Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии
На правах рукописи
Федоров Сергей Николаевич
Химическая структура и биологическая активность некоторых морских природных соединений и их синтетических аналогов
02.00.10 - Биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Владивосток - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН (Владивосток, Россия) и в Институте Хормела при университете Миннесоты (Миннеаполис, США).
Научный консультант:
Академик РАН, доктор химических наук Стоник Валентин Аронович
Официальные оппоненты:
Булгаков Виктор Павлович Член-корр. РАН, доктор биологических наук, Учреждение Российской академии наук Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН, заведующий отделом биотехнологии Попов Сергей Владимирович Доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, заведующий отделом молекулярной иммунологии и биотехнологии Звягинцева Татьяна Николаевна Доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН, заведующая лабораторией химии ферментов
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Защита состоится л 29 ноября 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).
Автореферат разослан л октября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Черников О.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Актуальность поиска и последующего изучения химической структуры и биологической активности морских природных соединений подтверждается опытом мировой науки. Установление их структур играет важную роль в развитии биоорганической химии, биохимии, биологии и медицины, без этого невозможно исследование биологических функций, путей биосинтеза и метаболизма таких веществ в соответствующих организмах, а также создание новых медицинских препаратов на основе морских природных соединений.
Известно, что морские природные соединения иногда обладают экстремально высокой биологической активностью. Среди них - самые мощные из небелковых токсинов (палитоксин, маитотоксин), противоопухолевые соединения с высочайшей токсичностью в отношении опухолевых клеток (спонгистатин, эктейнасцидины, бриостатины), вещества с очень высоким обезболивающим (конотоксины) и противовоспалительным эффектами (монаолид, контигнистерол).
Поиск новых природных противоопухолевых и канцерпревентивных веществ имеет большое практическое значение, поскольку лечение и профилактика онкологических заболеваний в последнее время становятся одной из самых актуальных проблем здравоохранения во всех странах, включая Россию. За рубежом исследования профилактической и терапевтической противоопухолевой активности соединений природного происхождения особенно активно проводятся в США, а также во многих ведущих европейских странах. Недавно были разрешены к применению первые высокоэффективные противоопухолевые лекарства, созданные на основе морских природных соединений джонделис и лэребулин мезилат. В России систематические работы в области химии, биохимии, биотехнологии природных соединений из морских организмов, включая противоопухолевые вещества, выполняются в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ).
При создании новых лекарственных и профилактических противоопухолевых средств важную роль играют не только поиск, получение, исследование строения и свойств их активных субстанций, но и выяснение молекулярного механизма действия.
Без знания механизма действия препарата невозможно введение его в клиническую практику, поэтому изучение механизма действия, предполагающее использование самых современных методов молекулярной и клеточной биологии, является важной и актуальной частью работ по созданию противоопухолевых средств.
Недавно среди природных соединений из различных биологических объектов наземного происхождения найдена серия веществ, ингибирующих канцерогенез.
Канцерпревентивные метаболиты красного вина, зеленого чая, красного перца привлекли большое внимание. Соответствующие работы приобрели самую широкую известность и были опубликованы в ведущих научных журналах мира Science и Nature.
Морские организмы, безусловно, также содержат соединения, препятствующие возникновению и развитию опухолей, но в то же время все еще остаются малоизученными в отношении содержания в них биологически активных веществ этого типа действия. Вероятность нахождения новых морских низко- и высокомолекулярных соединений, обладающих канцерпревентивными свойствами, высока, а их поиск, выделение, изучение строения и механизма действия с целью последующего применения таких веществ в медицинской практике являются актуальными.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлся поиск, выделение (получение), установление химического строения новых морских природных соединений и их синтетических аналогов, а также исследование их канцерпревентивной и противоопухолевой активности вплоть до некоторых аспектов молекулярного механизма их действия.
При поиске новых морских биологически активных природных соединений были решены задачи отбора наиболее интересных с биохимической точки зрения образцов морских беспозвоночных путем применения широкого скрининга с использованием хроматографических методов и методов тестирования биологической активности.
Для выделения конкретных природных соединений ставились задачи оптимального использования современных хроматографических методов, включая тонкослойную, колоночную и высокоэффективную жидкостную хроматографию.
При установлении химической структуры и определении чистоты выделенных соединений решали задачи комплексного применения различных физико-химических и химических методов, включая ЯМР, ИК, УФ, КД, масс-спектрометрию, а также рентгеноструктурный анализ.
В рамках данной работы ставились также задачи определения особенностей биологической, в частности канцерпревентивной и противоопухолевой активности отобранных веществ, а также изучения молекулярных механизмов их действия. В частности, решали задачи изучения цитотоксической активности веществ, их влияния на индукцию апоптоза и клеточный цикл, на транскрипционную активность p53, AP-и NF-B ядерных факторов, на внутриклеточные уровни различных белков, включая фосфорилированные и нефосфорилированные формы киназ, циклинов и циклинзависимых киназ и других белков, регулирующих клеточный цикл и апоптоз.
Еще одной задачей работы было изучение связи между строением исследуемых соединений и их биологической активностью и установление соответствующих закономерностей, которые дадут возможность прогнозировать свойства новых природных веществ и препаратов, создаваемых на их основе. Эта задача была решена с помощью широкого набора экспериментальных методов с последующим применением статистических методов анализа.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Из спиртового экстракта морского моллюска Aplysia dactylomela были получены 3 новых терпеноида. При изучении химических свойств выделенных терпеноидов получены 8 их новых производных. Химическое строение этих веществ установлено рентгеноструктурным анализом и спектроскопическими методами. Показано, что один из этих терпеноидов, дактилон, обладает канцерпревентивными свойствами, которые реализуются путем остановки клеточного цикла трансформированных и опухолевых клеток с последующим апоптозом.
2. Из спиртовых экстрактов 4-х видов офиур и 2-х видов шестилучевых кораллов были выделены 9 новых полигидроксилированных стероидов, а еще 2 стероида были впервые выделены из морских организмов. Их строение установлено физикохимическими методами. Путем химических превращений получены 15 их новых производных. Сульфатированные полиоксистероиды из офиур и морских звезд проявляют цитотоксическое действие против нескольких линий опухолевых клеток человека, ингибируют биосинтез ДНК в клетках карциномы Эрлиха и вызывают быстрый вход ионов Са2+ в клетки из внеклеточной среды через кальциевые каналы.
3. Левиускулозид G, стероидный гликозид из морской звезды Henricia leviuscula обладает цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток и канцерпревентивной активностью. Эти активности связаны с индукцией апоптоза в опухолевых клетках человека и ингибированием трансформации нормальных клеток в опухолевые. Они опосредованы, по крайней мере отчасти, через индукцию транскрипционной активности белка-супрессора опухолей р53 и ингибирование транскрипционной активности, зависимой от онкогенных AP-1 и NF-B ядерных факторов, а также через ингибирование EGF-индуцированного фосфорилирования онкогенных протеинкиназ ERKs.
4. Алкалоид поликарпин из асцидии Polycarpa aurata и его синтетический аналог диметилполикарпин показывают высокую противоопухолевую и цитотоксическую активности, а также канцерпревентивную активность в малотоксичных концентрациях.
Эти активности поликарпинов, по крайней мере отчасти, обусловлены индукцией поликарпинами каспаза-3- и р53-зависимого апоптоза в трансформированных клетках.
Фосфорилирование и активирование под действием поликарпинов белка-супрессора опухолей р53 в свою очередь опосредовано активированными протеинкиназами JNKs, которые участвуют в фосфорилировании белка c-Jun, активировании р53 и последующем апоптозе.
5. Алкалоиды индольного типа шеринины А-Е из морского гриба Penicillium janthinellum не проявляют заметной цитотоксической активности в концентрациях до 200 мкМ. Однако уже в концентрации 13 мкМ шеринин Е ингибирует опухолевую трансформацию нормальных мышиных клеток. Кроме того, шеринины А-Е, также как и морские алкалоиды, 3- и 10-бромофаскаплизины, вызывают апоптоз опухолевых клеток человека.
6. Новый пренилированный 1,4-бензохинон (глабрухинон А) был выделен из асцидии Aplidium glabrum. Определено его химическое строение. Методами органического синтеза получены 9 новых и 3 ранее известных аналога глабрухинона.
Полученные полипренилхиноны индуцируют в клетках независимый от активации супрессора опухолей р53 апоптоз, обладают in vitro и in vivo канцерпревентивной и противоопухолевой активностью, и являются мощными индукторами АР-1 и NF-B ядерных транскрипционных факторов. Установлена зависимость между биологическими активностями и структурой в этом ряду соединений.
7. Биополярный необычный сфинголипид ризохалин из губки Rhizochalina incrustata, его аналоги и производные демонстрируют цитотоксические свойства по отношению к опухолевым клеткам человека и вызывают их р53- и каспаза-8, 9, 3зависимый апоптоз. Показано также, что МАРК JNK и ERK сигнальные пути участвуют в ответе JB6 Cl41 клеток на воздействие ризохалина и его аналогов.
8. Актинопорин RTX-A из актинии Heteractis crispa демонстрирует канцерпревентивную и цитотоксическую активности. Проявление RTX-A данных активностей может быть объяснено, по крайней мере частично, индукцией р53независимого апоптоза и ингибированием активности онкогенных АР-1 и NF-B ядерных факторов.
9. С11 циклопентенон (диосфенол) из асцидии Diplosoma sp. обладает канцерпревентивной активностью в субцитотоксических концентрациях.
Канцерпревентивное и цитотоксическое против опухолевых клеток действие диосфенола обусловлены индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках. По всей вероятности, МАРК JNK и р38 сигнальные пути участвуют в ответе клеток на воздействие диосфенола.
10.Тритерпеновые гликозиды из голотурий семейств Cucumariidae, Stichopodidae, Psolidae, Holothuriidae и Synaptidae показывают цитотоксические активности, а в малотоксичных концентрациях - канцерпревентивное действие. Механизм их действия связан с индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках и ингибированием онкогенных АР-1 и NF-B ядерных факторов транскрипции.
Научная новизна и практическая ценность работы. 44 новых морских вторичных метаболита и их синтетических аналога были выделены из морских организмов или получены в результате химических модификаций. Их строение было установлено физико-химическими и химическими методами. Впервые изучены канцерпревентивная и цитотоксическая активности (в отношении опухолевых клеток) 62-х морских природных соединений и их синтетических аналогов, большинство из которых являются новыми. Для многих из них исследована зависимость биологической активности от их химической структуры.
Новизна данной работы состоит и в том, что в России до недавнего времени еще не проводился направленный поиск канцерпревентивных природных соединений, а в других странах такой поиск проводился в основном среди природных соединений наземного, но не морского происхождения. Только в 2004 г. нами была опубликована первая статья, посвященная канцерпревентиному действию морских метаболитов, алкалоидов поликарпинов, выполненная совместно с американскими учеными. В настоящее время в ТИБОХ ДВО РАН организована экспериментальная база, обеспечивающая проведение таких работ. Для поиска соединений, обладающих канцерпревентивными свойствами, создана коллекция из более чем 80 клеточных линий опухолевых и нормальных клеток человека и мыши. В данной работе применены методы поиска соединений, ингибирующих EGF- и TPA-индуцируемую трансформацию мышиных JB6 Cl41 Р+ клеток в мягком агаре, MTS-метод определения цитотоксической активности, люциферазный метод определения АР-1, р53 и NF-Bзависимой транскрипционной активности, а в экспериментах используются генетически измененные клетки мыши, применяемые, в том числе для изучения влияния веществ на МАРК р38, JNK и ERK сигнальные пути. Ряд этих методик впервые поставлены нами в России. С помощью метода мягкого агара изучены канцерпревентивные свойства 27 морских природных соединений и их синтетических аналогов, найдено несколько соединений перспективных в качестве хемопревентивных средств, тормозящих опухолевое перерождение клеток.
Некоторые изученные вещества индуцировали апоптоз в опухолевых клетках человека, воздействовали на активность внутриклеточных белков, регулирующих клеточный цикл и апоптоз, и активировали ряд ядерных факторов, в том числе белоксупрессор опухолей р53. В процессе выполнения работы показано, что некоторые виды морского пищевого сырья, в частности морские водоросли и голотурии, содержат соединения с канцерпревентивными свойствами.
Результаты данных исследований могут найти применение в медицине, пищевой промышленности и биотехнологии, расширить спектр используемых в России биологически активных добавок к пище и привести к разработке новых медицинских препаратов. По результатам работы получены 2 патента РФ на изобретения, связанные с открытием новых перспективных противоопухолевых и апоптоз-индуцирующих препаратов профилактической и терапевтической направленности.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в виде постерных сообщений и устных докладов на ряде научных конференций и симпозиумов, в том числе: VI International Symposium on marine natural products (Дакар, Сенегал, 1989), 10-th World Congress on Animal, Plant and Microbial Toxins (Сингапур, 1991). 8-th Conference of Young Scientists on Organic and Bioorganic Chemistry (Riga, Латвия, 1991), 8-th International Symposium on Marine Natural Products (Santa Cruz de Tenerife, Canary Islands, 1995), Научная Конференция ТИБОХ ДВО РАН (Владивосток, Россия, 1998), 9th International Symposium on Marine Natural Products (Townsville, Australia, 1998), IX Pacific Science International Congress (Taipei, Taiwan, 1998), Pacific Science Congress (Sydney, Australia, 1999), 95th AACR Annual Meeting (Orlando, Florida, USA, 2004), International Conference УDietary Factors and Cancer Prevention: Current Premises and Future PromisesФ (Rochester, Minnesota, USA, 2004), IV Всероссийская Научная Конференция Химия и технология растительных веществ (Сыктывкар, Россия, 2006), The Commemorative International Symposium for the 60-th Anniversary of Dong-A University УBiotechnological Approaches for Agriculture and MedicineФ (Busan, Korea, 2006), International Conference УJoint Russian-Korean Research of Physiological and Therapeutic Activity of Natural CompoundsФ (Vladivostok, Russia, 2007).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 30 статей в отечественных и международных журналах, 2 главы в монографиях, 2 патента и тезисов докладов региональных, всероссийских и международных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация построена традиционно и состоит из 6 глав. Вслед за Введением следует Литературный обзор, в котором дается представление о современных достижениях в области изучения структуры и противоопухолевой профилактической активности морских природных соединений, а также общие сведения о канцерогенезе, фазах его развития, методах изучения, внутриклеточных мишенях и сигнальных путях его ингибирования. В главе Обсуждение результатов приведены и обсуждены результаты выполненного исследования. Эта глава состоит из 8 разделов, в которых материал сгруппирован в соответствии с химическими структурами исследуемых соединений. В Экспериментальной части даны сведения об использованных приборах и материалах, клеточных культурах, методиках выполненных экспериментов и сообщены характеристики полученных веществ. Завершают диссертацию Выводы и Список цитированной литературы. Работа изложена на 295 страницах, содержит 34 таблицы, 78 рисунков и 9 схем. Список литературы включает 516 цитируемых работ.
Благодарности. Автор благодарен научному консультанту, академику РАН Стонику В.А., всем сотрудникам лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН, а также н.с. Радченко О.С., к.х.н. Баланевой Н.Н., к.х.н. Сметаниной О.Ф., д.х.н. Монастырной М.М., Жидкову М.Е. (ДВФУ), принимавшим участие в данной работе и представившим свои вещества для нашего изучения. Автор благодарен также д.х.н. Калиновскому А.И., к.х.н. Дмитренку П.С., к.х.н. Исакову В.В., к.х.н.
Герасименко А.В. (ИХ ДВО РАН), к.х.н. Попову Д.Ю. (ИХ ДВО РАН) - за получение и помощь в обработке спектральных данных или данных рентгеноструктурного анализа, к.б.н. Аминину Д.Л., к.б.н. Агафоновой И.Г., к.б.н. Шастиной В.В., к.х.н. Сова В.В., к.х.н. Ермаковой С.П., к.б.н. Горшковой И.А., к.б.н. Бердышеву Е.В. (Институт Хормела, США), проф. Боуд А.М. (Институт Хормела, США), проф. Донг З. (Институт Хормела, США) и сотрудникам его лаборатории, проф. Квак Д.Й. (Университет ДонгА, Республика Корея) и сотрудникам его лаборатории - за помощь в работе и проведение отдельных экспериментов по изучению биологической активности, а также к.б.н. Смирнову А.В. (ЗИН РАН, г. Санкт-Петербург), н.с. Красохину В.Б. и Гребневу Б.Б. - за определение видовой принадлежности изученных морских организмов.
Используемые сокращения. КД - круговой дихроизм; MTS - 5-(3карбоксиметоксифенил)Ц2Ц(4,5-диметилтиазолил)-3-(4-сульфофенил) тетразолий, внутренняя соль; EGF - эпидермальный фактор роста; IC50 - (Inhibition concentration 50), концентрация исследуемого вещества, при которой происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток на 50%; INCC50 - (Inhibition of the number of the colonies C50) концентрация вещества, при которой происходит ингибирование колонеобразования клеток в мягком агаре на 50%; JB6 Cl41 DNM-p38 или JB6 ClDNM-JNK1 или JB6 Cl41 DNM ERK2 - (dominant negative mutant), JB6 Сl41 клетки, доминант-негативно-мутантные по p38 или JNK1 или ERK2; FBS - сыворотка бычьих эмбрионов; МАРК - (Mitogen Activated Protein Kinases), митоген-активируемые протеин киназы; p38 - киназы, относящиеся к МАРК; JNKs - киназы, относящиеся к МАРК; ERKs - киназы, регулируемые экстраклеточными сигналами, относятся к МАР киназам; JB6 Cl41 р53 или JB6 Cl41 АР-1 или JB6 Cl41 NF-B - линии клеток со стабильно экспрессированным геном люциферазы, контролируемым промоторной рили АР-1 или NF-B нуклеотидной последовательностью; Rb - ретинобластома, белоксупрессор опухолей; р53 - белок-супрессор опухолей, ядерный транскрипционный фактор; AP-1 - активаторный белок-1, ядерный транскрипционный фактор; NF-B - (Nuclear Factor - B), ядерный транскрипционный фактор; Cdk4 - циклин-зависимая киназа; противоопухолевая активность - в данной работе - активность вещества по отношению к опухолевым клеткам, так или иначе приводящая к их гибели или замедлению пролиферации.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Химические структуры, свойства и биологическая активность терпеноидов из некоторых моллюсков и водорослей Предполагается, что потребление разнообразной морской пищи приводит к значительному количественному уменьшению случаев заболеваний раком в Японии и других странах, население которых традиционно потребляет в пищу большое количество морепродуктов. Известно, что многие виды морской пищи содержат низкомолекулярные природные продукты, не характерные для наземных организмов.
Однако возможная роль большинства таких вторичных метаболитов, за исключением жирных кислот, в профилактике раковых заболеваний остается неизвестной.
Галогенированные хамиграновые сесквитерпеноиды представляют собой группу морских природных соединений, которые были найдены только в красных водорослях и моллюсках, питающихся этими растениями. Метаболиты этой серии были выделены из различных видов морских водорослей, принадлежащих к роду Laurencia, включая те виды, которые используются в пищу населением Японии, Гавайских островов и других стран мира. Противоопухолевые свойства этих соединений были изучены явно недостаточно.
Дактилон - галогенированный хамиграновый сесквитерпеноид из моллюска Aplysia dactylomela. Структура и абсолютная конфигурация. Из хлороформенного экстракта морского моллюска A. dactylomela был получен новый хамиграновый бромсодержащий сесквитерпеноид дактилон (1). Брутто-формула (1) С15Н21ОВr установлена путем изучения его масс-спектра (электронная 9 ионизация) (М+ 298, 296 m/z), а также O А O 10 5 Н и 13С ЯМР спектров. УФ-спектр 11 Br В Br 1 (max 236 нм, 8470) и ИК-спектр (С=О 1667, С=С 1624 см-1) указывают 14 на наличие в его структуре фрагмента ,-непредельного кетона. Н ЯМР спектр дактилона близок к спектру ранее известного соединения 2, но отличается сдвигом сигнала одной из метильных групп от 0.95 до 1.72 м.д. и появлением мультиплета олефинового протона при 6.5 м.д. В связи с этим для 1 предложена структура 10-бромо-3,11,11-триметил-7-метилиден-спиро[5,5]ундец-2-ен-4-она.
Окончательно структура дактилона (1) и его абсолютная стереохимия установлена как (6S,10R)-10-бромо-3,11,11-триметил-7-метилиденспиро[5,5]ундец-2-ен-4-она с помощью рентгеноструктурного анализа. Конформации циклов: А - кресло, В - 6софа. Как следует из полученных данных, выделенный нами терпеноид (1) относится к производным (+)--хамигрена. Родственные 1 соединения с такой абсолютной стереохимией спироатома до этого были найдены только в двух видах красных водорослей рода Laurencia: L. elata и L. оbtusa.
Некоторые химические свойства дактилона. Семь новых терпеноидных производных получены нами из дактилона (1) путем химических превращений. Их структуры установлены сравнением ЯМР спектров со спектрами исходного дактилона (1), а также с помощью КД и масс-спектров.
Так, в результате восстановительного дебромирования дактилона (1) действием Zn в AcOH (схема 1) были получены новые хамиграновые сесквитерпеноиды 3 и 4.
Определена их абсолютная стереохимия как (3S,6S)-3,11,11-триметил-7-метилиден спиро[5,5]ундекан-4-она (3) и (6S)-3,11,11-триметил-7-метилиден-спиро[5,5]ундец-2ен-4-она (4).
7 O O Zn A O 6 + B Br AcOH 14 Схема 1. Восстановительное дебромирование дактилона (1) до производных 3 и 4.
Гидрирование дактилона (1) над катализатором Адамса (схема 2) приводит к еще двум новым хамиграновым сесквитерпеноидам 5 и 6.
O O H2/Pt O + Br Br 5 Схема 2. Реакция гидрирования дактилона (1) над катализатором Адамса.
Для терпеноидов 5 и 6 установлена абсолютная стереохимия как (3S,6S,7S,10R)-10бромо-3,7,11,11-тетраметилспиро[5,5]-ундекан-4-она (5) и (3S,6S,7R)-3,7,11,11тетраметилспиро[5,5]ундекан-4-она (6) соответственно.
Обработка дактилона трифторуксусной кислотой в растворе в метаноле в течение дней при комнатной температуре приводит к миграции экзометиленовой двойной связи в эндоциклическое положение (схема 3). Единственный продукт реакции - (6S,10R)-10бромо-3,7,11,11-тетраметилспиро[5,5]ундека-2,7-диен-4-он (7) - получен с выходом 82%.
Предполагается, что морские хамиграновые сесквитерпеноиды биосинтезируются в результате циклизации бизаболановых предшественников. Нами установлено, что обратное превращение галогенированных хамигранов в сесквитерпеноиды бизаболанового типа неожиданно легко и с почти количественным выходом происходит в результате реакции хамигранов со щелочью.
3' 1' 2' 4' O O O OH KOH 5' 6' Br Br MeOH 8' 7' H+ MeOH O O OH O KOH Br Br MeOH Схема 3. Перегруппировка дактилона (1) и его -изомера (7) с образованием производных бизаболанового типа (8 и 9).
Так, дактилон (1) и его -изомер (7) после обработки КОН в метаноле в течение часов при комнатной температуре претерпевают перегруппировку с размыканием бромсодержащего цикла и образованием производных бизаболанового типа 8 и соответственно (схема 3). Возможно, аналогичные трансформации хамиграновых предшественников имеют место также и в живых организмах. Сесквитерпеноиды с углеродным скелетом, аналогичным таковому для соединений 8 и 9, были выделены ранее из ряда горгонарий и губок.
Биологическая активность дактилона. Цитотоксическое и канцерпревентивное действие. MTS-методом было показано, что дактилон мало токсичен в отношении мышиных JB6 Cl41 P+ клеток и клеток рака легкого человека, HT-460, его IC50 - около 150 и 200 мкМ соответственно. Для определения эффекта дактилона на опухолевую трансформацию нормальных клеток или колонеобразование опухолевых клеток был использован стандартный метод мягкого агара. В качестве промотора злокачественной трансформации мышиных JB6 Cl41 P+ клеток, которые при такой трансформации образуют многочисленные колонии при росте в мягком агаре, был использован эпидермальный фактор роста (EGF) в концентрации 10 нг/мл.
Результаты экспериментов показали, что дактилон проявляет канцерпревентивные свойства в практически нетоксичных дозах. Так, 50% ингибирование числа колоний трансформированных JB6 Cl41 Р+ клеток (INCC50) дактилоном наблюдается уже в концентрации 45.4 мкМ. Похожие эффекты зафиксированы в экспериментах по ингибированию дактилоном колонеобразования опухолевых клеток человека НТ-460, НСТ-116 и SK-MEL-5, при этом INCC50 равны 92.4; 70.5 и 99.2 мкМ соответственно.
Действие дактилона на клеточный цикл. С помощью проточной цитометрии показано, что дактилон индуцирует остановку клеточного цикла в JB6 Cl41 Р+ и SKMEL-28 клетках на стадии перехода от G1 к S фазе. Так, уже при концентрации 40 мкМ дактилон в значительной степени препятствует переходу JB6 Cl41 Р+ клеток из G1 в S фазу клеточного цикла, а при концентрации 60 мкМ он полностью блокирует прогрессию клеточного цикла на этом этапе. Однако при действии на доминантнегативно-мутантные JB6 Сl41 DNM-ERK2 клетки дактилон в концентрациях 10-мкМ не ингибирует, а наоборот, интенсифицирует переход клеток из G1 в S фазу. На основании этих данных мы предположили, что эффект дактилона на прогрессию клеточного цикла, по крайней мере частично, может быть опосредован через МАРК ERKs.
Индукция дактилоном апоптоза. Данные, полученные путем клеточной цитометрии, показали, что дактилон может индуцировать запрограммированную смерть клеток путем апоптоза. Индукция клеточного апоптоза дактилоном показана с использованием красителей Аннексин V-FITC и пропидиум йодид. Было найдено, что дактилон в малотоксичных дозах индуцирует дозозависимый апоптоз в мышиных JBCl41 P+ клетках (рис. 1А), а также в опухолевых клетках человека SK-MEL-28 (рис. 1Б), HL-60 и THP-1. Таким образом, противоопухолевое действие дактилона можно объяснить его способностью вызывать остановку клеточного цикла с последующим апоптозом.
A Б 1* * * * * * * * 0 10 40 80 100 0 60 80 100 2Концентрация дактилона, мкМ Концентрация дактилона, мкМ Рисунок 1. Индукция дактилоном (1) апоптоза в JB6 Cl41 Р+ (A) и SK-MEL-28 (Б) клетках.
Здесь и в последующих рисунках * р< 0.05 (достоверное отличие от контроля).
Эффект дактилона на фосфорилирование и внутриклеточные уровни некоторых сигнальных белков и роль ERKs в воздействии дактилона на клетки млекопитающих. Некоторые ранее опубликованные данные показывают, что ERKsфосфорилирование и активирование может индуцировать остановку клеточного цикла.
В нашей работе установлено, что дактилон в концентрациях 50-100 мкМ индуцирует в JB6 Cl41 P+ клетках время- и дозозависимое фосфорилирование основных МАР киназ, включая ERKs (рис. 2А), р38 (рис. 2Б), и JNKs (рис. 2В). Основываясь на результатах изучения действия дактилона на клеточный цикл, мы также исследовали эффект различных его доз на экспрессию в клетках циклина D3, Cdk4 и фосфорилированных форм белка-супрессора опухолей ретинобластомы (Rb), которые регулируют прогрессию от G1 к S фазе клеточного цикла. Показано, что обработка дактилоном в концентрации 40-100 мкМ подавляет экспрессию циклина D3 и Cdk4, а также фосфорилирование Rb в JB6 Cl41 P+ клетках. Похожее ингибиторное действие дактилона наблюдалось также на SK-MEL-28 и HT-460 линиях опухолевых клеток.
Данные об активной роли ERK-сигнального пути в опосредовании индуцированного дактилоном ингибирования Rb фосфорилирования с последующей остановкой клеточного цикла на G1/S переходе были получены при сравнении эффектов дактилона на Rb белок в JB6 Cl41 P+, JB6 Cl41 DNM-ERK2, JB6 Cl41 DNMp38 и JB6 Cl41 DNM-JNK1 клетках.
Было найдено, что до концентрации 100 мкМ дактилон никак не воздействует на Rb фосфорилирование в JB6 Cl41 DNM-ERK2 клетках. Напротив, Rb фосфорилирование было подавлено после воздействия дактилона в JB6 Cl41 DNM-p38 и JB6 Cl41 DNMJNK1 клетках. Ингибиторный эффект дактилона на Rb фосфорилирование также значительно понижен в RSK2- (синдром Коффин-Лоури) клетках по сравнению с нормальными WT-RSK2 клетками.
Рисунок 2. Эффект дактилона (1) на фосфорилирование ERKs (А), р38 (Б), и JNKs (В) в JB6 Cl41 клетках.
RSK2 является основным субстратом ERKs в MAPK/ERK сигнальном пути. Кроме того, в пользу предположения об активной роли ERK-сигнального пути в механизме действия дактилона на клетки млекопитающих свидетельствует тот факт, что в концентрациях от 40 до 150 мкМ дактилон лишь незначительно влияет на жизнеспособность JB6 Cl41 DNM-ERK2 или RSK2- клеток, в отличие от JB6 ClDNM-JNK1, JB6 Cl41 DNM-p38 и WT-RSK2 клеток, жизнеспособность которых понижается на 30-60%.
Влияние дактилона на р53-, АР-1- и NF- B-зависимую транскрипционную активность. Эффект дактилона на р53-, АР-1- и NF-B-зависимую транскрипционную активность оценивался с помощью JB6 Cl41 клеток со стабильно экспрессированным репортерным геном люциферазы, контролируемым р53, АР-1 или NF-B промоторными ДНК последовательностями. Белок-супрессор опухолей р53 играет критическую роль в апоптозе, а увеличение уровня р53 в клетке с последующим апоптозом характеризует эффект на клетку многих канцерпревентивных агентов, например резвератрола, экстракта черного чая и других. Однако в наших экспериментах дактилон в нетоксичных концентрациях 50-100 мкМ, напротив, в два раза ингибирует базовую р53-зависимую транскрипционную активность и в 1.2-1.6 раз активирует базовую АР-1- и NF-B-зависимую транскрипционную активность в JBCl41 клетках.
Все полученные нами результаты показывают, что хамиграновые сесквитерпеноиды морского происхождения (представленные здесь дактилоном), являясь компонентами некоторых экзотических морских блюд, образуют перспективную группу канцерпревентивных и противоопухолевых природных соединений. Их противоопухолевое действие, вероятно, дополняется некоторыми другими эффектами галогенированных сесквитерпеноидов, сообщенными в литературе, например, их антибактериальной активностью по отношению к штаммам, устойчивым к действию антибиотиков, антивирусной активностью против вируса герпеса, а также антигельминтной активностью. Наличием всех этих эффектов могут быть объяснены полезные свойства, приписываемые общественным мнением такой морской пище.
Cесквитерпеноид с перегруппированным углеродным скелетом из моллюска A.
dactylomela. В литературе имеется много сообщений о выделении галогенированных сесквитерпеноидов хамигранового типа с углеродным скелетом типа А (рис. 3) из красных водорослей и моллюсков, питающихся этими водорослями. Более редкими являются соединения, имеющие углеродный скелет типа В (рис. 3).
13б H 13а H O H3C CHH H 14а 14б A B Рисунок 3. Обычный (А) и прегруппированный (В) углеродные скелеты хамиграновых терпеноидов. Структура терпеноида 10.
Мы выделили новый необычный негалогенированный сесквитерпеноид (10) c углеродным скелетом В из этанольного экстракта морского зайца A. dactylomela.
Структура кетонсодержащего цикла в 10 идентична структуре аналогичного фрагмента в дактилоне (1), что подтверждается спектральными данными. Другой цикл в 10, как было доказано методами ЯМР спектроскопии, включая NOE эксперименты, имеет конформацию кресла с двумя экзо-метиленовыми группами в -положениях и одной экваториальной метильной группой в -положении к спиро-атому. Эти данные в сумме указывают на конформацию этого цикла в виде7,10-кресла. Ранее рентгеноструктурный анализ показал, что дактилон (1) имеет абсолютную конфигурацию 6S,10R. Для того чтобы определить абсолютную конфигурацию в 10, мы получили насыщенный кетон 11 каталитическим гидрированием 10 и использовали еще один насыщенный кетон 3, который был получен ранее путем обработки дактилона (1) цинком в смеси уксусной кислоты и метанола (схема 4). Путем сравнения КД спектров производных 11 и 3, был сделан вывод о 6S конфигурации в соединении 10.
O HO O O Zn B r Pt AcOH 11 Схема 4. Получение производных 11 из соединения 10 и 3 из дактилона 1.
Таким образом, структура терпеноида 10 была определена как (6S,10S)-3,10диметил-7,11-диметилиден-спиро[5,5]ундец-2-ен-4-он.
Присутствие терпеноидов 10 и 1, имеющих одинаковую конфигурацию спиро-атома в экстрактах A. dactylomela, предполагает, что 10 может быть продуктом метаболизма дактилона (1) в организме моллюска (схема 5).
-H+ O -Br- + O O O Br + 1 Схема 5. Гипотетическая схема биотрансформации дактилона 1 в терпеноид 10.
Аплидактон, терпеноид с беспрецедентным углеродным скелетом из моллюска A. dactylomela. Из спиртового экстракта A. dactylomela был выделен уникальный сесквитерпеноидный кетон 14, названный аплидактоном. Для установления его строения и абсолютной конфигурации использовали рентгеноструктурный анализ. В аплидактоне (14) были обнаружены значительные отклонения в длинах углерод-углеродных связей и значениях двугранных углов по сравнению с обычными, в том числе характерными для циклобутанов. КД спектр аплидактона показал положительный эффект Коттона с []287 = +42.8105. Применение правила октантов подтвердило абсолютную конфигурацию аплидактона, определенную рентгеноструктурным анализом.
До выделения аплидактона трудно было предположить, что такие соединения, содержащие два циклобутановых цикла, вписанных в шестичленный цикл, могут быть достаточно устойчивы, и существовать в природе. Возможно, что биосинтетическим предшественником 14 может служить дактилон (1). В этом случае образование четырехчленного цикла в 14 является результатом энзиматической трансформации, включающей [2+2]-циклоприсоединение в 1 (схема 6). Известно, что оно может происходить под действием УФ-облучения соответствующих диненасыщенных соединений. Однако наши попытки получить аплидактон (14) из дактилона (1) путем долговременного УФ-облучения не увенчались успехом. Это свидетельствует в пользу in vivo образования аплидактона.
S R R R S R B r S O Br O Схема 6. Гипотетическая схема трансформации дактилона 1 в аплидактон 14.
Мы предположили, что аплидактон, имеющий нуклеофильный центр, может быть перегруппирован в более стабильное соединение под действием донора протонов.
Действительно, реакция с p-TsOH дала с почти количественным выходом изомерное соединение 15 (схема 7). Структура и абсолютная конфигурация 15 были установлены тщательным ЯМР анализом, включая H-1H COSY, HMQC, HMBC и 1D-NOE эксперименты, а также КД спектроскопией. КД спектр показал положительный эффект Коттона с []287 = +36105, что подтвердило стереохимические особенности 15.
O H+ O Br Br Схема 7. Перегруппировка аплидактона 14 в производное 15 под действием кислоты.
Биологическая активность аплидактона и хамигранового сесквитерпеноида (3R,4S,6S,10R) 10 - бромо - 3, 11, 11 - триметил - 7 -метилиден-спиро[5,5]ундекан3,4-диола из моллюска A. dactylomela. Было показано, что терпеноид 14 обладает весьма слабой цитотоксической активностью по отношению к JB6 Cl41 P+ клеткам, IC= 148 мкМ, более того, в концентрациях 25-75 мкМ, аплидактон (14) способствует ускорению клеточной пролиферации почти в полтора раза, по сравнению с контрольными клетками, в течение 24 ч.
Кроме того, было показано, что, аплидактон (14) обладает свойствами увеличивать UVB-индуцированную транскрипционную активность АР-1 и NF-B ядерных факторов. Так, в нецитотоксической концентрации 75 мкМ, аплидактон в два раза увеличивает транскрипционную активность АР-1 и в три раза активность NF-B ядерных факторов, не оказывая при этом большого влияния на активность рядерного фактора. Вполне возможно, что именно с увеличением активности АР-1 и NFB ядерных факторов связано ускорение пролиферации клеток под действием нецитотоксических концентраций аплидактона. Таким образом, соединение обладает, вероятно, канцерпромоторными свойствами.
Хамиграновый сесквитерпеноид (3R,4S,6S,10R) 10-бромо-3,11,11-триметил-7метилиденспиро[5,5]ундекан-3,4-диол (16) был выделен нами из экстрактов A.
dactylomela. Была исследована цитотоксическая активность сесквитерпеноида 16 в сравнении с цитотоксической активностью дактилона (1) в отношении клеток лейкемии человека HL-60 и THP-1. Сесквитерепеноид 16 проявляет цитотоксическую активность по отношению к HL-60 и THP-1 лейкемическим клеткам с IC50 = 102 мкМ и 152 мкМ соответственно. Таким образом, замена сопряженной с двойной связью карбонильной группы в кольце В в дактилоне (1) на диольную группировку в терпеноиде 16 приводит к некоторому увеличению цитотоксической активности последнего по сравнению с дактилоном.
Цитотоксическая активность против опухолевых клеток терпеноидов из дальневосточной бурой водоросли Dictyota dichotoma. Из экстракта дальневосточной бурой водоросли D. dichotoma были выделены дитерпеноид пахидиктиол А (17) и сесквитерпеноид аксенол (18).
H Br H OH HO OH OH Как пахидиктиол А (17), так и аксенол (18) демонстрируют in vitro слабую цитотоксическую активность против опухолевых клеток человека HeLa, THP-1 и SNUC4. В то же время оба вещества значительно менее цитотоксичны по отношению к здоровым мышиным эпидермальным клеткам линии JB6 Cl41. Более того, дитерпеноид пахидиктиол А (17) показывает примерно в два раза более высокую цитотоксическую активность по отношению к вышеперечисленным клеточным линиям, чем сесквитерпеноид аксенол (18) (табл. 1).
Таблица 1. IC50 пахидиктиола А (17) и аксенола (18) по отношению к опухолевым клеткам человека HeLa, THP-1 и SNU-C4 и нормальным эпидермальным клеткам мыши JB6 Cl41.
Клеточная линия Цитотоксическая концентрация (IC50), мкМ Пахидиктиол А (17) Аксенол (18) HeLa (цервикальная 98 1карцинома) THP-1 (лейкемия) 74 1SNU C-4 (рак кишечника) 99 1JB6 Cl 41 110 22. Химическая структура и биологическая активность стероидных производных из иглокожих и шестилучевых кораллов Моносульфатированный полиоксистероид (20R)-холест-5-ен-3,4,21-триол 3сульфат натрия из офиур Ophiura sarsi, Ophiura leptoctenia и Stegophiura brachiactis.
Основным компонентом фракции полярных стероидов из офиуры O. sarsi оказался стероидный сульфат 19.
OR3 8 19 R1 = SO3Na; R2 = R3 = H 20 R1 = R2 = R3 = H 21 R1 = SO3Na; R2 = R3 = Ac R1O 22 R1 = H; R2 = R3 = Ac ORСтруктуру 19 установили на основании анализа его ЯМР, ИК и МС данных. После сольволиза 19 нагреванием в смеси диоксан-пиридин получили десульфатированное производное 20. Ацетилирование 19 давало моносульфатированный диацетат 21, сольволитическое десульфатирование которого приводило к диацетату 22. Для доказательства наличия в стероиде 20 -диольной группировки, было проведено его периодатное окисление с последующим восстановлением боргидридом натрия и ацетилированием. Окисление 19 реактивом Саррета привело к образованию в 4-м положении карбонильной группы, сопряженной с 5,6-двойной связью, и подтвердило, таким образом, что сульфатированный гидроксил расположен у С-3, а вторичная гидроксильная группа находится в -положении к двойной связи. На основании полученных данных мы предложили для выделенного соединения 19 структуру (20R)холест-5-ен-3,4,21-триола 3-сульфата натрия. Этот сульфатированный полиоксистероид был идентифицирован в этанольных экстрактах еще двух видов дальневосточных офиур: O. leptoctenia и S. brachiactis.
Ди- и три- сульфатированные полиоксистероиды из O. sarsi. Продолжив исследования экстрактов из офиуры O. sarsi, мы выделили новые ди- и трисульфатированные стероидные полиолы 23, 24 и 25. Ввиду того, что соединение 24 не удалось очистить до индивидуального состояния, структурно изучался продукт его десульфатирования 26, что и позволило определить химическое строение стероида 24.
Наблюдаемые в ЯМР спектрах 23 по сравнению со спектрами 19 сдвиги сигналов протонов CH2-21 в слабое поле и сигналов углеродных атомов С-20 и С-21 в сильное и слабое поля, соответственно, могут быть объяснены сульфатированием С-гидроксигруппы в соединении 23. Это было подтверждено получением идентичного продукта сольволиза 20 из стероидов 19 и 23. На основании этих данных для 23 была установлена структура (20R)-холест-5-ен-3,4,21-триола 3,21-дисульфата натрия. Этот стероид был выделен нами также из этанольного экстракта O. aculeata.
После ацетилирования и последующего сольволитического десульфатирования стероида 23 был получен полиоксистероид, содержащий ацетоксильную группу при С4, идентичный по спектральным характеристикам моноацетату стероидного триола 26, выделенному после десульфатирования подфракции полиоксистероидов, где преобладал стероид 24.
Кроме того, сравнение спектров триацетатов, полученных из 23 и 24 после сольволитического десульфатирования и ацетилирования, показало их идентичность друг другу. Установлено, что они имеют формулу 27. Расположение сульфатных групп в молекуле 24 было определено при сравнении Н ЯМР спектра подфракции сульфатированных полиоксистероидов, где преобладающим компонентом был стероид 24, со спектром сульфатированного моноацетата, полученного при ацетилировании стероида 23. Эти спектры оказались идентичными. Таким образом, для сульфатированного полиоксистероида 24 было доказано строение (20R)-4-ацетоксихолест-5-ен-3,21-диол 3,21-дисульфата натрия.
RROH H3C H H H RH H H R1 OH RRA 23 R1 = R3 = OSO3Na; R2 = OH 25 R1 = R2 = R3 = OSO3Na 24 R1 = R3 = OSO3Na; R2 = OAc 28 R1 = R2 = R3 = OH 26 R1 = R3 = OH; R2 = OAc 29 R1 = R2 = R3 = OAc 20 R1 = R2 = R3 = OH 27 R1 = R2 = R3 = OAc Сульфатированный полиоксистероид 25 при попытке ацетилирования не изменялся, а продукт его сольволиза 28 в масс-спектре имеет пик молекулярного иона с m/z 418. В С ЯМР спектре триола 28 присутствуют сигналы трех атомов углерода, связанных с кислородом, и двойной связи. Ацетилирование соединения 28 приводит к триацетату 29, который отличается от триацетата холест-5-ен-3,4,21-триола (27). Сравнение спектров 13С ЯМР 28 и 20, а также 1Н ЯМР спектров их ацетатов 29 и 27 показывает почти полное совпадение сигналов С-12 - С-27 и небольшое отличие сигналов атомов в кольцах А и В. Был сделан вывод об идентичности боковых цепей триолов 28 и 20. На основании спектральных данных мы предположили, что две вторичные гидроксильные группы и двойная связь находятся в полициклической части молекулы и образуют фрагмент А. Данные спин-декаплинг экспериментов, а также ширина сигналов протонов СН-2 и СН-3, указывают на их экваториальную конфигурацию и 2,3расположение гидроксильных групп. Следовательно, сульфатированный полиоксистероид 25 имеет строение (20R)-холест-5-ен-2,3,21-триол 2,3,21трисульфата натрия.
Дисульфатированные стероидные триолы из офиуры Ophiopholis aculeata. Из офиуры O. aculeata были получены дисульфатированные стероидные триолы 30-32.
RRRRRR30 R1 = OH; R2 = R3 = OSO3Na 31 R1 = R3 = OSO3Na; R2 = OH; 33 R1 = OAc; R2 = R3 = OH 32 R1 = R3 = OSO3Na; R2 = OH; 22 22 22 22 34 R1 = R3 = OH; R2 = OAc; 35 R1 = R2 = R3 = OAc; 36 R1 = R2 = R3 = OAc; 22 22 22 22 При сравнении С ЯМР спектра 30 со спектром 25 можно было убедиться, что разница в химсдвигах углеродных атомов стероидного ядра для этих соединений значительна лишь для С-2, что говорит о наличии в 30 свободной гидроксильной группы при С-2 по сравнению с сульфатной группой при С-2 в 25. И наоборот, сигналы С-3 и С-21 в спектре 30 смещены в слабое поле по сравнению с соответствующими сигналами в 13С ЯМР спектре известного триола 28, что свидетельствует о наличии в 30 сульфатных групп при С-3 и С-21. Два дополнительных (по сравнению со спектрами 25 и 28) сигнала в области двойных связей (128.5 и 138.1 м.д.) указывают на то, что в боковой цепи стероида 30 имеется еще одна двойная связь. Наконец, присутствие в 13С ЯМР спектре 30 только 26 сигналов углеродных атомов показывает, что эта боковая цепь укорочена. Дальнейшее доказательство структуры стероида 30 мы проводили, используя 13С и 1Н ЯМР, а также масс-спектры моноацетата 33, в результате чего было установлено, что полиоксистероид 30 имеет структуру (20R,22Е)-24-нор-холеста-5,2213 диен-2,3,21-триол 3,21-дисульфата натрия. Из сравнения спектров С и Н ЯМР стероидов 31, 32 и 23 можно было сделать вывод о том, что 23, 31, 32 имеют одну и ту же структуру стероидного ядра, а разница между ними заключается лишь в строении боковых цепей. При сравнении химсдвигов протонов СН2-21 в 1Н ЯМР спектре смеси стероидов 31 и 32 с таковыми в спектрах известных сульфатированных полиоксистероидов 23, 25, стало очевидно, что в 31 и 32 в 21-положении боковой цепи находится сульфатная группа. При ацетилировании с последующим десульфатированием из 31 был получен моноацетат 34.
С ЯМР и масс-спектры 34 подтверждают его структуру как моноацетата С27стероидного триола с двумя двойными связями. Чтобы окончательно определить строение стероида 31, моноацетат 34 после ацетилирования и последующего гидрирования над катализатором Адамса был превращен в известное ранее производное - триацетат 27. Идентификацию проводили с помощью Н ЯМР и массспектров. Таким образом, строение сульфатированного полиоксистероида установлено как (20R)-холеста-5,25-диен-3,4,21-триол 3,21-дисульфат натрия.
Сульфатированный полиоксистероид 32 выделить в индивидуальном состоянии не удалось. Его 13С ЯМР спектр был получен вычитанием из спектра смеси стероидов 31 и 32 спектра 31. Присутствие в спектре стероида 32 сигналов при 130.2 и 133.3 м.д.
позволяет предположить наличие в его боковой цепи двойной связи, отличной от 25(26)-двойной связи стероида 31, а именно: 22-связи. Смесь стероидов 31 и ацетилировали и провели сольволиз полученных ацетатов. Попытки разделить смесь продуктов этих превращений не были успешными. Однако Н ЯМР спектр смеси подтвердил наличие в стероиде 32 22-двойной связи с транс-расположением олефиновых протонов. Смесь полученных моноацетатов затем ацетилировали, а фракцию стероидных триацетатов 35 и 36 разделили с помощью ВЭЖХ. Масс-спектр 36 подтверждает структуру триацетата С27-стероидного триола с двумя двойными связями (одна - в ядре, другая - в боковой цепи). Структура боковой цепи 36 доказана с помощью ЯМР экспериментов. Для окончательного подтверждения структуры стероида 32 его производное 36 было превращено в известный триацетат 27 путем гидрирования над катализатором Адамса. Идентификацию провели сравнением Н ЯМР и масс- спектров, они были идентичны. Таким образом, для сульфатированного полиоксистероида была 32 определена структура (20R)-холеста-5,22-диен-3,4,21триола 3,21-дисульфата натрия.
Дисульфатированные стероидные тетраолы из офиуры O. aculeata.
Поскольку смесь дисульфатированных полиоксистероидов 37 и 38, выделенную из O. aculeata, разделить не удалось, а спектральный анализ смеси был затруднен ассоциацией в растворах, вызванной наличием сульфатных групп, то структурно изучались продукты их ацетилирования и последующего десульфатирования, а именно - смесь эпимеров 39 и 40.
RR37 24R; R1 = R4 = OH; R2 = R3 = OSO3Na R38 24S; R1 = R4 = OH; R2 = R3 = OSO3Na 39 24R; R1 = R4 = OAc; R2 = R3 = OH R40 24S; R1 = R4 = OAc; R2 = R3 = OH 13 При сравнении С и Н ЯМР спектров смеси с соответствующими спектрами стероида 33 можно было сделать вывод об идентичном строении стероидного ядра в 33 и 39, 40 и о существенной разнице в структуре их боковых цепей. Сигналы углеродных атомов боковой цепи смеси 39 и 40 (кроме сигналов С-20 и С-21) имеют вид "дублетов" с разницей в химсдвигах 0.1-0.06 м.д., а для С-24 эта разница составляет 0.08 м.д. Именно такой вид С ЯМР спектров характерен для смеси стероидных эпимеров по одному из атомов боковой цепи. Химсдвиги углеродных атомов боковой цепи свидетельствуют о наличии в ее структуре гидроксильной и ацетоксильной групп, а также 25(26)-двойной связи. 1Н ЯМР спектр и эксперименты ЯЭО подтверждают наличие 25(26)-двойной связи, гидроксильной группы у С-21 и (20R)-конфигурацию в стероидах 39 и 40, а также наличие в положении С-24 ОАсгруппы. Расщепление сигнала этой ОАс-группы на два примерно равных синглета (2.05 и 2.06 м.д.) указывает на то, что смесь состоит из приблизительно эквимолярных количеств 24R и 24S-эпимеров 39 и 40. Основываясь на структурах ацетатов 39 и 40, мы определили для нативных полиоксистероидов 37 и 38 строение (20R,24R)- и (20R,24S)-холеста-5,25-диен-2,3,21,24-тетраол 3,21-дисульфатов.
Идентификация 3,21-дисульфатированных стероидных диолов в офиурах O.
aculeata, O. sarsi и S. brachiactis. Продолжив изучение полярных стероидов из офиур, мы получили в индивидуальном состоянии и идентифицировали ранее известные (20R)-5-холестан-3,21-диол 3,21-дисульфат натрия (41) и (20R)-холест-5-ен-3,21диол 3,21-дисульфат натрия (42) в O. aculeata, O. sarsi и S. brachiactis. Идентификация 13 стероидов 41 и 42 проводилась сравнением С и Н ЯМР, а также масс-спектров исходных сульфатов и их производных 43 и 44 с литературными данными.
OROR41 R1 = R2 = SO3Na;
42 R1 = R2 = SO3Na;
R1O 43 R1 = R2 = H 44 R1 = R2 = H R1O H Вероятные пути биосинтеза сульфатированных полиоксистероидов офиур.
Наиболее характерными местами гидроксилирования и сульфатирования для полиоксистероидов офиур являются положения 2, 3, 4, а в боковой цепи - 21.
Возможные пути их биосинтеза изображены на схеме 8. Предшественниками этих соединений являются, очевидно, стерины (45, R=боковая цепь). Образование 2,3- и 3,4-окисей (46, 50) может быть следствием энзиматической дегидратации свободных стеринов с последующим окислением образующихся при этом 2(3)- и 3(4)-двойных связей. Размыкание эпоксициклов при их взаимодействии с протоном и реакция соответствующих карбкатионов (47, 51) с сульфат-анионом, по-видимому, завершают этот процесс, что приводит к образованию соответствующих сульфатированных полиоксистероидов (48, 49, 52, 53).
R R R HO O + HO 50 R R R HO NaO3SO + R O R 47 R OH NaO3SO NaO3SO NaO3SO NaO3SO OAc OH Схема 8. Возможные пути биосинтеза сульфатированных полигидроксистероидов в офиурах Биологическая активность полярных стероидов. Действие на опухолевые и нормальные клетки млекопитающих. В наших экспериментах полиокситероид 19, выделенный из O. sarsi, показывает слабую цитотоксическую активность против опухолевых клеток человека HL-60, HeLa, SNU-C4, а также против мышиных эпидермальных JB6 Сl41 клеток в концентрациях 50-200 мкг/мл. Причем при концентрации 200 мкг/мл 19 на 100% ингибирует рост всех используемых клеточных линий. IC50 равна 121, 135, 101 и 114 мкг/мл в отношении HL-60, HeLa, SNU-C4 и JBCl41 клеток соответственно. Следовательно, более высокую активность стероид проявляет против SNU-C4 опухолевых клеток человека (рак кишечника).
Полярные стероиды 23 и 31 из O. aculeatа, отличающиеся друг от друга только наличием в боковой цепи стероида 31 25(26)-двойной связи, в концентрациях до 1мкг/мл не проявляют ни цитотоксической активности по отношению к клеткам карциномы Эрлиха и к лимфоцитам мыши, ни гемолитической активности по отношению к эритроцитам мыши. Влияние стероидов 23 и 31 на транспорт ионов Са2+ через клеточную мембрану было исследовано при помощи радиоизотопного и спектрофлюориметрического методов с использованием ионов радиоактивного изотопа Са2+ и флуоресцентного кальциевого зонда. Оказалось, что 23 и 31 в концентрациях 1-100 мкг/мл и времени инкубирования с клетками 5 мин стимулируют быстрый вход ионов Са2+ в клетки карциномы Эрлиха (рис. 4). Причем стероид 31 примерно в 8 раз более активен, чем 23.
12108Стероид 6Стероид 423.13 6.25 12.5 25 50 1Концентрация стероидов 23, 31(мкг/мл) Рисунок 4. Влияние стероидов 23 и 31 на вход ионов Са2+ в клетки карциномы Эрлиха.
Подобный эффект стероидов 23 и 31 на внутриклеточную концентрацию Са2+ зафиксирован также на лимфоцитах и макрофагах мыши.
Противоопухолевая активность и механизм действия левиускулозида G, стероидного гликозида из морской звезды Henricia leviuscula. Гликозилированные стероиды являются обычными вторичными метаболитами морских звезд.
евиускулозид G (LSG, 54) был выделен из дальневосточной морской звезды H.
leviuscula в лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ и показал гемолитическую и нейритогенную активности. Однако его проапоптотические и противоканцерогенные свойства до наших работ не были изучены.
Проапоптотические свойства левиускулозида G.
OH Клетки лейкемии человека HL-60 или THP-1 были OH обработаны в течение 24 часов возрастающими O HO O концентрациями LSG, что вызвало в данных клетках апоптоз, зависящий от концентрации LSG. HL-60 клетки были более чувствительными OH к действию LSG по сравнению с THP-1 клетками.
OH Так, LSG в концентрации 40 мкМ вызывал CH3OHO O O апоптоз в 70% HL 60 клеток и лишь в 30% THP-OCH3 OH OH клеток.
2+ Концентрация Са, % от контроля Канцерпревентивная и цитотоксическая активности левиускулозида G.
Результаты изучения цитотоксической активности показали, что даже концентрация LSG 80 мкМ является нецитотоксической для JB6 P+ Cl41 клеток (рис. 5 А).
Б А 40135301* 2520* 15105* 35 50 65 Контроль EGF 20 30 40 Концентрация LSG, мкМ Контроль Концентрация LSG, мкМ Рисунок 5. Действие LSG (54) на жизнеспособность JB6 P+ Cl41 клеток (А). Ингибирование LSG EGF-индуцированной проканцерогенной трансформации JB6 Cl41 P+ клеток (Б).
LSG дозoзависимым образом и в нецитотоксических концентрациях ингибирует трансформацию JB6 Cl41 P+ клеток, индуцированную эпидермальным фактором роста (EGF) (рис. 5 Б).
Действие левиускулозида G на АР-1-, р53- и NF- B-зависимую транскрипционную активность. Для того чтобы изучить механизм действия LSG на клеточном уровне, было исследовано его действие на АР-1-, р53- и NF-B-зависимую транскрипционную активность в JB6 Cl41 клетках. Роль АР-1 ядерного транскрипционного фактора в пролиферации, дифференциации и EGF-индуцированной прораковой трансформации JB6 P+ Cl41 клеток хорошо известна, а ингибиторы АР-активности рассматриваются как потенциальные противооопухолевые и/или канцерпревентивные вещества. Полученные нами результаты показывают, что LSG является новым ингибитором базовой, а также EGF-индуцированной АР-1-зависимой транскрипционной активности. Ядерный транскрипционный фактор NF-B также участвует в активации большого числа генов, включая гены, ответственные за воспалительные процессы, подавление апоптоза и клеточный ответ на инфекцию.
1.A 8.Б * 1.0 7.* 6.0.5.0.4.* * 3.0.2.0.1.* 0.0.0 25 50 0 25 50 Концентрация LSG, мкМ Концентрация LSG, мкМ Рисунок 6. Ингибирование LSG базовой NF-B-зависимой (А) и активирование базовой р53зависимой (Б) транскрипционной активности в JB6 Cl41 клетках. **Относительные единицы.
В противоположность этому, активирование белка-супрессора опухолей р53 ведет к ингибированию клеточного роста путем остановки клеточного цикла или индукции апоптоза. В нашем исследовании LSG, подобно многим другим противоопухолевым веществам, в нецитотоксических концентрациях и дозозависимым образом ингибировал NF-B-зависимую (рис. 6 А), но индуцировал р53-зависимую транскрипционную активность (рис. 6 Б) в JB6 Cl 41 клетках.
Действие левиускулозида G на EGF-индуцированное фосфорилирование ERKs. Известно, что ERKs - существенный элемент контроля клеточного деления.
ERKs способны активировать онкогенные факторы транскрипции, такие как AP-1, NFB, и c-Myc. Сами ERKs также фосфорилируются и активируются эпидермальным фактором роста в процессе опухолевой трансформации мышиных эпидермальных JBCl41 P+ клеток. Ингибиторы ERKs рассматриваются в качестве противоопухолевых веществ. Наши эксперименты показали, что LSG дозозависимым образом ингибирует EGF-индуцированное ERKs фосфорилирование и активирование в нецитотоксических концентрациях 20-40 мкМ (рис. 7).
Концентрация LSG, мкМ EGF 5 10 20 -фосфо-ERKs -нонфосфо -ERKs Рисунок 7. Ингибирование LSG EGF-индуцированного фосфорилирования ERKs в JBCl41 P+ клетках.
Таким образом, биологическая активность LSG выражается в индукции апоптоза в опухолевых клетках человека и ингибировании трансформации нормальных клеток в опухолевые. Она реализуется, по крайней мере отчасти, через индукцию транскрипционной активности белка-супрессора опухолей р53 и ингибирование транскрипционной активности, зависимой от онкогенных AP-1 и NF-B ядерных факторов, а также через ингибирование EGF-индуцированного фосфорилирования и активирования онкогенных ERKs. На примере изучения LSG показано, что некоторые стероидные гликозиды из морских звезд представляют собой группу морских вторичных метаболитов, перспективных в качестве потенциальных противоопухолевых и канцерпревентивных веществ.
3. Биологическая активность морских алкалоидов и их аналогов.
Биологическая активность и механизм действия поликарпина и его синтетического аналога диметилполикарпина. Противоопухолевый алкалоид поликарпин (55) из асцидии Polycarpa aurata. высоко токсичен в отношении опухолевых клеток человека. Это соединение и его производное диметилполикарпин (56) были получены путем полного химического синтеза в лаборатории органического синтеза природных соединений ТИБОХ с хорошими выходами.
OCHOCHOCH2CH3 OCH2CHS S S S 2HCl 2HCl N N N N N N CH3 CH3 N CH3 CH3 N NH2 55 NH2 NH2 NHИсследование цитотоксической и канцерпревентивной активностей поликарпина и диметилполикарпина. Методом MTS было показано, что поликарпин (55) и диметилполикарпин (56) ингибируют жизнеспособность JB6 Cl41 P+ клеток с IC50=7.2 и 7.7 мкМ соответственно. Канцерпревентивную активность поликарпина и его производного 56 исследовали с помощью метода мягкого агара. В качестве активаторов процесса опухолевой трансформации JB6 Cl41 P+ клеток в мягком агаре были использованы EGF (10 нг/мл) и форболовый эфир (ТРА, 20 нг/мл). Полученные результаты показывают, что алкалоиды 55 и 56 обладают канцерпревентивной активностью в малоцитотоксических концентрациях, при этом INCC50 равны для 1.2-1.5 мкМ, а для 56 - 2.5-4.3 мкМ. Таким образом, оба вещества демонстрируют способность тормозить трансформацию нормальных клеток, причем поликарпин (55) в 2 раза более активный ингибитор злокачественного перерождения клеток, чем диметилполикарпин (56).
Индукция апоптоза в JB6 Cl41 P+ клетках, а также в опухолевых клетках человека. Методом проточной цитометрии показано, что поликарпины 55 и индуцируют апоптоз в JB6 клетках дозозависимым образом (рис. 8). В этом случае также более активен, чем 56. Однако такие активности обоих веществ по отношению к одним и тем же лейкемическим клеткам человека примерно одинаковы.
A Б 80 * 50 * * 40 * 30 * * * * 0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 0 5.0 7.5 10.0 12.Концентрация диметилполикарпина, мкМ Концентрация поликарпина, мкМ Рисунок 8. Индукция поликарпином (55) (А) и диметилполикарпином (56) (Б) апоптоза в JB6 Cl41 P+ клетках.
Поликарпин в концентрации 5 мкМ вызывает ранний апоптоз в 17.3% и поздний в 81.8% HL-60 клеток, соответствующие цифры для диметилполикарпина - 18.7% и 76.0%. Оба вещества оказались более активными индукторами апоптоза по отношению к HL-60 клеткам по сравнению с ТНР-1 клетками. Действительно, при концентрации мкМ 55 вызывает общий апоптоз в 56.7% HL-60 клеток, но лишь в 22.5% ТНР-1 клеток.
Аналогичный результат получен и для 56. Вестерн-блоттингом с использованием первичных антител к прокаспазе-3 и к активной, расщепленной форме каспазы-установлено, что 55 и 56 активируют каспазу-3 в JB6 Cl41 P+ клетках в зависимости от времени и концентрации веществ (рис. 9).
A Б Поликарпин, мкМ Диметилполикарпин, мкМ _______________________ _______________________ Ктр UVB Ктр UVB 2.5 5 7.5 10 12.5 2.5 5 7.5 10 12.-прокаспаза--прокаспаза-6ч 6ч -расщепленная -расщепленная каспаза-каспаза--прокаспаза--прокаспаза-10ч 10ч -расщепленная -расщепленная каспаза-каспаза--прокаспаза--прокаспаза-24ч 24ч -расщепленная -расщепленная каспаза-каспаза-Рисунок 9. Активирование поликарпином (55) (А) и диметилполикарпином (56) (Б) каспазы-3 в JB6 Cl41 P+ клетках.
Эти результаты показывают, что канцерпревентивные и противоопухолевые свойства поликарпинов могут быть обусловлены индукцией каспаза-3-зависимого апоптоза в трансформированных или раковых клетках.
Фосфорилирование MAP-киназ, активированное поликарпином и диметилполикарпином. С применением метода ветерн-блоттинга мы показали, что поликарпин и диметилполикарпин индуцируют дозозависимое фосфорилирование МАРК р38, JNKs и ERKs (рис. 10 А-В) в JB6 Cl41 Р+ клетках. Так, поликарпин и диметилполикарпин начинают стимулировать фосфорилирование p38 киназы и JNKs уже при концентрации 2.5 мкМ, но фосфорилирование ERKs они индуцируют только при концентрации 10 мкМ и выше.
Концентрация, мкМ Концентрация, мкМ A Б Кт р 2.5 5 7.5 10 Ктр 2.5 5 7.5 10 Поликарпин -фосфо-рфосфо-JNKs Поликарпин -pJNKs Диметил-фосфо-рполикарпин -p38 Диметилфосфо-JNKs поликарпин ДиметилполиПоликарпин, мкМ JNKs В карпин, мкМ Ктр 2.5 5 10 15 2.5 5 10 фосфо-ERKs ERKs Рисунок 10. Индукция поликарпином и диметилполикарпином фосфорилирования МАРК р38 (А), JNKs (Б), ERKs (В) в JB6 Cl41 P+ клетках.
Индукция поликарпином и диметилполикарпином фосфорилирования белка cJun по Ser 73 в Jnk+/+, но не в Jnk1-/-и Jnk2-/- мышиных эмбриональных фибробластах (МЭФ). c-Jun является известным субстратом для JNKs. Наши результаты показывают, что и поликарпин, и диметилполикарпин в концентрациях 7.512.5 мкМ индуцируют c-Jun фосфорилирование по Ser 73 в Jnk+/+ мышиных эмбриональных фибробластах (МЭФ) дозозависисмым образом (рис. 11).
Поликарпин, мкМ Поликарпин, мкМ A Б Ктр 7.5 10 12.5 Ктр 7.5 10 12.Ктр 7.5 10 12.5 Ктр 7.5 10 12.JNK+/+ JNK1-/JNK+/+ JNK2-/-фосфо-с-Jun -фосфо-с-Jun -нонфосфо-с-Jun -нонфосфо-с-Jun Диметилполикарпин, мкМ Диметилполикарпин, мкМ Ктр 7.5 10 12.5 Ктр 7.5 10 12.Ктр 7.5 10 12.5 Ктр 7.5 10 12.JNK+/+ JNK1-/JNK+/+ JNK2-/-фосфо-с-Jun -фосфо-с-Jun -нонфосфо-с-Jun -нонфосфо-с-Jun Рисунок 11. Воздействие поликарпина и диметилполикарпина на фосфорилирование c-Jun по Ser 73 в Jnk+/+ и Jnk1-/- МЭФ (А), а также в Jnk+/+ и Jnk2-/- МЭФ (Б).
В то же время никакого активирования c-Jun фосфорилирования не наблюдается в Jnk1-/-и Jnk2-/- МЭФ. Этот результат ясно показывает, что поликарпины индуцируют активность JNKs.
Роль МАР киназ в индукции поликарпином или диметилполикарпином проапоптотического сигнала в JB6 Cl41 клетках. MTS методом была оценена роль MAP киназ в эффектах поликарпина или диметилполикарипна на жизнеспособность клеток. Экспрессия доминант-негативной формы JNK1 приводит к резкому увеличению числа JB6Cl 41 JNK1 DNM клеток, выживших после воздействия токсичных концентраций поликарпинов по сравнению с контрольными JB6 Cl41 Р+ клетками. С другой стороны, экспрессия доминант-негативных форм р38 или ERK2, напротив, приводит к уменьшению числа выживших JB6 Cl41 р38 DNM или JB6 ClERK2 DNM клеток по сравнению с контрольными JB6 Cl41 Р+ клетками.
Далее, для подтверждения активной роли JNK киназ в опосредовании действия поликарпинов на клеточном уровне, мы изучили поликарпин- и диметилполикарпининдуцированный апоптоз в клетках с экспрессированными доминант-негативномутантными (DNM) формами MAP киназ или в Jnk1-/-и Jnk2-/- МЭФ. Результаты этих экспериментов соответствуют результатам MTS экспериментов и указывают на то, что количество апоптотических JB6 Cl41 JNK1 DNM клеток после воздействия токсических доз поликарпинов значительно, на 20-70% меньше, чем в контрольных JB6 Cl41 клетках. Напротив, JB6 Cl41 p38 DNM клетки в тех же условиях дают значительно большее, на 20-50% количество апоптотических клеток по сравнению с контрольными JB6 Cl41 Р+ клетками. Экспрессия DNM ERK2 не приводит к большой разнице в апоптозе, индуцированном поликарпинами 55 и 56 в JB6 Cl41 ERK2 DNM и JB6 Cl41 Р+ клетках.
Для того чтобы еще раз подтвердить роль JNK киназ в поликарпин-индуцированном апоптозе, мы использовали специфические ингибиторы JNKs: SP600125 и ингибитор пептидной природы #420116. Результаты этих экспериментов показывают, что поликарпин-индуцированный апоптоз на 20-50% ингибируется этими JNK ингибиторами в JB6 Cl41 Р+ клетках. С другой стороны, 30-минутное преинкубирование JB6 Cl41 клеток со специфическим ингибитором р38 киназы, SB202190, имеет результатом значительное, на 20-30%, увеличение числа апоптотических клеток при концентрации поликарпинов 12.5 мкМ, в сравнении с контрольными клетками. Эти результаты подтверждают решающее значение МАРК JNK сигнального пути в индукции апоптоза поликарпином (55) и диметилполикарпином (56).
Роль белка-супрессора опухолей р53 в эффектах, индуцированных поликарпином и диметилполикарпином на клеточном уровне. Для того чтобы исследовать роль рв индукции апоптоза поликарпином и диметилполикарпином, мы изучили апоптоз в р53+/+ и р53-дефицитных (р53-/-) МЭФ. Для каждого из веществ, при концентрациях 1012.5 мкМ, количество апоптотических клеток в р53+/+ МЭФ в 2-4 раза выше, чем в р53-/МЭФ. Этот результат показывает, что р53 вовлечен в апоптоз, индуцированный поликарпином или диметилполикарпином. Для того чтобы показать, что оба соединения стимулируют активность р53, мы затем изучили индукцию поликарпинами р53-зависимой транскрипционной активности и р53-фосфорилирования в JB6 Clклетках. Нами показано, что после обработки JB6 Cl41 клеток со стабильно экспрессированным р53-люциферазным репортерным геном (PG-13 клетки) поликарпинами при концентрациях от 2.5 до 12.5 мкМ, в клетках происходит значительное, на 25-50%, увеличение р53-зависимой транскрипционной активности (рис. 12).
Это увеличение хорошо согласуется с ростом внутриклеточных уровней фосфорилированной и нефосфорилированной форм ядерного фактора р53, наблюдаемым в JB6 Cl41 Р+ клетках, обработанных поликарпином или диметилполикарпином в концентрациях 7.5 мкМ и более (рис. 13).
1.1.А * Б * * * * 1.4 * * 1.* * * * * 1.1.1.0 1.0.8 0.0.0.0 1.25 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 0 1.25 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 Поликарпин, мкМ Диметилполикарпин, мкМ Рисунок 12. Индукция поликарпином (А) и диметилполикарпином (Б) р53-зависимой транскрипционной активности в JB6 Cl41 р53 клетках.
Рисунок 13. Влияние поликарпина и диметилполикарпина на внутриклеточные уровни белка-супрессора опухолей р53 в JB6 Cl41 P+ клетках.
Роль JNKs в фосфорилировании белка-супрессора опухолей р53, индуцированном поликарпином и диметилполикарпином. Для того чтобы определить роль JNKs в фосфорилировании р53, индуцированном поликарпинами, мы изучили фосфорилирование р53 по Ser 15, индуцированное 55 и 56 в Jnk1-/-, Jnk2-/- или Jnk+/+ МЭФ. Полученные результаты показывают, что фосфорилирование р53 было ингибировано в Jnk1-/-и Jnk2-/- МЭФ по сравнению с Jnk+/+ МЭФ (рис. 14). Это указывает на востребованность JNK киназ в процессе поликарпин- или диметилполикарпин-индуцированного фосфорилирования р53 по Ser 15 и последующего апоптоза.
Рисунок 14. Влияние поликарпина и диметилполикарпина на внутриклеточные уровни белка-супрессора опухолей р53 в Jnk+/+, Jnk1-/- и Jnk2-/- МЭФ.
Таким образом, наши результаты показывают, что цитотоксическая и канцерпревентивная активности поликарпинов, по крайней мере отчасти, обусловлены индукцией каспаза-3-зависимого апоптоза. Кроме того, поликарпины активируют фосфорилирование р38, JNKs и ERKs в JB6 Cl 41 клетках и, следовательно, все три основных МАРК-сигнальных пути вовлечены в ответ JB6 клеток на действие поликарпинов. Мы также показали, что поликарпин-индуцированный апоптоз в значительной степени подавлен в клетках с экспрессированной доминант-негативномутантной формой JNK1 киназы. Поликарпины стимулируют р53-зависимую транскрипционную активность и р53 фосфорилирование в JB6 Сl 41 клетках.
Фосфорилирование р53 по Ser-15 подавлено в JNK1 и JNK2 нокаут клетках. Более того, поликарпины не способны индуцировать апоптоз в р53-дефицитных (р53-/-) мышиных эмбриональных фибробластах (МЭФ) в противоположность с сильной индукцией апоптоза в МЭФ с экспрессированной формой р53 (р53+/+ МЭФ). Этот факт предполагает участие р53 в апотозе, индуцированном поликарпинами.
Фосфорилирование и активирование р53 было в свою очередь опосредовано активированными JNK киназами. Все это ясно указывает на проапоптотическую роль JNK-сигнального пути и показывает, что JNK киназы востребованы в фосфорилировании c-Jun, активировании р53 и последующем апоптозе, индуцированном поликарпинами.
Изучение биологической активности индольных алкалоидов шерининов A, E и D из морского гриба Penicillium janthinellum Biourge. Морские алкалоиды индольного типа шеринин А (ShA, 57), шеринин Е (ShE, 58) и шеринин D (ShD, 59) были выделены из заселяющего морские донные осадки гриба Penicillium janthinellum в лаборатории микробного биосинтеза ТИБОХ. Ранее было показано, что некоторые шеринины обладают инсектицидным действием, а также обладают свойством блокировать натриевые каналы. Мы исследовали ShА, ShЕ и ShD на цитотоксическую, канцерпревентивную и проапоптотическую активности и установили, что эти алкалоиды не токсичны в отношении мышиных JB6 Cl41 P+ и опухолевых HeLa клеток в дозах до 200 мкМ. Было установлено, что шеринин Е (58) в нецитотоксических концентрациях ингибирует неопластическую трансформацию JB6 Cl41 Р+ клеток, стимулированную EGF, и тем самым проявляет канцерпревентивные свойства. Так, 50% ингибирование числа колоний в обработанных ShЕ JB6 Cl41 Р+ клетках наблюдалось уже при концентрации 13 мкМ, а практически полное ингибирование роста колоний трансформированных клеток было достигнуто при концентрации ShE мкМ.
OH H OH H OH O O N N O O H H O O O O шеринин А (57) шеринин E (58): H-22, H-23 - cis шеринин D (59): H-22, H-23 - trans Для исследования проапоптотических свойств шерининов A, D, E были использованы клетки лейкемии человека HL-60 и метод проточной цитометрии.
Полученные данные показали, что эти алкалоиды дозозависимым образом индуцируют запрограммированную смерть клеток путем апоптоза. При концентрации 100 мкМ и инкубировании с клетками в течение 24 часов шеринин A вызывает апоптоз в 19%, шеринин Е - в 44%, а шеринин D - в 49% HL-60 клеток, по сравнению с 10% апоптоза в контрольных клетках. Таким образом, канцерпревентивную активность шерининов, по крайней мере частично, можно объяснить индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках.
Изучение проапоптотической активности 3-бромо- и 10-бромо- фаскаплизинов.
3-Бромо- и 10-бромо- фаскаплизины (60 и 61) были недавно выделены из морской губки Fascaplysinopsis reticulata и асцидии рода Didemnum и затем синтезированы в лаборатории органического синтеза природных соединений ТИБОХ и на кафедре органической химии ДВФУ. Ранее для этих алкалоидов была известна только цитотоксическая активность против нескольких линий опухолевых клеток человека и мыши. Нами с помощью проточной цитометрии изучена их проапоптотическая активность на HL-60 клетках.
Cl + Cl + N N N Br N Br 60 O O Было показано, что алкалоиды 60 и 61 могут индуцировать запрограммированную смерть клеток. Найдено, что они индуцируют апоптоз в HL-60 клетках дозозависимым образом. Уже в концентрациях около 500 нМ 3-бромо- и 10-бромофаскаплизины вызывают апоптоз более 50% HL-60 клеток.
4. Глабрухинон А (деметилубихионон Q2) из асцидии Aplidium glabrum и его синтетические аналоги. Структура, противоопухолевая активность и механизм действия. Из этанольного экстракта дальневосточной асцидии Aplidium glabrum нами выделены два новых дипренилбензохинона, глабрухиноны А (62) и В (63). Структуры выделенных соединений установлены физико-химическими методами. 1Н ЯМР спектр глабрухинона А похож на спектр вераплихинона А, выделенного ранее из Aplidium sp., с тем лишь отличием, что содержит дополнительно типичный для метоксильной группы синглет при 4.02 м.д. Квартеты при 61.2 и 61.3 м.д. в С ЯМР спектре указывают на присутствие двух метоксильных групп в структуре 62. Присоединение терпеноидного фрагмента к С-5, а метоксильных групп к С-2 и С-3 бензохинонового остатка установлено после детального изучения ЯМР спектров, включая 1H-1H-COSY, NOESY и HMBC эксперименты. Сигналы двух трехзамещенных двойных связей, трех метильных групп, присоединенных к этим двойным связям, а также трех метиленовых групп в С ЯМР спектре ясно указывают на присутствие в структурах 62 и дипренильной боковой цепи.
9' 10' O O OCH1' OCH8' 6' H H H 10' OCHH OCHO O 1H-1H COSY HMBC Фактически, как было определено на основании химических сдвигов С-10 в С ЯМР спектрах 62 и 63, эти соединения отличаются друг от друга конфигурацией 2,3 двойной связи. В Е-изомере 62 сигнал метильной группы (С-10, 16.2 м.д.) наблюдается в более сильном поле по сравнению с аналогичным сигналом в Z-изомере 63 (22.м.д.), что согласуется с литературными данными. Сравнение 1Н ЯМР спектров 62 и показывает, что эти соединения содержат соответственно геранильный и нерильный типы боковой цепи. Можно отметить, что боковые цепи второго типа встречаются в природе редко, а большинство пренилированных бензохинонов, выделенных из морских объектов, имеют геранильную боковую цепь. Строение 62 и 63 было подтверждено их синтезом из 2,3,4-триметоксибензальдегида.
Очень интересным представляется факт, что глабрухинон А структурно более близко родственен к убихинонам, чем другие линейные полипренилхиноны, выделенные ранее из асцидий и губок. Поскольку глабрухинон А, в отличие от убихинонов, не содержит метильной группы в хиноидном остатке, он может быть назван деметилубихиноном Q2.
Цитотоксическая активность глабрухинона А и его синтетических аналогов.
Производные глабрухинона А (62), полипренилированные бензохиноны и гидрохиноны 64-75, были синтезированы так же, как и глабрухинон А.
O O O H CH3O CH3O H H n n n 62 n=2 65 n=CH3O OCH3 64 n= 68 n=3 69 n= 71 n=O O O O OH O H CH3O H H n n n 66 n=CH3O CH3O 72 n=67 n= 70 n=O OH O O O CH3O H CH3O H n n H n CH3O H n O O O H H 74 n=73 n=2 n n CH3O 75 n=O Исследуемые вещества были разделены на три группы: структурная группа включает в себя вещества, имеющие в своей структуре изопреноидную часть, состоящую из двух изопреновых единиц (глабрухинон А (62) и его синтетические аналоги 64-67), структурная группа 2 - соединения с тремя изопреновыми единицами (вещества 68-72), структурная группа 3 - с 4-6 изопреновыми единицами (вещества 7375).
Для оценки цитотоксической активности глабрухинона А (62) и его синтетических аналогов 64-75 использовали мышиные JB6 Cl41 P+ клетки и их стабильные трансфектанты JB6 Cl41 NF-B, JB6 Cl41 AP-1 и JB6 Cl41 р53 клетки, а также опухолевые клетки человека HT-460. Полученные значения IC50 для каждого из исследованных хинонов показаны в табл. 2. В результате исследования всех трех структурных групп хинонов было показано, что вещества 62, 64-75 дозозависимым образом воздействуют на жизнеспособность клеток в широком диапазоне концентраций от нескольких мкМ до нескольких сотен мкМ. Большинство веществ, входящих в структурную группу 2 обладают более сильной цитотоксической активностью, чем вещества из структурных групп 1 и 3 (табл. 2).
Таблица 2. IC50 и INCC50 глабрухинона А (62) и его синтетических аналогов 64-по отношению к нормальным мышиным JB6 Cl41 и опухолевым клеткам человека НТ460, HCT-116 и SK-MEL-28.
Вещество IC50, мкМ INCC50, мкМ JB6 JB6 Cl41 JB6Cl41 HT- JB6 Cl41 P+ HT-460 HCT-116 SK-MELCl41 P+ AP-1 460 NF-B Группа 1. 62 11.4 11.0 20.9 25.8 7.3 50.5 12.7 17.2. 64 45.1 29.2 20.3 81.8 15.1 124.1 83.4 46.3. 65 8.3 12.3 4.6 30.6 6.6 26.2 38.1 10.4. 66 11.8 23.9 20.2 29.1 3.1 30.4 15.9 12.5. 67 23.4 25.7 12.7 47.8 14.7 43.2 21.4 20.Группа 6. 68 5.1 5.4 5.2 18.7 19.4 70.9 26.5 36.7. 69 4.7 8.0 5.9 27.6 16.7 58.9 22.7 24.8. 70 8.6 15.9 13.2 22.1 7.4 61.1 17.7 21.9. 71 25.5 29.0 17.2 72.0 24.6 н/и* 98.6 н/и* 10.72 4.6 4.3 3.6 12.1 51.7 15.2 15.3 8.Группа 11. 73 >140 >220 >220 >220 29.2 58.7 28.3 40.12. 74 >15 н/и* н/и* >100 54.7 198.7 н/и* н/и* 13. 75 99.6 85.8 54.7 350 95.3 180.5 112.8 91.н.и* - не исследовали Канцерпревентивная активность глабрухинона А и его синтетических аналогов. Канцерпревентивный эффект глабрухинона А (62) и его синтетических аналогов 64-75 исследовали методом мягкого агара. Полученные значения INСC50 для каждого из изученных хинонов отражены в табл. 2. Было показано, что все исследованные хиноны дозозависимым образом ингибируют трансформацию здоровых клеток в опухолевые или рост колоний опухолевых клеток в мягком агаре, причем вещества из группы 1 предотвращают EGF-индуцированную опухолевую трансформацию JB6 Cl41 P+ клеток в нецитотоксических концентрациях (табл. 2).
Проапоптотическая активность глабрухинона А и его синтетических аналогов. Способность глабрухинона А и его аналогов индуцировать в клетках апоптоз исследовали методом проточной цитометрии.
Полученные результаты, показывают, что полипренилхиноны 62, 64-дозозависимым образом вызывают апоптоз в JB6 Cl41 P+ клетках. Кроме того, глабрухинон А индуцирует апоптоз в JY лимфобластах и опухолевых клетках человека SK-MEL-28, HT-460, HCT-116 (рис. 15), а также в лейкемических HL-60 клетках человека. Тем же методом было показано, что обработка HL-60 или THP-1 клеток глабрухиноном А в концентрации 30 мкМ приводит к значительному увеличению доли соответствующих суб-G1 клеток, что тоже является доказательством индукции апоптоза. Кроме того, индукция глабрухиноном А апоптоза в JB6 Cl41 P+ клетках была подтверждена методом ДНК лестницы. Эти результаты демонстрируют, что глабрухинон А более эффективно действует против клеток меланомы SK-MEL-28 и рака кишечника HCT-116, чем против клеток рака легких HT-460.
* 70 JY 50 * * * 0 1.25 2.5 5 Концентрация глабрухинона А, мкМ JB6 Cl41 P+ 60 SK-MEL-* * * * * * * 30 * 0 0 7.5 10 12.5 15 20 Ctrl 7.5 10 12.5 15 Концентрация глабрухинона A, мкМ Концентрация глабрухинона A, мкМ * 100 HCT-1HT-4* * * * 0 25 30 35 40 0 5 Концентрация глабрухинона A, мкМ Концентрация глабрухинона А, мкМ Рисунок 15. Индукция глабрухиноном А апоптоза в JB6 Cl41 P+ и JY клетках, а также в опухолевых клетках человека SK-MEL-28, HT-460 и HCT-116.
Влияние глабрухинона А и его синтетических аналогов на р53-, АР-1- и NF- B зависимую транскрипционную активность. Известно, что некоторые ядерные транскрипционные факторы, включая белок-супрессор опухолей р53, АР-1 или NF-B участвуют в индукции или ингибировании апоптоза под действием различных стимулов, в том числе при действии на клетку хемопревентивных или лекарственных препаратов. Мы изучили действие полипренилхинонов 62, 64-75 на эти три транскрипционных фактора.
Таблица 3. Наибольшее активирование или ингибирование АР-1-, NF-B- или р53зависимой транскрипционной активности в JB6 Cl41 клетках глабрухиноном А (62) и его синтетическими аналогами 64-75.
Вещество Транскрипционная Вещество Транскрипционная активность, в % от контроля активность, в % от контроля АР-1 p53 АР-1 pNF-B NF-B Группа 1 Группа 62 190.3 216.9 71.7 68 125.0 99.2 24.69 97.2 138.8 57.64 159.8 194.8 55.8 70 252.2 223.0 26.71 107.7 179.3 31.65 293.3 197.9 36.3 72 84.0 403.5 22.Группа 66 721.7 201.2 31. 73 139.5 225.7 н/и* 74 н/и* н/и* н/и* 67 880.7 421.7 47. 75 198.5 549.7 36.Апоптоз, % от контроля Апоптоз, % от контроля Апоптоз, % от контроля Апоптоз, % от контроля Апоптоз, % от контроля Результаты, представленные в табл. 3, отражают наибольшие значения активирования или ингибирования транскрипционной активности ядерных факторов хинонами 62, 64-75. Эти результаты свидетельствуют о том, что полипренилхиноны 62, 64-75 вызывают значительное (до 8-ми раз) увеличение базовой АР-1- или NF-Bзависимой и ингибирование (до 4-х раз) р53- зависимой транскрипционной активности.
Таким образом, наше исследование предполагает, что апоптоз, индуцируемый полипренилхинонами 62, 64-75, происходит независимо от активирования белкасупрессора опухолей р53, но может быть связанным с активированием ядерных транскрипционных факторов АР-1 и NF-B.
Зависимость биологической активности глабрухинона А и его синтетических аналогов от их химической структуры. Полученные результаты показывают, что биологическая активность полипренилхинонов 62, 64-75 зависит от длины терпеноидных боковых цепей. Статистический анализ данных из табл. 2 показывает, что при увеличении длины полипренильной части молекул полипренилхинонов от 2 до 3 изопреновых единиц, цитотоксическая активность соединений увеличивается, но при дальнейшем увеличении до 4-6 единиц - резко уменьшается.
При статистическом анализе результатов ингибирования полипренилхинонами 62, 64-75 опухолевой трансформации JB6 Cl41 P+ клеток (см. табл. 2) было найдено, что хиноны из группы 1 обладают наиболее сильной канцерпревентивной активностью по сравнению с хинонами из групп 2 или 3, а хиноны из группы 3 наименее активны среди всех трех групп хинонов. Затем, мы сравнили данные по цитотоксической активности (IC50, JB6 Cl41 P+ клетки) изученных полипренилхинонов 62, 64-75 (табл. 2) с данными по их канцерпревентивной активности (INCC50, JB6 Cl41 P+ клетки). Было найдено, что хиноны из группы 1 ингибируют трансформацию JB6 Cl41 P+ клеток в нецитотоксических концентрациях и потенциально могут быть использованы в качестве канцерпревентивных препаратов, в отличие от хинонов из группы 2.
Нами также было показано, что канцерпревентивная активность полипренилхинонов зависит от положения метоксильной группы по отношению к терпеноидной боковой цепи в молекуле. Мы выбрали несколько пар структурно похожих хинонов, которые имеют метоксильные группы в одинаковых положениях.
Такими парами были: орто-аналоги, хиноны 64 и 71; мета-аналоги, хиноны 65 и 69 и пара-аналоги, хиноны 66 и 70. Основываясь на данных из табл. 2 и 3, можно сделать вывод, что канцерпревентивная и АР-1-зависимая транскрипционная активности хинонов возрастают в ряду орто-мета-пара-аналогов. В свою очередь среди парааналогов 66 и 70 наиболее активным является 66, имеющий в боковой цепи две изопреновые единицы.
Ингибирование глабрухиноном А роста солидной карциномы Эрлиха in vivo.
Ингибирование глабрухиноном А роста солидной карциномы Эрлиха изучали in vivo методом магнитно-резонансной томографии с использованием белых нелинейных мышей с привитой карциномой Эрлиха. Глабрухинон А растворяли в смесях растворителей DMSO-H2O, 1:1 или EtOH-H2O, 1:1. Обработку мышей веществом начинали за день до (канцерпревентивный эффект) или через сутки после тансплантации опухоли (терапевтический противоопухолевый эффект).
Результаты изучения показаны на рис. 16 как процент ингибирования роста опухоли в зависимости от времени воздействия глабрухинона А. Показано, что рост солидной карциномы Эрлиха в мышах ингибируется на 50% после превентивной инъекции глабрухинона А в концентрации 30 мг/кг (LD50 = 35 мг/кг), растворенным в 50% DMSO или 50% EtOH (рис. 16 A или 16 Б соответственно). Когда глабрухинон А используют в той же концентрации в качестве терапевтического препарата, через сутки после инокуляции опухоли, ингибирование роста опухоли составляет 20-25% (рис. 16 В).
Рисунок 16. Ингибирование глабрухиноном А роста солидной карциномы Эрлиха in vivo.
Кроме измерений опухоли, проводили также наблюдение этим же методом за состоянием печени, селезенки и тимуса при жизни мышей, и не было обнаружено никаких значительных отклонений в размерах, виде, общем состоянии этих иммунокомпетентных органов у мышей, обработанных глабрухиноном А по сравнению с контрольными необработанными мышами. Эти результаты свидетельствуют, что даже относительно высокие дозы глабрухинона А не имеют отрицательного эффекта на иммунную систему мышей.
Таким образом, изученные полипренилированные 1,4-бензохиноны и гидрохиноны обладают некоторым потенциалом в качестве канцерпревентивных веществ, а также демонстрируют противоопухолевые свойства in vivo. Эти вещества вызывают р53независимый апопотоз опухолевых клеток и являются эффективными активаторами ядерных транскрипционных факторов АР-1 и NF-B. Наиболее активные из них, по нашему мнению, могут быть применены в этом качестве при исследованиях в области клеточной молекулярной биологии. Принимая во внимание, что изученные полипренилхиноны предупреждают злокачественное перерождение эпидермальных JB6 клеток и проявляют наибольшую активность против клеток рака кожи человека SK-MEL-28 (меланома), мы предполагаем, что некоторые из изученных хинонов могут быть использованы непосредственно или в качестве моделей для синтеза на их основе канцерпревентивных веществ, активных в отношении рака кожи человека.
5. Противоопухолевые свойства и механизм действия морского двухголового сфинголипида ризохалина, его производных и аналогов Сфинголипиды привлекают внимание как противоопухолевые вещества из-за их способности регулировать процессы клеточного роста, дифференциации и апоптоза.
Эти вещества находятся в клеточных мембранах эукариотических организмов, в том числе морских беспозвоночных, которые являются богатым источником сфинголипидов и сфинголипид-подобных соединений, различающихся структурами и биологической активностью.
Со времени выделения в нашей лаборатории в 1989 году необычного двухголового (биполярного) сфинголипида ризохалина (76) было обнаружено несколько его природных аналогов. До настоящего времени эти редкие природные соединения были найдены только в морских губках. Двухголовые сфинголипиды отличаются от классических сфинголипидов ,-положением фрагментов, сходных по строению с полярными концевыми группами сфингоидных оснований. Часто они содержат терминальные метильные группы вместо гидроксиметильных. Известно, что ризохалин и его аналоги обладают противомикробной и противогрибковой активностями, а также являются ДНК-повреждающими агентами и могут ингибировать протеин киназу С и блокировать биосинтез фитосфинголипидов.
Мы изучили канцерпревентивную, апоптоз-индуцирующую и цитотоксическую активности ризохалина (76) и его аналогов и производных (77-82), а также некоторые детали молекулярного механизма действия этих веществ.
RNHR R5-H2C CHNHR4 O OROH OH O Ризохалин R1 = R2 = R3 = R4 = R5 =H O HO OH OAcOAc O R2 = R3 = R4 = Ac R5 =H Перацетат ризохалина R1 = O AcO OAc Агликон ризохалина (ризохалинин) R1 = OH R2 = R3 = R4 = R5 =H Перацетат агликона ризохалина R1 = OAc R2 = R3 = R4 = Ac 79 R5 =H O Ризохалинин А R1 = OH R2 = O CH3 R3 = R4 = R5=H Ризохалинин С R1 = R5 = OH 81 R2 = R3 = R4 = H OH OH OH O OH O HO OH H3C NH2 OMe HN Оцеаналин А Канцерпревентивные и цитотоксические свойства ризохалина, его производных и аналогов. Полученные нами результаты показывают, что ризохалин демонстрирует потенциальные канцерпревентивные свойства уже при концентрациях 5-10 мкМ. Так, 50%-ное инигибирование EGF-индуцированного колонеобразования JB6 Cl41 P+ клеток достигается при концентрации ризохалина INCC50 = 8.6 мкМ. Похожие эффекты наблюдались в экспериментах, в которых ризохалин или его агликон ингибировали колонеобразование нескольких линий опухолевых клеток в мягком агаре. К примеру, INCC50 для ингибирования ризохалином колонеобразования HeLa или THP-1 клеток, составили 12.6 или 5.4 мкМ соответственно. Агликон ризохалина (78) ингибировал колонеобразование SNU-C4 клеток при значительно меньших концентрациях, его INCC50 = 1.7 мкМ. Напротив, один из аналогов ризохалина, оцеаналин А (82), будучи протестирован в экспериментах с мягким агаром, не ингибировал ни злокачественную трансформацию JB6 Cl41 P+ клеток, ни колонеобразование раковых HeLa или THP-клеток вплоть до концентрации 20 мкМ.
Агликон ризохалина (78) имеет свободные гидроксильные группы на - и - концах молекулы, в то время как исходный ризохалин (76) - только на -конце. В случае же оцеаналина А, -конец молекулы имеет тетрагидроизохинолиновое строение, в отличие от вицинального аминоспирта в ризохалине. По-видимому, этим и обусловлен тот факт, что по своей канцерпревентивной активности эти три вещества могут быть записаны в виде ряда: агликон ризохалина (78) > ризохалин (76) >оцеаналин А (82).
Была изучена цитотоксическая активность ризохалина, а также его производных и аналогов по отношению к JB6 Cl41 P+, HeLa, HL-60 или THP-1 клеткам. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 4. После сравнения полученных данных с результатами экспериментов на канцерпревентивную активность был сделан вывод о том, что ризохалин демонстрирует канцерпревентивные свойства против HeLa или THP-1 клеток в малоцитотоксических концентрациях. В случае JB6 Cl41 P+ клеток активные концентрации ризохалина приблизительно одинаковы в экспериментах на канцерпревентивную и цитотоксическую активности.
Также как и в экспериментах по канцерпервентивной активности, наибольшую цитотоксическую активность проявил агликон ризохалина (78), а также его аналоги, ризохалинины А и С (80 и 81), являющиеся агликонами ризохалинов А и С.
Наименьшую же активность показали перацетат ризохалина (77), оцеаналин А (82) и перацетат агликона ризохалина (79), расположенные здесь в порядке убывания цитотоксической активности.
Таблица 4. Цитотоксическая активность (IC50, мкМ) соединений 76-82.
Соединение JB6 P+ Cl 41 HeLa HL-60 THP-Ризохалин (76) 8.8 22.1 14.4 13.Перацетат ризохалина (77) н/и* н/и * 29.2 26.Агликон ризохалина (78) 2.8 8.5 3.8 3.Перацетат агликона ризохалина (79) 63.>30 >30 >Ризохалинин A (80) н/и* н/и* н/и* 7.Ризохалинин C (81) н/и* н/и* н/и* 6.Оцеаналин А (82) 27.9 н/и* н/и* 44.н.и* - цитотоксическая активность не изучалась В наименее активных соединениях (77, 79, 82), по сравнению с наиболее активными агликонами (78, 80, 81), гидроксильные группы на ,-концах молекул либо гликозилированы, либо ацетилированы, либо, как в оцеаналине А, -конец молекулы не содержит вицинального аминоспирта. Вероятно, гидроксильные группы на - и концах молекул играют важную роль в ингибировании клоногенного эффекта опухолевых промоторов ризохалином, его производными и аналогами.
MTS метод и доминант-негативно-мутантные (DNM) JB6 Cl41 клетки были использованы для изучения влияния ризохалина и его аналогов на основные MAPкиназные (ERKs, JNKs, и p38) сигнальные пути в JB6 Cl41 клетках. Показано, что ризохалин (рис. 17 А) и оцеаналин А (рис. 17 Б) проявили значительно большую цитотоксическую активность по отношению к JB6 Cl41 DN-ERK2 или JB6 Cl41 DNJNK1 клеткам, чем к JB6 Cl41 DN-p38 или к исходным, немутантным JB6 Cl41 клеткам.
Кроме того, JB6 Cl41 DN-p38 и JB6 Cl41 P+ клетки показали примерно одинаковую чувствительность к действию ризохалина (рис. 17 A); эти же выводы можно сделать и по отношению к оцеаналину А (рис. 17 Б).
11Б A 11JB6 P+ Cl JB6 Cl 41 DN-pJB6 Cl 41 DN-ERK* * JB6 Cl 41 DN-JNK20 * * * 0 3.75 7.5 15 18.75 37.Концентрация оцеаналина А, мкМ Концентрация ризохалина, мкМ Рисунок 17. Цитотоксическая активность ризохалина (А) и оцеаналина А (Б) по отношению к различным JB6 Cl41 DNM клеткам, а также исходным JB6 Cl41 Р+ клеткам.
Полученные результаты показывают, что по всей вероятности, JNK и ERK сигнальные пути участвуют в ответе JB6 Cl41 клеток на воздействие ризохалина или оцеаналина.
Индукция ризохалином, его производными и аналогами апоптоза опухолевых клеток человека. Методом проточной цитометрии было установлено, что ризохалин вызывает дозозависимый апоптоз HL-60 или THP-1 клеток с IAC50 (концентрация, вызывающая апоптоз 50% экспериментальных клеток) 19.4 или 6.5 мкМ соответственно. Таким образом, ризохалин проявляет избирательность по отношению к некоторым опухолевым клеткам и является в три раза более сильным индуктором апоптоза в клетках моноцитарной лейкемии человека THP-1, чем в клетках промиелоцитарной лейкемии HL-60. Агликон ризохалина (82) является наиболее активным среди исследованных соединений (IAC50 = 6.0 мкМ), а перацетат агликона ризохалина (83) - наименее активным (IAC50 = 62.0 мкМ). Перацетат ризохалина (81) в этих экспериментах показал примерно такую же активность (IAC50 = 19.2 мкМ), как и ризохалин (IAC50 = 19.4 мкМ).
С помощью метода проточной цитометрии мы оценили количество HL-60 клеток, находящихся в фазе суб-G1 после воздействия на них агликонов ризохалина (82) и ризохалина А (84) в концентрации 10 мкМ. Появление суб-диплоидного ДНК пика (суб-G1 пик) является специфическим маркером апоптоза; некроз, индуцируемый цитотоксическими веществами или лизис клеток, производимый комплементом, не приводят к появлению суб-G1 пика на ДНК гистограмме. Было показано, что количество суб G1 клеток, по сравнению с контрольными, необработанными клетками, возросло после воздействия агликона ризохалина в 24 раза, а после действия агликона в % от контроля Число живых клеток, ризохалина А - в 26 раз, что является дополнительным подтверждением индукции апоптоза агликонами ризохалина (82) и ризохалина А (84) в HL-60 клетках лейкемии человека.
Методом вестерн блоттинга было показано, что ризохалин (80), а также агликоны ризохалина (82) и ризохалина А (84) в концентрации 10 мкМ вызывают активирование каспаз-8, 9, 3 и про-апоптотических белков PARP и Bid (рис. 18). Следовательно, ризохалин, его производные и аналоги вызывают апоптоз опухолевых клеток человека, в котором участвуют оба каспаза-зависимых пути: митохондриальный путь (через каспазу-8) и путь через рецепторы смерти (участвует каспаза-9).
(КДа) А Б В Г Д Е Прокаспаза- 18 Каспаза- Прокаспаза- 32 Каспаза- Прокаспаза- Каспаза- 1PARP Bid - А ктин Рисунок 18. Влияние ризохалина (Б), агликона ризохалина (В), перацетата ризохалина (Г), перацетата агликона ризохалина (Д) и агликона ризохалина А (Е) на внутриклеточные уровни каспаз-8, 9, 3 и проапоптотических белков PARP и Bid в лейкемических HL-60 клетках человека. (А) - контрольные, необработанные клетки.
Индукция ризохалином и его агликоном базовой р53-зависимой транскрипционной активности в JB6 Cl41 клетках. Для того чтобы выяснить возможный механизм канцерпревентивнго действия ризохалина и его аналогов, был исследован эффект ризохалина (80) и его агликона (82) на p53-зависимую транскрипционную активность в JB6 Cl41 p53 клетках (рис. 19A, В). Кроме p53зависимой транскрипционной активности, было также изучено действие ризохалина (80) и его агликона (82) на жизнеспособность JB6 Cl41 p53 клеток (рис. 19Б, Г). В результате экспериментов было показано, что ризохалин (рис. 19A) или агликон ризохалина (рис. 19В) в концентрациях 5-10 или 1.25-2.5 мкМ, соответственно, дозо- и время-зависимым образом индуцируют p53-зависимую транскрипционную активность в JB6 Cl41 клетках. Таким образом, наши результаты показывают, что ризохалин (80) и его аналоги (81-86) представляют собой новую группу морских вторичных метаболитов, перспективных в качестве противоопухолевых и канцерпревентивных веществ. Канцерпревентивные эффекты ризохалина, его производных и аналогов могут объясняться, по крайней мере отчасти, индукцией в раковых клетках p53-зависимого апоптоза. Показано также, что по всей вероятности, JNK и ERK сигнальные пути участвуют в ответе JB6 Cl41 клеток на воздействие ризохалина и его аналогов.
180 1* Б A 160 1* 6 ч * 140 124 ч 120 1100 1* 80 6 ч 60 * 24 ч 40 * 20 * 0 0 2.5 5 10 0 2.5 5 10 Концентрация ризохалина, мкМ Концентрация ризохалина, мкМ * 11Г В * 6 ч 1124 ч 11116 ч * 24 ч * 40 * 20 * * * 0 1.25 2.5 5 10 0 1.25 2.5 5 Концентрация агликона ризохалина, мкМ Концентрация агликона ризохалина, мкМ Рисунок 19. Индукция ризохалином (A) или агликоном ризохалина (В) базовой p53зависимой транскрипционной активности в JB6 Cl41 p53 клетках. Воздействие ризохалина (Б) или агликона ризохалина (Г) на жизнеспособность JB6 Cl41 p53 клеток после 6 или 24 часов инкубирования с веществами.
6. Противоопухолевая активность и механизм действия актинопорина RTX-A из актинии Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus) В 2002 году из тропической актинии Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus) сотрудниками лаборатории химии пептидов ТИБОХ были выделены три изоформы пептидных токсинов актинопоринов, RTX-A, RTX-S, и RTX-G. Были установлены их мощная гемолитическая активность и ингибирование этой активности сфингомиелином.
Мы установили, что RTX-А в экстремально низких концентрациях защищает клетки от действия опухолевых промоторов, продемонстрировали его апоптоз-индуцирующий и цитотоксичекий эффекты по отношению к нескольким линиям опухолевых клеток человека, а также изучили некоторые детали молекулярного механизма противоопухолевого действия этого полипептида.
Канцерпревентивная и цитотоксическая активности актнопорина RTX-A.
Исследование канцерпревентивных свойств RTX-A было проведено с использованием мышиных эпидермальных JB6 Cl41 P+ клеток, опухолевых клеток человека HeLa и метода мягкого агара при их обработке EGF. Наши эксперименты показали, что RTX-A предотвращает EGF-индуцированную опухолевую трансформацию JB6 Cl41 P+ клеток и ингибирует колонеобразование раковых клеток HeLa в мягком агаре с INCC50 = 0.0нМ и 0.057 нМ соответственно. Эти концентрации, соответственно, в 17 и 50 раз меньше цитотоксических (табл. 5).
в % от контроля Число живых клеток, pактивность, в % от контроля в % от контроля Число живых клеток, p53зависимая транскрипционная зависимая транскрипционная активность, в % от контроля Таблица 5. IC50 и INCC50 RTX-A по отношению к нормальным мышиным JB6 ClP+ клеткам, а также HeLa, THP-1, SNU-C4, MDA-MB-231 и HL-60 опухолевым клеткам человека.
Клеточная линия IC50, нМ INCC50,нМ HeLa 2.26 0.0THP-1 1.SNU-C4 4.MDA-MB-231 4.HL-60 1.JB6 Cl41 P+ 0.57 0.0RTX-A демонстрирует мощную цитотоксическую активность (IC50 = 1-5 нМ) по отношению к опухолевым HeLa, THP-1, SNU-C4, MDA-MB-231и HL-60 клеткам человека (табл. 5).
Проапоптотическая активность актинопорина RTX-A. Эксперименты с использованием проточной цитометрии показали, что RTX-A индуцирует апоптоз в JB6 Cl41 P+ клетках. Так, после обработки клеток этим актинопорином в концентрациях от 0.125 до 1 нМ в течение 24 часов, был зафиксирован апоптоз клеток, зависимый от концентрации RTX-A. Результаты отражены на рис. 24 в виде процентного содержания клеток, находящихся в раннем (нижний правый квадрант) и позднем (верхний правый квадрант) апоптозе (рис. 20).
0.125 нМ 0.5 нМ 1.0 нМ 0.25 нМ Контроль 1.5% 1.9% 3.8% 18.3% 13.7% 32.2% 26.0% 15.0% 23.5% 62.2% 95.0% 68.6% 1.6% 2.7% 1.9%76.0% 1.1%43.2% 1.1%10.7% Aннексин V-FITC Рисунок 20. Индукция RTX-А апоптоза в JB6 Cl41 P+ клетках. Здесь и в последующих рисунках этого типа ранний апоптоз показан в нижних правых квадрантах; поздний - в верхних правых.
Влияние актинопорина RTX-A на АР-1-, NF- и р53-зависимую B- транскрипционную активность в JB6 Cl41 клетках. Для того чтобы изучить возможный механизм противоопухолевого действия актинопорина, были исследованы эффекты RTX-A на базовую АР-1-, NF-B- и р53-зависимую транскрипционную активность, а также на жизнеспособность в соответствующих JB6 Cl41 клетках через и 24 часа инкубирования клеток с RTX-A. Наши результаты демонстрируют, что RTXA в концентрациях 0.1-1.6 нМ время- и дозозависимым образом ингибирует базовую AP-1, NF-B, и р53-зависимые транскрипционные активности в JB6 Cl41 клетках, указывая на то, что апоптоз, индуцируемый RTX-A в JB6 Cl41 клетках, может не зависеть от р53 ядерного фактора. Этим можно объяснить тот факт, что RTX-A в таких малых концентрациях (1нМ) демонстрирует цитотоксическую активность по отношению к р53-дефицитным лейкемическим THP-1 и HL-60 клеткам человека.
На основании полученных экспериментальных данных можно сделать заключение, что канцерпревентивная и противоопухолевая активности RTX-A могут быть объяснены, по крайней мере частично, индукцией р53-независимого апоптоза и PI ингибированием активности онкогенных АР-1 и NF-B ядерных факторов транскрипции.
7. Противоопухолевая активность и механизм действия 5-гидрокси-7-проп-2ен-(Е)-илиден-7,7а-дигидро-2Н-циклопента[b]пиран-6-она (диосфенола) из асцидии Diplosoma sp.
5-Гидрокси-7-проп-2-ен-(Е)-илиден-7,7а-дигидро-2Н-циклопента[b]пиран-6-он (диосфенол, 87), выделенный в лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ, относится к классу С11 циклопентенонов и известен как природное соединение, обладающее антимикробными и цитотоксическими свойствами.
HO O O Однако его канцерпревентивное действие не было ранее исследовано. Нами были изучены канцерпревентивные и проапоптотические свойства диосфенола (87), а также его воздействие на основные МАРК-сигнальные пути в JB6 Cl41 клетках.
Канцерпревентивная и цитотоксическая активности диосфенола. Результаты исследования канцерпревентивной активности приведены на рис. 21 А (снимки колоний трансформированных JB6 Cl41 P+ клеток) и Б (зависимость количества колоний трансформированных JB6 Cl41 P+ клеток от концентрации диосфенола (87)).
Наши эксперименты показали, что 87 на 50% ингибирует EGF-индуцированную опухолевую трансформацию JB6 Cl41 P+ клеток в мягком агаре уже при INCC50 = 6.мкМ (рис. 21 А, Б). Эта концентрация в 3 раза меньше цитотоксической, IC50 = 21.мкМ (рис. 21 В).
Индукция апоптоза диосфенолом в опухолевых клетках человека. Мы показали, что диосфенол в пределах концентраций 5-50 мкМ индуцирует дозозависимый апоптоз в клетках лейкемии человека HL-60 и THP-1. Уже при концентрации диосфенола мкМ и времени его инкубирования с клетками равном 24 час около 40% HL-60 клеток находились в состоянии апоптоза, из них только около 10% клеток показывали ранний апоптоз. Как показали дальнейшие эксперименты, для достижения примерно такого же, в количественном отношении, апоптоза в ТНР-1 клетках, их необходимо было обработать 30 мкМ диосфенола, при этом большинство клеток находились в состоянии раннего апоптоза. Таким образом, диосфенол является гораздо более сильным индуктором апоптоза по отношению к HL-60, чем к THP-1 клеткам лейкемии человека.
Для того, чтобы подтвердить индукцию апоптоза диосфенолом (87), было изучено его влияние на количество ТНР-1 клеток, находящихся в фазе суб-G1. Появление субдиплоидного ДНК пика (суб-G1 пик) на ДНК гистограмме является характерным признаком апоптоза и дает возможность отличить его от некроза. В наших экспериментах было показано, что обработка диосфенолом в концентрациях 25 или мкМ приводит к увеличению количества ТНР-1 клеток в фазе sub-G1 в 2 или в 5 раз, соответственно, по сравнению с контрольными, ничем не обработанными клетками (рис. 22). В качестве положительного контроля были использованы ТНР-1 клетки, обработанные ДМСО в концентрации 50 мкл на 1 мл среды.
А EGF 0 10 нМ 10 нМ 10 нМ 10 нМ Диосфенол 0 1 мкМ 5 мкМ 10 мкМ В Б JB6 Cl41 P+ 120 111* 140 * * EGF, нМ 0.0 10.0 10.0 10.0 10.3.75 7.5 15 Диосфенол, мкМ 0.0 1.0 5.0 10.Концентрация диосфенола, мкМ Рисунок 21. Ингибирование диосфенолом EGF-индуцированной опухолевой трансформации JB6 Cl41 P+ клеток в мягком агаре (А, Б). Ингибирование диосфенолом жизнеспособности JB6 Cl41 P+ клеток (В).
Диосфенол, мкМ Контроль ДМСО Контроль 12.5 25 12.5 25 12.5 25 12.5 25 Суб-G1 Суб-GСуб-GСуб-GСуб-GPI Рисунок 22. Индукция диосфенолом популяции суб-G1 ТНР-1 клеток.
Роль MAPK сигнальных путей в цитотоксическом действии, индуцированном диосфенолом. Для изучения роли основных MAP киназ в опосредовании цитотоксического действия диосфенола были использованы доминант-негативномутантные (DNM) JB6 Cl41 клетки и MTS метод. Клетки обработали диосфенолом в пределах концентраций от 3 до 30 мкМ. Полученные результаты показали, что в концентрациях от 7.5 до 15 мкМ диосфенол проявляет значительно более сильную цитотоксическую активность по отношению к JB6 Cl41 DNM-p38 или JB6 Cl41 DNMJNK1 клеткам, чем к JB6 Cl41 DNM-ERK2 или к исходным, немутантным JB6 Clклеткам, показавшим примерно одинаковую чувствительность к действию диосфенола.
Таким образом, полученные нами результаты показывают, что: 1) диосфенол обладает канцерпревентивной активностью в субцитотоксических концентрациях; 2) канцерпревентивное и противоопухолевое действие диосфенола обусловлено индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках; 3) по всей вероятности, МАРК JNK и р38 сигнальные пути участвуют в ответе клеток на воздействие диосфенола.
Счет, относит.
единицы 8. Канцерпревентивная и противоопухолевая активности и механизм действия некоторых тритерпеновых гликозидов из голотурий Голотурии или морские огурцы традиционно используются в качестве пищи в юговосточной Азии, а в последние годы в США, России и других странах. Эти беспозвоночные содержат в больших количествах тритерпеновые гликозиды, обладающие широким спектром биологических активностей, в том числе противоопухолевой активностью. Активность этих веществ, взятых в дозах от десятых долей микрограмма до нескольких микрограммов в миллилитре, направленная против различных видов раковых клеток, описана в большом числе научных статей, однако канцерпревентивная активность гликозидов из голотурий до сих пор не была изучена.
Мы изучили канцерпревентивную и противоопухолевую активности in vitro, а также механизм действия некоторых тритерпеновых гликозидов, выделенных в лаборатории химии морских природных соединений из голотурий семейств Cucumariidae, Stichopodidae, Psolidae, Holothuriidae и Synaptidae.
O O RO O OH O 88 (FrA): R1=OMe; R2=CH2OH; R3=H; R4=OSO3Na; R5=OAc O R89 (A2-2): R1=OMe; R2=R3=CH2OH; R4=OSO3Na; R5=O; 25, R2 R3 CH3 O 93 (A2-2DS): R1=OMe; R2=R3=CH2OH; R4 = OH; R5=O; 25, O O O OH R1 O O O 94 (AglA2-2): R5=O; 25, HO HO 95 (A4-2): R1=OH; R2=R3=CH2OH; R4=OSO3Na; R5=O; 25, O O OH OH 96 (A6-2): R1=OMe; R2=CH2OSO3Na; R3=CH2OH; R4=OSO3Na; R5=O; 25,26 O O OH OH 97 (A7-1): R1=OMe; R2=R3=CH2OSO3Na; R4=OSO3Na; R5=O; 25, HO HO OH O CH2OSO3Na CH2OSO3Na CH92 (PSA) O O O O O O OMe OH O HO HO OAc OH OH OH O O O O OH OAc RO R3 R2 HOH2C O O O O CH2OH CH2OH O OMe OH O O O O O OMe OH O 90 (STC): R = CHHO HO OH OH OH 91 (STD): R = CH2OH HO HO OH OH O CH2OH R 98 (OkhB1): R1 = OSO3Na; R2 = CH2OH; R3 = CH2OH O O O 99 (OkhB2): R1 = OSO3Na; R2 = CH2OSO3Na; R3 = CH2OH O OMe OH O 100 (OkhB3): R1 = OH; R2 = CH2OSO3Na; R3 = CH2OSO3Na HO HO OH OH OH O O R1 O O O RR O O CH2OH CH2OH CH2OSO3Na O O O O O O OH OMe OH O O OH HO HO HO OH OH OH 103 (HtxA1): R1=H; R2=O; R3=H; 25, O CH2OH COONa CH2OH CH3 101 (SynA): 7,8; R=H R3 CH3 O 104 (oh): R1=OH; R2=H; R3=CH2OH O O O O O O 105 (oh): R1=H; R2=H; R3=CH2OH 102 (SynA1): 8,9, R=O O O OMe OH OMe OH O O HO HO HO HO OH OH OH OH OH OH Канцерпревентивная и цитотоксическая активности некоторых тритерпеновых гликозидов. Канцерпревентивный эффект фрондозида А (FrA, 88) из Cucumaria frondosa, кукумариозида А2-2 (89) из Cucumaria japonica, стихопозидов С и D (STC и STD, 90 и 91) из Stichopus chloronotus, а также псолюсозида А (PSA, 92) из Psolus fabricii исследовали методом мягкого агара с использованием JB6 Cl41 P+ клеток, активированных с помощью EGF (10 нг/мл) или 12-О-тетрадеканоил-форбол13-ацетата (ТРА, 20 нг/мл). Было показано, что все исследуемые гликозиды в субмикромолярных дозах обладают канцерпревентивной активностью in vitro, которая зависит как от концентрации гликозида, так и от его химической структуры. Если сравнивать структуры FrA и A2-2, выделенных из голотурий семейства Cucumariidae, то более активный FrA (INCC50 = 591.9 нМ) отличается от менее активного A2-(INCC50 = 861.1 нМ) как по агликону, так и по углеводной части. При сравнении двух других исследуемых гликозидов, STC и STD, выделенных из Stichopus chloronotus, видно, что более активный STC (INCC50 = 73.6 нМ) отличается от менее активного STD (INCC50 = 300.3 нМ) лишь наличием в углеводной части остатка хиновозы вместо одного из остатков глюкозы. Пятый из исследованных гликозидов, псолюсозид А, выделенный из голотурии семейства Psolidae, показал INCC50 = 358.6 нМ.
Сравнение канцерпревентивной активности гликозидов с их цитотоксической активностью (табл. 5) по отношению к JB6 Cl41 P+ клеткам показывает, что канцерпревентивную активность все 5 упомянутых гликозидов проявляют в концентрациях, в которых цитотоксический эффект не значителен. Особенно можно выделить FrA и A2-2, для них действующие канцерпревентивные концентрации (INCC50) в 7 и в 4 раза, соответственно, меньше цитотоксических (IC50). Два из пяти гликозидов, а именно FrA и STD, были исследованы также на ингибирование трансформации JB6 Cl41 P+ клеток, индуцированной действием форболового эфира ТРА. В этих экспериментах FrA и STD на 100% ингибировали ТРА-индуцированную трансформацию JB6 Cl41 P+ клеток уже при концентрации INCC100 = 300 нМ. Таким образом, канцерпревентивная активность тритерпеновых гликозидов зависит не только от их структуры и концентрации, но и от природы промотора канцерогенеза.
Цитотоксическая активность по отношению к JB6 Cl41 P+ и к опухолевым клеткам HeLa была исследована для гликозидов 88-105, выделенных из голотурий семейств Cucumariidae, Stichopodidae, Psolidae, Holothuriidae и Synaptidae (табл. 5).
Общими выводами в части установления закономерностей в соотношении структура - активность исследуемых гликозидов, которые можно сделать из рассмотрения полученных данных, являются следующие: 1) канцерпревентивная и цитотоксическая активности гликозидов увеличивается при замене одного из остатков глюкозы на остаток ксилозы, например, активность STC (90) > STD (91); 2) чем больше сульфатных групп содержится в углеводной части молекулы гликозида, тем большую цитотоксическую активность он проявляет, например, активность уменьшается в ряду A7-1 (97) > A6-2 (96) > A2-2 (89) > A2-2DS (93); а также OkhB2 (99) или OkhB3 (100) > OkhB1 (98); 3) агликоны гликозидов на несколько порядков менее цитотоксичны, чем сами гликозиды (см. AglA2-2 (94) и A2-2 (89)); 4) гидроксилирование по 12-му положению в тритерпеновой части молекулы приводит к уменьшению цитотоксической активности гликозида, например активность BohB (105) > BohA (104); и 5) введение в положение 7 агликонной части молекулы карбонильной группы, сопряженной с 8(9)-двойной связью, вместо 7(8)-двойной связи, приводит к уменьшению цитотоксической активности гликозида, например активность SynA (101) > SynA1 (102).
Таблица 5. IC50 тритерпеновых гликозидов или их производных 88-105 по отношению к нормальным мышиным JB6 Cl41 P+ и опухолевым клеткам человека HeLa и HL-60.
Вещество № IC50, мкМ JB6 Cl41 P+ HeLa HL-FrA (88) 4.16 1.53 0.A2-2 (89) 3.53 -* 1.A2-2DS (93) 7.60 - AglA2-2 (94) 232.64 - A4-2 (95) - - 1.A6-2 (96) 1.90 - A7-1 (97) 1.27 - STC (90) 0.11 - 0.STD (91) 0.67 - 0.PSA (92) 0.57 - OkhB1 (98) - 24.20 OkhB2 (99) - 9.28 OkhB3 (100) - 12.67 SynA (101) - 6.12 SynA1 (102) - > 10 HtxA1 (103) 0.82 - BohA (104) 0.14 - BohB (105) 0.06 - * - не исследовали Проапоптотическая активность некоторых гликозидов из голотурий семейств Cucumariidae и Stichopodidae. Мы исследовали индукцию апоптоза гликозидами A2-(89), A4-2 (95), STC (90) и STD (91) в HL-60 опухолевых клетках человека методом проточной цитометрии. Клетки были обработаны соответствующими гликозидами в пределах концентраций от 100 до 1000 нМ. Наши эксперименты показали, что все гликозида после инкубирования с HL-60 клетками в течение 24 часов индуцируют в клетках дозозависимый апоптоз. Кукумариозиды A2-2, A4-2, а также стихопозид STD в концентрациях 500-1000 нМ вызывают апоптоз от 30 до 80% процентов клеток, в то время как более активный стихопозид STС уже при концентрации 100 нМ индуцирует запрограммированную гибель более 60% HL-60 клеток. Менее активный STD индуцирует апоптоз около 65% HL-60 клеток лишь в концентрации 1000 нМ.
0 1000 (нМ) 100 200 51.3% 35.5% 0.7% 61.6% 1.7% 5.6% 1.8% 3.9% 2.3% 9.8% 8.3% 1.9% 55.3% 82.3% 28.3% STC 37.4% 12.0% 59.6% 54.9% 35.8% 0.7% 35.1% 1.8% 3.8% 1.8% 3.9% 1.5% 2.9% 2.1% 2.4% STD 21.5% 73.3% 82.3% 84.0% 80.7% 21.1% 42.7% 12.0% 14.9% 11.5% Aннексин V-FITC Рисунок 23. Индукция апоптоза гликозидами STC (90) и STD (91) в ТНР-1 клетках лейкемии человека.
PI Кроме того, была показана индукция апоптоза стихопозидами STC и STD в лейкемических ТНР-1 клетках. И в этих экспериментах STC оказался более сильным индуктором апоптоза, чем STD (рис. 23).
Влияние тритерпеновых гликозидов FrA, STD и PSA на транскрипционную активность онкогенных АР-1 и NF- B ядерных факторов. Мы исследовали влияние трех из пяти гликозидов, для которых была показана канцерпревентивная активность (FrA (88), STD (91) и PSA (92)), на EGF и UVB-индуцированную транскрипционную активность онкогенного АР-1 ядерного фактора. Как следует из полученных результатов, два из трех исследованных гликозидов, FrA и STD, в концентрациях, хорошо согласующихся с концентрациями, в которых они проявляют канцерпревентивную активность, ингибируют транскрипционную активность АР-ядерного фактора. Так, фрондозид FrA в концентрациях 500-800 нМ ингибирует EGFиндуцированную транскрипционную активность АР-1 ядерного фактора на 34-51%, соответственно, а стихопозид STD в концентрации 300 нМ - на 57%. Точно также оба гликозида ингибируют UVB-индуцированную транскрипционную активность АР-ядерного фактора: FrA в концентрации 500 нМ - на 41%, а STD в концентрации 250 нМ - на 45%. В то же время псолюсозид PSA в этих экспериментах не активен вплоть до концентрации 500 нМ.
Было исследовано также влияние FrA, STD и PSA на EGF и UVB-индуцированную транскрипционную активность онкогенного NF-B ядерного фактора. Показано, что все 3 исследованных гликозида в концентрациях, в которых они проявили канцерпервентивную активность, ингибируют EGF-индуцированную транскрипционную активность NF-B ядерного фактора: FrA в концентрации 500 нМ - на 37%, STD в концентрации 500 нМ - на 36% и PSA в концентрациях 300-500 нМ - на 22-25%. В то же время, только два из исследованных гликозидов, (STD и PSA), ингибируют UVB-индуцированную активность ядерного фактора NF-B: STD в концентрации 500 нМ - на 46% и PSA в концентрации 600 нМ - на 49%. Таким образом, можно сделать вывод о том, что канцерпревентивная и противоопухолевая активность тритерпеновых гликозидов из голотурий могут быть объяснены, по крайней мере частично, индукцией апоптоза в трансформированных или опухолевых клетках и ингибированием онкогенных АР-1 и NF-B ядерных факторов транскрипции.
Исследованные гликозиды могут быть применены в качестве ингибиторов транскрипционной активности АР-1 и NF-B ядерных факторов при исследованиях в области клеточной молекулярной биологии, а также в качестве средств, стимулирующих апоптоз опухолевых клеток человека.
ВЫВОДЫ 1. Из спиртовых экстрактов морских беспозвоночных с использованием различных вариантов колоночной хроматографии, включая ВЭЖХ, выделено или получено в результате химических модификаций 44 новых и 12 ранее известных терпеноидов, сульфатированных полиоксистероидов и полипренил-1,4-бензохинонов. Их строение установлено физико-химическими и химическими методами. Обнаружено действие некоторых полиоксистероидов на клеточный кальциевый транспорт.
2. Исследованы химические превращения ряда новых терпеноидов и сульфатированных стероидов из офиур. Показано, что уникальный, имеющий два циклобутановых фрагмента сесквитерпеноид аплидактон перегруппировывается в кислотной среде в т.н. изоаплидактон, найдены условия превращения бициклического хамигранового сесквитерпеноида дактилона в моноциклические бизаболановые производные.
3. Изучены цитотоксические свойства полученных лично или сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН 62 морских природных соединений и их синтетических аналогов в отношении нескольких линий нормальных и опухолевых клеток. Найдены соединения с высокой цитотоксичностью в отношении использованных клеток (бромированные фаскаплизины, некоторые тритерпеновые гликозиды, радиантотоксин А).
4. Изучена способность большой серии морских природных соединений и их синтетических аналогов тормозить неопластическую трансформацию эпидермальных мышиных JB6 Cl41 P+ клеток, вызванную действием опухолевых промоторов, и/или колонеобразование в культурах опухолевых клеток. Найдено 27 соединений, в том числе терпеноиды, алкалоиды, биополярные липиды, полипептиды, обладающих канцерпревентивной активностью в опытах in vitro на этих клеточных моделях. Многие из них, в особенности дактилон, шеринины, радиантотоксины, тритерпеновые гликозиды, демонстрирует эту активность в малотоксичных или нецитотоксичных концентрациях.
5. С помощью проточной цитометрии, применения различных, в том числе генетически измененных клеточных линий, вестерн-блоттинга для определения внутриклеточных уровней фосфорилированных и нефосфорилированных форм различных белков и люциферазного метод определения транскрипционной активности р53, AP-1 или NF-B ядерных факторов изучены некоторые особенности молекулярных механизмов действия более 10 из изученных веществ. Показано, что эти механизмы включают подавление экспрессии циклина D3 и Cdk4 и блокирование клеточного цикла (дактилон), апоптоз (многие изученные вещества), ингибирование фосфорилирования Rb белка (дактилон), индукцию транскрипционной активности белка-супрессора опухолей р53 и/или ингибирование транскрипционной активности AP-1 и NF-B ядерных факторов (поликарипины, радиантотоксин А, ризохалины, левиускулозид G, тритерпеновые гликозиды), или, наоборот, значительное активирование транскрипционной активности AP-1 и NF-B ядерных факторов при отсутствии активирования белка-супрессора опухолей р53 (полипренилхиноны).
6. Показано, что в индуцировании биологических эффектов, вызванных некоторыми изученными веществами, участвует MAP киназы, в частности JNKs (поликарпин), ERKs (левиускулозид G), JNKs и ERKs (ризохалины), JNKs и р38 (диосфенол).
7. На основании полученных результатов сделаны обоснованные предположения о возможном применении некоторых из изученных соединений в качестве хемопревентивных противоопухолевых препаратов (полипренилхиноны, дактилон, некоторые тритерпеновые гликозиды) или в качестве биохимических инструментов при исследованиях в области клеточной молекулярной биологии (тритерпеновые гликозиды, полипренилхиноны, радиантотоксины).
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Левин В.С., Калинин В.И., Федоров С.Н., Смайли С. Структура тритерпеновых гликозидов и систематическое положение двух видов голотурий семейства Stichopodidae // Биология моря 1986. C.72-77.
2. Федоров С.Н., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Идентификация экдистероидов шестилучевых кораллов // Хим. природ. соедин. 1988. С.603-604.
3. Левина Э.В., Калиновский А.И., Стоник В.А., Федоров С.Н., Исаков В.В.
Стероидные соединения из офиур. I. Новый стероидный сульфат из Ophiura sarsi // Хим. природ. соедин. 1988. C. 375-379.
4. Федоров С.Н., Решетняк М.В., Щедрин А.П., Ильин С.Г., Стручков Ю.Т., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Новый галогенированный хамиграновый сесквитерпеноид из моллюска Aplysia sp. Структура и абсолютная конфигурация // Докл. АН СССР. 1989.
Т. 305. C. 877-879.
5. Левина Э.В., Федоров С.Н., Стоник В.А., Андриященко П.В., Калиновский А.И., Исаков В.В. Стероидные соединения из офиур. II. Сульфатированные стероиды из Ophiura sarsi и Ophiura leptoctenia // Хим. природ. соедин. 1990. С.483-487.
6. Fedorov S.N., Levina E.V., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Sulfated steroids from Pacific brittle stars Ophiopholis aculeata, Ophiura sarsi and Stegophiura brachiactis // J. Nat. Prod. 1994. V. 57. P.1631-1637.
7. Сова В.В., Левина Э.В., Андриященко П.В., Федоров С.Н., Елякова Л.Н.
Действие полиоксистероидов из морских звезд и офиур на активность -1,3-глюканаз // Хим. природ. соедин. 1994. С.647-650.
8. Aminin D.L., Agafonova I.G., Fedorov S.N. Biological activity of disulfated polyhydroxysteroids from the pacific brittle star Ophiopholis aculeata. // Comp. Biochem.
Physiol. 1995. V. 112C. P. 201-204.
9. Agafonova I.G., Aminin D.L., Shubina L.K., Fedorov S.N. Influence of polyhydroxysteroids from pacific brittle star on cytosolic calcium oscillation in cells // In Biodiversity and allelopathy: from organisms to ecosystems in the Pacific. Chou C.H., Waller G.R., Reinhardt C. (Eds). Taipei, Academia Sinica. 1999. P. 205-214.
10. Fedorov S.N., Shubina L.K., Kalinovsky A.I., Lyakhova E.G., Stonik V.A. Structure and absolute configuration of a new rearrannged chamigran-type sesquiterpenoid from the sea hare Aplysia sp. // Tetrahedron Lett. 2000. V. 41. P. 1979-1982.
11. Fedorov S.N., Radchenko O.S., Shubina L.K., Kalinovsky A.I., GerasimenkoA.V., Popov D.Y., Stonik V.A. Aplydactone, a new sesquiterpenoid with an unprecedented carbon skeleton from the sea hare Aplysia dactylomela, and its Cargill-like rearrangement // J. Am.
Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 504-505.
12. Agafonova I.G., Aminin D.L., Shubina L.K., and Fedorov S.N. Influence of polyhydroxysteroids on [Ca2+]I // Steroids 2002. V. 67. P. 695-701.
13. Ляхова Е.Г., Федоров С.Н., Шубина Л.К., Радченко О.С., Калиновский А.И., Дмитренок П.С., Стоник В.А. Химические свойства морских терпеноидов. 1.
Некоторые реакции (6S,10R)-10-бромо-3,11,11-триметил-метилиденспиро[5,5]ундец-2ен-4-она, сесквитерпеноида из морского зайца Aplysia dactylomela // Изв. АН Сер. Хим.
2003. С. 970-974.
14. Fedorov S.N., Bode A.M., Stonik V.A., Gorshkova I.A., Schmid P.C., Radchenko O.S., Berdishev E.V., Dong Z. Marine alkaloid polycarpine and its synthetic derivative dimethylpolycarpine induce apoptosis in JB6 cells through p53- and caspase 3- dependent pathways // Pharm. Res. 2004. V. 21. P. 2307- 2319.
15. Shubina L.K., Fedorov S.N., Radchenko O.S., Balaneva N.N., Kolesnikova S.A., Dmitrenok, P.S., Bode A.M., Dong Z., Stonik V.A. Desmethylubiquinone Q2 from the FarEastern ascidian Aplidium glabrum: structure and synthesis // Tetrahedron Lett. 2005. V. 46.
P. 559-562.
16. Fedorov S.N., Radchenko O.S., Shubina L.K., Balaneva N.N., Bode A.M., Stonik V.A, Dong Z. Evaluation of cancer-preventive activity and structure-activity relationships of 3-demethylubiquinone Q2, isolated from the ascidian Aplidium glabrum, and its synthetic analogs // Pharm. Res. 2006. V. 23. P. 70-81.
17. Kolesnikova S.A., Kalinovsky A.I., Fedorov S.N., Shubina L.K., Stonik V.A.
Diterpenes from the Far-Eastern brown alga Dictyota dichotoma // Phytochemistry 2006. V.
67. P. 2115-2119.
18. Fedorov S.N., Shubina L.K., Bode A.M., Stonik V.A, Dong Z. Dactylone inhibits epidermal growth factor-induced transformation and phenotype expression of human cancer cells and induces G1-S arrest and apoptosis // Cancer Res. 2007. V. 67. P. 5914-5920.
19. Шубина Л.К., Федоров С.Н., Калиновский А.И., Дмитренок А.С., Джин Д.О., Сонг М.Г., Квак Д.Й., Стоник В.А.. Четыре новых хамиграновых сесквитерпеноида из заднежаберного моллюска Aplysia dactylomela // Изв. АН Сер. Хим. 2007. C. 2037-2042.
20. Smetanina O.F., Kalinovsky A.I., Khudyakova Y.V., Pivkin M.V., Dmitrenok P.S., Fedorov S.N., Ji H., Kwak J.Y., Kuznetsova T.A. Indole alkaloids produced by a marine fungus isolate of Penicillium janthinellum Biourge // J. Nat. Prod. 2007 V. 70. P. 906-909.
21. Zhidkov M.E., Baranova O.V., Balaneva N.N., Fedorov S.N., Radchenko O.S., Dubovitskii S.V. The first syntheses of 3-bromofascaplysin, 10-bromofascaplysin and 3,10dibromofascaplysin - marine alkaloids from Fascaplysinopsis reticulata and Didemnum sp.
by application of a simple and effective approach to the pyrido[1,2-a:3,4-bТ]diindole system // Tetrahedron Lett. 2007. V. 48. P. 7998-8000.
22. Макарьева Т.Н., Захаренко A.M., Денисенко В.A., Дмитренок П.С., Гузий A.Г., Шубина Л.К., Kaпустина И.И., Федоров С.Н. Ризохалинин A, новый антилейкемический двухголовый сфинголипид из губки Rhizochalina incrustata // Хим.
природ. соедин. 2007. С. 385-386.
23. Fedorov S.N., Shubina L.K., Kicha A.A., Ivanchina N.V., Kwak J.Y., Jin J.O., Bode A.M., Dong Z., Stonik V.A. Proapoptotic and anticarcinogenic activities of leviusculoside G from the starfish Henricia leviuscula and probable molecular mechanism // Nat. Prod.
Commun. 2008. V. 3. P. 1575-1580.
24. Fedorov S.N., Radchenko O.S., Shubina L.K., Balaneva N.N., Agafonova I.G., Bode A.M., Jin J.O., Kwak, J.Y., Dong Z., Stonik V.A. Anticancer activity of 3demethylubiquinone Q2. In vivo experiments and probable mechanism of action // Anticancer Res. 2008. V. 28. P. 927-932.
25. Avilov S.A., Silchenko A.S., Antonov A.S., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Smirnov A.V., Dmitrenok P.S., Evtushenko E.V., Fedorov S.N., Savina A.S., Shubina L.K., Stonik V.A. Synaptosides A and A(1), triterpene glycosides from the sea cucumber Synapta maculata containing 3-O-methylglucuronic acid and their cytotoxic activity against tumor cells // J. Nat. Prod. 2008. V. 71. P. 525-531.
26. Silchenko A.S., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Fedorov S.N., Stepanov V.G., Dong Z., Stonik V.A. Constituents of the sea cucumber Cucumaria okhotensis. Structures of okhotosides B1-B3 and cytotoxic activities of some glycosides from this species // J. Nat. Prod. 2008. V. 71. P. 351-356.
27. Jin J.-O., Shastina V., Park J.-I., Han J.-Y., Makarieva T., Fedorov S., Rasskazov V., Stonik V., Kwak J.-Y. Differential induction of apoptosis of leukemic cells by rhizochalin, two headed sphingolipid from sponge and its derivatives // Biol. Pharm. Bull. 2009. V. 32. P.
955-962.
28. Jin J.-O., Shastina V.V., Shin S.-W., Xu Q., Park J.-I., Rasskazov V.A., Avilov SA., Fedorov S.N., Stonik V.A., Kwak J.-Y. Differential effects of triterpene glycosides, frondoside A and cucumarioside A2-2 isolated from sea cucumbers on caspase activation and apoptosis of human leukemia cells // FEBS Lett. 2009. V. 583. P. 697-702.
29. Федоров С.Н., Шубина Л.К., Капустина И. И., Авилов С.А., Стоник В.А., Шастина В.В., Квак Я.Й., Парк Д.И., Квон Я.Х. Средство, стимулирующее апоптоз клеток лейкемии человека // Патент на изобретение № 2360692.
Зарегистрировано 10 июля 2009г. Заявка №2007148013. Приоритет изобретения 21 декабря 2007 г.
30. Fedorov S.N., Makarieva T.N., Guzii A.G., Shubina L.K., Kwak J.-Y., Stonik V.A.
Marine two-headed sphingolipidЦlike compound rhizochalin inhibits EGF-induced transformation of JB6 P+ Cl 41 cells // Lipids. 2009. V. 44. P. 777-785.
31. Fedorov S.N., Dyshlovoy S.A., Monastyrnaya M.M., Shubina L.K., Leychenko E.V., Kozlovskaya E.P., Jin J.-O., Kwak J.-Y., Bode A.M., Dong Z., Stonik V.A. The anticancer effects of actinoporin RTX-A from the sea anemone Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus) // Toxicon. 2010. V. 55. P. 811-817.
32. Stonik V.A., Fedorov S.N. Cancer preventive marine natural products // In Cellular and Genetic Practices for Translational Medicine. J.-Y. Kwak and J.-Y. Han (Eds). Kerala, India. 2011. P. 133-168.
33. Федоров С.Н., Боуд А.М., Донг З., Радченко О.С., Шубина Л.К., Стоник В.А.
Терапевтические хиноны // Патент на изобретение № 2411229. Зарегистрировано 10 февраля 2011г. Заявка №2007110478. Приоритет изобретения 23 сентября 2004 г.
34. Fedorov S.N., Dyshlovoy S.A., Shubina L.K., Guzii A.G., Kuzmich A.S., Makarieva T.N. C11 cyclopentenone from the ascidian Diplosoma sp. prevents epidermal growth factorinduced transformation of JB6 cells // Drugs and Therapy Studies. 2012. V. 2. P. e4.
Соискатель Федоров С.Н.
Федоров Сергей Николаевич Химическая структура и биологическая активность некоторых морских природных соединений и их синтетических аналогов Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии