Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
ЧЕРЕВКО НАТАЛЬЯ АНАТОЛЬЕВНА
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕАКТИВАЦИИ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ И ЕЕ СВЯЗЬ С АЛЛЕРГОПАТОЛОГИЕЙ
14.03.03 - патологическая физиология 14.03.09 - аллергология и иммунология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Томск - 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ Новицкий Вячеслав Викторович доктор медицинских наук, профессор Климов Владимир Васильевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Уразова Ольга Ивановна доктор медицинских наук Федоренко Ольга Юрьевна доктор медицинских наук, профессор Долгих Татьяна Николаевна
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный медико-стоматологический университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита диссертации состоится л___ __________2012 г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Автореферат разослан л___ __________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Амосова Е.Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Проблема инфекций, вызванных вирусами простого герпеса типов 1 и 2 (ВПГ1, ВПГ2), не теряет своей актуальности, несмотря на многочисленные исследования в области вирусологии в последние 10 лет. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), смертность, обусловленная вирусами герпеса (15,8%), занимает второе место после гриппа (35,8%), перинатальная смертность составляет 10%, инфицированность новорожденных во время родов - 0,03%. Механизм латентной вирусной инфекции, а также механизмы, лежащие в основе реактивации ВПГ, неизвестны. Применяемые методы лечения рецидивирующих форм герпетических инфекций (ГИ) дают временные ремиссии, профилактика и прогнозы развития инфекции противоречивы. Это определяет не только медицинскую, но и социальную значимость проблемы.
Одним из актуальных вопросов, связанных с инфекциями, обусловленными ВПГ, является его эпидемиология. К сожалению, в России (в том числе и в Сибирском регионе) не проводился массовый скрининг по оценкам носительства герпесвирусов и клинических форм ГИ у населения, как и анализ влияния персистирующего вирусного носительства на популяционный иммунитет жителей Сибири. Это подтверждается данными глобального клиникоэпидемиологического исследования IHMF (International Herpes Management Forum), в котором нет информации по России, что объясняется отсутствием учёта заболеваемости герпетической инфекцией и носительства вируса [Malkin et al., 2004; Халдин А.А., Баскакова Д.В., 2007]. Эпидемиологическая оценка в работах в основном имеет вводный или описательный характер для решения иных задач и основывается на данных годовых медицинских статистических отчётов, как известно, фиксирующих только частоту обращаемости по установленным нозологиям.
Вследствие тесной связи герпетических инфекций, выражающейся в пожизненной вирусной персистенции, с иммунитетом хозяина, вирус может служить своеобразным маркером иммунных нарушений как у отдельно взятого человека, так и в популяции в целом. Если учесть, что в последнее время наблюдается неуклонный рост как иммунных нарушений у населения, так и распространенности ГИ, то с этих позиций становится очевидной необходимость дальнейшего изучения ГИ в качестве своеобразного показателя частоты иммунодефицитных состояний и его влияния на популяционный иммунитет населения. С другой стороны, взаимоотношения между ГИ и иммунной системой хозяина могут представляться неким симбиозом, что требует детального изучения и понимания. Возможно, что в результате нарушения выстроенного симбиоза формируются клинические эпизодическое и рецидивирующее течение ГИ. В настоящее время накоплены результаты научных исследований о том, что некоторые хронические персистирующие вирусные инфекции вызывают поляризацию иммунного ответа по Th2пути с высоким уровнем продукции интерлейкина (IL) 4, IL5, IL13 и иммуноглобулина (Ig) E [Наследникова И.О. и др., 2005; Рязанцева Н.В. и др., 2006]. Возможно, это связано с адаптацией вируса к условиям, в которых ему невыгодны активный клеточный интерферонопосредованный иммунный ответ и реакции естественного иммунитета, вследствие чего вирус может быть распознанным натуральными киллерами (NK) и цитотоксическими Тлимфоцитами. Следовательно, инфекционные и аллергические болезни развиваются на основе перекрывающихся иммунологических механизмов. С иммунологической точки зрения имеются достаточные основания для объяснения связи между ГИ и аллергическими болезнями [Maizels, Yazdanbakhsh, 2003]. Формирование аллергической патологии непосредственно определяется повышенной активностью цитокинов, секретируемых Th2-лимфоцитами, под влиянием которых образуется ключевой субстрат аллергических реакций - IgE. Для хозяина - это моделирование активного гуморального иммунного ответа на антигены с вероятным риском развития аллергической сенсибилизации. Согласно данным эпидемиологических исследований, в последние десятилетия наблюдается значительный рост частоты аллергических заболеваний [Yazdanbakhsh, Matrikardi, 2004]. Вместе с тем, существующие в настоящее время сведения об иммунных механизмах моделирования риска развития аллергических болезней у лиц с хроническими вирусными инфекциями (в частности ГИ) недостаточны и требуют глубокого изучения их молекулярных основ.
Пристального внимания заслуживает факт вовлеченности одних и тех же генов в этиологию и патогенез как инфекционных, так и аллергических болезней. Характер и степень модифицирующего влияния ГИ на иммунную систему хозяина зависят от конкретных условий, в том числе генетических особенностей индивидуума. Работы, посвященные оценке роли полиморфизма генов-модификаторов продукции основных цитокинов иммунного ответа при ГИ, разнонаправлены и не учитывают латентного периода ГИ. В связи с этим анализ однонуклеотидных полиморфизмов генов-модификаторов иммунного ответа может быть высоко информативным при решении вопроса о механизмах моделирования риска аллергической заболеваемости у лиц с разными типами клинических проявлений ГИ.
Исследование полиморфизма генов внутриклеточных сигнальных молекул регуляторных цитокинов представляется важным и перспективным для понимания развития и прогноза аллергической заболеваемости в условиях массовой инфицированности герпесвирусами, механизмов реактивации ГИ, новых подходов к терапии и профилактике рецидивирующего характера инфекции у населения. Используемые методы диагностики, прогноза течения и терапии ГИ, включая часто необоснованное применение комбинаций противовирусной терапии и отечественных иммуномодулирующих препаратов, не могут на современном этапе решить ни одной из перечисленных выше задач.
Цель работы: охарактеризовать иммунологические механизмы реактивации герпетической инфекции и ее связь с аллергопатологией.
Задачи исследования:
1. Оценить роль инфекции, вызванной вирусами герпеса типов 1 и 2, в развитии аллергопатологии.
2. Оценить взаимосвязь аллергической сенсибилизации и продукции IgE и IL4 с характером течения герпетической инфекции.
3. Исследовать особенности продукции IFN, IFN, функциональной активности NK-клеток и Т-лимфоцитов в периоды обострения и клинической ремиссии герпетической инфекции у пациентов с рецидивирующим течением герпеса и бронхиальной астмой.
4. Исследовать патогенетическую гетерогенность иммунных ответов у пациентов с разными вариантами течения герпетической инфекции и аллергической сенсибилизацией.
5. Оценить взаимосвязь аллельного полиморфизма генов TBX21, TLR9, IL12B, IFNG, IL4, IL4RA c характером течения герпетической инфекции и бронхиальной астмой.
6. Проанализировать ассоциацию полиморфных вариантов генов IFNG, IL4, IL4RA c наличием аллергической сенсибилизации у лиц с рецидивирующим течением герпетической инфекции.
7. Выделить патогенетически обоснованные иммунологические критерии для оценки эффективности противовирусной терапии у пациентов с рецидивирующим течением герпетической инфекции.
8. Дать патогенетическое обоснование для назначения комбинированной аллергенспецифической терапии у пациентов с аллергическим ринитом и бронхиальной астмой, ассоциированными с герпетической инфекцией.
Научная новизна. Показано, что у пациентов с бронхиальной астмой частота инфицированности ВПГ1 составляет 100%, что позволяет рассматривать ГИ как один из вероятных этиологических факторов аллергопатологии. У 31% пациентов с бронхиальной астмой ГИ протекает в рецидивирующей, у 42% - в эпизодической форме. Независимо от клинического течения ГИ (включая латентное течение инфекционного процесса) выявлен высокий уровень специфического IgG к ВПГ1, -2 в крови у обследованных лиц в возрасте 46Ц60 лет и гетерогенные его показатели у пациентов в возрасте 18Ц45 лет. Установлено, что у 61% обследованных имеет место реактивация (из них у 18,5% - рецидивирующая форма) ГИ, у 39% - латентное течение инфекции.
Впервые проведен анализ выраженности аллергической сенсибилизации к неинфекционным аллергенам в зависимости от клинического течения ГИ. Установлено, что общий показатель аллергической сенсибилизации к неинфекционным аллергенам составляет 74%, включая лиц с диагностированными аллергическими заболеваниями, из них у 49% положительная аллергическая сенсибилизация к неинфекционным аллергенам обнаружена впервые.
Обоснована высокая частота встречаемости поливалентной аллергической сенсибилизации у лиц с рецидивирующим течением ГИ. Выявлена корреляция содержания IgE и IL4 в сыворотке крови с титром специфических антител к ВПГ1 в период эпизодической реактивации ГИ. Показана высокая частота манифестных форм ГИ у лиц с положительной латентной аллергической сенсибилизацией.
Установлены особенности продукции интерферонов IFN, IFN и цитотоксической активности NK-лимфоцитов в периоды обострения и ремиссии рецидивирующей ГИ у пациентов без аллергической сенсибилизации и с бронхиальной астмой. Впервые с помощью сравнительного анализа уровня регуляторных цитокинов TNF, IFN, IL4 и соотношения IFN/IL4, оценки пролиферативной активности Т-лимфоцитов у обследованных лиц выделены критерии реактивации ГИ.
Выделены дифференциальные типы индуцированного вирусным антигеном иммунного ответа, позволяющие прогнозировать течение ГИ и обосновать адресную терапию для пациентов с рецидивирующей формой инфекции. Для больных с бронхиальной астмой предложены критерии контроля реабилитации интерферонопродукции и функциональной активности NK-клеток в ранний пост- и межрецидивный период ГИ.
Впервые установлена связь полиморфизма генов цитокинов IFNG, IL4, IL12B, рецепторов TLR9, IL4RA и транскрипционного фактора TBX21 у обследованных лиц, имеющих серопозитивные титры специфических антител к ВПГ, с рецидивирующим течением ГИ.
Обоснованы ассоциации полиморфизма генов IL4, IL4RA у пациентов с ГИ с формированием аллергического статуса (аллергической сенсибилизации).
Дано патогенетическое обоснование индуцированного контроля интерферонопродукции и титра специфических антител к вирусу герпеса при проведении аллергенспецифической терапии для повышения ее эффективности у пациентов с аллергическим ринитом и бронхиальной астмой с манифестным течением ГИ.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования, их анализ и выводы расширяют имеющиеся представления о патогенетических механизмах формирования, реактивации и особенностях течения ГИ, адекватности терапии. Выявлены достоверные дифференциально-диагностические критерии, позволяющие повысить качество диагностики, адекватность и эффективность проводимого патогенетически обоснованного лечения ГИ и аллергических заболеваний, сочетанных с ГИ. На основе полученных результатов разработана модифицированная схема лечения, которая может быть рекомендована для широкого применения у пациентов, имеющих сочетание аллергии с ГИ.
Теоретические и практические положения, разработанные в диссертационном исследовании, внедрены в научно-педагогическую деятельность кафедр патофизиологии и иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, в практическую деятельность врачей общей врачебной практики и узких специалистов поликлиник Медицинского объединения Центр семейной медицины (г. Томск), МЛПУ Межвузовская больница (г. Томск).
Положения, выносимые на защиту:
1. Инфицированность вирусами простого герпеса типов 1 и 2 способствует формированию аллергической сенсибилизации к неинфекционным антигенам (преимущественно к бытовым и пыльцевым аллергенам). У 61% обследованных лиц герпетическая инфекция протекает в реактивной форме, из них у 18,5% имеет рецидивирующий характер. Инфицированность ВПГ1 при бронхиальной астме составляет 100%. Рецидивирующее течение герпетической инфекции отмечается у 31% пациентов с бронхиальной астмой и в 22,9% случаев при положительной аллергосенсибилизации.
2. ВПГ1, -2 инициирует Тh2-зависимое воспаление за счет повышенного синтеза специфических антител к герпесвирусным антигенам, IgE, продукции IL4 как в условиях латентного течения, так и при клинической манифестации герпетической инфекции независимо от стажа заболевания.
3. Характер течения герпетической инфекции у лиц без аллергической сенсибилизации и пациентов с бронхиальной астмой ассоциирован с гетерогенными вариантами изменений количества и функциональной активности NK-клеток и Т-лимфоцитов, содержания IFN, IFN, IL4 и баланса IFN/IL4 как в сыворотке крови, так и в индуцированных тестах in vitro с вирусным антигеном. У пациентов, страдающих бронхиальной астмой, клиническая манифестация герпетической инфекции сопровождается достоверным повышением содержания интерферонов в сыворотке крови с динамическим его понижением в ранний восстановительный период на фоне повышения продукции IL4 и снижения функциональной активности NKлимфоцитов.
4. К рецидивам герпетической инфекции предрасполагает носительство генотипа T/С и аллеля С гена IFNG, генотипа T/T и аллеля Т гена TLR9, генотипа G/A и аллеля G гена TBX21, генотипа Т/С и аллеля Т гена IL4. Рецидивирующее течение герпетической инфекции у больных бронхиальной астмой ассоциировано с увеличением частоты встречаемости генотипа С/С и аллеля С гена IL12B, генотипа С/С и аллеля С гена IFNG, генотипа Т/T и аллеля Т гена IL4, генотипа I/I и аллеля I гена IL4RA по сравнению с таковой у лиц с латентным течением инфекции.
5. Риск формирования аллергической сенсибилизации у пациентов с эпизодической реактивацией и рецидивирующим течением герпетической инфекции ассоциирован с модулирующим влиянием полиморфных вариантов генов IL4 (T/Т) и IL4RA (V/V) на продукцию IgE.
6. Динамика индуцированной продукции IFN, IL4 и пролиферации Т-лимфоцитов in vitro в тестах с вирусным антигеном являются доступными клинико-лабораторными критериями эффективности и прогноза противовирусной и иммуномодулирующей терапии.
7. Критериями для назначения комбинированной аллергенспецифической иммунотерапии у пациентов с аллергическими заболеваниями (аллергический ринит, бронхиальная астма) с эпизодической реактивацией и рецидивирующим течением герпетической инфекции являются снижение содержания IFN в мукозальном секрете и повышение титров специфических антител к ВПГ1 в крови на фоне стандартных схем получения доз лечебного (причинного) аллергена.
Апробация и реализация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной конференции Иммунотерапия: от теории к практике (Москва, 2005); Российской научной конференции с международным участием Дни иммунологии в Томске (Томск, 2008); I Международной конференции Проблемы диагностики, лечения и профилактики герпесвирусных инфекций (Москва, 2008); Областной научнопрактической конференции Вопросы эпидемиологии, клиники, лечения и профилактики вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекций (Томск, 2008); Областной конференции Новые подходы к терапии герпесвирусной инфекции (Томск, 2009); Городской научно-практической конференции Обоснованность длительных курсов противовирусной терапии у пациентов с рецидивирующими формами герпетической инфекции (Томск, 2009); Всероссийской научной конференции Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии (Новосибирск, 2010); Областной научно-практической конференции Современные подходы к лечению аллергических заболеваний (Томск, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 23 научные работы, в том числе 14 в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент на изобретение №2383009.12.2008 г. Опубликована 1 монография.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 226 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы Материал и методы, из трех глав собственных результатов и их обсуждения и заключения. Список литературы содержит 288 наименований, в том числе 132 - отечественные и 156 - зарубежные источники.
Работа иллюстрирована 20 рисунками, включает 22 таблицы.
ичный вклад автора в проведенное исследование. Планирование и реализация исследований, набор клинического материала, курсы иммунотерапии, значительная часть представленных лабораторных исследований проведены и интерпретированы лично автором.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В основу работы положены результаты клинико-лабораторного обследования 1843 жителей г. Томска (837 мужчин и 1006 женщин в возрасте от 18 до 60 лет) в период с 2003 по 2009 г. Все волонтеры предварительно давали письменное согласие на участие в проводимом исследовании, которое было разработано биоэтическим комитетом ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России согласно Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека с поправками 2000 г. и Правилам клинической практики в Российской Федерации, утвержденным Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266. Обследование и анкетирование участников проводили на базе поликлиник Медицинского объединения Центр семейной медицины (г. Томск), отделения иммунологии и аллергологии МЛПУ Межвузовская больница.
Группу добровольцев с аллергическими заболеваниями составили 220 пациентов (1женщины и 88 мужчин) в возрасте от 18 до 50 лет, состоящих на учете с подтвержденным диагнозом бронхиальная астма средней степени тяжести (n = 100), круглогодичный аллергический ринит (КАР) (n = 40), сезонный аллергический ринит (САР) (n = 42), и сезонный аллергический ринит, сочетанный с бронхиальной астмой (БА) (n = 38). Клиническая картина заболеваний во всех случаях характеризовалась средней степенью тяжести, управляемым течением, пациенты получали постоянно базисную терапию согласно медицинским стандартам, не имели обострений БА в течение предшествующих 4 нед до обследования.
Стаж аллергического заболевания у пациентов составлял от 12 мес до 24 лет, стаж клинических проявлений герпетической инфекции - от 3 до 15 лет. У всех пациентов была подтверждена поливалентная сенсибилизация к нескольким аллергенам из разных групп. Диагностика бронхиальной астмы проведена в соответствии с программой GINA (Global Initiative for Asthma, 2005Ц2006), аллергического ринита - с программой ARIA (Allergic Rhinitis and Impact on Asthma, 2005Ц2006).
Группа пациентов, получавших комбинированную терапию имунофаном и ацикловиром состояла из 82 человек (49 женщин и 33 мужчины) в возрасте от 18 до 45 лет. 40 больных имели диагноз БА с сопутствующей рецидивирующей формой ГИ, 42 пациента - диагноз ГИ, рецидивирующее течение, назолабиальная локализация (без отягощенного аллергоанамнеза).
С первого дня очередного обострения герпетической инфекции пациентам назначался: ацикловир (1,6 г/сут, таблетки, 10 дней ежедневно) и имунофан (инъекции в/м 1,0 мл ежедневно №5, затем через день №5.). Имунофан - иммунорегуляторный пептид, представляет собой синтетическое производное гормона тимопоэтина (аргинил-a-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин).
Главными мишенями являются Т-лимфоциты, влияет на пролиферацию и дифференцировку Тклеток путем усиления продукции ими IL2 и его рецепции чувствительными клетками. Контрольные измерения клеточных показателей и уровня интерферонов проводили в 1Ц2-й день клинических проявлений, повторно через 15 дней после начала лечения (клиническая ремиссия инфекционного процесса), затем через 30 дней от начала обострения.
Группа обследованных, получавших терапию трансфер-фактором, состояла из 62 человек (37 женщин и 25 мужчин) в возрасте 18Ц45 лет с диагнозом ГИ, рецидивирующее течение, назолабиальная и генитальная локализация (без отягощенного аллергоанамнеза).
Трансфер-фактор (лFor life research, США) - известный фактор, регулирующий экспрессию HLA 1 и HLA 2 антигенпрезентирующих дендритных клеток, стимулятор активности клеток с цитотоксическим потенциалом (CD8+, CD16+) и индуктор интерферонов. Рекомендован для лечения пациентов с герпетическими инфекциями. Все пациенты получали трансфер-фактор в суточной рекомендуемой дозе курсом 14 дней в периоде клинической ремиссии ГИ. Контроль показателей после курса терапии проводили на 15Ц16-й день.
Группа обследованных в возрасте 22Ц45 лет, получавших аллерген специфическую терапию (АСИТ) состояла из 40 пациентов с КАР, 42 больных с САР, 38 пациентов с БА+САР.
Из них у 52 человек была диагностирована сопутствующая ГИ, эпизодическое течение, и у пациентов - ГИ, рецидивирующее течение (назолабиальная, генитальная форма).
Все волонтеры были подвергнуты клиническому осмотру врача, паразитологическому (копровоскопия) и аллергологическому обследованию (кожное аллерготестирование с бытовыми, эпидермальными, пыльцевыми и пищевыми аллергенами производства ОАО Биомед им. И.И. Мечникова (г. Москва)), иммунологическому обследованию, исследованию титров специфических антител к основным герпесвирусам.
Критериями исключения волонтеров из дальнейшего участия в исследовании были положительные результаты обследования на НbsАg, ПЦР положительные тесты крови на ВПГ1, -2, паразитарные инфекции, наличие позитивных результатов онкомаркеров, острых инфекционных и неинфекционных заболеваний, обострение хронических неинфекционных заболеваний, не связанных с ВПГ1, -2, аутоиммунные заболевания, прием любых лекарственных средств, за исключением базисной терапии БА (серетид / симбикорт, фликсотид) и для АР - назонекс, фликсоназе, назарел.
Материалом для исследования служила кровь, взятая натощак в одинаковых условиях процедурного кабинета, в утренние часы, а также мукозальный секрет, надосадочная культуральная жидкость индуцированных лимфоцитов ФГА и вирусным антигеном (АГ). Материалом для генетического исследования являлась ДНК, выделенная из ядросодержащих клеток венозной крови методом осаждения ДНК на сорбенте (набор ДНК-сорб-АМ, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (г. Москва)).
Заполнение индивидуальной регистрационной / информационной карты проводилось врачом-исследователем во время визита добровольца с учетом результатов клинического, паразитологического, аллергологического и иммунологического исследований.
Дизайн работы - ретроспективное эпидемиологическое рандомизированное клиническое сравнительное исследование в группах.
Выполнение кожных аллерготестов in vivo. Процедура проведения кожных аллергопроб соответствовала стандартам ВОЗ. Аллергопробы выполняли на коже внутренней поверхности предплечья. Были использованы диагностические аллергены пищевой, бытовой, пыльцевой и эпидермальной групп производства ОАО Биомед им. И.И. Мечникова. Местную реакцию на аллерген оценивали через 20 мин. В зависимости от наличия или отсутствия сенсибилизации к неинфекционным антигенам были выделены подгруппы сравнения: с отрицательными кожными аллергопробами (КАП); с положительными КАП.
Определение концентрации цитокинов IL4, IFN, IFN TNF в сыворотке крови, в мукозальном секрете, в супернатанте индуцированных лимфоцитов проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), тест-системы ЗАО Вектор-Бест (г. Новосибирск). Для определения содержания IFN использовали набор реактивов ООО Протеиновый контур (г. Санкт-Петербург). Концентрацию цитокинов вычисляли по калибровочным кривым, а в мукозальном секрете - методом перерасчета с учетом общего белка, определяемого микробиуретовым методом.
Определение количества NK-лимфоцитов. Для определения количества натуральных киллерных клеток (CD16+-лимфоцитов) использовали МАТ ЛНК-16 фирмы Сорбент (г. Москва). Результаты цитотоксического теста учитывали в препарате раздавленная капля.
Определение функциональной активности. Метод основан на способности NK-клеток разрушать эритроциты кур без предварительной сенсибилизации при их совместном инкубировании [Гордиенко С.П., 1983]. Учет производили методом люминесцентной микроскопии, светофильтр ФС-1-1.
Определение количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови выполняли пробирочным методом [Меньшикова В.В., 1987].
Определение пролиферативной активности Т-лимфоцитов периферической крови в реакции бласттрансформации. Контроль трансформирования лимфоцитов в бласты проводили через 72Ц96 ч после контакта с антигеном или митогеном (ФГА). Для стимуляции секреторных способностей лимфоцитов вносили ФГА (лDifco, Германия) в концентрации 0,01 мг/мл культуры, параллельно в другую часть проб 0,01 мг/мл герпетической культуральной инактивированной вакцины штаммы ВПГ 1 и 2 типов (г. Санкт-Петербург). Результат реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) выражали в процентах.
Определение количества IgЕ. Количественное определение IgЕ проводили методом ИФА набором IgЕ общий - ИФА-Бест (ЗАО Вектор-Бест, г. Новосибирск).
Определение количества IgM и IgG к вирусу простого герпеса. Количественное определение IgM, IgG и авидности IgG к ВПГ1 и -2 проводили методом ИФА наборами ВектоВПГ - IgМ - стрип, ВектоВПГ - IgG-1 - стрип и ВектоВПГ - IgG-2 - стрип (ЗАО ВекторБест, г. Новосибирск).
Анализ полиморфных вариантов генов цитокинов. Были исследованы полиморфные варианты генов IFNG (rs 2069705), IL4Ra (rs 1805010), IL4(rs 2070874), IL12RB1 (rs 11575934), IL12B (rs 3212227), TBX21 (rs 11652969), TLR9 -1237T/C (rs 5743836). Полиморфные варианты генов выбирали с помощью базы данных ( Последовательность праймеров подбирали с помощью программы Vector NTI AdvanceЩ Software (GatewayЩ).
Для генотипирования использовали рестрикционный анализ продуктов амплификации специфических участков генов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Статистическая обработка результатов. Результаты представлены в виде М m, где М - среднее арифметическое значение, m - ошибка среднеквадратичного отклонения, или в виде Me (Q1ЦQ3), где Me - медиана, (Q1ЦQ3) - процентили (нижний и верхний квартиль), и обработаны в программе SPSS for Windows Ver 11.5. Сравнение частот встречаемости признаков и попарное сравнение групп проводили с использованием критерия 2 Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность и (или) точный тест Фишера. Сравнение количества IgE в группах пациентов выполняли при помощи непараметрического критерия КраскалаЦУоллиса, попарное сравнение групп Цкритерия МаннаЦУитни с поправкой Бонферрони. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при p < 0,05. Дополнительно обработка результатов исследования проводилась с использованием критерия отношения шансов OR с расчетом для него 95%-го доверительного интервала (CI).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследования инфицированности вирусами простого герпеса населения города Томска У населения г. Томска было выявлено, что частота инфицированности ВПГ1 и ВПГпревышает средние значения показателей по России. Так, в 2003 г. среди 168 обследованных добровольцев у 86,3% были установлены положительные титры антител к ВПГ, в 2005 г. - у 93,0 % (из 320 человек), в 2006 г. - 93,3% (из 298 человек), в 2007 г. - 97,8% (из 318 пациентов), в 2008 г. - 97,1% (из 347 человек), в 2009 г. - у 97,1% больных (из 392 человек). При анализе встречаемости ВПГ1 и ВПГ2 выявлено, что к 2009 г. частота инфицированности ВПГ1 и ВПГ2 составила 97,08% и 38,68% соответственно (рис. 1). У обследованных обнаружены высокие (1 : 1600 - 1 : 12800) и низкие (1 : 200 - 1 : 800) значения IgG к ВПГ1, -2, включая обследованных с латентным течением ГИ или стадией динамического равновесия вирусЦиммунная система хозяина. Только у 3% лиц с латентным течением ГИ получены отрицательные значения, совпадающие с отсутствием клинических проявлений герпетической инфекции. Исследование частоты клинических проявлений ГИ у населения г. Томска показало, что у 39,0% обследованных имело место бессимптомное (латентное) течение, у 42,5% - эпизодическое течение, в 18,5% случаев отмечено рецидивирующее течение ГИ. Установленные титры специфических IgG к ВПГ1, -2 не зависели от частоты клинических проявлений инфекции. Более того, в группе латентного течения ГИ у 58% пациентов зарегистрированы высокие значения титров IgG к ВПГ1.
ВПГ 1,2 - отрицательно - 3% доля ВПГ 38,68% 38,68% ВПГ 1 - 97,08% Рис. 1. Уровень инфицированности вирусом простого герпеса 1 и 2 типов среди обследованных г. Томска в 2009 г Установленные в 64% случаев высокие специфические титры IgG к ВПГ1 (от 1 : 16и выше) у всех обследованных являются индикаторами ответов на ГИ, свидетелями активности репликации вируса и одновременно отражают активность Тh2-типа иммунного ответа (активного гуморального ответа). Установленные в 58,1% случаев высокие титры специфических антител IgG к ВПГ1 при латентном течении ГИ отражают активность иммунного ответа и подтверждают динамическую теорию взаимоотношения вируса и иммунной системы хозяина.
Выявление латентной сенсибилизации к неинфекционным аллергенам у лиц с разным клиническим течением герпетической инфекцией В последние десятилетия продолжается рост аллергических заболеваний (АЗ) во всех развитых странах. На этом фоне аллергологи отмечают факты скрытой или латентной сенсибилизации к неинфекционным аллергенам при наборе контроля соматически здоровых волонтеров в разных возрастных группах. На момент обследования эти лица не имели жалоб на аллергические проявления отягощенного наследственного анамнеза по АЗ, не обращались за помощью к врачам-аллергологам. С другой стороны, по нашему мнению, привлекательна роль инфекционных агентов и в частности медленных вирусных инфекций, способных изменять характер иммунного ответа в организме. Вместе с тем, гигиеническая гипотеза, широко обсуждаемая в настоящее время в научной литературе, подтверждает, что воздействие инфекционных агентов в раннем возрасте формирует индивидуальный устойчивый тип ответа иммунной системы, снижая риск развития АЗ.
Для оценки аллергической сенсибилизации у населения г. Томска к неинфекционным аллергенам были проанализированы результаты КАП и значения общего IgE, IL4 сыворотки крови у лиц с различными вариантами течения ГИ без диагностированных ранее в анамнезе АЗ (n = 381). Группой сравнения явились пациенты, состоящие на учете с подтвержденным диагнозом латопическая бронхиальная астма (легкой персистирующей и средней степени тяжести клинического течения, в периоде ремиссии, n = 100). У 74% обследованных выявлена положительная сенсибилизация к неинфекционным аллергенам, у 49% из них впервые диагностированы положительные результаты в тестах с аллергенами. У этих лиц клинические симптомы аллергии отсутствовали. Среди положительных результатов КАП преобладали аллергены бытовой и пыльцевой групп, лидировала поливалентная сенсибилизация в разных сочетаниях.
Для анализа клинических особенностей течения ГИ и результатов КАП у этих пациентов проведена дополнительная стратификация: были выделены ВГИ - А - лица с отрицательными результатами КАП и ВГИ + А - лица с установленной аллергосенсибилизацией (КАП положительные). Участники исследования, у которых получены положительные результаты КАП, демонстрировали достоверно высокое (p < 0,05) число случаев клинической манифестации и рецидивирующих форм ГИ (22,9%) по сравнению с лицами без аллергической сенсибилизации (11,5% рецидивирующих форм ГИ). У пациентов с БА в 73% случаев отмечены проявления клинических форм ГИ (рецидивирующих форм - 31%), при этом у всех обследованных выявлены положительные титры специфических IgG к ВПГ1, высокий уровень общего IgE и IL4, поливалентная аллергическая сенсибилизация (табл. 1, 2). Выраженность местной реакции сенсибилизации к неинфекционным аллергенам оценивали по 5-балльной шкале в соответствии с характером кожных проявлений в ответ на нанесение аллергена. Самая высокая степень выраженности сенсибилизации (1,42 балла) наблюдалась у лиц с рецидивирующим течением ГИ. У пациентов с латентным течением ГИ степень сенсибилизации к аллергенам составила 1,09 балла.
Таким образом, оценка аллергической сенсибилизация к неинфекционным аллергенам при различных формах проявлений ГИ является актуальной для понимания типа иммунного ответа в условиях доклинической репликации вируса, а также для пациентов с клинической манифестацией герпетического процесса.
В отсутствие аллергической сенсибилизации у пациентов установлена положительная корреляция между уровнем IgE и значениями IgG к ВПГ1, -2 при латентном течении ГИ (r = 0,46, p = 0,001 и r = 0,44, p = 0,005, соответственно) и между уровнем IgE и значениями IgG к ВПГ1 при эпизодическом течении ГИ (r = 0,43, p = 0,004). На основании анализа критерия отношения шансов OR установлено, что риск развития эпизодических форм течения ГИ связан с увеличением значений общего IgE, уровня IL4 в сыворотке крови.
Таблица Частота сочетания аллергической сенсибилизации у волонтеров с различным типом течения герпетической инфекции, % Характер клинического течения ВГИ - А ВГИ + А БА Латентное течение 51,9 39,6* 27,0* Эпизодическое течение 36,5 37,5 42,Рецидивирующее течение 11,5 22,9* 31,0* Примечание. ВГИ - лица с отрицательными (ЦА) и положительными (+А) кожными аллерготестами; БА - пациенты с атопической бронхиальной астмой * - p < 0,05 по сравнению с группой ВГИ - А Таблица Уровень продукции IgE и IL4 в исследуемых группах (Me(Q1ЦQ3)) Уровень IgE, КЕ/л Уровень IL4, пкг/мл Характер Волонтеры Волонтеры Волонтеры Волонтеры клинического с отрицатель- с положитель- с отрицатель- с положительтечения ГИ ными КАП ными КАП ными КАП ными КАП Латентное 49,18 38,52 6,течение (16,60Ц136,40) (14,30Ц177,10) (2,10Ц9,90) Эпизодическое 24,82 525,70 5,80 128,течение (11,80Ц77,80) (95,50Ц583,7)* (2,30Ц12,1) (20,30Ц250,00)* Рецидивирую- 70,05 103,0 щее течение (15,80Ц117,00) (40,90Ц584,40) * - p < 0,05 между группами При анализе клинических особенностей течения ГИ нами обнаружено, что от латентного к манифестному рецидивирующему течению увеличивается число пациентов с аллергической сенсибилизацией к неинфекционным аллергенам. Лица с положительной аллергической сенсибилизацией имеют более высокую частоту клинических проявлений ГИ, чем лица с отрицательной аллергосенсибилизацией. Самая высокая частота проявления клинических форм ГИ зарегистрирована в группе пациентов, страдающих БА. Таким образом, длительная персистенция вируса ВПГ1 и (или) -2 даже при латентной форме инфекции может являться причиной сенсибилизации к неинфекционным аллергенам, изменяя популяционный иммунитет современного населения г. Томска. В условиях эпизодической реактивации ГИ могут формироваться клинически выраженные аллергические реакции, с дальнейшей вероятностью развития аллергического, IgE-зависимого процесса. Таким образом, можно реально рассматривать участие ГИ в увеличении частоты аллергических заболеваний, в частности аллергического ринита, встречаемость которого колеблется от 25 до 60%, продолжая нарастать с учетом статистики последнего десятилетия XX в.
ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ И АЛЛЕРГОПАТОЛОГИИ Особенности противовирусного иммунитета при рецидивирующем течении герпетической инфекции Установлено, что в стадию обострения рецидивирующей ГИ у обследованных лиц независимо от наличия или отсутствия аллергической сенсибилизации имеет место однотипный алгоритм снижения количества и цитотоксической активности NK-лимфоцитов, без восстановления показателей в стадию клинической ремиссии ГИ до значений, зарегистрированных в группе с латентным течением ГИ (периода динамического равновесия инфекции и иммунной системы хозяина). У этих же пациентов выделены особенности интерферонового статуса:
в отсутствие аллергической сенсибилизации установлено, что концентрации IFN и IFN в крови повышались в острую стадию проявлений ГИ с дальнейшей динамикой снижения в стадию ремиссии до сравниваемых таковых значений при латентном течении ГИ. У лиц с аллергической сенсибилизацией после подъема значений интерферонов в период обострения (в фазу клинической ремиссии инфекции) имело место резкое снижение концентраций IFN ниже референсных значений (табл. 3).
У пациентов с однотипным клиническим течением герпетической инфекции были выделены особенности функциональной активности лимфоцитов в индуцированном ответе на вирусный АГ (табл. 4). У 46% обследованных обнаружено статистически значимое увеличение количества активных Т-лимфоцитов по сравнению со спонтанным вариантом (отнесены в 1-ю группу), у 54% больных показатели РБТЛ с антигеном достоверно не отличались от значений спонтанной активности Т-лимфоцитов (2-я группа). Различная активность лимфоцитов объясняется особенностями цитокиновой продукции, измеренной в супернатантах индуцированных клеток. У лиц с положительным ответом лимфоцитов была зарегистрирована высокая продукция IFN и IL4 в тесте с АГ по сравнению с таковыми значениями при латентном течении ГИ.
При этом у лиц с отсутствием активного ответа CD3+ лимфоцитов (2-я группа) высокие уровни IL4 наблюдались в тестах со специфическим АГ и с ФГА на фоне сниженной продукции IFN. Таким образом, индуцированный вирусным АГ иммунный ответ у 46% пациентов с положительным ответом лимфоцитов сохраняет резервные возможности продукции IFN, несмотря на клинически рецидивирующее течение. В 54% случаев при отсутствии положительного пролиферативного ответа лимфоцитов на вирусный АГ индуцируется иной тип иммунного ответа, связанный с активным высвобождением IL4 и снижением уровня IFN.
Таблица Показатели системы естественной цитотоксичности и концентрации интерферона в крови у лиц с рецидивирующим течением герпетической инфекции без и в сочетании с аллергическими заболеваниями (бронхиальной астмой) (М m) Рецидивирующее Рецидивирующее Латентное Показатель течение ГИ без АЗ течение ГИ с БА течение Обострение Ремиссия Обострение Ремиссия Лейкоциты, 109/л 5,7 0,2 5,9 0,9 5,5 0,7 5,8 0,7 5,6 1,Лимфоциты, 109/л 1,85 0,10 1,86 0,10 1,88 0,10 1,85 0,09 1,87 0,Натуральные 0,27 0,05 0,20 0,02* 0,25 0,02 0,20 0,03* 0,20 0,02* киллеры, 109/л Индекс цитотоксичности натуральных 38,5 3,3 27,6 3,2* 22,9 2,0*# 18,4 1,3* 18,9 1,7* киллеров, % Сывороточный IFN, 3,8 0,5 54,2 4,8* 3,4 0,9# 14,3 2,8* 3,6 0,9# пкг/мл Сывороточный IFN, 15,3 3,6 158,0 22,0* 19,0 1,2# 216,0 34,0* 7,0 1,5*# пкг/мл * - p < 0,05 по сравнению с группой латентного течения ГИ;
# Цp < 0,05 по сравнению с группой лиц с рецидивирующим течением ГИ в стадию обострения Таким образом, несмотря на то, что клинически течение герпетической инфекции у обследованных лиц оценивалось как рецидивирующее однотипное, была выявлена дифференциация показателей, у 54% лиц цитокиновый профиль соответствовал Th2-типу иммунного ответа.
При столь активном участии гуморального иммунного ответа на вирусный АГ у этих лиц сформирован риск развития аллергических и, возможно, аутоиммунных процессов. У пациентов с рецидивирующей ГИ в сочетании с аллергической сенсибилизацией (БА) пролиферативная активность T-лимфоцитов была снижена в индуцированном тесте с ФГА и не изменялась в индуцированном тесте с АГ (табл. 4). В то же время уровень IFN и продукция IL4 в тесте с АГ были достоверно выше, чем у лиц с латентным течением и с отсутствием аллергической сенсибилизации. При этом индуцированный АГ уровень IL4 определялся значениями десятикратно выше, чем прирост значений IFN. Таким образом, при рецидивирующем течении ГИ в сочетании с БА в период обострения инфекции выявлено повышение значений интерферонопродукции в крови с дальнейшим резким их снижением в период относительной клинической ремиссии. Отмечено, что в период ремиссии в индуцированном ответе на вирусный АГ in vitro определялась низкая продукция IFN на фоне высоких значений IFN, но с кратным превышением значений IL4 по сравнению с таковыми значениями у лиц без аллергии и с латентным течением (табл. 4).
В целом, оценивая изучаемые показателей при рецидивирующей герпетической инфекции без аллергической сенсибилизации, у 54% пациентов была зафиксирована однотипность цитокиновых изменений в индуцированном ответе на вирусный антиген, соответствующая показателям, полученным у пациентов с БА, т.е. соответствующая сформированному Th2-типу иммунного ответа.
Таблица Спонтанная и индуцированная активность Т-лимфоцитов и продукция IFN, IFN, IL4 при латентном и рецидивирующем течении герпетической инфекции в период ремиссии (М m) Латентное течение Рецидивирующее Рецидивирующее течение герпетической инфекции Показатель герпетической течение герпетической Группа 1 (46%) Группа 2 (54%) инфекции инфекции с БА Спонтанная активность 8,0 2,0 9,5 3,0 7,3 2,1 6,0 2,CD3+-лимфоцитов, % АГ-стимулированная актив10,0 1,0 23,5 7,8* 8,9 2,6 16,0 7,ность CD3+-лимфоцитов, % Стимулированная ФГА актив80,0 4,5 72,0 2,5 65,6 13,6 60,0 8,5* ность CD3+-лимфоцитов, % Стимуляция ФГА 31,0 11,3 86,3 35,8* 88,6 35,4* 23,0 9,IFN, Стимуляция пг/мл 81,5 16,2 93,0 26,0 91,5 24,4 35,5 20,2* специфическим АГ Стимуляция ФГА 60,0 5,8 79,0 21,0 65,9 21,1 54,6 15,IFN, Стимуляция пг/мл 89,0 4,2 86,5 21,0 39,0 23,3* 119,6 28,4* специфическим АГ Стимуляция ФГА 9,8 0,7 11,7 0,8 48,3 14,7* 18,9 13,9* IL4, Стимуляция пг/мл 12,2 1,8 21,7 2,4* 52,0 4,8* 136,3 14,1* специфическим АГ * - p < 0,05 по сравнению с группой лиц с латентным течением ГИ Таблица Оценка цитокинового профиля у волонтеров с разными вариантами течения герпетической инфекции (M m) Латентное течение ГИ Эпизодическое течение ГИ Рецидивирующее течение ГИ Показатель Отрицательные Положительные Отрицательные Положительные Отрицательные Положительные КАП КАП КАП КАП КАП КАП сп 39,50 8,50 52,60 7,71* 37,80 5,09 25,33 3,25# 37,10 9,32 21,36 8,19# IFN, ФГА 34,50 4,35 25,00 4,91* 50,25 3,79* 279,25 80,63# 121,63 35,55* 546,0 152,90# пг/мл ст 89,00 4,16 63,50 1,32 406,50 51,97* 106,50 25,31# 334,25 117,85* 119,57 28,40# сп 7,65 0,25 9,60 0,87 8,53 0,38 20,64 3,04# 28,43 8,55* 18,49 2,39# IL-4, ФГА 8,10 0,30 8,60 0,72 9,78 0,39 23,25 4,49# 33,33 10,91* 20,24 2,39# пг/мл ст 12,20 0,79 10,40 0,23 105,50 11,11 149,76 12,40# 121,75 24,20* 136,63 74,10# сп 629,00 33,64 125,50 42,90* 397,00 164,25* 356,67 100,59# 97,33 31,76* 55,00 15,03# TNF, ФГА 383,00 67,66 114,00 34,39* 297,38 65,88 203,75 66,71# 350,67 142,79 81,75 22,пг/мл ст 236,50 6,99 127,50 48,19* 588,75 84,25*# 502,50 108,77# 565,33 192,75* 256,7 45,59# Коэффициент баланса 7,29 6,10 3,85 0,71 2,74 0,IFN/IL* - p < 0,05 по сравнению с группой латентного течения ГИ с КАПЦ, # - p < 0,05 по сравнению с группой латентного течения ГИ с КАП+ Цитокиновый профиль при различных типах клинического течения герпетической инфекции Проведено сравнительное исследование цитокинового профиля в индуцированных тестах с вирусным АГ и ФГА с учетом типа течения ГИ (латентное, эпизодическое, рецидивирующее). Пациенты были распределены в следующие группы:
Ц с эпизодическим течением ГИ с КАПЦ, - с эпизодическим течением ГИ с КАП+, - с рецидивирующим течением ГИ с КАПЦ, - с рецидивирующим течением ГИ и с КАП+ (у пациентов с БА).
Группы для сравнения показателей представляли волонтеры с отрицательным анамнезом по проявлениям ГИ и положительными значениями титров к ВПГ, с отрицательной или положительной аллергической сенсибилизацией (табл. 5). В результате оценки динамики уровней IFN и IL4 в клеточных супернатантах у лиц с латентным течением ГИ и положительной аллергической сенсибилизацией выявлено умеренное спонтанное повышение IFN, что, вероятно, связано с компенсаторным сдерживанием развития аллергических реакций. Индуцированный ответ на АГ характеризовался отсутствием динамики изменения IFN и IL4, а также статистическим значимым снижением значений TNF. (табл. 5). У лиц с эпизодическим течением ГИ и отрицательным аллергическим фоном в индуцированном тесте с АГ отмечался выраженный (в 1,5 раза по сравнению с исходным) подъем концентрации IFN и TNF. При этом наблюдалось незначительное нарастание продукции IL4, что, вероятно, отражает умеренное напряжение гуморального ответа, связанное с продукцией специфических АТ (IgG2, IgG4, IgE) к ВПГ1 (табл. 5). Таким образом, ответ на вирусный АГ у лиц с эпизодическими проявлениями ГИ при отсутствии аллергической сенсибилизации сопровождается цитокиновой продукцией, соответствующей Тh1-типу клеточного ответа.
У пациентов с эпизодическим течением ГИ с положительной аллергической сенсибилизацией обнаружены значительные изменения показателей. Установлены низкие уровни спонтанной продукции лимфоцитами IFN и TNF (табл. 5). В индуцированных тестах с АГ отмечены тенденция к незначительному подъему уровней IFN, умеренная позитивная динамика TNF на фоне резкого увеличения уровней IL4. Вероятно, на фоне эпизодического течения ГИ с положительной аллергической сенсибилизации имеется иной, отличный от Th1-типа, ответ на вирусный АГ: наибольший прирост продукции IL4 на фоне сниженных показателей TNF и IFN. Как известно, за счет снижения продукции IFN нарушается контроль за репликацией вирусов, активацией цитокинов Th2-типа. Таким образом, высокие показатели IL4 в индуцированных тестах с АГ и ФГА свидетельствуют об активации гуморального звена и синтеза антител - свидетелей ГИ IgG и IgЕ [Кривицкая В.З. и др., 2004; Львова И.И., Дерюшева А.В., 2005].
У этих лиц соотношение коэффициента баланса IFN/IL4 было статистически значимо снижено по сравнению с таковым при латентном течении ГИ (табл. 5). В нагрузочных тестах с АГ зарегистрировано достоверное увеличение уровня TNFa по сравнению с таковым при латентном течении ГИ. Это может свидетельствовать о том, что у лиц с эпизодическим течением ГИ формируются процессы усиленного несекреторного контроля за клетками, поврежденными вирусом [Babu R. et al., 2006; Симбирцев А.С., 2007].
Таким образом, полученные различные алгоритмы цитокинового профиля у пациентов с эпизодическим течением ГИ как с КАП+, так и с КАПЦ позволяют прогнозировать особенности развития как аллергического, так и инфекционного процесса, а также, очевидно, и особенности ответа на стандартную противовирусную терапию.
В группе лиц с рецидивирующим течением ГИ и отрицательной аллергической сенсибилизацией (КАПЦ) наблюдается снижение спонтанных значений TNF и повышение IL4 по сравнению с таковыми при латентном течении ГИ. Индуцированный тест с АГ сопровождался повышением IFN, TNF, но в большей степени повышением продукции IL4 относительно аналогичных показателей в группах сравнения. Коэффициент баланса IFN/IL4 у пациентов с рецидивирующим течением ГИ без аллергического фона составил 2,74 ед., который соответствовал значениям высвобождения цитокинов клеточного Th1-типа (табл. 5). У пациентов с рецидивирующим течением ГИ и БА были получены самые низкие индуцированные показатели, включая уровень TNF и соотношение баланса IFN/IL4, которое снижалось до 0,87 ед. Вероятно, это свидетельствует о пороговом интерфероновом дефиците и постоянном риске развития клинических проявлений ГИ у пациентов с реализованной аллергической сенсибилизацией. Необходимо напомнить, что количество клинически манифестированных форм герпетической инфекции (до 71%) было зарегистрировано у лиц этой группы (см. табл. 2). Таким образом, выявленные особенности продукции IL4 и IFN связаны с частотой клинических реактиваций герпетической инфекции, а особенности индуцированной продукции IFN и TNF - с тяжестью клинических проявлений.
Сходные результаты в группах с эпизодическим и рецидивирующим течением ГИ на фоне положительной сенсибилизации к неинфекционным аллергенам объясняют риски клинических рецидивов инфекции на фоне Th2-типа иммунного ответа, который сочетается с нарушением продукции интерферонов. Хроническое рецидивирующее и эпизодическое течение ГИ сопровождается статистически значимым повышением уровня IL4 даже в условиях отрицательных КАП, что определяет фактор риска по развитию аллергической сенсибилизации.
Как следует из полученных данных, уровень IL4 положительно коррелирует с частотой манифестации герпетической инфекции. IFN и TNF принадлежит критическая роль контроля за иммунологическими противовирусными механизмами репликации вируса, включая процессы апоптоза инфицированных вирусом клеток. Клиническая реактивация герпетической инфекции связана с развитием алгоритма иммунного ответа Th2-типа, который формирует в популяционном иммунитете повышение чувствительности к неинфекционным ксенобиотикам (аллергенам), провоцируя на первых этапах развитие клинически скрытой сенсибилизации, а в последующем - формирование аллергических заболеваний.
Особенности противовирусного иммунитета при герпетической инфекции, сочетанной с аллергическим ринитом и бронхиальной астмой Для изучения особенностей клинического течения ГИ, отягощенной аллергическими заболеваниями, были обследованы пациенты с АЗ: круглогодичным аллергическим ринитом (КАР) (n = 40), сезонным аллергическим ринитом (САР) (n = 42) и сочетанной аллергической бронхиальной астмой (БА и КАР, n = 38). У всех пациентов была выявлена поливалентная сенсибилизация к нескольким аллергенам из разных групп. Ведущей явилась бытовая (55%) и пыльцевая (45%) сенсибилизация. У обследованных лиц титры IgG к ВПГ1 колебались в диапазоне от 1 : 800 до 1 : 12800. Во всех трех группах пациентов с АЗ были получены достоверно высокие значения IL4 в плазме крови и назальном секрете (табл. 6).
У пациентов с эпизодическим и рецидивирующим течением ГИ были выявлены высокие значения IL4 в назальном секрете по сравнению таковыми у лиц с латентным течением ГИ.
У обследованных лиц с эпизодическим течением ГИ также установлены высокие уровни IFN в плазме крови и назальном секрете, по сравнению с таковыми значениями у пациентов с рецидивирующим течением ГИ. У лиц с рецидивирующим течением ГИ наблюдалось снижение соотношения IFN/IL4, уровня IFN в плазме крови и назальном секрете, увеличение TNF.(табл. 6). Полученные изменения уровней цитокинов в назальном секрете и плазме крови в зависимости от типа течения ГИ отражают активность гуморального иммунного ответа по Th2-типу. Снижение продукции IFN и IFN связано с типом течения ГИ. При этом в назальном секрете у лиц с рецидивирующим течением ГИ был выявлен самый высокий уровень TNF, который рассматривался нами как фактор, обусловленный тяжестью клинических проявлений ГИ и аллергического воспаления с участием эозинофилов и тучных клеток. Таким образом, различные клинические проявления герпетической инфекции связаны с особенностями цитокиновой продукции.
Клиническое рецидивирование различных форм ГИ - серьезная проблема, требующая длительных курсов противовирусной терапии и иммунореабилитации. Носительство герпетических вирусов не учитывается при подборе как базисной, так и этиопатогенетической терапии у пациентов с БА. Основываясь на классических представлениях формирования иммунного ответа, между аллергией и ГИ должна существовать связь по типу единства противоположностей. В патогенезе аллергического воспаления Тh2-путь иммунного ответа посредством ILконтролирует пролиферативную активность клеток и переключение синтеза антител с IgM на IgЕ, подавляет продукцию IFN. Поэтому длительное течение АЗ с активацией Тh2 необратимо сопровождается формированием функционального дефицита Тh1-пути иммунного ответа с последующим ослаблением противовирусной активности, в том числе за счет снижения IFN, TNF в плазме крови и нарастания в назальном секрете (табл. 6).
Таблица Показатели уровней цитокинов IL4, IFN, TNF, IFN в плазме крови и назальном секрете у лиц с аллергической патологией в зависимости от клинического течения герпетической инфекции (M m) Характер Исследуе- IFN/ клинического IFN IFN IL4 TNF мый объект ILтечения ГИ Плазма 39,5 18,5 81,0 + 11,3 241,3 33,0 129,0 33,6 0,Латентное течение Назальный 89,1 14,2 191,5 + 16,2 208,4 25,6 236,5 67,0 0,секрет Плазма 154,5 22,0* 86,3 + 35,8 221,4 26,3 156,7 100,6 0,Эпизодическое течение Назальный 159,3 33,1* 193,5 + 56,0 497,6 124* 302,5 58,8* 0,секрет РецидивиПлазма 32,4 18,2 46,6 + 25,4* 184,9 23,9 255,0 45,0* 0,рующее Назальный течение 69,0 + 39,4* 91,5 + 24,4* 566,3 174* 356,7 67,6* 0,секрет * - p < 0,05 между группами В связи с этим требуется пересмотр базисной терапии аллергических заболеваний (ринита и бронхиальной астмы) у пациентов с сопутствующим эпизодическим и рецидивирующим течением герпетической инфекции. Таким образом, одни и те же сигнальные молекулы вовлечены в патогенез хронических ГИ и аллергических болезней, поэтому в различной степени способны определять особенности клинического течения инфекционных и (или) аллергических состояний.
Типы иммунного ответа у пациентов с рецидивирующим течением герпетической инфекции У пациентов с упорно-рецидивирующим течением ГИ оценивалась цитокинпродуцирующая способность лимфоцитов периферической крови в индуцированных тестах с вирусным АГ in vitro. Сравнение проводилось с аналогичными показателями у лиц с латентным течением инфекции и положительными титрами специфических IgG к ВПГ1. При этом выполнялись следующие условия:
1) все пациенты имели упорно-рецидивирующее течение герпетической инфекции и получали лечение (ацикловир, индукторы интерферона, рекомбинантные интерфероны) только по данному поводу в изучаемый период;
2) повторы клинических рецидивов свидетельствовали о невысоком клиническом эффекте проводимой традиционной терапии;
3) лимфоциты периферической крови у обследованных лиц были взяты в период относительной клинической ремиссии.
Активность клеточного иммунитета является ведущей в ответе на вирусные и внутриклеточные АГ (грибковые, опухолевые). Так, по мнению ряда авторов, IFN, как основной цитокин Тh1-клеток, играет важнейшую роль в противогерпетическом ответе. Частые рецидивы ГИ наблюдаются на фоне сниженной способности периферических мононуклеаров к выработке IFN [McKenna D.B. et al., 2001]. В результате анализа полученных данных было выделено 4 типа изменения функциональной активности лимфоцитов в индуцированном ответе с вирусным АГ (см. рис. 1).
У 46% участников исследования в супернатантах АГ-индуцированных лимфоцитов отмечено повышение уровня IL4 на фоне низких значений IFN. По нашим представлениям, преобладание Th2-типа иммунного ответа ассоциировано с неблагоприятным прогнозом течения вирусных инфекций, формированием аллергической сенсибилизации, проблемами низкой эффективности этиотропной противовирусной терапии.
В 19% случаев имело место повышение продукции IFN на фоне низких значений IL4.
Адекватный иммунный ответ, спровоцированный антигенами вирусов, формировался за счет Th1-лимфоцитов, как известно, регулирующих активность NK-клеток, и CD8+ Т-клеток (ЦТЛ).
Вероятно, выделенный тип ответа свидетельствует о благоприятном прогнозе течения ГИ и эффективности моноэтиотропной противовирусной терапии для пациентов с выявленным ответом.
У 11,5% обследованных отсутствовали изменения уровней IFN и IL4 в супернатантах активных лимфоцитов в ответ на стимуляцию АГ, что, по нашему мнению, отражало наличие комбинированного иммунодефицита, возможно, за счет высвобождения неких супрессорных факторов в ответ на АГ. Такой алгоритм ответа соответствовал неблагоприятному прогнозу течения ГИ и объяснял отсутствие клинического эффекта от противовирусной терапии без дополнительной иммуномодуляции.
В 23,5% случаев наблюдалось однонаправленное повышение продукции IL4 и IFN в тестах. Вероятно, эта комбинация цитокинов отражала поляризацию иммунного ответа с активацией провоспалительного направления, определяемого IFN, TNF (возможно, активация по Th17пути), и требовала дальнейшего анамнестического анализа обследованных, в частности, по наследованию или клиническим признакам реализации аутоиммунных заболеваний. Данный алгоритм ответа на вирусный АГ является неблагоприятным прогнозом для клинического течения процесса и требует подбора комбинированной противовирусной и иммунотропной терапии. Наши данные согласовываются с результатами исследований М.В. Мезенцевой и соавт., которые наблюдали активацию Т-клеточного и гуморального иммунитета у больных тяжелыми формами генитального герпеса до лечения ацикловиром. Выявленные типы алгоритмов индуцированных ответов на АГ, вероятно, обусловлены недостаточностью или активацией одной из иммунорегуляторных субпопуляций T-хелперов (Th1, Th2, Th17, Treg), обеспечивающих неодинаковый баланс Т-клеточного и гуморального механизмов иммунного ответа.
1пкг/мл 11латентное течение комбинированный дефицит Th2 путь специфического ИО Тh1 путь специфического ИО Неопределенная поляризация ИО Продукция IFN y Продукция IL-Рис. 2. Продукция IFN и IL4 лимфоцитами, стимулированными причинным антигеном, у обследованных волонтеров с рецидивирующим течением герпеса Баланс между Тh1- и Th2-клетками чрезвычайно важен в обеспечении цитотоксического и АТ-ответа при вирусной инфекции. В результате совокупного анализа продукции исследуемых цитокинов нами было выделено 4 основных алгоритма продукции цитокинов в индуцированном тесте с АГ in vitro:
1) комбинированный иммунодефицит;
2) поляризация Th2-пути иммунного ответа;
3) поляризация Th1-пути иммунного ответа;
4) неопределенная поляризация пути иммунного ответа.
Таким образом, у пациентов с рецидивирующим течением ГИ определяются различные типы индуцированной цитокиновой продукции, что позволяет выделить особенности патогенеза инфекции и обосновывать индивидуальный адресный подход к комбинированной терапии инфекции.
Особенности полиморфизма генов цитокинов, рецепторов IL4RA и TLR9, транскрипционного фактора Tbet при различных типах герпетической инфекции С помощью рестрикционного анализа продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома исследованы полиморфные участки генов IFNG (rs 2069705), IL4Ra (rs 1805010), IL4(rs2070874), IL12RB1 (rs 11575934), IL12B (rs 3212227), TBX21 (rs 11652969), TLR9 -1237T/C (rs5743836). Нами проведена оценка особенностей полиморфизма генов регуляторных циткинов, опредляющих как направление иммунного ответа, так и выраженность воспалительных реакций у лиц с разными типами течения ГИ. В ходе исследования установлено, что частота генотипов по исследованным полиморфным локусам соответствовала ожидаемой при равновесии ХардиЦ Вайнберга. Первая группа (линфекционная модель) состояла из лиц с основными критериями:
положительные титры антител к ВПГ1, -2, в анамнезе наличие герпетической инфекции с разными типами течения и отсутствие фоновых заболеваний (иные инфекции, аллергии, аутоиммунные процессы и паразитозы). Вторую группу (лаллергическая модель) сформировали пациенты с установленным диагнозом латопическая БА согласно критериям GINA (Global Initiative for Asthma, 2005). Установлено, что полиморфизм генов цитокинов и их рецепторов (IL4, IL12B, IFNG, IL4RA), а также Toll-подобного рецептора 9 (TLR9) и транскрипционного фактора T-bet (TBX21) ассоциированы с вариациями клинического течения ГИ.
Проведено исследование полиморфизма продукта гена TBX21, являющегося кофактором клеточного направления противовирусного иммунного ответа. Продукт гена TBX21 выступает решающим транскрипционным фактором (T-bet), который регулирует баланс Th-1/Th-2 пути и продукцию IFN. При вирусной инфекции ген TBX21 стимулирует дифференцировку Th0 в Th1 и индуцирует продукцию IFN. Одновременно ген TBX21 подавляет продукцию IL4, угнетая Th2-путь, что клинически не приводит к рецидивирующему течению ГИ. Латенция вирусоносительства у пациентов без аллергической сенсибилизации определялась увеличением частоты встречаемости гомозиготного генотипа А/А гена TBX21.
Рецидивирующее течение ГИ было связано с генотипом А/G и аллелем G гена TBX21 (табл. 7).
Таким образом, данный гетерозиготный генотип гена TBX21 можно считать моделью риска развития рецидивирующих тяжелых форм ГИ.
Toll-подобные рецепторы (TLR) являются центральным элементом многоуровневой системы распознавания патоген-ассоциированных молекулярных структур. При оценке полиморфизма Ц1237T/C (rs5743836) гена TLR9 установлено, что рецидивирующее течение ГИ совпадает с увеличением частоты встречаемости генотипов Т/Т гена TLR9, продукт которого должен распознавать GpG мотив ВПГ1 АПК.
Таблица Распределение частот генотипов генов TBX21 и TLR9 у лиц с латентным, эпизодическим и рецидивирующим течением герпетической инфекции Латентное Эпизодическое Рецидивирующее Генотип Ген течение ГИ, % течение ГИ, % течение ГИ, % TBX21 G/G 41,2 53,8 38,G/A 38,2 38,5 61,5* A/A 20,6 7,7 0,0* T/T 60,5 70,6 88,0* TLRC/T 39,5 28,2 10,0* C/C 0 1,2 2,* - p < 0,05 между группами Таблица Распределение частот генотипов при латентном, эпизодическом и рецидивирующем типе течения герпес-инфекции Латентное течение Эпизодическое Рецидивирующее ГИ, % течение ГИ, % течение ГИ, % Ген Инфекци- Аллерги- Инфекци- Аллерги- Инфекци- Аллергионная ческая онная ческая онная ческая модель модель модель модель модель модель А/А 76,7 58,3* 72,7 64,9 80,0 61,IL12B A/C 10,0 41,7* 15,2 27,0& 13,3 26,9# C/C 13,3 0* 12,1 8,1& 6,7 11,5# V/V 14,8 29,2* 15,2 18,9 20,0 18,IL4RA I/V 59,3 50,0 48,5 45,9 53,3 44,(I50V) I/I 25,9 20,8 36,4 35,1 26,7 37,0# С/С 61,3 60,0 56,7 67,6 40,0 60,ILT/С 20,0 35,0 30,3 26,5 50,0# 18,T/T 19,7 5,0* 13,0 5,9 10,0# 22,0*#& C/C 31,0 12,5* 27,3 24,3& 0,0# 25,9# IFNG T/C 21,4 66,8* 36,4 56,8* 66,7# 51,T/T 47,6 20,8* 36,4 18,9* 33,3 22,* - p < 0,05 между показателями у представителей инфекционной и аллергической моделей; & - p < 0,между показателями у пациентов с латентным и эпизодическим течением герпетической инфекции; # - p < 0,между показателями у лиц с латентным и рецидивирующим течением герептической инфекции; - p < 0,05 между показателями у лиц с эпизодическим и рецидивирующим течением герпетической инфекции.
Генотип Рецидивирующее течение ГИ у лиц в отсутствие аллергической сенсибилизации, также как и повышенные значения IgE у лиц обоего пола было ассоциировано с частотой носительства генотипа Т/С (66,7%, p < 0,05) гена IFNG. Для латентного течения ГИ у лиц в отсутствие аллергической сенсибилизации выявлена частота носительства генотипа T/Т 47,6% гена IFNG.
Таким образом, адекватный клеточный иммунный ответ или период динамического равновесия между вирусом и иммунной системой хозяина (латентное течение) связан с частотой носительства генотипа Т/Т гена IFNG.
Таблица Уровень IgE у пациентов с разными генотипами полиморфных вариантов генов Уровень IgE, Me (Q1ЦQ3) Ген Генотип Инфекционная модель Аллергическая модель 26,20* 52,45 122,00* 177,А/А (5,00Ц113,40) (22,30Ц72,40) (106,50Ц130,00) (66,80Ц392,50) 70,70 64,10 92,40 313,IL12B A/C (19,00Ц177,50) (53,30Ц68,70) (32,60Ц274,80) (252,50Ц432,40) 11,00 126,85* 147,C/C (5,10Ц30,40) (20,40Ц316,70) (120,90Ц263,00) 29,50* 192,90* 110,40* 219,50* V/V (2,60Ц112,20) (40,60Ц421,90) (32,60Ц214,80) (137,90Ц345,75) 31,80* 42,40 186,50* 124,40* IL4RA I/V (7,00Ц173,10) (32,00Ц63,55) (47,20Ц311,00) (5,50Ц297,10) 7,20 41,15 98,75* 323,60* I/I (4,50Ц61,55) (22,30Ц60,00) (20,90Ц176,60) (236,90Ц650,00) 78,40* 90,80* 160,00* 190,00* T/T (64,30Ц129,20) (50,40Ц145,20) (130,00Ц501,00) (155,40Ц610,00) 12,40 22,80 243,10* 280,70* IL4 T/C (5,20Ц35,65) (15,00Ц55,50) (130,40Ц567,10) (124,50Ц450,10) 30,88 40,44 94,80* 160,30* C/C (10,40Ц63,50) (8,00Ц88,20) (27,50Ц307,00) (120,40Ц280,20) 31,30 50,20 75,85 297,10* T/T (6,10Ц86,20) (19,65Ц62,10) (16,50Ц194,40) (145,50Ц324,70) 62,05* 40,00* 129,70* 202,40* IFNG T/C (6,20Ц245,30) (16,60Ц129,90) (33,20Ц307,00) (119,4Ц345,80) 12,40* 72,80 168,90* 229,30* C/C (3,70Ц37,20) (72,40Ц73,20) (106,50Ц243,20) (102,90Ц366,00) *Ц p < 0,05 между группами Рецидивирующее течение ГИ у больных БА было ассоциировано с достоверно увеличенной частотой генотипа С/С гена IFNG. С аллелем C связана, вероятно, низкая продукция IFN у представителей обеих моделей, являющаяся причиной клинического рецидивирования вирусной инфекции. Можно предположить, что у пациентов с БА имеется генетически детерминированный нарушенный контроль за продукцией белка IFN, ассоциированный с носительством генотипа С/С гена IFNG. Таким образом, у больных БА, ассоциированных с носительством полиморфизма C/C и Т/С гена IFNG, имеет место более тяжелый прогноз течения аллергического заболевания (БА) за счет активной продукции IgE и риска манифестации рецидивирующего течения ГИ.
IgE принадлежит ведущая роль в формировании и прогрессировании аллергических реакций. Контроль активности гуморального иммунитета и, в частности, уровня IgE осуществляется регуляторным цитокином Th2-пути - IL4. У пациентов в инфекционной модели самый высокий уровень IgE был ассоциирован с носительством генотипа Т/Т и аллелем Т гена IL(средний 78,4 КЕ/л, максимальный - 145,2 КЕ/л) (p = 0,036) и с частотой носительства генотипа V/V гена IL4RA (c 112,2 до 421,9 КЕ/л). Пациенты инфекционной модели с носительством генотипов Т/Т гена IL4 и V/V гена IL4RA уже при латентном и эпизодическом течении ГИ, по нашему мнению, имели риск присоединения аллергических реакций, связанных с повышенной продукцией IgE при обострении вирусной инфекции.
В аллергической модели у пациентов с БА установлено статистически значимое повышение частоты носительства генотипа T/T гена IL4 между латентным и рецидивирующем течением ГИ, при этом высокий уровень IgE был ассоциирован с частотой встречаемости генотипов Т/Т и Т/С гена IL4 не зависимо от пола пациентов. Ранее нами было показано, что у 71% пациентов, страдающих, БА развивается сопутствующая эпизодическая и рецидивирующая герпетическая инфекция.
Совместное влияние у выделенных лиц с носительством генотипов G/A гена TBX21, Т/Т TLR9, T/C и С/С IFNG, Т/С IL4, V/V IL4RA приводит к нарушению контроля клеточного иммунного ответа по Th1-типу и адекватного синтеза IgE. В условиях массовой инфицированности населения герпесвирусами (ГВ) такие пациенты являются группой риска развития сенсибилизации слизистых и кожи к неинфекционным антигенам, развития аллергических заболеваний в отсутствие отягощенного аллергического наследственного анамнеза. При рецидивирующем течении герпетическая инфекция, на наш взгляд, приводит к формированию аллергического характера воспаления и реализации аллергической патологии в динамике развития рецидивов инфекционного процесса. Одной из причин неэффективности стандартной противоаллергической терапии аллергических заболеваний является недооценка в патогенезе вклада инфекционного фактора.
ИММУНОТЕРАПИЯ ПРИ ГЕРЕПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ И АЛЛЕРГОПАТОЛОГИИ Влияние курса комбинированной противовирусной и иммуномодулирующей терапии на иммунный ответ у пациентов с рецидивирующим герпесом Проблема поиска новых подходов для эффективного лечения рецидивирующих форм ГИ является актуальной. Так как полноценная элиминация герпетических вирусов в принципе невозможна, то выздоровление в привычном понимании этого слова также теряет смысл. Для пациентов с рецидивирующей ГИ цель терапии состоит в переводе клинических рецидивов в латентную форму взаимодействия вируса и иммунной системы хозяина. Иммунная система должна вернуться к контролю над пролиферацией вируса. В этом процессе основная задача состоит в реабилитации врожденного иммунитета с адекватной реакции адаптивного иммунитета на хронически присутствующий антиген. Проведен курс комбинированной терапии у пациентов с рецидивирующей ГИ без аллергической сенсибилизации (40 человек) и с фоном аллергического заболевания - БА (42 человека). Пациенты с БА получали утвержденную базисную терапию основного заболевания весь период наблюдения. С первого дня очередного обострения герпетической инфекции назначались: ацикловир (1,6 г/сут, таблетки, 10 дней ежедневно) и имунофан (инъекции в/м 1,0 мл ежедневно №5, затем через день №5). Имунофан относится к группе лекарственных средств с основным влиянием на клеточный иммунитет и продукцию IFN. Группу сравнения составили лица с латентным течением ГИ.
Контрольные измерения клеточных показателей и уровня интерферонов проводили на 1Ц2-й день клинических проявлений, повторно через 15 дней после начала лечения (клиническая ремиссия инфекционного процесса), затем через 30 дней от начала обострения. На 15-й день сразу после курса комбинированной терапии у лиц с рецидивирующим течением ГИ не зависимо от наличия аллергической сенсибилизации отмечалось достоверное (p < 0,05) возрастание абсолютного количества лейкоцитов, лимфоцитов, NK-клеток, цитотоксической активности NK-лимфоцитов по сравнению с показателями в стадии обострения в каждой группе.
Однако эффект повышения цитотоксической активности и уровня IFN нивелировался у лиц с БА уже к 30 дню после проведенной терапии, характеризуясь снижением активности NKлимфоцитов и концентрации IFN в достоверно большей степени, чем у пациентов с ГИ в инфекционной модели. Как известно, система естественной цитотоксичности, включающая популяцию NK-лимфоцитов, обеспечивает лизис клеток-мишеней, инфицированных ВПГ и ограничивает тем самым распространение ГИ. Состояние системы естественной цитотоксичности в значительной степени определяет частоту манифестации ГИ. Клиническая распространенность и длительность клинических проявлений зависит от адаптивного иммунитета (CD8+, IFN). Таким образом, представленные результаты показали, что у больных, имеющих рецидивирующее течение ГИ без аллергической сенсибилизации, манифестированный дефект в системе естественной цитотоксичности выражался в снижении количества и активности NK-клеток как в стадию обострения, так и стадию ремиссии ГИ. Реабилитация показателей интерферонов до значений группы сравнения (при латентном течении ГИ) после курса комбинированной терапии ацикловиром и имунофаном сохранялась до 30 дней, за исключением индекса цитотоксичности NK-лимфоцитов.
Принимая во внимание, что персистенция герпетического воспаления приводит к постоянному поражению эпителия слизистых, неизбежным является формирование гиперреактивности, которая способствует утяжелению аллергических проявлений. Для пациентов, страдающих БА, становится актуальным периодическое проведение контроля показателей интерферонов и активности NK-лимфоцитов, специфической диагностики ВПГ1, -2. Пациентам с БА и сопутствующей рецидивирующей ГИ требуются длительные комбинированные схемы противовирусной и иммунотропной терапии.
Влияние курса иммунотерапии трансфер-фактором на иммунный ответ у пациентов с рецидивирующим герпесом У пациентов с рецидивирующим течением ГИ для оценки особенностей противовирусного иммунного ответа в условиях in vitro и обоснования применения индивидуальной иммунотропной терапии была использована модель РБТЛ, стимулированных вирусным АГ (вакцинальный штамм ВПГ1, -2) в сравнении показателей РБТЛ с ФГА. В выбранной группе волонтеров (62 пациента в возрасте от 18 до 50 лет) в стадию клинической ремиссии оценивали пролиферативную активность Т-лимфоцитов, а также способность клеток в ответ на разные стимулы секретировать и высвобождать IFN и IFN. Трансфер-фактор (лFor life research, США) - известный фактор, регулирующий экспрессию HLA 1 и HLA 2 антиген презентирующих дендритных клеток, стимулятор активности клеток с цитотоксическим потенциалом (CD8+, CD16+) и индуктор интерферонов. Рекомендован для лечения пациентов с герпетическими инфекциями. Все участники исследования получали трансфер-фактор в суточной дозе курсом 14 дней в период клинической ремиссии ГИ. Контроль показателей после курса терапии проводили на 15Ц16-й день. Группу сравнения для оценки изучаемых показателей составили пациенты с латентным течением ГИ. Анализ показателей проведен ретроспективно после назначенного курса терапии. По результатам показателей РБТЛ со специфическим АГ все волонтеры были дополнительно дифференцированы на 2 группы: с положительным ответом и отсутствием ответа лимфоцитов на индукцию АГ. Пациенты, распределенные в 1-ю группу (22 человека), в индуцированном тесте с вирусным АГ имели высокие показатели пролиферации по сравнению с представителями группы сравнения до терапии (36,00 2,78)%). После курса терапии трансфер-фактором индуцированная вирусным АГ концентрация IFN увеличилась с (58,74 5,20) пг/мл до (110,00 2,62) пг/мл (p < 0,05), продукция IFN - с (22,36 4,01) пг/мл (p < 0,05) до (57,14 8,03) пг/мл, также возросла продукция индуцированного IFN в тесте с ФГА. Таким образом, пациенты в результате полученного курса терапии увеличили свои резервные возможности инерферонопродукции в ответ на вирусный антиген и ФГА.
У пациентов 2-й группы (40 человек), не показавших прироста пролиферации лимфоцитов в тесте со специфическим АГ до терапии, по сравнению с группой сравнения ((11,33 2,44) против (10,00 1,00)%), имели место иные итоговые показатели. После курса терапии трансферфактором у 25 человек был отмечен прирост пролиферативной активности Т-лимфоцитов в тесте со специфическим АГ ((18,33 6,89)%). Мы расценили данный факт как позитивный, обусловленный нормализацией экспрессии специфического TCR в ответ на АГ, и связывали с этим прирост продукции IFN. Продукция IFN увеличилась, хотя и менее значительно, по сравнению с таковой у представителей 1-й группы: в тестах с ФГА с (26,33 21,78) до (63,33 6,44) пг/мл, индуцированная АГ - от 0 до (19,00 9,33) пг/мл, (p < 0,05).
Проведенные исследования показали, что трансфер-фактор, модулятор экспрессии рецепторов Т-лимфоцитов и индуктор продукции интерферонов, оказывают положительный эффект у пациентов, который выражается в нормализации показателей интереферонового статуса и функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Необходимо разрабатывать адресные схемы терапии трансфер-фактором и применять их под контролем состояния эндогенной системы интерферонов и функциональной активности Т-лимфоцитов. Для этого можно использовать модель РБТЛ со специфическим антигеном in vitro. Полученные разноплановые изменения в интерфероновом статусе зависят от состояния иммунной системы пациентов до начала лечения, способности специфического TCR лимфоцитов распознавать вирусный АГ и отвечать на него.
Таким образом, предприняты попытки лабораторно доказать, что у пациентов с рецидивирующим течением ГИ нарушена экспрессия специфических TCR на Т-лимфоцитах на вирусный АГ. Это позволяет объяснить слабую эффективность традиционных курсов этиотропной (ацикловир) терапии, после отмены которой рецидивы возобновляются. Прием ацикловира не может исправить данную ситуацию в пользу реабилитации иммунного ответа. Более того, возможно, что многочисленные АТ к ВПГ экранируют специфические рецепторы и нарушают ответ на специфический АГ.
Выраженный дисбаланс состояния Т-клеточного, гуморального иммунитета и системы интерферонов в период ремиссии ГИ, усиливающийся при рецидиве инфекции, подтверждает обоснованность и целесообразность использования в комплексной терапии ГИ, наряду с базисной терапией противовирусными препаратами, лекарственных средств, обладающих адресной иммуномодулирующей активностью для каждого пациента.
Аллергенспецифическая иммунотерапия у больных с аллергической патологией, отягощенной герпетической инфекцией Единственным этиопатогенетическим методом лечения аллергических заболеваний признана аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ, категория доказательства Ib) [Гущин И.С. 2002; Bousquet et al., 2002; Johansson, 2004; Alvarez-Cuesta et al., 2006 Горячкина Л.А.
и др., 2009;]. В настоящее время одним из ведущих механизмов АСИТ считается переключение иммунного ответа с проаллергенного Тh2 на Тh1, изменение баланса IFN, TGF, после чего должно следовать снижение высвобождения IL4, активация экспрессии IL4RA, изменение функциональной активности CD22+, CD23+ Т-лимфоцитов и, как следствие, - нормализация синтеза реагиновых антител (IgE) [Хаитов Р.М. и др., 2000]. Клиническое обострение ГИ у пациентов с АЗ на любом этапе АСИТ должно нарушать механизмы формирующейся толерантности. В течение 4 лет под нашим наблюдением находились пациенты с круглогодичным аллергическим ринитом (КАР) (40 человек), сезонным аллергическим ринитом (САР) (42 человека), бронхиальной астмой и КАР (38 человек). Пациенты получали АСИТ бытовым (пыльцевым) аллергеном ускоренным методом, суммарная доза курса составила 10 тыс. PNU согласно методике подкожного введения причинно-значимого аллергена (ПЗА) [Гущин И.С., 1998; Горячкина Л.А. и др., 2009]. Оценку клинической эффективности АСИТ (отлично, хорошо, удовлетворительно, неудовлетворительно) проводили по следующим критериям:
1) уменьшение выраженности симптомов заболевания до полного их исчезновения и установления ремиссии по балльной шкале: 0 баллов - отсутствие признака в период воздействия ПЗА, 1 балл - редкое или минимальное проявление признака в присутствии ПЗА, 2 балла - ежедневное умеренное проявление признака в присутствии ПЗА, 3 балла - максимально выраженный признак при минимальном ежедневном воздействии ПЗА;
2) уменьшение объема фармакотерапии вплоть до отмены препаратов или применения прежних доз;
3) нормализация качества жизни пациента;
4) решение проблемы социальной адаптации.
Для оценки критерия иммунологической эффективности АСИТ введено соотношение регуляторных цитокинов, отражающих участие Th1/Th2 лимфоцитов - IFN/IL4, и активность хемотаксиса эозинофилов в слизистую носа (показатель клеточного аллергического воспаления). После проведенной терапии по клиническим критериям эффективности курса АСИТ в группе с латентным течением ГИ отличных результатов зарегистрировано 66,6% (24 человека), хороших - 22,2% (8 человек), удовлетворительных - 11,2% (4 человека) (рис. 3). Отличные и хорошие клинические результаты сочетались с повышением значений IFN, снижением IL4 и TNF как в плазме, так и назальном секрете. Коэффициент IFN/IL4 в этой группе после лечения был зафиксирован выше 1. В цитологии мазка слизистой носа статистически значимо снизились показатели деструктивного эпителия и количества эозинофилов. Однако после курса АСИТ отмечена динамика снижения IFN в назальном секрете.
По итогам АСИТ в группе с эпизодическим течением ГИ отличные результаты составили 38,5% (19 человек), хорошие - 32,7% (17 человек.), удовлетворительные - 30,8% (16 человек) (рис. 3) У представителей данной группы отсутствовала динамика изменений в плазме крови для всех изучаемых цитокинов. В назальном секрете зафиксировано статистически значимое снижение уровня IL4 с нарастанием IFN. Однако, в отличие от группы с латентным течением ГИ, зарегистрированы высокие значения TNF в назальном секрете как до, так и после лечения.
По итогам АСИТ в группе с рецидивирующим течением ГИ отличные результаты составили 21,9% (7 человек), хорошие - 28,1% (9 человек), удовлетворительные - 37,5% (12 человек), неудовлетворительные - 12,5 (4 человек) (рис. 3). В 62,5% случаев (20 человек) нагрузка ПЗА привела к повышению титра IgG к ВПГ, у 44% (14.) пациентов отмечено обострение ГИ с локализацией на слизистой носа и губ на фоне высоких доз ПЗА. Клинически течение КАР у всех пациентов данной группы характеризовалось постоянной блокадой носового дыхания и расценивалось как аллергическое воспаление с участием медиаторов поздней фазы на фоне статистически высоких значений TNF, с назальной эозинофилией и лимфоцитозом, низкими значениями IFN и IFN.
отличные хор удовл неуд.
66,60% 70,60,36,50% 50, 32,70% 28,10% 40, 37,50% 30,80% 21,90% 30,22,20% 20,11,20% 12,50% 10,00 %%% 0,латентное течение ГИ эпизодическое течение ГИ рецидививирующ ее течение ГИ Рис. 3. Эффективность АСИТ у пациентов с разным течением герпетической инфекции Курс АСИТ приводил к достоверному снижению в назальном секрете IFN. Снижение лейкоцитарного интерферона отражает нарушение контроля врожденного иммунитета, включая вирусные антигены, и участия IFN в иммунорегуляторном противовоспалительном контроле на слизистых. У 5 (10%) пациентов в этой группе произошло клиническое обострение ГИ с локализацией на слизистой носа и губ на фоне высоких доз получения ПЗА. В 29% случаев (15 пациентов) зарегистрировано среднее повышение титров IgG к ВПГ, из них у 10 человек клинические проявления ГИ на этапах АСИТ отсутствовали.
Таким образом, при сравнительной характеристике клинических проявлений АСИТ в 3 группах пациентов достоверно худший результат был получен в группе больных, имеющих эпизодическое и рецидивирующее течение ГИ. У лиц с эпизодическим и рецидивирующим течением ГИ на фоне АСИТ в 91% случаев имело место повышение титров специфических антител к ВПГ1. Эффективность терапии АСИТ зависит от частоты рецидивов герпетической инфекции в год и количества рецидивов во время АСИТ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенное исследование 1843 жителей г.Томска в возрасте 18Ц60 лет позволило выявить высокую частоту инфицированности ВПГ 1 (97,08%) и ВПГ 2 (38,68%) типов, в сравнении со средними показателями по России. У 39 % обследованных имело место латентное течение ГИ или состояние динамического равновесия вируса и иммунной системы человека. Рецидивирующее течение ГИ с разной локализацией проявлений установлено у 18,5% обследованных. Присутствие в 58% случаев высоких титров специфических антител к ВПГ1 (1 : 1600 - 1 : 12800) в период латентного присутствия инфекции отражает активность гуморального иммунного ответа.
У 74% обследованных выявлена положительная сенсибилизация к неинфекционным аллергенам в разной степени выраженности, из них у 49% латентная аллергическая сенсибилизация обнаружена впервые. Латентная аллергическая сенсибилизация зарегистрирована в сочетании с различными клиническими проявлениями герпетической инфекции (латентной, эпизодической, рецидивирующей). У лиц с положительной аллергической сенсибилизацией в 22,9% случаев установлено рецидивирующее течение ГИ. При этом у пациентов, страдающих БА, рецидивирующее течение ГИ выявлено в 31,0% случаев, т.е. у каждого третьего больного. У пациентов с отрицательной аллергической сенсибилизацией рецидивирующее течение ГИ встречалось только в 11,5% случаев. Таким образом, наибольшее количество клинически рецидивирующих форм ГИ установлено у пациентов с БА, на втором месте высокий процент случаев рецидивирующего течения ГИ зарегистрирован у пациентов, имеющих положительную аллергическую сенсибилизацию, включая скрытое течение аллергии. Анализ клинических особенностей течения ГИ показал, что от латентного к манифестному рецидивирующему течению увеличивается число пациентов с положительной сенсибилизацией к неинфекционным аллергенам. Независимо от наличия сенсибилизации к неинфекционным аллергенам, установлена положительная корреляция риска развития эпизодических форм течения ГИ с нарастанием уровня IgE, IL4. У обследованных с положительной сенсибилизацией к неинфекционным аллергенам определены высокие титры специфических АТ к ВПГ1, -2 и значений IgE. С другой стороны, высокие титры специфических антител IgG к ВПГ1 и 2 при положительной корреляции с повышенным уровнем IgE и IL4 отражают активность Тh2-типа иммунного ответа и свидетельствуют о неблагоприятном течении и прогнозе герпетической инфекции, что нам и удалось показать в выполненном исследовании. Вирус-индуцированная аллергия, сопровождающаяся активностью Th2 лимфоцитов, - есть стратегия выживания персистирующего герпесвируса. Постоянная активность Th2типа иммунного ответа способствует риску развития аллергии на окружающие антигены и влияет на популяционный иммунитет современного населения.
Таким образом, длительная персистенция ВПГ даже без клинических проявлений инфекции может являться причиной сенсибилизации к неинфекционным аллергенам у современного населения. При рецидивировании ГИ начинают формироваться клинически выраженные реакции аллергического заболевания, на первом месте из которых стоят аллергический ринит и бронхиальная астма.
Характер течения герпетической инфекции у лиц без аллергической сенсибилизации и пациентов, страдающих бронхиальной астмой, ассоциирован с гетерогенными вариантами изменений количества и функциональной активности NK-клеток и Т-лимфоцитов, содержания IFN, IFN, IL4 и баланса IFN/IL4 как в сыворотке крови, так и в индуцированных тестах in vitro с вирусным антигеном.
При рецидивирующем течении ГИ установлено, что в стадию обострения у пациентов, не зависимо от аллергической сенсибилизации, имеет место однотипный алгоритм снижения количества и цитотоксической активности NK-лимфоцитов, без восстановления показателей в стадию клинической ремиссии до таковых значений, зарегистрированных в группе с латентным течением ГИ (периода динамического равновесия). Выявлены особенности продукции интерферонов: у пациентов без аллергической сенсибилизации уровни IFN и IFN в крови повышаются в острую стадию ГИ с дальнейшим снижением в стадию ремиссии до сравниваемых таковых значений при латентном течении ГИ. У пациентов с аллергическими заболеваниями, включая БА, в стадию обострения инфекции происходит увеличение содержания сывороточного IFN и IFN, с динамичным снижением уровня IFN ниже нормативных значений, зарегистрированных при латентном течении ГИ. На фоне рецидивирующего течения ГИ и БА установлено, что в индуцированных тестах с вирусным АГ прирост продукции IL4 сопровождался сниженной продукцией IFN и TNF по сравнению с таковыми при эпизодическом течении ГИ. Как известно, с функцией IFN связаны контроль противовирусного иммунного ответа, репликация вирусов, антагонизм продукции IL4. TNF регулирует несекреторный апоптоз поврежденных вирусом клеток, но активирует цитокины аллергического воспаления.
Таким образом, при манифестном течение ГИ пациенты с БА на вирусный АГ формируют Th2- ответ в отличие от обследованных лиц с манифестными формами течения ГИ в отсутствии аллергической сенсибилизации.
Рецидивирующее течение ГИ в отсутствие аллергосенсибилизации характеризуется разными типами индуцированного ответа на вирусный антиген. У 46% обследованных отмечено повышение уровня IL4 на фоне низкого количества IFN в супернатантах АГиндуцированных лимфоцитов. По нашим представлениям, развитие Th2-типа иммунного ответа ассоциировано с неблагоприятным прогнозом течения вирусных инфекций, формированием аллергической сенсибилизации, проблемами низкой эффективности стандартной этиотропной противовирусной терапии.
У 19% пациентов отмечено увеличение продукции IFN на фоне низких значений IL4.
Вероятно, выделенный алгоритм ответа свидетельствовал о благоприятном прогнозе течения ГИ, не смотря на рецидивное течение инфекции. Требуется подбор схем этиотропной противовирусной терапии без дополнительной коррекции иммунного ответа.
В 11,5% случаев отсутствовали изменения продукции IL4 и IFN в супернатантах лимфоцитов, стимулированных АГ, что, на наш взгляд, отражает наличие комбинированного иммунодефицита, вероятно, за счет некого супрессорного цитокинового сопровождения, возможно, за счет активности Treg-лимфоцитов в ответ на АГ. Такой алгоритм ответа соответствовал неблагоприятному прогнозу течения ГИ. Этим же можно объяснить отсутствие клинического эффекта от стандартной длительной противовирусной терапии у пациентов (стандартные приемы ацикловира до 6 мес).
У 23,5% обследованных с рецидивирующим течением ГИ наблюдались однонаправленные повышения продукции IL4 и IFN в тесте с АГ. Возможно, эта комбинация цитокинов отражает поляризацию иммунного ответа с участием провоспалительных цитокинов (IFN, TNF) по пути Th17 и требует дальнейшего анамнестического анализа обследованных, в частности, по выявлению наследования и клинических признаков реализации аутоиммунных расстройств. Выявленный алгоритм ответа на вирусный антиген может отражаться неблагоприятным прогнозом клинического течения процесса и требует подбора комбинированной противовирусной и иммунотропной терапии.
Рецидивирующее течение ГИ любой локализации требует длительных курсов противовирусной терапии и адресной иммунореабилитации.
Современная стандартная терапия у пациентов с аллергическими заболеваниями (бронхиальная астма, аллергический ринит, аллергический дерматит) не учитывает носительство герпесвирусов при подборе как базисной, так и этиопатогенетической терапии. Если учитывать классические представления о формировании иммунного ответа, то между аллергией и ГИ прослеживается связь по принципу единства противоположностей. В патогенезе аллергического воспаления Тh2-путь иммунного ответа посредством IL4 контролирует пролиферативную активность клеток и переключение синтеза антител с IgM на IgЕ, подавляет продукцию IFN.
Отсутствие клинических проявлений ГИ в латентном течении и особенности манифестации и рецидивирование ГИ определяются генетическими факторами и активностью как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Взаимоотношения в интерфейсе клеточного генома человека и вирусного генома имеют сложную причинно-следственную цепь влияний. Нами проведена оценка особенностей полиморфизма генов регуляторных циткинов, определяющих как направление иммунного ответа, так и выраженность воспалительных реакций у обследованных с разными типами течения ГИ.
Установлено, что полиморфизм генов цитокинов и их рецепторов (IL4, IL12B, IFNG, IL4RA), а также Toll-подобного рецептора 9 (TLR9) и транскрипционного фактора Tbet (TBX21) ассоциирован с вариациями клинического течения ГИ.
атентное течение ГИ или состояние динамического равновесия между активностью вируса и клиническими проявлениями у пациентов без аллергической сенсибилизации в условиях установленных высоких специфических титров IgG к ВПГ1, -2 типа (в результате событий состоявшегося ответа на ВПГ1, -2) связано с контролем клеточного иммунитета белковыми продуктами генотипов А/А TBX21, C/T TLR9, A/A IL12B, T/T IFNG. При этом клеточный иммунный ответ этих волонтеров остается функционально активным по отношению к АГ иного / различного происхождения. Рецидивирующее течение ГИ у обследованных без аллергической сенсибилизации (инфекционная модель) обусловлено нарушением клеточного и активацией гуморального иммунитета, дисбалансом регуляторных цитокинов и их рецепторов, связанных с частотой носительства генотипами T/T TLR9, G/A TBX21, С/С IL12B, T/С IFNG, Т/C IL4.
(рис. 4) У обследованных без аллергической сенсибилизации, а также в группе с аллергическими заболеваниями (БА) установлено, что уровень IgЕ связан с белковым продуктом гена IL4 (p = 0,036). Риск формирования аллергической сенсибилизации у пациентов с латентной, а также эпизодической реактивацией и рецидивирующим течением ГИ ассоциирован с модулирующим влиянием полиморфных вариантов генов IL4 (T/Т) и IL4RA (V/V) на продукцию IgE (рис. 4). Базисная терапия рецидивирующей герпетической инфекции должна учитывать риск развития аллергической сенсибилизации.
атентное течение у пациентов с БА (аллергическая модель) ассоциировано с высокой частотой носительства генотипов А/С гена IL12B и T/C гена IFNG, контролирующих клеточный иммунный ответ. Можно предположить, что клиническое сдерживание ГИ происходит только у пациентов, страдающих БА, у которых рецептор IL4R является продуктом гетерозиготного гена I/V IL4RA.
Формирование аллергической сенсибилизации у пациентов с РГИ АПК Плазмоцитоидная Вирусный антиген ВПГ1 - поражение дендритная клетка эпителиальных клеток слизистых и клеток кожи ген TLR9 (экзон) Ген IFNG (промотор) IgM Генотип Т/T Ig G Генотип Т/C Замена аминокислоты в соответствующем белке (рецепторе) Bлф Ig E Нарушение функциональный свойств при Нарушение структуры взаимодействии с мотивом GpG ДНК ВПГ1 и регуляторных участков, снижение дальнейшей активации генов синтеза белка - INF транскрипционных факторов, в частности Ген IL-4 (промотор) TBXГенотип Т/С Генотип Т/T Нарушение структуры ген TBX21 (интрон) регуляторных участков, Низкая экспрессия HLAII, повышение синтеза Повышение Генотип G/A белка IL4 синтеза IgE слабая активация Thи нарушение Изменение структуры регуляторных аффинитета + участков, снижение продукции белка t-bet Ген IL-4Ra (экзон)- IL4-IL4R Th0 ThЗамена аминокислоты в соответствующем белке (рецепторе) - Нарушение регуляции баланса Th0 ЦTh1, снижение продукции IFN Нарушение функциональных свойств рецептора ThФормирование гуморального иммунитет, благоприятные условия для размножения вируса и деструкции клеток и тканей, формирование гиперреактивности слизистых Рис. 4. Формирование аллергической сенсибилизации у пациентов с рецидивирующей герпетической инфекцией (инфекционная модель риска развития аллергии, авторская схема).
Рецидивирующее течение ГИ у пациентов, страдающих БА, связано с нарушением продукции цитокинов и с частотой носительства генотипов C/C гена IFNG, генотипа T/T гена IL4, генотипа I/I гена IL4RA. Таким образом, совместное влияние полиморфизмов генов формирует нарушение противовирусного иммунитета в аллергической модели и также ассоциировано с повышенным риском осложненного течения ГИ среди больных БА и, как следствие, с усилением тяжести основного аллергического заболевания.
В условиях массовой инфицированности населения ГВ, одной из причин неэффективности стандартной противоаллергической терапии аллергических заболеваний является недооценка в патогенезе вклада инфекционного фактора с учетом особенностей генетического контроля.
Кроме того, существующие виды терапии и профилактики рецидивирующих форм ГИ не дают однозначных положительных результатов в работе врачей клинических специальностей. Полученные данные позволяют приблизиться к пониманию механизмов реактивации ГИ у пациентов с разным типом течения ГИ и риском развития аллергических заболеваний даже в отсутствие отягощенного наследственного аллергоанамнеза. Возможно, генотипические данные могут быть использованы для разработки тест-системы прогнозирования риска развития рецидивирующего течения ГИ, присоединения аллергической сенсибилизации, уточнения практических целей и индивидуальности курсов терапии ГИ, разработки противогерпетических аутовакцин.
Динамика индуцированной продукции IFN, IL4 и пролиферации Т-лимфоцитов in vitro в тестах с вирусным антигеном являются доступными клинико-лабораторными критериями эффективности и прогноза противовирусной и иммуномодулирующей терапии. Нами было установлено, что курс комбинированной терапии противовирусным и иммунотропным препаратами ацикловиром и имунофаном приводит к увеличению активности NK- лимфоцитов у обследованных без отягощенного аллергоанамнеза и к увеличению как активности NK-клеток, так и их количества, в группе больных с аллергическими заболеваниями (БА), по сравнению с соответствующими показателями в стадию ремиссии. Данный эффект нивелируется у больных с БА уже через 2 нед после проведенной терапии, характеризуясь снижением активности NKлимфоцитов и концентрации IFN в достоверно большей степени, чем у обследованных без аллергической сенсибилизации. Реабилитация показателей до значений группы сравнения (латентное течения ГИ) после курса комбинированной терапии ацикловиром и имунофаном происходит на кратковременный (до 1 мес) период. Принимая во внимание тот факт, что персистенция герпетического воспаления приводит к постоянному поражению эпителия слизистых и эпидермиса кожи у этой категории пациентов, неизбежны периоды гиперреактивности слизистых и кожи, ведущие к утяжелению аллергических проявлений и недостаточности терапии БА. Для пациентов, страдающих БА, становится актуальным периодическое проведение контроля показателей интерферонов и активности NK-клеток, специфической диагностики ВПГ1, -2. Пациентам с БА и сопутствующей рецидивирующей ГИ требуются длительные комбинированные схемы противовирусной и иммунотропной терапии.
Трансфер-фактор - известный фактор, регулирующий экспрессию HLA1 и HLAантигенпрезентирующих дендритных клеток, стимулятор активности клеток с цитотоксическим потенциалом (CD8+, CD16+) и индуктор интерферонов. Рекомендован для лечения пациентов с герпетическими инфекциями. Проведенные исследования показали, что трансфер-фактор оказывает положительный эффект только у части пациентов, которые в условиях индукции антигеном отвечают повышением функциональной активности Т-лимфоцитов, и как следствие, увеличением продукции интерферона. Полученные разноплановые изменения в интерфероновом статусе зависят от состояния иммунной системы пациентов до начала лечения, способности специфического TCR-лимфоцитов распознавать и отвечать на вирусный АГ. Очевидно, что необходимо разрабатывать оптимальные схемы терапии трансфер-фактором и применять их с учетом и под контролем состояния эндогенной системы интерферонов и иммунологического резерва пациента в каждом конкретном случае. Более того, возможно, многочисленные АТ к ВПГ лэкранируют специфические рецепторы и нарушают ответ при встрече со специфическим АГ.
Единственным этиопатогенетическим методом для лечения аллергических заболеваний остается аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ, категория доказательства Ib). В настоящее время одним из ведущих механизмов АСИТ считается переключение иммунного ответа с проаллергенных Тh2-клеток на Тh1-опосредованный путь ответа, изменение баланса IFN и TGF, после чего должно следовать снижение высвобождения IL4, активация экспрессии IL4RA, изменение функциональной активности CD22+ CD23+-лимфоцитов и, как следствие, - уменьшение синтеза реагиновых антител (IgE). Клиническое обострение ГИ у пациентов с аллергическими болезнями на любом этапе АСИТ должно нарушать механизмы формирующейся толерантности. При сравнительной оценке эффективности проведенной АСИТ достоверно худший результат был получен в группе больных, имеющих сочетание аллергического заболевания с эпизодическим или рецидивирующим течением ГИ. Ежедневный набор с увеличением дозы причинного аллергена у этих пациентов приводил к достоверному снижению в назальном секрете уровня IFN. С IFN, как известно, связана иммунорегуляторная противовоспалительная и противовирусная функция врожденного иммунитета. Снижение количества и функции IFN является причиной пролиферативной активации вируса герпеса, находящегося в эпителиальных клетках. Дополнительно у 91% пациентов зарегистрировано повышение титров специфических антител к ВПГ1. Количество полученных лотличных результатов АСИТ снижалось у пациентов в группах с эпизодическим и рецидивирующем течении ГИ. Таким образом, клинические маркеры эффективности проведенной АСИТ зависели от частоты рецидивов ГИ в год (из анамнеза болезни пациента) и количества клинических вирусных рецидивов во время набора доз причинного аллергена, включая период поддерживающей терапии. Лабораторные критерии эффективности для этой группы пациентов были связаны с динамическим изменением уровня IFN, титра IgG к ВПГ1, -2.
Таким образом, полученные результаты исследования, их анализ и выводы расширяют имеющиеся представления о патогенетических механизмах формирования, реактивации, особенностях течения герпетической инфекции, причинах аллергической сенсибилизации современного населения, изменении популяционного иммунитета на фоне массового носительства герпетических вирусов. Выявлены достоверные дифференциально-диагностические критерии, позволяющие повысить качество диагностики, адекватность и эффективность патогенетической терапии герпетической инфекции, а также лечения герпетической инфекции у пациентов с аллергическими заболеваниями. Результаты позволяют разработать новые диагностические критерии для прогноза течения инфекционного процесса и обоснования индивидуальной иммуномодулирующей терапии, а также внедрения модифицированной схемы лечения, которая может быть рекомендована для широкого применения пациентов, имеющих сочетание аллергии с герпетической инфекцией.
ВЫВОДЫ 1. Массовая инфицированность вирусами простого герпеса (97,08% ВПГ1, 38,68% ВПГ2) изменяет популяционный иммунитет, отменяя толерантность к неинфекционным антигенам и способствуя формированию аллергической сенсибилизации. В 39% случаев отмечается латентное течение герпетической инфекции или состояние динамического равновесия вирус - иммунная система хозяина; у 61% обследованных герпетическая инфекция протекает в клинически явной форме, из них у 18,5% диагностируется рецидивирующее течение инфекции.
Инфицированность лиц с бронхиальной астмой ВПГ1 составляет 100%.
2. У 64% обследованных пациентов обнаружены высокие титры специфических IgG к ВПГ1, 2 (1 : 1600Ц1 : 12800), у 3% - отсутствие противогерпетических антител в крови, совпадающее с отсутствием клинических проявлений герпетической инфекции в течение жизни.
Титры специфических антител к ВПГ1 не зависят от стажа клинических проявлений и типа течения герпетической инфекции, являются лантителами-свидетелями активности гуморального иммунного ответа, начиная с периода латентного течения инфекции.
3. Положительная аллергическая сенсибилизация к неинфекционным аллергенам обнаруживается в 74% случаев, из них в 49% аллергические заболевания ранее не диагностировались.
Преобладает аллергическая сенсибилизация к бытовым и пыльцевым аллергенам. Рецидивирующее течение герпетической инфекции устанавливается в 22,9% случаев при положительной аллергосенсибилизации и у 31,0% пациентов, страдающих бронхиальной астмой. В отсутствие аллергической сенсибилизации рецидивирующее течение герпетической инфекции выявлено в 11,5% случаев. В период манифестного рецидивирующего течения герпетической инфекции число лиц с положительной сенсибилизацией к неинфекционным аллергенам увеличивается до 46%. Эпизодическая реактивация герпетической инфекции связана с повышением уровней IgE, титра специфических антител к ВПГ1 в крови, IL4 как в сыворотке крови, так и в индуцированных тестах с вирусным антигеном.
4. Больные с аллергической сенсибилизацией характеризуются отрицательной динамикой уровней IFN и IFN в сыворотке крови в ранний восстановительный период и период реабилитации после обострения герпетической инфекции, что сочетается со снижением количества и функциональной активности NK-лимфоцитов. При положительной аллергической сенсибилизации в индуцированных тестах с вирусным антигеном снижение продукции IFN in vitro регистрируется при всех формах герпетической инфекции, начиная с латентного ее течения.
5. Рецидивирующие формы герпетической инфекции независимо от наличия аллергической сенсибилизации характеризуются однотипными изменениями индуцированной продукции IFN, IL4, TNF in vitro и снижением коэффициента IFN/IL4. Гетерогенность значений коэффициента IFN/IL4 позволяет дифференцировать типы иммунного ответа (гуморальный, клеточный, комбинированный) у лиц с рецидивирующим течением герпетической инфекции в индуцированных тестах с вирусным антигеном и использовать их для прогноза течения инфекции и подбора индивидуальной адресной терапии.
6. У лиц с рецидивирующим течением герпетической инфекции частота носительства генотипа T/С и аллеля С гена IFNG, генотипа T/T аллеля Т гена TLR9, генотипа G/A и аллеля G гена TBX21, генотипа Т/С и аллеля Т гена IL4 выше по сравнению с таковыми у лиц с латентным течением инфекции. Рецидивирующее течение герпетической инфекции у пациентов с бронхиальной астмой ассоциировано с увеличением частоты носительства генотипа С/С и аллеля С гена IL12B, генотипа С/С и аллеля С гена IFNG, генотипа Т/T и аллеля Т гена IL4, генотипя I/I и аллеля I гена IL4RA по сравнению с таковым у лиц с латентным течением инфекции.
7. Риск формирования аллергической сенсибилизации у пациентов с эпизодической реактивацией и рецидивирующим течением герпетической инфекции ассоциирован с модулирующим влиянием полиморфизма T/Т гена IL4 и V/V гена IL4RA на продукцию IgE.
8. Об эффективности противовирусной и иммуномодулирующей терапии, связанной с дальнейшим прогнозом инфекционного процесса, свидетельствуют повышение пролиферативной активности Т-лимфоцитов, снижение продукции IL4 и повышение продукции IFN и TNF в индуцированных тестах с вирусным антигеном in vitro.
9. Эффективность аллергенспецифической иммунотерапии у лиц с аллергическим ринитом и бронхиальной астмой, ассоциированными с герпетической инфекцией, зависит от частоты клинических манифестаций инфекции, подтверждается снижением уровня IFN в мукозальном секрете, повышением титров специфических антител к ВПГ1 в крови на фоне стандартной схемы получаемых доз лечебного аллергена.
Практические рекомендации В результате проведенного исследования сформулированы практические рекомендации для повышения эффективности АСИТ причинными неинфекционными аллергенами:
1. Пациентам, имеющим сочетание аллергических заболеваний с эпизодической или рецидивирующей герпетической инфекцией, на первом этапе целесообразно проведение коррекции интерферонового статуса с помощью адресных иммуномодуляторов.
2. Набор дозы ПЗА необходимо сочетать с назначением заместительного рекомбинантного IFN в течение всего цикла. В случае обострения герпетической инфекции по время АСИТ назначать курс противовирусной терапии ацикловиром (валтрексом) с поддерживающей схемой до конца основного курса АСИТ и контроля динамики специфического IgG к ВПГ1, -2.
3. Пациентам, имеющим сочетание аллергии с герпетической инфекцией, требуется динамический контроль содержания IgG к ВПГ1, -2 в крови на разных этапах набора максимальной дозы причинно-значимого аллергена.
4. Терапия должна быть индивидуальной, комплексной и основываться на конкретных клинических проявлениях вирусной инфекции, на оценке индуцированной вирусным антигеном продукции IFN, IFN и IL4 in vitro.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Особенности формирования иммунного ответа на герпес-антиген / Н.А. Черевко, Т.В. Кошовкина, Н.С. Кошкарова и др. // Аллергология и иммунология. - 2004. - Т. 5, №1 - С. 119.
2. Прогностические возможности оценки алгоритмов иммунного ответа у пациентов с герпетической инфекцией / Н.А. Черевко, Т.В. Кошовкина, Н.С. Кошкарова // Международный конгресс Иммунитет и болезни: от теории к терапии, Сб. трудов, Москва, 2005.Ц С. 205.
3. Опыт применения Реаферона-ЕС липинта у пациентов с аллергическими заболеваниями / Н.А. Черевко, Т.В. Кошовкина, Н.С. Кошкарова и др. // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т. 6, №2. - С. 165.
4. Особенности профиля цитокинов назального секрета у пациентов с аллергическим ринитом / О.В. Астафурова, В.В. Климов, А.В. Староха, Н.А. Черевко, А.В. Давыдов // Аллергология. 2005. №3. С. 14Ц18.
5. Эффективность специфической иммунотерапии у пациентов с аллергическим ринитом, осложненным герпес-инфицированием / Н.А. Черевко, О.В. Астафурова, Т.В. Кошовкина, Н.С. Кошкарова // VII Конгресс Современные проблемы аллергологии и иммунологии. Сб.
трудов. Аллергология и иммунология. 2006. Т. 7. №3. С. 282.
6. Изучение распространенности аллергической патологии и описторхозной инвазии и их взаимосвязи у населения Томской области / Л.М. Огородова, М.Б. Фрейдин, А.Э. Сазонов, О.С. Фёдорова, И.Э. Гербек, Н.А. Черевко, А.А. Рудко, и др. // Бюл. сиб. медицины. - 2006. Т. 5.
Ц №4. - С. 48Ц51.
7. A pilot screening of prevalence of atopic states and opisthorchosis and their relationship in people of Tomsk / L.M. Ogorodova, M.B. Freidin, A.E. Sazonov, O.S. Fedorova, I.E. Gerbek, N.A. Cherevko, N.Y. Lebedeva // Parasitology Research. 2007. V. 101. №4. P. 1165Ц1168.
8. Влияние инфекций на манифестацию аллергических заболеваний / Н.А. Черевко, С. Романова, Н. Теплова и др. // Рос. аллергол. журн. - 2007. - №3. Прил. 1. - С. 272.
9. Оценка особенностей инфицированности и клинических проявлений герпес-инфекции у жителей г. Томска / Н.А. Черевко, Л.М. Огородова, М.Б. Фрейдин, А.Э. Сазонов, О.С. Фёдорова, В.В. Климов // Рос. иммунол. журн. - 2008. - Т. 2. №2Ц3. - С. 111Ц112.
10. Evalution of peculiarities of infectioness and clinical manifestation of the herpes virial infection among tomsk city inhabitans / L.M. Ogorodova, M.B. Freidin, N.A. Cherevko, A.E. Sazonov, O.S. Fedorova, V.V. Klimov // 5th Russian-German conference HUMAN HERPESVIRUS INFECTIONS. Moscow. Abstracts. - 2008. P. 16Ц17.
11. Особенности алгоритмов иммунного ответа у пациентов с герпетической инфекцией / Н.А. Черевко, С.О. Романова // Рос. аллергол. журн. - 2008. - №1. - С. 333Ц336.
12. Характеристика эпидемиологических и молекулярных взаимоотношений аллергических и гельминтных болезней в эндемическом очаге описторхоза / Л.М. Огородова, О.С. Фёдорова, М.Б. Фрейдин, М.В. Васильева, Н.А. Черевко, А.Э. Сазонов и др. // Бюл. сиб. медицины. - 2008.
Т. 7. №4. С. 37Ц43.
13. Связь полиморфизма генов цитокинов с особенностями клинического течения герпетической инфекции / Н.А. Черевко, М.Б. Фрейдин, Е.Ю. Брагина, В.В. Климов // Цитокины и воспаление. - 2009. - Т. 8. - №4. - С. 32Ц37.
14. Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы / Огородова Л.М., Фрейдин М.Б., Черевко Н.А., Васильева М.В., Брагина Е.Ю., Салтыкова И.В. // Патент на изобретение №200814685/15(063743), 2009 г.
15. Аудит знаний основных положений GINA у врачей Томской области / Л.В. Абашина, О.С. Кобякова, И.А. Деев, И.Л. Коломеец, Е.А. Старовойтова, Н.А. Черевко, Ю.А. Петровская, Л.Ю. Никитина // Бюл. сиб. медицины. - 2009. - Т. 8. №4(2). - С. 96Ц102.
16. Особенности эпидемиологических и клинико-иммунологических взаимосвязей инфекций, вызванных вирусами герпеса и описторхисами у жителей города Томска / Н.А. Черевко, Л.М. Огородова, М.В. Васильева // Бюл. сиб. медицины. - 2010. - Т. 9, №5. - С. 108Ц112.
17. Особенности аллергенспецифической иммунотерапии у больных с аллергической патологией, отягощенной герпетической инфекцией / Н.А. Черевко, С.О. Романова, Т.В. Кошовкина, Н.С. Кошкарова, В.В. Климов, О.В. Астафурова // Вестн. Уральской мед.
академ. науки. - 2010. - №2/1(29). - С. 280Ц282.
18. Особенности изменения популяционного иммунитета населения на фоне гепресинфицирования / Н.А. Черевко, С.В. Гусакова, И.С. Попова, В.В. Климов // Рос. аллергол.
журн. - 2010. - №1, вып.1. С. 207Ц208.
19. Особенности цитокинового профиля при различных типах клинического течения герпесвирусной инфекции / Н.А. Черевко, Л.М. Огородова, В.В. Климов // Врач. - 2010. - №4.
Ц С. 45Ц46.
20. Особенности полиморфизма генов цитокинов IFNG, IL12B, TBX21 и особенности течения герпетической инфекции / Н.А. Черевко, Ю.А. Яковлева, И.В. Салтыкова, Е.Ю. Брагина // Цитокины и воспаление. - 2010. - Т. 9, №3. - С. 58.
21. Особенности полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов при герпетической инфекции / Черевко Н.А. // Актуальные проблемы химии, биологии и медицины: монография.
Ц Красноярск: Научно-инновационный центр. 2011. - С. 262Ц276.
22. Эпидемиологические и клинико-иммунологические особенности течения герпесинфекций у жителей г. Томска // Н.А. Черевко // Вестн. новых мед. технологий. - 2011.- Т. XVIII, №2. - С.234Ц236.
23. Способ лечения хронического описторхоза у больных с хроническим аутоиммунным тиреоидитом / Соломина М.С., Иванова О.И., Черевко Н.А. // Патент № 2414219. Заявка № 2010108660 приоритет от 09.03.2010 г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20.03.2011 г.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АГ - антиген ПЗА - причинно-значимый аллерген АЗ - аллергические заболевания РБТЛ - реакция бластной трансформации АР - аллергический ринит лимфоцитов АСИТ - аллерген-специфическая иммуноте- САР - сезонный аллергический ринит рапия ФГА - фитагемагглютенин БА - бронхиальная астма Ig - иммуноглобулин БГЛ - большие гранулярные лимфоциты IFN - интерферон ГИ - герпетическая инфекция NK - натуральные киллеры ГВ - герпесвирусы Th - Т-лимфоциты-хелперы ИО - иммунный ответ Th1 - Т-лимфоциты-хелперы 1-типа ИФА - иммуноферментный анализ Th2 - Т-лимфоциты-хелперы 2-типа ИЦ - индекс цитотоксичности TLR - Toll-подобные рецепторы (Toll-like КАР - круглогодичный аллергический ринит receptors) КАП - кожные аллергопробы TNF - фактор некроза опухолей (ФНО)
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине