Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ХУСАИНОВ ФИДАИЛЬ МИННИГАЛЕЕВИЧ
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ХЛАМИДИЙ, РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ХЛАМИДИОЗОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
03.00.07.-микробиология
16.00.03.-ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология.
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора ветеринарных наук
Казань-2007
Работа выполнена в лаборатории контроля и индикации возбудителей вирусных и хламидийных инфекций в объектах ветеринарного надзора ФГУ "Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных", на кафедре патологической анатомии имени К.Г.Боля Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана.
| Научные консультанты: | -доктор ветеринарных наук, профессор, Х.З.Гаффаров -доктор ветеринарных наук, профессор, Ф.З.Авзалов |
Официальные оппоненты: Ведущее учреждение: | -доктор ветеринарных наук, профессор К.М. Салмаков -доктор ветеринарных наук, профессор М.В. Харитонов -доктор ветеринарных наук, профессор П.М. Митрофанов -Пермская государственная сельскохозяйственная академия |
Защита состоится " 25 " сентября 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГУ "Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных" (ФГУ "ФЦТРБЦВНИВИ") (420075, г. Казань, Научный городокЦ2).
С диссертацией можно ознакомиться библиотеке ФГУ "ФЦТРБЦВНИВИ"
(г. Казань).
Автореферат разослан "____"_____________2007 года
Ученый секретарь диссертационного совета к.в.н., с.н.с. | Степанов В.И. |
3
1.Общая характеристика работы
Актуальность темы. Хламидиозы с.-х. животных относятся к группе заболеваний зооантропонозов и представляют потенциальную угрозу здоровью человека из-за возможности заболевания людей в результате контакта с животными и птицами, пораженными ими (Шаткин А.А., 1989).
Паразитируя в организме, хламидии вызывают обширный спектр проявлений болезней: аборты, пневмонии, энтериты, артриты, конъюнктивиты, энцефалиты и др. У животных они способствуют бесплодию, снижению продуктивности, племенной ценности, нередко и гибели. В 70Ц80 годы прошлого века, отечественными учеными описаны и изучены большинство хламидийных инфекций с.-х. животных (Терских И.И. 1964; Гаффаров Х.З., 1969,1986; Боровик Р.В. и др. 1975; Митрофанов П.М., 1980; Караваев, Ю.Д., Налетов Н.И., 1981; Авзалов Ф.З., Курбанов И.А. и др.,1980; Шафикова Р.А. и др.,1987; Хамадеев Р.Х., 1990). Однако, несмотря на очевидные успехи в изучении хламидиозов животных, уровень массовой диагностики и имеющиеся эффективные средства специфической профилактики хламидиозов не удовлетворяют требованиям практической ветеринарии.
Приоритетным в профилактике и ликвидации хламидиозов с.-х. животных остается применение вакцинных препаратов. Использование антибиотиков с профилактической и лечебной целью при хламидиозах животных экономически не оправдано и далеко не всегда эффективно (Караваев Ю.Д. и др. 2006). В настоящее время проблема по созданию высокоэффективных биопрепаратов против хламидиозов крупного рогатого скота, свиней и лошадей приобретают особую актуальность. Таким образом, разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики и специфической профилактики хламидиозов с.-х. животных, а также внедрения их в ветеринарную практику остаются в центре внимания научного поиска.
Цель и задачи исследований. Цель исследований изучить иммунобиологические свойства выделенных нами штаммов хламидий и на их основе разработать и усовершенствовать средства лабораторной диагностики и специфической профилактики хламидиозов сельскохозяйственных животных.
При этом предусматривалось решить следующие задачи:
изучить клинико-эпизоотологические проявления различных форм хламидиозов крупного рогатого скота, свиней и лошадей в хозяйствах региона Среднего Поволжья и Предуралья;
выделить хламидий и изучить их иммунобиологические свойства, отобрать штаммы, обладающие антигенными и иммуногенными свойствами для возможного использования в качестве производственных;
Цразработать технологию изготовления набора препаратов для диагностики хламидиозов животных в РНГА, испытать его эффективность в лабораторно-производственных условиях;
Цразработать научную основу технологии производства моно- и полиштаммовых вакцин для специфической профилактики хламидиозов крупного рогатого скота и свиней;
испытать экспериментальные и опытно-промышленные серии моно- и полиштаммовых противохламидиозных вакцин в различных регионах РФ и внедрить их в производство.
Научная новизна. Впервые выделены ранее неизвестные инфекционные агенты, являющиеся возбудителями болезней крупного рогатого скота, свиней и лошадей в хозяйствах региона Среднего Поволжья и Предуралья, которые по своим иммунобиологическим характеристикам (морфо-тинкториальным свойствам, патогенность для лабораторных животных, токсичность, групповая антигенная специфичность), а некоторые из них по фрагментам ДНК, выявленным специфическими праймерами (ПЦР), идентифицированы как представители рода Chlamydia (Chlamydophila).
Разработана технология получения эритроцитарного корпускулярного хламидийного антигена на основе возбудителя хламидиозного конъюнктивита крупного рогатого скота (штамм "СКЦ89") для изготовления "Набора препаратов для диагностики хламидиозов животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)". Подтверждена его высокая активность, специфичность и чувствительность (в 2Ц3 раза) по сравнению с существующим диагностикумом "Набором для серологической диагностики с.-х. животных в РСК".
Разработан способ повышения выхода биомассы хламидий, отличающийся от существующей технологии её получения (авторское свидетельство № 1641883 с приоритетом от 24.10.88 г.)
Усовершенствована технология изготовления и применения инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота, позволяющей повысить иммуногенную активность вакцины путем установления оптимальной концентрации хламидийного антигена и дозу вакцины, обеспечивающей формирование напряженного противохламидийного иммунитета у животных в период беременности и в первые дни жизни молодняка (патент на изобретение № 2092188 с приоритетом от 29.10.1991г.).
Впервые, на основе антигенов штаммов хламидий "МЗ-89", "СК-89" и "250", выделенных, соответственно, при менингоэнцефалите, конъюнктивите и аборте крупного рогатого скота, разработана полиштаммовая инактивированная эмульсионная вакцина против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота, обладающая широким антигенным спектром, обеспечивающая максимальную иммунологическую защиту вакцинированных животных от различных клинических форм проявления хламидийной инфекции (положительное решение ФИПС РФ о выдаче патента с приоритетом от 06.12.2005г.).
Используя антигены двух штаммов хламидий "РС-85" и "ЛС-87", выделенных при абортах и пневмонии свиней, впервые разработана инактивированная эмульсионная вакцина для специфической профилактики хламидиоза у свиней, содержащая оптимальное соотношение и концентрацию хламидийных антигенов в одной дозе вакцины и обеспечивающая при однократной инъекции стойкий иммунитет в период супоросности (патент на изобретение № 2247577 с приоритетом от 20.12.2002 г.).
Комплексными иммуноморфологическими исследованиями установлено, что инактивированная эмульсионная вакцина против хламидиоза свиней вызывает выраженную иммунологическую перестройку в организме привитых свиней, проявляющаяся усилением структурно-функциональной активностью иммунокомпетентных клеток в лимфоидных органах в виде лимфоидно-гиперпластической, плазмоцитарной и макрофагальной реакции, создавая тем самым морфологическую основу для формирования у них напряженного иммунитета против заражения хламидиями и не обладает побочным действием.
Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработана и усовершенствована технология изготовления и применения моно-полиштаммовых вакцины для специфической профилактики хламидиозов крупного и мелкого рогатого скота и свиней. Использование их в системе противохламидийных мероприятий в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах, способствует сокращению количества абортов и мертворождаемости у маточного поголовья и увеличению в 2-4 раза рождаемости и сохранности молодняка.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных научных конференциях ФГУ "ФЦТРБЦВНИВИ" (1987-2006гг.); региональных и республиканских научно-практических конференциях (Казань, 1987,1988,1989,1990; Троицк,1989; Киров, 1998); Всесоюзных и Всероссийских научных конференциях (Москва, 1987; Новосибирск, 1991; Харьков 1991; Владимир, 1995; Щелково, 1996,2001;2005; Казань 2002; Екатеринбург,1999); Международных научных конференциях (Москва, 1991; Воронеж, 1997; Казань, 1998, 2000; Ульяновск, 2006); съездах (Казань, 1995, 2000).
Результаты основных этапов исследований прошли комиссионную проверку с участием представителей ВГНКИ ветпрепаратов и ЦВЛ (г.Москва), заслушивались на заседаниях Ученых Советов ФГУ ФЦТРБ-ВНИВИ (1994-2000 гг.). На ВДНХ СССР в 1991г. "Вакцина против хламидиозов крупного рогатого скота" была отмечена серебряной медалью № 8092; "Вакцина полиштаммовая против хламидиоза крупного рогатого скота" представленная на ВВ - в (1994г.) была удостоена медали "ЛАУРЕАТ ВВЦ" № 2357; "Вакцина против хламидиоза свиней"(1999г.) удостоена медали "ЛАУРЕАТ ВВЦ" №1983.
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликована 51 работа, получены три патента на изобретение РФ, одно авторское свидетельство.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-результаты выделения и изучения иммунобиологических свойств хламидий, являющиеся этиологическими агентами болезней крупного рогатого скота, свиней и лошадей в хозяйствах Среднего Поволжья и Предуралья;
-разработка лабораторного регламента получения эритроцитарного хламидийного антигена и испытание "Набора препаратов для диагностики хламидиозов с.-х. животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)";
-разработка и усовершенствование технологии изготовления и применения вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота и оценка её эффективности в производственных условиях;
-разработка научной основы технологии изготовления и испытание эффективности полиштаммовой инактивированной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота и овец и свиней в различных регионах РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (6 глав), обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и список использованной литературы (всего 532 источника, в том числе 265 иностранных). Диссертация иллюстрирована 80 таблицами, 22 рисунками.
2.Собственные исследования.
2.1. Материалы и методы.
Работа выполнялась в период 1987-2006 гг. в соответствии с государственным планом НИОКР в лаборатории контроля и индикации возбудителей вирусных и хламидийных инфекций в объектах ветеринарного надзора ФГУ "ФЦТРБЦВНИВИ" (Казань), на Херсонской биофабрике и на кафедре патологической анатомии КГАВМ им. Н.Э.Баумана, и апробирована в хозяйствах, неблагополучных по хламидиозам с.-х.животных в регионах Среднего Поволжья и Предуралья.
В опытах были использованы 70000 шести-семи суточные развивающиеся КЭ, экспериментально зараженные и естественно больные животные, белые мыши -1620, морские свинки - 400, овцы- 1510, крупный рогатый скот -112020, свиньи -21661, лошади -990.
При выполнении работы были использованы 12 штаммов хламидий, адаптированных к размножению на КЭ.
При эпизоотологическом обследовании хозяйств, руководствовались "Методическими указаниями по эпизоотологическому обследованию (И.А.Бакулов, Г.Г.Юрков и др.,1986).
Исследованию было подвергнуто 400 проб патологического и клинического материала, 2914 проб сывороток крови, полученных от крупного рогатого скота, 464 от свиней и 350 проб от лошадей.
Для изоляции и индикации хламидий использовали КЭ, реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментный анализ (ИФА). Хламидийные антитела выявляли в реакциях связывания комплемента (РСК, РДСК), непрямой гемаглютинации (РНГА) и в тест - системе ИФА.
Молекулярно-генетическую идентификацию штаммов хламидий 250, "СК89, МЗ89, ЛС87, РС85 проводили методом полимеразной цепной реакцией (ПЦР). ДНК хламидий экстрагировали гуанидининизотиоцианатным методом (Рибосорб ЦНИИЭМ, Россия). ПЦР осуществляли с использованием специфичных к Chlamydia psittaci олигонуклеотидных праймеров, сконструированных (R.G.Hewinson еt. al., 1997). CPF: 5/-GAAGACACTCCTCAAAGCC-3/ и CPR:5/-CCTTCCCACATAGTGCCCATC-3//
Патогенность, иммуногенность и перекрестный иммунитет между штаммами хламидий, определяли на белых мышах, морских свинках, используя разные способы введения 10% -ной взвеси хламидий с инфекционным титром не ниже 10-5,0 10-6,5 ЭЛД50/0,3 мл. Токсичность штаммов хламидий, выделенных от крупного рогатого скота и свиней проверяли на белых мышах общепринятым методом.
При получении хламидийного эритроцитарного антигена использовали способ культивирования хламидий разработанный нами (Р.Х.Хамадеев с соавт.,1990), а хламидиосодержащий материал очищали методом Poffenroth L., с соавт. (1973). Корпускулярный хламидийный антиген готовили из аллантоисной жидкости РЭК (Хамадеев Р.Х соавт., 1995). Стандартизацию антигенов проводили по оптической плотности на ФЭК56М. Танизацию эритроцитов осуществляли по методу описанному Г.Фримелем (1984). Специфические хламидийные и контрольные сыворотки получали на овцах и крупном рогатом скоте. Активность и специфичность хламидийных сывороток оценивали в РСК, РНГА и ИФА. Очистку хламидийных сывороток от неспецифических антител выполняли, используя иммуносорбент (А.Е.Гурвич, 1986).
Опытные серии Набор препаратов для диагностики хламидиоза животных в РНГА изготавливались согласно НТД (утв. директором ВНИВИ и согласовано с департаментом ветеринарии МСХ РФ от 15.03.01.). "Набор препаратов для диагностики хламидиоза с.-х. животных в РНГА" испытывались комиссионно в областных и республиканских ветлабораториях Пермской, Кировской, Ульяновской областей, Республики Татарстан и в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории (г. Москва).
Иммуногенные и антигенные свойства инактивированных эмульсионных моно- и полиштаммовых вакцин против хламидиозов крупного рогатого скота и свиней изучали на крупном рогатом скоте, овцах и свиньях.
Экспериментальные исследования по усовершенствованию технологии изготовления и способа применения вакцины против хламидиозов крупного рогатого скота, выполненные в условиях лаборатории и неблагополучных по хламидиозу хозяйствах нашли отражение в НТД, утвержденных ГУВ МСХ СССР от 13.10.91г. У вакцинированных животных наблюдали поствакцинальную реакцию на введения биопрепарата и изучали в динамике накопления специфических противохламидийных антител.
Полиштаммовую вакцину против хламидиоза крупного рогатого скота, овец и свиней применяли и изготавливали согласно НТД, утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России от 14.07.99г., 16.05.2000г. и директором ВНИВИ (г. Казань) от 28.11.94 г., 28.03.95 г.
(ТУ 9388-003-00-00492374-00).
Иммуногенные и антигенные свойства инактивированных эмульсионных моно- и полиштаммовых вакцин, изучали в лабораторных опытах на нетелях, телятах, овцах и свиньях. Контроль вакцин на стерильность и безвредность осуществляли согласно ТУ 10Ц07Ц253Ц91.
Иммуноморфологическую оценку иммуногенных свойств, аллергизирующих и других побочных влияний инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней прослеживали патологоанатомическими, гистологическими и гистохимическими методами. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином, по Романовскому-Гимза, Ван-Гизону (Г.А.Меркулов, 1969). Наличие РНК определяли по Браше, ДНК - по Фельгену, жиры - суданом-III, гликоген ШИК-реакцией по Шабадашу.(1947). Кислую и щелочную фосфатазы определяли по Гомори.
Широкие производственные испытания эффективности моно-полиштаммовых инактивированных эмульсионных вакцин против хламидиозов рогатого скота и свиней, изготовленной в ФГУ ФЦТРБЦВНИВИ(г.Казань), проводили в условиях 24-х неблагополучных по хламидиозу хозяйствах зоны Среднего Поволжья и Предуралья РФ.
Оценку иммуногенной эффективности моно- и полиштаммовых вакцин проводили в неблагополучных хозяйствах на основании фактических данных по количеству абортов и мертворождаемости, а также вынужденному убою животных до и после применения вакцины.
В выполнении отдельных этапов научно-исследовательской работы принимали участие Ф.З. Авзалов, В.В.Евстифеев, Л.А.Барбарова, Р.М. Ахмадеев, Р.Р.Вафин, Р.Х.Хамадеев, А.З.Равилов.
Статистическую обработку цифрового материала, полученного в процессе исследований, проводили общепринятыми методами вариационной статистики согласно критерия Стьюдента при помощи прикладных программ Microsoft Excel 2000.
2.2.Результаты исследований.
2.2.1. Выделение и идентификация хламидий из патологического материала при различных клинических формах проявления заболеваний крупного рогатого скота, свиней и лошадей в хозяйствах региона Среднего Поволжья и Предуралья.
Изучение и анализ эпизоотической ситуации по хламидиозу с.-х. животных проводили в хозяйствах Ульяновской, Кировской, Пермской областей; республик Чувашия, Башкортостан, Удмуртия, Татарстан, МарийЦЭл. В результате было установлено, что при исследовании в РСК сывороток крови на хламидиоз, в диагностических титрах реагировали крупный рогатый скот - от 4 до 18%, свиньи - от 1 до 6% и овцы - от 2,0 до 20%.
Этиологическая роль хламидий в патологии крупного рогатого скота, свиней и овец в регионе была подтверждена выделением возбудителя из патологического материала: в среднем у крупного рогатого скота от 3 до 37% случаев, у свиней от 1 до 35 и у овец до 25% случаев из числа исследованных животных.
В ряде хозяйств Республики Татарстан ежегодно регистрировался высокий процент заболеваемости и падежа среди телят. Лабораторными исследованиями были исключены общеизвестные бактериальные и вирусные инфекции. Серопозитивность к возбудителю хламидиоза у телят в этих хозяйствах, где наблюдались заболевания, проявляющиеся полиартритами, конъюнктивитами, энцефаломиелитами и пневмоэнтеритами, колебалась в пределах 50-52% в титре 3,80,6 лог2. Из патологического материала от павших и вынуждено убитых телят в 65% случаев наличие хламидий было подтверждено микроскопически и в РИФ, а в 42% проб были выделены патогенные изоляты хламидий, условно названные "УП-89", "СК-89", "МЗ-89", и идентифицированы в последующем как представители рода Chlamydia (Chlamydophila).
Изучение этиологии различных клинических форм патологии свиней проводили в хозяйствах республики Татарстан, Марий-Эл, Башкортостана и Ульяновской области. Клинико-эпизоотологически было обследовано три крупных свиноводческих комплекса ("Сосновоборский", "Звениговский", "Рощинский"), где регистрировались аборты, мертворождения и респираторно-кишечные заболевания невыясненной этиологии у 3,2-10% животных. При этом имели место бронхопневмонии, полиартриты, конъюнктивиты и гибель животных разных половозрастных групп от 10 до 14%. У хряков производителей заболевание чаще всего протекало бессимптомно.
При серологическом исследовании в РДСК с хламидиозным антигеном 604 пробы сыворотки крови, полученные из 24 хозяйств, у 29% взрослых свиней выявили специфические хламидийные антитела в титрах 1:5-1:40. Эти показатели у свиноматок составили 28%, у хряков-производителей - 21% и у поросят- 14%. В большинстве случаев хламидиоз свиней подтверждали выделением возбудителя от абортированных плодов и пораженного участка легочной ткани вынуждено убитых и павших поросят. В результате комплексного изучения этиологии респираторно-кишечных заболеваний свиней в хозяйствах Среднего Поволжья и Предуралья нами выделены и идентифицированы патогенные штаммы хламидий: "РС-85", "ЛС-87"и "ПСС-89".
Заболевание лошадей неизвестной этиологии изучали в трех хозяйствах Пермской области и республики Татарстан, которое клинически проявлялось в виде спорадических абортов, рождением мертвых и нежизнеспособных жеребят у 11-35% кобыл, а у 7 23% народившегося молодняка с признаками полиартрита и бронхопневмонии.
При серологическом исследовании 26 проб сывороток крови, полученных от жеребцов-производителей и кобыл с неблагополучным потомством, в РСК с хламидиозным антигеном положительно реагировали 8 (30%) исследованных проб и составил 1:8,10,12 Лог2. Исследование этих сывороток крови в РНГА в 23 (88,5%) пробах были выявлены специфические хламидийные антитела со средним титром 1:3200,5 Лог2. При заражении КЭ взвесями патологических и клинических материалов удавалось выделять инфекционные биологические агенты из спермы 3-х жеребцов-производителей, а также паренхиматозных органов (легкие, печень) и суставной жидкости павшего жеребенка, которые по морфологическим признакам оказались сходными с хламидиями. На основании морфологических признаков, тинкториальных особенностей и некоторых биологических свойств, выделенный из суставной жидкости скакательного сустава жеребенка изолят, условно названный "КС-98", нами был идентифицирован как представитель рода Chlamydia (Chlamydophila).
Таким образом, по результатам лабораторных исследований у лошадей конезавода Пермской области и в двух других неблагополучных хозяйствах была установлена хламидиозная инфекция, сопровождаемая энзоотически протекающими абортами, мертворождаемостью и рождением нежизнеспособного приплода. У жеребят заболевание проявлялось в виде полиартритов, пневмоний, конъюнктивита и гибелью, у жеребцов-производителей поражением половых органов и контаминацией спермы хламидиями.
2.2.2. Биологические свойства и молекулярно-генетический анализ штаммов хламидий, изолированных от крупного рогатого скота, свиней и лошадей.
Из лабораторных животных наиболее чувствительными к выделенным штаммам хламидий оказались белые мыши и морские свинки. С их помощью устанавливали вирулентность, антигенные и иммуногенные свойства хламидий.
При этом степень вирулентности хламидий к белым мышам зависела от вида животного, у которого они выделены, и способах их заражения. Мыши были наиболее чувствительны к штаммам, выделенным от крупного рогатого скота, свиней и лошадей. Более эффективными оказались (в порядке убывания) внутривенный (в/в), интрацеребральный (и/ц), интраназальный (и\н), внутрибрюшинный (в/б) и подкожный (п/к) способы инъекции инфекционного материала. Так, процент гибели белых мышей от различных штаммов при в/в инъекции варьировал от 80 до 100, при и/ц - 25-98, и/н- 50-80, в/б - 10-93, п/к -от 5 до 40.
Эксперименты по изучению спектра патогенности изучаемых штаммов хламидий по отношению к морским свинкам, также показали неодинаковую их чувствительность при разных способах введения: интраназальном и внутрибрюшинном заражении - лишь штамм "СК-89" оказался патогенным для морских свинок (установлена гибель 40-50 % животных): интраназальном способе введения штаммы хламидий "УП-89" и "КС-98" вызывали гибель 50-80% животных. Некоторые штаммы хламидий ("Г-88","МЗ-89","РС-85","ЛС-87") при внутрибрюшинном способе заражении не вызывали гибель морских свинок.
Существенные различия в течении заболевания наблюдали при внутривенном заражении телят и свиноматок соответственно штаммами "МЗ-89", "СК-89","УПЦ89"и "РСЦ85","ЛСЦ87". У животных, зараженных штаммами хламидий "МЗ-89", при заболевании доминировали признаки менингоэнцефалита, СК-89конъюнктивита, "УПЦ89" - полиартрита, у супоросных свиноматок, зараженных штаммом "РСЦ85" наблюдали аборты, рождение нежизнеспособных поросят, а штаммом ЛСЦ87 пневмонию и рождение мертвых поросят.
Таким образом, при изучении биологических свойств штаммов "РСЦ85" и "ЛСЦ87" были установлены различия в патогенности и вирулентности по отношению к экспериментальным и естественным хозяевам. Результаты экспериментальных исследований обобщены в таблице 1.
Таблица 1
Спектр патогенности новых штаммов хламидий
Штаммы | С.-х. животное, клиника | Способ заражения | Патогенность | |||
Гибель, (%) | клиника заболевания | |||||
б.мыши | морские свинки | круп. рог. скот | свиньи | |||
"МЗ-89" | круп. рог.скот менингоэнцефалит | интраназально | 7080 | 0 | менингоэнцефалит | - |
подкожно | 4050 | |||||
внутрибрюшинно | 60-67 | |||||
внутривенно | 100 | |||||
интрацеребрально | 75-98 | |||||
Итого | 69-79 | |||||
"СК-89" | круп. рог.скот конъюнктивит | интраназально | 90100 | 40Ц50 | - конъюнктивит - | - |
подкожно | 4050 | |||||
внутрибрюшинно | 8293 | 4050 | ||||
внутривенно | 100 | 0 | ||||
интрацеребрально | 73-98 | |||||
Итого | 77-88 | |||||
"УП-89" | круп рог.скот полиартрит | интраназально | 70Ц80 | 40-50 | полиартрит | - |
подкожно | 30Ц40 | 0 | ||||
внутрибрюшинно | 64Ц67 | |||||
внутривенно | 100 | |||||
интрацеребрально | 75-98 | |||||
итого | 68-77 | |||||
"Г-88" | круп. рог.скот аборт | интраназально | 70-80 | 0 | аборт | - |
подкожно | 10-50 | |||||
внутрибрюшинно | 82-97 | |||||
внутривенно | 80-86 | |||||
интрацеребрально | 70-98 | |||||
Итого | 64-82 | |||||
"КС-89" | ошадь артрит | интраназально | 90-100 | 50-80 | - | - |
подкожно | 5-6 | 0 | ||||
внутрибрюшинно | 10-20 | |||||
внутривенно | 80-86 | |||||
интрацеребрально | 40-50 | |||||
итого | 45-62 | |||||
"ЛС-87" | свинья пневмония | интраназально | 80-100 | 0 | - | пневмония, рождение мертвых поросят |
подкожно | 30-40 | |||||
внутрибрюшинно | 30-40 | |||||
внутривенно | 80-86 | |||||
интрацеребрально | 30-40 | |||||
итого | 56-61 | |||||
"РС-85" | свинья аборт | интраназально | 50-60 | 0 | - | аборты, рождение нежизнеспособ-ных поросят |
подкожно | 40-50 | |||||
внутрибрюшинно | 60-70 | |||||
внутривенно | 80-86 | |||||
интрацеребрально | 25-30 | |||||
итого | 51-60 | |||||
Обозначения: - не изучалось.
Сравнительное изучение антигенной активности выделенных нами штаммов хламидий в перекрестном исследовании в РСК с использованием гипериммунных сывороток морских свинок, полученных от возбудителей хламидиозов крупного и мелкого рогатого скота, свиней и птиц, с группоспецифическим антигеном из этих же штаммов, выявило их антигенное родство с эталонными представителями рода Chlamydia (Chlamydophila). При этом отмечали не высокую активность орнитозного антигена (шт. Лори) и титр комплементсвязывающих антител в гипериммунных сыворотках был на 23 порядка ниже, чем при исследовании с антигенами изготовленными из других штаммов хламидий. Кроме этого, обнаружена более выраженная антигенная активность у штамма хламидий "МЗ-89" выделенного при менингоэнцефалите крупного рогатого скота. Антигены штаммов хламидий, выделенные от крупного рогатого скота "МЗ-89", "УП-89", "СК-89" и свиней "ЛС-87", "ПСС-89" и "РС-85", реагировали между собой на один или два порядка ниже, чем с гомологичными штаммами, что указывает на возможное существование различных серотипов штаммов хламидий, поражающих крупный рогатый скот и свиней. Обобщенные данные исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2
Характеристика антигенных свойств изучаемых и известных штаммов хламидий выделенных от крупного рогатого скота и свиней
№№ п/п | Сыворотки к штаммам | Антигены из штаммов | |||||||||
МЗ-89 | "УПЦ89" | СК-89 | "Г-88" | "РСЦ85" | "ПССЦ89" | "ЛСЦ87" | "Рост.Ц70" | ори | |||
1 | "МЗ-89" | 80х | 40 | 20х | 80 | - | 80 | 20 | |||
2 | "СК-89" | 20х | 40 | 80х | 80 | 40 | 20 | ||||
3 | "УПЦ89" | 40 | 80 | 40 | 80 | 80 | 20 | ||||
4 | "Г-88" | 80 | 80 | 80 | 80 | 80 | 20 | ||||
5 | "РСЦ85" | - | 80 | 40х | 20 | 40х | 20 | ||||
6 | "ПССЦ89" | 40 | 40х | 80 | 20х | 20 | |||||
7 | "ЛСЦ87" | 20 | 40х | 80 | 40х | 20 | |||||
8 | "Рост.-70"* | 40 | 160 | 80 | 80 | 160 | 40 | ||||
9 | ори* | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 40 | 40 | |
В опытах по изучению иммуногенности штаммов хламидий установили (таблица 3), что двукратная внутрибрюшинная иммунизация мышей суспензиями хламидий штаммов "МЗ-89", 250,"УПЦ89" и "СК-89" предохраняет их: от гибели при экспериментальном заражении этими штаммами на 90-98%. При заражении их штаммами хламидий "250" и "МЗ-89" защита мышей, иммунизированных штаммом "СК-89", составляла лишь 60-68%. Аналогичные иммуногенные свойства выявляли у штаммов хламидий, выделенных при хламидиозном аборте ("РС-85", "ПСС-89") и пневмонии свиней ("ЛС-87"). Устойчивость мышей к заражению штаммами хламидий "РС-85", "ПСС-89" и "ЛС-87" составляла 92-93%, а при перекрестном заражении их защита между штаммами, вызывающие аборты "РС-85", "ПСС-89" и "ЛС-87" была значительно ниже и колебалась в пределах 60-68% (табл.3).
Таким образом, в опытах по изучению иммуногенных свойств изучаемых штаммов установили, что изготовленные на их основе препараты обеспечивают у привитых животных формирование разного по напряженности иммунитета. Эти данные свидетельствуют о неоднородности антигенной структуры изучаемых штаммов хламидий крупного рогатого скота и свиней.
Таблица 3
Характеристика иммуногенных свойств изучаемых и известных
штаммов хламидий выделенных от крупного рогатого скота и свиней
Штамм используемый для иммунизации | Процент выживаемости после контрольного заражения штаммами, Мм, % | |||||||||||
МЗ89 | СК89 | "250" | "УПЦ89" | "РСЦ85" | "ПССЦ89" | "ЛСЦ87" | ||||||
МЗ89 | 939 | 6010 | 901 | 647 | - | |||||||
СК89 | 6825 | 9825 | 602 | 901 | ||||||||
250 | 6210 | 603,5 | 921 | 9025 | ||||||||
"УПЦ89" | 972,5 | 939 | 647 | 941 | ||||||||
"РСЦ85" | - | 939 | 9210 | 681 | ||||||||
ПССЦ89" | 9825 | 9825 | 6025 | |||||||||
"ЛСЦ87" | 6210 | 603,5 | 921 | |||||||||
Контроль | 811 | 0 | 2010 | 2026 | 911 | 0 | 2010 | |||||
В последующем, выше перечисленные штаммы хламидий были отобраны для дальнейшего использования при разработке набора для серологической диагностики хламидиоза с.-х. животных в РНГА и вакцин, предназначенных для специфической профилактики хламидиоза рогатого скота и свиней.
Современные достижения молекулярной биологии открыли перспективы в решении проблем диагностики, основанной на прямой идентификации первичной субстанции, т.е. нуклеиновых кислот. Наибольшее внимание среди этих методов привлекает ПЦР, позволяющий выявлять и дифференцировать геномы возбудителей хламидиоза (Обухов И.Л.,1997; Авзалов Ф.З.,1997; Р.Р.Вафин, 2003; Everett K.D.,1999; Hartley J.C., 2001). В нашей работе результатом ПЦР со специфичными праймерами к Chlamydia psittaci CPF и CPR проб ДНК штаммов хламидий "СК-89", "МЗ-89" "ЛС-87", "РС-85" явилась амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов. В результате установлена их генетическая однородность. Следовательно, из изученных нами хламидий штаммы "СК-89", "МЗ-89" "ЛС-87", "РС-85" выделенные, соответственно от крупного рогатого скота, свиней и лошадей, обладали наиболее выраженной патогенностью для лабораторных и естественно восприимчивых животных, а также антигенной и иммунногенной активностью.
2.2.3.Усовершенствование методики получения эритроцитарного хламидийного антигена для серологической диагностики хламидиозов в РНГА.
Одной из задач наших исследований была разработка серологической диагностики хламидиозов с.-х. животных с помощью метода реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). С этой целью нами была предложена методика получения эритроцитарного антигена для РНГА с использованием группоспецифического корпускулярного хламидийного антигена. Для изготовления эритроцитарного хламидийного антигена был отобран наиболее активный для данного метода штамм хламидий "СКЦ89" обеспечивающий стабильный результат при постановке РНГА с эритроцитарным антигеном. Антигены, изготовленные из этого штамма, проявляли стабильность результата, выявляя наибольший титр специфической хламидийной сыворотки при отсутствии агглютинации с негативной сывороткой и разбавителем. Результаты этих опытов представлены в таблице 4.
Таблица 4
Сравнительная оценка в РНГА специфичности и чувствительности эритроцитарных антигенов изготовленных из штаммов хламидий, выделенных от крупного рогатого скота и свиней.
№ серии опыта | Штамм хлам. | Сывки полож .и отриц | Активность сывороток в РСК | Титры сыв.в РНГА с эритр.хлам.антигеном | Контр. с разбавит |
| 1. | "250" | S | 1:160 | 1:640 | полож. |
N | 0 | 1:10 | |||
"МЗ89" | S | 1:160 | 1:5120 | полож. | |
N | 0 | 1:5120 | |||
"СК89" | S | 1:160 | 1:640 | полож. | |
N | 0 | 1:5 | |||
"РС85" | S | 1:160 | 1:160 | полож. | |
N | 0 | 1:10 | |||
"ЛС88" | S | 1:160 | 1:160 | полож. | |
N | 0 | 1:5 | |||
Контр. | S | 1:160 | 0 | отриц. | |
N | 0 | 0 | |||
| 2. | "250" | S | 1:320 | 1:640 | полож. |
N | 0 | 1:80 | |||
"МЗ89" | S | 1:320 | 1:1280 | полож. | |
N | 0 | 1:5120 | |||
"СК89" | S | 1:320 | 1:1280 | полож. | |
N | 0 | 1:5 | |||
"РС85" | S | 1:320 | 1:320 | полож. | |
N | 0 | 1:10 | |||
"ЛС88" | S | 1:160 | 1:160 | полож. | |
N | 0 | 1:5 | |||
Контр. | S | 1:160 | 0 | отриц. | |
N | 0 | 0 | |||
| 3. | "250" | S | 1:160 | 1:320 | отриц. |
N | 0 | 0 | |||
"МЗ89" | S | 1:160 | 1:320 | отриц. | |
N | 0 | 1:10 | |||
"СК89" | S | 1:160 | 1:640 | отриц. | |
N | 0 | 0 | |||
"РС85" | S | 1:160 | 1:320 | отриц. | |
N | 0 | 1:5 | |||
"ЛС88" | N | 1:160 | 1:320 | отриц. | |
S | 0 | 0 | |||
Контр. | S | 1:160 | 1:320 | отриц. | |
N | 0 | 0 |
Контроль специфических свойств и активность экспериментальных серий эритроцитарного хламидийного антигена проводили в сравнении с РСК путем титрования гомологичных и гетерологичных иммунных сывороток крови против хламидийного антигена. Наряду с этим были использованы "полевые" сыворотки крови различных видов животных: свиней, рогатого скота и лошадей из неблагополучных по хламидиозу хозяйств. Исследования показали высокую чувствительность и групповую специфичность диагностикума для РНГА. Положительная реакция была получена со всеми гомологичными сыворотками крови: контрольной хламидийной сывороткой крупного рогатого скота, стандартной орнитозной сывороткой и с сывороткой иммунизированной против хламидиоза овец. Отрицательная реакция наблюдалась с отрицательной контрольной сывороткой, бруцеллезной и сывороткой, позитивной к вирусу ринотрахеита. При исследовании полевых сывороток различных видов животных хламидийные антитела выявлялись в титрах 1:5 - 1:320. При сравнении результатов РСК и РНГА наблюдалась корреляция полученных данных.
На основе эритроцитарного хламидийного антигена был создан "Набор препаратов для диагностики хламидиозов животных в РНГА".
Производственные испытания этого набора были проведены в 1999-2001 годы в республиканских и областных ветеринарных лабораториях республики Татарстан, Мари-Эл и Пермской области. Было исследовано более 3925 проб сыворотки крови от крупного рогатого скота, свиней и лошадей, полученных из хозяйств, в которых проявлялись клинические симптомы, характерные для хламидиозной инфекции животных. В результате исследований получено 225 положительных результата, что составило 5,6% от общего числа исследованных проб. Результаты обобщены в таблице 5.
Таблица 5
Результаты испытаний опытных серий "Набор препаратов
для диагностики хламидиоза животных в РНГА"
№ п.п. | С.-х. животные | Города | Всего | Реагировало в РНГА | |
кол-во | % | ||||
1 | к.р.с. | Казань | 2801 | 84 | 3 |
2 | свиньи | 473 | 5 | 1,0 | |
3 | овцы | 102 | 5 | 5 | |
4 | ошади | Пермь | 453 | 46 | 10 |
5 | свиньи | Йошкар-Ола | 75 | 75 | 100 |
6 | к.р.с. | 19 | 8 | 42 | |
Итого | 3925 | 225 | 5,6 | ||
Проведенные испытания 44 наборов для РНГА, показали, что предлагаемый метод прост, удобен позволяет проводить массовые серологические исследования поголовья с.-х. животных на хламидиоз.
2.2.4. Разработка и испытание эффективности инактивированной вакцины против хламидиозов крупного рогатого скота.
Следующей задачей наших исследований явилась разработка вакцинных препаратов, предназначенных, в первую очередь, для специфической профилактики абортов хламидиозной этиологии у крупного рогатого скота и предупреждения заражения быков-производителей, являющихся основными потенциальными источниками распространения возбудителя инфекции (Курбанов И.А., Авзалов Ф.З. др.,1982; Щербань Г.П.,1986; Хамадеев Р.Х.,1991; Караваев Ю.Д., 2006).
На первоначальном этапе разработки противохламидиозных вакцин для рогатого скота, в экспериментальных опытах выявились преимущества и перспективность эмульгированной вакцины по сравнению с другими формами вакцинных препаратов. При испытании эффективности экспериментальной эмульсионной вакцины против хламидиозного аборта коров в межлабораторном комиссионном опыте на нетелях нами было установлено, что разработанная вакцина является стерильной, безвредной, антигенно активной и иммунногенной. Подкожное введение препарата крупному рогатому скоту в дозе 3 мл защищала его от развития экспериментальной хламидийной инфекции.
В дальнейшем в условиях Херсонской биофабрики с использованием штамма хламидий "250" (И.А. Курбанов, 1971) согласно НТД (утв. ГУВ МСХ СССР от 8 февраля 1990 г.) было изготовлено более 32 тыс. доз опытноЦпромышленных серий и использованы для производственных испытаний в неблагополучных по хламидиозу регионах РФ.
2.2.5. Производственное испытание опытно-промышленных серий вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота и усовершенствование технологии изготовления и способа её применения.
Производственное испытание опытноЦпромышленных серий вакцины в условиях производства проводили в девяти хозяйствах Татарстана и Владимирской области. Всего было привито 6862 голов крупного рогатого скота, в том числе 3715 коров, 79 быковЦпроизводителей и 3068 телят, телок случного возраста. Поствакцинальный и колостральный иммунитет у привитых коров, нетелей и колостральный иммунитет телят изучали в динамике по накоплению специфических комплементсвязывающих антител в крови у вакцинированных животных. Через один месяц после вакцинации была выявлена положительная реакция к хламидийному антигену у 97Ц100% вакцинированных животных со средним титром антител 1:65Ц1:87, что соответствовало максимальному уровню накопления специфических антител. Через шесть месяцев положительно реагировали в РСК на хламидийный антиген от 90 до 93,6% вакцинированных животных со средним арифметическим титром 1:12Ц1:14. В последующие сроки исследования (через 9 и 12 месяцев) установлено постепенное снижение числа положительно реагирующих животных до 41,9Ц60%. При этом средние арифметические титры специфических антител были в пределах 1:7Ц1:10, что примерно соответствовало фоновому уровню титров антител в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах (1:6Ц1:1:7).
Следовательно, серологическими исследованиями было установлено, что наиболее высокий уровень специфических противохламидийных антител формируется у животных к месячному сроку после однократной подкожной вакцинации инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота. Эти показатели уровня антител сохраняются в течение последующих 6 месяцев, а затем происходит постепенное снижение специфических антител в крови. При исследовании в РСК сывороток крови телят, родившихся от вакцинированных коров и нетелей, была установлена положительная реакция с хламидиозным антигеном в титрах 1:5Ц1:80 у 63,3% телят в возрасте до 1 месяца, у 40%-возрасте до 2Цх месяцев и у 23,3% животных в возрасте до 3Цх месяцев. Полученные данные свидетельствуют о передаче телятам колостральных антител вакцинированными животными.
Результаты испытаний показали, что "Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная", изготовленная на основе возбудителя хламидиозного аборта крупного рогатого скота "250", проявляет неодинаковую эффективность при различных клинических формах (полиартрите, конъюнктивите, менингоэнцефалите и др.) течения хламидийных инфекций крупного рогатого скота. О существовании различий в индицировании защиты от кишечной и плацентарной формы хламидиоза у овец и наличии неоднородности антигенной структуры хламидий, выделяемых у крупного рогатого скота и свиней сообщали В.А.Бортничук, (1991), F.W.A.Johnson, (1984), J. A. Perez- Martinez и Storz J., (1985). Поэтому в решении задачи по созданию вакцины против хламидиозов крупного рогатого скота с широким антигенным набором, способной индуцировать у них иммунный ответ при различных формах хламидиоза, подбор оптимального антигенного состава активных штаммов для нас являлся приоритетным. Однако, испытания вакцины на начальном этапе показали, что в отдельных неблагополучных по хламидиозу хозяйствах инъекция вакцины вызывает у некоторых животных повышенную чувствительность, которая характеризуется постепенным увеличением гранулемы на месте инъекции вакцины до размеров 68 см в течение 2Ц3 месяцев. Количество животных, проявивших такую реакцию на введение вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота, составило по отдельным хозяйствам от 2 до 10% привитого поголовья и появление её, поЦвидимому, объясняется аллергической реакцией замедленного типа у некоторых животных хламидионосителей, так как серопозитивность поголовья крупного рогатого скота к возбудителю хламидиоза в этих хозяйствах составляла от 10,2 до 47%. Результаты наших наблюдений подтверждаются данными некоторых авторов (RidgwayG.L., et.al. 1997) указывающих, что у животных как при естественном переболевании хламидиозом, так и после вакцинации проявляется гиперчувствительность замедленного типа к введению хламидийного антигена. Другой причиной аллергической реакции является содержание в составе вакцины неспецифических компонентов куриного эмбриона. Уменьшение реактогенных свойств вакцины были достигнуты путем введения, в технологический цикл предложенного нами метода по очистки биомассы хламидий от компонента вакцины от неспецифических антигенов, а также подбором оптимальной дозы и способа её введения. Это позволило оптимизировать концентрацию хламидийного антигена в составе вакцины и дозу иммунизации, соответственно, 8Ц10 мг/мл и 1Ц2 мл.
Выше перечисленные изменения в технологии изготовления и применения вакцины нашли своё отражение в НТД, утвержденные ГУВ МСХ СССР от 13 ноября 1991 года.
2.2.6.Разработка и изучение эффективности применения полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота на лабораторных животных, телятах и овцах.
На первоначальном этапе моделирования полиштаммовой вакцины, на белых мышах были сравнительно испытаны шесть вариантов эмульсионной вакцины. Результаты этих опытов приведены в таблице 6.
Таблица 6
Препарат изготовлен из штаммов хламидий | После заражения штаммом "250" (Мм %) | |
погибло | выжило | |
"250" | 241 | 761 |
"УПЦ89" | 232 | 772 |
"МЗЦ89" | 173 | 841 |
"СКЦ89" | 621 | 382 |
"250","УПЦ89","МЗЦ89","СКЦ89"(четырех штаммовый) | 502 | 502 |
"250","МЗЦ89","СКЦ89" (трехштаммовый) | 251 | 851 |
Контроль (невакцинированные) | 7510 | 2510 |
В опытах было установлено, что полиштаммовая вакцина, изготовленная на основе штаммов "250", "МЗ-89", "СК-89", при подкожном введении белым мышам имеет оптимальный спектр антигенности и обеспечивает выживаемость их 851% случаев после контрольного заражения вирулентной культурой хламидий, при гибели 7510% интактных мышей. В дальнейших исследованиях по разработке полиштаммовой вакцины были подобраны компоненты и отработаны технологические приемы получения более жидких эмульсионных вакцин на основе синтетических масел и ланолина. При подкожном введении белым мышам полиштаммовой вакцины у этих животных формировался напряженный иммунитет, обеспечивающий выживаемость их 762% случаев после контрольного заражения вирулентными культурами хламидий, при выживаемости 222,4% интактных. Результаты исследований приведены в таблице 7.
Таблица 7
Номера серии вакцины | Штамм, использованный для заражения | Наименование групп животных | Кол-во животных в группе | Выживаемость белых мышей после контрольного заражения (в %) | |
Серии №№ 5, 14, 20 (М±m) | МЗ89 | опытная | 45 | 734,3 | |
контрольная | 45 | 242,4 | |||
СК89 | опытная | 45 | 802,4 | ||
контрольная | 45 | 171,4 | |||
250 | опытная | 45 | 76,62,4 | ||
контрольная | 45 | 25,6±3,7 | |||
Итого | опытная | 135 | (762%) | ||
Итого | контрольная | 135 | (222,4%) | ||
В опытах по изучению антигенной и иммунногенной активности вакцины на лабораторных животных было установлено, что биопрепарат при подкожном введении индуцирует в сыворотке крови морских свинок формирование КС-антител в титрах 1:10-1:640, гемагглютинирующих (ГА) -1:80-1:1280 и защищает в среднем 76% вакцинированных белых мышей от экспериментального заражения, при 77% случаев гибели в контрольной группе. Оценка эффективности применения полиштаммовой вакцины на телятах в комиссионном опыте показала, что разработанная полиштаммовая вакцина стерильна, безвредна, иммунногенно активна. Внутримышечное введение препарата телятам в дозе 1 мл защищает их от развития различных клинических форм (менингоэнцефалита, полиартрита, конъюнктивита) экспериментальной хламидиозной инфекции.
Принимая во внимание литературные источники о близком родстве антигенов плацентарных штаммов мелкого и крупного рогатого скота (Johnson F.W., 1984; Storz J. et al., 1964), нами в опытах на суягных овцах была проведена оценка эффективности применения полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота для специфической профилактики хламидиозного аборта овец. С этой целью в КП им.Тимирязева Балтасинского района РТ перед осеменением было иммунизировано внутримышечным способом 1500 овцематок в дозе 1,0 мл3. Для определения антигенной активности вакцины у подопытных овец вакцинированных в дозах 0,5 и 1,0 мл через 80 дней после иммунизации средний титр КС-антител в сыворотке крови составил 1:10 и 1:33 соответственно. Через 3 месяца после вакцинации 10 овец, в их числе 6 голов вакцинированных (опытные) и 4 не вакцинированные (контрольные), были завезены в виварий института и заражены в условиях лаборатории вирулентной культурой возбудителем хламидиозного аборта овец (штаммом "РостиновоЦ70"). Животных разделили на 3 группы: первая (№№ 1Ц3) вакцинирована в дозе 0,5 см3, вторая (№№ 4Ц6) - в дозе 1,0 мл. Не вакцинированные 4 овцематки (№№7Ц10) были контрольными. По результатам исхода беременности вакцинированных (опытных) и невакцинированных (контрольных) овец судили об эффективности вакцины.
В первой опытной группе у одной овцы, родился слабый ягненок, у других овец родились клинически здоровые и жизнеспособные ягнята. В контрольной группе регистрировали аборты и мертворождения.
Таким образом, было установлено, что однократная внутримышечная иммунизация овец полиштаммовой вакциной против хламидиоза крупного рогатого скота в дозе 1,0 мл обеспечивает максимальную защиту подопытных животных от заболевания хламидиозом (штамм "РостиновоЦ70") в течение 3Ц4 месяцев после вакцинации.
При разработке технологии изготовления и контроля инактивированной эмульсионной полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота на основе штаммов "МЗ-89", "СК-89" и "250" нами был применен разработанный более эффективный способ получения биомассы хламидий на КЭ. Дополнительно были проведены исследования по усовершенствованию метода инактивации, очистки, концентрации и стандартизации биомассы хламидий, а также был предложен упрощенный метод контроля вакцины.
Наиболее важными этапами в технологии производства полиштаммовой вакцины, изготавливаемой и выпускаемой в ФГУ ФЦТРБ-ВНИВИ, составляющую её научную основу, являются:
1) Разработка способа получения биомассы хламидий, основанного на выращивании патогенных штаммов ("МЗ-89", "СК-89" и "250") хламидий одновременно в желточной и аллантоисной полостях куриного эмбриона, позволяющая увеличить выход хламидий с инфицированного куриного эмбриона по сравнению с существующей технологией;
2) Усовершенствование режима инактивации биомассы хламидий с помощью формальдегида (0,20,3%) в течение 48 часов при температуре 370С, с последующей гомогенизацией инактивированных и очищенных хламидийных антигенов в растворе глутарового альдегида (0,20,3 %). Подобранный режим инактивации оказался оптимальным. Хламидии теряли инфекционные свойства, сохраняя антигенную активность;
3) Разработка способа очистки и концентрирования хламидий от неспецифических компонентов, позволяющего повысить иммунногеность полиштаммовой вакцины;
Повышение иммуногенной активности, достигалось также и тем, что полиштаммовая вакцина для специфической профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота содержит инактивированные и очищенные хламидийные антигены из штаммов хламидий вида Chlamydia psittaci: "МЗ89" - возбудителя менингоэнцефалита, 250 возбудителя хламидиозного аборта и "СК-89" - возбудителя хламидиозного конъюнктивита телят, взятых в соотношении 0,25; 0,25; 0,5 соответственно и с концентрацией 16-18 мг/мл, адсорбированных на алюмо-калиевых квасцах и эмульгированных в масляно-ланолиновом адъюванте, при следующем соотношении основных компонентов препарата (мл):
1. Инактивированные хламидийные антигены из штаммов вида Chl. psittaci :
"МЗ-89" с титром ЭЛД50 10-5,5 10-7,7 в 0,3 мл 250 с титром ЭЛД50 10-5,.5 - 10-7,7 в 0,3 мл мл "СК-89" с титром ЭЛД50 10-5,5 - 10-7,7 в 0,3 мл Масло-ланолиновый адъювант 10% раствор алюмо-калиевых квасцов 10% раствор глутарового альдегида | 13,712,6 13,712,6 24-25 48-49 0,4-0,5 0,2-0,3 |
Детальное описание разработанной нами технологии получения полиштаммовой вакцины, его контроля и применения нашли свое отражение в соответствующих разделах инструкции по изготовлению и контролю вакцины, ТУ на биопрепарат и наставления по применению вакцины.
2.2.6. Оценка эффективности инактивированной эмульсионной полиштаммовой вакцины, предназначенной для специфической профилактики хламидиозов крупного и мелкого рогатого скота, в производственных условиях.
Испытания полиштаммовой инактивированной эмульсионной вакцины проводили в 10 неблагополучных по хламидиозу крупного и мелкого рогатого скота хозяйствах республик Татарстана, Марий-Эл, Чувашии и Пермской области Российской Федерации. При этом всего было привито 7064 голов крупного рогатого скота, в том числе 4343 коровы, и 2720 телят и телок случного возраста, а также 2675 гол. мелкого рогатого скота, в том числе 1000 овцематок, 70 баранов и 1602 голов ярок. Поствакцинальный и колостральный иммунитет у привитых животных (коров, телят, овец) изучали в динамике по накоплению специфических поствакцинальных комплементсвязывающих антител у вакцинированных животных. Полученные данные свидетельствовали о том, что через месяц после однократной вакцинации положительная реакция к хламидийному антигену выявляется у 100% вакцинированных животных со средним титром антител 1:25, через 6-7 месяцев (после ревакцинации) положительная реакция составила 96% со средним титром антител 1:29. В последующие сроки исследования (через 9 месяцев) серопозитивность у коров перед отелом составляла 96% со средним титром 1:20. В сыворотке крови новорожденных телят от 3 до 32-дневного возраста, родившихся от вакцинированных коров, положительная реакция к хламидиозному антигену в РСК отмечалось у 100% телят со средним титром 1:25. Выборочные исследования сыворотки крови вакцинированных овец через один и три месяца после иммунизации выявили положительную реакцию у 80-100% животных со средним титром комплементсвязывающих антител 1:10 и 1:80 соответственно.
Таким образом, серологические исследования вакцинированных животных показали, что внутримышечная вакцинация инактивированной эмульсионной полиштаммовой вакциной против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота создает достаточно высокий уровень специфических противохламидийных антител у привитых животных и у полученного от них молодняка.
Оценку эффективности применения полиштаммовой вакцины проводили на основании фактических данных по количеству абортов и мертворождаемости, а также падежу и вынужденному убою молодняка в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах до и после применения вакцины. Полученные нами данные показали, что до применения вакцины общие потери молодняка в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах в республиках Чувашии и Марий-Эл составляют в среднем 22-33%. В первый год применения полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота отход молодняка сократился до 17-18%.
При этом количество зарегистрированных абортов и мертворождений уменьшилось на 2Ц8%, падеж и вынужденный убой телят до 2,5Ц18%. На втором году использования вакцины в этих хозяйствах эти показатели составили соответственно 3Ц6% и 8Ц13%. При этом общие потери молодняка сократились на 5Ц17%. На третий год применения полиштаммовой вакцины отход молодняка сократился в 1,1Ц2 раза, количество абортов и мертворождений уменьшились 1,4Ц2,5 раза, а падеж и вынужденный убой телят в некоторых хозяйствах сократился в 2,0 раза.
Следовательно, в результате применения полиштаммовой инактивированной эмульсионной вакцины в системе противохламидиозных мероприятий в течение последующих трех лет существенно сократилось количество абортов и мертворождений хламидиозной этиологии; в 2,0 раза уменьшилась заболеваемость, сократился падеж и вынужденный убой телят.
Таким образом, проведенные широкомасштабные испытания полиштаммовой инактивированной эмульсионной вакцины в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах показали, что её целесообразно применять систематически до полного оздоровления поголовья крупного рогатого скота от этой инфекции.
2.2.7.Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней и оценка её эффективности.
К настоящему времени накоплен сравнительно большой фактический материал об этиологической роли хламидий в инфекционной патологии свиней в специализированных комплексах и хозяйствах промышленного типа (Г.П.Щербань, 1978; Прудников С.И., 1981; Бортничук В.А., 1991; Leonhard I., 1988). Если при хламидиозе овец разработаны и внедрены в ветеринарную практику эффективные меры борьбы и средства специфической профилактики, то при хламидиозе свиней эти задачи находятся на стадии разработки и апробации.
Приступая к разработке биопрепарата перед нами была цель, получить вакцину, обладающей высокой иммунногенной активностью с широким спектром антигенности для профилактики хламидиоза свиней.
Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней проводилась с использованием штаммов хламидий "РСЦ85 и "ЛСЦ87", адаптированных к размножению на КЭ с инфекционным титром не ниже 10Ц5,5Ц6,5 ЭЛД50 в 0,3 мл. Получение биомассы хламидий, её инактивация, очистка хламидийного антигена осуществляли по разработанной нами технологии. Биомассу после очистки от тканевых компонентов куриных эмбрионов концентрировали и стандартизировали по содержанию специфического хламидийного антигена. Антиген адсорбировали на алюмоЦкалиевых квасцах и эмульгировали в адъюванте, состоящего из диэтилполисилоксановой жидкости (ПЭСЦ3) и ланолина. При подборе антигенного состава опытным путем было установлено, что оптимальная концентрация составила 10-15 мг/мл хламидийных антигенов из двух штаммов ("РСЦ85"и "ЛСЦ87") взятых в равном соотношении. При таком содержании антигена в вакцине обеспечивается наибольшая иммунологическая устойчивость у более чем 75% зараженных мышей, при 75% гибели интактных мышей в контроле.
Таким образом, в опытах на белых мышах установили, что созданная вакцина на основе выше перечисленных штаммов хламидий обладала высокой иммуногенной активностью, имела наиболее оптимальный антигенный состав, необходимый для создания иммунитета у мышей от экспериментальной хламидийной инфекции.
В испытаниях 10 экспериментальных серий вакцины на стерильность, безвредность была удостоверена её стерильность и безвредность, что является необходимым требованием для вакцинного препарата. Изучение её антигенной активности проводилось на морских свинках. Исследованиями установлено, что уровень КС антител в сыворотке крови у 91% иммуннизированных морских свинок со специфическим антигеном составляет в среднем 1:7826,4. Таким образом, нами была подтверждена высокая антигенная активность разработанной вакцины.
Контроль иммуногенной активности вакцины против хламидиоза свиней испытывали на белых мышах. Контрольное заражение опытных и интактных мышей проводили штаммами хламидий "РС-85" и "ЛС-87" внутрибрюшинно, в дозе 0,5 мл через 30 дней после иммунизации. Выживаемость белых мышей после контрольного заражения вирулентными культурами хламидий штаммом "РС-85" и "ЛС-87" колебалась в пределах 79,6±4,3% и 76,6±2,4% соответственно. Средний процент выживаемости вакцинированных мышей составил 78,2±2,1%. В контрольных группах мышей, подвергнутых заражению, отмечалось 100%-ное клиническое переболевание и гибель 60-80% животных. Выживаемость интактных мышей после заражения штаммами хламидий "РС-86" и "ЛС-88" была в пределах 24±2,4% и 35,6±4,7% соответственно.
Таким образом, при испытании вакцин в лабораторных условиях была установлена стерильность, безвредность, выраженная антигенная и иммуногенная активность разработанной вакцины против хламидиоза свиней.
2.2.7. Оценка антигенной и иммунногенной активности вакцины против хламидиоза свиней на супоросных свиноматках.
Иммуногенную эффективность разработанной вакцины против хламидиоза свиней испытывали в остром опыте на 10 (серонегативных в РНГА на хламидиоз) подсвинках с 1Ц1,5 месячным сроком беременности. Контрольное заражение вакцинированных и интактных подсвинок проводили через 21 день после вакцинации. Возбудитель хламидиозного аборта свиней (штамм "РС-85") был введен двум опытным и трем контрольным животным; возбудитель пневмонии свиней (штамм "ЛС-87")-также двум опытным и трем контрольным свиньям внутривенно по 5 мл 10-6,5 ЭЛД50 в 0,3 мл.
После заражения за подсвинками вели клиническое наблюдение, проводили серологические, микроскопические и микробиологические исследования. Установлено, что характер изменения температуры тела и проявления клинических признаков заболевания у вакцинированных и контрольных животных, подвергнутых заражению, был неодинаковым: у животных контрольной группы отмечались кратковременная температурная реакция и клинические признаки острого заболевания: угнетение, отказ от корма, нарушение координации движения, слабость, слезо-, слюнотечение. У вакцинированных свиней симптомы заболевания не наблюдали. Пробы сывороток крови параллельно исследовались в РСК и РНГА. Через 21 день после вакцинации происходило накопление специфических хламидийных антител в сыворотке крови иммунизированных свиней. В эти сроки КС антитела выявлялись в высоких титрах 1:4023,3. Титры ГА - антител были в пределах 1:9029. У контрольных животных до заражения хламидийные антитела не обнаруживали. Следовательно, инактивированная эмульсионная вакцина против хламидиоза свиней обладает высокой антигенной активностью и индуцирует при однократном внутримышечном её введении максимальный уровень специфических антител.
Свинки опытной группы опоросились в срок. Полученные поросята (36 голов) были жизнеспособны, подвижны, имели среднюю живую массу 1225±0,5г. При микроскопическом исследовании мазков-отпечатков из котиледонов плаценты этих свиноматок наличие хламидий не обнаруживали. В контрольной группе из 76 народившихся поросят 56 (73%) были мертворожденные, остальные 20 поросят были слабые и нежизнеспособные, их вес составил 908±0,5 г., наблюдались признаки гипотрофии. Из котиледонов плаценты, паренхиматозных органов плодов, мертвых и слаборожденных поросят, на КЭ был реизолирован возбудитель хламидиоза свиней.
Таким образом, однократное введение свиноматкам инактивированной эмульсионной вакцины в дозе 2 мл обеспечивало формирование стойкого иммунитета, способного защитить супоросных свиноматок от экспериментального заражения вирулентными штаммами хламидий, вызывающих аборты и пневмонию у свиней.
2.2.7. Иммуноморфологическая оценка эффективности инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней
Иммуноморфологическая перестройка организма привитых супоросных подсвинок сопровождалась выраженной лимфоидно-гиперпластической, макрофагальной и плазмоклеточной реакциями в лимфоидных органах и активацией клеточных элементов системы мононуклеарных фагоцитов во внутренних органах, а также резким повышением уровня гуморальных антител в периферической крови к 3-45 дням после вакцинации. Результаты исследований позволили заключить, что испытуемая экспериментальная вакцина против хламидиоза свиней обладает способностью создавать достаточно напряженный иммунитет у животных, позволяющий противостоять к заражению эпизоотическими штаммами хламидий, не обладает побочным действием, вызывающим глубокие необратимые структурные изменения в их организме.
С 1995 года нами в ФГУ ФЦТРБЦВНИВИ было организовано опытное мелкосерийное производство эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней для оценки её эффективности в производственных условиях. За период с 1995 по 2006 годы было изготовлено более 500 тыс. доз вакцины против хламидиоза свиней.
Изготовленные серии вакцины прошли контроль на стерильность и безвредность. Изучением антигенной активности вакцины было обнаружено, что средние арифметические титры в РСК у морских свинок, вакцинированных опытными сериями вакцин, составляют от 1:57 до 1:100. Полученные результаты свидетельствуют о высокой иммуногенной активности опытных серий вакцины против хламидиоза свиней изготовленных по разработанной технологии.
2.2.8. Изучение эффективности применения инактивированной эмульсионной против хламидиоза свиней в неблагополучных по хламидиозу свиноводческих хозяйствах Среднего Поволжья.
Производственные испытания результативности опытных серий вакцины проводились в неблагополучных по хламидиозу свиноводческих хозяйствах с участием специалистов Государственной ветеринарной службы республик Татарстана, МарийЦЭл, Чувашии; Ульяновской и Тамбовской областей. При этом ежегодно вакцинировалось 22388 голов свиней, том числе 21355 Цсвиноматки и 934 хрякаЦпроизводителя. Анализ состояния иммунизированного поголовья свиней в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах показал, что введение вакцины не оказывает существенного влияния на общее состояние привитых свиней, показатели температуры тела, пульса и дыхания, как в близкие, так и отдаленные сроки после вакцинации. На месте введения вакцины наблюдали местную реакцию виде небольшой припухлости, которая исчезала в течение 2Ц4 недель.
По уровню накопления специфических хламидийных антител в крови у привитых свиней косвенно определяли напряженность поствакцинального иммунитета. На 21Цй день после вакцинации в крови 96% свиней были выявлены специфические КС - антитела в титрах 1:5Ц1:40 (при титре 3,120,14 Лог2). Максимальный уровень специфических антител у свиней был выявлен на 45Цй день после вакцинации. При этом в РСК реагировало положительно 98% вакцинированных свиней с титром 3,24 0,08 Лог2. В дальнейшем, через 3 месяца после вакцинации в РСК реагировало положительно 96% вакцинированных свиней в титрах 1:5Ц1:20 в среднем 2,960,08 Лог2. При исследовании тех же сывороток крови свиней в РНГА, процент положительно реагирующих животных, так и титры специфических хламидийных антител были несколько выше, чем в РСК. Так, на 45Цдень после вакцинации в РНГА реагировало положительно 100% вакцинированных свиней в титрах в 4,640,14 Лог2.
Таким образом, результаты производственных испытаний показали, что однократная вакцинация инактивированной эмульсионной вакциной против хламидиоза свиней в дозе 2 мл способствует формированию стойкого иммунитета против указанной инфекции.
Об эффективности испытания вакцины судили на основании сравнения фактических данных по количеству абортов и мертворождений среди свиноматок, а также падежа и вынужденного убоя поросят до 2Цх месячного возраста в 7 неблагополучных по хламидиозу свиноводческих хозяйствах РФ до и после применение вакцины.
Количество абортов и мертворождений в 7Цми неблагополучных свиноводческих хозяйствах до вакцинации устанавливали в пределах 10,6-66% (в среднем 29%), падеж и вынужденный убой поросят от 8Ц43%, в среднем (24%). В результате применения вакцины количество абортов и мертворождений в этих хозяйствах снизились от 1,0Ц16%, т.е. уменьшилось в 5,5 раз, одновременно снижением заболеваемости, падежа и вынужденного убоя молодняка с 8-43% до 2-30% в среднем более чем два раза от хламидиозной инфекции.
Таким образом, испытание вакцины в лабораторных и производственных условиях показало, что биопрепарат обладает всеми свойствами антигенного раздражителя, обуславливающего иммуноморфологическую перестройку организма животных и обеспечивающего иммунологическую защиту свиней от заражения возбудителем хламидиоза.
3. Выводы.
- КлиникоЦэпизоотологическими и лабораторными исследованиями установлено широкое распространение хламидийной инфекции с.-х. животных в животноводческих комплексах и племпредприятиях Ульяновской, Кировской, Пермской областей, республик Чувашии, Башкортостана, Удмуртии, Татарстана и Марий-Эл. Серопозитивность к антигену возбудителя хламидиоза выявлена у крупного рогатого скота от 29 до 75%, свиней от 14 до 28%, лошадей от 18 до 31%. Впервые в этом регионе от различных половозрастных групп больных хламидиозом животных (крупного рогатого скота, свиней и лошадей) и клинически проявляющиеся в виде абортов, пневмоний, энцефалитов, полиартритов и конъюнктивитов, выделено 9 новых штаммов хламидий. Выделенные штаммы являются этиологическими агентами у этих видов животных, которые по своим иммунобиологическим характеристикам, а некоторые по анализу проб ДНК со специфическими праймерами идентифицированы как представители рода Chlamydia (Chlamydophila).
- Сравнительным изучением биологических свойств 7 штаммов возбудителей хламидиозов с.-х. животных, выявлены различия по токсичности, патогенности для белых мышей и морских свинок при различных способах заражения и по характеру проявления экспериментальной инфекции на естественных хозяевах. Все изученные штаммы хламидий одинаково размножались в эпителиальных клетках желточной оболочки 6-7 суточных развивающихся куриных эмбрионов, вызывая генерализованную инфекцию и накапливались в титрах 10-5,5-10-6,5 ЭЛД50/0,3 мл. По степени антигенной и иммуногенной активности, накопления хламидий в процессе длительного культивирования в куриных эмбрионах, отобраны 4 штамма хламидий ("СК-89", "МЗ-89", "РС-85" и "ЛС-87"), которые депонированы в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ ВГНКИ и признаны пригодными для использования в качестве производственных для изготовления средств диагностики, специфической профилактики хламидиозов с.-х. животных.
- Разработана технология изготовления хламидийного эритроцитарного диагностикума на основе корпускулярного хламидийного антигена штамма "СКЦ89" и создан "Набор препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)" (ТУ 9388Ц005Ц00492374Ц01). Подтверждена его высокая активность, специфичность и чувствительность.
- Изыскан способ повышения выхода биомассы хламидий с инфицированного КЭ по сравнению с существующей технологией (авторское свидетельство №1641883 с приоритетом от 24.10.88 г.)
- Усовершенствована технология изготовления и способ применения моновакцины против хламидиоза крупного рогатого скота: внедрен способ очистки хламидийного антигена от балластных веществ КЭ, позволяющий повышать иммуногенную активность вакцины, установлено оптимальное количество специфического хламидийного антигена в составе вакцины, изыскан способ и кратность её инъекции, индуцирующий формирование напряженного противохламидийного иммунитета в течение 12 месяцев.
- Впервые разработана новая полиштаммовая инактивированная эмульсионная вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота сконструированная на основе штаммов "250", "МЗЦ89", "СКЦ89", обладающая широким спектром набора антигенов, иммуногенной активностью и обеспечивающая эффективную защиту вакцинированных животных от различных форм клиникоЦанатомического его проявления. (Решение ФИПС РФ о выдаче патента с приоритетом от 06.12.2005г.)
- Испытание полиштаммовой инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота с целью защиты овцематок показало, что она также способна формировать напряженный иммунитет у мелкого рогатого скота против возбудителя хламидиозного аборта.
- На основе результатов производственных испытаний опытных серий полиштаммовой инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота в различных регионов РФ установлено, что биопрепарат обладает высокой эффективностью и при систематическом применении (в течение не менее трех лет) обеспечивает стабилизацию эпизоотической ситуации и оздоровление животных в неблагополучных хозяйствах.
- Впервые разработана "Вакцина для специфической профилактики хламидиоза свиней", имеющая в единице дозы вакцины оптимальное соотношение и концентрацию хламидийных антигенов двух штаммов, которая защищает свиней от развития экспериментальной хламидийной инфекции (патент на изобретение № 2247577 с приоритетом от 20.12.2002 г.).
- Комплексными иммуноморфологическими, цитосерологическими и микробиологическими исследованиями установлено, что инактивированная эмульсионная вакцина против хламидиоза свиней вызывает выраженную иммуноморфологическую перестройку в организме привитых свиней, проявляющуюся усилением структурно-функциональной активности иммунокомпетентных клеток лимфоидных органов в виде лимфоидно-гиперпластической, плазмоцитарной и макрофагальной реакций, создавая тем самым морфологическую основу для формирования у них напряженного иммунитета.
- Результаты производственных испытаний "Вакцины для специфической профилактики хламидиоза свиней", показали её высокую антигенную, иммуногенную активность и эффективность. Однократное введение биопрепарата супоросным свиноматкам обуславливает продукцию хламидийных антител у 94Ц98% животных, которые достигают максимальных титров на 30 день и сохраняются на достаточно высоком уровне в течение 3Ц4х месяцев. Применение вакцины в системе противохламидийных мероприятий, в хозяйствах неблагополучных по хламидиозу свиней, сокращает количество абортов и мертворождаемость в среднем в 5 раз и уменьшает падеж и вынужденный убой поросят в более чем в 2 раза от хламидийной инфекции.
- Итоги сравнительного изучения иммунобиологических свойств ранее неизвестных инфекционных агентов, изолированных от крупного рогатого скота, свиней и лошадей, явились научной предпосылкой для разработки и усовершенствования средств лабораторной диагностики и специфической профилактики хламидиозов. Впервые разработана научная основа технологии, налажено серийное производство и внедрены в ветеринарную практику набор препаратов для диагностики и полиштаммовые инактивированные эмульсионные вакцины против хламидиозов с.-х. животных. Решена проблема их специфической профилактики.
5. Практические предложения
По результатам проведенных исследований разработаны следующие нормативно-технические документы:
- Инструкция по профилактике и ликвидации хламидиоза животных, утвержденная ГУВ Госагропрома СССР от 08.08.89г.;
- Рекомендации по обеспечению эпизоотического благополучия свиноводческих хозяйств по хламидиозу, утвержденные ГУВ КМ РТ от 07.05.97г.;
- Временная инструкция по изготовлению и контролю набора препаратов для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), утвержденная директором ВНИВИ от 28. 11.94 г;
- Технические условия на "Набор препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)" (ТУ 9388Ц005Ц00492374Ц01) на опытную партию (согласовано департаментом ветеринарии МСХ РФ и утвержденная директором ВНИВИ от 15.03.01г.);
- Временное наставление по применению набора препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютинации РНГА (в порядке широких производственных испытаний в 2001Ц2003 гг.), утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ от 10.07.01г. и одобрено Советом по ветеринарным препаратам 15 мая 2001 года, (протокол № 2, №001257ЦОП);
- "Набор препаратов для диагностики хламидиозов животных в РНГА" от 28.11.94 г.;
- Временное наставление по применению вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной, утвержденное ГУВ при Госкомиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам от 08.02.90г;
- Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной, утвержденная ГУВ МСХ СССР от 13 11.91 г.;
- Технические условия на вакцину против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированную эмульсионную (ТУ 10Ц07Ц253Ц91), утвержденные ГУВ МСХ СССР от 13.11.91г.;
- Наставление по применению вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной, утвержденное ГУВ МСХ РФ от 02.02.93г.;
- Временная инструкция по изготовлению и контролю вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота полиштаммовой инактивированной эмульсионной утвержденная директором ВНИВИ (г.Казань) от 28.11.94 г.;
- Временное наставление по применению вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота полиштаммовой инактивированной эмульсионной утвержденное ГУВ КМ РТ 30.11.94 г.;
- Временная инструкция по изготовлению и контролю вакцины против хламидиоза свиней инактивированной эмульсионной, утвержденная директором ВНИВИ (Казань) 28.03.95 г.;
- Технические условия на вакцину против хламидиоза свиней инактивированную эмульсионную (ТУ9388Ц003Ц00Ц00492374Ц00), утвержденные директором ВНИВИ (г.Казань) от 05.06.99г., согласовано ВГНКИ, Департаментом ветеринарии МСХ РФ;
- Наставление по применению вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной утвержденное Минсельхозпрода России департаментом ветеринарии от 14.07.99г.;
- Временное наставление по применению вакцины против хламидиоза свиней инактивированной эмульсионной, утвержденное департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России от 16.05.2000г.;
- Временное наставление по применению вакцины против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота полиштаммовой, инактивированной, эмульсионной, утвержденное ГУВ КМ РТ от 14.03.2002 г.;
- Временное наставление по применению вакцины против хламидиоза рогатого скота и лошадей полиштаммовой инактивированной эмульсионной утверждено ГУВ КМ РТ от 23.08.02г.;
- "Способ получения биомассы хламидий" (авторское свидетельство № 1641883 с приоритетом от 24.10.88 г.);
- "Вакцина для специфической профилактики хламидиоза крупного рогатого скота" (патент на изобретение №2092188 с приоритетом от 29.10.1991г.);
- "Вакцина для специфической профилактики хламидиоза свиней" (патент на изобретение № 2247577 с приоритетом от 20.12.2002г.);
- "Вакцина для специфической профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота" решение о выдаче патента с приоритетом от 06.12.2005г.
Список научных работ опубликованных по теме диссертации.
- Авторское свидетельство, №1641883 СССР. Способ получения биомассы. / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, А.З.Равилов - №1641883; заявл.24.10.88.
- Авзалов, Ф.З. Изучение иммуноморфогенеза при вакцинации свиней противохламидиозной вакциной /Ф.З.Авзалов, Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов //Матер. по актуальные проблемы живот. и ветеринарии.-Казань, 1999.-С.45Ц47
- Евстифеев, В.В. Разработка средств специфической профилактики хламидиоза свиней/ В.В.Евстифеев, Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов //Матер. Международной научноЦпрактической конференции, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов" посвященной 35Цлетию института - Щелково, 2005.-С.382Ц384.
- Евстифеев, В.В. Разработка средств специфической профилактики хламидиоза свиней /В.В.Евстифеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] //Матер.Международного симпозиума "Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", посвященного 45Цлетию образования института-Казань, 2005.- С. 382-386
- Пат. № 2092188. Российская Федерация, МПК А61К39/Хусаинов Ф.М.; заявитель и патентообладатель Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт№5008246; заявл.29.10.91; опубл.27.04.92.Бюл.№18.-3с.
- Пат. 2247577 Российская Федерация, МПК А61К39/Хусаинов Ф.М. [и др.]; заявитель и патентообладатель Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт (RU) №2002135, заявл. 20.12.2002; публ.27.04. 2002, Бюл.№18.-3с.
- Равилов, А.З. Разработка биологических препаратов и методов диагностики, лечения и профилактки хламидиозов сельскохозяйственных животных, пушных зверей и птиц/ А.З.Равилов, Ф.М.Хусаинов, [и др.] / Материалы на соискание Государственной премии РТ 1995 года в области науки и техники.- Казань, 1995.-165 с.
- Хамадеев, Р.Х., Специфическая профилактика хламидиозного аборта крупного рогатого скота /Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, А.З.Равилов, [и др.] //Матер. респ. науч.-произв.конф.- Казань, 1989.-С.17Ц19.
- Хусаинов, Ф.М. Хламидиоз крупного рогатого скота / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев // Матер. зональной. науч. - техн. конф.- Троицк,-1989,- С.22Ц24.
- Хамадеев, Р.Х. Хламидиоз крупного рогатого скота / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, А.З.Равилов // Ветеринария, 1990.-№2,ЦС.42Ц45.
- Хамадеев, Р.Х. Изучение поствакцинального иммунитета у коров, вакцинированных против хламидиоза крупного рогатого скота /Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Тез. Докл. Всесоюзной конференции по эпизоотологии. - Новосибирск., 1991.-С.412Ц413.
- Хамадеев, Р.Х. Экспериментальная оценка инактивированной вакцины против хламидиозного аборта крупного рогатого скота / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] // Матер. У Всесоюзн. конф.- Москва, 1991. ЦС.26Ц28.
- Хамадеев, Р.Х. Специфическая профилактика крупного рогатого скота/Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов., [и др.]// Матер. Всесоюзн. конф., посвящ.,140Цлетию Харьковского зооветеринарного института.- Харьков, 1991.-С.151-153.
- Хамадеев, Р.Х. Оценка иммуногенной активности полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота/ Р.Х. Хамадеев, Ф.М.Хусаинов,[и др.] //Матер. науч.-произв. конф. по проблеме ветеринарии и животноводства.- Казань, 1995.-С.42-44.
- Хусаинов, Ф.М. КлиникоЦэпизоотологическое проявление хламидиозов крупного рогатого скота и свиней в хозяйствах Среднего Поволжья / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]//Матер.науч.-произв. конф. по проблеме ветеринарии и животноводства.- Казань, 1995.-С.41-43.
- Хусаинов, Ф.М. Диагностика хламидиоза свиней и крупного рогатого скота методом ИФА / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]// Матер. науч.-произв. конф. по проблеме ветеринарии и животноводства.- Казань, 1995.-С.46-48.
- Хамадеев, Р.Х. Разработка диагностикума для РНГА при хламидиозах / Р.Х. Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Матер. науч.-произв. конф. по проблеме ветеринарии и животноводства.- Казань,1995.-С.47-49.
- Хусаинов, Ф.М. Использования иммуноферментного анализа для диагностики хламидиоза свиней / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]// Вирусные болезни с.-х. животных. - Владимир, 1995.-С.67-68.
- Хамадеев, Р.Х. Использования РНГА для оценки поствакцинального иммунитета при хламидиозах / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]// Вирусные болезни с.-х. животных.- Владимир, 1995.-С.132-133.
- Хамадеев, Р.Х. Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Вирусные болезни с.-х. животных. - Владимир, 1995.-С.151.
- .Хамадеев, Р.Х. Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]// Ветеринария, 1996. №6 ЦС.22Ц24.
- Хусаинов, Ф.М. Сравнительная оценка серологических методов РСК, РНГА и ИФА при диагностике хламидиозной инфекции крупного рогатого скота и свиней/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]//Всерос.науч.конф. Инфекц.болезни молодняка с.-х. животных. Тез докл..-М., 1996.-С.12Ц14.
- Хамадеев, Р.Х. Клинико-эпизоотическое проявление хламидиозов крупного рогатого скота и свиней в зоне Среднего Поволжья/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов, Матер. V Всероссийской конференции.- Щелково, 1996. - С.153-154.
- Хусаинов, Ф.М. Деконтаминация спермы при генитальном хламидиозе быковЦпроизводителей/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]// Респуб. Тез.докл. Науч. конф. молодых ученых и специалистов., - Казань, 1996.ЦС.59.
- Хамадеев, Р.Х. Клинико-эпизоотическое проявление хламидиозов крупного рогатого скота и свиней в зоне Среднего Поволжья / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Тезисы докладов V Всероссийской конференции.- Щелково, 1996, С.153-154.
- Хамадеев, Р.Х. Получение эритроцитарного диагностикума для выявления антител при хламидиозе/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Науч. основы технологии пром. прЦва вет. биол.препаратов ЦЩелково, 1996 ЦС.153Ц154.
- Хамадеев, Р.Х. Эффективность полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]/Науч.основы технологии пром.прЦва вет.биол.препаратовЦЩелково, 1996 - С.178Ц179.
- Хамадеев, Р.Х. Профилактика хламидиоза в условиях промышленного свиноводства./ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] //Матер. Всерос. научноЦметод.конф. по патологической анатомии с.-х.животных. Казань. 1998.-С.99Ц100.
- Хамадеев, Р.Х. Эпизоотологические особенности хламидиоза в условиях промышленного свиноводства./ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Матер. Всерос. научноЦметод. конф. по патологической анатомии с.-х.животных. Казань. 1998.-С.100Ц101.
- Авзалов, Ф.З. Иммуноморфологическая перестройка организма телят при введении полиштаммовой вакцины против хламидиоза/ Ф.З.Авзалов, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Матер. Всерос. научноЦметод. конф. по патологической анатомии с.-х. животных. Казань. 1998.-С44Ц48.
- Хусаинов, Ф.М Хламидиозы свиней и крупного рогатого скота в Среднем Поволжье/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев [и др.]// Матер.науч.конф. посвященной 125Цлетию академии Ч.1.- Казань, 1998,ЦС.113Ц114.
- Хамадеев, Р.Х. Распространение, диагностика хламидиозов сельскохозяйственных животных и меры борьбы / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]// Диагностика, лечение и профилактика опастных инфекционных заболеваний. Матер. юбил. научн.-произв.конф., посвященные 70 летию НИИ микробиологии МО РФ.-Киров, 1998.-С.249Ц250.
- Хамадеев, Р.Х Диагностика хламидиоза лошадей/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] / Матер. по актуальные проблемы живот. и ветеринарии. - Казань, 1999.-С.56Ц57.
- Хамадеев, Р.Х. Эритроцитарный диагностикум для обнаружения и идентификации возбудителя хламидиоза// Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов [и др.]// Матер. по актуальные проблемы живот. и ветеринарии.-Казань, 1999.-С.68Ц69.
- Хусаинов, Ф.М. Разработка эритроцитарного диагностикума для обнаружения и идентификации возбудителя хламидиоза /Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]// Матер. юбилейной научной конференции посвященной 50Цлетию Центра военноЦтехнических проблем биологической защиты НИИ Микробиологии МО РФ. Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария.-Екатеринбург ,1999.-С.259Ц260.
- Хусаинов, Ф.М. Профилактика и лечение хламидиоза крупного рогатого скота и свиней / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]//Ж. Ветеринарный врач, №4, 2000г.
- Хамадеев, Р.Х. Эпизоотологические факторы хламидиоза и основные принципы противохламидиозных мероприятий /Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, //Матер. Межрегиональной научноЦпрактической конф. По актуальным проблемам исследований в области зоотехнии и ветеринарной медицины в современных условиях.-Чебоксары, 2000.-С.129.
- Хусаинов, Ф.М. Профилактика хламидиозного аборта овец полиштаммовой инактивированной вакциной против хламидиоза крупного рогатого скота/Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]/ Матер. Международной научн. конф. посвященной 70Цлетию образования зооинженерного факультета "Инфекционные и инвазионные болезни"- Казань.-2000.-С.8.
- Хамадеев, Р.Х. Противоэпизоотические мероприятия при хламидиозе свиней / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Матер. Международной научн.конф. посвященная 70Цлетию образования зооинженерного факультета "Инфекционные и инвазионные болезни".-Казань.-2000.-С.78.
- Хамадеев, Р.Х. Эпизоотические особенности хламидиоза у животных и основные принципы противохламидиозных мероприятий / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] // Матер. Международной научн.конф. посвященная 70Цлетию образования зооинженерного факультета "Инфекционные и инвазионные болезни".-Казань.-2000.-С.99.
- Хусаинов, Ф.М. Профилактика хламидиозного аборта овец полиштаммовой инактивированной вакциной против хламидиоза крупного рогатого скота / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.] Матер.// Международной научн.конф. посвященная 70Цлетию образования зооинженерного факультета "Инфекционные и инвазионные болезни".-Казань.-2000.-С.100Ц101.
- Хамадеев, Р.Х. Течение хламидиоза и его профилактика на свинокомплексе / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] // Ветеринария, №2, 2000г. С.14Ц17.
- Хамадеев, Р.Х. Разработка и испытание набора препаратов для диагностики хламидиоза животных в РНГА/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов [и др.] /Матер. Всеросс. научн. практ. конф., посвященной 30Цлетию института. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. - Щелково.-2001.-С.56Ц58.
- Хусаинов, Ф.М. Изучение хламидиоза сельскохозяйственных животных в зоне Среднего Поволжья/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев [и др.]// Матер. Всеросс. научн.- производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии Ч.1.-Казань.-2002.-С.130.
- Хусаинов, Ф.М. Испытание на овцах в производственных условиях полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота/Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев [и др.] // - Матер. Всеросс. научн.- производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии Ч.1.-Казань.-2002.-С.126.
- Хамадеев, Р.Х. Совершенствование диагностики, мер борьбы и специфической профилактики хламидиозов/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов // Уч. Зап. КГАВМ , т.174, 2003, С.177-184.
- Хамадеев, Р.Х. Основные факторы эпизоотического процесса и разработка средств специфической профилактики хламидиоза/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] /Сельскохозяйственная биология - М.,2004.- С.70-77.
- Хусаинов, Ф.М. Разработка ассоциированной инактивированной вакцины против парвовирусной и хламидийной инфекции свиней и оценка её эффективности/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.] // Матер. Международного симпозиума "Научные основы обеспечения защиты от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", посвященного 45-летию образования института - Казань, 2005.- С.388-393.
- Хусаинов, Ф.М. Разработка средств специфической профилактики хламидиоза сельскохозяйственных животных/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.] // Матер. Международного симпозиума "Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", посвященного 45-летию образования института - Казань, 2005 - С. 393-395.
- Хусаинов, Ф.М. Изучение распространения хламидиоза голубей, обитающих на территории г.Казани/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.] //Материалы Международного симпозиума "Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", посвященного 45-летию образования института - Казань, 2005.- С.385-387.
- Хусаинов, Ф.М. КлиникоЦэпизоотологическое проявление хламидиозов крупного рогатого скота в хозяйствах Среднего Поволжья и Предуралья//Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]// Ж.Ветеринарный врач. №1Ц2006, С.32Ц37.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии