Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Петрова Анастасия Олеговна Хлорамины аминокислот - ингибиторы агрегации тромбоцитов:
физико-химические свойства и механизм действия Биофизика - 03.01.02
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства
Научный консультант:
доктор биологических наук Мурина Марина Алексеевна
Официальные оппоненты:
Потапенко Александр Яковлевич - доктор биологических наук, профессор, ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой физики и математики Рууге Энно Кустович - доктор физ.-мат. наук, профессор, ФГБУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России, руководитель лаборатории физико-химических методов исследования
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук
Защита состоится 10 октября 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.057.01 при ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России по адресу: 119435, Москва, ул.
Малая Пироговская, д. 1а
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России
Автореферат разослан л______________2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Мурина М.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Сердечно-сосудистые заболевания наравне с онкологическими заболеваниями и диабетом прочно удерживают первенство среди самых распространенных и опасных заболеваний XX и XXI веков.
Патологический тромбоз, связанный с усиленной активностью тромбоцитов и повышенным внутрисосудистым свертыванием крови, - частая и непосредственная причина смерти при ряде сердечно-сосудистых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда и т.д.). Исходя из чрезвычайно важной роли, которую выполняют тромбоциты в процессе тромбообразования, существует острая необходимость в создании антитромбоцитарного препарата генерализованного типа действия, т.е. средства, которое угнетало бы все виды функциональной активности тромбоцитов независимо от природы агониста.
В последнее время резко возрос интерес к ковалентным (необратимым) ингибиторам тромбоцитов. Эти ингибиторы подавляют функции тромбоцитов путем химической модификации молекулярных мишеней клеток. По сравнению с другими ингибиторами, действие которых связано с обратимым связыванием с мишенью, эффективность ковалентных ингибиторов определяется их двумя основными свойствами. Одно из них заключается в перманентном угнетении функций тромбоцита на весь срок его жизни.
Второе свойство - кумулятивность небольших доз ингибитора в организме, что обеспечивает снижение побочного действия. К категории ковалентных ингибиторов относятся ацетилсалициловая кислота (аспирин) и тиенопиридины (тиклопидин, клопидогрел, прасугрел). Аспирин - давно признанное и высокоэффективное противотромбоцитарное средство (Awtry et al., 2000; Wu, 2003; Undas et al., 2007), необратимо блокирует циклооксигеназу I (синтазу простагландина Н2 - 1), ацетилируя гидроксильную группу 530 серина (Patrono et al., 2009). Тиенопиридины ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (Guerra et al., 2009). Механизм их действия заключается в необратимом блокировании связывания АДФ с тромбоцитарным рецептором P2Y12. Активными блокаторами этих рецепторов являются не сами тиенопиридины, а их метаболиты, образующиеся в печени (Clutton et al., 2001; Pereillo et al., 2002).
В качестве перспективного средства для борьбы с тромбозами также предложены хлораминовые производные биогенных соединений, главным образом аминокислот и таурина. Аминокислотные хлорамины являются природными веществами; они образуются в организме в активированных нейтрофилах при взаимодействии аминокислот с гипохлоритом, синтезируемым в реакции, катализируемой миелопероксидазой (Slivka et al., 1980; Thomas et al., 1979, 1995). Хлораминовые производные аминокислот обладают выраженной способностью угнетать функции тромбоцитов, в первую очередь их агрегацию (Мурина и др., 1998, 2004, 2006; Рощупкин и др. 1995, 2007). Поэтому возможно создание на их основе нового ингибитора тромбоцитов для предупреждения артериального тромбообразования (Мурина и др, 1998, 2010). Однако хлораминовые производные аминокислот - внутренне нестабильные соединения, что ограничивает возможность использование их в качестве лекарственного средства. Производные хлорамина таурина более стабильные соединения. Можно полагать, что они могут стать основой получения новых лекарственных соединений с антиагрегационным действием.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение физикохимических свойств и молекулярно-клеточных механизмов антиагрегантного действия стабильных хлораминовых производных аминокислот и таурина.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1. Изучить связь констант скоростей распада хлораминовых производных ряда аминокислот с их структурой.
2. Провести компьютерный квантово-механический расчет характеристик хлораминовых производных аминокислот, прежде всего, парциальных зарядов атомов, как показателей их устойчивости.
3. Исследовать антиагрегантные свойства хлораминовых производных аминокислот и таурина, выяснить изменения их активности под влиянием сывороточного альбумина.
4. Исследовать механизм модификации серосодержащих атомных групп при действии хлораминовых производных аминокислот.
Научная новизна исследования. Определены константы скоростей распада хлораминовых производных ряда моноаминовых -аминокислот.
Спектрофотометрическим методом выявлено несколько аминокислотных хлораминов с повышенной устойчивостью. К ним относятся N-хлорглицин, N-хлорвалин, Nхлортреонин и N-хлоризолейцин. Молекулам этих хлораминов свойственна структурная особенность в -положении. В случае хлорамина глицина отсутствует атом углерода в указанном положении, а производные остальных трех аминокислот имеют разветвление структуры. У менее устойчивых хлораминов (N-хлорсерин, N-хлорлейцин, Nхлорнорлейцин, N-хлораланин и N-хлорфенилаланин) замещен лишь один атом водорода.
Выходит, устойчивость хлораминов аминокислот в значительной степени можно отнести на счет свойств атома углерода в -положении. Это заключение подкрепляется результатами расчета парциальных зарядов атомов.
Проведен компьютерный расчет парциальных атомных зарядов Уанга-Форда хлораминов -аминокислот параметрическим квантово-механическим методом АМ1.
Показано, что хлорамины с повышенной устойчивостью отличаются высокими положительными суммами зарядов трех атомов: углерода в - и -положениях и атома углерода карбоксильной группы. Высокий парциальный заряд получен и для одного атома углерода в -положении. Эти расчетные величины можно использовать для предсказания устойчивости новых хлораминов. Одно из предсказаний свидетельствует, что наиболее высокие атомные заряды и устойчивость характерны для хлораминовых соединений аминокислотного ряда, у которых все атомы водорода в -положении замещены углеводородными цепями или гидроксильными группами.
Исследована закономерность угнетения хлориминовыми и хлораминовыми ингибиторами начальной агрегации изолированных тромбоцитов в присутствии сывороточного альбумина быка (БСА). Обнаружено, что в суспензии тромбоцитов с сывороточным альбумином антиагрегационное действие исследуемых соединений усиливалось. Согласно спектрофотометрическим измерениям, сывороточный альбумин способен связывать хлорамины (показано на примере N,N-дихлортаурина), что влечет за собой изменение конформации белка. Можно предполагать, что повышенная антиагрегантная эффективность хлораминов таурина в присутствии сывороточного альбумина есть результат особого взаимодействия с тромбоцитами белковохлораминового комплекса.
Спектрофотометрическим методом изучены возможные механизмы модификации серосодержащих атомных групп (на примере дитиотреитола) под действием хлораминовых производных аминокислот, а также гипохлорита (хлорноватистой кислоты).
Установлено, что в этом процессе происходит окисление серосодержащих групп с образованием циклического дисульфида (1,2-дитиан-4,5-диола). Действие гипохлорита или хлорамина на 1,2-дитиан-4,5-диол в умеренно кислой среде (рН около 3) приводит к образованию S-оксида (тиосульфината). Получено, что хлорамины способны модифицировать дисульфидные мостики тромбоцитов по пути образования S-оксидов.
Практическое значение работы. Обнаруженные нами закономерности антиагрегационного действия хлораминовых производных таурина на тромбоциты могут быть использованы для разработки нового лекарственного средства для борьбы с внутрисосудистым тромбообразованием. Кроме того, хлораминовые производные аминокислот являются вторичными продуктами миелопероксидазной реакции, протекающей в нейтрофилах, поэтому изучение функциональной активности клеток под действием хлораминов представляет интерес.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на национальной научнопрактической конференции Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека (Смоленск, 2007, 2009, 2011); на крымском симпозиуме Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии (Судак, 2008, 2009, 2010); на международной научной конференции Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем" (Минск, 2008, 2010); на научно-практической конференции Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины (Москва, 2008).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124 страницах, содержит рисунка, 2 таблицы и 5 схем, состоит из введения, глав Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и их обсуждение и выводов. Список литературы включает 1наименований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Реактивы коммерческие: гипохлорит натрия (Aldrich, 4%), аминокислоты (УFlukaФ и УSigmaФ), таурин, АДФ, бычий сывороточный альбумин, глутатион окисленный, глутатион восстановленный, буфер HEPES, 1,4-димеркаптобутан-2,3-диол (все фирмы УSigmaФ), коллаген (УServaФ).
Получение хлораминовых и хлориминовых производных аминокислот и таурина.
Хлораминовые и хлориминовые производные аминокислот получали при взаимодействии гипохлорита натрия с растворами аминокислот или иминокислот, молярная концентрация которых превышала концентрацию гипохлорита натрия примерно на 10 %. N,Nдихлортаурин получали при введении раствора таурина в раствор гипохлорита натрия в соотношение молярных концентраций 1:2 (Мурина и др., 1997). Образование монохлораминовых производных аминокислот контролировали спектрофотометрическим способом по наличию в спектре поглощения максимума 253 - 255 нм, а N,Nдихлортаурина - по наличию в спектре поглощения максимума 302 нм. Эти спектры снимали на спектрофотометре DU-720 (Beckman-Coulter). Концентрации хлораминовых и хлориминовых соединений и гипохлорита натрия определяли методом йодометрического титрования (Кудрявцев, 1986).
Объект исследования. Работа проводилась на тромбоцитах кролика в составе обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП), цельной крови кролика и изолированных эритроцитах и тромбоцитах кролика.
Выделение тромбоцитов. Для получения ОТП кровь стабилизировали 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 по объем и центрифугировали 15 минут при 460 g. Полученный супернатант, представляющий собой ОТП, отбирали для исследования.
Для выделения изолированных тромбоцитов кровь кролика стабилизировали кислым цитратом натрия (85мМ трхзамещнного цитрата натрия; 71мМ лимонной кислоты; 11мМ D-глюкозы; pH= 4,5) в объмном соотношении 5:1. После центрифугирования при 460 g мин в супернатант (ОТП) добавляли 1мМ ЭДТА и центрифугировали 7 мин при 1850 g.
Осажднные тромбоциты ресуспензировали в 0,1 объма 3,8% цитрата натрия (pH=7,4) и инкубировали 5 мин при 37С. Для работы суспензию тромбоцитов разбавляли буфером (10 мМ HEPES; 134 мМ NaCl; 5 мМ KCl; 1 мМ MgSO4; 0,5 мМ Na2HPO4; 0,5 мМ глюкозы;
pH=7,4) в 10 раз.
Регистрация агрегации тромбоцитов. Начальную агрегацию изолированных тромбоцитов исследовали нефелометрическим методом, который заключается в регистрации увеличения интенсивности света, рассеянного под малыми углами, при образовании мелких тромбоцитарных агрегатов. Для изучения такой агрегации в нашей лаборатории сконструирован кинетический нефелометр-агрегометр (Рощупкин и др., 1995), который позволяет регистрировать зависимость от времени интенсивности света, рассеянного в пределах 0,5Ц7о. Источником света служит гелий-неоновый лазер с длиной волны 632,8 нм. Количественным показателем агрегационной способности тромбоцитов было изменение интенсивности рассеянного света (I), регистрируемое через 60 секунд после введения агониста (АДФ). При исследовании действия соединений данные представлены в виде отношения I/IК*100%, где IК и I - изменение интенсивности рассеянного света (степень агрегации), регистрируемое через 60 секунд после введения АДФ, в контроле и при введении исследуемых соединений.
Агрегацию тромбоцитов в ОТП измеряли турбидиметрическим методом на агрегометре P.I.C.A. фирмы "Chronolog Cor." (США). Принцип регистрации агрегации тромбоцитов по методу Борна заключается в том, что при образовании агрегатов происходит увеличение светопропускания образца. Количественным показателем агрегационной способности клеток служило максимальное изменение светопропускания ОТП ( Т, степень агрегации), регистрируемое через 5Ц7 мин. после введения индуктора агрегации: АДФ или коллагена (Born, 1962).
Агрегацию тромбоцитов в составе цельной крови регистрировали импедансным методом на агрегометре Whole Blood Aggregometer 591 фирмы Chrono-log Cor..
Количественным показателем агрегационной способности тромбоцитов было изменение импеданса крови (A), регистрируемое через 8 минут после введения агониста АДФ (10 мкМ) и CaCl2 (1 мМ).
Компьютерный расчет парциальных зарядов атомов (электростатического потенциала). Была разработана компьютерная (расчетная) технология предсказания устойчивости хлораминовых антиагрегантов на основе расчета парциальных зарядов их атомов совместно с профессором кафедры биофизики ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.
Пирогова Минздравсоцразвития России Д.И. Рощупкиным. Компьютерные расчеты проводили с использованием пакета программ ChemBio3D Ultra 11. Процедура расчета включала следующие этапы. (1) Создание пространственной структуры молекулы хлорамина. Хлораминовую группу брали в незаряженной форме, поскольку, как известно (Gray et al., 1978), ее pK меньше 1. (2) Минимизация энергии и оптимизация геометрии соединения. Это необходимо для создания стандартной пространственной конфигурации атомов в молекуле, поскольку электростатический потенциал и соответственно парциальные заряды зависят от пространственного расположения атомов в молекуле. (3) Расчет в состоянии минимума энергии парциальных зарядов. Единицей измерения парциального заряда атомов служил модуль заряда электрона (мзэ).
В настоящей работе изучали парциальные заряды в варианте Уанга-Форда (WangFord). Основным методом минимизации энергии (теплоты образования) и расчета зарядов был параметрический метод квантовой механики АМ1 (от начальных букв английского названия Austin Model 1). В этом методе при расчетном решении волнового уравнения квантовой механики используются экспериментальные параметры. Отличие величин атомных зарядов при повторных расчетах составляло менее 2 %. Расчеты повторяли 3 раза.
Исследование распада хлораминов спектрофотометрическим методом. Водные растворы хлораминов в концентрации 2 мМ и 4 мМ (рН 7,4) сразу после синтеза помещали в кюветное отделение спектрофотометра. Для количественной характеристики измеряли начальную скорость уменьшения оптической плотности в максимуме поглощения хлораминовой группы атомов, а затем рассчитывали основную кинетическую характеристику - константу скорости. Определяли константу начальной скорости распада (k), чтобы исключить влияние вторичных процессов. Для этого в расчеты включали величины оптической плотности в начальный период времени ( t), когда ее снижение ( D) составляло не более 15Ц20% от исходного значения. Указанную величину константы рассчитывали по формуле: k = (|D|/D)/t (час-1), где D - исходная оптическая плотность образца.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием параметрического t-критерия Стьюдента. Результаты приведены в виде средних арифметических значений, их разброс описывали среднеквадратической ошибкой средней величины.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1.Зависимость устойчивости хлораминовых производных аминокислот от их структуры Известно, что аминокислотные хлорамины спонтанно распадаются и при этом происходят отщепление Cl Ц, дезаминирование и декарбоксилирование (Zgliczynski et al., 1971). Согласно количественным и полуколичественным измерениям, разные аминокислотные хлорамины могут сильно отличаться по устойчивости (Hawkins et al., 1998). Однако до сих пор не имеется достаточно полного количественного описания связи устойчивости биохлораминов с их структурой. Одна из проблем применения хлораминовых производных биогенных соединений в качестве противотромботической субстанции состоит в нахождении наиболее стабильной структуры. Была изучена устойчивость хлораминовых производных аминокислот и проведен квантовомеханический расчет характеристик хлораминовых производных аминокислот, прежде всего, парциальных зарядов атомов, как показателей их устойчивости.
1.1. Количественные закономерности распада хлораминовых аминокислот Экспериментально изучали в основном хлораминовые производные нециклических моноаминовых -аминокислот, а также хлорамин фенилаланина. Это было продиктовано тем, что невозможно осуществить синтез хлораминовых производных серосодержащих аминокислот, триптофана и тирозина вследствие протекания быстрых реакций гипохлорита не только с аминогруппой, но и с другими группами. Далее важно, что для обеспечения определенности интерпретации результатов целесообразно было исследовать именно хлорамины одинакового типа строения. Измеренные величины констант скоростей распада хлораминов представлены в таблице 1. Хлорамины расположены в порядке уменьшения средних значений констант скоростей, т.е. в порядке повышения устойчивости. Для сравнения в конце приведены данные для хлориминовых производных пролина и оксипролина. Хлориминовые соединения ведут себя как очень неустойчивые соединения (табл. 1).
Таблица 1. Константы начальной скорости распада хлораминовых производных аминокислот и иминоксислот.
Длина волны Константа начальной скорости Хлораминовые производные максимума спектра распада (ч-1) аминокислот поглощения (нм) 2 мМ 4 мм N-Хлорнорлейцин 254 0,720,06 - N-Хлорсерин 255 0,680,04 0,720,N-Хлорлейцин 254 0,660,04 - N-Хлорфенилаланин 257 0,640,01 - N-Хлораланин 253 0,560,04 0,520,N-Хлоризолейцин 256 0,480,04 - N-Хлорвалин 255 0,40,02 0,360,N-Хлортреонин 256 0,390,02 - N-Хлорглицин 255 0,060,01 0,050,N-Хлорпролин 257 16,81,04 - N-Хлоргидроксипролин 262 17,380,91 - В целом, как уже отмечалось в других работах (Hawkins et al., 1998), имеется зависимость устойчивости аминокислотных хлораминов от структуры. Константы скоростей N-хлорфенилаланина, N-хлорлейцина, N-хлорсерина, N-хлорнорлейцина статистически не различаются между собой. Условно отнесем эту первую группу хлораминов к категории слабо устойчивых. Константы скорости распада этой группы соединений статистически достоверно выше константы (уровень значимости p<0,01) Nхлораланина. Константа N-хлораланина достоверно (p<0,015) отличается от константы скорости распада N-хлоризолейцина и следующих за ним хлораминов.
Условно назовем N-хлоризолейцин, N-хлорвалин, N-хлортреонин, а также N-хлорглицин повышенно устойчивыми. Среди них особо высокой устойчивостью выделяется хлорамин глицина, что можно отнести на счет отсутствия у него атома углерода в -положении.
Следует обратить внимание на то, что отличие в структуре слабо устойчивых и повышенно устойчивых аминокислотных хлораминов имеет место уже на уровне атома углерода в положении.
Сравнительно давно известно, что хлорамины серина и лейцина распадаются примерно одинаково, но быстрее хлорамина валина (Zgliczynski et al., 1971). По данным других авторов (Hawkins et al., 1998), которые измеряли время, в течение которого абсорбция уменьшается в 2 раза, можно составить следующий ряд интенсивности распада аминокислотных хлораминов: N-хлорпролин >> N-хлорсерин N-хлорлейцин > Nхлортреонин N-хлорвалин. Все эти соединения распадаются быстрее хлораминов изолейцина и глицина. Наши результаты измерений констант скоростей распада (табл. 1) удовлетворительно согласуются с указанными данными.
Представляет интерес один из частных случаев зависимости устойчивости аминокислотных хлораминов от их структуры. Имеется разница в устойчивости в группе хлораминовых производных трех структурных изомеров лейцина: повышенной устойчивостью обладает N-хлоризолейцин (табл. 1). Его структура отличается от строения N-хлорлейцина и N-хлорнорлейцина, в частности, тем, что в -положении имеет место разветвление, один из двух атомов водорода замещен на другую группу атомов.
На основании всех данных можно сформулировать эмпирический структурный признак повышенной устойчивости некоторых аминокислотных хлораминов. У них либо отсутствует атом углерода в -положении (N-хлорглицин), либо в указанном положении обязательно замещены два атома водорода на другие группы атомов: гидроксильную и метильную группы (N-хлортреонин) или две углеводородные группы (N-хлорвалин, Nхлоризолейцин). У слабо устойчивых хлораминов замещен лишь один атом водорода.
Выходит, устойчивость хлораминов аминокислот в значительной степени можно отнести на счет свойств атома углерода в -положении. Это заключение подкрепляется результатами расчета парциальных зарядов атомов.
1.2. Компьютерный расчет парциальных зарядов Из данных литературы известно, что устойчивость и реакционную способность соединений можно предсказывать по величине некоторых физико-химических характеристик. Среди них, прежде всего, важны парциальные электрические заряды атомов в молекуле данного соединения. Эта величина представляет собой разность между зарядом ядра атома и расчетным зарядом электронов в области этого атома.
Компьютерный расчет дает парциальные заряды всех атомов изучаемого соединения.
Исходя из общих соображений, можно было бы предполагать, что для оценки устойчивости аминокислотных хлораминов важны заряды атомов азота и хлора хлораминовой группы. Однако результаты расчета зарядов этих атомов оказались неожиданными. Хлораминовые производные различных аминокислот, представленные в таблице, мало отличаются друг от друга по величине зарядов атома хлора хлораминовой группы; эти заряды составляют 0,09 - 0,11 модуля заряда электрона. В ряду изученных хлораминов не наблюдается существенной разницы парциальных зарядов атома азота хлораминовой группы (рис. 1, кривая 5). Поэтому не представляется возможности прямо соотнести разницу в устойчивости хлораминов различных аминокислот со свойствами хлораминовой группы, хотя при их распаде (Zgliczynski et al., 1971, Hawkins et al., 1998) происходит отщепление атома хлора в виде Cl - и дезаминирование.
Были сопоставлены заряды атомов углерода в -положении (C), -положения (C карбоксильной группы (C). Предварительный анализ показал, что кроме зарядов отдельных атомов полезно использование суммы зарядов трех и двух атомов углерода: C, C, C или C, C. Полученные данные представлены на рис. 1 по следующей схеме.
Основной величиной была выбрана сумма зарядов атомов C, C и C. Соединения ранжировали по величине этой суммы. Хлорамину с наименьшей суммой присваивали номер 1, следующему хлорамину с большим значением суммы устанавливали номер 2 и т.
д. Если было необходимо сравнить другой зарядовый показатель (зависимый) с основным или родственные соединения (зависимые) с основной группой, то зависимые соединения располагали в ряд по порядку основной группы. Расчеты проведены и в состоянии недиссоциированной карбоксильной группой и в ионной форме. Заряды атомов C, C, C этих двух форм хлораминов в некоторой степени различаются. Вместе с тем последовательности величин сумм зарядов и заряда C очень близки (данные не приводим).
Рис. 1 Парциальные атомные заряды, мзэ аминокислотных хлораминов.
0,1 (кружочки) - сумма зарядов трех атомов 0,углерода: в -, -положении и карбоксильной 0,группы;
0 2 (звездочки) - заряд атома углерода в положении;
-0,3 (треугольники) - заряд атома азота.
-0,, мзэ - атомный заряд, модуль заряда -0,электрона;
-0,Номера соединений: 1 - 9 - хлораминовое производное цистеиновой кислоты, -фенилаланина, аланина, лейцина, норлейцина, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Номер соединения серина, изолейцина, валина, треонина.
Для изученных хлораминов характерно резкое отличие и по знаку, и по абсолютной величине сумм зарядов атомов углерода (рис. 1, кривая 1). В значительной степени варьирование этих сумм обусловлено атомом углерода -положения (рис.1, кривая 2).
Далее важно, что выделяется группа хлораминов, состоящая из N-хлоризолейцина, Nхлорвалина и N-хлортреонина. Эта группа явно отличается от остальных изученных хлораминов: атом C имеет положительный заряд (0,16 - 0,30 мзэ), суммы парциальных зарядов атомов углерода C, C и C достигают высоких положительных значений (0,5 - 0,мзэ). Такие суммы в случае остальных хлораминов в 2-3 раза меньше, либо вообще отрицательные. Сопоставление этих результатов с экспериментальными данными, касающимися констант скоростей распада (табл.1), показывает, что заряд атома C и сумма зарядов атомов углерода C, C и C отражают устойчивость аминокислотных хлораминов.
К категории повышенно устойчивых относятся те соединения, у которых пара этих показателей достигает значительных положительных значений.
Сейчас строго связать величины расчетных зарядов атомов углерода с механизмом распада хлораминов затруднительно. Формально, возможно, существенно, что в случае повышенно устойчивых хлораминов складывается такая ситуация, что получается система из значительных по абсолютной величине разноименных зарядов: отрицательный заряд атома азота хлораминовой группы (рис.1, кривая 3) и положительный заряд рассматриваемых атомов углерода. Именно такого рода части молекул обладают повышенной устойчивостью.
Таким образом, полученные данные позволяют предложить расчетный зарядовый показатель устойчивости аминокислотных хлораминов. Признаком повышенной устойчивости хлорамина можно считать значительные положительные значения заряда атома C и суммы зарядов атомов углерода C, C и C. Одно из направлений проектирования новых более устойчивых аминокислотных хлораминов может заключаться в изменении состояния атома C путем разветвления структуры.
1.3. Устойчивость и антиагрегационные свойства новых хлориминовых производных таурина Использование квантово-механического метода расчета парциальных зарядов атомов привело к обнаружению новой (ранее неизвестной) группы хлораминов - производных хлоримина таурина. Хлоримины получаются при замещении атома водорода хлораминовой группы на углеводородные радикалы. Был синтезирован ряд хлориминовых производных таурина, в том числе N-метил-N-хлортаурин (Мурина и др., 2010).
Устойчивость хлоримина контролировали спектрофотометрическим методом. Видно, что N-метил-N-хлортаурин обладал устойчивостью в течение нескольких месяцев (рис. 2).
D T/ TK, A/ AK, % 10,0,0,2 3 2 3 1 25 4 210 250 290 30,5 1 1,С, мМ Длина волны, нм Рис. 2. Спектры поглощения Рис. 3. Действие N-метил-N-хлортаурина на N-хлорметилтаурина (2 мМ). агрегацию тромбоцитов в составе ОТП и 1 - Сразу после синтеза; цельной крови. 1, 2 - Агрегация тромбоцитов в 2, 3 и 4 - соответственно через составе ОТП, индуцированная соответственно 4,5 и 6 месяцев хранения. АДФ (10мкМ) или коллагеном (12 мкг/мл) и D - оптическая плотность. СаCl2 (2мМ); 3, 4 - агрегация тромбоцитов в Образец хранился в концентрации составе цельной крови, индуцированная 2 мМ при температуре +10 С. соответственно АДФ (10 мкМ) или коллагеном (12 мкг/мл) и СаCl2 (4 мМ).
T/ TK, A/ AK, - Степень агрегации тромбоцитов в составе ОТП или цельной крови. С - концентрация, мМ.
Получено, что N-метил-N-хлортаурин обладает выраженным антиагрегационным эффектом в системах ОТП и цельной крови (рис. 3).
Таким образом, с использованием квантово-механического метода расчета парциальных зарядов атомов, были синтезированы хлориминовые производные таурина, которые являются не только стабильными соединениями, но и проявляют выраженный антиагреационный эффект.
2. Действие хлораминовых производных аминокислот и таурина на изолированные тромбоциты Для понимания механизма антиагрегантного действия хлораминов на тромбоциты важно изучать не только обычную конечную агрегацию тромбоцитов (образование крупных агрегатов), но и начальную - образование мелких агрегатов клеток. Начальную агрегацию изолированных тромбоцитов в виде суспензии в забуференном физиологическом растворе регистрировали нефелометрическим методом. Было изучено действие нескольких хлораминовых производных таурина. Эти соединения отличаются устойчивостью и могут быть перспективными соединениями для борьбы с тромбозами, опосредованными тромбоцитами (Мурина и др., 2010). N,N-Дихлортаурин подавляет начальную агрегацию клеток на 50% (С50) в концентрации примерно 0,2 мМ (рис. 4). NМонохлортаурин и N-хлор-N-метилтаурин оказывают более слабое антиагрегационное действие: в конечной концентрации 0,75 мМ ингибирование агрегации составляет соответственно 15 3 и 16 4 %.
I/ IК, % I/ Iк, % 11 150 0 0,5 1 1,5 0 0,2 0,4 0,6 0,С, мМ С, мМ Рис. 4. Концентрационные зависимости Рис. 5. Концентрационные зависимости действия N-монохлортаурина (кривая 1) и действия N-хлор-N-метилтаурина на N,N-дихлортаурина (кривая 3) на начальную начальную АДФ-индуцированную АДФ-индуцированную агрегацию агрегацию изолированных тромбоцитов в изолированных тромбоцитов. суспензии в забуференном 2, 4 - в суспензию тромбоцитов вводили БСА физиологическом растворе (кривая 1) и в (0,34 мМ), а затем соответственно N- присутствии БСА (0,34 мМ) (кривая 2).
монохлортаурин и N,N-дихлортаурин (С50 - С - концентрация, мМ.
0,02 мМ). С - концентрация, мМ.
Сравнение данных, представленных на рис. 3 и рис. 5, показывает, что эффективность ингибирования агрегации тромбоцитов N-хлор-N-метилтаурином в составе ОТП либо в цельной крови значительно выше ингибирования агрегации изолированных тромбоцитов.
Можно полагать, что действие хлораминов в ОТП потенцируется белками плазмы крови.
Далее было исследовано действие хлораминовых производных таурина и аминокислот на агрегацию изолированных тромбоцитов в присутствии сывороточного альбумина быка (БСА). Получено, что при действии N,N-дихлортаурина, Nмонохлортаурина и N-хлор-N-метилтаурина на суспензию тромбоцитов с БСА (0,34 мМ) антиагрегационное действие хлораминов резко усиливается (рис. 4 и 5).
Для сравнения были исследованы хлораминовые производные глицина и фенилаланина. N-Хлорглицин (0,025 мМ) снижал агрегацию тромбоцитов в чистой суспензии клеток и в присутствии альбумина (0,34 мМ) соответственно на 224 и 4510 % (p<0,05). Антиагрегационное действие N-хлорфенилаланина в присутствии БСА также усиливается (рис. 6). N-Хлорфенилаланин (0,25 мМ) ингибирует агрегацию изолированных тромбоцитов на 272 %, а если в суспензию тромбоцитов предварительно ввести БСА (0,34 мМ) и затем N-хлорфенилаланин (0,25 мМ), то агрегация снижалась на 524 % (p<0,05). Такое же антиагрегационное действие оказывало введение в суспензию тромбоцитов смеси БСА и N-хлорфенилаланина, предварительно проинкубированной в течение 5 минут. При добавлении в суспензию тромбоцитов сначала N-хлорфенилаланина (0,25 мМ), а затем БСА (0,34 мМ) степень агрегации снижалась на 445 %. Таким образом, антиагрегационный эффект хлораминов в присутствии БСА не зависит от последовательности введении их в суспензию тромбоцитов и обусловлен модификацией альбумина.
Рис. 6. Действие N-хлорфенилаланина (0,I/ IK, % мМ) на агрегацию изолированных 1тромбоцитов в присутствии сывороточного альбумина быка (0,34 мМ).
1 - в суспензию тромбоцитов вводили соответственно N-хлорфенилаланин;
2 - в суспензию тромбоцитов вводили смеси соответственно БСА с N-хлорфенил50 аланином (p<0,05 от 1);
3 - в суспензию тромбоцитов сначала вводили БСА, а затем соответственно Nхлорфенилаланин;
1 4 - в суспензию тромбоцитов вводили соответственно N-хлорфенилаланин (p<0,от 1), а затем БСА.
Известно, что гипохлорит натрия обладает выраженным антиагрегационным действием на тромбоциты. Встает вопрос, будет ли ингибирующее действие гипохлорита усиливаться в присутствии БСА. В работе было изучено влияние гипохлорита натрия на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов. Получено, что ГХН (0,24 мМ), введенный в чистую суспензию тромбоцитов и суспензию тромбоцитов с альбумином (0,34 мМ), ингибирует агрегацию в одинаковой степени - на 404 % и 407 % соответственно. Если смесь ГХН и БСА предварительно инкубировать 5Ц10 минут, а затем ввести ее в суспензию тромбоцитов, то ингибирование агрегации тромбоцитов составляет лишь 23 9 %. Таким образом, получили, что усиления антиагрегационного действия ГХН на изолированные тромбоциты в присутствии БСА не происходит.
Одно из объяснений усиления сывороточным альбумином быка антиагрегационного действия хлораминов может быть представлено следующим образом: БСА образует комплекс с хлораминовыми производными аминокислот и таурина, и этот комплекс обеспечивает более эффективную реакцию хлораминов с тромбоцитами.
3. Изучение взаимодействия N,N-дихлортаурина с сывороточным альбумином спектрофотометрическим методом Для экспериментального выяснения механизма взаимодействия хлораминовых производных таурина и сывороточного альбумина было изучено изменение спектра поглощения сывороточного альбумина при введении в него раствора хлорамина.
Достаточно определенно такое изучение возможно только в случае N,N-дихлортаурина, полоса поглощения которого с максимумом 302 нм не полностью перекрывается с полосой поглощения белка. С этой целью в раствор альбумина (0,07 мМ) в фосфатном буфере (рН=7,4) вводили N,N-дихлортаурин в конечной концентрации 1 мМ (2 мМ по активному хлору) и записывали спектры поглощения. В работе анализировали разность между спектром поглощения смеси хлорамина с альбумином и спектром поглощения чистого белка, так называемые дифференциальные спектры. Их получали расчетным способом на основе электронных таблиц указанных спектров.
Можно было бы думать, что в смеси большая часть хлорамина прореагировала с серосодержащими группами белка. Это не согласуется с характеристиками дифференциального спектра поглощения, т. е. разности спектра поглощения смеси альбумина с хлорамином и спектра чистого раствора белка. На рис. 7 видно (кривая 2), что полоса поглощения N,N-дихлортаурина при длинах волн более примерно 295 нм сохраняется в дифференциальном спектре, полученном сразу после приготовления смеси.
Полоса поглощения N,N-дихлортаурина слабее полосы поглощения свободного хлорамина не более 8 % (рис 7, кривые. 1 и 2). Это может быть объяснено тем, что лишь небольшая часть N,N-дихлортаурина прореагировала с сульфгидрильной группой в альбумине [Carr et al., 2001]. В наших экспериментах, судя по изменению оптической плотности в максимуме поглощения N,N-дихлортаурина, в первые минуты с БСА реагирует 0,0,024 мМ N,N-дихлортаурина (по активному хлору).
Из анализа остальной части дифференциального спектра поглощения видно, что введение N,N-дихлортаурина в раствор альбумина приводит к появлению структурированной полосы в области 265Ц295 нм в дифференциальном спектре поглощения. Слабо выраженные пики в этой полосе и более коротковолновой области хорошо воспроизводятся. Среди этих пиков имеются следующие: 253, 256, 267, 273, 277, 280, 285, 287, 290, 293 нм. В своем большинстве эти пики проявляются в дифференциальном спектре, полученным путем сдвига спектра поглощения альбумина быка в длинноволновую область на 1 нм. На основании этих результатов и данных литературы (Kandagal et al., 2006; Loll et al., 1994) можно предположить, что N,Nдихлортаурин переводит молекулы альбумина в другое состояние, затрагивающее микроокружение остатков ароматических аминокислот: фенилаланина (пики в области 255Ц270 нм), тирозина (пики в области 280Ц285 нм), триптофана (290Ц295 нм).
D, D Рис. 7. Спектр поглощения раствора 0,N,N-дихлортаурина в концентрации 2 мМ (по активному хлору) (кривая 1) и разности 0,между спектром поглощения смеси N,Nдихлортаурина (2 мМ) c альбумином (0,0,мМ) и спектром поглощения сывороточного альбумина быка, регистрируемые сразу 0,(кривая 2) и после двух часовой инкубации смеси (кривая 3).
0,D - оптическая плотность (кривая 1);
D - разность оптических плотностей (кривые 2 и 3).
245 265 285 305 3Длина волны, нм В итоге есть основания утверждать, что N,N-дихлортаурин взаимодействует с сывороточным альбумином, изменяя его конформацию.
Важно отметить, что через 2 часа инкубации смеси альбумина и N,N-дихлортаурина происходит заметное изменение дифференциального спектра при длинах волн короче 2нм, относящихся к белку, а поглощение N,N-дихлортаурина изменяется примерно на 15% (рис. 7, кривая 3). Это указывает, что изменение состояния белка под влиянием хлорамина в целом развивается во времени.
Итак, антиагрегантное действие хлораминовых производных аминокислот и таурина усиливается в присутствии сывороточного альбумина. Согласно спектрофотометрическим измерениям, сывороточный альбумин способен связывать N,N-дихлортаурин, что влечет за собой изменение конформации белка. Можно предполагать, что повышенная антиагрегантная эффективность хлораминов в присутствии сывороточного альбумина есть результат особого взаимодействия с тромбоцитами белково-хлораминового комплекса.
4. Модификация сульфгидрильных и дисульфидных групп аминокислотными хлораминами Способность исследуемых хлораминов и гипохлорита вызывать образование дисульфидов из тиолов и превращение дисульфидов в S-оксиды нами была исследована методом спектрофотометрии. Опыты проведены на растворах дитиотреитола (1,4димеркаптобутан-2,3-диол). Этот выбор был обусловлен тем, что в дитиотреитоле очень быстро протекает процесс внутримолекулярного образования дисульфидной связи, так что вторичные реакции окисления сульфеновой группы, являющееся начальным продуктом окисления тиольной группы, не проявляются. На рисунке 8 видно, что спектр поглощения раствора дитиотреитола после действия N-хлорглицина имеет выраженный максимум при 283 нм. Этот спектр принадлежит циклическому дисульфиду 1,2-дитиан-4,5-диолу, ранее полученному в иных условиях (Сараsso et al., 1984).
D 0, 1,2-дитиан-4,5-диол 0,Рис. 8. Спектры поглощения:
1,2-дитиан-4,5-диол, получающийся при 0,окисления 1,4-димеркаптобутан-2,3-диола (0,мМ) N-хлорглицином (0,5 мМ, кривая 1);
дитиотреитол (0,5 мМ, кривая 2) и Nхлорглицин (0,5 мМ, кривая 3).
220 260 3D - оптическая плотность.
Длина волны, нм Действие гипохлорита или хлораминов на 1,2-дитиан-4,5-диол в умеренно кислой среде (рН около 3) приводит к изменению спектра поглощения в коротковолновой части (рис. 9, кривая 2): здесь резко усиливается поглощение и появляется плечо. Это плечо можно охарактеризовать тем, что в отрицательной области значений первой производной имеются широкий максимум около 230 нм и минимум приблизительно при 240 нм (рис.10). Такие особенности характерны для спектров поглощения органических тиосульфинатов (S-оксидов).
D D/ 0,2,-0,1,-0,0,-0,220 260 300 3220 260 300 3Длина волны, нм Длина волны, нм Рис. 9. Спектры поглощения: 1,2- Рис. 10. Первая производная от спектра дитиан-4,5-диол (кривая 1); его S-оксид поглощения S-оксида, представленного на (кривая 2), получающийся при рис. 9.
окислении дитиана (рН=3,5) гипохлоритом (2 мМ).
Можно предположить, что исследуемые нами антиагреганты способны модифицировать дисульфидные связи по пути образования S-оксидов (см. ниже схему 2).
Известно, что S-оксиды цистина, окисленного глутатиона вызывают тиолирование белков (образование смешанных дисульфидов) более эффективно, чем другие соединения, включая соединения с сульфеновой группой (Li et al., 2001). В наших экспериментах Sоксид подавлял начальную агрегацию изолированных тромбоцитов на 50 % в концентрации 0,1 мМ. Поэтому представляется важным учитывать участие S-оксидов в механизме действия хлораминов на клетки.
Исходя из данных литературы [Biewenga et al., 1994] и наших данных картину реакций хлораминов можно представить в следующем виде. Первый этап модификации хлорамином тиольного соединения, вероятно, заключается в замещении атома водорода этой группы на хлор с образованием неустойчивого промежуточного соединения. Затем в результате его взаимодействия с гидроксильной группой (выделяется хлорид) появляется сульфеновое соединение (схема 1).
Схема 1. Начальные стадии окислительной модификации тиольной группы хлорамином или хлоримином.
Сульфеновая кислотная группа проявляет высокую реакционную способность. Вопервых, сульфеновое соединение при избытке хлораминов продолжает подвергаться окислению, превращается в устойчивые сульфиновое и сульфоновое соединения. Такого рода превращение тиольной группы в составе рецепторов тромбоцитов может вызывать существенное изменение их структуры и тем самым инактивацию. Во-вторых, сульфеновые соединения проявляют высокую способность к окислительной модификации других веществ (схема 2).
Можно полагать, что в клетках может происходить реакция между сульфеновой и тиольной группами с образованием смешанного дисульфидного соединения через ряд промежуточных реакций. Один из начальных процессов модификации дисульфидных соединений без разрыва дисульфидной связи - образование S-оксида. S-Оксиды дисульфидных соединений, как и сульфеновые соединения, способны окислять тиольные соединения [Giles et al., 2002].
Схема 2. Модификация тиольной группы в реакции с сульфеновой группой и окислительная модификация дисульфидной группы.
Выводы 1. Определены спектрофотометрическим методом константы скоростей распада хлораминовых производных ряда моноаминовых -аминокислот. Выявлено несколько аминокислотных хлораминов с повышенной устойчивостью. К ним относятся Nхлорглицин, N-хлорвалин, N-хлортреонин и N-хлоризолейцин. Этим хлораминам свойственна структурная особенность в -положении: в случае хлорамина глицина отсутствует атом углерода, а производные остальных трех аминокислот в указанном положении имеют разветвление структуры.
2. Проведен компьютерный расчет парциальных атомных зарядов Уанга-Форда хлораминов -аминокислот полуэмпирическим квантово-механическим методом АМ1.
Хлорамины с повышенной устойчивостью отличаются высокими положительными суммами зарядов трех атомов: углерода в - и -положениях и атома углерода карбоксильной группы. Высокий парциальный заряд получен и для одного атома углерода в -положении. Одно из направлений создания новых более устойчивых аминокислотных хлораминов может заключаться в изменении состояния атома C путем разветвления структуры.
3. Изучено действие хлораминовых производных таурина на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов. Угнетение агрегации зависит от структуры хлораминовых антиагрегантов: наиболее эффективным является N,N-дихлортаурин (С50=0,2 мМ), более слабые антиагреганты - N-хлор-N-метилтаурин и N-хлортаурин в конечной концентрации 0,75 мМ снижают агрегацию тромбоцитов лишь на 15 %. Антиагрегантное действие хлораминовых производных таурина, глицина и фенилаланина усиливается примерно в 2 раза в присутствии сывороточного альбумина. Это, вероятно, обусловлено особым взаимодействием с тромбоцитами хлораминов таурина в комплексе с альбумином.
4. Исследовано взаимодействие хлораминов с сывороточным альбумином методом дифференциальной спектрофотометрии. После введения N,N-дихлортаурина в раствор сывороточного альбумина в дифференциальном спектре поглощения появляется ряд максимумов, структурированная полоса 265 - 290 нм. Это указывает на связывание N,Nдихлортаурина с переходом молекул альбумина в другое состояние, затрагивающее микроокружение остатков ароматических аминокислот: фенилаланина (пики в области 255Ц270 нм), тирозина (пики в области 280Ц285 нм), триптофана (290Ц295 нм). Можно полагать, что альбумин образует комплекс с хлораминовыми производными аминокислот и таурина и этот комплекс обеспечивает более эффективную реакцию хлораминов с тромбоцитами.
5. Особенностью взаимодействия хлораминовых производных аминокислот с тиолсодержащими соединениями может быть начальное образование активной сульфеновой группы (ЦSOH), судя по образованию циклического дисульфида (1,2-дитиан4,5-диола) из дитиотреитола (1,4-димеркаптобутан-2,3-диола). На примере 1,2-дитиан-4,5диола получены данные о том, что аминокислотные хлорамины или гипохлорит могут вызывать превращение дисульфидной группы в продукт, который обладает выраженным антиагрегантным свойством.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Кравченко Н.Н., Петрова А.О., Сергиенко В.И.
Антиагрегантное действие биогенных хлораминов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, Приложение 2, С. 94Ц100.
2. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Чудина Н.А., Петрова А.О., Сергиенко В.И.
Антиагрегантное действие хлораминов таурина в присутствии сывороточного альбумина.
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2009, № 6, С. 642Ц646.
3.Рощупкин Д.И., Мурина М.А., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Зависимость устойчивости аминокислотных хлораминов от их структуры. Биомедицинская химия, 2009, № 4, С. 510 - 518.
4. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Аминокислотные хлораминовые и хлориминовые антиагреганты: реакционные свойства и механизм действия. Вестник Российской Академии медицинских наук, 2009, № 10, С.43Ц49.
5. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Реакционная активность и структурные особенности биогенных хлораминов. Пятая национальная научнопрактическая конференция Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека, Материалы конференции, Смоленск. ФГУ Смоленский ЦНТИ, 2007, С. 61Ц64.
6. Петрова А.О., Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Сергиенко В.И. Хемилюминесцентный способ исследования окислительной активности биохлораминов. Пятая национальная научно-практическая конференция Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека, Материалы конференции, Смоленск. ФГУ Смоленский ЦНТИ, 2007, С. 74Ц76.
7. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Чудина Н.А., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Физикохимические характеристики и реакционные свойства хлораминовых антиоксидантов.
Сборник тезисов докладов Четвертого крымского симпозиума Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии. Судак, 2008, С.35.
8. Рощупкин Д.И., Мурина М.А, Петрова А.О., Сергиенко В.И. Парциальные атомные заряды и реакционные свойства хлораминовых антиагрегантов. Сборник статей Международной научной конференции Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. Минск, 2008, С.128Ц130.
9. Рощупкин Д.И., Мурина М.А., Петрова А.О., Чудина Н.А. Компьютерное предсказание реакционных свойств биомолекул: хлораминовые антиагреганты, пептиды хромофорной области флуоресцентных белков. Сборник тезисов Научно-практической конференции Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины, Москва, 2008, С. 88.
10. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Чудина Н.А., Петрова А.О., Сергиенко В.И.
Хлораминовые, хлориминовые и серосодержащие реактивные оксиданты природного происхождения и их действие на тромбоциты. Сборник тезисов V Крымской конференции Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии, 2009, Изд. ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий, Крым, Судак, С.49.
11. Murina M.A., Petrova A.O., Roshchupkin D.I. Amino acid chloramines and chloramines as reactive oxidants: properties and mechanism of anti-platelet action. 6-th International Confernce УReactive Oxygen and Nitrogen species, Antioxidants and human HealthФ, Smolensk, Russia, 2009, p. 45Ц46.
12. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Петрова А.О., Белакина Н.С., Сергиенко В.И.
Хлораминовые и хлориминовые антиагреганты - необратимые ингибиторы функций тромбоцитов. Сборник статей Международной научной конференции Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем". Минск, Беларусь, 2010, часть 2, С. 258Ц260.
13. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Петрова А.О., Сергиенко В.И. Компьютерное и экспериментальное изучение реакционной способности хлораминовых и хлориминовых оксидантов. Сборник тезисов VI Крымской конференции Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии, 2010, Изд. ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий, Крым, Судак, Украина, С. 44.
14. Murina M.A., Roshchupkin D.I., Petrova A.O., Sergienko V.I. Аcylamido derivatives of Nchlorotaurine as reactive oxidants: properties and mechanism of anti-platelet action. 7-th International Conference УReactive Oxygen and Nitrogen species, Antioxidants and Human HealthФ, Smolensk, Russia, 2011, p.185Ц187.