах посредством активации мембранного фермента НАДФН-оксидазы. Мы предположили, что защитное действие антител к 7-типу АХР и прионному белку на клетки реализуется за счет ингибирования активируемой бета-амилоидом продукции свободных радикалов в астроцитах. Для измерения активных форм кислорода использовали флуоресцентный краситель дигидроэтидиум (Het), чувствительный к супероксидным радикалам. Было показано, что бета-амилоид 2535 значительно увеличивал скорость образования АФК в кортикальных астроцитах, но не в нейронах (на фазово-контрастном изображении, полученном с использованием флоуресцентной микроскопии, нейроны были хорошо отличимы от глиальных клеток). Преинкубация культуры клеток с ингибитором НАДФНоксидазы AEBSF (4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride) приводила к практически полному блокированию индуцированной бетаамилоидом 25-35 продукции АФК (рис.15). Предварительная обработка смешанной культуры нейронов и астроцитов АХРат или PrPат приводила к значительному Флуоресценция Fura-2, 340/3снижению скорости образования АФК в астроцитах (рис.15). Таким образом, мы показали, что протективный эффект антител к 7-типу АХР и к прионному белку на клетки, обработанные бета-амилоидом, может быть реализован за счет снижения скорости образования АФК в астроцитах.
Рис.15. Средние значения скорости образования АФК в астроцитах, обработанных бета-амилоидом 25-35, до и после добавления блокатора НАДФН-оксидазы и антител к АХР-IV и к PrP-I.
За 100% принята средняя скорость образования АФК в астроцитах, не обработанных бета-амилоидом 25-35.
* p<0,05.
В случае с 7-типом АХР было проведено более детальное исследование механизма регуляции производства АФК через этот тип рецепторов. Представляло интерес выяснить, как будут влиять на продукцию АФК агонист и антагонист этого рецептора. Было показано, что при добавлении ацетилхолина значительно снижается скорость образования АФК, индуцированных бета-амилоидом 25-(рис.16). Следует заметить, что блокатор 7-типа АХР -бунгаротоксин также снижал активируемую бета-амилоидом скорость образования АФК.
Рис.16. Средние значения скорости образования АФК в астроцитах, обработанных бета-амилоидом 25-35, до и после добавления агониста и антагониста АХР 7-типа.
* p<0,05.
Полученные результаты свидетельствуют об участии 7-типа АХР в регуляции производства АФК. Для изучения механизма действия АХРат на НАДФН-оксидазу и на индуцируемое бета-амилоидом производство АФК, была проведена серия экспериментов с использованием классического активатора НАДФН-оксидазы типа (NOX2) - форболового эфира (phorbol 12-myristate 13-acetate, или PMA). Было показано, что добавление форболового эфира к кортикальным астроцитам приводило к резкому увеличению продукции АФК (рис.17). Добавление блокатора НАДФН-оксидазы AEBSF приводило к понижению скорости образования АФК в клетках, обработанных PMA. Предварительная обработка клеток АХРат приводила к частичному ингибированию продукции АФК под действием PMA. Преинкубация клеток с ацетилхолином или с -бунгаротоксином понижала скорость образования АФК под действием PMA.
Рис.17. Средние значения скорости образования АФК в астроцитах, обработанных форболовым эфиром, до и после добавления антител к АХР-IV, ацетилхолина и бунгаротоксина.
* p<0,05.
Таким образом, было показано, что обработка культур кортикальных клеток АХРат или PrPат приводит к снижению индуцированного бета-амилоидом образования АФК в астроцитах. Возможно, именно по этому пути реализуется протективное действие антител на клетки, обработанные бета-амилоидом. Ацетилхолин и бунгаротоксин также снижают скорость образования АФК под действием бетаамилоида 25-35 и форболового эфира, благодаря чему можно предположить, что воздействие на 7-тип АХР регулирует работу этого комплекса и, как следствие, продукцию АФК.
Исследование действия аффиноочищенных кроличьих антител к фрагменту 173193 7-субъединицы АХР и к фрагменту 95-123 прионного белка на индуцированную бета-амилоидом активацию каспазы Известно, что активация каспазы 3 приводит к запуску механизма клеточной смерти. Мы предположили, что протективное действие АХРат или PrPат реализуется за счет блокирования бета-амилоид опосредованой активации каспазы 3.
Было показано, что обработка кортикальной культуры нейронов и астроцитов бета-амилоидом 25-35 приводила к быстрой активации каспазы 3 в нейронах и астроцитах (рис.18). Преинкубация клеток с АХРат или к PrPат значительно замедляла время начала активации каспазы 3. Так, АХРат замедляли сигнал в раз, а PrPат - в 10 раз. Ингибитор 7-типа АХР -бунгаротоксин также значительно замедлял активацию каспазы 3 в клетках.
Рис.18. Среднее время начала активации каспазы 3 в нейронах и астроцитах под действием бета-амилоида 25-35 после добавления антител к АХР-IV и к PrP-I, а также -бунгаротоксина.
* p<0,05.
Таким образом, было показано, что АХРат и PrPат предохраняют нейроны и астроциты от индуцированной бета-амилоидом гибели. Было установлено, что наблюдаемый протективный эффект антител на клетках не зависел от изменений внутриклеточной концентрации Са2+ под действием бета-амилоида. Выявлено, что АХРат и PrPат понижают продукцию АФК, индуцированную бета-амилоидом в астроцитах, а также замедляют активацию каспазы 3 в нейронах и астроцитах. В случае с 7-типом АХР было проведено более детальное исследование с использованием ацетилхолина и -бунгаротоксина и показано, что этот тип рецептора регулирует работу комплекса НАДФН-оксидазы в астроцитах.
Выводы 1. Изучена иммунотерапевтическая активность синтетических фрагментов 7субъединицы ацетилхолинового рецептора на животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера и выявлен фрагмент 173-193, иммунизация которым в свободном виде оказывала иммунотерапевтическое действие на животных.
2. Установлено, что пассивная иммунизация аффинноочищенными антителами к фрагменту 173-193 предотвращает ухудшение пространственной памяти мышей с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера.
3. Изучена иммунотерапевтическая активность синтетических фрагментов прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера и выявлен фрагмент 95-123, иммунизация которым в конъюгированном с белком-носителем виде оказывала иммунотерапевтическое действие на животных.
4. Установлено, что пассивная иммунизация аффинноочищенными антителами к фрагменту 95-123 прионного белка оказывала иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера.
5. Показано, что аффинноочищенные антитела к фрагменту 173-193 7субъединицы и к фрагменту 95-123 прионного белка предотвращают индуцированную бета-амилоидом гибель клеток в первичной культуре нейронов и астроцитов гиппокампа крыс.
6. Установлено, что аффинноочищенныe антителa к фрагменту 173-193 7субъединицы и к фрагменту 95-123 прионного белка понижают индуцированную бета-амилоидом скорость продукции активных форм кислорода в астроцитах и ингибируют вызванную действием бета-амилоида активацию каспазы 3 в первичной культуре нейронов и астроцитов коры мозга крыс. Действие антител опосредовано снижением активности НАДФНоксидазного комплекса глиальных клеток.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи журналов:
1. О. М. Вольпина, Т. Д. Волкова, М. А. Титова, Ю. Г. Гершович, Н. И.
Медвинская, А. Н. Самохин, А. В. Камынина, В. С. Шалгунов, Д. О. Короев, М.
П. Филатова, М. Б. Обозная, Н. В. Бобкова. Новые подходы к иммунотерапии болезни Альцгеймера с использованием синтетических фрагментов 7субъединицы ацетилхолинового рецептора. Биоорг. Химия. 2008. Т.34(1). С.5055.
2. Камынина А.В., Шалгунов В.С., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Обозная М.Б., Медвинская Н.И., Самохин А.Н., Бобкова Н.В., Вольпина О.М. Подход к терапии болезни Альцгеймера с помощью индукции антител, направленных к 7-субъединице ацетилхолинового рецептора. Труды МФТИ. 2008. Т.1. С.46-51.
3. Kamynina A.V., Volpina O.M., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.J., Volkova T.D., Koroev D.O., Samokhin A.N., Nesterova I.V., Shelukhina I.V., Kryukova E.V., Tsetlin V.I., Ivanov V.T., Bobkova N.V. Vaccination with Peptide 173-193 of Acetylcholine Receptor alpha7-Subunit Prevents Memory Loss in Olfactory Bulbectomized Mice. J. Alzheimers Dis. 2010. V.21. P.249-261.
Тезисы докладов:
1. Камынина А.В., Шалгунов В.С., Титова М.А., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Обозная М.Б., Гершович Ю.Г., Бобкова Н.В., Цетлин В.И., Вольпина О.М.
Изучение подходов к иммунотерапии болезни Альцгеймера с помощью синтетических фрагментов альфа-7 субъединицы ацетилхолинового рецептора.
VIII чтения, посвящнные памяти академика Ю.А. Овчинникова. Биоорганика2006, Москва. 2006. №1.49. С.112.
2. Камынина А.В., Шалгунов В.С., Титова М.А., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Обозная М.Б., Гершович Ю.Г., Медвинская Н.И., Самохин А.Н., Бобкова Н.В., Вольпина О.М. Влияние иммунизации синтетическими фрагментами альфа7субъединицы ацетилхолинового рецептора на состояние пространственной памяти мышей в экспериментальной модели болезни Альцгеймера. III российский симпозиум Белки и пептиды, Пущино. 2007. С.38.
3. Камынина А.В. Альфа7-субъединица ацетилхолинового рецептора как эндогенная мишень для терапии болезни Альцгеймера. Международная конференция Ломоносов-2008. Москва. 2008. С.35-36.
4. Камынина А.В., Вольпина О.М., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Шалгунов В.С., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Самохин А.Н., Валеева О.А., Бобкова Н.В. Разработка нового подхода к иммунотерапии болезни Альцгеймера. 2-ая Московская международная конференция Иммунофизиология: естественный аутоиммунитет в норме и патологии.
Москва. 2008. С.97-99.
5. Kamynina A., Volpina O., Medvinskaya N., Aleksandrova I., Shalgunov V., Volkova T., Koroev D., Samokhin A., Valeeva O., Bobkova N. Immunization with a synthetic fragment of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor causes therapeutic effect in mice with experimentally induced AlzheimerТs disease. 34th FEBS congress, Prague, Czech Republic. 2009. V.276. P.371.
6. Kamynina A.V., Volpina O.M., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.Ju., Shelukhina I.V., Krukova E.A., Volkova T.D., Koroev D.O., Samokhin A.N., Tsetlin V.I., Bobkova N.V. A new method of AlzheimerТs Disease therapy using antibodies to protein receptors of beta-amyloid. International Conference Molecular Mechanisms of Neurological and Psychiatric Disorders. Martin, Slovakia. 2009. P.59.
7. Kamynina A.V., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.Ju., Volkova T.D., Koroev D.O., Bobkova N.V., Volpina O.M. Synthetic fragments of the neuronal receptors of betaamyloid provide immunetherapeutic effect in mice with experimentally induced AlzheimerТs disease. 10th International Congress of Neuroimmunology. Sitges, Barcelona, Spain. 2010. J. Neuroimmunol. 2010. V.228. P.97-98.
8. Kamynina A.V., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.Y., Samokhin A.N., Volkova T.D., Koroev D.O., Bobkova N.V. Therapeutic effect of immunization with prion synthetic fragment 95-123 in bulbectomized mice with AlzheimerТs type degeneration. 10th International Conference УAlzheimer`s and Parkinson`s Diseases 2011: Neurodegenerative diseasesФ. Barсelona, Spain. 2011.V.8(1).
9. Камынина А.В., Бобкова Н.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Короев Д.О., Волкова Т.Д., Вольпина О.М. Иммунотерапевтическое действие пептидных фрагментов альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка в экспериментальной модели болезни Альцгеймера. V Российский симпозиум Белки и пептиды, Петрозаводск. 2011. С.145.
10. Камынина А.В., Короев Д.О., Вольпина О.М., Абрамов А.Ю. Механизм протективного действия антител к синтетическим фрагментам альфа7субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка против бетаамилоидной токсичности. Международная конференция Биология - наука века, Москва. 2012. С.97.