Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
ШИЛОВА ИНЕССА ВЛАДИМИРОВНА
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ РАСТЕНИЙ СИБИРИ И РАЗРАБОТКА НООТРОПНЫХ СРЕДСТВ НА ИХ ОСНОВЕ
14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук
Пятигорск - 2010
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научноисследовательском институте фармакологии СО РАМН и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ чл.-корр. РАМН, доктор фармацевтических Научные консультанты:
наук, профессор Самылина Ирина Александровна доктор медицинских наук, профессор Суслов Николай Иннокентьевич доктор фармацевтических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Попова Ольга Ивановна доктор медицинских наук, профессор Бейер Эдуард Владимирович доктор фармацевтических наук, профессор Молчанов Геннадий Иванович ГОУ ВПО Самарский государственный
Ведущая организация:
медицинский университет Росздрава
Защита состоится л___ _________ 2011 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.069.01 в ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).
Автореферат разослан л____ ____________ 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Е. В. Компанцева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В современном мире прогрессирующий рост числа заболеваний, сопровождающихся нарушениями в когнитивной и мнестической сфере, делает актуальной проблему изучения и фармакотерапии нервнопсихической патологии, определяя её медицинской задачей с высокой социальной значимостью (Арушанян, 2005; Воронина, Середенин, 2007). В настоящее время одним из приоритетных направлений отечественного здравоохранения выступает расширение ассортимента используемых лекарственных средств за счет внедрения в медицинскую практику новых препаратов, в частности ноотропного действия.
Ноотропные лекарственные средства незаменимы для коррекции нарушений высшей нервной деятельности при широком круге заболеваний, связанных с повреждениями центральной нервной системы: инсульты, ишемические повреждения мозга, атеросклероз, черепно-мозговые и психические травмы, последствия клещевого энцефалита, менингита, гриппа, перенесенных хирургических вмешательств с применением наркоза, химические, лучевые и другие воздействия (Венгеровский и др., 2000; Воронина, Середенин, 2007).
Фармакоэкономическая оценка затрат в условиях неврологического стационара выявила, что 40-50 % финансовых расходов приходится на препараты ноотропного действия (Шилова и др., 2005). Ограниченный ассортимент синтетических ноотропных средств, недостаточная их эффективность и широта терапевтического действия, вызываемые ими побочные явления и широкое распространение невротических расстройств среди взрослого населения (ими по данным разных авторов страдает от 50 до 70 % населения) (Windisch, 1996; Малин, 2000; Sumner, 2004; Батышева и др., 2007), недоступность отечественному потребителю, вследствие дороговизны, наиболее эффективных импортных средств диктует необходимость поиска активных и безопасных отечественных препаратов для лечения когнитивных расстройств.
Перспективными являются фитопрепараты ноотропного действия, однако, представленные на отечественном рынке Гинсана (Pharmaton, Швейцария) и Танакан (Beaufour Ipsen, Франция) значительно дороже синтетических, что указывает на актуальность поиска и разработки отечественных ноотропных средств растительного происхождения, отвечающих требованиям фармакоэкономики с точки зрения эффективности, безопасности и себестоимости курса лечения (Шилова и др., 2005). В этом аспекте значительный интерес представляют виды флоры Сибири - княжик сибирский, лабазник вязолистный и л. обыкновенный, альфредия поникшая и а. снежная, черника обыкновенная, бадан толстолистный.
Растения имеют достаточную сырьевую базу или введены в культуру, находят широкое применение в народной медицине в качестве тонизирующих и общеукрепляющих средств, при нервных заболеваниях и показали перспективность в предварительных экспериментальных исследованиях на ноотропную активность.
Сведения о химическом составе выбранных видов носят фрагментарный характер, большая часть данных имеет предварительное значение, а для некоторых растений информация отсутствует. Наиболее изучен фенольный комплекс видов рода лабазник, произрастающих в Европейской части России и Германии, и бадана толстолистного.
Цель работы. Разработка рациональных научно-методических подходов к поиску источников и созданию эффективных ноотропных средств растительного происхождения на основе изучения химического состава и фармакологической активности растений флоры Сибири.
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:
- осуществить отбор видов флоры Сибири, как перспективных источников ноотропных средств, на основе анализа данных литературы, результатов исследования химического состава и фармакологического скрининга;
- исследовать основные группы биологически активных веществ и элементный состав, антиоксидантную и ноотропную активность экстрактов из надземной части княжика сибирского, лабазника вязолистного и л. обыкновенного, альфредии поникшей и а. снежной, побегов черники обыкновенной, листьев бадана толстолистного;
- разработать рациональные способы получения экстрактов из надземной части княжика сибирского, лабазника вязолистного и альфредии поникшей, как наиболее перспективных источников ноотропных средств, разделить их на фракции, оценить ноотропные и антиоксидантные свойства;
- разработать методические приемы выделения индивидуальных соединений из экстрактов и фракций надземной части княжика сибирского, лабазника вязолистного и альфредии поникшей, обладающих выраженным ноотропным эффектом, и установить их структуру с помощью современных физикохимических методов анализа;
- установить зависимость химическая структура - антиоксидантная, ноотропная активность для выделенных фенольных и тритерпеновых соединений;
- выявить иммунотропный, гепатопротекторный и диуретический эффекты наиболее перспективных источников получения фитопрепаратов ноотропного действия;
- разработать нормативную документацию на лекарственное сырье наиболее перспективных растений и рациональные лекарственные препараты на их основе.
Научная значимость и новизна результатов. Впервые выделены и изучено строение веществ, обуславливающих ноотропную активность княжика сибирского, лабазника вязолистного и альфредии поникшей, - фенолоспирты, гликозиды кверцетина, тритерпеновые спирты, бутиролигнаны, и разработаны лекарственные средства ноотропного действия на их основе. На основании изучения химического состава и фармакологической активности княжика сибирского, лабазника вязолистного и л. обыкновенного, альфредии поникшей и а. снежной, черники обыкновенной, бадана толстолистного предложены рациональные научноЦ методические подходы к поиску источников и созданию ноотропных средств растительного происхождения, включающие схему выбора рациональных экстрагентов, способы выявления перспективных видов и оценки их ноотропных свойств.
Изучены основные группы биологически активных веществ надземной части княжика сибирского, лабазника вязолистного и л. обыкновенного, альфредии поникшей и а. снежной, побегов черники обыкновенной, зеленых листьев бадана толстолистного, доминирующими в которых явились фенольные (представители простых фенолов, флавоноидов, лигнанов, фенолкарбоновых кислот) и тритерпеновые соединения. Впервые изучен элементный состав вышеуказанных растений, собранных в различных районах Сибири, результаты которого свидетельствуют о возможности использования сырья изученных видов в качестве источников макро- и микроэлементов, включая эссенциальные.
В результате исследований установлено, что экстракты изучаемых растений проявляют антиоксидантную активность, причем наиболее выраженные свойства присущи экстрактам на 70 % и 95 % спирте этиловом, которые по эффекту сравнимы или превосходят дигидрокверцетин и кислоту аскорбиновую.
Впервые установлено, что экстракты исследуемых растений проявляют ноотропные свойства; наиболее выраженная активность присуща экстрактам княжика сибирского на 25 % спирте этиловом, лабазника вязолистного на 70 % спирте этиловом и альфредии поникшей на 95 % спирте этиловом, сопоставимая, а на некоторых моделях превосходящая пирацетам и препарат Гинсана, и впервые предложены рациональные способы их получения. Выявлено, что наиболее выраженный ноотропный и антиоксидантный эффекты проявляет бутанольная фракция экстракта княжика сибирского. При разделении экстрактов альфредии поникшей и лабазника вязолистного на фракции показано распределение ноотропного эффекта на составляющие, что указывает на специфическое действие суммы БАВ.
В результате изучения химического состава бутанольной фракции княжика сибирского, проявляющей ноотропный эффект, впервые выделены 3,4дигидроксифенилэтанол-2, 2-(3,4-дигидроксифенил)-этил-О--D-глюкопиранозид, хлорогеновая кислота, сумма гликозидов дигидроксибутановой кислоты, 3-О--Dглюкопиранозид олеаноловой кислоты, изучен состав аминокислот и неорганических компонентов.
Из фармакологически активных фракций лабазника вязолистного впервые получены: флавоноиды (изокверцитрин, 4'-О--D-галактопиранозид кверцетина), ароматические кислоты и их эфиры (коричная, феруловая, анисовая, этилгаллат).
Структура 4'-О--D-галактопиранозида кверцетина не описана ранее в литературе.
Из активного экстракта альфредии впервые выделены: лигнан (арктиин), флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), ароматические кислоты (коричная, ванилиновая и хлорогеновая) и тритерпеновые спирты (- и -амирины, моретенол, лупеол).
Экспериментально установлено, что наибольшей антиоксидантной активностью обладают производные фенилэтанола-2, гликозиды кверцетина, бутиролигнан (арктиин) и сумма тритерпеновых спиртов, выделенные из исследуемых растений. Впервые обнаружено, что тритерпеновым спиртам и бутиролигнанам, свойственен выраженный ноотропный эффект, а гликозиды кверцетина различаются по активности в зависимости от структуры.
Показано, что экстракты княжика сибирского, лабазника вязолистного и альфредии поникшей проявляют иммунотропное действие. Впервые выявлена выраженная гепатопротекторная активность экстракта лабазника вязолистного, по ряду показателей превышающая эффективность карсила. Обнаружено, что экстракты альфредии поникшей и княжика сибирского обладают диуретической и салуретической активностью.
Данные химического и фармакологического исследования послужили обоснованием для разработки унифицированных методик качественного обнаружения и количественного определения фенолоспиртов в побегах княжика сибирского, флавоноидов в траве лабазника вязолистного и альфредии поникшей, а также лекарственных формах на их основе. Впервые предложена методика спектрофотометрического определения фенолоспиртов на основе реакции окисления с о-фенантролином и железа (III) хлоридом.
Практическая значимость работы:
На основании изучения химического состава и фармакологического действия экстрактов ряда растений подтверждены рациональные научноЦметодические подходы к поиску источников и созданию ноотропных средств растительного происхождения.
Установлено, что княжик сибирский, лабазник вязолистный и альфредия поникшая являются перспективными источниками для получения ноотропных фитопрепаратов.
На основании данных фитохимического, фармакологического, морфологоанатомического и товароведческого анализа разработаны проекты фармакопейных статей на лекарственное растительное сырье Княжика сибирского побеги, Лабазника вязолистного трава, Альфредии поникшей трава.
На основе сложившихся рациональных научноЦметодических подходов к поиску источников и созданию ноотропных препаратов растительного происхождения, разработаны эффективные фитопрепараты ноотропного действия, обладающие также иммунотропными, гепатопротекторными и диуретическими свойствами: Княжика экстракт жидкий, Княжика экстракт густой и Княжика таблетки, Лабазника экстракт жидкий, Лабазника экстракт сухой и Лабазника таблетки, Альфредии экстракт жидкий.
Результаты фитохимических исследований и, в частности, изучение физикохимических свойств индивидуальных соединений позволили обосновать, в соответствии с современными требованиями, аналитические подходы в решении проблемы стандартизации изучаемых новых видов лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов на их основе. Разработаны валидированные и унифицированные методики качественного и количественного анализа с применением хроматографии в тонком слое, спектроскопии в УФ- и видимой областях спектра:
контроль качества сырья и лекарственных препаратов на основе княжика сибирского предложено проводить по основной группе, обусловливающей активность - фенолоспиртам, методом хроматографии в тонком слое силикагеля с подтверждением характерным УФ-спектром и спектрофотометрическим методом по реакции окисления с о-фенантролином и железа (III) хлоридом соответственно;
для травы лабазника вязолистного, альфредии поникшей и лекарственных препаратов на их основе разработаны методики идентификации и количественного определения: хроматография в тонком слое силикагеля с подтверждающим УФспектром и метод дифференциальной спектрофотометрии по реакции комплексообразования с алюминия хлоридом в кислой среде флавоноидов (гликозиды кверцетина), проявляющих ноотропные свойства.
Материалы внедрения:
Проекты ФС на лекарственное растительное сырье Княжика сибирского побеги и лекарственный препарат Княжика сибирского экстракт жидкий приняты к рассмотрению в ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России (письмо № 297-ЦСЛС от 09.12.2009 г., № 569-ЦСЛС от 14.09.2010 г.) для включения в Государственную фармакопею России XII издания.
Составлены и подготовлены к рассмотрению следующие проекты ФС: на лекарственное растительное сырье Альфредии поникшей трава, Лабазника вязолистного трава и лекарственные средства Княжика экстракт густой, Княжика таблетки, Альфредии экстракт жидкий, Лабазника экстракт жидкий, Лабазника экстракт сухой, Лабазника таблетки.
Подготовлены материалы, характеризующие специфическую ноотропную активность экстрактов княжика сибирского густого, лабазника вязолистного сухого в рамках требований Фармакологического государственного комитета Минздравсоцразвития РФ.
Получены акты апробации технологии экстрактов княжика сибирского жидкого, густого (от 12.01.2009 г., 19.01.2009 г.) и экстракта лабазника вязолистного жидкого, сухого (от 02.02.2009 г., 09.02.2009 г.) на базе ООО Томская фармацевтическая фабрика.
Результаты диссертационной работы включены в монографию И. В. Шиловой, Н. И. Суслова, И. А. Самылиной Химический состав и ноотропная активность растений Сибири и использованы при реализации проектов ФЦП Интеграция (№ Е 0144 Биологические механизмы устойчивости природных популяций интенсивно эксплуатируемых лекарственных растений. Оценка ресурсов лекарственного сырья), научных разработок Томской области (№ 202 Разработка нового высокоэффективного ноотропного средства на основе клеточной культуры княжика сибирского), ФЦП Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 г. (ГК № 02.512.11.2220 Создание высокопродуктивной суспензионной культуры Аtragene speciosa Weinm. (княжика сибирского) с целью получения веществ ноотропного действия).
Разработанные методики качественного и количественного анализа действующих веществ в лекарственных препаратах на основе побегов княжика сибирского, травы лабазника вязолистного и альфредии поникшей (экстракты жидкие, сухой и таблетки), включенные в проекты ФС, апробированы на кафедре биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого и фармацевтической химии Новосибирского государственного медицинского университета.
Приоритет разработанных средств защищен патентами РФ на изобретение: № 2276992, № 2292214, № 2310467, № 2311193, № 2314115, № 2325179, № 2347580, № 2354397.
Публикации. По результатам исследований опубликовано 109 научных работ, отражающих основное содержание диссертации, из них 1 монография, патентов РФ на изобретение, 29 статей в журналах, рекомендуемых ВАК.
Апробация работы. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на конференции, посвященной 15-летию НИИ фармакологии Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов (Томск, 1999), Международной научно-практической конференции Здоровье и образование в ХХI веке (Москва, 2002, 2003, 2007, 2009), научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета Лекарственные растения в фармакологии и фармации (Барнаул, 2004), Всероссийской научной конференции Химия и технология растительных веществ (Сыктывкар, 2006, Уфа, 2008), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.Н.
Березнеговской Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения (Томск, 2006), VI Всероссийском научном семинаре с молодежной научной школой Химия и медицина (Уфа, 2007), Международном Конгрессе молодых ученых Науки о человеке (Томск, 2008), XV Российском Национальном Конгрессе Человек и лекарство (Москва, 2008), I и II Российском фитотерапевтическом съезде (Москва, 2008, 2010).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Учреждения РАМН НИИ фармакологии СО РАМН и кафедры фармакологии Сибирского государственного медицинского университета, комплексной целевой программой СО РАМН Здоровье человека в Сибири (№ Гос. регистрации 01.9.2002479) и в рамках программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2008-2012 гг. Поиск, создание и изучение механизмов действия фитопрепаратов из растений Сибири и Дальнего Востока и биологических тканей (в т.ч. морепродуктов), обладающих противоязвенной, противоопухолевой, противовоспалительной, антигипоксической, иммунотропной и психотропной активностью (№ Гос. регистрации 0120.0 601994).
Положения, выносимые на защиту:
Теоретическое и экспериментальное обоснование рациональных подходов к поиску источников ноотропных средств растительного происхождения на основании изучения химического состава и фармакологической активности растений флоры Сибири.
Результаты фитохимического, фармакологического и морфологоанатомического исследования надземной части княжика сибирского, лабазника вязолистного и альфредии поникшей.
Обоснование возможности использования княжика сибирского, лабазника вязолистного и альфредии поникшей в качестве источников ноотропных средств и разработка фармакопейных статей на новые виды лекарственного растительного сырья Княжика сибирского побеги, Лабазника вязолистного трава, Альфредии поникшей трава с учетом химического состава и современных принципов стандартизации.
Принципы методических приемов выделения индивидуальных соединений из экстрактов и фракций растений, обладающих выраженным ноотропным эффектом.
Результаты изучения зависимости химическая структура - антиоксидантная, ноотропная активность для фенольных и тритерпеновых соединений, выделенных из растений, обладающих выраженной ноотропной активностью, как основа создания эффективных ноотропных средств.
Данные по разработке рациональных способов получения наиболее активных экстрактов княжика сибирского, лабазника вязолистного и альфредии поникшей как перспективных ноотропных средств и стандартизации с позиций унификации методик качественного и количественного анализа лекарственных средств Княжика экстракт жидкий, Княжика экстракт густой и Княжика таблетки, Лабазника экстракт жидкий, Лабазника экстракт сухой и Лабазника таблетки, Альфредии экстракт жидкий.
Результаты разработки нормативной документации на растительное сырье и лекарственные средства, содержащие фенолоспирты и флавоноиды.
На основе сложившихся рациональных научноЦметодических подходов к поиску источников и созданию ноотропных средств растительного происхождения, разработаны эффективные фитопрепараты, обладающие также иммунотропными, гепатопротекторными и диуретическими свойствами.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 3страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 рисунками, 58 таблицами, состоит из введения, 9 глав, выводов и приложения. Список цитируемой литературы включает 320 наименований, из которых 141 на иностранных языках.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования явились: надземная часть княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.), лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.), л. обыкновенного (Filipendula vulgaris Moench), альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), а. снежной (Alfredia nivea Kar. et Kir.), побеги черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.), зеленые и черные листья бадана толстолистного (Bergenia crassifolia (L.) Fritsch.), собранные в 1996-2007 гг. в Томской и Кемеровской областях, Алтайском и Красноярском краях, Республиках Горный Алтай, Хакасия и Тыва в разные периоды вегетации; экстракт княжика жидкий и густой, полученные на 25 % этаноле, и таблетки, полученные в лабораторных и заводских условиях, на основе экстракта густого; экстракт лабазника вязолистного жидкий и сухой, полученные на 70 % этаноле, и таблетки, полученные в лабораторных условиях, на основе экстракта сухого; экстракт альфредии жидкий, полученный на 95 % этаноле.
Качественный и количественный анализ природных соединений исследовали с помощью общепринятых приемов и методов фитохимического анализа. В основу аналитических исследований элементов положен эмиссионный спектральный и нейтронно-активационный анализ, плазменная масс-спектрометрия. Для выделения индивидуальных соединений использовали методы избирательной жидкостной экстракции, адсорбционной колоночной и флэш-хроматографии на полиамиде и силикагеле, хроматографии на бумаге и в тонком слое, хромато-массспектрометрии (ГХ/МС), противоточного распределения и дробной кристаллизации. Вещества идентифицировали по температуре плавления, оптическому вращению, методами УФ-спектроскопии с использованием 1 ионизирующих и комплексообразующих реагентов, ИК-, ЯМР Н, С спектроскопии с применением программ фирмы Bruker для регистрации двумерных спектров HSQC, HMBC, COSY, ROESY и NOESY, масс-спектрометрии.
Фармакологические испытания проведены на 450 беспородных мышах (самцах и самках), 342 мышах (самцах и самках) линии СВА/CaLac, 120 мышахсамцах C57Bl/6, в возрасте 2-2,5 месяцев, массой тела 20-22 г; 150 беспородных крысах (самцах и самках) и 178 крысах (самцах и самках) линии Wistar массой тела 180-250 г. Животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши и крысы, получены из коллекционного фонда лаборатории экспериментального биологического моделирования Учреждения РАМН НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется). Фармакологические испытания выполняли в соответствии с рекомендациями Фармакологического государственного комитета Минздравсоцразвития РФ и включали исследования по оценке безопасности (острая токсичность) и изучению специфической ноотропной активности. Для оценки функционального состояния ЦНС изучали ориентировочноисследовательское поведение на модели лоткрытое поле и эмоциональную реакцию животных; устойчивость к гипоксическому воздействию - в условиях гипоксии гермообъема; влияние на обучение и память - при выработке и воспроизведении условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ); на физическую работоспособность и адаптацию к физическим нагрузкам - в условиях принудительного плавания с утяжеляющим грузом, 10 % от массы тела;
антистрессорные свойства - на модели лиммобилизационный стресс, аксиолитические и противоневротические - в условиях конфликтной ситуации, функциональное состояние интегративных механизмов - при выработке и воспроизведении условного питьевого рефлекса в сложном Т-образном лабиринте;
экспериментальную ишемию вызывали путем полной перевязки левой сонной артерии и ограничения кровотока в правой на 50 %; тканевую гипоксию - введением нитропруссида натрия. Иммунотропную активность исследовали, определяя показатели гуморального (количество антителообразующих клеток в селезенке - методом локального гемолиза, уровень гемагглютининов в сыворотке крови - в реакции гемагглютинации) и клеточного (реакция гиперчувствительности замедленного типа) иммунного ответа, фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов (в тестах с частицами коллоидной туши и частицами латекса), пролиферативную активность лимфоидных клеток (с солью тетразолия ХТТ) и уровень интерлейкина-2.
Гепатопротекторную и антиоксидантную активность изучали на модели токсического гепатита, вызванного четыреххлористым углеродом.
Терапевтическую эффективность оценивали по активности маркерных ферментов повреждения печени (аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы) в сыворотке крови, гистологическим показателям печени, содержанию метаболитов ПОЛ (диеновые коньюгаты, гидроперекиси липидов и ТБК-реактивных продуктов) и активности ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы и каталазы) в ткани печени; функциональное состояние печени - в условиях модели гексобарбиталовый сон. Влияние на диурез и салурез исследовали путем измерения объема выделенной мочи после предварительной водной нагрузки и определения содержания ионов натрия и калия методом пламенной фотометрии.
Антиоксидантную активность изучали методом катодной вольтамперометрии и кинетическим методом на модельной цепной реакции инициированного окисления изопропилбензола. Экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием t критерия Стьюдента, непараметрического критерия ВилкоксонаМанна-Уитни и метода Фишера для сравнения долей.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Подходы к поиску источников и созданию растительных ноотропных средств представлены на основании химико-фармакологического исследования экстрактов растений Сибири. В основу скринингового отбора видов положены: анализ данных литературы, результаты исследования химического состава и биологической активности растений.
ИССЛЕДОВАНИЕ ОСНОВНЫХ ГРУПП БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (БАВ) И ЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА РАСТЕНИЙ В ходе исследования выявлены основные группы БАВ отобранных растений, изучен их состав и определено количественное содержание. Полученные результаты (табл. 1-3) свидетельствуют о наличии во всех объектах представителей простых фенолов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и тритерпеновых соединений.
Таблица 1 - БАВ надземной части княжика сибирского Количественное Группы БАВ Состав содержание, % 3,4-дигидроксифенилэтанол-2, 2-(3,4Фенолоспирты 3,240,дигидроксифенил)-этил-O--D-глюкопиранозид Флавоноиды Кемпферол, кверцетин, изокверцитрин 0,260,Скополетин, эскулетин, эскулин, умбеллиферон, Кумарины 0,850,скиммин Органические кислоты Кофейная, хлорогеновая, хинная 3,100,Дубильные вещества Гидролизуемые и конденсированные 0,560,Тритерпеновые Олеаноловая кислота, хедерагенин, 1,000,сапонины витальбозид А Стерины -ситостерин, глюкозид -ситостерина # Алкалоиды Аконитин, дельфинин След. количества Полисахариды D-глюкоза, D-галактоза, L-арабиноза, 0,630,водорастворимые L-рамноза, D-ксилоза, D-галактуроновая кислота Каротиноиды + # Аминокислоты + 2,820,Примечание: ( + ) - обнаружение группы БАВ, (#) - определение не проводилось.
Фитохимическое исследование надземной части лабазника обыкновенного показало присутствие простых фенолов (салигенин, салицин), флавоноидов (1,720,09 %; кверцетин, кемпферол, апигенин, лютеолин, таксифолин, изокверцитрин, авикулярин, спиреозид, рутин), кумаринов (0,540,10 %; кумарин, умбеллиферон, эскулетин, фраксетин), фенолкарбоновых кислот (4,900,47 %;
гентизиновая, ванилиновая, галловая, п-кумаровая, кофейная, хлорогеновая, феруловая), дубильных веществ (3,230,36 %; гидролизуемые), тритерпеновых кислот (урсоловая, олеаноловая) и сапонинов, стеринов, водорастворимых полисахаридов (1,470,02 %, состоящих из D-глюкозы, D-галактозы, Dглюкуроновой кислоты), каротиноидов и аминокислот (лизин, треонин).
Таблица 2 - БАВ надземной части лабазника вязолистного Количественное Группы БАВ Состав содержание, % Простые фенолы Рододендрол, салигенин, салицин # Кверцетин, кемпферол, апигенин, лютеолин, таксифолин, изокверцитрин, авикулярин, гиперозид, Флавоноиды 4,300,спиреозид, 4'-О--D-галактопиранозид кверцетина, рутин Бензойная, салициловая, м-гидроксибензойная, Органические анисовая, ванилиновая, галловая и ее этиловый эфир, 5,660,кислоты гентизиновая, коричная, п-кумаровая, кофейная, хлорогеновая, феруловая, хинная Кумарины Эскулетин 2,260,Дубильные Гидролизуемые, в т. ч. эллаговая кислота 3,980,вещества Тритерпеновые Урсоловая, олеаноловая кислоты 0,770,соединения Стерины + # Полисахариды D-глюкоза, D-галактоза, L-арабиноза 1,910,водорастворимые Эфирное масло + # Каротиноиды + # Аминокислоты Валин, глутаминовая кислота, гистидин # Примечание: ( + ) - обнаружение группы БАВ, (#) - определение не проводилось.
Исследование химического состава побегов черники обыкновенной выявило:
простые фенолы (1,470,34 %; гидрохинон, рододендрол, рододендрин, арбутин), флавоноиды (0,880,12 %; кверцетин, кемпферол, таксифолин, изокверцитрин, авикулярин, гиперозид, рутин; антоцианы), фенолкарбоновые кислоты (2,140,23 %; галловая, ванилиновая, гентизиновая, кофейная, феруловая, хлорогеновая), кумарины (0,440,08 %; умбеллиферон, эскулетин, скополетин, фраксетин), дубильные вещества (7,600,99 %; гидролизуемые), тритерпеновые соединения (-амирин, олеаноловая, урсоловая кислоты), стерины (Цситостерин), водорастворимые полисахариды (2,340,21 %; состоящие из DЦглюкозы, DЦ галактозы, L-рамнозы), каротиноиды, аминокислоты (валин, треонин).
Качественный состав и количественное содержание БАВ надземной части дикорастущей альфредии поникшей (табл. 3) аналогичны таковому культивируемого (в условиях юга Томской области) растения. Так, количество флавоноидов в культуре составляет 0,83 0,09 %, фенолкарбоновых кислот - 2,57 0,25 %. Растение, выращенное в условиях открытого участка, накапливает больше фенолокислот - 5,00 0,84 %, в полутени их содержание снижается до 1,58 0,27 %.
Таблица 3 - БАВ надземной части альфредии поникшей и а. снежной Состав и количественное содержание, % Группы БАВ Альфредия поникшая Альфредия снежная Простые фенолы + + Лигнаны Арктиин + Кверцетин, кемпферол, таксифолин, Кверцетин, кемпферол, апигенин, лютеолин, изокверцитрин, таксифолин, апигенин, Флавоноиды лютеолин-7-глюкозид, рутин изокверцитрин, рутин 0,810,08 0, 860,Бензойная, салициловая, Бензойная, салициловая, Органические ванилиновая, коричная, кофейная, ванилиновая, коричная, кофейная, кислоты хлорогеновая, хинная хлорогеновая, хинная 3,330,49 3,370,Кумарины Эскулетин + Дубильные След. количества След. количества вещества Тритерпеновые - и -амирин - и -амирин соединения 1,050,Стерины Цситостерин Цситостерин D-глюкоза, D-галактоза, L-арабиноза, D-глюкоза, L-арабиноза, Полисахариды D-глюкуроновая кислота D-глюкуроновая кислота водорастворимые 2,270,33 2,240,Каротиноиды + + Азотсодержащие 13,82,5 + соединения Аспарагиновая и глутаминовая кислоты, серин, пролин, глицин, аланин, цистеин, изолейцин, лейцин, Валин, гистидин, метионин, лизин, Аминокислоты тирозин, фенилаланин, валин, треонин, триптофан гистидин, метионин, лизин, треонин, триптофан 2,970,Примечание: ( + ) - обнаружение группы БАВ.
Проведенные нами исследования групп БАВ зеленых листьев бадана толстолистного указывают на присутствие простых фенолов (17,010,44 %;
гидрохинон, арбутин), флавоноидов (1,750,14 %; кверцетин, кемпферол, апигенин, лютеолин, таксифолин, изокверцитрин, рутин), фенолкарбоновых кислот (2,740,12 %; галловая, гентизиновая, кофейная, феруловая, хлорогеновая), кумаринов (0,640,24 %; бергенин, эскулетин), дубильных веществ (19,350,55 %;
смешанной природы), водорастворимых полисахаридов (2,180,13 %; состоящих из D-глюкозы, D-галактозы, L-арабинозы), каротиноидов, аминокислот.
С использованием эмиссионного спектрального и нейтронно-активационного методов анализа впервые изучен элементный состав сырья исследуемых видов, собранных в различных районах Сибири (Томской и Кемеровской областях, Алтайском и Красноярском краях, Республиках Горный Алтай, Хакасия и Тыва), результаты которого свидетельствуют о возможности использования растений в качестве источников разнообразных макро- и микроэлементов (калий, кальций, кремний, фосфор, натрий, магний, железо, барий, стронций, цинк, рубидий, бром, марганец, медь, хром, кобальт, литий, лантан, тантал, торий и др.), включая эссенциальные, а также представить видовую специфичность растений по составу элементов, определить территории для сбора, с учетом геохимической обстановки.
АНТИОКСИДАНТНАЯ И НООТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ РАСТЕНИЙ Согласно мембранно-синаптической гипотезе памяти, механизм ее формирования определяется структурно-функциональными изменениями в мембране (Воронина, Середенин, 2007). Вызываемые свободными радикалами поражения в мембране играют важную роль в ряде патологических состояний, на которые ориентировано действие ноотропов. Результаты исследования in vitro показали наиболее выраженные антиоксидантные свойства экстракта зеленых листьев бадана толстолистного (4,6490,052 мкмоль/лмин), побегов черники обыкновенной (4,3510,080 мкмоль/лмин), надземной части княжика сибирского (1,2960,045 мкмоль/лмин) на 70 % этаноле и лабазника вязолистного на 95 % этаноле (1,1700,051 мкмоль/лмин), превосходящие по активности дигидрокверцетин (0,6500,040 мкмоль/лмин), кислоту аскорбиновую (1,1500,053 мкмоль/лмин), за счет полноты экстракции фенольных и тритерпеновых веществ.
Учитывая сущность ноотропного эффекта, для скринингового выявления источников получения фитопрепаратов ноотропного действия нами выбраны модели: гипоксия гермообъема, лоткрытое поле, выработка и воспроизведение УРПИ после гипоксического воздействия, принудительное плавание с грузом.
Скрининговое изучение предложено проводить, начиная исследование действия с экстрактов на 40 % этаноле в диапазоне доз от 2 до 1000 мг/кг, что определяется извлечением из сырья суммы содержащихся БАВ гидрофильного и липофильного характера. Сравнительную активность водного и водно-этанольных (40 %, 70 %, 95 %) экстрактов растений изучали по вышевыбранным методикам. Экстракты получали методом с использованием нагревания, обеспечивающим наиболее полное истощение растительного сырья при сохранении нативности БАВ. Для выявления групп БАВ, обусловливающих действие, наиболее активные экстракты растений фракционировали рядом растворителей с увеличивающейся полярностью (хлороформом, этилацетатом, бутанолом-1).
Ноотропные, антигипоксические и адаптогенные свойства присущи водному экстракту лабазника обыкновенного в дозе 50 мг/кг, фракционирование которого указывает на эффективность суммы его БАВ фенольной (простые фенолы, флавоноиды, гидроксикумарины, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества), тритерпеновой (кислоты и сапонины) и углеводной (в т.ч. водорастворимые полисахариды) природы, аминокислот и биоэлементов.
Ноотропные и адаптогенные эффекты характерны для экстракта черники обыкновенной на 70 % этаноле в дозе 200 мг/кг, при разделении которого получена хлороформная фракция, обладающая выраженной антиамнестической и адаптогенной активностью. ГХ/МС анализ фракции показал наличие -амирина, пальмитиновой кислоты и ее этилового эфира, этилового эфира стеариновой и олеиновой кислот, -токоферола, хинокиола, скополетина, предельных спиртов, диэтилфталата и моно(2-этилгексил)фталата. Во фракции также обнаружены гидрохинон, рододендрол, феруловая и ванилиновая кислоты, стерины.
Экстракт зеленых листьев бадана толстолистного на 70 % этаноле в дозе 50 мг/кг обладает ноотропной, антигипоксической и адаптогенной активностью, при фракционировании которого установлено, что полная сумма фенольных соединений обусловливает его эффект. Высокой антиоксидантной активностью, сравнимой с таковой -ионола, обладают фенольные (гидрохинон, кверцетин, таксифолин, рутин, галловая кислота, эскулетин) компоненты бадана,.
Наиболее выраженной ноотропной активностью характеризуются экстракты княжика сибирского на 25 % этаноле в дозе 100 мг/кг, лабазника вязолистного на 70 % этаноле в дозе 50 мг/кг и альфредии поникшей на 95 % этаноле в дозе 100 мг/кг, превышающей препарат Гинсана и соответствующей пирацетаму. Для разработки рациональных способов получения экстрактов применяли методы: с использованием нагревания и противоточной экстракции. Фармакологические исследования показали, что эффекты, вызываемые экстрактами, полученными разными способами, практически равноценны (табл. 4). Однако, выходы экстрактов и временной фактор процесса (напр., для лабазника 19,60,3 % и 7,20,3 %, 2-3 ч и 10 суток соответственно) существенно отличаются в пользу первого способа.
Таким образом, наиболее предпочтительным является способ получения экстракта княжика на 25 % этаноле при соотношении 1:10-1:12, температуре 80 С, степени измельчения сырья - 2-3 мм в течение 120 мин. Экстракцию сырья лабазника следует осуществлять 70 % этанолом в соотношении 1:18Ц1:20 при температуре 90 С и степени измельчения сырья - 1-2 мм в течение 60-90 мин. Сырье альфредии наиболее рационально экстрагировать 95 % этанолом в соотношении 1:20Ц1:25 при температуре 80Ц90 С и степени измельчения сырья - 2 мм в течение 90Ц120 мин.
При оптимизации процесса получения экстрактов решающим является температурный фактор и соотношение сырье:экстрагент.
Таблица 4 - Влияние экстрактов лабазника вязолистного на 70 % этаноле, на сохранность УРПИ после гипоксической травмы, физическую работоспособность и адаптацию к физически нагрузкам ( Х m, n=10) Доля животных с наличием Продолжительность Группа наблюдения, доза рефлекса при проверке на 14 плавания, с сутки после гипоксии, % 2 день 4 день Интактный контроль 90 93,58,9 111,39,Гипоксический контроль 10* - Ц Экстракт, полученный методом 80# 117,99,3* 157,414,7* противоточной экстракции, 50 мг/кг Экстракт, полученный методом с 80# 128,010,2* 165,515,2* использованием нагревания, 50 мг/кг Примечание: * - различия достоверны в отношении интактного контроля (p0,05); # - различия достоверны в отношении гипоксического контроля (p0,05).
Экстракт княжика оказывает незначительное влияние на поведение нормальных животных только в больших дозах, улучшает ориентировочноисследовательское поведение и условно-рефлекторную деятельность при их нарушении, увеличивает работоспособность в первые дни адаптации к физическим нагрузкам. При экспериментальной ишемии мозга экстракт улучшает выработку условного рефлекса и снижает количество рефлекторных реакций (табл. 5). В условиях конфликтной ситуации экстракт проявляет анксиолитическое действие, незначительно уступая по активности феназепаму и превосходя пирацетам, при отсутствии депримирующего и психостимулирующего эффектов. При фракционировании экстракта получена бутанольная фракция, обладающая выраженным ноотропным и антиоксидантным эффектом.
Таблица 5 - Влияние экстракта княжика сибирского на выработку условного питьевого рефлекса у крыс с экспериментальной ишемией мозга ( Х m, n=8) Группа Время Количество Число Невротические наблюдения, достижения вертикальных Груминг ошибок реакции доза поилки, с стоек Интактный 5212 1,40,5 2,00,6 1,70,6 0,080,контроль Контроль- 36945* 4,81,1* 0,550,8* 3,51,4 3,50,ишемия p0,01 p0,05 p0,0Экстракт, 486# 0,50,3# 1,30,4# 0,050,01# 1,50,100 мг/кг p0,05 p0,05 p0,05 p0,0Пирацетам, 699#* 0,50,3# 1,50,6# 0,120,04# 1,30,400 мг/кг p0,05 p0,05 p0,05 p0,# Примечания: * - различия достоверны в отношении интактного контроля, - различия достоверны в отношении ишемического контроля.
Экстракт лабазника вязолистного улучшает ориентировочноисследовательское поведение, условно-рефлекторную деятельность животных после гипоксического воздействия и в условиях экспериментальной кофеиновой интоксикации, обладает выраженными антистрессорными и противоневротическими свойствами, увеличивает работоспособность животных в процессе адаптации к физическим нагрузкам, начиная с первых дней наблюдения (табл. 4). Экстракту растения присущи умеренные транквилизирующие свойства, уступающие по силе эффекта феназепаму и пирацетаму. В то же время экстракт лабазника улучшает интегративные показатели мозговой деятельности нормальных животных. При разделении экстракта выявили выраженную антиамнестическую активность этилацетатной фракции; адаптогенные, антигипоксические и антиоксидантные свойства в максимальной степени присущи хлороформной фракции.
Экстракт альфредии поникшей улучшает показатели условно-рефлекторной деятельности и эксплоративного поведения животных после перенесенного гипоксического воздействия и конфликтной ситуации; обладает выраженным анксиолитичексим действием (табл. 6), превосходящим пирацетам, но уступающим феназепаму, наряду с отсутствием побочных эффектов указанных препаратов, а также проявляет выраженные антистрессорные и противоневротические свойства.
При этом экстракт альфредии не оказывает существенного влияния на поведение нормальных животных, способствует увеличению физической работоспособности.
При фракционировании экстракта обнаружили рассредоточение ноотропного эффекта на составные части: хлороформная фракция проявляет выраженную антигипоксическую, антиоксидантную и анксиолитическую активность, а антиамнестические свойства в наибольшей степени присущи водному остатку и бутанольной фракции.
Таблица 6 - Влияние экстракта альфредии поникшей на поведение крыс в условиях конфликтной ситуации ( Х m, n=10) Группа Суммарная Латентное Число Число Время наблюдения, двигательная время до подходов наказуемых замирания, с доза активность питья, с к поилке взятий воды Контроль 80,77,9 3,20,9 136,371,6 7,81,7 8,20,Экстракт, 133,59,1* 0,70,3* 6,72,3* 19,02,3* 15,12,0* 100 мг/кг p0,001 p0,05 p0,001 p0,001 p0,Пирацетам, 140,610,2* 26,75,3* 14,22,7* 12,51,9* 1,70,400 мг/кг p0,001 p0,01 p0,05 p0,Феназепам, 7,20,8* 395,883,1* 22,53,5* 19,23,1* 59,812,1 мг/кг p0,05 p0,05 p0,01 p0,Примечания: * - различия достоверны по отношению к контролю.
Экстракты надземной части культивируемой альфредии поникшей, альфредии снежной на 95 % этаноле проявляют равноценную ноотропную активность, с незначительным преимуществом экстракта дикорастущего растения по влиянию на сохранность рефлекса.
ДРУГИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ НАИБОЛЕЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ИСТОЧНИКОВ ПОЛУЧЕНИЯ ФИТОПРЕПАРАТОВ НООТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ В одном лекарственном средстве растительного происхождения может быть реализовано несколько основных направлений этиопатогенетической и симптоматической терапии за счет комплексного фармакологического воздействия, поэтому нами исследованы иммунотропный, гепатопротекторный и диуретический эффекты наиболее перспективных экстрактов растений.
Экстракт княжика сибирского на 25 % этаноле в дозе 100 мг/кг проявляет иммунотропное действие, обусловленное стимуляцией макрофагального звена, активацией процессов пролиферации лимфоидных клеток и противовоспалительными свойствами. Экстракт альфредии поникшей на 95 % этаноле в дозе 100 мг/кг оказывает влияние на гуморальный иммунный ответ путем стимуляции образования антителопродуцирующих клеток в селезенке. Наиболее выраженное действие обнаруживает экстракт лабазника вязолистного на 70 % этаноле в дозе 50 мг/кг, влияя на специфический гуморальный ответ и неспецифическую резистентность организма, превосходя по активности настойку эхинацеи пурпурной. Экстракт обладает выраженной противовоспалительной активностью, снижая синтез интерлейкина-2 спленоцитами и угнетая продукцию провоспалительных цитокинов в реакции гиперчувствительности замедленного типа; в дозах 10, 50, 150 и 500 мг/кг стимулирует индуктивную и продуктивную фазы гуморального иммунного ответа у мышей CBA/CaLac и C57Bl/6, не проявляя иммунотоксического действия.
На модели токсического CCl4-гепатита выявлена выраженная гепатопротекторная активность экстракта лабазника вязолистного на 70 % этаноле в дозе 100 мг/кг, его этилацетатной и хлороформной фракций, превышающая по ряду показателей эффективность карсила, что обусловлено активацией внутриклеточных регенераторных процессов и нормализацией гистологических, метаболических показателей печени, антиоксидантными и мембраностабилизирующими свойствами.
Экстракт княжика сибирского на 25 % этаноле в дозе 100 мг/кг оказывает стимулирующее действие на экскреторную функцию почек, особенно выраженное в отношении ионов натрия. Выявлено отсутствие статистически достоверного влияния на диурез и салурез экстракта лабазника вязолистного на 70 % этаноле в дозе 50 мг/кг. Экстракт альфредии поникшей на 95 % этаноле в дозе 100 мг/кг проявляет выраженную диуретическую и салуретическую активность.
ИЗУЧЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА - АНТИОКСИДАНТНАЯ И НООТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ ДЛЯ ФЕНОЛЬНЫХ И ТРИТЕРПЕНОВЫХ ВЕЩЕСТВ Наибольшей антиоксидантной активностью обладает 3,4дигидроксифенилэтанол-2 и флавоноиды (изокверцитрин, 4'-глюкозид и 4'галактозид кверцетина, рутин) в гидрофильных и липофильных средах (табл. 7).
Результаты исследования показывают высокую активность гликозидов флавонолов в сравнении с образцом агликона в гидрофильных средах. Замещение глюкозой по 4'-положению снижает активность по сравнению с таковым по С-3 агликона, также как и образование биозида по 3-положению. На активность, судя по экспериментальным данным, оказывают влияние свойства углеводного заместителя. В порядке уменьшения активности далее следует бутиролигнан (арктиин) и фенолкарбоновые кислоты, уступающие по эффективности флавоноидам и гидроксикумарину. Среди фенолокислот наибольшей активностью обладают производные коричной кислоты (простые фенилпропаноиды).
Тритерпеновые соединения проявляют менее выраженную антиоксидантную активность, однако, сравнимую с таковой анализируемых фенолокислот. Так, антиоксидантный эффект тритерпеновых кислот составляет 49-50 % от такового ионола, а сумма тритерпеновых спиртов альфредии превосходит по эффективности -ионол в 1,7 раза.
Таблица 7 - Антиоксидантная активность фенольных и тритерпеновых соединений по отношению к процессу электровосстановления кислорода № К, мкмоль/ № К, мкмоль/ Образец Образец п/п мин п/п мин 3,4-Дигидроксифенил1. 2,5790,007 13. Этилгаллат 0,1690,0этанол-2. Кверцетин 0,1400,002 14. Салициловая кислота 0,1360,03. Изокверцитрин 2,2870,005 15. Коричная кислота 1,8620,04. Изокверцитрин* 9,7390,005 16. Феруловая кислота 0,8310,05. 4'-глюкозид кверцетина 2,2220,004 17. Эскулетин 1,648 0,0Сумма тритерпеновых 6. Рутин 1,8890,004 18. 5,9250,0спиртов* 7. Рутин* 9,0510,007 19. ОВ-2* 1,7490,0Сумма изокверцитрин :
8. 4'-галактозид кверцетина 1,3930,004 20. Олеаноловая кислота* 1,7020,0(5:7) 9. Авикулярин 0,6550,004 21. Урсоловая кислота* 1,6560,010. Арктиин 1,3400,009 22. Дигидрокверцетин 0,5400,011. Арктиин* 6,6960,009 23. Аскорбиновая кислота 1,0250,012. Галловая кислота 0,1490,002 24. -Ионол* 3,4050,0Примечание: * - исследование выполнено в среде ДМФА. К - кинетический критерий антиоксидантной активности.
Фенольные соединения (изокверцитрин, рутин, арктиин) не проявляют существенного воздействия на эксплоративное поведение. Влияние же на указанные показатели тритерпеновых соединений является неодинаковым и, вероятно, зависит от их структуры: сумма тритерпеновых спиртов (-амирин, амирин, моретенол, лупеол) не оказывает влияния на изучаемое поведение, а ОВ-достоверно снижает двигательную активность нормальных животных. Наиболее выраженным положительным влиянием на память обладает ОВ-2, высокая активность характерна для тритерпеновых спиртов, арктиина и изокверцитрина.
Наименьшим антиамнестическим действием характеризуется рутин (табл. 8).
Таблица 8 - Влияние фенольных и тритерпеновых соединений на двигательную активность в лоткрытом поле, выработку и сохранность УРПИ у мышей после гипоксии ( Х m, n=10) Латентное время Доля животных Суммарная захода в темный с сохранившимся рефлексом Группа наблюдения, двигательная отсек при при проверке, % доза активность выработке 48 ч 7 сут 14 сут 21 сут через 30 мин рефлекса, с после выработки 87,05,9* 38,96,4* 90* 90* 80* 80* Интактный контроль p0,001 p0,01 p0,05 p0,05 p0,05 p0,Гипоксический 46,78,1 12,73,0 30 20 20 контроль Сумма тритерпеновых 28,75,2* 100* 90* 80* 70* 33,010,спиртов, 7,0 мг/кг p0,05 p0,05 p0,05 p0,05 p0,90* 90* 80* 90* ОВ-2, 0,3 мг/кг 34,615,7 23,06,p0,05 p0,05 p0,05 p0,Изокверцитрин, 90* 90* 70* 70* 40,114,0 17,91,1,0 мг/кг p0,05 p0,05 p0,05 p0,90* Рутин, 1,0 мг/кг 31,97,8 15,63,7 60 40 p0,24,85,1* 90* 90* 80* 70* Арктиин, 1,0 мг/кг 34,312,p0,05 p0,05 p0,05 p0,05 p0,Примечание: * - различия достоверны в отношении гипоксического контроля.
Таким образом, тритерпеновым соединениям и лигнанам (в меньшей степени), свойственен выраженный ноотропный эффект, флавоноиды различаются по активности в зависимости от структуры.
РАЗДЕЛЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ И ФРАКЦИЙ РАСТЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ВЫРАЖЕННЫМ НООТРОПНЫМ ЭФФЕКТОМ. ВЫДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И УСТАНОВЛЕНИЕ ИХ СТРУКТУРЫ Княжик сибирский В фармакологически активной бутанольной фракции княжика сибирского выявили наличие фенольных соединений: фенолоспирты и их гликозиды, флавоноиды (кверцетин, кемпферол, изокверцитрин), фенолокислоты (кофейная, хлорогеновая), кумарины (скополетпн, эскулетин, эскулин, умбеллиферон, скиммин) и дубильные вещества смешанной природы; а также тритерпеновые сапонины, аминокислоты и неорганические компоненты с преобладанием магния, железа и меди. В состав фракции входят семь свободных аминокислот (0,33 %), включая незаменимые (треонин, валин, изолейцин, гистидин) и доминирующие (пролин и изолейцин). Для очистки от неорганических компонентов (2,4 %) бутанольную фракцию обрабатывали ацетоном. Выпавший осадок отделяли, а из сконцентрированного раствора проводили выделение фенольных соединений методом колоночной хроматографии на полиамиде, получив при элюировании смесью хлороформ-метанол 98:2, 95:5 и 93:7 вещества 1-3 соответственно.
Вещество 1 - стекловидная масса желтоватого цвета (30 мг). УФ-спектр (СН3ОН), max, нм: 220, 280. Вещество 2 - стекловидная масса желтоватого цвета (20 мг), [ ] - 30,50 (с 2,55, метанол). УФ-спектр (СН3ОН), max, нм: 225, 282. При D кислотном гидролизе расщепляется на вещество 1 и D-глюкозу. ИК-спектры (КВr, max, см-1): 1530, 1610 (С6Н6), 3400 (ОН). Данные ЯМР 1Н спектров подтверждаются характеристикой ЯМР 13С соединений 1 и 2 (табл. 9). В ЯМР 1Н спектре вещества дополнительно обнаружен дублет Н-1 glc с J=7,9 Гц при 4,30 м.д. и мультиплет Н2, 3, 4, 5, 6a, 6в, 8в при 3,20-3,90 м.д., что характерно для D-глюкозы, образующей гликозидную связь по СН2-СН2-ОН боковой цепи. Соединение идентифицировали как 3,4-дигидроксифенилэтанол-2, 2 - 2-(3,4дигидроксифенил)-этил-О--D-глюкопиранозид.
Таблица 9 - ЯМР 1Н (d4-CH3OH, 500,13 МГц, , м.д.) и ЯМР 13С (d4-CH3OH, 125,76 МГц, , м.д.) характеристика вещества 1 и 2 княжика сибирского Химические сдвиги (м.д.); КССВ (Гц) 13 1 13 Атом С Н С Н Вещество 1 Вещество 1 130,6 - 131,6 - 2 130,9 6,69 д. (2,0) 116,4 6,70 д. (2,0) 3 116,2 - 146,1 - 4 156,7 - 144,7 - 5 116,2 6,68 д. (8,0) 117,2 6,68 д. (8,1) 6 130,9 6,55 д.д. (8,1; 2,0) 121,3 6,54 д.д. (8,1; 2,0) 7 36,5 2,78 м. 36,6 2,77 м.
8 72,1 4,05 м. 72,1 4,02 м.
Вещество 3 - белые кристаллы (10 мг), т. пл. 203-205 С (вода). УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 243, (300), 330. ИК-спектр (KBr), max, см-1: 1523, 1605 (C6H6), 1690 (C=O сл. эф.), 1706 (СООН), 3443, 3481 (OH). В продуктах щелочного гидролиза - кофейная и D-хинная кислоты. Химические сдвиги атомов Н совпадают с таковыми для 3-кофеил-D-хинной кислоты (хлорогеновой).
Выделение неорганических компонентов осуществляли хроматографией на колонке с силанизированным силикагелем и элюировании водой, получили сумму доминирующих элементов: Na>Fe>Ba>Cr>Br>Sb>Rb>La>Co>Ce>Th>Hf>Au,Sc. Во фракцию, в большем количестве относительно надземной части растения, экстрагируется натрия, сурьмы, хрома и брома.
Для исследования фракции хлороформ-метанол-вода 70:23:1, полученной при разделении ацетоновой фракции, применяли колоночную хроматографию на силикагеле. В результате выделили 20 мг бесцветной стекловидной массы, содержащей, по данным хроматографии в тонком слое силикагеля, два близких по структуре вещества 4 и 5, относящихся к одной группе соединений, с Rf 0,18 и 0,(хлороформ-метанол-вода 63:23:3), 0,21 и 0,30 (бутанол-1-этанол-вода 10:2:4). На основании данных хроматографического анализа, результатов кислотного и щелочного гидролиза, ИК-, ЯМР Н спектральных характеристик вещества 4 и охарактеризованы как гликозиды дигидроксибутановой кислоты.
Гидролиз суммы тритерпеновых гликозидов ацетоновой фракции, полученной перколяцией водой на колонке с дезактивированным алюминия оксидом, привел к получению олеаноловой кислоты и хедерагенина, что свидетельствует о принадлежности гликозидов княжика к олеанановому ряду. Для выделения индивидуальных гликозидов из их суммы использовали колоночную хроматографию на силикагеле. При элюировании системой растворителей хлороформ-метанол 97:3 получили вещество 6 - бесцветные кристаллы (10 мг), т.
пл. 255-256 С (метанол), [] + 54 (с 2,23, метанол). На основании физических D констант, хроматографического поведения, результатов кислотного и щелочного гидролиза, ИК-спектра сапогенина вещество 6 идентифицировали как 3-О--Dглюкопиранозид олеаноловой кислоты (витальбозид А, андросептозид А).
абазник вязолистный Исследование хлороформной фракции экстракта на 70 % этаноле выявило наличие стеринов, тритерпеновых соединений, простых фенолов (рододендрола, салицина), ароматических кислот (м-гидроксибензойной, ванилиновой), флавоноидов (кверцетина, кемпферола, апигенина, лютеолина, таксифолина) и неорганических компонентов. ГХ/МС анализ фракции дополнительно показал наличие о-ксилола (0,73 %), бензойной кислоты (0,51 %), салигенина (0,52 %), салициловой кислоты (2,39 %), анисового спирта (0,74 %), анисовой кислоты (6,28 %), 1-(4-гидроксифенил)-2-метил-1-пропанона (0,12 %), кониферилового спирта (0,81 %), феруловой кислоты (0,1 %), 3-оксо--ионола (4-(3-гидрокси-1бутенил)-3,5,5-триметил-2-циклогексен-1-он, 0,24 %), дигидроактинидиолида (4,4,7a-триметил-5,6,7,7a-тетрагидро-2(4H)-бензофуранон, 0,28 %), пальмитиновой кислоты (2,49 %) и её этилового эфира (1,12 %), линолевой (0,69 %) и линоленовой кислот (1,07 %), -амирина (0,19 %), диэтилфталата (69,88 %), диизооктилфталата (0,4 %), фитола и его изомеров (1,36 %,), алканов - сумму генеикозана и трикозана (0,45 %), а также пентакозана (0,31 %).
При разделении фракции методом флэш-хроматографии на силикагеле и элюировании смесью гексан-хлороформ 6:4 получили вещество 1 - игольчатые кристаллы белого цвета (20 мг), С8Н8О3, т. пл. 150-152 С (возг.) (этанол-гексан 1:3). УФ-спектр (СН3ОН), max, нм: 218, 252. ИК-спектр (KBr), max, см-1: 1539, 16(C6H6), 1650 (аромат. C=O), 1689 (С=О кислоты), 2848 (ОCH3 аром.), 2916, 29(CH3, CH), 3443 (OH). Масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 152 (М+), 135, 119, 107, 92. ЯМР Н спектр (DMSO-d6), , м.д.: 8,05 (с.; Н-2, Н-6), 6,94 (с.; Н-3, Н-5), 3,86 (с.; 3Н).
Вещество идентифицировали как 4-метоксибензойная кислота (анисовая).
Рехроматографией на колонке с силикагелем из фракции, полученной системой гексан-хлороформ 6:42:8, выделили вещества 2 (белый мелкокристаллический порошок (17 мг), т. пл. 302-304 С (метанол); ЯМР Н спектр (DMSO-d6), , м.д.; J, Гц: 3,24 (дд., 12,4 Гц, 1Н, Н-3), 5,42 (т., 1Н, Н-12), 3,(уш. дд., 14,4 Гц, 1Н, Н-18), 1,26 (с., 6Н, Н-23), 1,09 (с., 6Н, Н-24), 0,88 (с., 3Н, Н25), 1,09 (с., 3Н, Н-26), 1,26 (с., 3Н, Н-27), 0,91 (с., 3Н, Н-29), 0,90 (с., 3Н, Н-30); 3гидроксиолеан-12-ен-28-овая кислота, олеаноловая) и 3 (белый мелкокристаллический порошок (10 мг), т. пл. 284-285 С (этанол); ИК-спектр (KBr), max, см-1: 670, 1270 (цис-тризамещенная С=С), 1182, 1109, 1138 (ОH), 1270, 1310, 1321, 1342, 1403 (CH3, CH2, CH), 1637 (С=С, цис), 1690 (С=О кислоты), 2871, 2930, 2965 (CH3, CH2, CH), 3446 (OH); ЯМР 1Н спектр совпадает с таковым для 3гидроксиурс-12-ен-28-овой кислоты, урсоловой).
В этилацетатной фракции экстракта лабазника обнаружены: простые фенолы (рододендрол, салигенин, салицин), флавоноиды (кверцетин, кемпферол, апигенин, таксифолин, гиперозид), ароматические кислоты (бензойная, ванилиновая, гентизиновая, галловая, эллаговая, п-кумаровая, кофейная, феруловая, хлорогеновая), кумарины, дубильные вещества (преимущественно, гидролизуемой группы), тритерпеновые соединения (олеаноловая кислота) и неорганические компоненты.
Разделение фракции осуществляли с помощью флэш-хроматографии на полиамиде. Сумму фенолкарбоновых кислот и гидроксикумаринов, элюированных смесью хлороформ-метанол 8:2, рехроматографировали на силикагеле и выделили вещество 4 (белые игольчатые кристаллы (20 мг), т. пл. 154-156 С (бензол); УФспектр (СН3ОН), max, нм: 231, 300; масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 138 (М+);
салициловая кислота) и 5 (белые кристаллы (8 мг), т. пл. 169-170 С (этанол-вода 1:5); УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 239, (298), 322; масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 1(М+); 3-метокси-4-гидроксикоричная кислота, феруловая кислота), 6 (белый мелкокристаллический порошок (30 мг), С9Н10О5, т. пл. 159-160 С (хлороформ);
УФ-спектр (СН3ОН), max, нм: 222, 275; масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 198 (М+), 1(М-15), 170 (М-28), 153 (М-45, OC2H5), 125 (М-73, COOC2H5), 107 (125-18, H2O);
этилгаллат) и 7 (бесцветные игольчатые кристаллы (8 мг), т. пл. 270-271 С (этанолвода 1:4); УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 265, (306), 355; (+СН3СООNа): 270; ИКспектр (KBr), max, см-1: 1592, 1625 (C6H6), 1716 (С=О -пирона), 3446 (OH); 6,7дигидроксикумарин, эскулетин) соответственно.
Фенольные соединения фракции, выделенные смесью хлороформ-метанол 6:4, разделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле и получили вещества 8 (лимонно-желтые кристаллы (60 мг), т. пл. 312-313 С (этанол-хлороформ 1:20);
УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 255, (295), (317), 372; кверцетин) и 9 (белые игольчатые кристаллы (120 мг), т. пл. 238-240 С (возг.) (метанол-хлороформ 1:20);
УФ-спектр (СН3ОН), max, нм: 218, 271; ИК-спектр (КBr), max, см-1: 1543, 16(C6H6), 1650 (аромат. C=O), 1680 (СООН), 3277, 3500 (OH); масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 170 (М+); галловая кислота), 10 (желтые кристаллы (30 мг), т. пл. 208-210 С (метанол-хлороформ-гексан 1:1:1,5); УФ-спектр (СН3ОН), max, нм: 257, 356; в продуктах кислотного гидролиза - кверцетин и L-арабиноза; ИК- и ЯМР Н спектры характерны для 3-О--арабофуранозида кверцетинаа, авикулярина) и 1,92 г кристаллической смеси соединений 11, 12 соотношении 7:5. Разделение веществ осуществлено применением метода противоточного распределения в системе растворителей хлороформ-метанол-бутанол-1-вода (10:10:1:6). Из верхней фазы системы нами получено вещество 11 - желтый мелкокристаллический порошок, т. пл. 217-218 С (этанол), [] - 56,60 (с 0,53, этанол). УФ-спектр D (С2Н5ОН), max, нм: 254, (264), 364. ИК-спектр (KBr), max, см-1: 1009, 1040, 10(пиранозное кольцо), 1261 (С-О-С), 1513, 1558, 1610 (C6H6), 1659 (аромат. C=O пиронового цикла), 3382 (OH). ЯМР 1Н спектр (DMSO-d6), , м.д.; J, Гц: 6,20 (д., 2,Гц, 1Н, Н-6), 6,45 (д., 2,0 Гц, 1Н, Н-8), 7,70 (д., 2,0 Гц, 1Н, Н-2'), 7,26 (д., 9,0 Гц, 1Н, Н-5'), 7,62 (дд., 9,0 Гц, 2,0 Гц, 1Н, Н-6'), 5,70 (д.; 8,0 Гц, 1Н, Н-1''). ЯМР 13С спектр (DMSO-d6), , м.д.: 146,8 c (C-2), 136,5 c (C-3), 170,1 c (C-4), 103,2 с (С-4а), 160,7 c (C-5), 98,3 д (С-6), 164,1 с (С-7), 93,6 д (С-8), 156,3 с (С-8а), 125,1 с (С-1Т), 116,0 д (С-2Т), 146,0 с (С-3Т), 146,4 с (C-4Т), 115,2 д (С-5Т), 119,6 д (С-6Т), 101,8 (С-1''), 75,(С-2''), 73,2 (С-3''), 71,2 (С-4''), 68,0 (С-5''), 60,7 (С-6''). Таким образом, на основании физических, спектральных и хроматографических данных вещество 11 - 4'-О--Dгалактопиранозид кверцетина, информация о нахождении которого в растениях в литературе нами не найдена.
Вещество 12 - ярко-желтый мелкокристаллический порошок, т. пл. 238-239 С (этанол-ацетон 1:20). УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 257, (303), 363. ИК-спектр (KBr), max, см-1: 1019, 1059, 1080, 1088 (пиранозное кольцо), 1267 (С-О-С), 1503, 1566, 1606 (C6H6), 1657 (аромат. C=O -пиронового цикла), 3346 (OH). В продуктах кислотного гидролиза обнаружили кверцетин и D-глюкозу. В спектре HMBC сигнал атома С-3 (133,4 м. д.) имеет кросс-пик с аномерным протоном молекулы глюкозы (5,46 м. д.). Вещество идентифицировали с 3-О--D-глюкопиранозидом кверцетина (изокверцитрином).
В бутанольной фракции экстракта лабазника выявлено наличие флавоноидов, фенолкарбоновых кислот (гентизиновая, п-кумаровая, кофейная, хлорогеновая), кумаринов (след. количества), дубильных веществ гидролизуемой группы, аминокислот (в т. ч. валина, гистидина), углеводов (D-глюкоза, Dгалактоза, L-арабиноза) и неорганических компонентов. Разделение фракции проводили методом флэш-хроматографии на полиамиде с последующей рехроматографией на силикагеле. В результате получили 0,21 г галловой кислоты, 50 мг изокверцитрина, вещества 13 и 14 (светло-желтый мелкокристаллический порошок (31 мг), т. пл. 198-200 С (вода); УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 257, (300), 361; кислотный гидролиз - кверцетин, D-глюкоза и L-рамноза; химические сдвиги углеродных атомов С совпадают с таковыми для рутина), 15 (бесцветные игольчатые кристаллы со специфическим запахом (3 мг), т. пл. 120-122 С (ацетонгексан 1:20); УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 222, 293; масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV:
148 (М+); коричная кислота), 16 (желтые кристаллы (6 мг), т. пл. 278-279 С (метанол); УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: (254), 267, (296), (320), 365;
(+СН3СООNа): 269, 380; (+AlCl3): 270, 420; (+С2Н5ОNa): 278, 414; кемпферол) и мг кверцетина.
Вещество 13 - светло-желтый мелкокристаллический порошок (20 мг), т. пл.
228-230 С (хлороформ-метанол-бутанол-1-вода (10:10:1:6) из верхней фазы). УФспектр (С2Н5ОН), max, нм: 256, (266), 366. ИК-спектр (KBr), max, см-1: 1011, 1022, 1047, 1090, 1138 (пиранозное кольцо), 1234, 1253 (С-О-С), 1507, 1517, 1558, 1599, 1618 (C6H6), 1656 (аромат. C=O -пиронового цикла), 3354, 3523 (OH). Кислотный гидролиз показал наличие кверцетина и D-глюкозы. В спектре HMBC сигнал аномерного протона молекулы глюкозы (4,85 м. д.) имеет кросс-пик с углеродным атомом C-4' (146,8 м. д.). Вещество - 4'-О--D-глюкопиранозид кверцетина (спиреозид).
R RO R 8 H H HO O 10 H -L-Araf O H 11 -D-Galp H 12 H -D-Glup O R 13 -D-Glup H O O H 14 -D-Glup--L-Rhap H В фармакологически активный экстракт лабазника, преимущественно, извлекается бром, кобальт, сурьма, хром и гафний. В хлороформную фракцию переходит железо, кальций, хром, гафний и самарий, а в этилацетатную - кальций, хром, железо, самарий, цинк, лантан, церий, гафний, натрий, торий и скандий.
Альфредия поникшая В хлороформной фракции экстракта обнаружены стерины (-ситостерин), тритерпеновые соединения, гидроксикумарины (эскулетин), ароматические кислоты (ванилиновая). ГХ/МС анализ дополнительно выявил присутствие сильвестрена (1-метил-5-(1-метилэтенил)-циклогексен, 0,02 %), фенилэтилена (0,62 %,), бензилового (0,05 %) и кониферилового (1,11 %) спиртов, ванилина (0,19 %), сиреневого альдегида (0,15 %), бензойной (0,07 %), салициловой (0,46 %) и галловой (0,41 %) кислот, этилсалицилата (0,1 %), диэтилфталата (9,59 %), моно(2-этилгексил)фталата (3,56 %), дигидроактинидиолида (0,06 %), пентакозана (0,37 %), фитола и его изомеров (4,96 %), пальмитиновой (3,59 %), линолевой (1,04 %), -линоленовой (0,94 %) кислот, -амирина (10,9 %) и его ацетата (5,5 %).
Выделение фенольных и тритерпеновых соединений проводили методом колоночной хроматографии на силикагеле. При элюировании хлороформом получили, по данным ГХ/МС (рис. 1), сумму четырех близких по структуре веществ тритерпеновой структуры (98,54 %, tr 53,58-66,96 мин) с (М+) 426 (m/z, ЭУ, 70 eV), одним из которых является -амирин (30,07 %, tr 53,58 мин), а также оксилол (0,02 %, tr 5,87 мин), капроновую кислоту (0,03 %, tr 6,58 мин), 3-карен (0,01 %, tr 7,31 мин), диметилсукцинат (0,03 %, tr 7,41 мин), м-крезол (0,01 %, tr 7,мин), диметиловый эфир азелаиновой кислоты (0,11 %, tr 12,55 мин), диэтилфталат (1,1 %, tr 13,11 мин). При рехроматографии суммы на силикагеле и промывании колонки смесью гексан-ацетон 98:2 выделили 1,6 г белого мелкокристаллического порошка, т. пл. 160-161 С (этанол), представляющего собой однородную по хроматографии в тонком слое смесь веществ 1-4, идентифицированных ГХ/МС как -амирин (олеан-12-ен-3-ол, 27,48 %), -амирин (урс-12-ен-3-ол, 27,52 %), моретенол (гоп-22(29)-ен-3-ол, 25,52 %) и лупеол (луп-22(29)-ен-3-ол, 19,48 %).
Отн. интенсивность, % 57,100 53,Рисунок 1 - ГЖ80 хроматограмма фракции, 75 13,содержащей сумму 66,11 тритерпеновых 55 соединений, полученной из хлороформной фракции экстракта альфредии 30 поникшей 66,10 12,16,5 69,7,29,05 73,30,42 51,69 80,10 20 30 40 50 60 70 80 Время, мин Фракцию, полученную смесью хлороформ-этанол 93:7Ц90:10, рехроматографировали на силикагеле с последующим противоточным распределением в системе хлороформ-метанол-вода (5:6:4) из нижней фазы, выделили вещество 5 - белый мелкокристаллический порошок (100 мг), C27H34O11;
т. пл., С (хлороформ-гексан 1:2): 86 (газ. выдел.), 250 (разл.). УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 224, 255, (274), (298). ИК-спектр (в пл. CHCl3), max, см-1: 1026, 1074, 1140, 1157 (пиранозное кольцо), 1194, 1235, 1264 (С-О-С), 1332, 1349, 1383, 1421, 1453, 1464 (CH3, CH2, CH), 1515, 1592, 1606 (аром.), 1766 (-лактонный цикл, лактонный карбонил), 2855 (ОCH3 аром.), 2839, 2921 (CH3, CH2), 3419 (OH). ЯМР характеристика представлена в таблице 10. Вещество 5 (рис. 2) - 3-(3-метокси-4-D-глюкопиранозилоксибензил)-4-(3,4-диметоксибензил)-бутиролактон (арктиин).
Таблица 10 - Химические сдвиги и корреляции в молекуле вещества Хим. сдвиги (м.д.); КССВ (Гц) Атом COSY HSQC HMBC 13 С Н 2 178,7 - Ц - H3 46,52 2,43, м. Н6 2,43\46,52 C4 41,19 2,52, м. Н7 2,52\41,19 C5 71,27 4,09, дд.; 9,2; 7,7. 3,8, м. Н4 4,09; 3,8\71,27 C3; C6 34,48 2,83, м. Н3 2,83\34,48 C3; C2,63, дд.; 13,75; 6,3. 2,50;
7 38,10 H4 C2''; C6'' 2,50, м. 2,63\38,1' 133,24 - Ц - H2'; H5' 2' 113,34 6,61, д.; 1,66 H6' 6,61\113,34 C1'; C4' 3' 149,53 - Ц - H5'; 4' 145,15 - Ц - H3'; H5'; H1''' 5' 117,85 6,88, д.; 8,2 H6' 6,88\117,85 C2'; С4' 6' 121,92 6,53, дд.; 8,2; 1,84 H2'; H5' 6,53\121,92 C1'; C3'; C4' 1'' 130,05 - Ц - H2'': H5'' 2'' 112,05 6,47, д.; 1,84 H6'' 6,47\112,05 C1''; C4''; C3'' 3'' 149,13 - Ц - H2''; H5''; H6''; 4'' 148,00 - Ц - H2''; H5''; H6''; 5'' 111,54 6,73, д.; 8,2 H6''; 6,73\111,54 C1''; C2''; C3''; C4''; C5''; 6'' 120,74 6,55, дд.; 8,2; 1,75 H2''; H5'' 6,55\120,74 C3''; C4'' 1''' 102,10 4,78, д.; 7,40 H2''' 4,78\102,10 145,2''' 73,31 - Ц - Ц 3''' 76,24* - Ц - Ц 4''' 69,49 - Ц - Ц 5''' 76,98* - Ц - Ц 6''' 61,64 - Ц - Ц 56,01 3,67, c. H2' 3,67\56,01' C3' 56,07 3,77, c. H2'' 3,77\56,07 C3'' 56,07 3,80, c. H5'' 3,80\56,07 C4'' Примечание: * - значения взаимозаменяемы. ЯМР 1Н (DMSO-d6, 400 МГц, , м.д.) и ЯМР 13С (DMSO-d6, 125,76 МГц, , м.д.).
''' H CO ' '' '' ' 2 6 C ''' '' ' 6 4 ''' 4 ''' 1 '' А 1 Б CH' 3 ''' 3 ''' '' ' ' 5 2 '' O CHO H H OCHH CO HOH C H 2 H H H O HO H H OCHO HO HO H H H H H H O O H Рисунок 2 - Формула вещества 5 (1) и кросс-пики, вызванные ядерным эффектом Оверхаузера (2) В этилацетатной фракции экстракта альфредии обнаружили простые фенолы, флавоноиды (кверцетин, кемпферол, таксифолин, апигенин, лютеолин, изокверцитрин, лютеолин-7-глюкозид), ароматические кислоты (ванилиновая, коричная, кофейная, хлорогеновая), лигнаны (арктиин), кумарины, тритерпеновые соединения, стерины (-ситостерин) и неорганические компоненты. Разделение фракции осуществляли методом колоночной хроматографии на силикагеле. При элюировании смесью хлороформ-этанол 98:2 в индивидуальном состоянии получили 32 мг вещества 6 (кверцетин) и 7 (белый мелкокристаллический порошок (16 мг), т. пл. 282-283 С (хлороформ-этанол 6:4); ИК-спектр (KBr), max, см-1: 1023, 1074, 1105, 1166 (ОH), 1197, 1255, 1304, 1333, 1367, 1379, 1443, 1464 (CH3, CH2, CH), 1644, 1669 (С=С), 2851, 2869, 2934, 2959 (CH3, CH2), 3396 (OH); на пластинке Silufol UV-254 проявляется в виде темно-красного пятна при обработке ванилинфосфорным реактивом с Rf 0,25 (хлороформ-метанол 25:3) и 0,30 (хлороформэтанол 8:1); отнесено к тритерпеновым соединениям, ОВ-2), хлороформ-этанол 88:12 - 37 мг вещества 8 (желтый мелкокристаллический порошок, т. пл. 238240 С (ацетон); УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 258, (300), 360; (+AlCl3+HCl): 268, 410; изокверцитрин).
Фракцию, элюированную хлороформом, разделяли рехроматографией на силикагеле и при промывании колонки смесью гексан-ацетон 92:8 получили 3 мг вещества 9 (коричная кислота), гексан-ацетон 80:20 - вещество 10 (белый мелкокристаллический порошок (10 мг), т. пл. 210-212 С (этанол-хлороформ 1:20);
УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 220, 260, 290; масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 168 (М+), 153, 151, 125, 97; ЯМР 1Н спектр (d-ацетон),, м.д.; J, Гц: 7,62 (дд., 9,0 и 2,0 Гц, Н 6), 7,56 (д., 2,0 Гц, Н-2), 6,92 (д., 9,0 Гц, Н-5), 3,90 (с., СН3О); 3-метокси-4гидроксибензойная кислота, ванилиновая).
В бутанольной фракции экстракта альфредии обнаружены простые фенолы, флавоноиды (лютеолин-7-глюкозид), ароматические кислоты (ванилиновая, коричная, кофейная), тритерпеновые соединения (след. количества), аминокислоты (в т.ч. валин, треонин, триптофан, метионин) и неорганические компоненты. При разделении фракции методом флэш-хроматографии на силикагеле и элюировании смесью хлороформ-метанол 2:8 получили 15 мг вещества 11 (белый кристаллический порошок, т. пл. 203-204 С (этанол-вода 3:2); УФ-спектр (С2Н5ОН), max, нм: 243, (299), 326; хлорогеновая кислота). Из фракции, элюированной смесью хлороформ-метанол 6:4, рехроматографией на полиамиде получили 100 мг вещества 12 (рутин) и 8 (изокверцитрин).
В водном остатке содержится 10,63 % азотсодержащих соединений, 1,99 % аминокислот (с доминированием глутаминовой и аспарагиновой кислот, валина, пролина, аланина и гистидина), 32 % углеводов (D-глюкоза, D-галактоза, Lарабиноза, D-глюкуроновая кислота), следовые количества флавоноидов, неорганические компоненты.
В элементном составе активного экстракта альфредии преобладают: кальций, натрий, железо, цинк, стронций, барий, бром, кобальт, хром, гафний, торий, лютеций, лантан и самарий; в составе водного остатка - калий, магний, цинк, рубидий, фосфор, кальций и марганец.
СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ЕГО ОСНОВЕ Параметры качества лекарственного сырья и лекарственных препаратов на его основе, включенные в проекты ФС, разрабатывали и оформляли в соответствии с ОСТ 91500.05.001.-00.
В качестве сырья рекомендованы олиственные побеги княжика сибирского, собранные в фазы цветения и начала плодоношения. К диагностически значимым признакам листа и цветка отнесены длинные одноклеточные волоски и мелкие пузырчатые трихомы; эпидермис стебля представлен клетками с прямыми стенками и немногочисленными устьицами аномоцитного типа, окруженными восемью околоустьичными клетками; для строения плода характерно наличие мезокарпия, образованного слоем изодиаметрических клеток, утолщающегося в клиновидных выростах, основная часть семени представлена эндоспермом с включениями жирного масла, семянка в нижней части опушена редкими простыми одноклеточными волосками.
Стандартизацию лекарственного сырья предложено осуществлять по фенолоспиртам (производным фенилэтанола-2), обусловливающих активность (табл. 11). Обнаружение фенолоспиртов проводят в тонком слое силикагеля, в экспериментально подобранной системе растворителей хлороформ-метанол-вода (70:12:1), применяя в качестве детектора ванилин-фосфорный реактив. Кроме того, в УФ-области обнаруживается характерная для фенолоспиртов полоса поглощения (2802 нм). В основу методики количественного определения фенолоспиртов в побегах княжика положен спектрофотометрический метод и реакция образования окрашенных, устойчивых во времени комплексов с о-фенантролином в присутствии железа (III) хлорида, поглощающих излучение при длине волны 509нм. Условия проведения реакции отрабатаны на 3,4-дигидроксифенилэтаноле-2, т.
к. спектры поглощения продуктов реакции с о-фенантролином в присутствии железа (III) хлорида этого соединения и фенолоспиртов княжика сибирского совпадают (max 509 нм). Учитывая неустойчивость 3,4-дигидроксифенилэтанола-в процессе хранения, расчет содержания фенолоспиртов предложено проводить по экспериментально установленному удельному показателю поглощения (156,8).
Относительная ошибка методики составляет 5,4 %. Методика валидирована, согласно рекомендациям ICH, по показателям: линейность (y=0,1426x+0,0031, R2=0,9999), прецизионность (RSD=0,96 %) и точность (RSD=0,43 %). Наибольшее количество фенолоспиртов содержится в цветках и листьях, а также в сырье, собранном в фазы цветения и начала плодоношения. Срок годности сырья составляет три года. Учитывая принцип унификации методик в ряду: сырье - субстанция - лекарственная форма, определение наличия и содержания действующих веществ (фенолоспиртов) в экстракте княжика сибирского жидком, густом и таблетках осуществляют хроматографически в тонком слое силикагеля, получением характерного УФ-спектра и спектрофотометрическим методом на основе реакции окисления с о-фенантролином в присутствии железа (III) хлорида соответственно (табл. 12, 13).
Таблица 11 - Нормы качества побегов княжика сибирского, травы лабазника вязолистного и альфредии поникшей (цельных и измельченных) по числовым показателям Норма по проекту ФС, % Лабазника Альфредии Показатель Княжика сибирского вязолистного поникшей побеги трава трава не менее 1,5 не менее 1,5 не менее 0,фенолоспиртов флавоноидов флавоноидов Действующих веществ (в пересчете на 3,4- (в пересчете на (в пересчете на дигидроксифенилэтанол-2) кверцетин) изокверцитрин) Экстрактивных веществ, не менее 18 не менее 18 не менее извлекаемых 25 % спиртом 70 % спиртом 95 % спиртом Влажность не более 14 не более 12 не более Золы общей не более 9 не более 9 не более Золы, нерастворимой в хлористоводородной не более 1 не более 1,5 не более кислоте не более 50 не более не более Стеблей отделенных диаметром диаметром более 4 мм при анализе более 20 мм Частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром не более10 не более 10 не более отверстий 7 мм Частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий не более 10 не более 10 не более 0,5 мм Потемневших частей не более 3 не более 10 - растения Органической примеси не более 3 не более 1,5 не более 1,Минеральной примеси не более 1 не более 1 не более Таблица 12 - Нормы подлинности и качества экстрактов княжика сибирского Нормы по проектам ФС Показатель Экстракт жидкий Экстракт густой Жидкость темно-коричневого цвета Густая вязкая масса темнос красноватым оттенком коричневого цвета со Описание со специфическим запахом кисло- специфическим запахом горького вкуса кисло-горького вкуса На хроматограмме должны обнаруживаться пятна розового Хроматография и красного цвета с Rf около 0,49 после обработки ванилинфосфорным реактивом и диазореактивом соответственно УФ-спектр испытуемого раствора должен иметь Спектр поглощения максимум при длине волны 2802 нм Содержание действующих не менее 1,5 не менее 1,веществ (фенолоспиртов), % Содержание спирта, % не менее 17 - Сухой остаток, % не менее 16 - Содержание не более 0,01 не более 0,тяжелых металлов, % Влага, % - не более Микробиологическая ОФС 42-0067Ц07, Категория 4Б чистота Срок годности 3 года Таблица 13 - Нормы качества таблеток княжика сибирского и лабазника вязолистного Норма по проекту ФС Параметр Княжика сибирского Лабазника вязолистного таблетки таблетки Описание Плоскоцилиндрические Плоскоцилиндрические таблетки с риской кремового таблетки с риской бежевого цвета с темными вкраплениями цвета с темными вкраплениями со специфическим запахом со специфическим запахом Геометрические и вкусом и вкусом параметры: d, мм 9,000,30 10,000,h, мм 3,440,40 3,350,0,3250,016, отклонение от 0,3400,017, отклонение от Средняя масса, г средней массы таблеток средней массы таблеток должно быть не более 5 % должно быть не более 5 % Прочность на истирание, % не менее 97 не менее Распадаемость, мин не более 15 не более Содержание аэросила, % не более 5 - Содержание действующих 0,009560,00143 0,00720,001веществ, г на 1 таблетку (фенолоспиртов) (флавоноидов) Растворение, % не менее 75 не менее Микробиологическая ОФС 42-0067Ц07, ОФС 42-0067Ц07, чистота Категория 4Б Категория 4Б Срок годности 3 года 3 года Трава лабазника вязолистного, собранная в фазу цветения, рекомендована нами как лекарственное растительное сырье. Характерным диагностическим признаком сырья является наличие волосков различных типов: простых одноклеточных толстостенных - на эпидермисе стебля, верхнем эпидермисе листа и по краю листа, железистых - на верхнем эпидемисе листа, простых кнутовидных - на нижнем эпидемисе листа и булавовидных железистых - на эпидермисе лепестка венчика.
Стандартизацию травы предложено осуществлять по флавоноидам (кверцетину и его гликозидам), проявляющим выраженную активность (табл. 11).
Определение наличия действующих веществ (изокверцитрин, спиреозид, авикулярин) осуществяляют методом хроматографии в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-этанол (8:2), детектируя 5 % раствором алюминия хлорида на 95 % этаноле и УФ-светом (360 нм). В УФ-области (365нм) имеется, характерная для гликозидов кверцетина, полоса поглощения.
Количественное определение флавоноидов проводят методом дифференциальной спектрофотометрии, используя реакцию комплексообразования с раствором алюминия хлорида в кислой среде. Учитывая, что сумма гликозидов кверцетина проявляет выраженную активность, осуществляли кислотный гидролиз экстракта лабазника. Условия проведения реакции отрабатывали на ГСО кверцетина (ФС 421290-79), т.к. спектры поглощения продуктов реакции с раствором алюминия хлорида этого соединения и флавоноидов лабазника вязолистного после гидролиза совпадают (max 425 нм). Относительная ошибка методики составляет 1,42 %.
Методика валидирована, согласно рекомендациям ICH, по показателям:
инейность (y=0,1416x+0,0043, R2=0,9999), прецизионность (RSD=0,99 %) и точность (RSD=0,46 %). Наибольшее количество флавоноидов обнаружено в сырье, собранном в фазу цветения, а максимальное содержание - в цветках и листьях растения. Срок годности сырья - три года. Разработанные методики положены в основу стандартизации экстрактов жидкого, сухого и таблеток лабазника вязолистного (табл. 13, 14).
Таблица 14 - Нормы подлинности и качества экстрактов лабазника вязолистного Нормы по проектам ФС Показатель Экстракт жидкий Экстракт сухой Жидкость темно-коричневого цвета Аморфный порошок с зеленоватым оттенком коричневого цвета Описание со специфическим запахом со специфическим запахом горько-вяжущего вкуса вяжущего вкуса На хроматограмме должны обнаруживаться пятна лимонно-желтого цвета с Rf около 0,55 (авикулярин), 0,25 (изокверцитрин) и 0,Хроматография (спиреозид) после обработки 5 % раствором алюминия хлорида в 95 % спирте этиловом в видимом и УФ-свете при длине волны 360 нм УФ-спектр испытуемого раствора должен иметь Спектр поглощения максимум при длине волны 3652 нм Содержание действующих не менее 1,5 не менее 1,веществ (флавоноидов), % Содержание спирта, % не менее 57 - Сухой остаток, % не менее 7 - Содержание не более 0,01 не более 0,тяжелых металлов, % Влага, % - не более Микробиологическая ОФС 42-0067Ц07, Категория 4Б чистота Срок годности 3 года В качестве сырья нами рекомендована трава альфредии поникшей, собранная в фазу цветения. Микроскопическим диагностическим признаком сырья является наличие различных типов волосков: на эпидермисе листа - простые многоклеточные тонкостенные и толстостенные волоски с продольной складчатостью, простые тонкостенные волоски с многоклеточным основанием;
цветка - простые многоклеточные тонкостенные и звездчато-лучистые многоклеточные волоски с многоклеточным основанием; стебля - простые многоклеточные волоски с неравномерными утолщениями и простые многоклеточные двухрядные волоски.
Стандартизацию сырья предложено осуществлять по флавоноидам (изокверцитрину), обладающим выраженным ноотропным эффектом (табл. 11).
Обнаружение проводят на пластинках Сорбфил ПТСХ-П-А в системе растворителей этилацетат-муравьиная кислота-вода (8:1:1), проявляя в УФ-свете (360 нм) и 5 % раствором алюминия хлорида на 95 % этаноле. В связи с отсутствием выраженного максимума поглощения в УФ-спектре и для увеличения избирательности методики, определяли оптическую плотность окрашенных, устойчивых во времени продуктов реакции флавоноидов альфредии с алюминия хлоридом в кислой среде (рН экстракта), используя метод дифференциальной спектрофотометрии. Спектры поглощения продуктов реакции изокверцитрина с алюминия хлоридом и флавоноидов альфредии совпадают (max 4102 нм). Расчет содержания флавоноидов осуществляют в пересчете на изокверцитрин по экспериментально установленному удельному показателю поглощения (295,0).
Относительная ошибка методики составляет 5,57 %. Методика валидирована, согласно рекомендациям ICH, по показателям: линейность (y=0,6313x+0,0065, R2=0,9998), прецизионность (RSD=0,96 %) и точность (RSD=0,46 %). Содержание флавоноидов достигает максимума в период цветения - 0,73 %, а наибольшее количество их накапливается в цветках альфредии - 1,4 %. Срок годности травы альфредии поникшей составляет три года.
Таблица 15 - Нормы подлинности и качества экстракта альфредии поникшей жидкого Показатель Норма по проекту ФС Жидкость темно-коричневого цвета с зеленоватым оттенком Описание со специфическим запахом горько-кислого вкуса На хроматограмме должно обнаруживаться пятно желтого цвета с Rf около 0,50 после обработки 5 % раствором алюминия Хроматография хлорида в 95 % спирте этиловом в видимом и УФ-свете при длине волны 360 нм Содержание действующих не менее 0,веществ (флавоноидов), % Содержание спирта, % не менее Сухой остаток, % не менее Содержание тяжелых не более 0,металлов, % Микробиологическая чистота ОФС 42-0067Ц07, Категория 4Б Срок годности 3 года Разработку методик качественного обнаружения и количественного определения действующих веществ в жидком экстракте альфредии поникшей проводили в соответствии с принципом унификации методик в ряду: сырьелекарственная форма (табл. 15).
Таким образом, на основании изучения химического состава и фармакологической активности ряда растений Сибири предложены рациональные научноЦметодические подходы к поиску источников и созданию эффективных ноотропных средств растительного происхождения (рис. 3), включающие схему выбора рациональных экстрагентов, способы выявления перспективных видов и оценки их ноотропных свойств.
Блок I. Выявление перспективных видов растений 1.1. Анализ данных литературы и ресурсной базы видов 1.2. Исследование групп БАВ и элементного состава растений 1.3. Исследование антиоксидантных свойств водных и водно-этанольных экстрактов растений in vitro 1.4. Скрининговое изучение ноотропной активности (гипоксия гермообъема, "открытое поле", выработка и воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания, принудительное плавание с утяжеляющим грузом) и химического состава водных и водно-этанольных экстрактов растений Блок II. Химико-фармакологическое изучение экстрактов перспективных видов 2.1. Разработка рациональных способов получения 2.2. Исследование специфической ноотропной активности экстрактов перспективных видов выбранных экстрактов и их безопасности, выявление спектра ноотропной активности 2.3. Разделение выбранных экстрактов на фракции, 2.4. Разработка методических приемов разделения оценка их ноотропных и антиоксидантных свойств экстрактов и фракций, выделение индивидуальных соединений, установление их структуры 2.5. Изучение зависимости химическая структура - 2.6. Оценка иммунотропного, гепатопротекторного, антиоксидантная и ноотропная активность диуретического и других эффектов перспективных для выделенных соединений источников получения ноотропных фитопрепаратов Блок III. Разработка нормативной документации на лекарственное сырье перспективных видов и ноотропные лекарственные средства на их основе 3.1. Стандартизация лекарственного растительного сырья 3.2. Разработка лекарственных форм, перспективных видов, их стандартизация, оценка специфической активности, составление нормативной документации безопасности, составление нормативной документации Рисунок 3 - Рациональные научно-методические подходы к поиску источников и созданию ноотропных средств растительного происхождения ВЫВОДЫ 1. Теоретически и экспериментально обоснована перспективность исследования и использования надземной части княжика сибирского, лабазника вязолистного и л.
обыкновенного, альфредии поникшей и а. снежной, побегов черники обыкновенной, зеленых листьев бадана толстолистного как источников ноотропных фитопрепаратов.
2. Изучены основные группы биологически активных веществ в исследуемых видах, что выявило доминирование фенольных (представители простых фенолов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, лигнанов) и тритерпеновых соединений.
Впервые изучен элементный состав вышеуказанных растений, собранных в различных районах Сибири, и показана возможность их использования в качестве источников макро- и микроэлементов, включая эссенциальные.
3. Установлено, что экстракты изучаемых растений проявляют антиоксидантную активность, причем наиболее выраженные свойства присущи экстрактам на 70 % и 95 % этаноле, сравнимые или превосходящие по эффекту дигидрокверцетин и кислоту аскорбиновую. Впервые установлено, что экстракты исследуемых растений проявляют ноотропные свойства. Наибольшей активностью характеризуются экстракты княжика сибирского на 25 % этаноле, лабазника вязолистного на 70 % этаноле и альфредии поникшей на 95 % этаноле, сопоставимой, а на некоторых моделях, превосходящей пирацетам и препарат Гинсана; определена зависимость их специфической активности от ряда факторов, что позволило разработать оригинальные ноотропные фитопрепараты.
4. Впервые выявлены различия по спектру ноотропных свойств: экстракт княжика сибирского обладает наиболее выраженным противоишемическим, анксиолитическим и антистрессорным, лабазника вязолистного - антиоксидантным и адаптогенным, альфредии поникшей - антистрессорным, анксиолитическим и противоневротическим действием. Из надземной части княжика сибирского получена бутанольная фракция, проявляющая выраженный ноотропный эффект.
При фракционировании экстрактов альфредии поникшей и лабазника вязолистного выявлено разделение ноотропного эффекта на составляющие, что указывает на специфическое действие суммы их биологически активных веществ.
5. Впервые из фармакологически активной фракции княжика сибирского выделены фенолоспирты (3,4-дигидроксифенилэтанол-2 и его глюкозид), фенолкарбоновая кислота (хлорогеновая), сумма гликозидов дигидроксибутановой кислоты, тритерпеновый гликозид (3-0--D-глюкопиранозид олеаноловой кислоты) и установлен состав аминокислот и микроэлементов.
6. Из фармакологически активного экстракта лабазника вызолистного получены флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, 4'-глюкозид кверцетина, авикулярин, 4'-О-D-галактопиранозид кверцетина, рутин; кемпферол), ароматические кислоты (салициловая, анисовая, галловая и её этиловый эфир, коричная, феруловая), кумарины (эскулетин), тритерпеновые соединения (урсоловая и олеаноловая кислоты). Из растения впервые выделены изокверцитрин, 4'-О--Dгалактопиранозид кверцетина, коричная, феруловая, анисовая кислоты и этилгаллат. Структура 4'-О--D-галактопиранозида кверцетина не описана ранее в литературе.
7. Впервые из экстракта альфредии поникшей, обладающего ноотропным действием, выделены: лигнан (арктиин), флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), ароматические кислоты (коричная, ванилиновая, хлорогеновая) и тритерпеновые спирты (- и -амирины, моретенол, лупеол).
8. Экспериментально установлено, что наибольшей антиоксидантной активностью обладают выделенные производные фенилэтанола-2, гликозиды кверцетина, арктиин и сумма тритерпеновых спиртов. Наиболее выраженной ноотропной активностью обладают тритерпеновые соединения, арктиин и изокверцитрин, наименьшим характеризуется рутин.
9. Показано, что экстракты княжика сибирского, лабазника вязолистного и альфредии поникшей проявляют иммунотропное действие. Наиболее выраженное влияние обнаруживает экстракт лабазника на 70 % этаноле, превосходящий по активности настойку эхинацеи пурпурной. Впервые выявлена выраженная гепатопротекторная активность указанного экстракта лабазника, по ряду показателей, превышающего эффективность карсила, что обусловлено активацией внутриклеточных регенераторных процессов и нормализацией гистологических, метаболических показателей печени, антиоксидантными и мембраностабилизирующими свойствами. Обнаружено, что экстракт альфредии поникшей и княжика сибирского проявляют выраженную диуретическую активность.
10. Разработаны унифицированные методики качественного и количественного анализа: фенолоспиртов, обусловливающих активность, в побегах, экстрактах и таблетках княжика сибирского; флавоноидов, проявляющих ноотропные свойства, для травы лабазника вязолистного, альфредии поникшей и их лекарственных форм.
Составлены проекты фармакопейных статей на лекарственное растительное сырье и лекарственные формы на его основе Княжика экстракт жидкий, Княжика экстракт густой и Княжика таблетки, Лабазника экстракт жидкий, Лабазника экстракт сухой и Лабазника таблетки, Альфредии экстракт жидкий.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Монография:
1. Шилова, И. В. Химический состав и ноотропная активность растений Сибири / И. В. Шилова, Н. И. Суслов, И. А. Самылина. - Томск : Изд-во Томского ун-та, 2010. - 236 с.
2. Патенты:
2. Пат. 2276992 Российская Федерация, МКИ А61 К36/71, К9/20.
Фармацевтический состав, обладающий ноотропной активностью / Е. А.
Краснов [и др.] (РФ). - № 2004121294/15; заявл. 12.07.04; опубл. 27.05.06, Бюл.
№ 15. - 7 с.
3. Пат. 2292214 Российская Федерация, МКИ А61 К36/28, Р17/18. Средство, обладающее антиоксидантной активностью / И. В. Шилова [и др.] (РФ). - № 2005123760/15; заявл. 26.07.05; опубл. 27.01.07, Бюл. № 3. - 4 с.
4. Пат. 2310467 Российская Федерация, МКИ А61 К36/73, Р1/16, Р39/06.
Гепатопротекторное средство, обладающее антиоксидантной активностью, и способ его получения / Е. А. Краснов [и др.] (РФ). - № 2005126107/15; заявл.
17.08.05; опубл. 20.11.07, Бюл. № 32. - 10 с.
5. Пат. 2311193 Российская Федерация, МКИ А61 К36/73, Р25/28. Средство, обладающее ноотропной и адаптогенной активностью / Н. И. Суслов [и др.] (РФ). - № 2006114551/15; заявл. 02.05.06; опубл. 27.11.07, Бюл. № 33. - 6 с.
6. Пат. 2314115 Российская Федерация, МКИ А61 К36/73, Р25/28. Ноотропное средство, обладающее антигипоксической активностью / И. В. Шилова [и др.] (РФ). - № 2006114550/15; заявл. 27.04.06; опубл. 10.01.08, Бюл. № 1. - 6 с.
7. Пат. 2325179 Российская Федерация, МКИ А61 К36/73, К39/06. Средство, обладающее антиоксидантным действием / Е. А. Краснов [и др.] (РФ). - № 2006141871/15; заявл. 28.11.06; опубл. 27.05.08, Бюл. № 15. - 5 с.
8. Пат. 2347580 Российская Федерация, МКИ А61 К36/28, Р25/28. Средство, обладающее ноотропным действием / И. В. Шилова [и др.] (РФ). - № 2007137877/15; заявл. 12.10.07; опубл. 27.02.09, Бюл. № 6. - 7 с.
9. Пат. 2354397 Российская Федерация, МКИ А61 К36/28, Р25/10. Средство, обладающее анксиолитическим действием / И. В. Шилова [и др.] (РФ). - № 2007141023/15; заявл. 06.11.07; опубл. 10.05.09, Бюл. № 13. - 7 с.
3. Статьи:
10. Шилова, И. В. Адаптогенные и ноотропные свойства густого экстракта из надземной части Atragene speciosa Weinm. / И. В. Шилова, Н. И. Суслов, Е. А.
Краснов // Раст. ресурсы. - 2001. - Т. 37, вып. 3. - С. 78-88.
11. Шилова, И. В. Химико-фармакологическое изучение активной фракции Atragene speciosa Weinm. / И. В. Шилова, Е. А. Краснов, Н. И. Суслов // Бюл.
СО РАМН. - 2001. - Т. 101, № 3. - С. 44-49.
12. Шилова, И. В. Исследование биологически активных веществ Atragene speciosa Weinm. / И. В. Шилова // Бюл. Сиб. медицины. - 2002. - № 2. - С. 35-39.
13. Элементный состав надземной части Atragene speciosa Weinm. / И. В. Шилова [и др.] // Раст. ресурсы. - 2002. - Т. 38, вып. 4. - С. 69-74.
14. Аминокислотный и минеральный состав надземной части Atragene speciosa Weinm. / И. В. Шилова [и др.] // Хим.-фармац. журн. - 2002. - Т. 36, № 11. - С.
26-28.
15. Состояние и перспективы развития рынка лекарственных средств ноотропного действия / И. В. Шилова [и др.] // Фармация. - 2005. - № 3. - С. 15-17.
16. Фенольные соединения Filipendula ulmaria / Е. А. Краснов [и др.] // Химия природ. соединений. - 2006. - № 2. - С. 122-124.
17. Гепатопротекторные и антиоксидантные свойства экстрактов лабазника вязолистного при экспериментальном токсическом гепатите / И. В. Шилова [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2006. - Т. 142, № 8. - С. 181-184.
18. Антиоксидантные свойства экстрактов листьев бадана толстолистного / И. В.
Шилова [и др.] // Хим.-фармац. журн. - 2006. - Т. 40, № 11. - С. 39-42.
19. Антиоксидантная активность экстрактов надземной части лабазника вязолистного / И. В. Шилова [и др.] // Хим.-фармац. журн. - 2006. - Т. 40, №.12.
Ц С. 22-24.
20. Анатомическое строение надземной части альфредии поникшей / Н. В. Кувачева [и др.] // Фармация - 2006. - № 6. - С. 10-12.
21. Изучение травы княжика сибирского / И. В. Шилова [и др.] // Фармация. - 2007.
Ц № 2. - С. 14-16.
22. Шилова, И. В. Рациональные подходы к поиску и созданию ноотропных средств растительного происхождения / И. В. Шилова // Вестн. РУДН. Сер.
Медицина. - 2007. - № 6. - С. 236-240.
23. Антиоксидантные свойства биологически активных веществ Alfredia cernua и Alfredia nivea (Asteraceae) / И. В. Шилова [и др.] // Раст. ресурсы. - 2008. - Т.
44, вып. 1. - С. 114-121.
24. Шилова, И. В. Растения рода княжик - перспективные источники лекарственных средств / И. В. Шилова // Фармация. - 2008. - № 1. - С. 53-55.
25. Анатомическая характеристика травы лабазника вязолистного / Е. Ю. Авдеева [и др.] // Фармация. - 2008. - № 2. - С. 21-23.
26. Состояние и перспективы развития фармацевтического рынка лекарств ноотропного действия / И. В. Шилова [и др.] // Сиб. вестн. психиатрии и наркологии. - 2008. - № 2. - С. 128-130.
27. Аминокислотный и элементный состав активной фракции княжика сибирского / И. В. Шилова [и др.] // Вопр. биол., мед. и фармац. хим. - 2008. - № 3. - С. 3437.
28. Авдеева, Е. Ю. Компонентный состав фракции Filipendula ulmaria (L.) Maxim. с высокой антиоксидантной активностью / Е. Ю. Авдеева, Е. А. Краснов, И. В.
Шилова // Химия раст. сырья. - 2008. - № 3. - С. 115-118.
29. Ноотропная активность экстрактов надземной части лабазника вязолистного / И. В. Шилова [и др.] // Вопр. биол., мед. и фармац. хим. - 2008. - № 4. - С. 2426.
30. Гепатозащитные свойства фракций экстракта лабазника вязолистного при экспериментальном токсическом гепатите / И. В. Шилова [и др.] // Бюл.
эксперим. биологии и медицины. - 2008. - Т. 144, № 7. - С. 54-57.
31. Влияние экстракта Filipendula ulmaria на иммунную систему мышей CBA/CaLac и C57BL/6 / А. А. Чурин [и др.] // Эксперим. и клинич.
фармакология. - 2008. - Т. 71, № 5. - С. 32-36.
32. Влияние экстракта лабазника вязолистного и его фракций на память и работоспособность в эксперименте / Н. И. Суслов [и др.] // Вопр. биол., мед. и фармац. хим. - 2008. - № 6. - С. 81-84.
33. Авдеева, Е. Ю. Динамика содержания флавоноидов и фенолокислот в надземной части Filipendula ulmaria L. / Е. Ю. Авдеева, Е. А. Краснов, И. В. Шилова // Раст. ресурсы. - 2009. - Т. 45, вып. 1. - С. 107-112.
34. Амельченко, В. П. Особенности развития и компонентный состав Alfredia cernua (Asteraceae) в условиях интродукции (г. Томск) / В. П. Амельченко, И. В. Шилова, Н. В. Кувачева // Раст. ресурсы. - 2009. - Т. 45, вып. 2. - С. 2331.
35. Химический состав и биологическая активность фракции экстракта лабазника вязолистного / И. В. Шилова [и др.] // Хим.-фармац. журн. - 2009. - Т. 43, № 4.
Ц С. 7-11.
36. Влияние экстрактов альфредии поникшей на поведение, память и работоспособность в эксперименте / Р. Н. Мустафин [и др.] // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2010. - Т. 73, № 1. - С. 16-18.
37. Гепатопротекторные свойства экстракта лабазника вязолистного / И. В. Шилова [и др.] // Вопр. биол., мед. и фармац. хим. - 2010. - № 2. - С. 2832.
38. Ноотропная активность экстрактов из дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей / Р. Н. Мустафин [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2010. - Т. 150, № 9. - С. 302-304.
4. Публикации:
39. Некоторые аспекты механизма действия адаптогенных препаратов / Н. И. Суслов [и др.] // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов : матер. конф., посвящ. 15-лет. НИИ фармакологии.
Ц Томск, 1999. - Т.10. - С.94-103.
40. Шилова, И. В. Исследования по созданию эффективного ноотропного фитопрепарата / И. В. Шилова, Е. А. Краснов, Н. И. Суслов // Здоровье и образование в ХХI веке : матер. Третьей Междунар. науч.-практич. конф. - Москва, 2002. - С. 437.
41. Анализ сырья и лекарственных форм Atragene speciosa Weinm. / И. В. Шилова [и др.] // Здоровье и образование в ХХI веке : матер. Четвертой Междунар.
науч.-практич. конф. - Москва, 2003. - С. 687.
42. Химическое исследование надземной части лабазника вязолистного / И. В. Шилова [и др.] // Лекарственные растения в фармакологии и фармации :
тез. докл. науч. конф., посвящ. 50-лет. Алтайск. гос. мед. ун-та. - Барнаул, 2004.
Ц С. 306-307.
43. Химический состав и антиоксидантные свойства растений рода лабазник и альфредия / И. В. Шилова [и др.] // Химия и технология растительных веществ :
тез. докл. IV Всерос. науч. конф. - Сыктывкар, 2006. - С. 217.
44. Изучение диуретической и салуретической активности экстрактов альфредии поникшей / О. Л. Кулагин [и др.] // Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения : матер. Всерос. науч.практич. конф., посвящ. 100-лет. со дня рожд. проф. Л.Н. Березнеговской. - Томск, 2006. - С. 202Ц204.
45. Шилова, И. В. Разработка рационального способа получения экстракта лабазника вязолистного / И. В. Шилова // Здоровье и образование в ХХI веке;
Концепции болезней цивилизации : матер. VIII Междунар. конгр. - Москва, 2007. - С. 707-708.
46. Шилова, И. В. Изучение влияния экстракта черники обыкновенной на условнорефлекторную и эксплоративную деятельность / И. В. Шилова, Н. И. Суслов // Здоровье и образование в ХХI веке; Концепции болезней цивилизации : матер.
VIII Междунар. конгр. - Москва, 2007. - С. 708-709.
47. К вопросу стандартизации травы альфредии поникшей как перспективного источника фитопрепарата / Н. В. Кувачева [и др.] // Химия и медицина : тез.
докл. VI Всерос. науч. семинар с молодежной науч. шк. - Уфа, 2007. - С. 178.
48. Шилова, И. В. Химическое исследование активной фракции черники обыкновенной / И. В. Шилова // Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании2007 : матер. междунар. науч.практич. конф. - Одесса, 2007. - Т. 18. - С. 44-45.
49. Шилова, И. В. Поиск растений, обладающих ноотропной активностью / И. В. Шилова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб. науч. тр. - Вып. 63. - Пятигорск, 2008. - С.
518-519.
50. Шилова, И. В. Ноотропные свойства экстрактов лабазника вязолистного / И. В. Шилова // I Российский фитотерапевтический съезд : сб. науч. тр. - Москва, 2008. - С. 224.
51. Исследование антиоксидантных и ноотропных свойств растений рода альфредия / И. В. Шилова [и др.] // Человек и лекарство : сб. матер. XV Росс.
Национал. Конгр. (тез. докл.). - Москва, 2008. - С. 732.
52. Шилова, И. В. Химико-фармакологическое исследование листьев бадана толстолистного / И. В. Шилова // Науки о человеке : матер. IX конгр. молодых ученых и специал. - Томск, 2008. - С. 117-118.
53. Шилова, И. В. Антиоксидантные свойства и биологически активные вещества экстракта лабазника обыкновенного / И. В. Шилова, Е. И. Короткова, А. Н. Вторушина // Химия и технология растительных веществ : тез. докл. V Всерос. конф. - Уфа, 2008. - С. 329.
54. Шилова, И. В. Химическое исследование экстракта альфредии поникшей, обладающего ноотропными свойствами / И. В. Шилова, Н. В. Кувачева // Медицина в Кузбассе. Спецвыпуск: Проблемы медицины и биологии. - 2009. - № 3. - С. 188.
55. Шилова, И. В. Исследования по разработке ноотропных средств на основе растений Сибири / И. В. Шилова, Н. И. Суслов // Здоровье и образование в ХХI веке. Инновационные технологии в биологии и медицине : науч. тр. Х Междунар. конгр. - Москва, 2009. - С 475-477.
56. Шилова, И. В. Химический состав и ноотропные свойства экстрактов черники обыкновенной / И. В. Шилова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб. науч. тр. - Вып. 65. - Пятигорск, 2010. - С.
523-524.
57. Шилова, И. В. Биологически активные вещества фракции лабазника вязолистного / И. В. Шилова, Н. И. Суслов // Современные проблемы фитотерапии : сб. тр. II Междунар. съезда фитотер. - Москва, 2010. - С. 88-89.
Автор выражает искреннюю признательность и благодарность д-ру фарм. наук, профессору Первого Московского государственного медицинского университета им.
И.М. Сеченова, чл.-корр. РАМН И.А. Самылиной, д-ру мед. наук, профессору НИИ фармакологии СО РАМН Н.И. Суслову, д-ру хим. наук, профессору Иркутского технического университета А.А. Семенову, д-ру геол.-мин. наук, профессору Национального исследовательского Томского политехнического университета Л.П. Рихванову за помощь в организации аналитических исследований и обсуждении полученных результатов.