Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии
на правах рукописи ПОЛОВКОВ НИКОЛАЙ ЮРЬЕВИЧ Химическая модификация аналитов для анализа методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (02.00.03. - органическая химия) АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Москва 2012
Работа выполнена на кафедре органической химии факультета физико-математических и естественных наук федерального государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов.
Научный консультант: доктор химических наук, профессор Варламов Алексей Васильевич
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Лебедев Альберт Тарасович (МГУ им. М.В. Ломоносова) кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Вирюс Эдуард Даниэлевич (ФГУП "Антидопинговый центр")
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им.
А.Н. Несмеянова РАН (ИНЭОС РАН)
Защита диссертации состоится 27 марта 2012 г. в 15 час 30 мин. на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.203.11 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117923, Москва, ул. Орджоникидзе, д.3, зал № 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Учебно-научном информационном библиографическом центре Российского университета дружбы народов по адресу:
117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.
Автореферат разослан ________ 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент: Курилкин В.В.
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Масс-спектрометрия на сегодняшний день является одним из самых популярных инструментальных методов изучения, идентификации и установления строения различных органических соединений. Создание и быстрое развитие низкоэнергетических или мягких методов ионизации позволило использовать массспектрометрию в ранее недоступных областях, таких как исследование органических соединений с низкой летучестью и большими молекулярными массами. Одним из таких методов является матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ).
Однако регистрируемые с помощью этого метода ионизации масс-спектры содержат пики только протонированных или катионизированных молекул, что пригодно для определения молекулярно-массовых характеристик аналитов, однако далеко не всегда позволяет устанавливать более тонкую структуру изучаемых соединений, одним из ключевых элементов которой являются свободные функциональные группы и их число. Важность этого параметра подчеркивается тем, что от него зависят как химические, так и физические свойства соединений. В некоторых случаях функциональные группы могут быть обнаружены с применением тандемной масс-спектрометрии и распада ионов после источника, а также с использованием масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье. Наиболее же очевидным решением этой задачи представляется использование простых методов химической модификации (силилирование, ацилирование, образование оснований Шиффа и проч.) аналитов с последующим сравнительным анализом масс-спектров МАЛДИ исходных веществ и полученных производных. Изучение таких подходов является актуальной задачей при создании экспрессных и эффективных структурно-аналитических методов современной органической химии.
Существенным препятствием на пути использования такого подхода является эмпирический характер подбора условий измерения масс-спектров МАЛДИ: типа используемой матрицы, соотношения матрицы и аналита, методов нанесения их на мишень, использование допантов. Поэтому особую актуальность приобретает разработка стандартных протоколов пробоподготовки для различных типов органических соединений и их производных.
Работа выполнена на экспериментальной базе Института нефтехимического синтеза им. А.В Топчиева РАН и поддержана Программой фундаментальных исследований Президиума Российской академии наук Создание и совершенствование методов химического анализа и исследования структуры веществ и материалов.
Цель работы. В настоящей работе поставлены цели:
- разработать общие подходы к применению дериватизации функциональных групп для определения тонкой структуры аналитов различного строения с помощью массспектрометрии МАЛДИ;
- изучить возможность использования разработанных подходов для определения числа и характера свободных функциональных групп (гидроксильных, первичных амино-групп) в различных типах соединений и промышленных продуктов.
Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование возможности использования предварительной химической модификации в сочетании с массспектрометрией МАЛДИ для определения числа и типа свободных гидроксильных и первичных амино-групп в индивидуальных олигомерах различных полиалкиленгликолей, функционализированых полиалкиленгликолей, силсесквиоксанов, циклических полисахаридов и продуктах полимеризации азиридинов (полиэтилениминах).
Показано, что применение дериватизации (силилирования и ацилирования) для характеризации полиалкиленгликолей позволяет однозначно определять число свободных гидроксильных групп в них, дифференцировать линейные и циклические олигомеры. В случае полисилсесквиоксанов использование предварительной химической модификации дает возможность устанавливать число свободных гидроксильных групп в олигомерах и дифференцировать их двухмерные и трехмерные формы. Использование этой методики для установления числа свободных функциональных групп в полисахаридах осложнено не количественным протеканием реакций дериватизации. Получение оснований Шиффа из соединений с первичными амино-группами позволяет определять их число в функционализированных полиалкиленгликолях и полиэтилениминах, а также устанавливать связь между молекулярной массой, числом мономерных звеньев и количеством первичных амино-групп в индивидуальных олигомерах.
Практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют границы применения масс-спектрометрии МАЛДИ в области изучения особенностей строения олигомеров. Разработанные методики определения количества свободных функциональных групп в индивидуальных олигомерах различного происхождения позволяют контролировать реакции, используемые для их получения, определять характеристики синтезируемых и закупаемых материалов.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 56-й конференции Американского масс-спектрометрического общества (1-5 июня 2008, США, Денвер, США), 57-й конференции Американского масс-спектрометрического общества (1-июня 2009 г,, Филадельфия, США), III-ей Всероссийской конференции с международным участием УМасс-спектрометрия и её прикладные проблемыФ (18-22 мая 2009г., Москва, Россия), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов, Секция Химия, (14 - 17 апреля 2009 г., Москва, Россия), 58-й конференции Американского масс-спектрометрического общества (23-27 мая 2010 г., Солт-Лейк-Сити, США), XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов, Секция Химия, (11 - 15 апреля 2011 г., Москва, Россия), IV-ой Всероссийской конференции с международным участием УМасс-спектрометрия и её прикладные проблемыФ (05-09 сентября 2011 г., Москва, Россия), 59-й конференции Американского масс-спектрометрического общества (5-9 июня 2011 г., Денвер, США).
Публикации. По материалам работы опубликовано 5 статей (все в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации) и 19 тезисов в сборниках докладов научных конференций.
Структура и объём работы. Диссертация объёмом 162 страницы, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, трех глав обсуждения результатов работы и выводов. Содержит 17 таблиц и 55 рисунков. Библиография включает 93 названия.
Основное содержание работы
Во Введении дано обоснование актуальности работы, новизны, научной и практической значимости выбранной темы.
Глава 1 представляет собой краткое описание наиболее актуальных мягких методов ионизации в масс-спектрометрии и обзор литературных данных, касающихся химической модификации органических соединений для анализа с их помощью. Показано, что основная часть научных публикаций описывает использования дериватизации для повышения вероятности ионизации полученных соединений, в то время как ее использование для характеризации свободных функциональных групп и определения других элементов структуры практически не обсуждается.
Глава 2, являющаяся экспериментальной частью, описывает методы получения производных изученных соединений, оптимизацию процесса пробоподготовки. Массспектры МАЛДИ измерялись на масс-спектрометре Autoflex II, оснащенным азотным лазером ( 337 nm), в режиме регистрации положительных ионов с использованием рефлектрона. Изученные низкомолекулярные полиалкиленгликоли, пропоксилированные и этоксилированные глицерины, поликапролактондиолы и -триолы, полиэтиленимины, а также реагенты для дериватизации являются коммерчески доступными. Силсесквиоксаны синтезированы на кафедре химической технологии пластмасс РХТУ им. Д.И.Менделеева. В работе использовали матрицы: 3-индолакриловая кислота (IAA), 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB), 1,8,9-антрацентриол (AT) (Aldrich, USA), 2-(4-гидроксифенилазо)бензойная кислота. В качестве допантов использовали ацетат и трифторацетат натрия (Aldrich, USA).
OH OH OH OH COOH COOH COOH OH N N N HO H HABA AT DHB IAA В главах 3, 4 и 5 обсуждаются результаты, полученные в работе:
3. Общие принципы использования химической модификации для определения числа свободных функциональных групп с помощью масс-спектрометрии с МАЛДИ Существенным недостатком масс-спектрометрии МАЛДИ является то, что регистрируемые масс-спектры содержат пики только протонированных или катионизированных молекул, что пригодно для определения молекулярно-массового распределения, однако далеко не всегда позволяет устанавливать более тонкую структуру молекул - характер и количество функциональных групп, последовательность звеньев, особенности строения каркасных олигомеров. В общем случае ион олигомера имеет следующий вид:
Г1(М)n Г2 + Кат+ где М - мономерное звено, Г1 и Г2 - концевые группы, Кат+ - катион, присоединяющийся в процессе ионизации, n-число мономерных звеньев в олигомере.
Для определения суммарной массы концевых групп необходимо взять массовое число пика катионизированной молекулы одного из гомологичных ионов и вычесть из него массу катиона Kат+, который обычно определяется используемым допантом. Затем из остатка вычесть суммарную массу необходимого числа мономерных звеньев и получить суммарную массу концевых групп Г1+Г2. При этом получают, однако, лишь величины масс концевых групп, природа которых может быть выведена лишь дедуктивно. В некоторых случаях элементы структуры могут быть установлены с применением тандемной масс-спектрометрии и распада после источника, а также с использованием анализаторов FT-ICR. Однако более простым способом представляется использование легко протекающих реакций, позволяющих замещать активные атомы водорода свободных функциональных групп на силильные (в случае гидроксильных, карбоксильных и др. групп), ацильные (в случае гидроксильных, амино- и др.групп), алкил- и арилалкилиденовые (в случае амино-групп) заместители.
Массовое число молекулярного иона продукта химической модификации (дериватизации) изменятся при этом следующим образом:
m/zпрод = m/zисх + n*И - Kат+1 + Kат+где m/zпрод - массовое число пика модифицированного олигомера с присоединенным катионом Kат+2, ; m/zисх - массовое число пика исходного олигомера с присоединенным катионом Kат+1; n - число свободных функциональных групп в олигомере; И - инкремент массы вводимой при дериватизации группы; Kат+1 - атомная масса катиона присоединившегося к молекуле исходного олгомера при ионизации; Kат+2 - атомная масса катиона присоединившегося к молекуле продукта химической модификации олигомера при ионизации. При этом в большинстве случаев Kат+1 совпадает с Kат+2. Очевидно, что зная значения массовых чисел молекулярных ионов исходных соединений и продуктов их дериватизации, а также значение инкремента вводимой группы, вычисление числа свободных функциональных групп не составляет труда.
4. Химическая модификация соединений со свободными гидроксильными группами Химическая модификация гидроксильных групп для аналитических целей подразумевает количественное и легко протекающее замещение активного атома водорода в них на остаток дериватизирующего агента. Поэтому наиболее удобными методами для получения производных по гидроксильной группе являются ацилирование и силилирование.
В работе для проведения дериватизации гидроксильной группы аналитов использовались триметилсилилирующие [бис(триметилсилил) трифторацетамид, БСТФА)] и ацилирующие (уксусный ангидрид или ацетилхлорид, формилирующая смесь и хлорангидрид каприловой кислоты) агенты. Выбор этих реагентов обусловлен их доступностью и высокой реакционной способностью в сочетании с минимальной вероятностью образования побочных продуктов реакции.
Si O OH F O + R Si R Si N F F O O OH O + R R O O 4.1. Разработка методов дериватизации индивидуальных соединений На первом этапе работы была проверена возможность использования предварительной химической модификации для установления количества и характера функциональных групп в модельных соединениях - гепта-, окта-, ундекаэтиленгликолей, их монометиловых эфиров.
Для проведения химической модификации нами использовались триметисилилрующие и ацилирующие реагенты. Обнаружено, что масс-спектры МАЛДИ химически модифицированных соединений содержат пики катионизированных ионов соединений с количественно блокированными функциональными группами. Сравнение значений массовых чисел пиков катионизированных продуктов дериватизации аналитов и массовых чисел пиков катионизированных исходных молекул аналитов позволяет однозначно устанавливать число доступных для химической модификации концевых групп. Основным препятствием для этого является возможность неколичественного протекания реакций химической модификации, вероятность которого особенно возрастает при исследовании соединений, содержащих несколько функциональных групп. Установлено, что проведение химической модификации в этом случае требует большого избытка дериватизирующего агента. Для обеспечения количественного блокирования всех функциональных групп в молекуле весьма эффективно использование ультразвукового поля.
4.2. Анализ низкомолекулярных полиэтиленгликолей (ПЭГ) Способы дериватизации, разработанные для анализа индивидуальных соединений, были применены для изучения возможности их использования для определения характера и количества функциональных групп в промышленных низкомолекулярных ПЭГ со средними молекулярными весами от 400 до 1500 Да. Проведенная оптимизация условий пробоподготовки показала, что наилучшие результаты достигаются при измерении массспектров полиэтиленгликолей с использованием в качестве матрицы 3-индолакриловой кислоты (IAA) в сочетании с допантом - ацетатом натрия. Масс-спектры МАЛДИ исходных ПЭГ содержали преимущественно пики продуктов присоединения иона Na+ к молекулам олигомеров (рис.1a). Анализ масс-спектров показал, что наиболее интенсивные пики связаны с ионами, массовые числа которых соответствовали олигомерам с двумя концевыми гидроксильными группами [HO(C2H4О)nH+Na]+. В то же время, в масс-спектрах всех изученных ПЭГ присутствовали малоинтенсивные пики ионов отличающихся по молекулярной массе от основных олигомеров на 16 Да. Для определения числа свободных гидроксильных групп в этих олигомерах проведена химическая модификация исходных ПЭГ.
Поскольку образцы содержали значительные количества сорбированной воды, для обеспечения полноты дериватизации растворы аналитов предварительно абсолютизировали, а реакции дериватизации проводили с использованием 30-кратного избытка реагентов и ультразвуковой активации реакционной смеси. Масс-спектры продуктов силилирования, измеренные в трех названных матрицах, оказались совершенно различными. Только пики для исходных олигомеров были зарегистрированы в присутствии DHB, в то время как практически только пики для полностью дериватизированных олигомеров наблюдались в случае AT. Масс-спектры, полученные с использованием IAA, оказались сложными и содержали наборы пиков, типичных для недериватизированных, частично модифицированных (введение одной силильной группы) и полностью превращенных олигомеров. Наблюдаемый эффект, очевидно, является следствием переноса силильных групп на молекулы матрицы, содержащие склонную к силилированию свободную карбоксильную групп, в процессе их сокристаллизации с аналитом. Это предположение подтверждается тем, что по данным ГХ/МС продукты силилирования модельных соединений после их сокристаллизации с матрицей DHB гидролизуются до исходных соединений.
а б Рис.1. Масс-спектры МАЛДИ (матрица АТ) исходного (а) и ацилированного хлорангидридом каприловой кислоты (б) ПЭГ Carbowax PEG 1000.
Масс-спектры продуктов ацилирования каприлоилхлоридом, измеренные с использованием в качестве матрицы 3-индолакриловой кислоты (IAA), 2,5дигидроксибензойной кислоты (DHB) и 1,8,9-антрацентриола (AT), не содержали пиков ионов исходных олигомеров (рис.1б). Сдвиг массовых чисел ионов продуктов химической модификации соответствовал введению двух ацильных остатков в молекулы основного набора олигомеров и одного в молекулы минорного набора олигомеров, что указывает на наличие в них двух и одной гидроксильной группы соответственно и позволяет приписать наборам олигомеров следующие структуры:
O O O H HO H n n минорный набор основной набор олигомеров олигомеров 4.3. Анализ низкомолекулярных полипропиленгликолей (ППГ) Разработанная методика химической модификации для определения количества и характера концевых групп в олигомерах ПЭГ применена для решения аналогичной задачи в промышленных низкомолекулярных ППГ с различными средними молекулярными массами (от 400 до 1000 Да). Как и в предыдущем случае, при оптимизации условий пробоподготовки было обнаружено, что наилучшие соотношение сигнал/шум достигается при измерении массспектров ППГ в присутствии матрицы IAA в сочетании с допантом - ацетатом натрия. Массспектры МАЛДИ исходных ППГ содержали преимущественно пики продуктов присоединения иона Na+ к молекулам олигомеров (рис.2a), а массовые числа ионов соответствующих наиболее интенсивным пикам отвечают олигомерам с двумя концевыми гидроксильными группами [HO(C3H8O)nH + Na]+. В масс-спектрах всех изученных ПЭГ присутствовали пики ионов олигомеров, имеющих молекулярные массы на 18 Да меньшие, чем массы основных олигомеров, причем их интенсивность варьировалась в зависимости от образца и в некоторых случаях достигала 30% от интенсивности соответствующего пика иона основного набора олигомеров. Наиболее вероятной причиной наличия таких олигомеров может служить дегидратация в процессе синтеза основных олигомеров с двумя концевыми гидроксильными группами, а образующиеся при этом соединения могут иметь либо линейную, либо циклическую структуру:
O O n O O H O O n линейные продукты дегидратации циклические продукты дегидратации BSTFA BSTFA O Si O n а а б б Рис.2. Масс-спектры МАЛДИ (матрица АТ) исходного (а) и триметилсилилированного (б) ППГ Acpol PPG 1000.
При проведении химической модификации ППГ использовали протокол, разработанный для дериватизации ПЭГ. Масс-спектры продуктов ацилирования не содержали пиков ионов исходных олигомеров. В масс-спектрах продуктов силилирования отмечен матричный эффект, аналогичный наблюдавшемуся в случае продуктов силилирования ПЭГ, однако в масс-спектрах, измеренных с использованием АТ пики ионов исходных олигомеров также отсутствовали (Рис. 2б). Сдвиг массовых чисел ионов продуктов химической модификации соответствовал введению двух ацильных или силильных остатков в молекулы основного набора олигомеров и одного в молекулы минорного набора олигомеров. Этот результат убедительно доказывает линейную структуру минорного набора олигомеров, так как в случае циклического строение соединений свободные гидроксильные группы отсутствуют.
4.4. Анализ низкомолекулярных соолигомеров полипропилен- и полиэтиленгликолей (ППГ/ПЭГ) Полученные в результате изучения низкомолекулярных ППГ и ПЭГ результаты позволили перейти к определению характеристик более сложных объектов:
низкомолекулярных продуктов соолигомеризации полипропилен- и полиэтиленгликолей со средними молекулярными массами 1100 и 1200 Да. Отдельной оптимизации условий пробоподготовки в этом случае не потребовалось. Масс-спектры исходных ППГ/ПЭГ представляют собой сложную картину, поскольку содержат пики продуктов присоединения иона Na+ к олигомерам, содержащим различное число звеньев этилен- и пропиленгликоля.
Кроме того в них наблюдаются пики минорного набора олигомеров, массовые числа которых отличаются от массовых чисел основного набора олигомеров на 16 Да. Для проведения химической модификации ППГ/ПЭГ использовали протокол, разработанный для дериватизации ПЭГ. Масс-спектры продуктов ацилирования не содержали пиков ионов исходных олигомеров. Сдвиг массовых чисел ионов продуктов химической модификации соответствовал введению двух ацильных остатков в молекулы основного набора олигомеров и одного в молекулы минорного набора олигомеров. Установление строение концевых групп изученных соединений позволил рассчитать количество звеньев этилен- и пропиленгликоля в индивидуальных олигомерах исходя из следующего выражения:
m/zисх = m * 44 + n * 58 + mконц + K+ где m/zисх - массовое число пика протонированного исходного олигомера; m - число звеньев этиленгликоля в нем; 44 - масса звена этиленгликоля в Да; n - число звеньев пропиленгликоля в олигомере; 58 - масса звена этиленгликоля в Да; mконц - суммарная масса концевых групп в Да; K+ - атомная масса катиона присоединившегося к молекуле исходного олигомера при ионизации. При этом очевидно, что для приведенного выражения должны также выполняться следующие граничные условия:
0 m (m/zисх - mконц - K+) / 44, 0 n (m/zисх - mконц - K+) / При известных суммарных массах концевых групп и массе присоединившегося катиона и выполнении указанного граничного условия равенство имеет только один набор параметров m и n, который и определяет число звеньев этилен- и пропиленгликоля в соответствующем олигомере.
4.5. Анализ алкоксилатов глицерина Для проверки возможностей использования разработанного метода для анализа эфиров, содержащих три свободные ОН-группы в каждой олигомерной молекуле, нами было проведено изучение алкоксилатов глицерина. Оптимизация условий пробоподготовки показала, что наибольший выход ионного тока достигается при измерении масс-спектров исходных соединений с использованием в качестве матрицы DHB в сочетании с допантом - ацетатом натрия. Масс-спектры МАЛДИ алкоксилатов глицерина содержали хорошо разрешенные пики ионов [M+Na]+ индивидуальных олигомеров. Ацилирование с использованием ацетилхлорида, формилирующей смеси и хлорангидрида каприловой кислоты, а так же триметилсилилирование этих соединений проводили с использованием методики, разработанной для дериватизации ПЭГ и ППГ, но с увеличением избытка дериватизирующего агента до 40-кратного. Масс-спектры продуктов ацилирования и силилирования (измеренных с помощью АТ) не содержали пиков ионов исходных олигомеров. При использовании DHB и IAA для измерения масс-спектров продуктов силилирования наблюдался матричный эффект. Сдвиг массовых чисел ионов продуктов химической модификации соответствовал введению трех ацильных или силильных остатков в молекулы олигомеров.
4.6. Анализ низкомолекулярных продуктов полимеризации -капролактона Поскольку в ходе предварительной дериватизации полимеров по разработанной нами методике выделяются достаточно реакционноспособные соединения кислого характера, которые могут расщеплять лабильные связи в цепи соответствующих олигомеров и приводить к изменению молекулярно-массового распределения, эта методика была опробована на соединениях с легко гидролизующимися связями. В качестве таких соединений были выбраны биодеградируемые полимеры: продукты полимеризации капролактона со средними молекулярными массами 900 Да, 1200 и 2000 Да, которые содержат сложноэфирные связи, склонные к кислому гидролизу. Эти соединения получены с использованием в качестве инициатора диэтиленгликоля (т.н. поли(-капролактон)диолы) и 1,1,1-три(гидроксиметил)пропана (т.н. поли(-капролактон)триолы) H O O H O O O O O m n поли(-капролактон)диол O O H O m H O O O O n O k O H поли(-капролактон)триол Na+ O O H O m H O O а O O n O k O H n+m+k=Na+ O O SiMeO б m Me3Si O O O O n O k O Me3Si n+m+k=Рис.3. Масс-спектры МАЛДИ (матрица АТ) исходного (а) и триметилсилилированного (б) поли(-капролактон)триола.
Было установлено, что наилучшие результаты достигаются при измерении массспектров с использованием в качестве матрицы DHB в сочетании с допантом - ацетатом натрия. Для химической модификации поли(-капролактон)диолов и триолов использовали протокол, разработанный для дериватизации алкоксилированных глицеринов. Анализ массспектров МАЛДИ исходных соединений показал, что в основном они содержат пики олигомеров, катионизированных ионами Na+ (Рис.3а). В масс-спектрах продуктов ацилирования и силилирования (измеренны с помощью матрицы АТ) пики ионов, соответствующие исходным олигомерам, практически отсутствуют, что свидетельствует о количественном протекании реакций. Сдвиг массовых чисел ионов продуктов химической модификации соответствовал введению двух ацильных или триметилсилильных остатков в молекулы олигомеров поли(-капролактон)диолов и трех ацильных или триметилсилильных остатков в молекулы олигомеров поли(-капролактон)триола (Рис.3б), что указывает на наличие в исходных олигомерах двух и трех свободных гидроксильных групп соответственно. При использовании в качестве матрицы DHB и IAA в масс-спектрах продуктов дериватизации наблюдались пики ионов исходных олигиомеров, что объясняется матричным эффектом. Низкомолекулярных продуктов расщепления олигомеров ни в одном из случаев не наблюдалось, а картина молекулярно-массового распределения существенно не менялась.
4.7. Анализ силсесквиоксанов В целях проверки возможностей методики для анализа элементорганических соединений были изучены олигомеры, полученные конденсацией из 3(триметоксисилил)пропилового эфира метакриловой кислоты:
O O KOH O Si олигомеры H2O O O В отличие от полисилоксанов, в мономерных звеньях которых атом кремния связан с двумя атомами кислорода, полисилсесквиоксаны содержат атомы кремния, связанные с тремя атомами кислорода (стехиометрическая формула [RSiO1.5]. При этом механизм реакции поликонденсации подразумевает образование не только полностью конденсированных сесквиоксанов, но и олигомеров, содержащих несколько гидроксильных групп. При оптимизации пробоподготовки наилучшие результаты были достигнуты с использованием в качестве матрицы DHB, а необходимости в использовании допанта не было. Анализ массспектров МАЛДИ силсесквиоксанов показал, что в основном они содержат пики олигомеров, катионизированных ионами Na+, а молекулярные массы обнаруженных олигомеров варьируются в пределах 900Ц3000 Да (рис.4а).
Химическую модификацию силсесквиоксанов проводили без абсолютирования их растворов с использованием 30-кратного избытка дериватизирующего агента (БСТФА) и ультразвуковой активации реакционной смеси. Проведение триметилсилилирования привело к практически полному исчезновению пиков ионов исходных олигомеров и появлению в спектре пиков катионизированных ионами Na+ производных, массовые числа которых отличаются на И * n Да (где n - число гидроксильных групп в соответствующем олигомере, а ИЦ инкремент силильной группы) от массовых чисел пиков исходных соединений (рис.4б, Табл.).
Na+ R R HO Si O Si O OH O O Si R HO Si O Si O а R R Na+ R R (Me)3SiO Si O Si O OSi(Me)O O Si R б (Me)3SiO Si O Si O R R Рис.4.Масс-спектры МАЛДИ (матрица DHB) исходного (а) и триметилсилилированного (б) силсесквиоксана.
В некоторых случаях образования силиловых эфиров не произошло, что свидетельствует о наличии в смеси полностью конденсированных силсесквиоксанов, не содержащих гидроксильных групп. Попытка использования для химической модификации силсесквиоксанов ацилирующих реагентов удовлетворительных результатов не дала, поскольку не удалось добиться количественного протекания реакции дериватизации.
Полученные же данные с применением силилирования позволили установить количество свободных гидроксильных групп в олигомерах и приписать им трехмерные и двухмерные (ллестничными) структуры (Таблица). Следует также отметить, что использование триметилсилилирования привело к заметному улучшению соотношения сигнал/шум в массспектрах МАЛДИ и возможности использования меньших энергий лазера.
Таблица. Массовые числа и предполагаемые структуры олигомеров и их производных, катионизированных Na+, в диапазоне от 1200 до 1350 Да (в узлах трехмерных структур для удобства не изображен атом кремния; во всех структурах R=(CH2)3OOCC(CH3)=CH2, RТ=(CH2)2CH2OH, n - число введенных триметилсилильных групп) m/z Структура ТМС m/z Структура ТМС произв произв одное одное HO 1235 m/z 1321 m/z R Na+ Na+ R R R R O 1523 16R O OHOH HO Si O Si O Si O OH O (n=4) (n=4) R O OH O O Si O R O O R R O O Si O Si O Si O R R R' HO R OH HO R Si Na+ HO HO R O OHOH R O R O O R O O O O R R HO HO 1285 m/z 1405 m/z R R Na+ Na+ OH R R O O 1357 14O R R R O O O O O (n=1) (n=2) R R R O O O O O R O O O O O O O O R R' R R R 1303 m/z 1455 - Na+ Na+ R R R O O 15R O R O HO Si O Si O Si O OH R O (n=3) R O O O O O Si O R O O R O R Si O Si O Si O O OH R R R R HO R Na+ R O R O OHOH O R O O R O O O O R R 4.7. Анализ циклодекстринов Так как одной из важнейших областей применения масс-спектрометрии МАЛДИ является изучение биомолекул, разработанная методика определения числа свободных гидроксильных групп была также опробована и на - и -циклодекстринах. При оптимизации условий пробоподготовки обнаружено, что наилучшие результаты достигаются при использовании в качестве матрицы АТ и допанта - ацетата натрия. Масс-спектры исходных соединений содержали индивидуальные пики катионизированных ионом натрия молекул.
Поскольку молекулы циклодекстринов содержат большое число свободных гидроксильных групп, для проведения дериватизации использовались жесткие условия: 60-кратный избыток дериватизирующего агента и проведение реакции в ультразвуковой бане в течении 2 суток.
Тем не менее, масс-спектры продуктов ацилирования циклодекстринов содержали пики ионов частично дериватизированных молекул, что свидетельствует о не полном протекании реакции, причиной которой, по-видимому, являлись стерические затруднения для подхода к гидроксильным группам внутренней полости молекулы. В то же время масс-спектры продуктов силилирования, измеренные с использованием АТ в качестве матрицы, содержали практически только пики ионов, соответствовавших модифицированным молекулам. Сдвиг массовых чисел ионов показал, что наиболее интенсивные пики ионов соответствовали введению в молекулу -циклодекстрина 18 триметилсилильных групп, а в молекулу циклодекстрина - 21 триметилсилильной группы. Вместе с тем, в масс-спектрах также присутствовали достаточно интенсивные пики ионов, массовые числа которых соответствовали введению 17 (интенсивность пика 9 отн.%), и 20 (интенсивности пика отн.%) триметилсилильных групп соответственно. Этот факт указывает на недостаточно полное протекание реакции химической модификации. Однако полученные данные позволяют с высокой точностью устанавливать число свободных гидроксильных групп в таких полисахаридах.
5. Химическая модификация соединений с первичными амино-группами Обычно химическая модификация амино-групп также заключается в количественном и легко протекающем замещении активных атомов водорода в них на остаток дериватизирующего агента. Очевидно, что в наибольшей степени этим условиям удовлетворяют реакции ацилирования. Однако такие реакции протекают как по первичным, так и по вторичным амино-группам, что существенно усложняет анализ образующейся смеси продуктов. Поэтому, для обнаружения и определения числа свободных первичных аминогрупп нами предложено использовать реакцию с карбонильными соединениям, которая приводит к образованию иминов (оснований Шиффа). В качестве карбонильных соединений в данной работе были взяты ацетон, бензальдегид, 4-метоксибензальдегид и 2,3дигидроксибензальдегид.
5.1. Анализ низкомолекулярных полиэтилен- и полипропиленгликолей с концевыми аминогруппами Низкомолекулярные полиэтилен и полипропиленгликоли с концевыми амино-группами и различными средними молекулярными массами (от 900 до 2000 Да) были выбраны в качестве модельных соединений при изучении возможности использования данного типа химической модификации для определения числа свободных амино-групп в аналитах.
Оптимизация условий пробоподготовки показала, что оптимальное соотношение сигнал/шум достигается при измерении масс-спектров исходных соединений с использованием в качестве матрицы DHB в сочетании с допантом - трифторацетатом натрия. Масс-спектры МАЛДИ исходных олигомеров, зарегистрированные с использованием DHB, HABA и IAA как матриц, содержали преимущественно пики олигомеров, катионизированный натрием [M+Na]+ (Рис.
5). Химическая модификация исходных соединений проводилась с использованием 20кратного избытка реагента и ультразвукового воздействия. В масс-спектрах продуктов химической модификации пики ионов исходных олигомеров отсутствовали. Сдвиг массовых чисел ионов продуктов химической модификации соответствовал введению в молекулы олигомеров двух алкилиденовых или бензилиденовых остатков, что подтверждает наличие в каждой олигомерной молекуле двух концевых первичных амино-групп (Рис. 6).
O R R'' O O NH2 R' R'' R N (CH2)k (CH2)k (CH2)k (CH2)k n n R' R', R''=H, Me, Ph k=2,Рис.5. Масс-спектр МАЛДИ (матрица DHB) аминозамещенного полипропиленгликоля (Mn = 1800 Да).
Рис.6. Масс-спектры МАЛДИ (матрица DHB) продукта модификации 4метоксибензальдегидом аминозамещенного полипропиленгликоля (Mn = 1800 Да).
5.2. Анализ низкомолекулярных продуктов полимеризации азиридина Разработанная методика химической модификации была использована для определения числа первичных амино-групп в низкомолекулярных продуктах полимеризации азиридина (лполиэтилениминах, средние молекулярные массы 600 и 800 Да). В общем случае олигомеры имеют следующее строение:
H H2N N H N n m NHМасс-спектры МАЛДИ исходных олигомеров, зарегистрированные с использованием DHB, HABA и IAA как матриц, содержали преимущественно пики протонированных олигомеров [M+Н]+ (Рис. 7а). Химическую модификацию этих соединений проводили с использованием 50-кратного избытка реагента в ультразвуковой бане. Дериватизация полиэтилениминов ацетоном, бензальдегидом и 4-метоксибензальдегидом не дала удовлетворительных масс-спектрометрических результатов. Вероятно, в этом случае происходит количественное превращение амино-групп в иминопроизводные, поскольку в масс-спектрах МАЛДИ практически исчезают пики ионов исходных олигомеров. Вместе с тем пики ионов производных также отсутствуют, а подобрать экспериментальные условия, при которых выход ионов достиг бы удовлетворительных значений, не удалось. Только при использовании 2,3-дигидроксибензальдегида и DHB как матрицы получены хорошие и воспроизводимые масс-спектры МАЛДИ производных. Наиболее вероятной причиной такого эффекта может служить тот факт, что иминные фрагменты, появившиеся при дериватизации в молекуле олигомера, близки по структуре молекуле матрицы, что облегчает сокристаллизацию последней и модифицированного олигомера и обеспечивает высокую эффективность ионизации. При этом масс-спектры МАЛДИ продуктов химической модификации содержали преимущественно пики олигомеров, катионизированный натрием [M+Na]+ (Рис. 7б).
а б Рис. 7. Масс-спектры МАЛДИ (матрица DHB) полиэтиленимина (Mn =600) (а) и продукта его модификации 2,3-дигидроксибензальдегидом (б).
Полученные данные позволили установить число первичных амино-групп в каждом конкретном олигомере полиэтиленимина, а также установить зависимость числа первичных амино-групп от числа мономерных звеньев в полиэтиленимине (рис. 8).
Рис. 8. Зависимость числа NH2-групп от числа мономерных звеньев в олигомерах полиэтиленимина.
Основные результаты и выводы 1. Впервые показано, что использование дериватизационных методик для исследования соединений, содержащих свободные функциональные группы с активными атомами водорода, методом масс-спектрометрии МАЛДИ позволяет получить информацию о характере и числе таких групп. Показано, что предварительная химическая модификация аналитов может быть использована для различения циклических и линейных молекул олигомеров.
2. Разработаны методики пробоподготовки для измерения масс-спектров МАЛДИ и химической модификации различных типов аналитов, включая низкомолекулярные полиэтилен- и полипропиленгликоли, блок-соолигомеры этилен и полипропиленгликолей, этоксилированные и пропоксилированные глицерины, функционализированные полиалкиленгликоли, полиэтиленимины, замещенные силсесквиоксаны, полисахариды.
3. На основе анализа масс-спектров МАЛДИ химически модифицированных силсесквиоксанов установлено число функциональных групп в индивидуальных олигомерах, сделаны выводы об их двухмерном или трехмерном строении, обнаружены полностью конденсированные олигомеры.
4. Впервые предложено использование химической модификации путем образования оснований Шиффа для определения числа первичных амино-групп в олигомерных соединениях. Методика использована для установления зависимости между массой олигомера, количеством мономерных звеньев и числом свободных амино-групп в полиэтилениминах.
5. Обнаружен матричный эффект, связанный с возможностью протекания реакции пересилилирования в совместном растворе модифицированного аналита и матрицы, при условии наличия в матрице функциональной группы с подвижным атомом водорода.
Основное содержание диссертационной работы изложено в следующих публикациях:
1. Заикин В.Г., Борисов Р.С., Половков Н.Ю., Лободин В.В. Исследование синтетических алифатических сополиамидов методом время-пролётной массспектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией // Известия Академии наук. Сер. хим. №7. 2007. С.1320-1324.
2. Борисов Р.С., Половков Н.Ю., Заикин В.Г., Филатов С.Н. Дериватизация силсесквиоксанов для определения структуры методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией // Масс-спектрометрия.
2008.. T. 5. №1. C. 25-37.
3. Zaikin V.G., Borisov R.S., Polovkov N.Yu., Filatov S.N., Kireev V.V. Preliminary silylation for structure determination of oligomeric silsesquioxanes by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry // European Journal of Mass Spectrometry.
2009. Vol. 15(2). P. 231-238.
4. Borisov R.S., Polovkov N.Yu., Zaikin V.G. Derivatization aids in the determination of end groups in poly(alkylene glycol)s by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry // Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2009. Vol. 23(20). P. 33093312.
5. Заикин В.Г., Борисов Р.С., Половков Н.Ю., Куликова Л.Н. Дериватизация путем образования оснований Шиффа при исследовании синтетических полимеров с аминогруппами методом масс-спектрометрии МАЛДИ // Масс-спектрометрия. 2011. Т. 8. № 4. С. 259-263.
6. Borisov R.S., Polovkov N.Yu., Zaikin V.G. Preliminary Imination in Structure Determination of Amine Group Containing Polymers by MALDI-ToF Mass Spectrometry // Сборник тезисов международной конференции 59th ASMS Conference on Mass Spectrometry. США. Денвер. 2011. CD.
7. Борисов Р.С., Половков Н.Ю., Заикин В.Г. Предварительное иминирование при исследовании полимеров с амино-группами методом масс-спектрометрии МАЛДИ // Сборник тезисов IV всероссийской конференции с международным участием Массспектрометрия и её прикладные проблемы. Москва. 2011. C.100.
8. Половков Н.Ю., Борисов Р.С., Заикин В.Г. Предварительная дериватизация при исследовании полимеров с лабильными связями методом масс-спектрометрии МАЛДИ // Сборник тезисов IV всероссийской конференции с международным участием Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы. Москва. 2011. C. 111.
9. Жиляев Д.И., Борисов Р.С., Половков Н.Ю., Заикин В.Г. Эффект матрицы в массспектрах МАЛДИ дериватизированных алкоксилатов глицерина // Сборник тезисов IV всероссийской конференции с международным участием Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы. Москва. 2011. C. 113.
10. Половков Н.Ю., Борисов Р.С. Предварительная химическая модификация полимеров с концевыми амино-группами для исследования методом масс-спектрометрии с источником МАЛДИ // Сборник тезисов XVIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных Ломоносов-2010. Cекция Химия.
Москва. 2011. CD.
11. Половков Н.Ю., Борисов Р.С. Дериватизация синтетических полимеров для исследования методом масс-спектрометрии с источником МАЛДИ: эффект матрицы // Сборник тезисов XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёныхЛомоносов-2010. Cекция Химия. Москва. 2010. CD.
12. Borisov R.S., Polovkov N.Yu., Zhilyaev D.I., Zaikin V.G. Matrix Effect in MALDI-ToF Mass Spectra of Derivatized Glycerol Ethoxylates // Сборник тезисов международной конференции 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry. США. Солт-Лейк-Сити.
2010. CD.
13. Борисов Р.С., Половков Н.Ю., Заикин В.Г. Дериватизация синтетических полимеров для исследования методом масс-спектрометрии с источником МАЛДИ // Материалы ХХ украинской конференции по органической химии. Украина. Ужгород. 2010. C.
112.
14. Половков Н.Ю., Борисов Р.С. Химическая модификация синтетических полимеров для исследования методом масс-спектрометрии с источником МАЛДИ // Сборник тезисов XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009. Cекция Химия. Москва. 2009. CD.
15. Горяинов С.В., Борисов Р.С., Половков Н.Ю., Заикин В.Г. Определение концевых групп в минорных компонентах полиалкиленгликолей методом масс-спектрометрии МАЛДИ с помощью предварительной дериватизации // Сборник тезисов III всероссийской конференции с международным участием Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы. Москва. 2009. C. 147.
16. Половков Н.Ю., Борисов Р.С., Филатов С.Н., Заикин В.Г. Дериватизация силсесквиоксанов для исследования методом масс-спектрометрии с источником МАЛДИ // Сборник тезисов III всероссийской конференции с международным участием Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы. Москва. 2009. C. 149.
17. Борисов Р.С., Половков Н.Ю., Заикин В.Г. Дериватизация синтетических полимеров для исследования методом масс-спектрометрии с источником МАЛДИ // Сборник тезисов всероссийской конференции с международным участием Массспектрометрия и её прикладные проблемы. Москва. 2009. C.132.
18. Борисов Р.С., Половков Н.Ю., Заикин В.Г. Предварительная химическая модификация аналитов для анализа методом МАЛДИ // Сборник тезисов 5-ой международной конференции молодых ученых по органической химии InterYCOS 2009. СанктПетербург. 2009. C. 105-107.
19. Borisov R.S., Polovkov N.Yu., Zaikin V.G. End-group Determination in Minor Components of Polyalkylene Glycoles by MALDI-ToF Mass Spectrometry Following Preliminary Derivatization // Сборник тезисов международной конференции 57th ASMS Conference on Mass Spectrometry. США. Филадельфия. 2009. CD.
20. Борисов Р.С., Половков Н.Ю. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация для исследования синтетических полимеров // Сборник тезисов VIII международной научно-практической конференции Молодые ученые - промышленности,науке и профессиональному образованию: проблемы и новые решения. Москва. 2009. C. 105.
21. Половков Н.Ю., Борисов Р.С. Изучение реакции поликонденсации алифатических диаминов и хлорангидридов дикарбоновых кислот с помощью матричноактивированной лазерной десорбцией/ионизацией // Сборник тезисов XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов. Секция Химия. Москва. 2008. CD.
22. Borisov R.S., Polovkov N.Yu., Kireev V.V., Zaikin V.G. Derivatization of Silsesquioxanes for Structure Elucidation by MALDI-ToF Mass Spectrometry // Сборник тезисов международной конференции 56th ASMS Conference on Mass Spectrometry. США.
Денвер. 2008. CD.
23. Борисов Р.С., Половков Н.Ю., Заикин В.Г. Изучение реакции поликонденсации алифатических диаминов и хлорангидридов дикарбоновых кислот с помощью матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией // Сборник тезисов всероссийской конференции с международным участием Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы. Москва. 2007. ОУ-4.
24. Половков Н.Ю., Борисов Р. С., Сивов Н.А., Заикин В.Г. Исследование поли(Nвинилпирролидонов) различного происхождения методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией // Сборник тезисов всероссийской конференции с международным участием Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы. Москва. 2007. ОС-24.
Половков Николай Юрьевич (Россия) Химическая модификация аналитов для анализа методом матричноактивированной лазерной десорбции/ионизации Разработаны методики определения числа свободных гидроксильных и первичных амино-групп в индивидуальных олигомерах полиалкиленгликолей, функционализированных полиалкиленгликолей, силсесквиоксанов, полиэтилениминов путем их химической модификации с последующими анализом методом масс-спектрометрии МАЛДИ.
Nikolai Yu.Polovkov (Russia) Chemical modification of analytes for the analysis by matrix-assisted laser desorbtion/ionization The methods for the determination of the number of free hydroxyl groups and primary aminogroups in individual oligomers of polyalkylene glycols, functionalized polyalkylene glycols, silsequioxanes, polyethyleneimines on the basis of their derivatization followed by MALDI mass spectrometry of initial and derivatized samples were developed.