Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
НИКИТИН
Владимир Юрьевич
ИММУНОПАТОГЕНЕЗ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С
14.00.36 аллергология и иммунология
14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Санкт-Петербург - 2007
Работа выполнена в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова
Научные консультанты:
доктор медицинских наук профессор ЦЫГАН Василий Николаевич
доктор медицинских наук МИТИН Юрий Алексеевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук профессор ВАСИЛЬЕВ Андрей Глебович
доктор медицинских наук профессор МОСКАЛЕВ Александр Витальевич
доктор медицинских наук профессор ЯКОВЛЕВ Алексей Авенирович
Ведущая организация: ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
Защита диссертации состоится л__ марта 2008 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.08 при Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6)
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке
Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова
Автореферат разослан л__ декабря 2007 года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук профессор
ПАСТУШЕНКОВ Владимир Леонидович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. По данным ВОЗ в настоящее время в мире насчитывается более 170 млн. больных хроническим вируcным гепатитом С, а количество инфицированных HCV (вирус гепатита С) достигает 500 млн. человек [Радченко В.Г. и соавт., 2004; Lauer G.M. et al., 2001]. Вирусный гепатит С занимает лидирующее место среди гепатотропных инфекций в развитых странах, где инфицировано 1-2% населения [Alter H.J. et al., 2000; Afdhal N.H. et al., 2004]. В России больных хроническими формами и носителей HCV не менее 2 млн. человек [Шахгильдян И.В. и соавт., 2003]. Характерной особенностью вирусного гепатита С является высокая частота хронизации инфекции (>85%), развития цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (4-8%) [Соринсон С.Н., 1998; Marcellin P. et al., 2002; Ahmad A. et al., 2004]. Различное течение и исходы заболевания обусловлены гетерогенностью иммунного ответа, определенного как иммуногенетическим своеобразием организма-хозяина, так и биологическими особенностями HCV.
Считается, что главным фактором, обуславливающим персистенцию HCV, является высокая скорость мутаций вируса. Благодаря высокой генетической вариабельности, HCV у каждого инфицированного лица существует в виде комплекса генетически близких постоянно изменяющихся вариантов (квазивидов) [Соринсон С.Н. и соавт., 1998; Kanto Т., 1995; Alter Н.J., Seeff L.B., 2000]. Другим механизмом, реализующим возможность персистенции, может быть подавление иммунного ответа под действием белков HCV [Фридлянд И.Ф. и соавт., 2002; Sarobe P. et al., 2003]. Третьим фактором, способствующим персистенции HCV, считается инфицирование этим вирусом лимфоидных клеток [Соринсон С.Н. и соавт., 1997; Lauer G.M. et al., 2001; Kanto T., Hayashi N., 2006]. Резервуаром инфекции в периферической крови и других тканях организма могут служить В- и Т-лимфоциты, моноциты/макрофаги, гранулоциты и другие клетки. Кроме названных механизмов персистенции, имеется предположение о том, что важнейшую роль в хронизации и прогрессировании гепатита С играют дисбаланс между Th1- и Th2-лимфоцитами и секретируемыми ими цитокинами [Приймяги Л.C. и соавт., 2002; Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003; Наследникова И.О. и соавт., 2005; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006; Antonaci S. et al., 1998; Fan X.. et al., 1998; Cramp M. et al., 1999; Boyer N. et al., 2000].
Наличие хронического инфекционного процесса, безусловно, является следствием недостаточности противовирусного иммунитета. Как продемонстрировали многочисленные исследования, главную роль в элиминации HCV играет Т-клеточный ответ, так как действие нейтрализующих антител зачастую оказывается неэффективным. Спонтанное прекращение острой HCV-инфекции ассоциируется с сильным продолжительным мультиспецифическим CD4+-Т-клеточным пролиферативным и IFN-γ-ответом, направленным одновременно на множество вирусных эпитопов-мишеней [Cramp M. et al., 1999; Day C.L. et al., 2002; Rosen H.R. et al., 2002; Chang K. M. et al., 2003; Wertheimer A.M. et al., 2003; Wollard D.J. et al., 2003]. При хроническом течении болезни наблюдается утрата способности CD4+- и CD8+-Т-клеток к пролиферации и к секреции IFN-γ [Wedemeyer H. et al., 2002; Ulsinheimer A. et al., 2003]. В ряде исследований было показано, что HCV способен снижать CD8+-Т-клеточный ответ [Wedemeyer H. et al., 2002; Sugimoto K. et al., 2003; Boettler T. et al., 2005]. Этот факт может объяснять частую клиническую ассимптоматичность острой HCV-инфекции и слабую степень повреждения печени у большинства пациентов [Wedemeyer H. et al., 2002; Accapezzato D. et al., 2004; Kanto T., Hayashi N., 2006].
Предполагается, что и острое и хроническое повреждение печени при гепатите С происходит, в основном, за счет реализации иммунного ответа на HCV, а не его цитопатического действия [Racanelli V. et al., 2001; Chang K. M. et al., 2003; Ahmad A., Alvares F., 2004; Kanto T., Hayashi N., 2006]. Клеточный иммунный ответ играет ключевую роль не только в элиминации вируса, но и в патологии печени при хронической HCV-инфекции. Однако, в настоящее время об изменениях субпопуляционного состава Т-лимфоцитов, других, участвующих в иммунном ответе факторах, связанных с повреждением печени при хронической HCV-инфекции, известно немного.
Особое внимание уделяется изучению роли в иммунопатогенезе ХГС регуляторных Т-клеток с иммунофенотипом CD3+CD4+CD25+ (Tregs) [Sugimoto K. et al., 2003; Cabrera R. et al., 2004; Sakaguchi S., 2004; Boettler T. et al., 2005]. В большинстве работ сообщается о повышении содержания CD4+CD25high Tregs (популяция с высокой степенью экспрессии антигена CD25) в периферической крови HCV-инфицированных пациентов по сравнению с выздоровевшими больными или неинфицированным контролем [Sugimoto K. et al., 2003; Cabrera R. et al., 2004]. Тем не менее, до сих пор не ясна причина повышения Tregs при HCV-инфекции [Kanto T., Hayashi N., 2006]. Большой интерес представляет исследование Т-клеток с экспрессией маркеров NK-клеток (CD16, CD56, CD161), включающих CD3+CD16+56+ Т-киллеры и регуляторные NKT-клетки, несущие на своей поверхности инвариантный Т-клеточный рецептор (ТКР), также участвующие в механизме повреждения печени при ХГС за счет выработки профибротических цитокинов (IL-4 и IL-13) 2 типа [Kawarabayashi N. et al., 2000; Ahmad A., Alvares F., 2004; De Lalla C. et al., 2004].
В последнее время интенсивно изучается характер CD4+- и CD8+-Т-клеточного ответа на белки HCV как в печени, так и в других компартментах (периферическая кровь, костный мозг и др.) [Shirren C.A. et al., 2000; Penna A. et al., 2002; Leroy V. et al., 2003; Watson M.W.et al., 2003; Morita K. et al., 2005]. Было выявлено, что IFN-γ-ответ мононуклеаров периферической крови (МНПК) на C-core-антиген HCV может быть маркером тяжести заболевания при ХГС [Watson M.W. et al., 2003]. Важное прогностическое значение при хронических заболеваниях печени могут иметь исследования цитокинового спектра. Как показано в большинстве работ, повышение содержания некоторых цитокинов связано с изменением активности и прогрессией ХГС [Логинов А.С. и соавт., 2001; Приймяги Л.С. и соавт., 2003; Наследникова И.О. и соавт., 2005; Скляр Л.Ф. и соавт., 2005; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006; Zilberberg H. et al., 1999]. Появились публикации о связи В-клеточного фенотипа со степенью фиброза у пациентов с хронической HCV-инфекцией [Racanelli V. et al., 2001; Ni J. et al., 2003; Sansonno D. et al., 2004; Morita K. et al., 2005].
В то же время, многие аспекты иммунопатогенеза HCV-инфекции остаются неясными и требуют более глубокого изучения. Так, практически отсутствуют сведения об экспрессии активационных маркеров (СD25, HLA-DR, CD95) на поверхности основных субпопуляций Т-, В-лимфоцитов и натуральных киллеров (NK-клеток) у больных с различной степенью фиброза печени. Важной представляется оценка роли Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD25 и HLA-DR, а также Т-киллеров (СD3+CD16+56+) в иммунопатогенезе ХГС и прогрессировании заболевания на стадии формирования цирроза печени. Мало изучена диагностическая значимость изменений провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, которые могли бы выступать в качестве иммунологических маркеров прогрессирования и дифференцирования стадий ХГС. До сих пор не установлены взаимосвязи между факторами гуморального, врожденного иммунитета и темпами прогрессирования фиброза печени у больных ХГС.
Особое значение приобретает создание дифференциально-диагностических и прогностических алгоритмов при ХГС, разработанных на основе анализа изменений клеточного и гуморального звена иммунной системы для случаев, когда отсутствует возможность проведения пункционной биопсии печени. В настоящее время их практически нет, поэтому разработка и практическое внедрение таких алгоритмов поможет клиницисту дифференцировать стадии, тип иммунного ответа при ХГС, оценить прогноз и выбрать рациональную лечебную тактику у конкретного больного.
Таким образом, дальнейшее уточнение иммунопатогенеза хронической HCV-инфекции и идентификация иммунологических критериев, ассоциированных с прогрессией ХГС, нарастанием степени фиброза печени и благоприятным ответом на лечение, является актуальной медицинской проблемой.
Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования.
Цель исследования. Изучить иммунопатогенез хронической HCV-инфекции при различных степенях фиброза печени и генотипах HCV, разработать дифференциально-диагностические и прогностические критерии заболевания.
Задачи исследования.
- Дать характеристику изменений клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и неспецифической резистентности у больных ХГС на различных стадиях заболевания.
- Исследовать изменения клеточного и гуморального звеньев иммунной системы и неспецифической резистентности у больных ХГС с циррозом печени.
- Оценить роль клеточных и гуморальных факторов иммунной системы в иммунопатогенезе хронической HCV-инфекции.
- Выявить особенности изменений иммунной системы при хронической HCV-инфекции, вызванной 3a и 1b генотипами вируса.
- Разработать иммунологические критерии дифференциальной диагностики и прогноза течения хронической HCV-инфекции.
Научная новизна исследования. У больных ХГС со слабой, умеренной, тяжелой степенями фиброза и циррозом печени впервые выявлены обусловленные прогрессией заболевания достоверные различия в содержании субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, ЦИК, иммуноглобулинов, интерлейкинов и функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов.
Впервые выявлены особенности иммунопатогенеза ХГС со слабой и умеренной степенью фиброза печени и сформулированы положения о доминировании гуморального иммунного ответа по Th2 типу и снижении субпопуляций Т- и NK-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности.
Впервые выявлены прогностические и дифференциально-диагностические иммунологические критерии, позволяющие проводить иммунологический мониторинг и прогнозировать течение ХГС у больных с различными степенями фиброза и компенсации цирроза печени.
Впервые выявлены закономерности и взаимосвязь процессов активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток у больных ХГС.
На основе изученных у больных ХГС закономерностей изменений клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности для практического здравоохранения впервые разработаны расширенный и сокращенный варианты обследования больных и алгоритмы дифференциальной иммунодиагностики ХГС на различных стадиях заболевания.
Практическая значимость. В целях дифференциальной диагностики и прогнозирования течения ХГС при слабой, умеренной и тяжелой степени фиброза, компенсированном и декомпенсированном циррозе печени предложен перечень иммунологических критериев и алгоритмы дифференциальной иммунодиагностики заболевания.
Определен объем первичного иммунологического обследования больных ХГС, включающий изучение показателей Т-, В-систем иммунитета, факторов неспецифической резистентности. Разработаны расширенный и сокращенный варианты углубленного иммунологического обследования больных ХГС, позволяющие установить доминирующий тип иммунного ответа.
Предложена система иммунологического мониторинга у больных ХГС, включающая изучение в динамике определенных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, в том числе, экспрессирующих маркеры активации и апоптоза. На основании изучения соотношений активированных и неактивированных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, разработаны иммунологические критерии прогноза ХГС.
ичное участие автора в получении результатов. Автором уточнены особенности иммунопатогенеза начальных и поздних стадий HCV-инфекции, проанализированы иммунологические, клинико-лабораторные и морфологические проявления заболевания на различных его этапах, созданы алгоритмы дифференцирования начальных и поздних стадий ХГС, а также оценки характера иммунного ответа, разработаны иммунологические критерии прогрессирования ХГС на основе анализа изменений иммунной системы у больных с различной степенью выраженности фиброза печени.
Автор осуществлял планирование и принимал непосредственное участие в иммунологическом обследовании больных, организации всех лабораторно-инструментальных и гистологических исследований, самостоятельно проводил анализ количественного состава субпопуляций лимфоцитов периферической крови на проточном цитометре с использованием тройных комбинаций прямых моноклональных антител, а также осуществлял определение содержания различных цитокинов в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа. Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Изменения иммунной системы у больных ХГС при слабой и умеренной степенях фиброза печени проявляются снижением уровня клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксической активности, доминированием гуморального иммунного ответа с преобладанием цитокинов Th2-профиля, высоким уровнем В-лимфоцитов, иммуноглобулинов и ЦИК, нарушением функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов.
2. При тяжелой степени фиброза и компенсированном циррозе печени у больных ХГС наряду с сохраняющимся превалированием В-клеточного иммунного ответа при прогрессии заболевания еще более снижается уровень CD3-CD8+, CD3-CD16+56+ естественных киллеров и усиливается активность Т-клеточного звена иммунной системы, проявляющаяся повышением содержания CD3+CD4+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+, CD3+CD95+ субпопуляций Т-лимфоцитов.
3. Прогрессирование ХГС сопровождается патогенетически значимыми изменениями Т-клеточного звена иммунной системы, характеризующимися взаимосвязью процессов активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток.
Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу НИЛ общей иммунологии и иммуногенетики НИО передовых медико-биологических технологий НИ - ВМедА им. С.М. Кирова, кафедр и клиник инфекционных болезней, факультетской терапии, клинической биохимии и лабораторной диагностики, микробиологии ВМедА им. С.М. Кирова, инфекционных центров и отделений госпиталей МО РФ. На основании полученных данных изданы методические рекомендации ГВМУ МО РФ: Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов (М., 2002), Латентные формы вирусных гепатитов В, С и D: диагностика, лечение и профилактика (М., 2002), подготовлены к изданию методические рекомендации Иммунологическое обследование больных вирусными гепатитами (2006).
Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции с международным участием Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика (Санкт-Петербург, 1999); Научной конференции Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней (Санкт-Петербург, 1999); 4 научной конференции с международным участием Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000 (Санкт-Петербург, 2000); 5 Всероссийской научно-практической конференции Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении (Санкт-Петербург, 2001); 5 научной конференции с международным участием Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001 (Санкт-Петербург, 2001); Всероссийской научной конференции, посвященной 125-летию со дня рождения профессора Н.К. Розенберга и 105-летию основания кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2001); 6 Всероссийской научной конференции с международным участием Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002 (Санкт-Петербург, 2002); 1 съезде военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ (Санкт-Петербург, 2002); Научной конференции Проблемы инфекции в клинической медицине и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002); VII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2003); VI Всероссийской научно-практической конференции Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении (Санкт-Петербург, 2003); VIII, IX, X, XI Всероссийских научных Форумах с международным участием имени академика В.И.Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004-2007).
По материалам исследования опубликовано 32 печатные работы, в том числе 2 методических рекомендаций, 16 научных публикаций, в журналах реферируемых ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 318 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 8 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, шести глав результатов собственных исследований), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 265 источников, в том числе 76 отечественных и 189 зарубежных. Текст содержит 92 таблицы, 20 рисунков и 8 приложений.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования. Всего было обследовано 247 больных хроническим гепатитом С на различных стадиях заболевания. Возраст больных находился в пределах от 18 до 60 лет и в среднем составил 32,4+0,52 года. Подавляющее большинство обследованных являлись лицами мужского пола 212 человек (86%), женщины составили 35 человек (14%). Большинство пациентов (80%) были жителями Санкт-Петербурга, Ленинградской области и Северо-Западного региона России. Остальные пациенты проживали в других областях страны. Большая часть обследованных была представлена военнослужащими РФ (73%) и меньшая часть гражданскими лицами (27%). Контрольную группу составляли здоровые лица (n=76), у которых отсутствовали любые клинико-лабораторные и морфологические признаки поражения печени, а также соматические заболевания. Большинство обследованных в контрольной группе также являлись лицами мужского пола 65 человек (86%), женщины составили 11 человек (14%). Все они проживали в Санкт-Петербурге, Ленинградской области или Северо-Западном регионе России. Их возраст находился в пределах от 18-40 лет и в среднем составил 30,2+0,43 года.
Диагноз ХГС был установлен с помощью клинических, лабораторных (в т. ч., обнаружением в периферической крови суммарных антител к HCV) и морфологических (биопсия печени) методов. Клинический осмотр больных, УЗИ органов брюшной полости, общеклинический анализ крови и мочи, биохимическое исследование крови, пункционная биопсия печени, молекулярно-генетические исследования проводились совместно с кафедрой инфекционных болезней ВМедА (заместитель начальника кафедры по клинической работе доктор медицинских наук К.В. Жданов и доктор медицинских наук Д.А. Гусев). В обследование были включены только те пациенты, у которых анализ методом ПЦР выявил в крови наличие РНК HCV. Больные с острой формой ГС, а также лица с алкоголизмом и наркоманией в исследование не включались.
Морфологические исследования гепатобиоптатов проводились совместно с кафедрой патологической анатомии ВМедА им. С.М. Кирова (начальник кафедры - профессор доктор медицинских наук С.А. Повзун, преподаватель кафедры - доктор медицинских наук В.С. Чирский). Полуколичественно оценивались активность и стадия патологического процесса в печени. Для этого использовался индекс гистологической активности (ИГА), предложенный R.G. Knodell (1981), в дальнейшем модифицированный (без четвертой составляющей, характеризующей выраженность фиброза), а для диагностики стадии патологического процесса применялся индекс фиброза в соответствии со стандартизированной системой METAVIR. В соответствии с этими индексами устанавливали гепатит с минимальной активностью (ИГА 1-3 балла), со слабо выраженной активностью (ИГА 4-8 баллов), с умеренной активностью (ИГА 9-12 баллов) и с выраженной активностью (ИГА 13-18 баллов), а также степень фиброза (Ф0 - отсутствие фиброза, Ф1 - слабый (портальный) фиброз, Ф2 - умеренный (с порто-портальными септами), Ф3 - тяжелый (с порто-центральными септами) и Ф4 - цирроз) [Knodell R.G. et al., 1981; Desmet V.J. et al., 1994; Poynard T. et al., 1997].
На основании морфологического обследования больные с хронической HCV-инфекцией были разделены на группы по стадиям хронического гепатита Ф1 (n=110), Ф2 (n=59), Ф3 (n=19) и Ф4 (n=13). В группу с циррозом (Ф4) входили больные как с компенсированным (7 пациентов), так и декомпенсированным (6 пациентов) циррозом печени.
Большинство серологических и молекулярно-биологических исследований осуществлялись совместно с городским центром вирусологических исследований г. Санкт-Петербурга (заведующий отделом ПЦР-диагностики - кандидат медицинских наук А.В. Семенов) и лабораторией вирусных гепатитов НИИЭМ им. Л. Пастера (заведующий лабораторией Ц доктор медицинских наук В.В. Малышев). Определение анти-HCV выполнялось с применением тест-системы УAnti-HCVabФ производства УAbbottФ (США) на иммунохимическом анализаторе УArchitect 2000 SRФ. Выявление генома HCV (РНК) проводилось методом обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени. Для качественной детекции генома применялась тест-система УАмплиСенс HCV-FRTФ, для количественной - УАмплиСенс HCV-монитор-FRTФ, производства ЦНИИЭ (Россия). Принцип тестирования основан на выделении тотальной РНК из плазмы крови совместно с внутренним контрольным образцом, проведении реакции обратной транскрипции РНК и амплификации с детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени. Исследования проводились на приборе iCycler фирмы УRio-RadФ (США) согласно инструкции производителя. Генотипирование HCV производилось с использованием тест-системы УАмплиСенс-50-R HCV-генотипФ, производства ЦНИИЭ (Россия). Метод основан на проведении обратной транскрипции РНК и последующей амплификации участков кДНК HCV генотипов 1a, 1b, 2, 3a.
На основании молекулярно-генетического обследования больные с хронической HCV-инфекцией были разделены на группы по генотипам HCV 1b (n=22) и 3a (n=30).
Иммунологические исследования крови включали в себя изучение гуморального и клеточного иммунитета, а также факторов неспецифической защиты организма (таблица 1).
Изучение количественного состава субпопуляций лимфоцитов в периферической крови выполнялось на проточном цитометре Facscan фирмы "Becton Dickinson" (США) с использованием тройных комбинаций прямых моноклональных антител (СD95/CD3/CD19, СD25/CD4/CD3, СD25/CD8/CD3, HLA-DR/СD4/СD3, HLA-DR/СD8/СD3, CD16+56/CD3) и изотипических контролей той же фирмы. Внешний контроль качества определения на проточном цитометре различных субпопуляций лимфоцитов проводился в рамках центральной Европейской программы по контролю качества иммунологических исследований (CEQUAL). В результате оценки качества исследований, выполняемых на проточном цитометре, получены сертификаты (№299 от 27.09.2002 г., №299 от 2.04.2004 г., №299 от 6.05.2005 г.).
Таблица 1
Объем иммунологических исследований
Иммунологические исследования | Количество исследований (n) | |
Больные ХГС | здоровые | |
Определение в периферической крови субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии с использованием двух- и трехцветных реагентов | ||
CD3+, CD19+ | 78 | 29 |
CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+ | 78 | 29 |
CD3+CD25+, CD3+HLA-DR+, CD3-CD25+, CD3-HLA-DR+ | 78 | 29 |
CD3+CD4+CD25+, CD3+CD4+HLA-DR+ | 44 | - |
CD3+CD8+CD25+, CD3+CD8+HLA-DR+ | 44 | - |
CD3+CD95+, CD19+CD95+, CD3-CD16+56+CD95+ | 45 | 10 |
CD3-CD8+, CD3-CD16+56+ | 78 | 29 |
Определение цитокинов и иммуноглобулинов методом ИФА | ||
IL-1β, IFN-γ, IL-10, IL-6 | 68 | 28 |
ФНО-α | 108 | 21 |
ИФН-α | 96 | 22 |
ИЛ-4 | 43 | 11 |
IgЕ, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 | 74 | 15 |
Прочие иммунологические методы исследования: | ||
IgM, IgA, IgG (по G.Mancini) | 247 | 74 |
ФЧ, ФП, ПЗФ, ЛКТ, НСТ-тест (спонтанный и индуцированный) | 247 | 54 |
ЦИК высокомолекулярные, | 247 | 125 |
ЦИК среднемолекулярные | 94 | 46 |
ЦИК низкомолекулярные | 94 | 44 |
ВСЕГО | 1763 | 566 |
Определение в сыворотке крови фактора некроза опухолей-α (TNF-α), интерферона-α (IFN-α), интерферона- (IFN-), интерлейкина-1β (IL-1β), интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-10 (IL-10) проводилось методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого использовались отечественные коммерческие тест-системы НПО Протеиновый контур. Методом ИФА определялись также сывороточные иммуноглобулины IgЕ и подклассы IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) с использованием отечественных диагностикумов (ООО УСтибиум плюсФ). Для определения иммуноглобулинов классов M, G и A в сыворотке крови использовался стандартный метод простой радиальной иммунодиффузии по G.Mancini и соавт. (1965).
Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводилось методом, предложенным Ю.А.Гриневичем и А.Н.Алферовым (1981).
Степень активности кислородзависимых и кислороднезависимых микробицидных систем нейтрофильных лейкоцитов оценивали по НСТ-тесту [Виксман М.Е., Маянский А.И., 1977] и ЛКТ [Пигаревский В.Е., Мазинг Ю.А., 1981]. Определение параметров фагоцитарной реакции нейтрофилов крови проводили по методу Н.В. Васильева и соавт. (1972) в модификации В.Г. Морозова и В.Х. Хавинсона (1980).
Исходные данные подвергались статистической обработке на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Exсel и Statistica 6.0 для Windows [Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., 2000; Реброва О.Ю., 2003]. При этом использовались следующие математико-статистические методы: описательная статистика количественных данных в группах; нормальность распределения количественных признаков в выборке с помощью критерия Шапиро-Уилка; сравнение групп с помощью рангового непараметрического метода U-критерия Манна-Уитни (при отсутствии нормального распределения признаков) и параметрического метода t-критерия Стьюдента (при нормальном распределении признаков); корреляционный анализ (коэффициент корреляции - r) двух признаков непараметрическим методом Спирмена и параметрическим методом Пирсона для оценки направления, силы, статистической значимости корреляционной связи между различными клинико-лабораторными, иммунологическими признаками и степенью фиброза печени, с целью отбора наиболее информативных показателей для дифференциальной диагностики различных стадий ХГС, а также оценки скорости прогрессии заболевания.
Результаты исследования и их обсуждение
У всех обследованных больных ХГС (группы Ф1, Ф2, Ф3) отсутствовали внепеченочные клинические проявления вирусного гепатита, уровень общего билирубина находился в пределах нормы. У 15,4% больных ХГС группы Ф4 были выявлены кожные знаки, геморрагии и желтуха.
Субпопуляции Т-хелперов (CD3+CD4+) и цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+) у больных ХГС изучались многими авторами [Никитин И.Г. и соавт., 1999; Mаммаев С.Н., 2001; Масалова О.В. и соавт., 2003; Penna A. et al., 2002; Morita K. et al., 2005]. Тем не менее, в этих работах не проводилось исследование изменений этих субпопуляций на различных стадиях заболевания.
В настоящей работе при анализе содержания Т-хелперов у больных ХГС с различной степенью фиброза и циррозом печени повышение относительного и абсолютного числа CD3+CD4+ Т-лимфоцитов отмечалось только у больных с циррозом печени (Ф4). В то же время, не было выявлено статистически значимых различий (р>0,05) по cравнению с другими группами (Ф1-Ф3). Медианы значений относительного содержания Т-хелперов в группах Ф1-Ф4 составили: здоровые - 38,5%, Ф1 - Ме=37,8%, Ф2 - Ме=37,3%, Ф3 - Ме=35,8%, Ф4 - Ме=40,8%. При этом, у больных группы Ф4 с компенсированным циррозом медиана (Ме) относительного количества CD3+CD4+ клеток равнялась 35,7%, а с декомпенсированным - Ме=47,95%. У 50% обследованных пациентов с декомпенсированным циррозом относительное количество СD3+CD4+ лимфоцитов превышало норму. Таким образом, самые высокие значения относительного содержания CD3+CD4+ Т-лимфоцитов наблюдались у больных ХГС на стадии декомпенсированного цирроза печени. Хотя, сильный CD4+ Т-хелперный ответ является необходимым условием для прекращения HCV-инфекции [Day C.L. et al., 2002, Rosen H.R. et al., 2002; Wertheimer A.M. et al., 2003], повышение CD3+CD4+ Т-лимфоцитов в ПК на стадии тяжелого фиброза (Ф3) имеет, по-видимому, патологический характер и вызвано развитием на поздних стадиях ХГС аутоиммунных процессов. В связи с этим, увеличение в ПК содержания CD3+CD4+ Т-лимфоцитов у больных с тяжелым фиброзом (Ф3) и компенсированным циррозом печени можно рассматривать как прогностически неблагоприятный признак течения заболевания.
Исследование содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+) показало, что медиана значений относительного количества этих клеток постепенно увеличивается по мере роста степени фиброза (Ф1-Ф3) (здоровые - Ме=25,9%, Ф1 Ме=24,4%, Ф2 Ме=27,0%, Ф3 Ме=27,1%), снижаясь у больных с циррозом печени (Ф4 Ме=21,95%). Однако различия между группами не были статистически значимыми (p>0,05). В свою очередь, проведение сравнительного анализа больных с компенсированным и декомпенсированным циррозом печени (группа Ф4), выявило статистически значимое уменьшение относительного (р<0,01) и абсолютного (р<0,05) количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов у больных с декомпенсированным циррозом. Медиана (Ме) относительного содержания CD3+CD8+ Т-клеток при компенсированном циррозе была равна Ме=43,5%, а при декомпенсированном - Ме=15,4%. Таким образом, у больных с компенсированным циррозом чаще отмечались более высокие значения содержания CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, чем у пациентов с декомпенсированным циррозом. Поэтому снижение в ПК относительного числа CD3+CD8+ клеток у больных ХГС на стадии компенсированного цирроза может отражать прогрессию заболевания в декомпенсированный цирроз печени.
Считается, что соотношение CD3+CD4+/CD3+CD8+ свидетельствует об эффективности клеточного иммунного ответа. Некоторые авторы предполагают, что уменьшение (менее единицы) значений этого показателя отражает слабый пролиферативный ответ Т-клеток на вирусные антигены, и связывают это с неблагоприятным прогнозом течения заболевания [Mаммаев С.Н., 2001; Наследникова И.О. и соавт., 2005]. В данном исследовании, при анализе отклонений от пределов нормы пониженные значения этого показателя у больных ХГС обнаружены у пациентов группы Ф1 в 21,9%, Ф2 - в 31,8%, Ф3 - в 15,4% случаев. Причем, у больных с циррозом печени (Ф4) зафиксировано не только снижение (22,2%), но и повышение (33,3%) этого индекса, а нормальные значения соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+ Т-лимфоцитов наблюдались только у 44,4% пациентов. Величины медианы (Ме) индекса CD3+CD4+/CD3+CD8+ в исследуемых группах составили: здоровые - Ме=1,6, Ф1 - Ме=1,35, Ф2 - Ме=1,44, Ф3 - Ме=1,3, Ф4 - Ме=1,95. При этом в группе Ф4 у больных с компенсированным циррозом Ме этого соотношения была равна 0,82, а у больных с декомпенсированным циррозом печени Ме=2,69. Данные исследования свидетельствуют о том, что наиболее низкие значения соотношения СD3+CD4+/CD3+CD8+ были характерны для стадии компенсированного, а самые высокие - для стадии декомпенсированного цирроза. Снижение этого индекса при компенсированном циррозе было обусловлено существенным увеличением количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, а его возрастание при декомпенсированном циррозе печени как увеличением числа СD3+CD4+, так и резким уменьшением содержания в ПК CD3+CD8+ Т-клеток. В связи с этим, у больных ХГС на стадии тяжелого фиброза (Ф3) снижение соотношения СD3+CD4+/CD3+CD8+ Т-лимфоцитов менее единицы может отражать прогрессию заболевания с переходом на стадию компенсированного цирроза печени. В то же время, существенное возрастание этого показателя (>2) у пациентов с ХГС на стадии компенсированного цирроза, по-видимому, может свидетельствовать о дальнейшей прогрессии, проявляющейся развитием декомпенсации цирроза печени.
При фенотипическом анализе особо выделяют Т-клетки, экспрессирующие маркеры, чаще свойственные NK-клеткам (CD3+CD16+56+ Т-киллеры) и обладающие киллерной и противоопухолевой активностью. Эта популяция содержит NKT-клетки и Т-клетки, экспрессирующие антигены CD16 и CD56. [Mendes R. et al., 2000; Ahmad A. et al., 2004; Mercer J.C. et al., 2005]. Оценка содержания в ПК CD3+CD16+56+ Т-киллеров может иметь важное клиническое значение. В настоящем исследовании значения Ме относительного содержания CD3+CD16+56+ Т-клеток в группах составили: здоровые - Ме=4,1%, Ф1 - Ме=3,5%, Ф2 Ме=3,0%, Ф3 - Ме=3,7%, Ф4 - Ме=7,3%. У больных с начальными стадиями фиброза (Ф1, Ф2), по сравнению со здоровыми лицами (здоровые и Ф2, p<0,05), было выявлено умеренное снижение содержания CD3+CD16+56+ Т-лимфоцитов. У больных с большей прогрессией заболевания, наблюдалось постепенное увеличение их числа, что отражалось наличием прямой корреляционной связи между количеством Т-киллеров и степенью фиброза (r=0,24; p=0,035). Было обнаружено статистически значимое (Ф2 и Ф4, р<0,05) повышение содержания этих клеток у больных с циррозом печени (Ф4). Анализ частоты отклонений значений CD3+CD16+56+ Т-клеток от пределов нормы показал, что на поздних стадиях заболевания (Ф3, Ф4) увеличивается частота случаев высокого относительного содержания CD3+CD16+56+ Т-лимфоцитов (Ф1 9,4%, Ф2 - 4,5% Ф3 - 15,4% и Ф4 - 33,3% случаев). В группе Ф4 максимальные значения содержания Т-киллеров отмечались у пациентов с компенсированным циррозом печени (Ме=13,7%). В то же время, у больных ХГС группы Ф4 с декомпенсированным циррозом (Ме=4,15%) было зафиксировано выраженное статистически значимое уменьшение относительного (р<0,01) и абсолютного (р<0,05) количества CD3+CD16+56+ лимфоцитов. Согласно данным литературы [Ahmad A. et al. 2004; De Lalla C. et al., 2004], Т-киллеры и NKT-клетки, также как и CD8+ Т-лимфоциты, играют важную роль в повреждении печени. Прогрессирование ХГС в цирроз печени связывают с продукцией инвариантными NKT-клетками профибротических цитокинов 2 типа (IL-4 и IL-13) [De Lalla C. et al., 2004]. Этот патогенетический механизм подтверждается данными настоящего исследования, что отражалось повышением при компенсированном и снижением при декомпенсированном циррозе печени относительного и абсолютного числа обеих субпопуляций цитотоксических Т-клеток (CD3+CD8+ и CD3+CD16+56+) в периферической крови. Таким образом, наиболее высокие значения CD3+CD16+56+ Т-лимфоцитов были характерны для больных с компенсированным циррозом печени. В связи с этим повышение уровня CD3+CD16+56+ Т-киллеров в ПК у больных ХГС с тяжелым фиброзом (Ф3) можно расценивать как неблагоприятный признак, отражающий прогрессирование патологического процесса с переходом в компенсированный цирроз печени. Значительное уменьшение относительного содержания в ПК CD3+CD16+56+ Т-клеток у больных ХГС при развившемся компенсированном циррозе является прогностически неблагоприятным признаком дальнейшего течения заболевания.
При анализе данных исследования о субпопуляциях активированных Т-лимфоцитов (CD3+СD25+ и CD3+HLA-DR+), наибольший интерес представляют результаты, свидетельствующие о повышении относительного и абсолютного содержания Т-клеток, экспрессирующих УпозднийФ маркер активации HLA-DR (CD3+HLA-DR+) у пациентов с высокой степенью фиброза. Так, при анализе содержания CD3+HLA-DR+ Т-клеток у больных ХГС (Ф1-Ф4) было обнаружено увеличение числа больных, имеющих повышенное содержание CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов (Ф1 9,4%, Ф2 - 4,5%, Ф3 - 15,4%, Ф4 - 33,3% случаев) по мере нарастания степени фиброза, что нашло свое отражение в виде прямой умеренной корреляционной связи между количеством CD3+HLA-DR+ Т-клеток и степенью фиброза (r=0,25; p=0,028). Значения медианы (Ме) относительного содержания CD3+HLA-DR+ Т-клеток в исследуемых группах составили: здоровые - Ме=2,5%, Ф1 - Ме=2,6%, Ф2 Ме=2,6%, Ф3 - Ме=3,1%, Ф4 - Ме=4,0%. Между группами больных ХГС Ф1 и Ф4, а также Ф2 и Ф4 были установлены статистически значимые (p<0,05) отличия по относительному и абсолютному числу этих клеток. В то же время, не было зафиксировано достоверных различий в содержании CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов у пациентов с компенсированным и декомпенсированным циррозом печени. Полученные в настоящем исследовании результаты соответствуют положению о том, что повышение числа активированных CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов у больных с ХГС связано со стадией заболевания [Panasiuk A., et al., 2003]. Поэтому повышение CD3+HLA-DR+ Т-клеток у больных ХГС с умеренным фиброзом может рассматриваться как критерий, характеризующий неблагоприятное течение заболевания.
Популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) неоднородны, в периферической крови существуют субпопуляции, включающие как активированные, так и неактивированные клетки. Изменения этих субпопуляций лимфоцитов на различных стадиях ХГС практически не изучены, хотя могут отражать новые механизмы иммунопатогенеза ХГС. В связи с этим, следующим этапом работы являлся анализ экспрессии активационных маркеров CD25, HLA-DR на субпопуляциях Т-хелперов (CD3+CD4+CD25+, CD3+CD4+HLA-DR+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+CD25+ CD3+CD8+HLA-DR+). Количество активированных Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов определялось от общего числа Т-клеток (CD3+).
В настоящее время установлено, что повышение числа CD4+CD25+ Т-клеток может происходить при воспалительных процессах любой природы (инфекционных, аутоиммунных) [Chatila T.A., 2005; Sakaguchi S., 2005]. В данном исследовании проводилась оценка общего количества CD4+CD25+ активированных Т-хелперов. Значения медианы (Ме) относительного содержания CD4+CD25+ Т-клеток в исследуемых группах составили: Ф1 - Ме=10,9%, Ф2 - Ме=10,1%, Ф3 - Ме=10,7%, Ф4 - Ме=12,5%. Достоверных различий в содержании CD4+CD25+ Т-хелперов у больных ХГС групп Ф1-Ф3 не было выявлено. В то же время, у пациентов с циррозом печени (Ф4) наблюдалось увеличение количества CD4+CD25+ Т-лимфоцитов, что согласуется с литературными данными [Cabrera R. et al., 2004; Boettler T. et al., 2005; Ormandy L.A. et al., 2005]. Можно предположить, что увеличение CD4+CD25+ Т-хелперов связано с развитием на поздних стадиях фиброза (Ф3, Ф4) аутоиммунных процессов. Несмотря на отсутствие статистически значимых различий в количественном содержании CD4+CD25+ Т-клеток у больных ХГС (групп Ф1-Ф3), а также корреляций между их уровнем и степенью фиброза, у больных со слабым фиброзом (Ф1) были зафиксированы прямые взаимосвязи между ИГА и относительным (r=0,84; р=0,001) и абсолютным (r=0,89; p=0,001) числом CD4+CD25+ Т-лимфоцитов. У этих же пациентов обнаружена прямая корреляция (r=0,62; p=0,023) между относительным количеством CD4+CD25+ Т-клеток и активностью цитолитического фермента ААТ. Эти данные свидетельствуют об участии на начальных стадиях заболевания CD4+CD25+ Т-хелперов в патогенезе воспалительного процесса в печени. Кроме этого, у больных ХГС группы Ф3 обнаружена обратная сильная корреляция между абсолютным содержанием CD4+CD25+ Т-лимфоцитов и уровнем вирусной нагрузки (r=-0,92; p=0,026), что позволяет предполагать участие позитивных по CD25 Т-хелперов в контроле репликации HCV. Таким образом, настоящее исследование подтверждает литературные данные [Cabrera R. et al., 2004; Kanto T. et al., 2006] о важной роли CD4+CD25+ лимфоцитов в регуляции иммунного ответа при хронической HCV-инфекции.
Корреляционный анализ выявил взаимосвязь увеличения количества активированных CD4+HLA-DR+ Т-хелперов с декомпенсацией цирроза печени (r=0,82; р=0,007). Медиана (Ме) относительного содержания CD4+HLA-DR+ Т-лимфоцитов у больных с компенсированным циррозом была равна Ме=1,37%, а с декомпенсированным Ме=2,75%. По-видимому, повышение числа Т-клеток, экспрессирующих маркер активации HLA-DR (CD4+HLA-DR+), наряду, с увеличением общего количества Т-хелперов (CD3+CD4+), отражают активность воспалительного и аутоиммунного процессов на стадии компенсированного цирроза.
Исследование содержания активированных ЦТЛ показало, что у больных ХГС в группах с более высокой степенью фиброза (Ф3 и Ф4) увеличивается количество активированных CD8+CD25+ и CD8+HLA-DR+ цитотоксических Т-лимфоцитов, хотя это повышение не было статистически значимым. Значения медианы (Ме) относительного содержания CD8+CD25+ Т-лимфоцитов в исследуемых группах составили: Ф1 - Ме=0,84%, Ф2 - Ме=0,86%, Ф3 - Ме=1,1%, Ф4 - Ме=1,0%, а CD8+HLA-DR+ Т-клеток: Ф1 - Ме=1,3%, Ф2 - Ме=1,6%, Ф3 - Ме=2,4%, Ф4 - Ме=2,3%. Необходимо отметить тот факт, что у больных с декомпенсированным циррозом, несмотря на резкое снижение в периферической крови содержания CD3+CD8+ ЦТЛ, уровень активированных CD8+CD25+ и CD8+HLA-DR+ Т-клеток не изменялся. На основании полученных данных можно говорить о том, что с ростом степени фиброза в иммунной системе происходят процессы, связанные со снижением доли неактивированных ЦТЛ, обусловленные потребностью в достаточно большом количестве активированных ЦТЛ, в результате чего соотношение активированные/неактивированные ЦТЛ смещается в сторону преобладания активированных ЦТЛ
Известно, что ключевая роль в регуляции лимфоцитарного пула на стадиях созревания и активации лимфоидных клеток принадлежит апоптозу [Буеверов А.О. и соавт., 2006]. В настоящем исследовании изучение содержания Т-лимфоцитов, несущих маркер апоптоза CD95 (CD3+CD95+) показало следующие результаты. Несмотря на отсутствие статистически значимых отличий в содержании CD3+CD95+ клеток между больными и здоровыми, было выявлено статистически значимое (р<0,01) повышение их количества, характерное для всех групп больных ХГС. Значения медианы (Ме) относительного содержания CD3+CD95+ Т-лимфоцитов в исследуемых группах составили: здоровые - Ме=5,35%, Ф1 - Ме=15,9%, Ф2 - Ме=12,1%, Ф3 - Ме=17,1%, Ф4 - Ме=12,3%. Увеличение иммунореактивных CD3+CD95+ клеток, по-видимому, было обусловлено продолжительной антиген-специфической и неспецифической активацией Т-лимфоцитов, что приводило к постоянной персистенции активированных лимфоцитов, причем процесс накопления преобладал над процессом их элиминации из периферической крови. У больных ХГС не было выявлено корреляционных взаимосвязей между повышением количества CD95+ Т-лимфоцитов и степенью фиброза, а также ИГА. В то же время, у больных со слабым фиброзом (Ф1) была обнаружена прямая корреляция между содержанием CD3+CD95+ лимфоцитов и ИГА (r=0,62; p=0,031), а также ААТ (r=0,57; p=0,043). Интересен тот факт, что в общей выборке больных ХГС уровень CD95+ лимфоцитов прямо коррелировал с содержанием экспрессирующих антиген CD25 Т-хелперов (СD4+CD25+; r=0,62; р=0,000) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+CD25+; r=0,57; р=0,000). Возможно, что активация CD95+ Т-лимфоцитов препятствовала процессам регулируемого апоптоза, происходящим в периферической крови, а персистирующие активированные Т-хелперы (CD4+CD25+CD95+), таким образом, могли принимать участие в реализации аутоиммунных механизмов патогенеза хронической HCV-инфекции. Одной из причин повышения экспрессии на ЛПК антигена CD95+ при ХГС также может быть персистенция HCV в клетках лимфоидной системы [Буеверов А.О. и соавт., 2000; Ulsenheimer A. et al., 2003].
Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о возрастании активности Т-клеточного звена иммунной системы у больных ХГС, обусловленной прогрессией заболевания и проявляющейся ростом степени фиброза печени, его важной роли в иммунопатогенезе хронической HCV-инфекции. Обнаружение в ПК повышенного содержания основных субпопуляций Т-лимфоцитов, экспрессирующих различные маркеры активации (CD25, HLA-DR, CD95), по-видимому, объясняется как ростом их образования, обусловленного продолжительной антиген-специфической или неспецифической активацией Т-лимфоцитов, так и нарушением процессов их элиминации из периферической крови. Данные настоящего исследования подтверждают важную роль в иммунопатогенезе ХГС не только цитотоксических CD3+CD8+ лимфоцитов, но и субпопуляций Т-киллеров и NKT-клеток, экспрессирующих поверхностные антигены NK-клеток (CD16, CD56), а также Т-хелперов (CD3+CD4+, CD4+CD25+, CD4+HLA-DR+), что, по-видимому, связано с реализацией аутоиммунных процессов на поздних стадиях заболевания (тяжелый фиброз, компенсированный цирроз). Известно, что увеличение экспрессии молекулы HLA-DR на CD3+CD4+ и CD3+CD8+ субпопуляциях лимфоцитов, происходящее под влиянием целого ряда цитокинов, свидетельствует о нарастании активности воспалительного процесса. Обнаружение взаимосвязи повышенной экспрессии Fas-антигена (CD95) с увеличением содержания СD4+CD25+ и CD8+CD25+ популяций активированных Т-клеток, может свидетельствовать о нарушении регулируемого апоптоза активированных Т-клеток, а также о непосредственном участии этих клеток в индукции аутоиммунных реакций. В то же время, для начальных стадий ХГС (слабый фиброз, умеренный фиброз) характерно нормальное содержание активированных Т-клеток. Отсутствие количественных изменений исследованных субпопуляций Т-клеток в периферической крови у больных ХГС на начальных стадиях болезни может быть связано с нарушением их активации, в том числе, с неадекватностью Т-клеточного ответа на HCV. В ряде исследований показано, что темпы прогрессирования фиброза нарастают с увеличением степени его выраженности [Marcellin P. et al., 2002., Seeff L.B., 2002]. В связи с этим, обнаруженное в настоящем исследовании повышение содержания в ПК активированных Т-лимфоцитов позволяет предположить патогенетически важную роль Т-клеточного ответа в реализации быстрого прогрессирования заболевания, в т.ч. трансформации фиброза в цирроз печени.
Выявленные в настоящем исследовании связи между количеством Т-клеток в периферической крови и степенью фиброза, позволяют рассматривать изменения со стороны некоторых субпопуляций Т-лимфоцитов как дополнительные лабораторные критерии прогрессирования заболевания и дифференциальной диагностики ХГС (таблица 2 и 3). Наиболее интересным в плане прогноза течения ХГС является изучение изменений относительного содержания в ПК следующих популяций лимфоцитов: CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+HLA-DR+, CD8+CD25+, CD4+CD25+, CD8+HLA-DR+, CD4+HLA-DR+, CD3+CD16+56+ (таблица 3). Соотношение CD3+CD4+/CD3+CD8+ меньше единицы является прогностически неблагоприятным признаком прогрессии на стадиях Ф1, Ф2, Ф3, как и повышение данного показателя выше 2 у пациентов с компенсированным циррозом (таблица 3).
Таблица 2
Характеристика частоты изменений содержания субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания
Субпопуляции Т-лимфоцитов | I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия | |
Комп. цирроз | Декомп. цирроз | ||||
CD3+CD4+ (%) | N | N | |||
CD3+CD8+ (%) | N | N | N | ||
CD3+CD4+/CD3+CD8+ | |||||
CD3+CD16+56+ (%) | N | N | N | ||
CD3+СD25+ (%) | N | N | N | N | |
CD3+HLA-DR+ ( %) | N | N | |||
CD3+CD95+ (%) | |||||
Примечание: N норма в 90%-100% случаев; выше нормы в 15-30% случаев; выше нормы в 30-60% случаев; выше нормы в более чем 60% случаев; ниже нормы в 15-30% случаев; ниже нормы в 30-60% случаев; ниже нормы в более чем 60% случаев
Таблица 3
Изменения уровней субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови у больных ХГС, как критерии прогрессирования заболевания
Субпопуляции Т-лимфоцитов | I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия (комп. цирроз) |
CD3+CD4+ (%) | - | |||
CD3+CD8+ (%) | - | - | ||
CD3+CD4+/CD3+CD8+ | ||||
CD3+CD16+56+ (%) | - | - | УNФ | |
CD3+СD25+ (%) | - | - | УNФ | |
CD3+CD4+СD25+ (%) | - | - | ||
CD3+CD8+СD25+ (%) | - | УNФ | ||
CD3+HLA-DR+ (%) | - | |||
CD3+CD4+HLA-DR+ (%) | - | УNФ | ||
CD3+CD8+HLA-DR+ (%) | - |
Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей УNФ значения соответствуют УнормеФ; повышение значений показателя на 10% выше нормы; повышение значений показателя на 20% выше нормы; повышение значений показателя на 30% выше нормы; уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы; уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы; уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы
Исследование субпопуляций естественных киллеров (CD3-CD16+56+, CD3-CD8+), выполняющих цитотоксическую функцию в противовирусном и противоопухолевом иммунитете, показало, что изменение количества CD3-CD16+56+ NK клеток в зависимости от стадий ХГС не носило закономерного характера. По сравнению со здоровыми лицами, содержание CD3-CD16+56+ NK клеток на начальных стадиях заболевания несколько снижалось, а затем повышалось у больных с тяжелым фиброзом. У пациентов с циррозом печени (Ф4), в целом, наблюдалось уменьшение числа CD3-CD16+56+ лимфоцитов. В то же время, при проведении отдельного анализа у больных группы Ф4, с различной степенью компенсации цирроза, было выявлено снижение медианы относительного содержания CD3-CD16+56+ NK клеток у больных с компенсированным циррозом (Ме=3,15) и увеличение значений количества NK клеток на стадии декомпенсированного цирроза (Ме=11,6). По мере прогрессирования заболевания, характеризующегося возрастанием степени фиброза печени, было обнаружено постепенное снижение содержания CD3-CD8+ NK-лимфоцитов, хотя достоверных отличий между группами в уровне этих клеток не было установлено. По сравнению со здоровыми лицами зафиксировано статистически значимое (p<0,05) уменьшение абсолютного числа CD3-CD8+ клеток практически на всех стадиях ХГС (Ф2, Ф3, Ф4). Снижение в ПК количества NK-клеток, позитивных по CD8-антигену (CD3-CD8+), может быть использовано в качестве дополнительного критерия прогрессирования заболевания у больных ХГС. В свою очередь, содержание в ПК CD3-CD16+56+ NK-клеток на разных стадиях хронического гепатита, изменялось у больных ХГС как в сторону снижения, так и повышения. По-видимому, уменьшение уровня субпопуляций естественных киллеров (CD3-CD8+, CD3-CD16+56+), а также Т-киллеров (CD3+CD16+56+) на начальных стадиях ХГС могло быть связано с дефицитом основного активатора NK-клеток IL-2, либо с миграцией NK-клеток в печень, со снижением их содержания в ПК. В связи с этим, можно предположить, что у больных со слабым и умеренным фиброзом печени (Ф1, Ф2), ввиду снижения эффективности цитотоксического Т-клеточного ответа, обусловленного смещением иммунного баланса в сторону Th2, основную роль в уничтожении инфицированных вирусом гепатоцитов играют NK-клетки и Т-киллеры. Выявленная тенденция к увеличению числа NK-клеток (CD3-CD16+56+) на поздних стадиях заболевания (Ф3, стадия декомпенсированного цирроза) совпадает с данными литературы, свидетельствующими об увеличении NK-клеток в ПК больных ХГС и наличии прямой корреляции между содержанием этих клеток и ИГА, а также фиброзом печени [Panasiuk A. et al., 2003]. В связи с этим, возрастание уровня естественных киллеров (CD3-CD16+56+) у пациентов с компенсированным циррозом печени может служить маркером прогрессирования болезни, характеризуя переход из компенсированного в декомпенсированный цирроз печени. Обнаруженное увеличение в ПК CD3-CD16+56+ NK клеток у больных с декомпенсированным циррозом, по-видимому, обусловлено активацией и увеличением, как в сыворотке крови, так и в ткани печени уровня цитокинов Th1, в частности IFN-γ, являющегося, наряду с IL-2, основным индуктором цитотоксической активности различных субпопуляций киллерных клеток.
Количественные изменения субпопуляций естественных киллеров могут служить дополнительными лабораторными критериями прогрессирования ХГС (таблица 4 и 5).
Таблица 4
Характеристика частоты изменений содержания субпопуляций NK-клеток периферической крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания
Субпопуляции NK-клеток | I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия | |
Комп. цирроз | Декомп. цирроз | ||||
CD3-CD16+56+ (%) | N | N | |||
CD3-CD8+ (%) | N | N | |||
Примечание: N норма в 90%-100% случаев; выше нормы в 15-30% случаев; выше нормы в 30-60% случаев; выше нормы в более чем 60% случаев; ниже нормы в 15-30% случаев; ниже нормы в 30-60% случаев; ниже нормы в более чем 60% случаев
Наиболее значимым для прогноза течения заболевания является снижение относительного количества субпопуляции NK-клеток с фенотипом CD3-CD8+ ХГС (таблица 5).
Таблица 5
Изменения уровней субпопуляций NK-клеток периферической крови у больных ХГС, как критерии прогрессирования заболевания
Субпопуляции NK-клеток | I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия (комп. цирроз) |
CD3-CD16+56+ (%) | - | УNФ | ||
CD3-CD8+ (%) | - |
Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей
УNФ значения соответствуют УнормеФ; повышение значений показателя на 10% выше нормы; уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы; уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы; уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы
При изучении В-клеточного звена иммунной системы статистически значимые (p<0,05) различия, связанные с повышением относительного содержания CD19+ В-лимфоцитов в ПК больных ХГС, были обнаружены при сравнении групп Ф2ЦФ4 со здоровыми лицами. Это согласуется с исследованиями других авторов [Mаммаев С.Н., 2001; Racanelli V. et al., 2001; Ni J. et al., 2003; Morita K. et al., 2005]. В то же время, достоверных отличий в количестве В-лимфоцитов между группами больных с ХГС не было зафиксировано. При проведении сравнительного анализа между больными с компенсированным (Ме=8,8%) и декомпенсированным (Ме=12,8%) циррозом (группа Ф4) было выявлено статистически значимое (р<0,05) увеличение относительного числа CD19+ В-клеток у пациентов с декомпенсированным циррозом печени. Кроме этого, у больных этой группы (Ф4) установлена прямая корреляция между процентным содержанием СD19+ клеток и степенью компенсации цирроза (r=0,71; p=0,019). Считается, что повышение в ПК больных ХГС количества СD19+ В-лимфоцитов свидетельствует о сдвиге иммунного ответа в сторону Тh2 [Ивашкин В.Т. и соавт., 2001; Mаммаев С.Н., 2001; Morita K. et al., 2005]. По данным ряда авторов, развитие Th2 ответа при ХГС (неэффективного для полной элиминации вируса) является неадекватной реакцией иммунной системы [Жукова О.Б., 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006]. В других работах активацию гуморального звена иммунитета при ХГС объясняют как реакцию организма, направленную на снижение воспалительной активности и сдерживание развития цирроза [Racanelli V. et al., 2001]. По данным наших исследований, несмотря на некоторое повышение СD19+ В-лимфоцитов у больных ХГС, отмечалось постепенное снижение относительного числа CD3-CD25+ активированных В-лимфоцитов. У больных с тяжелым фиброзом (Ф3) наблюдалось статистически значимое снижение (р<0,05) количества CD3-CD25+ клеток, как по сравнению с пациентами со слабым фиброзом (Ф1), так и со здоровыми лицами. Полученные результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что у больных ХГС с высокой степенью фиброза, несмотря на увеличение содержания В-клеток, число активированных В-лимфоцитов не повышается [Ni J. et al., 2003]. По-видимому, это связано с разобщением процессов пролиферации В-лимфоцитов и их активации антигенами HCV, в связи, с чем происходит накопление в периферической крови наивных неактивированных В-клеток. При сравнительном анализе групп больных ХГС (Ф1ЦФ4) по количеству В-лимфоцитов, экспрессирующих СD95-антиген (CD19+CD95+), статистически значимых различий выявлено не было. В то же время, относительное содержание CD19+CD95+ лимфоцитов у больных на всех стадиях ХГС было достоверно выше (р<0,05), чем у здоровых лиц. Повышение CD19+CD95+ В-клеток в группах Ф1 и Ф2 наблюдалось в 46,2% случаев, Ф3 и Ф4 - в 30% и 22,2%, соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что частота выявления увеличенного содержания CD95-позитивных В-клеток понижается с ростом степени фиброза. Также, как и в случае прямой взаимосвязи содержания CD95+ лимфоцитов с уровнем CD25+ Т-хелперов и ЦТЛ, с помощью корреляционного анализа была обнаружена положительная умеренная связь (r=0,48; р=0,001) между содержанием CD95+ лимфоцитов и активированных СD3-CD25+ В-клеток. На основании этого, можно предположить, что повышенная экспрессия CD95-антигена служит целям контроля субпопуляции активированных лимфоцитов.
Таким образом, можно констатировать, что на начальных стадиях ХГС происходит смещение иммунного баланса в сторону Тh2-ответа, что является одной из составляющих механизма, препятствующего повреждению печени цитотоксическими лимфоцитами и сдерживающего развитие фиброза. При низкой концентрации антигена В-клетки выполняют, главным образом, роль АПК, так как другие типы антигенпредставляющих клеток не могут захватить достаточное для представления количество антигенного материала [Ройт А., 2000]. Поскольку в данном исследовании у больных ХГС со слабым (Ф1) и умеренным фиброзом (Ф2) низкая вирусная нагрузка наблюдалась в 52,9% и 40% случаев, соответственно, можно предположить, что у этих пациентов роль АПК выполняли, главным образом, В-лимфоциты. Представляя антиген, В-клетки стимулировали нулевые Т-хелперы к дифференцировке в Th2-клетки, вырабатывающие цитокины необходимые для дальнейшей реализации В-клеточного иммунитета. В то же время, повышение количества В-лимфоцитов у больных с высокой степенью фиброза, по-видимому, происходило за счет аккумуляции наивных В-клеток, так как число активированных В-лимфоцитов не увеличивалось, а снижалось. В этой связи, увеличение В-клеток на начальных стадиях болезни можно считать благоприятным, а на поздних стадиях - неблагоприятным признаком, характеризующим прогрессию заболевания. В свою очередь, уменьшение относительного числа активированных В-лимфоцитов (CD3-СD25+) у больных ХГС, по-видимому, следует расценивать как прогностически неблагоприятный признак.
Количественные изменения со стороны субпопуляций В-клеток могут служить дополнительными лабораторными критериями прогрессирования ХГС (таблица 6 и 7).
Таблица 6
Характеристика частоты изменений содержании субпопуляций В-лимфоцитов периферической крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания
Субпопуляции В-лимфоцитов | I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия | |
Комп. цирроз | Декомп. цирроз | ||||
CD19+ (%) | / | N | |||
CD3-СD25+ (%) | N | ||||
CD19+CD95+ (%) | |||||
Примечание: N норма в 90%-100% случаев; выше нормы в 15-30% случаев; выше нормы в 30-60% случаев; выше нормы в более чем 60% случаев; ниже нормы в 15-30% случаев; ниже нормы в 30-60% случаев; ниже нормы в более чем 60% случаев
Таблица 7
Изменения уровней субпопуляций В-лимфоцитов периферической крови у больных ХГС, как критерии прогрессирования заболевания
Субпопуляции В-лимфоцитов | I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия (комп. цирроз) |
CD19+ (%) | УNФ | |||
CD3-СD25+ (%) | УNФ |
Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей
УNФ значения соответствуют УнормеФ; повышение значений показателя на 20% выше нормы; повышение значений показателя на 30% выше нормы; уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы; уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы; уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы
Из таблицы 7 видно, что наиболее значимым для прогноза течения заболевания является снижение относительного содержания субпопуляции активированных В-клеток с фенотипом CD3-CD25+.
Определение концентраций иммуноглобулинов классов M, A, G и подклассов IgG (IgG1-IgG4) в сыворотке крови показало, что максимальные концентрации IgМ, IgА и IgG отмечались у больных с циррозом печени. Статистически значимые различия (p<0,05) в содержании IgG и IgM у пациентов с циррозом (Ф4) были зафиксированы по сравнению с другими больными ХГС (Ф1-Ф3) и группой здоровых лиц. В результате корреляционного анализа были установлены прямые статистически значимые умеренной силы взаимосвязи между стадией заболевания и концентрацией IgA (r=0,26; p=0,018), а также IgG (r=0,24; p=0,027). Определение подклассов IgG (IgG1-IgG4) в сыворотке крови проводилось только у больных на начальных стадиях ХГС (Ф1, Ф2). При сравнении этих групп было обнаружено достоверное различие (p<0,05), связанное с повышением концентрации подклассов иммуноглобулина G (IgG2, IgG3 и IgG4) у пациентов с умеренным фиброзом (Ф2). Поиск корреляций между стадией заболевания и содержанием в сыворотке крови различных подклассов IgG позволил обнаружить прямую различной силы корреляционную зависимость концентраций IgG2, IgG3 и IgG4 от выраженности фиброза в печени. При этом наиболее сильная взаимосвязь наблюдалась между степенью фиброза печени и уровнем IgG3 (r=0,43; p=0,000), а также были выявлены прямые умеренные статистически значимые корреляции содержания IgG2 (r=0,32; p=0,005) и IgG4 (r=0,38; p=0,007) подклассов с фиброзом в печени. Полученные в результате сравнительного и корреляционного анализов данные свидетельствовали о нарастающей активации В-клеточного иммунного ответа по мере прогрессирования HCV-инфекции. В то же время, статистически значимых корреляционных взаимосвязей между содержанием В-лимфоцитов (CD19+), активированных В-лимфоцитов (CD3-CD25+) с одной стороны и уровнями иммуноглобулинов основных классов IgA, IgG и IgM с другой, не было обнаружено.
Максимальные значения уровней ЦИК всех трех видов наблюдались у больных с циррозом печени (Ф4). Только у этих пациентов, по сравнению с другими группами больных ХГС (Ф1-Ф3), отмечалось статистически значимое увеличение уровней как среднемолекулярных, так и низкомолекулярных ЦИК, которые превышали пределы нормы у больных группы Ф1 в 56,3%, Ф2 - в 47,8%, Ф3 - в 60%, а Ф4 - в 100% случаев. При анализе взаимосвязи степени фиброза и содержания различных типов ЦИК в сыворотке крови были выявлены прямые умеренные корреляционные связи уровней среднемолекулярных (r=0,37; p=0,007) и низкомолекулярных (r=0,26; p=0,047) ЦИК и стадии заболевания. Известно, что низкомолекулярные ИК могут избегать захвата фагоцитами, так как менее эффективно фиксируют комплемент и, за счет этого, хуже связываются с рецепторами для комплемента на мембранах эритроцитов. В результате чего они способны циркулировать в крови более длительное время и образовывать депозиты под эндотелием сосудов, так как в отличие от высокомолекулярных ЦИК, могут проникать сквозь базальную мембрану [Фрейдлин И.С. и соавт., 1999]. В связи с этим, выявленное повышение в сыворотке крови уровня низкомолекулярных ИК у больных ХГС может быть одним из условий развития у этой категории больных иммунопатологических реакций, что согласуется с литературными данными об ассоциации HCV-инфекции с рядом аутоиммунных заболеваний [Лесняк О.М. и соавт., 1999].
Изменения гуморальных факторов В-клеточного звена иммунной системы также могут служить дополнительными лабораторными критериями прогрессирования ХГС (таблица 8 и 9). Из таблицы 9 видно, что наиболее значимым для прогноза заболевания у больных ХГС является нарастание в сыворотке крови концентраций иммуноглобулинов классов А, G, подклассов IgG (IgG2-IgG4) и всех типов ЦИК (таблица 9).
Таблица 8
Характеристика частоты изменений концентраций иммуноглобулинов классов М, А, G, подклассов IgG (IgG1-IgG4) и ЦИК в сыворотке крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания
| Показатели | I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия | |
Комп. цирроз | Декомп. цирроз | ||||
IgM (г/л) | N | N | N | N | |
IgА (г/л) | N | N | N | ||
IgG (г/л) | N | N | N | ||
IgG1 (г/л) | N | N | - | - | - |
IgG2 (г/л) | N | - | - | - | |
IgG3 (г/л) | N | - | - | - | |
IgG4 (г/л) | N | - | - | - | |
ЦИК выс. (отн.ед.) | N | N | N | ||
ЦИК средн. (отн. ед.) | |||||
ЦИК низ. (отн. ед.) | |||||
Примечание: N норма в 90%-100% случаев; выше нормы в 15-30% случаев; выше нормы в 30-60% случаев; выше нормы в более чем 60% случаев; ниже нормы в 15-30% случаев; ниже нормы в 30-60% случаев; ниже нормы в более чем 60% случаев
В целом, полученные данные свидетельствуют об активации В-клеточного звена иммунной системы, связанной с прогрессированием ХГС, и тесной взаимосвязи изменений гуморального иммунитета, обусловленных иммунопатогенезом заболевания. Они согласуются с данными большинства исследователей, подтверждая выводы об увеличении количества В-лимфоцитов (CD19+) в периферической крови и наличии обратной корреляции между содержанием всех циркулирующих В-клеток и частью В-клеток, экспрессирующих активационные маркеры [Лесняк О.М. и соавт., 1999; Racanelli V. et al., 2001; Ni J. et al., 2003; Morita K. et al., 2005]. Этот рост общего числа В-лимфоцитов у больных ХГС связывают с активацией гуморальных факторов иммунной системы и сдвигом в сторону Тh2 ответа [Mаммаев С.Н., 2001; Ивашкин В.Т. и соавт., 2002; Наследникова И.О. и соавт., 2005; Morita K. et al., 2005]. Выявленные в процессе исследования снижение содержания активированных В-лимфоцитов (СD3-CD25+) в ПК, повышение концентраций IgA, IgG, IgG2, IgG3, IgG4, а также уровней средне- и низкомолекулярных ЦИК в сыворотке крови, коррелирующие со степенью фиброза печени у больных ХГС, позволяет сделать вывод о возможности их использования в качестве иммунологических критериев прогрессирования хронической HCV-инфекции.
Таблица 9
Изменения концентраций иммуноглобулинов классов А, G, подклассов IgG (IgG2-IgG4) и ЦИК в сыворотке крови у больных ХГС как критерии прогрессирования заболевания
| Показатели | I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия (комп. цирроз) |
IgА (г/л) | - | - | ||
IgG (г/л) | - | - | ||
IgG2 (г/л) | - | - | - | |
IgG3 (г/л) | - | - | - | |
IgG4 (г/л) | - | - | - | |
ЦИК выс. (отн. ед.) | - | - | ||
ЦИК средн. (отн. ед.) | ||||
ЦИК низ. (отн. ед.) |
Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей
повышение значений показателя на 10% выше нормы; повышение значений показателя на 20% выше нормы; повышение значений показателя на 30% выше нормы
Известно, что цитокины являются продуктами активированных клеток иммунной системы и действуют как растворимые медиаторы межклеточных взаимодействий. Покоящиеся клетки практически не продуцируют цитокины. В данном исследовании в сыворотке крови больных ХГС с различной степенью фиброза были изучены изменения следующих цитокинов: IFN-α, IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10 и TNF-α. В результате было установлено, что у больных ХГС по мере прогрессирования заболевания отмечалось повышение содержания в сыворотке крови IFN-γ, IL-10 и TNF-α. Увеличение концентрации IFN-γ было характерно, в основном, для более поздних стадий заболевания (Ф3, Ф4), что подтверждалось статистически значимыми различиями между группами больных ХГС Ф1 и Ф4 (р<0,05), а также Ф2 и Ф4 (р<0,05). Значения медианы (Ме) уровня IFN-γ в исследуемых группах составили: здоровые - Ме=7,43 пг/мл, Ф1 - Ме=9,96 пг/мл, Ф2 - Ме=11,86 пг/мл, Ф3 - Ме=12,1 пг/мл, Ф4 - Ме=21,02 пг/мл. Была выявлена прямая статистически значимая связь (r=0,25; р=0,05) между степенью фиброза и содержанием IFN-γ. Полученные результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что уровень IFN-γ в сыворотке крови при циррозе печени и ГЦК превышает таковой при ХГС [Дьяченко А.А. и соавт., 2001; Navas S., Martin J., 1998; Huang Y.S. et al., 1999; Kawakami Y. et al., 2001]. Также есть данные, что прогрессирующее повреждение печени при ХГС коррелирует с увеличением уровня внутрипеченочных цитокинов Th1-типа (IFN-γ) [Рязанцева Н.В. и соавт., 2006]. Учитывая тот факт, что изменение баланса цитокинов Th1/Th2 на локальном и системном уровне носит однонаправленный характер, определение сывороточной концентрации IFN-γ в динамике у конкретного больного можно использовать как маркер прогрессирования ХГС.
Такие же закономерности были характерны для уровней IL-10, концентрация которого в сыворотке крови увеличивалась с ростом степени фиброза. Об этом свидетельствовали статистически значимые различия между группами Ф1 и Ф4 (р<0,05), а также достоверная прямая корреляционная взаимосвязь между содержанием IL-10 и стадией заболевания (r=0,25; р=0,048). Наряду с этим наблюдалась тенденция к возрастанию частоты случаев отклонения от нормы концентрации IL-10 на поздних стадиях заболевания (Ф1 - в 9%, Ф2 - в 36,4%, Ф3 - в 35,7% и Ф4 - в 55,6% случаев). Полученные данные согласуются с результатами других авторов [Наследникова И.О. и соавт., 2005; Скляр Л.Ф. и соавт., 2005; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006; Abaily B. et al., 2003] и позволяют рекомендовать определение сывороточной концентрации IL-10 для дифференцирования стадий заболевания.
У больных ХГС обнаружено связанное с ростом степени фиброза печени повышение содержания TNF-α в сыворотке крови. Так, статистически значимые различия в концентрации TNF-α были установлены между группами больных ХГС Ф1 и Ф2 (р<0,01), Ф1 и Ф3 (р<0,05), Ф1 и Ф4 (р<0,01). При корреляционном анализе выявлена прямая сильная взаимосвязь между степенью фиброза и уровнем TNF-α (r=0,41; р=0,000). На основании этих данных, которые также согласуются с литературными [Логинов А.С. и соавт., 2003; Собчак Д.М. и соавт., 2004; Красавцев Е.Л. и соавт., 2005; Скляр Л.Ф. и соавт., 2005], можно сделать вывод, что определение в динамике содержания TNF-α в сыворотке крови больных ХГС может быть использовано как лабораторный критерий дифференциальной диагностики заболевания.
При анализе содержания IL-4 и IL-1β в сыворотке крови больных ХГС статистически значимых отличий между различными группами больных ХГС не было выявлено. В тоже время, у значительной части больных отмечалось увеличение концентрации этих цитокинов. Так, в группах Ф1-Ф4 повышение содержания IL-4 наблюдалось у 63,6%, 30%, 57,1% и 25% больных ХГС, а уровня IL-1β в 22,2%, 23,5%, 50% и 28,6% случаев, соответственно. Несмотря на отсутствие значимых отличий между больными ХГС групп Ф1-Ф4, установлена прямая корреляционная взаимосвязь между степенью фиброза и содержанием IL-1β (r=0,25; р=0,041). На основании этих данных, согласующихся с литературными [Дьяченко А.А. и соавт., 2001; Логинов А.С. и соавт., 2003; Красавцев Е.Л. и соавт., 2005; Скляр Л.Ф. и соавт., 2005] можно предположить, что увеличение концентрации IL-1β в сыворотке крови больных (Ф1, Ф2) отражает прогрессию ХГС на начальных стадиях заболевания.
Уровни цитокинов могут быть использованы в качестве дополнительных критериев дифференцирования стадий ХГС (таблица 10).
Таблица 10
Характеристика частоты изменений концентраций цитокинов в сыворотке крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания
| Цитокины | I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия | |
Комп. цирроз | Декомп. цирроз | ||||
IFN-γ (пг/мл) | N | N | N | ||
IFN-α (пг/мл) | N | N | N | N | N |
IL-4 (пг/мл) | - | - | |||
IL-10 (пг/мл) | N | ||||
IL-1β (пг/мл) | |||||
TNF-α (пг/мл) | N | N | N | ||
IL-6 (пг/мл) | N | N | N | N | |
Примечание: N норма в 90%-100% случаев; выше нормы в 15-30% случаев; выше нормы в 30-60% случаев; выше нормы в более чем 60% случаев; ниже нормы в 15-30% случаев; ниже нормы в 30-60% случаев; ниже нормы в более чем 60% случаев
Изменения концентраций IL-10, TNF-α и IFN-γ в сыворотке крови на любой стадии ХГС могут рассматриваться в качестве критериев прогноза заболевания (таблица 11).
Таблица 11
Изменения концентраций цитокинов в сыворотке крови у больных ХГС, как критерии прогноза заболевания
| Цитокины | I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия (комп. цирроз) |
IFN-γ (пг/мл) | - | - | ||
IL-4 (пг/мл) | - | - | ||
IL-10 (пг/мл) | ||||
IL-1β (пг/мл) | - | |||
TNF-α (пг/мл) | - | - |
Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей
повышение значений показателя на 10% выше нормы; повышение значений показателя на 20% выше нормы; повышение значений показателя на 30% выше нормы
Поскольку IL-4 и IL-10 являются цитокинами Th2-типа и участвуют в реализации В-клеточного иммунитета, можно сделать предположение о доминировании гуморального иммунного ответа у больных ХГС, имеющих повышенные концентрации этих цитокинов в сыворотке крови. Полученные данные свидетельствуют о высокой продукции противовоспалительных цитокинов в условиях персистенции HCV, что согласуется с результатами других авторов [Логинов А.С. и соавт., 2001; Ивашкин В.Т. и соавт., 2002; Приймяги Л.C. и соавт., 2002; Царегородцева Т.М. и соавт., 2003; Fan X.G. et al., 1998]. По-видимому, на начальных этапах заболевания биологическое значение функциональных изменений в иммунной системе, обусловленных преобладанием продукции интерлейкинов Th2-типа, состоит в сдерживании репликации вируса, а также ограничении интенсивности и распространенности воспаления в печени. В свою очередь, на поздних стадиях ХГС, продолжающееся повышение уровней IL-4 и IL-10, вызванное постоянной антигенной стимуляцией, реализуется активным фиброгенезом и прогрессированием заболевания. Нарастание уровней цитокинов Тh2-типа (IL-4 и IL-10) часто было взаимосвязано с увеличением концентрации таких провоспалительных цитокинов как IL-1β и TNF-α. Более выраженное повышение уровня провоспалительных цитокинов на поздних стадиях ХГС (у больных групп Ф3, Ф4) отмечалось и другими исследователями, обнаружившими их увеличение у больных с циррозом печени и ГЦК [Дьяченко А.А. и соавт., 2001; Huang Y.S. et al., 1999].
Таким образом, рост концентраций IL-1 и TNF- происходил в соответствии со степенью выраженности патологического процесса в печени и, вероятно, прогрессией ХГС, в целом. Обнаруженное в результате исследования увеличение у больных ХГС концентрации в сыворотке крови цитокинов Th2-типа (IL-4, IL-10), провоспалительных цитокинов (IL-1, TNF-), связанное с возрастанием степени фиброза, позволяет использовать их в качестве дополнительных лабораторных критериев прогноза заболевания. Повышение IFN-γ (цитокина Th1-типа) на поздних стадиях ХГС (Ф3, компенсированный цирроз) свидетельствует о его возможном участии в патогенезе повреждений печени при хронической HCV-инфекции. Необходимо еще раз отметить, что IFN-γ, (также как и IL-2) является основным индуктором цитотоксической активности различных субпопуляций киллерных клеток, среди которых, могут быть клоны аутореактивных эффекторных клеток, участвующих в реализации аутоиммунных реакций. В связи с этим, определение концентрации IFN-γ также может служить признаком прогрессирования болезни.
Роль нейтрофилов в противовирусном иммунитете реализуется участием в модуляции иммунных реакций через синтез и продукцию иммуномодуляторных цитокинов. Изучая изменения функциональной активности нейтрофилов, можно охарактеризовать воздействие вирусов и оценить устойчивость организма к бактериальной инфекции [Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000]. Исследования показали, что по сравнению со здоровыми лицами для всех больных ХГС (группы Ф1-Ф4) было характерным незначительное повышение активности кислородзависимых систем бактерицидности (НСТ) и снижение переваривающей функции нейтрофилов (ПЗФ). Наиболее значимым было постепенное снижение значений лизосомально-катионного теста (ЛКТ) по мере прогрессирования фиброза печени у больных ХГС. Это подтверждалось статистически достоверными различиями (р<0,05) между больными групп Ф1 и Ф4. Анализ показал, что с ростом степени фиброза ФЧ статистически значимо уменьшалось (r=-0,26; p=0,016), а ПЗФ - увеличивался (r=0,25; p=0,025). В результате корреляционного анализа были установлены статистически значимые обратные умеренные взаимосвязи между процентным содержанием в ПК нейтрофилов и уровнем спонтанного НСТ теста (r=-0,27; p=0,018), и ЛКТ (r=-0,25; p=0,032). Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ХГС в ответ на снижение в ПК количества нейтрофилов происходит компенсаторное повышение активности кислородзависимых и кислороднезависимых систем бактерицидности фагоцитов. Таким образом, при изучении активности систем бактерицидности нейтрофилов было установлено, что у больных ХГС наблюдается активация кислородзависимых систем бактерицидности фагоцитов. На начальных стадиях заболевания (Ф1, Ф2) отмечается усиление активности кислороднезависимых систем бактерицидности и поглотительной способности нейтрофилов. В дальнейшем, по мере прогрессирования фиброзного процесса происходит их постепенное снижение до нормы и затем ниже. В тоже время, отмечалась прямая корреляция между уровнем ПЗФ и стадией заболевания. Так, у больных с высокой степенью фиброза (Ф3 и Ф4) переваривающая способность нейтрофилов достоверно увеличивалась по сравнению с пациентами с начальными стадиями фиброза печени (Ф1, Ф2). По-видимому, это связано с компенсаторным повышением функциональной активности нейтрофилов на поздних стадиях заболевания.
Настоящее исследование продемонстрировало, что расширенный вариант иммунологического обследования (таблица 12) позволяет использовать изменения иммунной системы для дифференцирования стадий ХГС. Так, ключевыми иммунологическими показателями при дифференцировании I и II стадии ХГС являются IgG3, IL-10, CD3-CD25+ (рисунок 1). Для дифференциальной диагностики III стадии ХГС и компенсированного цирроза печени необходимо определять содержание CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, TNF-, IFN-, IgM, IgG (рисунок 2). Для дифференциации степени компенсации цирроза печени у больных ХГС необходимо исследовать содержание CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, CD3+CD4+/CD3+CD8+ (рисунок 3). На основании первичного иммунологического обследования можно определить преобладающий характер иммунного ответа (Th1- или Th2-типа) и прогнозировать вероятный темп прогрессирования заболевания (рисунок 4). Выявленные в настоящем исследовании связи между факторами иммунной системы и степенью фиброза, позволяют использовать характерные изменения некоторых иммунологических показателей в качестве критериев прогрессирования заболевания (таблица 13).
Таблица 12
Характеристика частоты изменений наиболее информативных иммунологических показателей у больных ХГС на различных стадиях заболевания
(расширенный вариант иммунологического обследования)
| Показатели иммунной системы | ХГС | ||||
I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия | ||
Комп. цирроз | Декомп. цирроз | ||||
CD3+CD4+ (%) | N | N | |||
CD3+CD8+ (%) | N | N | N | ||
CD3+CD4+/CD3+CD8+ | |||||
CD3+CD16+56+ (%) | N | N | N | ||
CD3+СD25+ (%) | N | N | N | N | |
CD3+HLA-DR+ (%) | N | N | |||
CD3-CD8+ (%) | N | N | |||
CD19+ (%) | / | N | |||
CD3-СD25+ (%) | N | ||||
IgM (г/л) | N | N | N | N | |
IgА (г/л) | N | N | N | ||
IgG (г/л) | N | N | N | ||
IgG2 (г/л) | N | N | - | - | - |
IgG3 (г/л) | N | - | - | - | |
IgG4 (г/л) | N | - | - | - | |
ЦИК выс. (отн.ед.) | N | N | N | ||
ЦИК средн.(отн. ед.) | |||||
ЦИК низ. (отн. ед.) | |||||
IFN-γ (пг/мл) | N | N | N | ||
IL-4 (пг/мл) | - | - | |||
IL-10 (пг/мл) | N | ||||
TNF-α (пг/мл) | N | N | N | ||
Примечание: N - норма в 90%-100% случаев; - выше нормы в 15-30% случаев; - выше нормы в 30-60% случаев; - выше нормы более 60% случаев; - ниже нормы в 15-30% случаев; - ниже нормы в 30-60% случаев; - ниже нормы более 60% случаев
Иммунологическое обследование больного ХГС | |||||||||||||
Определение в сыворотке крови содержания IgG3, IL-10 | |||||||||||||
Нормальный или пониженный уровень IgG3, IL-10 | Повышенный уровень IgG3, IL-10 | ||||||||||||
Определение в ПК содержания CD3-CD25+ В-лимфоцитов | Определение в ПК содержания СD3-CD25+ В-лимфоцитов | ||||||||||||
Нормальное или повышенное содержание CD3-CD25+ В-лимфоцитов | Пониженное содержание CD3-CD25+ В-лимфоцитов | ||||||||||||
I стадия ХГС (слабый фиброз) | II стадия ХГС (умеренный фиброз) | ||||||||||||
Иммунологическое обследование больного ХГС | |||||||||
Определение в ПК содержания субпопуляций (CD3+CD8+, CD3+CD16+56+) Т-лимфоцитов | |||||||||
Нормальное или пониженное содержание в ПК (CD3+CD8+, CD3+CD16+56+) Т-лимфоцитов | Повышенное содержание в ПК (CD3+CD8+, CD3+CD16+56+) Т-лимфоцитов | ||||||||
Определение содержания в сыворотке крови цитокинов TNF-, IFN-, иммуноглобулинов IgА, IgG | Определение содержания в сыворотке крови цитокинов TNF-, IFN-, иммуноглобулинов IgА, IgG | ||||||||
Нормальный или пониженный уровень TNF-, IFN-, IgА, IgG | Повышенный уровень TNF-, IFN-, IgА, IgG | ||||||||
III стадия ХГС (тяжелый фиброз) | ХГС на стадии компенсированного цирроза | ||||||||
Рисунок 1. Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на I и II стадии заболевания
Рисунок 2. Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии тяжелого фиброза и компенсированного цирроза печени
Иммунологическое обследование больного ХГС | |||||||
Определение в ПК содержания субпопуляции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов | |||||||
Повышенное содержание в ПК субпопуляции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов | Пониженное содержание в ПК субпопуляции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов | ||||||
Определение в ПК содержания (CD3+CD4+, CD3+CD16+56+) Т-лимфоцитов | Определение в ПК содержания (CD3+CD4+, CD3+CD16+56+) Т-лимфоцитов | ||||||
Умеренное увеличение содержания субпопуляции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, повышенное содержание CD3+CD16+56+ Т-киллеров | Значительное увеличение содержания субпопуляции CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, пониженное содержание CD3+CD16+56+ Т-киллеров | ||||||
Определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+ | Определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+ | ||||||
Соотношение CD3+CD4+/CD3+CD8+ <1 | Соотношение CD3+CD4+/CD3+CD8+ >2 | ||||||
ХГС на стадии компенсированного цирроза | ХГС на стадии декомпенсированного цирроза | ||||||
Рисунок 3. Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии компенсированного и декомпенсированного цирроза печени
Примечание: N - норма; - выше нормы; - ниже нормы
Рисунок 4. Доминирующие типы иммунного ответа и их связь с темпами прогрессирования заболевания у больных ХГС
Таблица 13
Перечень иммунологических критериев прогрессирования заболевания
у больных ХГС
Показатели иммунной системы | ХГС | |||
I стадия (слабый фиброз) | II стадия (умеренный фиброз) | III стадия (тяжелый фиброз) | IV стадия (компенсир. цирроз) | |
CD3+CD4+ (%) | - | |||
CD3+CD8+ (%) | - | - | ||
CD3+CD4+/CD3+CD8+ | ||||
CD3+CD16+56+ (%) | - | - | УNФ | |
CD3+HLA-DR+ (%) | - | |||
CD3-CD8+ (%) | - | |||
CD3-СD25+, (%) | УNФ | |||
IgА (г/л) | - | - | ||
IgG (г/л) | - | - | ||
IgG2 (г/л) | - | - | - | |
IgG3 (г/л) | - | - | - | |
IgG4 (г/л) | - | - | - | |
ЦИК средн. (отн. ед.) | ||||
ЦИК низк. (отн. ед.) | ||||
IFN-γ (пг/мл) | - | - | ||
IL-10 (пг/мл) | ||||
TNF-α (пг/мл) | - | |||
Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей УNФ значения соответствуют УнормеФ; повышение значений показателя на 10% выше нормы; повышение значений показателя на 20% выше нормы; повышение значений показателя на 30% выше нормы; уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы; уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы; уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы
В настоящее время возраст в момент инфицирования рассматривается многими исследователями в качестве наиболее весомого предиктора течения HCV-инфекции. Установлено, что при заражении в возрасте старше 40 лет отмечаются более быстрые темпы прогрессии ХГС с реализацией в цирроз печени [Ильина Е.Н. и соавт., 2001; Царегородцева Т.М. и соавт., 2003; Poynard T. et al., 1997]. В настоящем исследовании у больных возрастной группы 40Ц60 лет были выявлены статистически значимые корреляции между возрастом пациента и содержанием CD3+CD16+56+ Т-киллеров (r=0,41; p=0,000), активированных Т-хелперов CD4+CD25+ (r=0,33; p=0,038), цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+HLA-DR+ (r=0,31; p=0,049) ПК, а также уровнем в сыворотке крови низкомолекулярных ЦИК (r=0,33; p=0,023). Наряду с этим, повышение низкомолекулярных ЦИК также сочеталось с ростом активности ААТ (r=0,30; р=0,039) и высокой вирусной нагрузкой (r=0,49; р=0,02). Эти данные свидетельствуют о том, что более быстрое прогрессирование заболевания у больных старше 40 лет связано с активацией Т-клеточного иммунитета.
Помимо изучения изменений иммунной системы у больных ХГС с различной степенью фиброза проводилось иммунологическое исследование пациентов с генотипами HCV 3а и 1b. В литературе отсутствуют данные о взаимосвязи субтипа HCV c исследованными в представленной работе иммунологическими параметрами. В результате изучения Т-клеточного звена иммунной системы было установлено, что у больных ХГС с генотипом HCV 1b по сравнению с пациентами, имеющими субтип HCV 3а, отмечалось статистически значимое повышение содержания активированных СD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов (р<0,05) и CD3+CD16+56+ Т-киллеров (р<0,05). Этот факт был подтвержден данными корреляционного анализа, зафиксировавшим у пациентов с генотипом HCV 1b наличие взаимосвязи с более высоким содержанием CD3+CD16+56+ Т-киллеров (r=0,29; р=0,05) и CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов (r=0,37; р=0,011), в отличие от больных с субтипом HCV 3а. Исследование В-клеточного звена иммунной системы показало, что по сравнению с больными с генотипом HCV 3а у пациентов c субтипом HCV 1b статистически значимо (p<0,05) увеличивалась концентрация среднемолекулярных ЦИК. Поиск корреляций показал, что более высокие уровни всех типов ЦИК ассоциировались с генотипом HCV 1b. Таким образом, полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что у больных с генотипом HCV 1b наблюдаются более выраженные изменения иммунной системы: увеличение содержания CD3+CD16+56+ Т-киллеров, активированных CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов, ЦИК всех типов, по сравнению с больными ХГС, имеющими субтип HCV 3а. Как уже было показано, именно, эти факторы иммунной системы были связаны со степенью выраженности фиброза и старшим возрастом. Вполне вероятно, что выявленные в результате исследования изменения иммунной системы у больных ХГС с генотипом HCV 1b обусловлены большей степенью выраженности фиброза и возрастными особенностями, характерными для этой группы больных.
ВЫВОДЫ
1. Изменения клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности у больных ХГС со слабой и умеренной степенью фиброза печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, снижением в периферической крови уровней CD3+CD16+56+ субпопуляций Т-лимфоцитов, а также CD3-CD16+56+, CD3-CD8+ естественных киллеров, повышением CD3+CD95+ субпопуляций Т- и CD19+, CD19+CD95+ субпопуляций В-лимфоцитов, содержания IgM, IgG, IgG3, IL-1, TNF-, IL-4, IL-6, IL-10, ЦИК всех типов и нарушениями функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, проявляющимися повышением уровней кислородзависимой бактерицидности, активности неферментных лизосомально-катионных белков, поглотительной способности и снижением завершенности фагоцитоза.
2. Изменения иммунной системы у больных ХГС с тяжелой степенью фиброза печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, снижением в периферической крови уровней CD3-CD25+ субпопуляций В-лимфоцитов и CD3-CD8+ естественных киллеров, повышением уровней CD3+CD95+ субпопуляции Т- и CD19+, CD19+CD95+ субпопуляций В-лимфоцитов, содержания IgА, ЦИК всех типов, IL-1, TNF-, IL-4, IL-10, а также нарушениями функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, проявляющимися повышением уровня кислородзависимой бактерицидности, поглотительной способности и снижением завершенности фагоцитоза.
3. Изменения иммунной системы у больных ХГС с циррозом печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, повышением в периферической крови уровней CD3+CD4+, CD3+HLA-DR+, CD3+CD95+ субпопуляций Т-лимфоцитов, CD19+ В-лимфоцитов, снижением CD3+CD8+, CD3-CD25+, CD3-CD8+ лимфоцитов, уровня спонтанного НСТ-теста, повышением содержания IgG, IgА, IgM, ЦИК всех типов, IL-1, TNF-, IFN-, IL-10.
4. Изменения иммунной системы у больных ХГС с субтипом HCV 1b характеризуются достоверным, по сравнению с больными ХГС с генотипом HCV 3а, повышением количества CD3+CD16+56+ Т-киллеров, активированных CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов, высоко-, средне- и низкомолекулярных ЦИК.
5. Особенностями иммунопатогенеза ХГС со слабой и умеренной степенями фиброза печени является доминирование гуморального типа иммунного ответа, проявляющегося ростом числа (CD19+) В-лимфоцитов, иммуноглобулинов М, G и его подклассов G2, G3, G4, ЦИК, цитокинов Th2 профиля (IL-4, IL-10), сопровождающееся снижением количества CD3+CD16+56+ Т-лимфоцитов и CD3-CD8+, CD3-CD16+56+ субпопуляций NK-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности.
6. Особенностями иммунопатогенеза ХГС на стадии цирроза печени, по сравнению со стадией тяжелого фиброза, являются повышение содержания CD3+CD4+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, уровней иммуноглобулинов M, G, ЦИК всех типов, TNF-, IFN-, а также снижение числа CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и CD3-CD8+, CD3-CD16+56+ субпопуляций NK-клеток.
7. У больных ХГС на стадии развития декомпенсированного цирроза печени возникают достоверные, по сравнению с больными ХГС с компенсированным циррозом печени, дифференциально-диагностически значимые изменения иммунной системы: снижение уровня CD3+CD8+, CD3+CD16+56+ и повышение уровня CD3+CD4+ субпопуляций Т-лимфоцитов.
8. У больных ХГС отмечаются патогенетически значимые изменения иммунной системы, характеризующиеся взаимосвязью процессов активации, что отражается возрастанием уровней активированных CD8+CD25+, CD4+CD25+, CD8+HLA-DR+, CD4+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, и апоптоза иммунокомпетентных клеток, проявляющегося увеличением числа Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор (CD3+CD95+).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. В целях дифференциальной диагностики между ХГС со слабым фиброзом и ХГС с умеренным фиброзом печени рекомендуется использовать Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на I и II стадии заболевания, включающий определение в периферической крови содержания IgG3, IL-10, CD3-CD25+. Для прогнозирования перехода ХГС со слабым фиброзом в ХГС с умеренным фиброзом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD3-CD25+ субпопуляции В-лимфоцитов, IgG2, IgG3, IgG4, ЦИК всех типов, TNF-, IL-10.
2. Для прогнозирования перехода ХГС с умеренным фиброзом в ХГС с тяжелым фиброзом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD3-CD25+ субпопуляции В-лимфоцитов, CD3-CD8+ NК-клеток, ЦИК всех типов, IL-10.
3. В целях дифференциальной диагностики между ХГС с тяжелым фиброзом и ХГС с компенсированным циррозом печени рекомендуется использовать Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии тяжелого фиброза и компенсированного цирроза печени, включающий определение в периферической крови содержания CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, TNF-, IFN-, IgM, IgG. Для прогнозирования перехода ХГС с тяжелым фиброзом в ХГС с компенсированным циррозом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD3-CD25+ субпопуляции В-лимфоцитов, CD3-CD8+ NК-клеток, IgА, IgG, ЦИК всех типов, TNF-, IFN-, IL-10.
4. В целях дифференциальной диагностики ХГС с различной степенью компенсации цирроза печени рекомендуется использовать Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии компенсированного и декомпенсированного цирроза печени, включающий исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+. Для прогнозирования перехода стадии компенсированного цирроза в стадию декомпенсированного цирроза печени у больных ХГС рекомендуется исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD3-CD25+ субпопуляции В-лимфоцитов, CD3-CD8+ NК-клеток, IgА, IgG, ЦИК всех типов, TNF-, IFN-, IL-10.
5. Первичное иммунологическое обследование больных ХГС рекомендуется проводить по расширенному варианту обследования. В целях установления доминирующего типа иммунного ответа у таких больных, достаточно использования сокращенного варианта иммунологического обследования.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Жданов К.В. Некоторые клинико-иммунологические изменения у бессимптомных носителей вирусов гепатитов В и С / К.В. Жданов, О.И. Кошиль, Ю.В. Лобзин, С.Л. Мукомолов, К.Д. Жоголев, В.Ю. Никитин // Новые направления в гепатологии: Тез. Фальк симп. №92. - СПб., 1996. - С.202.
- обзин Ю.В. Некоторые клинико-лабораторные и морфологические изменения у бессимптомных носителей вирусов гепатитов В и С/ Ю.В. Лобзин, К.В. Жданов, С.Л. Мукомолов, О.И. Кошиль, К.Д. Жоголев, С.С. Бацков, В.С. Чирский, В.Ю. Никитин, Н.В. Бельгесов, П.П. Коршунов // Инфектология. Достижения и перспективы: Тез. докл. юбил. науч. конф., посвящ. 100-летию первой в России кафедры инфекционных болезней. - СПб., 1996. ЦС.81-82.
- Жданов К.В. Маркеры активной вирусной репликации у больных со скрыто протекающими формами вирусных гепатитов В и С / К.В. Жданов, Ю.В. Лобзин, С.Л. Мукомолов, О.И. Кошиль, К.Д. Жоголев, С.С. Бацков, В.С. Чирский, В.Ю. Никитин, Н.В. Бельгесов, П.П. Коршунов // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1997. - Т.7, №5, Прилож.4. - С.145.
- Никитин В.Ю. Состояние системы иммунитета и интерфероновый статус у больных хроническими вирусными гепатитами В и С / В.Ю. Никитин, К.Д. Жоголев, К.В. Жданов, Е.Г. Богданова // Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика: Материалы науч. конф. с междунар. участием. - СПб., 1999. - С.90.
- Новик А.А. Состояние иммунной системы у больных хроническими вирусными гепатитами В и С / А.А. Новик, В.Н. Цыган, В.Ю. Никитин, К.Д. Жоголев, К.В. Жданов, Н.Х. Дулатова // Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней: Тез. докл. науч. конф. - СПб., 1999. - С.214-216.
- Цыган В.Н. Оценка иммунного статуса у больных хроническими гепатитами В и С / В.Н. Цыган, В.Ю. Никитин, К.Д. Жоголев, К.В. Жданов, Н.Х. Дулатова // Russian J. Immunol. - 1999. - Vol.4, Suppl.1. - P.160.
- Цыган В.Н. Клинико-иммунологическая характеристика больных хроническими вирусными гепатитами В и С / В.Н. Цыган, В.Ю. Никитин, К.В. Жданов, К.Д. Жоголев, И.А. Сухина // Мед. иммунология. - 2000. - Т.2, №2. - С.202.
- Никитин В.Ю. Изучение особенностей иммунопатогенеза латентных форм хронических вирусных гепатитов В и С / В.Ю. Никитин, К.В. Жданов, И.А. Сухина // Мед. иммунология. - 2001. - Т.3, №2. - С.229-230.
- Никитин В.Ю. Изучение клинико-иммунологических особенностей латентных форм хронических вирусных гепатитов В и С / В.Ю. Никитин, К.В. Жданов, И.А. Сухина // Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении: Тез. докл. V Всерос. науч.-практ. конф. - СПб., 2001. - С.101.
- Никитин В.Ю. Динамическое наблюдение за течением инфекционного процесса при латентных формах вирусных гепатитов В и С / В.Ю. Никитин, К.В. Жданов, И.А. Сухина // Клинические перспективы в инфектологии: Тез. докл. Всерос. науч. конф., посвящ. 125-летию со рожд. проф. И.К. Розенберга и 105-летию кафедры инфекц. болезней Воен.-мед. акад. - СПб., 2001. - С.141-142.
- Новик А.А. Принципы проточной цитометрии в иммунологии и онкогематологии / А.А. Новик, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2001. - №2(6). - С.34-40.
- Жданов К.В. Латентные формы вирусных гепатитов В, С и D: диагностика, лечение и профилактика: Методические рекомендации / К.В. Жданов, О.И. Кошиль, Ю.В. Лобзин, В.Ю. Никитин, П.И. Огарков, В.А. Ратников, В.С. Чирский. - М.: ГВМУ МО РФ, 2002. - 47с.
- Жданов К.В. Иммунологическая характеристика хронического гепатита С у лиц молодого возраста / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, Д.М. Шахманов, В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, М.В. Яременко // Проблема инфекции в клинической медицине: Тез. докл. науч. конф. и VIII съезда Итало-Рос. об-ва по инфекц. болезням. - СПб., 2002. - С.113.
- Никитин В.Ю. Особенности гуморального ответа и состояния системы комплемента у больных хроническим гепатитом С / В.Ю. Никитин, К.В. Жданов, И.А. Сухина // Мед. иммунология. - 2002. - Т.4, №2. - С.247.
- Никитин В.Ю. Уровень иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента в сыворотке крови при хронической HCV-инфекции / В.Ю. Никитин, К.В. Жданов, И.А. Сухина, В.Н. Цыган // Военно-профилактическая медицина. Проблемы и перспективы: Тр. I съезда воен. врачей мед.-профилакт. профиля. - СПб., 2002. - С.278.
- Никитин В.Ю. Изучение маркеров активации лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, К.В. Жданов, Д.А. Гусев, В.Н. Цыган, Д.М. Шахманов // Проблема инфекции в клинической медицине: Тез. докл. науч. конф. и VIII съезда Итало-Рос. об-ва по инфекц. болезням. - СПб., 2002. - С.228-229.
- Новик А.А. Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов: Методические рекомендации / А.А. Новик, В.Н. Цыган, В.Ю. Никитин, Е.Д. Соколова, К.В. Жданов, П.И. Огарков, Ю.В. Лобзин, К.Д. Жоголев, В.В. Малышев, В.С. Токмаков, И.А. Сухина. - М.: ГВМУ МО РФ, 2002. - 78с.
- Жданов К.В. Состояние иммунной системы при хроническом гепатите С / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, Д.М. Шахманов// Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. V Рос. науч.-практ. конф. - М., 2003. - С.99-100.
- Никитин В.Ю. Экспрессия активационных маркеров лимфоцитов у больных хроническим гепатитом С / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, Д.А. Гусев, К.В. Жданов, В.Н. Цыган // Мед. иммунология. - 2003. - Т.5, №3/4. - С.311.
- Никитин В.Ю. Проточная цитометрия в диагностике заболеваний внутренних органов / В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган, А.Б. Смолянинов, Ю.Ю. Преснякова // Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении: Тез. докл. VI Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 300-летию Санкт-Петербурга и 205-летию Воен.-мед. акад. - СПб., 2003. - С.347-348.
- Никитин В.Ю. Изучение показателей Т-клеточного и В-клеточного звеньев иммунитета у больных с хроническим гепатитом С / В.Ю. Никитин, К.В. Жданов, Д.А. Гусев, И.А. Сухина, В.Н. Цыган // TERRA MEDICA. Лаб. диагностика. - 2004, №1. - С. 14-16.
- Никитин В.Ю. Состояние иммунной системы больных ХГС в зависимости от степени фиброза / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, Д.А. Гусев, К.В. Жданов, В.Н. Цыган // Мед. иммунология. - 2004. - Т.6, №3-5. - С.322.
- Никитин В.Ю. Иммунитет у больных с латентной формой хронического гепатита С в I и II стадии заболевания / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, К.В. Жданов, Д.А. Гусев, В.Н. Цыган // Клинико-лабораторный консилиум. - 2004. - №5. - С.43-46.
- Никитин В.Ю. Противовирусный иммунитет при гепатите С. Предпосылки для фармакологической коррекции нарушений / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, В.Н. Цыган // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2004. - Т.3, №1. - С.34-55.
- обзин Ю.В. Иммунный статус больных хроническим гепатитом С со слабовыраженным и умеренным фиброзом / Ю.В. Лобзин, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган, И.А. Сухина, К.В. Жданов, Д.А. Гусев // Мед. акад. журн. - 2005. - Т.5, №3. - С.68-73.
- Никитин В.Ю. Состояние иммунной системы больных хроническим гепатитом С в зависимости от генотипа вируса / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, Д.А. Гусев, К.В. Жданов, В.Н. Цыган // Мед. иммунология. - 2005. - Т.7, №2-3. - С.167-168.
- Никитин В.Ю. Изучение поверхностных активационных маркеров Т-лимфоцитов у больных ХГС с различной степенью фиброза / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, В.Н. Цыган // Мед. иммунология. - 2006. - Т.8, №2-3. - С.278.
- Жданов К.В. Клинико-иммунологические, вирусологические и морфологические взаимосвязи при хроническом гепатите С / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, В.С. Чирский, В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, Д.М. Шахманов // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2007. - №2(18). - С.78-82.
- обзин Ю.В. Иммунопатогенез вирусного гепатита С. Иммунологические маркеры прогрессирования заболевания / Ю.В. Лобзин, В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, В.Н. Цыган, Ю.А. Митин // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - №6. - С.75-84.
- Никитин В.Ю. Маркеры активации на Т-хелперах и цитотоксических Т-лимфоцитах на различных стадиях хронического вирусного гепатита С / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, В.Н. Цыган, Д.А. Гусев, К.В. Жданов // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2007. - №1(17). - С.65-71.
- Никитин В.Ю. Спектр цитокинов в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С на различных стадиях заболевания / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, В.Н. Цыган, Д.А. Гусев, Д.М. Шахманов, Е.А. Малахова // Мед. иммунология. - 2007. - Т.9, №2-3. - С.236-237.
- Сухина И.А. NK и NKT клетки как иммунологические маркеры прогрессирования хронического гепатита С / И.А. Сухина, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган, Д.А. Гусев, Д.М. Шахманов, И.В. Ширина // Мед. иммунология. - 2007. - Т.9, №2-3. - С.247-249.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине