Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах рукописи

ФУРСОВА

АНЖЕЛЛА ЖАНОВНА

ХОРИОРЕТИНАЛЬНАЯ ДИСТРОФИЯ: ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ  У ПРЕЖДЕВРЕМЕННО СТАРЕЮЩИХ КРЫС OXYS И ЕЁ КОРРЕКЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНЫМ АНТИОКСИДАНТОМ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Новосибирск - 2009

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (Новосибирск)

Научный консультант:

доктор биологических наук                        Колосова Наталия Гориславовна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук

профессор                                                Сафронов Игорь Дмитриевич

доктор медицинских наук                        Грек Олег Рувимович

профессор

доктор медицинских наук                        Черных Валерий Вячеславович

Ведущая организация:                Институт терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Защита состоится л___ ____________ 2009 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета  Д 001.048.01 в Научном центре клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: ул. Академика Тимакова, 2, Новосибирск, 630117.

Тел/факс 8 (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦКЭМ СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан  _____________  2009  г.

Учёный секретарь:

диссертационного совета

доктор биологических наук                                        Н.А. Пальчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Возрастная макулярная дистрофия (ВМД) занимает лидирующее положение в мире среди заболеваний, ведущих к стойкому снижению зрения и слепоте (Егоров Е.А., 2006). Её выраженные проявления в разной степени присутствуют более чем у 50% европейцев старше 65 лет (Акопян В.С., 2004). Заболеваемость ВМД растет на фоне увеличения продолжительности жизни. В России, по разным данным, ВМД страдает от 14 до 46% населения этой возрастной группы. Ситуация осложняется несвоевременной постановкой диагноза и тенденцией к ломоложению заболевания, что ведет к инвалидизации трудоспособного населения. Патогенез ВМД до конца не ясен, эффективных способов лечения нет, что обусловлено неполнотой знаний механизмов развития заболевания - комплексного и многофакторного, как и сам процесс старения (Cook H. et al., 2008).

Патогенез ВМД связан с гипоксией и воспалением. Их мишенью становятся пигментный эпителий сетчатки, мембрана Бруха и сосуды хориоидеи. В качестве основного повреждающего звена выступает окислительный стресс - нарушение баланса между генерацией и детоксикацией активных форм кислорода (АФК), его следствием - отек, отслойка пигментного и нейроэпителия, кровоизлияния, неоваскуляризация, потеря зрения. Неоваскуляризацию в условиях гипоксии в тканях внутренних оболочек глаза больных ВМД провоцирует фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial grows factor - VEGF). Он экспрессируется в клетках пигментного эпителия и в физиологических условиях обеспечивает жизнеспособность и пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов (Lau L., 2007, Ding X., 2008).  Атрофия клеток пигментного эпителия и недостаточная экспрессия гена и синтеза белка VEGF ведут к  атрофии хориокапилляров и развитию  атрофической формы ВМД (Grisanti S., Tatar O., 2008). Ингибиторы VEGF снижают неоваскуляризацию, их всё шире используют в лечении ВМД, однако механизм участия этого фактора в патогенезе заболевания остаётся до конца не выясненным.

Окислительный стресс, с одной стороны, сопровождает возрастные изменения, с другой - становится их причиной. Несмотря на значительное количество работ, доказывающих связь с ним патогенеза ВМД, конкретные механизмы развития окислительного стресса в процессе старения организма и непосредственно тканей глаза до конца не ясны. Тем не менее, количество антиоксидантов, используемых в профилактике и лечении ВМД, постоянно растет. Объективная оценка их эффективности в профилактике любых возрастных изменений у людей затруднена различиями в базовой обеспеченности антиоксидантами и индивидуальными темпами старения, обусловленными как генетическими, так и социальными детерминантами. Недавно появился принципиально новый класс антиоксидантов, способных проникать и накапливаться в митохондриях - основном источнике АФК в соматических клетках. Впервые адресную доставку в митохондрии антиоксиданта mitoQ - комплекса убихинона (CoQ) и проникающего катиона трифосфония - осуществили М. Мерфи и соавт. . (Murphy M.P., 2001; Kelso G.F.,  2002). Ещё более эффективным соединением этого класса оказался  созданный в России SkQ1 Ц - катионный аналог хинона, составленный из пластохинона, проникающего катиона и деканового линкера (Скулачев В.П., 2007). Комплексные исследования показали, что SkQ1 является мощным антиоксидантом многократного действия, поскольку легко восстанавливается в дыхательной цепи митохондрий (Скулачев В.П. и др., 2008; Antonenko Y.N. et al., 2008). Обсуждаются большие потенциальные возможности применения митохондриально направленных антиоксидантов в терапии заболеваний, патогенез которых связан с окислительным стрессом (Cochem H.M., 2007), однако их внедрение невозможно без проведения всесторонних  фундаментальных исследований.

Один из подходов к выяснению этиологии и патогенеза, к разработке способов терапии - создание биологических моделей социально значимых заболеваний человека. Дистрофию сетчатки моделируют воздействием физических факторов либо используют генетические модели: животных трансгенных, с нокаутом генов или с определенными мутациями (Ding H., 2008). По характеру изменений и механизму развития они не могут быть строго отнесены к моделям ВМД, т.к. воспроизводят, как правило, одну из стадий заболевания, но не дают комплексной картины его развития. У людей ВМД развивается на фоне множественных  проявлений старения, возраст манифестации которых различается, затрудняя отделение причин от эффектов старения.

Существует три основных критерия соответствия модели тому или иному заболеванию: адекватность клинических проявлений, изменений на морфологическом уровне и реакция на стандартную терапию (Swanson K. S., 2004). По характеру морфологической и электронно-микроскопической картины близки развивающимся при ВМД у пожилых людей изменения глазного дна преждевременно стареющих мышей SAM(P8), появляющиеся у них к возрасту 10-12 мес. (Maji A.B., 2000). Сегодня эта линия - единственная общепризнанная модель преждевременного старения, однако клиническая картина изменений тканей глазного дна у них не исследовалась.

Исследования последних лет показали, что  комплексное проявление фенотипических признаков  преждевременного старения характерно и для крыс линии OXYS, созданной в ИЦиГ СО РАН селекцией крыс Вистар по признаку ранней катаракты. В пяти первых поколениях её развитие провоцировали обогащенной галактозой диетой (Соловьева Н.А., 1975). В дальнейшем отбор шёл по ранней спонтанной катаракте, сцеплено с которой животные унаследовали синдромом преждевременного старения. Его проявлениями становятся сниженная по сравнению с исходной линией крыс Вистар продолжительность жизни и раннее развитие возраст-зависимых заболеваний на фоне ранней инволюции тимуса и снижения активности Т-клеточного звена иммунной системы (Колосова Н.Г., 2001, 2003, 2008; Лоскутова Л.В., Колосова Н.Г., 2000; Маркова Е.В., 2003, Bobko A. et al., 2005; Kolosova N.G., 2006). Состояние линии по-прежнему контролируется по признаку ранней спонтанной катаракты, однако до настоящего времени анализ клинической картины возрастных изменений хрусталиков крыс OXYS не проводился. Наши предварительные исследования показали, что наряду с катарактой у крыс OXYS развиваются клинические проявления хориоретинальной дистрофии (ХРД), аналогичные наблюдаемым при ВМД у людей. Выяснение механизмов развития у крыс OXYS патологических изменений сетчатки как одного из проявлений преждевременного старения, обоснование соответствия линии  критериям модели ВМД, пригодной для изучения молекулярно-генетических основ формирования этого заболевания и оценки эффективности терапевтических воздействий, представляются актуальными как для фундаментальной медико-биологической науки, так и для практической медицины. 

Цель исследования: изучить особенности развития хориоретинальной дистрофии у преждевременно стареющих крыс линии OXYS, оценить профилактический и терапевтический потенциал  митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать клинические особенности  развития  патологических изменений сетчатки и хрусталиков у крыс OXYS.
2. Провести морфологическое исследование особенностей развития ХРД у крыс OXYS.
3. Изучить уровень экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF в тканях внутренней оболочки глаз крыс OXYS на разных стадиях развития ХРД.
4. Установить связь развития катаракты и ХРД у крыс OXYS с окислительным стрессом и оценить возможность воздействия на их течение препаратов со свойствами антиоксидантов.
5. Изучить  влияние митохондриального антиоксиданта SkQ1  на развитие хориоретинальной дистрофии  и катаракты у крыс OXYS и связь его эффектов с влиянием на экспрессию гена VEGF хориоретинальном комплексе и альфа-кристаллинов в хрусталиках.

Научная новизна исследования. Впервые показано, что у преждевременно стареющих крыс линии OXYS параллельно с катарактой развивается ХРД, по клиническим и морфологическим проявлениям соответствующая ВМД у людей, что позволяет рассматривать  эту линию как адекватную модель этого заболевания. Установлено, что в основе патогенеза ХРД у крыс OXYS  лежат склеротические повреждения сосудов хориоидеи, нарушение кровотока в них и деструкция пигментного эпителия, которые приводят к ишемии и повреждению нейросенсорных клеток.

Показано, что развитие ХРД у крыс OXYS связано с изменениями уровня экспрессии гена VEGF в хориоретинальном комплексе крыс OXYS: его снижением на ранних стадиях заболевания,  влияющим на тяжесть поражения сетчатки, и ростом в период  формирования выраженных патологических изменений, когда между экспрессией гена VEGF и тяжестью поражения сетчатки устанавливается положительная связь. 

Установлено, что окислительный стресс,  выступая в качестве патогенетического фактора развития ХРД и катаракты, не лежит в основе их этиологии у крыс OXYS: он характерен для развитых стадий заболевания.

Впервые выявлен высокий терапевтический потенциал митохондриального антиоксиданта SkQ1 - пластохинон-децил-трифосфония: его способность при профилактическом приеме с кормом или в виде капель полностью предупреждать развитие катаракты и ХРД у крыс OXYS и снижать выраженность  патологических изменений хрусталиков и сетчатки. Отработаны способы введения и оптимальная эффективная доза  SkQ1 для профилактики и лечения дистрофических изменений хрусталиков и сетчатки у крыс OXYS

Показано, что в основе эффектов SkQ1 лежит нормализация кровотока в сосудах хориоидеи, восстановление функций пигментного эпителия, которые на молекулярном уровне связаны с нормализацией уровня экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF в хориоретинальном комплексе.  Антикатарактальный эффект SkQ1 связан с его способностью повышать экспрессию основных белков хрусталиков -кристаллинов.

Научно-практическая значимость работы. Научно-практическая ценность работы определяется доказательством соответствия линии преждевременно стареющих крыс OXYS критериям модели катаракты и ВМД. Это открывает уникальные возможности для использования этих животных для исследования этиологии и патогенеза этих заболеваний, в том числе на ранних доклинических стадиях развития, а также для корректной оценки эффективности терапевтических воздействий. Использование крыс OXYS позволило выявить новое свойство препарата офтан-катахром (Сантен, Финляндия) - его эффективность в профилактике ВМД,  усовершенствовать рецептуру БАД Окулист (ОАО Диод). Высокая эффективность использования модели для оценки терапевтического потенциала новых препаратов продемонстрирована на примере митохондриально антиоксиданта SkQ1 (Центр митоинженерии МГУ). Установлена перспективность создания лекарственных препаратов на основе SkQ1 для профилактики и лечения катаракты и ВМД. Результаты исследования легли в основу создания ветеринарного препарата, эффективность которого подтверждена в испытаниях на домашних животных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Развитие у крыс OXYS хориоретинальной дистрофии  по клиническим и морфологическим проявлениям соответствует возрастной макулярной дистрофии у людей, развивается параллельно с формированием катаракты и является одним из проявлений преждевременного старения.
2. В основе патогенеза хориоретинальной дистрофии  у крыс OXYS  лежат склеротические повреждения сосудов хориоидеи, нарушение кровотока в них, деструкция пигментного эпителия, изменения уровня экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF в хориоретинальном комплексе: снижение экспрессии на ранних стадиях и повышение по мере прогрессирования заболевания.
3. Митохондриальный антиоксидант SkQ1 обладает высоким профилактическим и лечебным потенциалом в отношении катаракты и ВМД, его эффекты связаны с нормализацией кровотока, восстановлением пигментного эпителия и  экспрессии генов: VEGF в хориоретинальном комплексе и  -кристаллинов в хрусталиках.
4. Использование линии преждевременно стареющих крыс OXYS позволяет получать более объективную оценку эффективности новых способов лечения и профилактики катаракты и ХРД.

Апробация материалов диссертации. Результаты работы были доложены и обсуждены на следующих научных собраниях: Всероссийской научно-практической конференции Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты (Новосибирск, 2004); International conference Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health (Смоленск, 2003); межрегиональной конференции офтальмологов (Красноярск, 2003), научно-практической конференции Пептидные биорегуляторы в офтальмологии (Москва, 2005); школе офтальмологов Диагностика и современные методы лечения дистрофических заболеваний глазного дна (Новосибирск, 2006); V Всероссийской школе офтальмологов (Москва, 2005); 3 International Conference Basic science for medicine (Новосибирск, 2007); XV международной конференции Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Гурзуф, 2007); 5-й национальной конференции Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека (Смоленск, 2007); 3 Всероссийской научно-практической конференции Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов (Новосибирск, 2007); конгрессе Человек и лекарство. Урал-2007 (Тюмень, 2007); 7th Joint Meeting of AFERP, ASP, GA, PSE & SIF Athenaeum Intercontinental (Greece, Athens,2008); I научно-практической конференции Ионы Скулачева (Москва, 2007); III Всероссийском семинар научного общества офтальмологов России Макула 2008 (Ростов-на-Дону, 2008); научно-практической конференции Фундаментальные науки - медицине (Новосибирск, 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); 6th European Congress of Biogerontology - Ageing and individual life history (Netherlands, Noordwijkerhout, 2008); II международной конференции Ионы Скулачева (Суздаль, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано  30 печатных работ, из них 8 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.

Объём и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 231 странице машинописного текста. Диссертация содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 3 главы, содержащие результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список цитированной литературы. Работа иллюстрирована 54 рисунками, цифровой материал представлен в 10 таблицах, указатель литературы включает 81 отечественных и 231 иностранных научных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Работа выполнена на 1710 крысах линий OXYS и Вистар на базе Центра коллективного пользования генофондов животных ИЦиГ СО РАН. Возрастные изменения органа зрения (состояние хрусталиков и глазного дна) исследованы на самцах и самках крыс в возрасте от 3 недель до 24 мес. Оценка эффективности препаратов проведена на 593 (1186 глаз) самцах крыс OXYS и 299 (588 глаз) самцах крыс Вистар. Возраст животных варьировал в зависимости от цели исследования. Препараты животные получали индивидуально с кормом (на сухариках, контрольные - только сухарики) или в виде инстилляций в конъюнктивальную полость.

Методы офтальмологического обследования животных. Биомикроскопию проводили после расширения зрачков 0,5% тропикамидом на щелевой лампе Shin Nippon(Япония)  и ручной щелевой лампе-насадке к электрическому офтальмоскопу Betta 200  (Германия).  Глазное дно исследовали с помощью ручного электрического офтальмоскопа Betta -200. Выборочно проводили флуоресцентную ангиографию и фотографирование глазного дна на животных фундус-камере Оптон (Германия)  под фторотановым наркозом (1-1,5 минут) через минут после внутрибрюшинного введения 10% флюоресцеина натрия. Электроретинографию проводили под масочным фторотановым наркозом  с помощью ручной портативной электроретинографической системы Ephious AB (Швеция). 

Состояние хрусталиков оценивали в соответствии с принятой в клинической практике градацией степени помутнения  хрусталика по системе AREDS в баллах, стадии  дегенерации сетчатки у животных определялись по классификации Л.А. Кацнельсона с соавт. (1990) в баллах, соответственно степени тяжести процесса на основании данных офтальмоскопических и ангиогранфических исследований.

Биохимические методы. Определение уровня МДА в сыворотке крови по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (Esterbauer, Cheeseman, 1990), содержание продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов и оснований Шиффа в хрусталиках и хориоретинальном комплексе определяли согласно (Колосова Н.Г., 2002). Липиды крови - с использованием стандартных наборов фирмы Biosibо. Суммарную клеточную РНК из хрусталиков и хориоретинального комплекса выделяли  фенол-хлороформным методом (Маниатис Т., 1982). Уровень экспрессии гена VEGF исследован в рамках совместной работы А.М.Марковцом (ИЦиГ СО РАН), уровень экспрессии -кристаллинов - Ю.В.Румянцевой методом ПЦР в реальном времени в присутствии красителя SYBR Green I ("Molecular Probes", США) на амплификаторе iCycler iQ4 (Bio-Rad laboratories, США).

Морфологические методы исследования. Заднюю стенку глазного яблока фиксировали для получения полутонких срезов  в растворе 2,5% глютаральдегида, приготовленном на основе 0,2 М какодилатного буфера (рН 7,4). Материал постфиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия на холоде в течение 3-х часов, дегидратировали в спиртах восходящей концентрации, ацетоне, пропиленоксиде и заливали в эпон-812 (БоголеповаН.Н., 1976).

На ультратоме LKB-4 (Швеция) готовили полутонкие срезы, окрашивали 0,1% раствором толуидинового синего. Просмотр и фотографирование полутонких срезов производили на световом микроскопе Люмам И 1. Для световой микроскопии  фиксацию проводили жидкостью Карнуа, готовили рутинные гистологические препараты, окрашивали гематоксилином-эозином. Препараты изучали и фотографировали на фотомикроскопе Mild-Leitz /Germany/.

Характеристика препаратов, эффекты которых исследовали в работе

Офтан-катахром  (Сантен, Финляндия), состав 1 мл:  цитохром С 675 мкг, аденозин 2мг, никотинамид 20 мг; Цитраль 0,01% водно-спиртовый раствор; Окулист (Диод, Москва) в 30 мг  антоцианы черники - 10 мг, дигидрокверцетин - 15 мг, бета-каротин - 0,5 мг, селен - 15 мкг, применяемая  доза  91,5 мг/кг; Лютеин-комплекс (Экомир, Москва) в  500 мг лютеина  - 2 мг; экстракта черники - 130 мг,  витамина С - 100 мг; витамина  Е- 15 мг, витамина  А - 1100 ME; бета-каротина - 1,3 мг; цинка - 5 мг; меди - 0,5 мг;  селена - 15 мкг; таурина - 50 мг), доза 25 мг/кг; Миртасол - водный, 25% экстракт из плодов черники, содержащий антиоксиданты антоцианидины с добавлением микроэлемента селена (5мкг натрия селината в мл). Активное вещество - антоцианидины, в т.ч. гликозид миртилин, в незначительных количествах: яблочная и лимонная кислота, пектиновые вещества; Витамин Е (-токоферола ацетат, Уралбиофарм).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica, 5. Использовали факторный дисперсионный ANOVA анализ с post hoc сравнением групповых средних (Newman-Keul test). Как независимые факторы рассматривали генотип, препарат, возраст животных. При оценке эффективности терапии проводили зависимые парные сравнения (t-test dependent samples), сопоставляя состояние глаза до и после действия. Данные в таблицах и на рисунках представлены как Mm, где M - среднее арифметическое значение, m - стандартная ошибка среднего. Достоверными считали различия при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клинические особенности развития патологических изменений

глазного дна и хрусталиков у крыс OXYS

На первом этапе работы была охарактеризована  клиническая картина развивающихся у крыс OXYS патологических изменений глазного дна и хрусталика и проведен анализ зависимости заболеваемости животных от возраста. Стандартное офтальмологическое обследование показало, что катаракта и дистрофия сетчатки развиваются у крыс OXYS параллельно. Первые признаки катаракты в  хрусталиках появляются у них в возрасте 5-6 недель у 20% животных, к 3 мес. патологические изменения присутствуют уже в 90% глаз крыс OXYS, но все они соответствуют ранним стадиям заболевания. Заболевание активно прогрессирует с возраста 12 мес. и достигает выраженных стадий, предполагающих потерю или существенное ухудшение остроты зрения в к 14 - 18 мес. (рис. 1). 

По локализации в 45% случаев катаракта развивается по типу субкапсулярной в области заднего полюса хрусталика, у 30%  развивается ядерная катаракта, у 10-15% наблюдается клиновидное помутнение средних отделов коры хрусталика по его периферии, по мере прогрессирования процесса постепенно распространяющееся к оптической зоне. На рис. 2 приведены примеры биомикроскопической  картины катаракты в зависимости от локализации помутнений хрусталика у крыс OXYS. У крыс Вистар и в 24 мес. в 33%  глаз хрусталики остаются без изменений, а в остальных регистрируются изменения, подобные наблюдаемым у 3-месячных крыс OXYS.

  а б  в

Рис. 2. Виды катаракты в зависимости от локализации помутнений хрусталика. а- ядерная, б- передняя  субкапсулярная, в- задняя  субкапсулярная. 

Первые признаки ХРД у крыс OXYS  также регистрируются в возрасте 5 - 6 недель и достигают выраженных стадий к  12 - 14 мес.  (рис. 3). В 3 мес. 24% крыс OXYS имеют признаки, характерные для 2 стадии заболевания. К возрасту 6 мес.  признаки поражения сетчатки регистрируются у 100% крыс OXYS,  при этом у 75% выявляется предисциформная и у 25% - дисциформная стадия ХРД (см. рис. 3). Тяжесть заболевания прогрессирует и к возрасту 9 мес. у 30,5% животных диагностируется дисциформная, у 2,9% - рубцовая стадия развития ХРД. К возрасту 12 месяцев уже 44% заболевших имеют грубые необратимые изменения сетчатки, а у 31% выявляется дисциформная стадия с обширными кровоизлияниями и экссудативной отслойкой пигментного и нейроэпителия сетчатки. Изменений сетчатки у крыс Вистар обнаружено не было.

Анализ результатов обследования  позволяет нам выделить два критических периода для развития катаракты и ХРД  у крыс OXYS: от 1,5 до 3 мес. - возраст манифестации первых признаков, 12 - 14 мес. - период формирования ярко выраженных патологических изменений. Первый период характеризуется на офтальмоскопическом уровне перераспределением  пигмента,  появлением  мягких  экссудативных (ишемических) очагов,  единичных кровоизлияний, признаков атрофии хориокапиллярного слоя и пигментного эпителия. Такие изменения соответствуют 1-ой предисциформной стадии развития ВМД у людей.

     

  а  б в г

Рис. 4.  Примеры патологических изменений картины глазного дна крыс OXYS. а - мягкие экссудативные ишемические очаги, б - выраженные экссудативные изменения в заднем полюсе с отслойкой пигментного эпителия, в - экссудативная отслойка нейроэпителия, г -  выраженный артериолосклероз.

  а б  в

Рис. 5.  Флуоресцентная ангиография глазного дна крыс OXYS.  а  - зоны атрофии пигментного эпителия; б - субретинальная  транссудация, отслойка РПЕ, в -  отслойка нейроэпителия с участками субретинальной новообразованной мембраны.

Второй период - соответствует 2-ой (дисциформной) стадии с выраженными экссудативными изменениями, отёком центральной зоны, достигающей  2-3 диаметров диска зрительного нерва, в виде одной или нескольких полостей (кистозных образований) с экссудативной  отслойкой  ретинального пигментного эпителия, нейроэпителия. В 10 % случаев диагностируется репаративная стадия, при которой регистрируются признаки  неоваскуляризации с экссудативно-геморрагической отслойкой пигментного и/или нейроэпителия сетчатки и рубцеванием. Офтальмоскопически это проявляется субретинальным возвышением тёмного цвета, края менее чёткие, по ним могут быть единичные кровоизлияния различной степени зрелости.

а  б в г  д

Рис. 6.  Примеры кривых ЭРГ крыс OXYS разного возраста. По оси ординат -амплитуда в мВ, оси абсцисс -время, мс. а -  супернормальная ЭРГ, возраст 3 мес.; б - негативная ЭРГ, возраст 6 мес.; в - нормальная ЭРГ, возраст 3 недель; г - субнормальная ЭРГ, возраст 7 мес.; д - нерегистрируемая ЭРГ, возраст 12 мес.

Позже сетчатка уплощается, видны зоны рубцового перерождения. Просвет сосудов равномерно сужен по всей длине, световой рефлекс с сосудистых стенок вялый, тускнеет по мере уменьшения калибра сосуда. Выраженность патологических изменений глазного дна нарастает с возрастом животных на фоне развития  артериосклероза - сужения калибра артерий, признаки которого клинически выявляются уже в возрасте 4 - 5 мес. у 100% крыс OXYS. На рис. 4 приведены примеры офтальмоскопической картины изменений глазного дна крыс OXYS.

Данные офтальмологических наблюдений подтверждены ангиографическими исследованиями. Методом флуоресцентной ангиографии (ФАГ)  у крыс OXYS выявлено замедление кровотока как в артериальной, так и венозной системах сетчатки, чётко визуализируются зоны атрофии пигментного эпителия, участки сливающейся гиперфлюоресценции, характерные для предисциформных изменений (рис.5). При дисциформной стадии регистрируется  неоваскуляризация, расположенная под сетчаткой и быстро заполняющаяся красителем. На поздних стадиях выявляются участки просачивания красителя из неполноценных новообразованных сосудов,  неоднородная флюоресценция, нарастающая к поздней венозной фазе, и  выход контраста в артерио-венозную фазу из хориоидеи с медленным прокрашиванием субретинального транссудата (рис. 5). Границы очага имели более чёткие контуры при экссудативной макулопатии, были размыты и изменялись за время исследования при экссудативной отслойке нейроэпителия. При далеко зашедших стадиях заболевания в области дисциформной отслойки нейроэпителия проявлялись новообразованные сосуды и участки плотного экссудата или кровоизлияний с участками субретинальной новообразованной мембраны (рис. 5).

Электроретинография (ЭРГ) - метод количественной оценки функционального состояния нервных клеток сетчатки, основанный на регистрации биопотенциалов, возникающих в ней при световом раздражении. Его используют для диагностики, локализации, прогноза и контроля течения патологического процесса в сетчатке (Шамшинова А.М.,1999).  ЭРГ показала, что  фоторецепторы развиваются у крыс OXYS физиологично и к возрасту 3-4 недель регистрируется функционально зрелая электроретинограмма (рис. 6). Для крыс OXYS в возрасте 3 месяцев характерна супернормальная ЭРГ, которая характеризуется  увеличением амплитуды a- и b Цволн, вследствие  раздражения фоторецепторов, вызванного, можно предполагать, развивающейся к этому возрасту  гипоксией сетчатки (рис. 6а). К 6 мес. чувствительность сетчатки  к световому раздражителю снижается, изменяется величина отрицательной a- и b волн, ЭРГ носит субнормальный характер, что может быть следствием частичной атрофии внутренней части сегментов палочек и их ядер (рис. 6г). По мере прогрессирования дистрофических изменений происходит снижение амплитуды  b- волны, что может отражать усиление ишемии сетчатки и служить прогнозом нарушений зрительных функций (Matsui Y., 1994). При выраженных экссудативных  изменениях  сетчатки у крыс OXYS регистрируется негативная  ЭРГ с небольшим снижением  до изолинии амплитуды b-волны (рис. 6б).  К  12 месяцам  по мере прогрессирования дегенеративных процессов происходит угнетение ЭРГ,  вплоть до её исчезновения (рис.  6д).

Таким образом, биомикроскопические, офтальмоскопические исследования, подтверждённые методами ФАГ и ЭРГ, показали, что у крыс OXYS развивается дистрофия сетчатки, которая протекает на фоне катаракты и  по клиническим проявлениям соответствует ВМД у людей.

2. Морфологические особенности развития хориоретинальной дистрофии у крыс линии OXYS

У людей развитие ВМД связано с атеросклеротическими изменениями сосудов хориоидеи, изменениями мембраны Бруха и пигментного эпителия, и, как следствие, гибелью фоторецепторов. Анализ их состояния у крыс OXYS разного возраста, выполненный нами совместно с проф. И.П.Хорошиловой-Масловой (Московский институт глазных болезней им. Гельмгольца) методами световой микроскопии, выявил прогрессивное нарастание патологических изменений  с возрастом (рис. 7). Уже в 3 мес. у крыс OXYS регистрируются характерные для хронической ишемии изменения, связанные с расстройством кровообращения. Они развиваются на фоне сохранной структуры сосудистой оболочки глаза, но при этом наблюдается полнокровие сосудов, появление эритроцитов в околососудистых пространствах, сладж синдром, набухание ядер клеток эндотелия сосудов и выраженный  отек в слое ганглиозных клеток. 

В  возрасте 7 мес. у крыс OXYS выявляются склероз, уплотнение стенок сосудов во внутренних слоях сетчатки, фиброз стромы хориоидеи и редукция кровообращения в ней за счет облитерации просвета сосудов, преимущественно в зоне хориокапиляров. В возрасте 14,5 мес.  на фоне прогрессирующей артериосклероза и фиброза хориоидеи, облитерации просвета ее сосудов наблюдается частичная гибель клеток фоторецепторного слоя, которую можно рассматривать как результат нарушения трофики наружных слоев сетчатки через систему хориокапиляров.  Признаком развивающегося при этом окислительного стресса является накопление в апикальной части пигментного эпителия липофусциновых гранул, выявленное нами у годовалых крыс OXYS при электронно-микроскопическом исследовании (Нероев  В.В. и др., 2008).

а	б	в
г	Рис. 7. Примеры изменений хориоретинального комплекса крыс OXYS (а - в) и его морфологическая картина у крыс Вистар (г). Окраска гематоксилин-эозин, 400. а -  отек в слое  ганглиозных клеток сетчатки, ядра отодвинуты от внутренней пограничной мембраны; б -  сохраняется отек в слое ганглиозных клеток, в - тотальный фиброз хориоидеи, просветы сосудов не определяются.

Нарастание артериосклеротических изменений, нарушение системы пигментный эпителий - мембрана Бруха - слой палочек  приводит к возрасту  24 мес. к полной гибели фоторецепторного слоя у крыс OXYS: палочек, наружного ядерного и наружного плексиформного слоев. Их гибель связана с облитерацией сосудов, питающих эту зону сетчатки. В то же время внутренние слои, отличающиеся другим источником кровоснабжения, оставались относительно сохранными. В сетчатке некоторых двухлетних  крыс Вистар также отмечались атрофические изменения, но лишь на периферии, в то время как в центральной зоне структура сетчатки была сохранена.

Такая картина развития патологических изменений на морфологическом уровне полностью  подтвердилась в независимом совместном исследовании с  А.А.Жданкиной  (СибГМУ), выполнившей количественный анализ полутонких срезов сетчаток крыс OXYS (Жданкина А.А,, 2008). Уже в возрасте 5 мес. у крыс OXYS наблюдали деструкцию сосудов хориоидеи, истончение их стенок и сужение  просвета, явления сладжа форменных элементов крови (рис. 8а) и тромбоза (рис. 8б). Так, количество тромбированных сосудов у крыс OXYS было в 19 раз  больше, чем у контрольных крыс Вистар (р<0,05), количество открытых сосудов снижено в 2,3 раза (р<0,05) (табл. 1).

У пятимесячных крыс OXYS выявлены деструктивные изменения пигментного эпителия: уменьшение размеров эпителиоцитов, их уплощение, вакуолизация  цитоплазмы и деструкция микроворсинок, исчезновение базальной складчатости, снижение удельной площади пигментного эпителия в полтора раза (р<0,05; см. табл. 1).

  А Б 

Рис. 8.  Стаз форменных элементов в сосудах хориоидеи сетчатки крыс OXYS (а).  Тромбоз хориоидальных сосудов крыс OXYS (б). Возраст животных 5 мес. НЯС - наружный ядерный слой, ФС - фотосенсорный слой, ПЭ - пигментный эпителий, Х - хориоидея. Окраска толуидиновым синим. Ув. 900.

Таким образом, морфологический анализ показал, что как и при ВМД у людей, при развитии дистрофии сетчатки у крыс OXYS в первую очередь страдают сосуды хориоидеи, пигментный эпителий и радиальная глия. Относительная резистентность нейронов внутренних слоев, вероятно, может быть связана с компенсаторным открытием и расширением интраретинальных сосудов в наружном, внутреннем сетчатом и ганглионарном слоях.

Таблица 1.

Морфологические показатели состояния хориоретинального комплекса у крыс OXYS и Вистар в возрасте 5 мес. (Мm)

иния крыс	Удельная площадь открытых сосудов хориоидеи (%)	Удельная площадь сосудов хориоидеи со сладжем эритроцитов и тромбозом (%)	Удельная площадь пигментного эпителия сетчатки (%)
Вистар	36,00,7	1,520,09	5,430,1
OXYS	15,371,14*	28,782,24*	3,560,21

* достоверные различия между крысами Вистар и  OXYS, р<0,05

Изменения хориоретинального комплекса у крыс OXYS - типичная реакция на хроническую гипоксию - один из ведущих факторов патогенеза ВМД. Нарушение кровообращения, транскапиллярного обмена способствует развитию трофической недостаточности и дистрофических изменений сетчатки,  нарушению синтеза и метаболизма специфических белков в пигментном эпителии, рекрутированию в хориоретинальный комплекс из  циркуляции лейкоцитов и активации каскада  комплемента  (Friedman, D,2004 Chen, J et al., 2007). Такие результаты согласуются с выявленными у крыс OXYS методом магнитно-резонансной томографии нарушениями мозгового кровотока и характерными для хронической ишемии склеротическими изменениями церебральных сосудов, в том числе и глазных (Агафонова И.Г. и др., 2007).

3. Окислительный стресс и развитие хориоретинальной дистрофии у крыс OXYS

Окислительный стресс вовлечен в патогенез катаракты и ВМД - заболеваний, которые нередко развиваются одновременно и у людей пожилого и старческого возраста.  Задачей настоящего раздела работы явилась оценка возможной связи развития катаракты и ХРД у крыс OXYS с окислительным стрессом, в качестве маркёра которого исследовали содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови крыс разного возраста, а также их концентрацию в сетчатке и хрусталиках животных с активно прогрессирующими патологическими изменениями органа зрения. Содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови используют в клинической практике и в эксперименте в качестве маркера окислительного стресса для диагностики системных изменений его параметров на уровне организма. С возрастом и при различных заболеваниях этот показатель растет. Увеличено содержание продуктов ПОЛ и в крови людей c ВМД и со старческой катарактой (Ates M., 2004).

Работая с крысами OXYS 60-65 поколений, мы выявляли у них повышенный уровень продуктов ПОЛ в сыворотке крови (Колосова Н.Г., Фурсова А.Ж. и др., 2004). Однако в рамках настоящего исследования мы установили, что содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови крыс OXYS 70-80 поколений не отличалось от такового у крыс Вистар как в период появления первых признаков катаракты и ХРД, так и при развитии выраженных патологических изменений (n = 52, возраст 2, 6, 13 и 24 мес.). С возрастом содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови крыс OXYS и Вистар росло  и в 24 мес. было вдвое выше, чем у двухмесячных животных.

Примечательно, что первые признаки катаракты, по нашим данным, развиваются у крыс OXYS на фоне повышенного содержания в хрусталиках восстановленного глутатиона,  которое становится существенно более низким, чем у крыс Вистар только при развитии выраженных патологических изменений в возрасте 13 - 24 мес.  Проявлением окислительного стресса в этом возрасте становится снижение растворимости белков хрусталиков вследствие связанных с окислительным повреждением пострансляционных модификаций. В возрасте 3 мес., когда у крыс OXYS активно формируются патологические изменения, мы исследовали содержание продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и оснований Шиффа) непосредственно в хрусталиках и не выявили отличий от крыс Вистар. В то же время  наши исследования показали, что уже на начальных стадиях развития катаракты наблюдается значительное снижение экспрессии генов А- и В-кристаллинов в хрусталиках крыс OXYS, которое с развитием заболевания ещё усиливается (Румянцева Ю.В. и др., 2008).

В хориоретинальном комплексе трёхмесячных крыс OXYS были обнаружены только тенденции к повышению содержания продуктов ПОЛ: несколько выше, чем у крыс Вистар было содержание конечных его  продуктов - оснований Шиффа (на 25%, р=0,06). Окислительный стресс, таким образом, будучи патогенетическим фактором развития катаракты и ХРД, не лежит в основе их этиологии у крыс OXYS. Следует отметить, что и проявления преждевременного старения мозга развиваются у крыс OXYS раньше, чем повышается содержание окисленных белков и липидов в нём (Kolosova N.G., 2006). В то же время становление мозга крыс OXYS в ранний постнатальный период происходит на фоне гипоксии, обусловленной задержкой формирования микроциркуляторного русла: замедленной пролиферации эндотелия сосудов (Григорьева Т.А., 2005, Korbolina L.E., 2007). В возрасте 20 - 30 дней её проявлением становятся характерные для адаптации к тканевой гипоксии изменения энергетического метаболизма: накопление фосфокреатина и его повышенный расход на синтез АТФ (Sergeeva S., 2006). Отставание выявлено в формировании как артериальных, так и венозных микрососудов пиальной оболочки мозга и брыжейки кишки, что указывает на системный характер изменений. Проявлением системных изменений сосудистого эндотелия может быть и снижение продукции оксида азота в организме крыс OXYS (Bobko А., 2005). Эти данные, а также результаты наших морфологических исследований свидетельствуют в пользу сосудистой этиологии ХРД у крыс OXYS.

4. Экспрессия гена VEGF в хориоретинальном комплексе крыс OXYS при развитии ВМД

Патогенез ВМД тесно связан с изменениями экспрессии гена VEGF, который синтезируется в клетках пигментного эпителия и, проникая через мембрану Бруха, в физиологических условиях обеспечивает жизнеспособность и пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов (Lau L.et al., 2007, Ding H.et al., 2008).  Экспрессия  VEGF усиливается при гипоксии и запускает сигнальный каскад, который может приводить к неоваскуляризации при развитии влажной ВМД. В то же время атрофия клеток пигментного эпителия и недостаточные экспрессия гена и синтез белка VEGF ведут к  атрофии хориокапилляров и развитию  атрофической формы ВМД  (Grisanti S., Tatar O., 2008).  Задачей следующего этапа работы являлась оценка связи развития ХРД у крыс OXYS с возможными изменениями экспрессии гена VEGF в хориоретинальном комплексе. Для этого проведено сравнение его экспрессии у крыс OXYS (n=37) и Вистар (n=42) в возрасте 0,7 , 3, 12, 14 мес.

У крыс Вистар исследованных возрастных групп значимых различий в  уровне экспрессии гена VEGF, которую оценивали по уровню  мРНК,  выявлено не было. У  крыс OXYS в 3 мес. её уровень был в 2 раза ниже, чем в 20 дней (р<0,0002), а также в 12 и 14 мес. (р<0,001) (рис. 9).  Только в возрасте 3 мес. выявлены межлинейные различия в уровне экспрессии гена VEGF: у крыс OXYS он был в 2 раза ниже, чем у крыс Вистар (р<0,01).  Как показано выше, к возрасту 3 мес. у большинства крыс OXYS присутствуют офтальмоскопически выявляемые признаки ХРД, прежде всего - проявления ишемии, а также морфологические признаки дистрофических изменений клеток пигментного эпителия. Возможно, сниженная экспрессия гена VEGF приводит к развитию сосудистой недостаточности, выявленной при морфологическом исследовании. Склероз сосудов сопровождается  развитием ишемии и дальнейшим нарушением функций пигментного эпителия. По нашим данным, последнее проявляется на ультраструктурном уровне в накоплении в клетках пигментного эпителия липофусциновых гранул, а в межклеточном пространстве - продуктов неполного распада клеток палочек (Нероев В.В., 2008).

Поздние стадии ХРД протекают у крыс OXYS на фоне не отличающегося от выявленного у крыс Вистар уровня экспрессии гена VEGF. Однако корреляционный анализ показал,  что уровень экспрессии  прямо зависит от выраженности патологических изменений (r=0,69, p<0,03). Он максимален у животных с признаками скрытой и классической  хориоидальной неоваскуляризации. 

VEGF экспрессируется в основном в клетках пигментного эпителия, количество которых у крыс OXYS уменьшается с возрастом и по мере прогрессирования ХРД. Как и у пациентов с ВМД, у крыс OXYS  уровень его экспрессии повышен при поздних стадиях заболевания.

5. Воздействие на развитие катаракты и хориоретинальной дистрофии  у крыс OXYS препаратами со свойствами антиоксидантов

Одним из инструментов выяснения механизмов развития заболевания и показателем адекватности модели может служить оценка возможности  воздействия на его течение методами стандартной терапии. Мы исследовали влияние  ряда применяемых в клинической практике лекарственных препаратов и содержащих антиоксиданты БАД  на развитие ХРД и катаракты в период активной манифестации патологических изменений у крыс OXYS. Крысы OXYS и Вистар (контроль) после офтальмоскопического осмотра в возрасте 1,5 - 2 мес. в течение 45 дней получали препараты в виде капель (офтан-катахром и 0,01% цитраль) или индивидуально с кормом. Контрольные крысы получали, соответственно, физиологический раствор в каплях или обычное питание. Каждая группа включала 15 животных.

Офтан-катахром и цитраль в каплях. Oftan- Саtachrom (УСантенФ, Финляндия) - комбинированный препарат из группы антигипоксантов, который широко используется для лечения катаракты. Входящие в его состав  действующие вещества (в 1 мл его раствора содержится 0,675 мг цитохрома С, 1 мг натрия сукцината, 2 мг аденозина, 20 мг никотинамида) активизируют энергетические процессы в тканях при состояниях, сопровождающихся нарушением окислительных процессов в организме. 0,01% раствор цитраля Цтрадиционный кератопластический препарат использовался для сравнения. При предварительном осмотре животных в возрасте 2 мес. у 41% крыс OXYS выявлены признаки начальной катаракты, у 31% - дистрофические изменения, соответствующие 1 стадии ХРД. 

Через 45 дней (в возрасте 3,5 мес.) в контрольной группе заболеваемость катарактой и ХРД достигла 100% и 79%, соответственно. У 54% крыс OXYS изменения сетчатки соответствовали 2 стадии заболевания (рис. 10). Цитраль не повлиял на состояние хрусталиков и сетчатки животных, выраженность патологических изменений согласно зависимым парным сравнениям  возросла (соответственно, р < 0,014 и р<0,026). Катахром предупредил прогрессирование не только катаракты, но и ХРД. У крыс Вистар патологических изменений хрусталиков и сетчатки выявлено не было, препараты на их состояние не повлияли.

Рис. 10. Влияние инстилляций препаратов цитраль и офтан-катахром на развитие ХРД и катаракты у крыс OXYS. По оси ординат - распределение глаз по выраженности патологических изменений сетчатки и хрусталиков.

Таким образом, показано, что офтан-катахром, терапевтический потенциал которого направлен на улучшение окислительных и энергетических процессов в  тканях, не только препятствует прогрессированию катаракты, но и способен не менее эффективно задерживать развитие ХРД, что позволяет рекомендовать его в качестве средства для лечения и профилактики ВМД у людей.

Препараты с антиоксидантной активностью. Проведено сравнение эффективности профилактического приема с кормом животными биологически активных добавок: Окулист (91,5мг/кг), селен-актив (34,4 мг/кг), лютеин-комплекс (50 мг/кг ), Миртасол (20 мг/кг сухого  вещества ) и витамина Е (20 мг/кг).

У крыс Вистар патологических изменений выявлено не было ни при предварительном осмотре в возрасте 1,5 мес., ни после приёма препаратов. У крыс OXYS в 1,5 мес. заболеваемость катарактой и ХРД составила ~ 20% и достигла у контрольных животных к возрасту 3 мес. 100%.  Парные зависимые сравнения показали, что все препараты повлияли на развитие патологических изменений хрусталиков (для всех p<0,05), однако эффект их существенно различался. В профилактике катаракты наибольшую эффективность проявили Миртасол и Окулист, полностью предотвратив развитие патологических изменений хрусталиков (рис. 11). Далее по эффективности препараты распределились следующим образом: Лютеин-комплекс > витамин Е > Селен-актив. Несколько иначе повлияли препараты на развитие ХРД у крыс OXYS. Патологические изменения сетчатки не развивались на фоне приёма препаратов Лютеин-комплекс, Окулист,  Миртасол. Зависимые парные сравнения выявили значимый лечебный эффект Лютеин-комплекса -  снижение заболеваемости  ХРД. Такие результаты соответствуют известным данным клинических исследований, доказывающих патофизиологическую направленность действия этого препарата при ВМД. На фоне приема Селен-актива заболеваемость выросла до 80%.

Рис. 11. Влияние приёма препаратов с антиоксидантной активностью на заболеваемость крыс OXYS катарактой и ХРД.

Таким образом, нами продемонстрирована возможность воздействовать на развитие  катаракты и ХРД у крыс OXYS препаратами с антиоксидантной активностью. Это  свидетельствует в пользу адекватности модели, а также о связи патогенеза катаракты и ХРД  у крыс OXYS с окислительным стрессом и  о перспективности использования линии для оценки новых способов лечения и профилактики этих возрастных заболеваний органа зрения.

6. Оценка профилактического и лечебного потенциала митохондриального антиоксиданта SkQ1

Возможность предотвращать и задерживать развитие признаков преждевременного старения с помощью антиоксидантов свидетельствует в пользу связи его патогенеза у крыс OXYS с окислительным стрессом. Ранее показано, что эффективность антиоксидантов зависит от их способности предупреждать развитие дисфункций митохондрий, которые появляются уже у молодых крыс OXYS и с возрастом нарастают (Шабалина И.Г. и др., 1995; Колосова Н.Г. и др., 2001; Сапрунова В.Б., 2008).

Рис.12. Структурная формула молекулы SkQ1.

Следующим этапом нашей работы явилось исследование влияния на развитие ХРД и катаракты у крыс OXYS митохондриального антиоксиданта SkQ1, способного избирательно накапливаться в митохондриях, защищая  их от окислительного стресса и вызванного им митоптоза и апоптоза (Скулачёв В.П., 2007, Сапрунова В.Б., 2008).  Формула этого соединения приведена на рис. 12.

  6.1. Оценка профилактического эффекта SkQ1

Приём SkQ1 с кормом. На первом этапе у крыс OXYS в критический для формирования первичных признаков заболевания период была исследована способность SkQ1 влиять на развитие ВМД и катаракты. После предварительного осмотра с возраста 1,5 мес. и контрольные Вистар в течение  45 дней получали SkQ1 в дозе 50 нмоль на кг массы тела с кормом. Препаратом сравнения служил  витамин Е (20 мг/кг). Количество животных в каждой группе 15 (30 глаз).

При первичном осмотре (рис. 13) в 20% глаз крыс OXYS выявлены начальные изменения хрусталиков и в 13% - признаки  макулопатии. В возрасте 3 мес.  заболеваемость катарактой составила  90%. В 35% глаз  изменения соответствовали 2 баллам по шкале градации нарушений прозрачности хрусталика, преобладали передние и задние субкапсулярные  помутнения. Изменения  глазного дна были выявлены в 85% глаз, в 16% из них Ц  2-й (дисциформной ) стадии. У крыс, принимавших витамин Е, катаракта развивалась в 58% глаз, т.е. заболеваемость была в 1,8 раз меньше, чем в контроле, но при этом в 12%  глаз изменения соответствовали 2 баллам. Признаки ХРД выявлены у 54% крыс OXYS этой группы (в 1,5 раза меньше, чем у контрольных), 2-й стадии ВМД соответствовали  изменения в 8% глаз.

Рис. 13. Влияние приёма SkQ1 и  витамина  Е  (с кормом в течение 45 дней по 50 нмоль/кг и  20 мг/кг, соответственно) на развитие патологических изменений сетчатки и хрусталиков у крыс OXYS.

Приём SkQ1 снизил заболеваемость крыс OXYS катарактой и ХРД и существенно повлиял на тяжесть их течения. Изменения хрусталиков были выявлены в  46% глаз, но все они соответствовали 1 баллу. Признаки ХРД зарегистрированы  у 38% крыс OXYS и клинически соответствовали предисциформной стадии ВМД. Сравнение с заболеваемостью до начала лечения показало, что заболеваемость катарактой на фоне приёма SkQ1 увеличилась на 26%, что на 64% ниже контрольных значений.  Заболеваемость ХРД была  на 44% ниже, чем в контрольной группе крыс OXYS. У крыс Вистар изменений прозрачности хрусталиков и поражения  сетчатки ни до, ни после приёма препарата выявлено не было.

Таким образом, установлено, что SkQ1 эффективней, чем витамин Е предупреждает развитие катаракты и ХРД у крыс OXYS и/или снижает выраженность патологических изменений. Проведенное исследование  продемонстрировало перспективность использования SkQ1 в профилактике возрастных заболеваний органа зрения. Следующий этап работы был посвящен изучению  зависимости эффекта препарата от дозы.

Оптимальная  профилактическая доза препарата определялась на  крысах-самцах OXYS (n = 120) и  Вистар (n = 120), которые с  возраста 1,5 месяцев после первичного осмотра в течение 45 дней получали  SkQ1 в дозах 10, 50 или 250 нмоль/кг. Количество животных в группе - 30. В возрасте 1,5 мес. (см. рис.12) в 23%  глаз крыс OXYS были выявлены начальные признаки катаракты, в 20% - дистрофии сетчатки. У крыс Вистар патологических изменений хрусталика и сетчатки в возрасте 1,5 и 3 мес. выявлено не было.

Рис. 14. Оценка профилактического приёма различных доз SkQ1 на развитие катаракты и ХРД у крыс OXYS. Приём препарата с возраста 1,5 мес. в течение 45 дней. По оси ординат - % глаз с патологическими изменениями.

У всех контрольных крыс OXYS были выявлены признаки ВМД и катаракты  - они регистрировались в 97 и 100% глаз животных, соответственно.  Как показал дисперсионный анализ, SkQ1 повлиял на развитие дистрофии сетчатки (F3,а102=9,3, p<0,00002) и катаракты (F3, 102=17,2, p<0,00002).  Его эффект зависел от дозы и с её увеличением нарастал (рис. 14). Зависимые парные сравнения показали, что приём SkQ1 в дозах 10, 50 и 250 нмоль/кг предупреждал развитие патологических изменений сетчатки у крыс OXYS, которая была ниже, чем в контрольной группе в 3; 4,5 и в 18 раз, соответственно. Степень патологических изменений хрусталиков, выраженная в баллах, снизилась, соответственно, в 2, 3 и в 8,7 раза. Согласно парным зависимым сравнениям состояния хрусталиков до и после приёма препарата, у животных, получавших  дозу 10 нмоль/кг крыс OXYS к возрасту 3-м мес. катаракта всё-таки развивалась (р<0,005). На фоне приёма 50 и 250 нмоль/кг  SkQ1 прогрессирования заболевания не было (р=0,135 и р=0,62, соответственно). Более того, степень прозрачности хрусталиков в возрасте 3 мес. у них была достоверно ниже, чем в возрасте 5-6 недель (p<0,05).

В следующем эксперименте мы показали эффективность длительного приема  SkQ1. Животные получали его с возраста 1,5 до 24 мес. (до возраста 12 мес. n=30, >12 мес. n=10)  и периодически осматривались (проведено 7 осмотров). Длительные наблюдения подтвердили, что ХРД и катаракта у крыс OXYS с возрастом прогрессируют и развиваются параллельно, что затрудняет осмотры глазного дна у животных с развитой катарактой. Как видим на рис. 15, у крыс OXYS, получавших SkQ1в дозе 250 нмоль/кг, и в 24 мес. заболеваемость сохранилась  на уровне полуторамесячных животных. Достоверным был и профилактический эффект SkQ1 в дозах  10 и 50 нмоль/кг: он существенно изменил  характер течения заболевания - снизил процент глаз с выраженными стадиями заболевания, что повлияло и на среднестатистический показатель -  выраженность изменений  хрусталиков и сетчатки в баллах.

Рис. 15. Влияние длительного приёма SkQ1 (с возраста 1,5 мес.) на развитие катаракты и ХРД у крыс OXYS. По оси ординат - выраженность патологических изменений. * - достоверные отличия по сравнению с контрольными животными.

Результаты клинических наблюдений подтверждены данными ЭРГ (рис. 16). Показательным  явилось трёхкратное снижение амплитуды  b- волны ЭРГ (рис.17),  значительное снижение активности общей  ЭРГ, вплоть до полного её  угнетения, что  свидетельствует о грубом поражении всех слоёв сетчатки у  24 месячных крыс OXYS. На фоне приема 250 нмоль/кг  SkQ1 амплитуда была такой же, как  у 3-месячных крыс OXYS, что свидетельствует об адекватности биоэлектрического ответа сетчатки, сохранности  её фоторецепторного аппарата.

Высокую эффективность длительного профилактического приёма SkQ1 в дозе 250 нмоль/кг подтвердили и морфологические исследования сетчатки  24-месячных крыс OXYS. Отмечено уменьшение  фиброзных изменений стромы сосудистой оболочки,  сохранение просвета не только мелких, но и крупных хориоидальных сосудов, что,  возможно, обеспечивало полноценную трофику наружных слоев сетчатки, отсутствие отёка и сохранность нормального расположения её ганглиозных клеток. Отмечалось сохранение наружного ядерного слоя, толщина которого  в заднем полюсе  достигала 8-10 рядов, в то время как у  контрольных крыс OXYS этот слой  полностью отсутствовал.

В области, где визуализировались наружный и внутренний ядерные слои, у получавших 250 нмоль/кг SkQ1 крыс OXYS были сохранены  палочки, которые имели укороченный вид (рис. 18). Слой ретинального пигментного эпителия сохранялся в этих участках, и лишь местами выявлялась его отслойка.

 

Рис. 16. ЭРГ контрольных крыс OXYS в возрасте 3 и 24 мес. и 24-месячных крыс OXYS, получавших с возраста 1,5 мес. 250 нмоль/кг  SkQ1.

Рис.17. Амплитуда b волны ЭРГ  контрольных крыс OXYS в возрасте  3 и 24 мес. и 24-месячных, получавших с возраста 1,5 мес. 250 нмоль/кг  SkQ1. * - достоверные отличия от 3-месячных, # - от контрольных 24-месячных крыс.

Таким образом, продемонстрирована зависимость эффективности  препарата  от дозы, выявлена оптимальная доза (250 нмоль/кг), полностью предотвращающая развитие патологических изменений сетчатки и хрусталиков. Длительный приём препарата положительно повлиял и на общее состояние крыс OXYS, в том числе на одно из характерных проявлений старения - изменения качества шерстного покрова. Признаков негативного влияния на общее клиническое  состояние  и поведенческие реакции животных при  длительном применении  SkQ1 не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии кумулятивной токсичности.

 

а б  с Рис. 18.  Хориоретинальный комплекс  двухгодовалых крыс Вистар  (а), OXYS (б) и  OXYS (с), получавших SkQ1с возраста 1,5 мес. в дозе 250 нмоль/кг. а -нормальная сетчатка, слои: (1) палочки, (2) наружный ядерный слой, (3) наружный плексиформный, (4)  внутренний ядерный слой, (5) внутренний плексиформный, (6) ганглионарные клетки. б- нет фоторецепторов (все слои отсутствуют). в - дифференциация слоёв сохранена. Окраска ГЭ.  400.

Поскольку оптимальная лечебная форма препаратов в  клинической офтальмологической практике - капли, мы исследовали возможность применения SkQ1 в инстилляционной форме. После предварительного осмотра с возраста 1,5 мес.  крысы Вистар и OXYS были разделены на группы (n = 15), которые получали препарат в каплях с концентрацией SkQ1 10, 50 или  250 нМ (контрольные животные - физиологический раствор). На момент начала лечения изменения хрусталиков были диагностированы у 16% крыс OXYS, признаки начальной стадии ВМД - у 14% (рис.19). 

 

Рис 19. Влияние капель SkQ1 на развитие ХРД и катаракты  у крыс OXYS.

* - достоверные отличия от контрольных животных, # - достоверные отличия по сравнению с предыдущим обследованием, зависимые парные сравнения. По оси ординат - выраженность патологических изменений.

К возрасту 3 мес. у 85% контрольных крыс OXYS развивалась ХРД, в  5 мес. изменения сетчатки и сосудистого русла регистрировались у 100% животных.  Изменения носили начальный характер  и были представлены отёком центральной зоны глазного дна, точечными геморрагиями, атрофией хориокапилярного слоя  и мягкими ишемическими очагами. Инстилляции  10 нМ SkQ1 затормозили, а в концентрации 250 нМ полностью предупредили развитие патологических изменений. В 3 мес. наблюдалась зависимость эффекта препарата от дозы (F2,87=8,8; p<0.0003), в 5 мес.  выраженность изменений сетчатки у крыс, получавших различающуюся в 25 раз дозу препарата,  была одинаковой (рис. 19). ХРД всё-таки развивалась, но имела менее выраженные стадии.

К возрасту 5 мес. заболеваемость крыс OXYS катарактой достигла 100%. Инстилляции 10 нМ SkQ1 существенно снизили выраженность изменений, а 250 нМ SkQ1 полностью предупредили их развитие. В этом возрасте эффект не зависел от концентрации капель. Парные сравнения данных биомикроскопии  показали, что состояние хрусталиков оставалось таким же, как и в 1,5 мес.

Таким образом, установлена способность SkQ1 в каплях предупреждать развитие патологических  изменений хрусталиков и сетчатки.

6.2. Оценка лечебного потенциала  SkQ1

Оценивая способность SkQ1 влиять на состояние сетчатки и хрусталиков животных с уже развитыми клиническими признаками  катаракты и ХРД, проведено 5 экспериментов. Эффект препарата исследовался на крысах OXYS разного возраста (от 7 до 12 мес.), получавших после предварительного осмотра препарат с кормом или в виде капель. При оценке результатов лечения проводили зависимые парные сравнения - сопоставляли состояние конкретно каждого глаза до и после лечения.

6.2.1. Эффекты  SkQ1  при его приёме с кормом

Опыт 1 выполнен на 48 крысах Вистар и  OXYS в возрасте 10,5 мес. Половина животных в течение 1,5 мес. получала по 50 нмоль/кг SkQ на кг, остальные служили контролем.  Зависимые парные сравнения показали, что у  контрольных крыс OXYS увеличилась интенсивность помутнений хрусталиков (р<0,04) и прогрессировала стадия дистрофии сетчатки (р<0,01), в то время как под влиянием SkQ1 выраженность этих изменений значительно снизилась. В сетчатке животных этой группы наблюдалось уменьшение отёка, количества и площади ишемических очагов,  рассасывание кровоизлияний. У крыс Вистар препарат не влиял на состояние хрусталиков, изменений глазного дна не наблюдали (рис. 20).

Рис. 20. Влияние 45-дневного курса SkQ1 (50 нмоль на кг массы тела с кормом) на состояние хрусталиков и сетчатки крыс Вистар и OXYS. # - достоверные межлинейные различия, * - достоверные отличия от контрольных животных.

Опыт 2 выполнен на 38 крысах-самцах OXYS (76 глаз) с  выраженными патологическими изменениями глаз. С возраста  7,5 мес.  после осмотра все животные в течение 3 мес. получали с кормом SkQ1 по 250 нмоль/кг массы тела в сутки. При осмотрах в возрасте 9,5 мес. и 10,5 мес. парные зависимые сравнения выявили снижение выраженности изменений, как хрусталиков, так и сетчатки (рис. 21).

  На фоне лечения произошло уменьшение интенсивности заднекапсулярных помутнений, ограничение локализации их преимущественно в области капсулы и освобождение от помутнений области коры и глубжележащих отделов хрусталика. Аналогично развивалась ситуация и с изменениями сетчатки. В 38 глазах (50%) животных отмечено значительное снижение отёка макулярной области и резорбция ишемических очагов, в 18 (24%) полностью исчезли мелкие петехиальные кровоизлияния и в  3 (4%) случаях имела место полная регрессия изменений сетчатки и офтальмоскопически данных за макулярную дистрофию не было.

 

К концу 3-месячного курса лечения у всех крыс OXYS наблюдалась положительная динамика. Прозрачность хрусталиков увеличилась, обозначилась отчётливая биомикроскопическая картина: помутнение  уменьшалось в размерах и визуализировалось в виде локальных изменений  в заднекапсулярной области. При ядерной локализации  интенсивность визуализации изменений настолько снизилась, что видимая биомикроскопически,  не поддавалась чёткой фоторегистрации доступными методами. На глазном дне в 22 глазах (28%) офтальмоскопически имела место полная регрессия изменений, а у 28 (73%) животных отмечен переход из второй в первую стадию процесса. На рис. 22 представлены фотографии глазного дна крыс OXYS после курса лечения SkQ1.

Опыт 3  выполнен на 60 крысах-самцах Вистар и OXYS, половина которых с возраста 8 мес. получали SkQ1 по 250 нмоль/кг с кормом ежедневно. У контрольных животных патологические изменения хрусталиков и сетчатки прогрессировали, SkQ1 достоверно снизил выраженность патологических изменений и хрусталиков, и сетчатки (рис. 23).

Рис. 23. Влияние приёма с кормом 250 нмоль/кг SkQ1 на состояние сетчатки и хрусталиков крыс OXYS. По оси ординат - выраженность патологических изменений. * - значимые отличия по сравнению с состоянием при предыдущем осмотре (зависимые парные сравнения).

Рис. 24.  Распределение контрольных и  опытных  крыс OXYS по стадиям развития катаракты.

Опыт 4  выполнен на 60 крысах-самцах OXYS и Вистар в возрасте 12 мес., половина которых  получала  по 250 нмоль на кг массы тела SkQ1  с кормом в течение 45 дней. На момент начала лечения у крыс OXYS признаки помутнения хрусталиков присутствовали у 100% животных (рис. 24). В 34% глаз изменения соответствовали 2-м, в 66% - одному баллу. После полутора месяцев приёма SkQ1  в 12,5% глаз крыс OXYS хрусталики восстановили прозрачность, в 72% соответствовали помутнения соответствовали одному баллу и только в 15,5% - двум баллам. 

Через 3,5 месяцев лечения уже в 59% хрусталиков крыс OXYS не было выявлено патологических изменений, в 41% глаз изменения хрусталиков соответствовали 1 баллу и в 3% (один глаз) - двум баллам (рис. 24б). Таким образом, в результате лечения количество глаз с изменениями, соответствующих 2 баллам, снизилось  на порядок. В контрольной группе крыс OXYS количество животных со второй стадией достигло 60%, а у 5% крыс была диагностирована полная катаракта, соответствующая 3 баллам (рис. 24а).

У крыс Вистар изменений сетчатки не было выявлено ни при предварительном осмотре, ни после лечения. Катаракта на момент начала лечения у крыс Вистар присутствовала: по возможности, в группу подбирались животные с изменениями хрусталиков для проверки независимости эффектов препарата от генотипа. В 50% глаз крыс контрольной группы и в 54% опытной при предварительном обследовании были выявлены признаки помутнения хрусталиков. Катаракта у крыс Вистар проявлялась небольшими очаговыми стационарными помутнениями, которые не прогрессировали. Процент глаз с изменениями хрусталиков за период наблюдений вырос в контрольной группе до 83%.  После 1,5 мес. приёма SkQ1 количество глаз с катарактой снизилось вдвое,  но через 3,5 мес. лечения количество глаз с изменениями достигло 43%. Тем не менее, если заболеваемость контрольных крыс Вистар выросла в 1,7 раза,  то на фоне приёма SkQ1 она была ниже, чем до начала лечения.

У крыс OXYS на момент начала эксперимента глаз заболеваемость ХРД составила 100%,дистрофические изменения присутствовали в разной степени у всех животных. За период наблюдения в группе контрольных крыс OXYS процент животных с изменениями глазного дна, соответствующими 2-м баллам,  вырос с 18 до 43% (рис. 25). На фоне  приёма SkQ1 через 1,5  мес. патологические изменения сетчатки отсутствовали  в 25%, через 3,5 месяца - в 81% глаз крыс OXYS. При этом изменений, соответствующих второй стадии заболевания, выявлено не было. Таким образом, заболеваемость со 100% снизилась до 18% (рис. 25).

Таким образом, в 4 независимых экспериментах продемонстрирована способность SkQ1 при его приёме с кормом  снижать выраженность уже развитых патологических изменений  хрусталиков и сетчатки и/или нормализовать их состояние.

Рис. 25.  Распределение контрольных и  опытных  крыс OXYS по стадиям развития ХРД.

6.2.2. ечебный эффект  капель SkQ1

Исследование лечебного эффекта капель SkQ1 проведено на 4 группах: три эксперимента на взрослых животных  в возрасте  8-10 мес. и один на старых в возрасте 20-22 мес. с развитыми стадиями  катаракты и ХРД. Опытные крысы получали 250 нМ раствор SkQ1, контрольным закапывали физиологический раствор.

Рис. 26. Влияние капель SkQ1 (250 нМ) на состояние хрусталиков и сетчатки крыс Вистар и OXYS. Начало приёма для крыс Вистар - 10 мес., OXYS - 8 мес. * - отличия достоверны при зависимых парных сравнениях  состояния глаз до начала лечения, # - по сравнению с предыдущим обследованием.

Опыт 1 выполнен на 18 крысах OXYS в возрасте 8 мес. и  20  Вистар в возрасте 10 мес. Крыс Вистар  отбирали по наличию  патологических изменений хрусталиков. Эффект инстилляций 250 нМ SkQ1 оценивали через 21, 35 и 60 дней лечения. Препарат повлиял на выраженность патологических изменений хрусталиков  крыс OXYS (F3,114=37,9, p<0,000), интенсивность которых уже через 21 день лечения SkQ1 снизилась в 1,7 раза (p<0,012), через 35 дней лечения была  в 3,3 раза менее выраженной, чем у контрольных животных и оставалась на том же уровне через 60 дней (рис. 26). У крыс Вистар значимых изменений состояния хрусталиков выявлено не было.

Выраженность патологических изменений сетчатки при осмотре через 21 день лечения  SkQ1 у крыс OXYS  снизилась вдвое, через 35 - в 5,2 раза, а через 60 - в 15 раз. Наблюдалось исчезновение или уменьшение отёка, клинически менее выраженными стали проявления отслойки нейроэпителия, рассосались петехиальные  кровоизлияния, произошла резорбция ишемических очагов, в 2-3 раза снизилось количество твёрдых экссудатов.

 

Рис. 28. Влияние капель SkQ1  (250 нМ) на состояние сетчатки и хрусталиков крыс OXYS. Начало приёма с возраста 9 мес. * - статистически значимые изменения по сравнению с состоянием на момент начала эксперимента (зависимые парные сравнения, p<0,0005).

Опыт 2 выполнен на 60 крысах Вистар и OXYS, половина которых в течение 3,5 мес. получала 250 нМ капли SkQ1 с возраста 9 мес. У контрольных крыс OXYS патологические изменения хрусталиков и сетчатки прогрессировали (рис. 27). Лечение каплями SkQ1 в течение 1,5 мес. снизило выраженность патологических изменений  хрусталиков и сетчатки вдвое. Лечебный эффект сохранялся на фоне терапии в течение 3,5 месяцев и проявился в уменьшении отёка, количества и площади ишемических очагов, рассасывании кровоизлияний:  у 12 животных (23 глаза, 77%) геморрагии рассосались полностью, а у 3 (4 глаза, 13%) - частично.

Опыт 3  выполнен на  крысах OXYS в возрасте 12 мес. (n=50),  половина которых  в течение  2 мес. получала 250  нМ SkQ1 в каплях, вторая половина служила контролем. К возрасту 14 мес. у контрольных крыс OXYS количество глаз со 2-й стадией катаракты выросло в 1,5 раза. Зависимые парные сравнения показали, что у крыс OXYS, получавших SkQ1 в каплях, выраженность патологических изменений хрусталиков достоверно снизилась (p<0,000). В 22% глаз признаков катаракты не обнаружено. Препарат позитивно повлиял и на состояние сетчатки (p<0,0001): количество глаз без патологических изменений выросло втрое, не  было зарегистрировано и дистрофических изменений, соответствующих 2-й стадии заболевания. У контрольных крыс OXYS признаки ХРД прогрессировали (рис. 29).

Рис. 29. Влияние капель SkQ1  (250 нМ)  на распределение глаз крыс OXYS по выраженности патологических изменений хрусталиков и сетчатки. По оси ординат - процент глаз с изменениями разной степени выраженности. Прием препарата с 12 мес., обследование в 14 мес.

В этом опыте было проведено ультраструктурное исследование  хориоретинального комплекса крыс OXYS, патологические изменения сетчатки которых оценивалась в 2 балла, а после лечения 250 нМ каплями SkQ1 не были выявлены (Нероев В.В., 2008).  У контрольных крыс OXYS количество полноценных капилляров в хориоидее было  в 7 раз меньше, чем у крыс Вистар и присутствовали сосуды с признаками полной деградации.  Под влиянием капель SkQ1 количество полноценных хориокапилляров на единицу длины сетчатки глаза возросло с 2,33 до 9 (p<0,001), а  сосудов с признаками деградации - снизилось  с 6,67 до 2,33(p<0,01), произошло восстановление  структуры мембраны Бруха. У крыс OXYS, получавших SkQ1, увеличилось количество клеток пигментного эпителия и восстановилась их функциональную активность, о чем свидетельствовало появление большого числа фагосом, практически полностью отсутствующих в клетках пигментного эпителия контрольных крыс OXYS. Следствием этого явилась интенсификация удаления из клеток палочек отработанных наружных сегментов фоторецепторов и, следовательно, запуск обновления фоторецепторного слоя.

Опыт 4 выполнен на крысах Вистар в возрасте 22 мес. (n=12) и  OXYS в возрасте  20  мес. (n=10)  с тяжелыми поражениями хрусталиков и сетчатки. В 8% глаз крыс Вистар изменений хрусталиков не было, а в 25% они были представлены нежными периферическими помутнениями в заднекапсулярной области и не могли быть строго отнесены к 1 стадии катаракты. В связи с этим мы ввели промежуточную стадию - 0,5. 50%  глаз соответствовали 1 стадии катаракты, 17% - 2-й. Через месяц лечения SkQ1 мы уже не выявили глаз без изменений, стадии л0,5 всё также соответствовало 25% глаз, 1-й стадии - 62,5%, второй - 12,5%. У крыс OXYS до лечения в 11% глаз  катаракта соответствовала  1-й стадии, 47% -  второй и  42% - 3-й с полной утратой прозрачности хрусталика.  Через месяц лечения выявлено прогрессирование катаракты у крыс OXYS: уже в 63% глаз  изменения хрусталиков соответствовали 2-й, в 37% - 3-ей стадии заболевания.

Выраженное помутнение хрусталиков у старых крыс OXYS не позволило дать объективную оценку состояния глазного дна и влияния на него препарата. В целом результаты ожидаемы - не приходилось надеяться на позитивные изменения в потерявших прозрачность хрусталиках с развитой ядерной катарактой и разрушенной сетчаткой. В целом же результаты настоящего раздела убеждают в том, что  SkQ1 обладает терапевтическим потенциалом - способен нормализовать состояние хрусталиков и глазного дна животных и/или снижать выраженность патологических изменений. Эффект препарата зависит от возраста животных и выраженности патологических изменений. Восприимчивыми к лечению оказались  животные с начальными стадиями заболевания: у них наблюдалось стойкое улучшение состояния хрусталиков и сетчатки и/или его нормализация. У старых животных с более выраженными изменениями на глазном дне и развитой ядерной катарактой  лечебный эффект  практически отсутствовал.

6.3. Связь терапевтических эффектов SkQ1 с его влиянием на содержание в крови продуктов ПОЛ и экспрессию гена VEGF во внутренних оболочках глаз крыс OXYS

Известно, что антиоксиданты в высоких концентрациях могут выступать как прооксиданты. Показано  (Antonenko Y.N. et al., 2008; Скулачев  В.П., 2007), что SkQ1 отличает широкий коридор концентраций, в котором он проявляет свойства эффективного антиоксиданта и в водной, и в липидной фазах, причем в очень низких концентрациях. Во всех наших экспериментах мы использовали наномолярные концентрации и получили терапевтический эффект. При длительном приёме SkQ1 он был минимальным при дозе 10 нмоль/кг. Однако,  если профилактический приём препарата в дозах 50 и 250 нмоль/кг в течение года не повлиял на содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови, то у животных, получавших SkQ1 в дозе 10 нмоль/кг, этот показатель оказался выше, чем в контроле: у крыс Вистар в 1,7, у OXYS - в 1,6 раз (p<0,003).

Напомним, что по содержанию продуктов ПОЛ в сыворотке крови крысы Вистар и OXYS разного возраста в настоящее время не различается. Такие результаты указывают на ограниченность прогностической ценности исследования содержания продуктов ПОЛ в крови в диагностических целях и для оценки терапевтических эффектов антиоксидантов. Эффекты SkQ1, как и других антиоксидантов, не ограничиваются влиянием на уровень окислительных повреждений. Влияя на АФК-зависимые пути сигнальной трансдукции, они изменяют настройку  редокс-зависимых генных сетей: воспалительного ответа,  антиоксидантного ответа, теплового шока, апоптоза, метаболизма железа, остановки клеточного цикла (Drge W., 2002). Изменения экспрессии ключевых для развития ВМД и катаракты генов под влиянием SkQ1 были выявлены в нашей работе.

Для оценки связи терапевтических эффектов SkQ1 с его влиянием на  экспрессию гена VEGF у крыс OXYS проведено два эксперимента.  В них оценивали: 1) эффект профилактического приёма SkQ1 в критический для развития дистрофии сетчатки период с 1,5 до 3 мес. в дозе 250 нмоль/кг с кормом; 2) лечебный эффект 3-месячного курса капель SkQ1 (250 нМ), приём с возраста 9 мес. Влияние препарата на экспрессию гена VEGF сопоставляли с клиническим эффектом препарата.

Рис. 30. Влияние профилактического приёма SkQ1 на уровень экспрессии гена VEGF в тканях внутренних оболочек глаза крыс OXYS и Вистар. Начало приёма Приём препарата с 1,5 мес. по 250 нмоль/кг в течение 45 дней с кормом. # - достоверные отличия с Вистар (p<0,016), * - достоверное отличие с контролем (р<0,044).

Профилактический приём SkQ1 полностью предупредил развитие катаракты и дистрофии у крыс OXYS. Он не повлиял на экспрессию гена VEGF у крыс Вистар, в то время как у 3-месячных крыс OXYS на фоне приёма антиоксиданта этот показатель был таким же, как  у контрольных крыс Вистар (рис. 30).  Можно полагать, такой эффект был связан со способностью препарата предупреждать  развитие характерных для крыс OXYS дистрофических изменений пигментного эпителия и склеротические изменения хориоидеи.  Сопоставление уровня экспрессии гена VEGF с выраженностью патологических изменений сетчатки выявило тесную отрицательную связь между этими параметрами: r = -0,61, p<0,03. Таким образом, на ранних стадиях развития заболевания выраженность патологических изменений у крыс OXYS зависит от уровня экспрессии гена VEGF.

Экспрессию гена VEGF при лечении каплями SkQ1 (250 нМ) исследовали на крысах OXYS и Вистар в возрасте 9 мес. Препарат оказывал лечебный эффект (см. раздел 4.2, рис. 28). У крыс Вистар под влиянием капель SkQ1 наблюдалась тенденция к повышению экспрессии гена VEGF (р<0,075). У крыс OXYS она, напротив, достоверно снизилась (рис. 31). Принципиально важно, что уровень экспрессии гена VEGF, как и при профилактическом приеме препарата 3-месячными крысами OXYS, зависел от выраженности патологических изменений, но связь оказалась положительной (r=0,69, p<0,03). 

Рис. 31. Уровень экспрессии гена VEGF в тканях внутренних оболочек глаза контрольных и получавших с возраста  9 до 12 мес. 250 нМ капли SkQ1 крыс OXYS и Вистар. * - отличие достоверно по сравнению с контролем (р<0,019).

В этом же опыте мы оценили влияние SkQ1 на экспрессию -кристаллинов - основных структурных белков хрусталика (более 90%  водорастворимых белков). -кристаллины обеспечивают прозрачность хрусталиков как его структурные компоненты, выполняют роль шаперонов, предотвращают апоптоз. Снижение их экспрессии нарушает плотность и укладку волокон, светорассеивание хрусталика и приводит к агрегации кристаллинов других групп, неокисленное состояние которых обеспечивается шаперонной активностью -кристаллинов. Снижение экспрессии генов типично для сенильной катаракты и связано с повреждениями эпителиального слоя хрусталика. Предполагается, что снижение крыс OXYS экспрессии генов -кристаллинов (Румянцева Ю.В., Фурсова А.Ж. и др., 2008) и развитие катаракты у крыс OXYS также сопряжено с  дистрофическими изменениями эпителия хрусталика, несостоятельностью его дренажной и пластической функций, причины которой пока не известны (Колосова Н.Г. и др., 2003). В пользу связи патогенеза катаракты с окислительным стрессом свидетельствует  то, что  приём SkQ1 в каплях не только улучшил состояние хрусталиков крыс OXYS,  но и повысил в них экспрессию генов -кристаллинов. Экспрессия гена А-кристаллина была в 2,7 раза выше, чем у контрольных крыс OXYS и достигла уровня крыс Вистар. Экспрессия В-кристаллина увеличилась 3,4 раза по сравнению с контролем, но оставалась в 5 раз меньше, чем у крыс Вистар. При этом корреляционный анализ показал, что  выраженность патологических изменений хрусталиков у крыс OXYS завиcит от уровня экспрессии генов А-(r = -0,53, p<0,012) и  В кристаллинов (r = - 0,60, p<0,003) (рис.32).

Рис. 32.  Влияние 250 нМ капель SkQ1 (приём с 9 мес. в течение 3,5 мес.)  на экспрессию генов А- (а) и В-кристаллинов (б) в хрусталиках крыс Вистар и OXYS.  # - статистически значимые межлинейные различия, * -  статистически значимый эффект препарата

Таким образом, установлено, что митохондриальный антиоксидант SkQ1 эффективен как в профилактике, так и в лечении ХРД и катаракты у крыс OXYS. При профилактическом приеме он предотвращает их развитие, а при лечении - снижает выраженность патологических изменений и/или приводит к их полному исчезновению. Его лечебный эффект в отношении катаракты связан с повышением уровня экспрессии основных белков хрусталиков -кристаллинов, в основе которого могут лежать восстановление эпителия хрусталиков и активизация энергетических процессов в нём. В отношении ХРД эффект SkQ1 связан с влиянием на уровень экспрессии гена VEGF в хориоретинальном комплексе крыс OXYS, который антиоксидант нормализовал. Важно, что препарат не влиял на этот показатель у крыс Вистар. Направленность изменений (повышение или понижение экспрессии VEGF) у крыс OXYS зависела от возраста животных и стадии заболевания. Во всех случаях терапевтический эффект SkQ1 был связан с нормализацией состояния сосудов хориоидеи и сетчатки, с предупреждением дистрофических изменений пигментного эпителия и восстановлением его функций.

Таким образом, результаты наших исследований указывают на то, что ключевую роль в развитии дистрофии сетчатки у крыс OXYS могут играть: а) нарушения структурно-функционального состояния мембраны Бруха  и  клеток пигментного эпителия,  уменьшение количества полноценных митохондрий в них; б) инволюция эндотелия капилляров хориоидеи, их метаболическая несостоятельностью на фоне снижения уровня экспрессии гена фактора роста сосудистого эндотелия VEGF в клетках пигментного эпителия в критический для развития ХРД период; в) развитие атрофических  процессов в эндотелии хориокапилляров, облитерация их просвета со значительной регрессией хориоидального кровообращения, следствием которых становится дальнейшее поражение клеток пигментного эпителия и поражение фоторецепторной системы с полной атрофией наружных слоёв. 

Полученные результаты свидетельствуют в пользу связи преждевременного старения крыс OXYS с дисфункцией митохондрий. Способность SkQ1 влиять на развитие катаракты и ХРД у крыс OXYS свидетельствует о том, что их развитие зависит от скорости образования АФК внутри митохондрий. Направленно изменяя её, проникающий в митохондрии антиоксидант SkQ1  способен влиять на реализацию программы старения и не только предупреждать развитие катаракты и ХРД, но  обеспечивать структурно-функциональные предпосылки к восстановлению зрительной функции: нормализацию микроциркуляции в хориоидее и фагоцитарной функции клеток пигментного эпителия, нормализацию организации мембраны Бруха, а, следовательно, гематоофтальмического барьера. Все эти изменения  происходили на фоне существенного увеличения содержания в клетках митохондрий, формирования мощного хондриома, отличающегося большой протяженностью и развитой системой крист (Сапрунова В.Б., 2008, Нероев В.В. и др., 2008).

Невозможность изучать молекулярные механизмы развития ВМД на ранних бессимптомных стадиях, этические и правовые нормы, не позволяющие оценивать их в динамике развития заболевания,  ограничивают возможности исследования этиологии и патогенеза ВМД и катаракты у людей. Как показали наши исследования, уникальные возможности для изучения этиологии, патогенеза ВМД, его молекулярно-генетических механизмов открывает использование линии крыс OXYS - полноценной модели сенильной ВМД и катаракты. Опыт оценки терапевтического потенциала митохондриального антиоксиданта SkQ1  убеждает в высокой эффективности использования модели для объективной оценки эффективности новых терапевтических воздействий.

ВЫВОДЫ

1. У крыс OXYS параллельно развиваются катаракта и хориоретинальная дистрофия, которые по клиническим проявлениям биомикроскопической и офтальмоскопической картины соответствуют изменениям хрусталика и сетчатки у пациентов с сенильной катарактой и возрастной макулярной дистрофией.

2. Установлены критические периоды развития катаракты и возрастной макулярной дистрофии у крыс OXYS: первые признаки этих заболеваний зарегистрированы в 5-6 недель, активно прогрессирует с возраста 12 месяцев и достигают выраженных стадий, предполагающих потерю или существенное ухудшение остроты зрения к 14Ц18 месяцам.

3. У крыс OXYS развитие хориоретинальной дистрофии связано с нарушениями кровообращения и транскапиллярного обмена в  хориокапиллярах и вызванной этим хронической ишемией, ведущей к  структурно-функциональным изменениям пигментного эпителия,  дистрофическим изменениям мембраны Бруха и, как следствие, гибели клеток фоторецепторного слоя.

4.  Развитие дистрофии сетчатки у крыс OXYS связано с изменениями экспрессии гена VEGF в клетках пигментного эпителия:

а) первичные признаки заболевания формируются на фоне его двукратного снижения по сравнению с контролем,  когда между тяжестью заболевания и  уровнем экспрессией гена VEGF формируется отрицательная связь;

б) в период формирования выраженных патологических изменений  средние величины уровня экспрессии гена VEGF не отличается от контрольных,  но между ним и выраженностью патологических изменений связь становится положительной.

5. Развитие  катаракты и хориоретинальной дистрофии у крыс OXYS с различной эффективностью предупреждают препараты с антиоксидантной активностью, что свидетельствует в пользу адекватности модели, а также о связи патогенеза катаракты и ХРД.

5. Митохондриально направленный антиоксидант SkQ1 при его приеме с кормом  и в виде  капель в коньюнктивальную полость  предупреждает развитие катаракты и дистрофии сетчатки и снижает тяжесть течения этих заболеваний у крыс OXYS. Лечебный эффект SkQ1 наиболее существенно выражен при начальных, не имеющих грубых органических изменений стадиях заболевания.

6. Терапевтический эффект митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1 при ХРД у крыс OXYS связан с нормализацией уровня экспрессии гена VEGF, восстановлением микроциркуляции на фоне снижения признаков склероза и облитерации сосудов, которые обеспечивают трофику и в результате - сохранность фоторецепторов сетчатки.

7. Терапевтический эффект митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1 при лечении катаракты связан с увеличением уровня экспрессии генов -кристаллинов.

8. Линия преждевременно стареющих крыс OXYS - адекватная модель для исследования этиологии и патогенеза катаракты и ВМД,  для оценки эффективности новых способов профилактики и  лечения этих заболеваний.

 

 

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Фурсова А.Ж. Опыт лечения макулярной дегенерации сетчатки в отделении микрохирургии глаза ГНОКБ (1992-1997) / А.Ж Фурсова // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в здравоохранении: Тезисы научно-практической конференции. - Новосибирск.-1998. - С. 28-29.
2. Колосова Н.Г. Преждевременно стареющие крысы  OXYS как модель сенильной катаракты человека / Н.Г. Колосова, П.А.Лебедев, А.Ж.Фурсова, Т.С.Морозкова, О.Г. Гусаревич // Успехи геронтологии. - 2003. ЦТ. 12. - С. 143-148.
3. Гусаревич О.Г. Изучение влияния Офтан Катахрома на развитие макулярной дегенерации сетчатки (экспериментальное исследование) / О. Г. Гусаревич, А.Ж.Фурсова, Н.Г.Колосова// Клиническая офтальмология. -  2003. - а Т. 4. - аС. 186-190.
4. Фурсова А.Ж. Крысы  OXYS - универсальная модель старения органа зрения / А.Ж. Фурсова, П.А. Лебедев, О.Г. Гусаревич, Колосова Н.Г.  // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты:  Тезисы Всероссийской научно-практической конференции.- Новосибирск, 2004. - С. 311-312.
5. Фурсова, А.Ж.  Возможности использования диодного лазера в лечении сосудистой патологии сетчатки / А.Ж Фурсова, Н.В. Чубарь, О.Г. Гусаревич //Сибирский консилиум.- 2004. -.№ 6 (36).-С.52-55.
6. Lebedev Р.A. Interaction between oxidative stress and cataractogenesis in senescence-accelerated OXYS rats / Р.A. Lebedev, A.Zh.Fursova, N.G. Kolosova. // International conference Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health. - Smolensk, 2003. - P. 149.
7. Фурсова А.Ж. Экспериментальная макулодистрофия и катарактогенез  у преждевременно стареющих крыс OXYS на фоне окислительного стресса / А.Ж.Фурсова, О.Г Гусаревич, Н.Г. Колосова // Тезисы межрегиональной конференции офтальмологов. - Красноярск, 2003. - С. 58-59.
8. Колосова Н.Г. Макулодистрофия и катарактогенез у преждевременно стареющих крыс OXYS, их связь с окислительным стрессом /Н.Г. Колосова, А.Ж. Фурсова, П.А Лебедев, О.Г. Гусаревич // Офтальмологический журнал. - 2004. - № 3. - С. 237-242.
9. Фурсова А.Ж. Экстракт черники в профилактике макулярной дегенерации и катаракты у крыс OXYS / А.Ж. Фурсова, О.Г. Гусаревич, А.М Гончар, Н.А.Трофимова, Н.Г.Колосова // Успехи геронтологии. - 2005. - Вып. 16.ЧС. 76Ц79.
10. Фурсова А.Ж. Сравнительная эффективность реваскуляризирующих операций в лечении дегенеративных изменений сетчатки / А.Ж. Фурсова, О.Г. Гусаревич //Тезисы V Всероссийского съезда офтальмологов.ЦМосква,  2005.- С 346-347.
11. Фурсова А.Ж. Опыт диодной лазеркоагуляции сетчатки в лечении патологии макулярной области / А.Ж Фурсова, О.Г Гусаревич // Тезисы V Всероссийского съезда офтальмологов. - Москва,  2005.- С. 404-406.
12. Гусаревич О.Г. Центральная инволюционная хориоретинальная дистрофия / О.Г Гусаревич., А.Ж Фурсова. // Пептидные биорегуляторы в офтальмологии: Тезисы докладов научно-практической конференции.- Москва, 2005. - С.36-39.
13. Гусаревич О.Г. Ретиналамин в лечении центральной инволюционной хориоретинальной дистрофии / О.Г. Гусаревич, А.Ж.Фурсова  //Тера-медика. - 2005. - № 3.- С 46-53.
14. Колосова Н.Г. Разнонаправленное влияние антиоксидантов на тревожность крыс Вистар и OXYS / Н.Г.Колосова, Н.А.Трофимова, А.Ж.Фурсова // Бюллетень экспериментальной  биологии и медицины. - 2006. - Т. 141, № 6. - С. 59-62.
15. Фурсова А.Ж. Анализ изменения основных гемодинамических показателей орбиты при различных методах  лечения ишемических заболеваний сетчатки и зрительного нерва / А.Ж.Фурсова, О.Г.Фенькова, О.Г. Гусаревич //Современные методы диагностики в офтальмологии. Анатомо-физиологические основы патологии органа зрения. Сборник статей под ред. Х.П. Тахчиди.- Москва.- 2006.- С.134-135.
16. Mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 as therapeutic approach for cataract and retinal dystrophy / N.G.. Kolosova, A.J.Fursova, N.A. Trofimova, V.P. Skulachev // Basic science for medicine: 3 Intern. Conference. - Novosibirsk, 2007. - P. 33.
17. Опыт использования препарата черники для лечения центральной хориоретинальной дегенерации / А.Ж.Фурсова, О.Г. Гусаревич, А.М.Гончар, Н.Г.Колосова // Бюллетень  СО РАМН. - 2007. -  №1 (123). - С. 92-96.
18. Румянцева Ю.В. Возрастные изменения физико-химических характеристик хрусталиков и катарактогенез у крыс OXYS / Ю.В.Румянцева, А.Ж.Фурсова, Н.Г. Колосова // Сибирский консилиум. - 2007. - № 7 (62). - С.  230-231.
19. Фурсова А.Ж. Дистрофия сетчатки и катарактогенез у преждевременно стареющих крыс OXYS, их связь с окислительным стрессом / А.Ж.Фурсова, Ю.В. Румянцева,  Н.Г. Колосова // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: Материалы XV международной конф. - Гурзуф,  2007. - С. 429-430.
20. Румянцева Ю.В. Снижение экспрессии генов а-кристаллинов в хрусталиках предшествует манифестации окислительного стресса при развитии катаракты у крыс OXYS / Ю.В. Румянцева, А.Ж Фурсова., Н.Г. Колосова // Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека: Материалы 5-й национальной конференции. - Смоленск, 2007. - С. 397-399.
21. Профилактика и лечение катаракты и дистрофии сетчатки у крыс OXYS митохондриально направленным антиоксидантом SkQ1 Н.Г.Колосова, А.Ж.Фурсова, Н.А Трофимова, В.П. Скулачёв // Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека: Материалы 5-й национальной конференции. - Смоленск, 2007. - С. 395-397
22. Deaminated UV filter 3-hydroxykynurenine O-beta-D-glucoside is found in cataractous human lenses / O.A. Snytnikova, A.Zh Fursova , EI Chernyak , Vasiliev V.G., Morozov S.V., Kolosova N.G., Y.P Tsentalovich // Experimental Eye Research. -2008. - №  86(6).- Р.951-956.
23. Изменения физико-химических характеристик и экспрессии генов -криссталинов в хрусталиках крыс OXYS при развитии катаракты / Ю.В. Румянцева., А.Ж. Фурсова, Л.А. Федосеева, Н.Г. Колосова // Биохимия.-2008.- Т. 73, вып. 11.- С. 1467 - 1475.
24. Клинико-морфологические особенности хориоретинальной дегенерации у преждевременно стареющих крыс линии OXYS / А.А. Жданкина, А.Ж.Фурсова, С.В. Логвинов, Н.Г.Колосова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 145, № 10. - С.  435-438.
25. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Связанные с возрастом заболевания глаз. 1. SkQ возвращает зрение слепым животным / В.В. Нероев, М.М. Архипова, Л.Е. Бакеев, А.Ж. Фурсова, Э.Н. Григорян, А.Ю. Гришанова, Е.Н. Иомдина, Ж.Н. Иващенко, Л.А. Катаргина, Хорошилова, И.П. Маслова, О.В. Килина, Н.Г. Колосова, Е.П. Копенкин, С.С. Коршунов, Н.А. Ковалева, Ю.П. Новикова, П.П. Филиппов, Д.И. Пилипенко, О.В Робустова., В.Б. Сапрунова, И.И. Сенин, М.В. Скулачев, Л.Ф. Сотникова, Н.А. Стефанова, Н.К. Тихомирова, И.В. Цапенко, А.И. Щипанова, Р.А. Зиновкин, В.П. Скулачев // Биохимия. - 2008. - Т. 73, № 12. - С. 1641Ц1654.
26. Kolosova N.G. Dietary supplementation with bilberry extract prevents macular degeneration and cataracts in senescent accelerated OXYS rats / N.G. Kolosova, A.Z. Fursova, N.A. Stefanova. // Planta Medica. - 2008. -№74.- P. 288.
27. Марковец А.М. Экспрессия гена VEGF-A в сетчатке крыс OXYS при развитии дистрофии сетчатки в лечении митохондриально-направленным антиоксидантом SkQ 1 / А.М.Марковец, А.Ж.Фурсова, Н.Г.Колосова // Фундаментальные науки - медицине: Тезисы научно-практической конференции. - Новосибирск, 2008. - С. 40.
28. Румянцева Ю.В. Экспрессия генов кристаллинов в хрусталиках крыс OXYS при развитии катаракты на фоне лечения митохондриально направленным антиоксидантом SkQ1 / Ю.В.Румянцева, Н.Г.Колосова, А.Ж Фурсова. //Тезисы. IVсъезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. - С. 232.
29. Митохондриально направленный антиоксидант  SkQ1 в профилактике преждевременного старения крыс OXYS / Н.Г. Колосова, Т.Г. Амстиславская, Н.А. Стефанова, А.Ж. Фурсова // Тезисы. IVсъезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. - С.333.

30. Mitochondria-targeted antioxidant SkQ1: therapeutic approach for cataract and its connection with elevation of crystalline genes expression/ Yu.V Rumyantseva., A.J.Fursova, N.G Kolosova. // Ageing and individual life history : 6th European Congress of Biogerontology. - Netherlands, Noordwijkerhout, 2008. - P.30

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ	Аденозинтрифосфорная кислота
АФК	Активные формы кислорода
ВМД	Возрастная макулярная дистрофия
ДК	Диеновые коньюгаты
МДА	Малоновый диальдегид
ПОЛ	Перекисное окисление липидов
РПЕ	Ретинальный пигментный эпителий
ФАГ	Флуоресцентная ангиография
ХНВ	Хориидальная неоваскуляризация
ХРД	Хориоретинальная дистрофия
ЭРГ	Электроретинография
GSH	Восстановленный глутатион
VEGF	Фактор роста эндотелия сосудов

Соискатель

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине