Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Даниленко Алексей Валерьевич
Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев
03.01.03 - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Кольцово - 2012
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор Научный Карпенко Лариса Ивановна, доктор биологических наук, доцент, ФБУН Государственный научный руководитель центр вирусологии и биотехнологии Вектор, заведующая лабораторией рекомбинантных вакцин Официальные Масычева Валентина Ивановна - доктор биологических наук, профессор, ИМБТ ФБУН оппоненты:
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор, директор Поздняков Сергей Геннадьевич - кандидат биологических наук, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, лаборатория медицинской химии, н.с.
Ведущая ФГБУ Государственный научный центр Институт организация иммунологии, г. Москва
Защита состоится л21 декабря 2012 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор по адресу: р.п. Кольцово Новосибирского района Новосибирской области, 630559, тел. 8(383)336-74
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГН - ВБ Вектор.
Автореферат разослан л16 ноября 2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Трошкова Г. П.
Общая характеристика работы
Актуальность темы Разработка безопасной и эффективной вакцины против ВИЧ-1 является приоритетной задачей мирового здравоохранения. Прошло более 25 лет с момента идентификации вируса иммунодефицита человека. За это время в мире было инфицировано ВИЧ-1 почти 70 миллионов человек и около 30 миллионов инфицированных уже умерли. Очевидно, что создание вакцины против ВИЧ-позволило бы сдержать развитие пандемии СПИДа. Работы по созданию вакцины против ВИЧ-инфекции активно ведутся и в России, и за рубежом.
Среди новых направлений в создании профилактических и терапевтических вакцин против различных патогенов весьма перспективными считаются ДНКвакцины. Принцип ДНК-вакцинации активно используется для разработки вакцин против ВИЧ-1. К настоящему времени уже получен ряд кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ-1 и показана способность таких вакцин индуцировать вирусспецифический иммунный ответ как на лабораторных животных, так и в процессе клинических испытаний.
В то же время эксперименты по ДНК-вакцинации обозначили определенные проблемы. Одна из них связана с низкой иммуногенностью ДНК-вакцин, в результате чего при внутримышечных инъекциях для достижения достаточно высокого иммунного ответа приходится вводить значительные количества плазмидной ДНК. Это обстоятельство предполагает поиск альтернативных путей доставки ДНК-вакцин, способных обеспечить высокий специфический иммунный ответ при малой дозе вводимой ДНК.
Рядом авторов показано, что одним из перспективных способов доставки ДНК-вакцин могут служить аттенуированные штаммы сальмонелл. Множество работ в этом направлении объясняется хорошей изученностью аттенуированных штаммов, полученных при создании живых мукозальных вакцин перорального применения против сальмонеллеза и брюшного тифа.
Актуальность создания мукозальной вакцины против СПИДа обусловлена тем, что значительная часть новых случаев инфицирования ВИЧ-1 происходит при половом контакте, поэтому вакцина против вируса должна обеспечивать защиту одновременно как в слизистых в области проникновения вируса, так и при передаче вируса через кровь. Преимущество непарентерального способа ДНКвакцинации с использованием аттенуированных сальмонелл по сравнению с инъекционным заключается в том, что при непарентеральном введении ДНКвакцины в составе бактериального вектора, помимо системного гуморального и клеточного ответа, активируется и специфический мукозальный иммунитет, создающий барьер для проникновения вируса в организм. При использовании данного подхода не требуется проведения дорогостоящей стадии очистки ДНКвакцины или антигена. Кроме того, инъекционный способ введения технически более сложен, что особенно важно при планировании массовых иммунизаций, охватывающих группы риска.
Если сравнивать пероральный и перректальный способы введения вакцины, то перректальный способ предпочтителен по двум причинам. Первая заключается в том, что слизистая кишечника является местом проникновения ВИЧ-1, а также начальным и преимущественным местом репликации вируса. Следовательно, перректальное введение ДНК-вакцины обеспечивает развитие иммунной реакции непосредственно в лворотах инфекции. Кроме того, перректальная вакцинация не требует антацидов, нейтрализующих кислый рН желудка, либо других способов защиты действующего начала, как это необходимо в случае перорального введения.
В данной работе в качестве вектора доставки ДНК-вакцины был использован штамм Salmonella enteritidis E23, созданный в Московской медицинской академии им.И.М. Сеченова (Бойченко и др., 1994). Штамм был аттенуирован путем введения делеций в генах аденилатциклазы и цАМФ-рецепторного белка. В результате таких модификаций патогенность S. enteritidis E23 была снижена по сравнению с родительским штаммом более, чем в 105 раз.
Ранее в ГН - ВБ Вектор была получена рекомбинантная плазмида pcDNATCI (анти-ВИЧ-1 ДНК-вакцина). Плазмида содержит искусственный ген, кодирующий полиэпитопный белок TCI, состоящий из 80 ЦТЛ эпитопов, входящих в состав белков вируса ВИЧ-1 субтипов А, В и С. С помощью трансформации плазмидой pcDNA-TCI клеток штамма S. enteritidis E23 был получен рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI. На основе этого штамма разработана кандидатная анти-ВИЧ-1 вакцина СаВИЧ Д в виде ректальных суппозиториев.
В то же время ряд вопросов, касающихся биологических свойств S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, остался неизученным, в связи с чем потребовались дальнейшие углубленные исследования в этом направлении. К ним относятся вопросы, связанные с наличием у рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI вирулентных, токсических и токсигенных свойств, исследование иммуногенности и персистенции штамма в организме лабораторных животных при его введении в виде ректальных суппозиториев.
Цель данной работы заключалась в характеризации рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследовании его иммуногенных свойств при перректальном введении в составе суппозиториев.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Оценить влияние плазмиды pcDNA-TCI на биохимические и антигенные свойства штамма S. enteritidis E23.
2. Изучить сохранность плазмиды pcDNA-TCI в клетках аттенуированного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.
3. Изучить вирулентность, токсичность и токсигенность штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI для теплокровных животных.
4. Изучить длительность персистенции аттенуированного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных после введения суппозиториев, содержащих рекомбинантный штамм.
5. Исследовать возможность экспрессии гена TCI в клетках пейеровых бляшек при введении суппозиториев, содержащих рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/ pcDNA-TCI.
6. Изучить интенсивность ВИЧ-специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунного ответа у лабораторных животных после введения суппозиториев, содержащих S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.
Научная новизна и практическая ценность 1. Впервые установлено, что штаммы S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI являются невирулентными, малотоксичными и нетоксигенными для теплокровных животных.
2. В ходе исследования персистенции рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI показано, что данный штамм, также как и штамм S. enteritidis E23, обладает ограниченной способностью к персистенции в организме млекопитающих. Установлено, что бактерии обоих исследованных штаммов не обнаруживаются в селезенке иммунизированных животных через 63 дня после однократного и через 70 дней после двукратного введения суппозиториев.
3. Впервые показано, что перректальное введение лабораторным мышам суппозиториев, содержащих лиофилизированные клетки штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, обеспечивает доставку плазмиды pcDNA-TCI и экспрессию гена TCI в клетках пейеровых бляшек.
4. Впервые показано, что после иммунизации лабораторных мышей штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев происходит формирование как системного Т-клеточного иммунного ответа, так и гуморального иммунного ответа, что выражалось в появлении специфических IgG и IgA в сыворотке крови против белков ВИЧ-лизата и рекомбинантного белка TCI. Схема иммунизация, основанная на двукратном введении S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, была более эффективной, чем на однократном введении.
Результаты настоящих исследований могут представлять интерес с точки зрения практического применения. Был получен ряд дополнительных характеристик, которые позволяют утверждать, что аттенуированный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI пригоден для дальнейшей разработки кандидатной вакцины против ВИЧ-1 СаВИЧ Д. На основании полученных данных можно рекомендовать штамм S. enteritidis E23 в качестве вектора доставки других ДНКвакцин против вирусных, бактериальных инфекций, онкологических заболеваний.
Возможно также рекомендовать использование штамма S. enteritidis E23 для доставки биологически активных белков (например, цитокинов) в случаях, когда необходимо активировать местный иммунитет слизистой.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Введение плазмиды pcDNA-TCI в клетки аттенуированного штамма S. enteritidis E23 не влияет на биохимические и антигенные свойства штамма.
2. Штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI невирулентен, малотоксичен и нетоксигенен для теплокровных животных.
3. Суппозитории, содержащие рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/pcDNATCI, при перректальном введении лабораторным мышам обеспечивают доставку плазмиды pcDNA-TCI и экспрессию гена TCI в клетках пейеровых бляшек.
4. Иммунизация мышей штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев вызывает формирование системного Т-клеточного иммунного ответа и появление специфических IgG и IgA антител в сыворотке крови против антигена TCI.
5. Повторное введение лабораторным мышам суппозиториев, содержащих S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, приводит к усилению иммунного ответа на антиген TCI.
Апробация работы и публикации По материалам диссертации опубликованы 3 статьи, две из которых - в журналах, рекомендованных ВАК для защиты диссертаций. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: на Всероссийской научной конференции Теоретические основы эпидемиологии.
Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний, Санкт-Петербург, 2008 г; Всероссийской научно-практической конференции Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней, Москва, 2008 г; Keystone Symposia Global Health Series.
HIV Vaccines: Progress and Prospects, Banff, Alberta, Canada, 2008 г; 3-ей конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, 2009 год; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Дни иммунологии в Сибири, Красноярск, 2010 г.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста, включая рисунков и 5 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (216 наименований).
ичный вклад автора Все основные эксперименты, включая исследование биохимических, антигенных и иммуногенных свойств штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, оценку стабильности ДНК-вакцины in vitro и vivo, исследование длительности персистенции в организме животных, иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNATCI в виде суппозиториев, а также анализ полученных результатов выполнены автором лично. Постановка ELISpot была проведена совместно с с.н.с. ФБУН ГН - ВБ Вектор Каплиной О.Н. Исследования патогенности штаммов S. enteritidis Eи S. enteritidis E23/pcDNA-TCI проводились совместно с сотрудниками Научноисследовательского центра токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (НИ - ТБП) ФМБА РФ.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Характеристика рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI Ранее в ФБУН ГН - ВБ Вектор была создана ДНК-вакцина pcDNA-TCI (рис.
1), которая кодирует полиэпитопный белок TCI, объединяющий в своей структуре более 80-ти ЦТЛ-эпитопов из белков ВИЧ-1 субтипов А, В и С (Bazhan et al., 2004).
bla CMVpr TCI pcDNA-TCI 6657 bp Bam H I (2112) Eco R I (2121) Hind III(2130) BGH polyA Pst I (3544) Sma I (3304) Рис. 1. Структура ДНК-вакцины pcDNA-TCI (Bazhan et al., 2004).
TCI - ген, кодирующий белок TCI;
CMVpr - эукариотический промотор цитомегаловируса;
BGH polyA - сигнал полиаденилирования;
bla - ген устойчивости к ампициллину;
Указано положение сайтов узнавания для эндонуклеаз рестрикции.
Вакцинный векторный аттенуированный штамм S. enteritidis E23 был получен профессором Бойченко М.Н. (Московская медицинская академия им. И.М.
Сеченова) из штамма дикого типа S. enteritidis 1791. Данный штамм несет делеционные мутации в генах cya и crp. Ранее на мышах, телятах и обезьянах показано, что патогенность штамма S. enteritidis E23 снижена в 100 тыс. раз по сравнению с родительским диким штаммом, причем, при многократных пассажах S. enteritidis E23 через организм животных его вирулентность не изменяется (Рыжова и Бойченко, 1997).
Плазмида рсDNA-TCI была введена в состав S. enteritidis E23 с помощью электропорации, в результате чего был получен рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/рсDNA-TCI (Карпенко и др., 2005). Полученный штамм задепонирован в музее ФБУН ГН - ВБ Вектор (регистрационный номер В-883).
Чтобы убедиться в том, что введение плазмиды рсDNA-TCI в состав клеток аттенуированного штамма сальмонеллы S. enteritidis E23 не повлияло на степень аттенуации, а также другие микробиологические и биохимические его свойства, нами было проведено всестороннее исследование свойств рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/ pcDNA-TCI.
Прежде всего, было изучено влияние плазмиды pcDNA-TCI на биохимический фенотип рекомбинантного штамма, так как он составляет основу дифференциации мутантных штаммов от штаммов дикого фенотипа.
Для определения спектра биохимической активности бактериальные штаммы S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI исследовали с помощью систем мультимикротестов для биологической идентификации энтеробактерий: ММТ-Е1 и ММТ-Е2 (производства Центра клинической фармакологии и фармакотерапии, г.
Ставрополь) согласно инструкции по применению производителя. Бактериальные клетки вносили в 96-луночный планшет с горизонтальными и вертикальными рядами лунок, в которых находились субстратно-индикаторные среды. Системы позволяют определить 12 ключевых показателей ферментативной активности энтеробактерий: образование сероводорода, индола, наличие активности лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы, способность к утилизации цитрата натрия, малоната натрия, маннита, сахарозы, лактозы, сорбита. В результате было показано, что плазмида не влияет на биохимические свойства рекомбинантного штамма. Как S. enteritidis E23, так и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI отличались от штамма дикого типа отсутствием способности утилизировать цитрат.
При производстве вакцины на основе S. enteritidis E23/pcDNA-TCI необходимо отработать короткую и надежную схему идентификации вышеуказанного штамма, позволяющую отличить его от дикого штамма сальмонеллы, а также других энтеробактерий (прежде всего, от штаммов E.coli как наиболее вероятных контаминантов). В результате анализа литературных данных и проведенных экспериментов было предложено использовать для идентификации штамма следующие компоненты: среда эндо, минимальный цитратный агар, агар Клиглера, агар Симонса, а также определение антигенной структуры с использованием специфических агглютинирующих сывороток (O: 1, 4, 5, 9, 12, ABCDE и H: i, g, m, 1, 2).
Согласно разработанной схеме была проведена сравнительная характеристика следующих энтеробактерий: E.coli BL, E.coli DH5F', дикий штамм S. typhymurium 415 и аттенуированные штаммы S. typhymurium SL7207, S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI. Было показано, что сероводород продуцируют только штаммы сальмонелл, причем как рекомбинантный штамм S.enteritidis E23/ pcDNATCI, так и аттенуированные штаммы (S. typhymurium SL 7207, S. enteritidis E23) начинали продуцировать сероводород после 18 часов инкубации, что вызывало почернение агара Клиглера. Это свойство является одним из дифференциальных признаков диких и аттенуированных штаммов сальмонелл. Рост штаммов E. сoli на среде Клиглера происходил без ее окрашивания, так как жизненный цикл E. сoli проходит без выделения сероводорода.
Было показано, что как аттенуированные, так и рекомбинантный штаммы сальмонелл были неспособны к росту и изменению цвета на агаре Симонса в течение 48 часов инкубации. В отличие от аттенуированных штаммов, дикий штамм S. typhimurium 415 хорошо рос на агаре Симонса и вызывал почернение агара Клиглера. Штаммы S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI различались по скорости роста в питательной среде YTx2. Если оптическая плотность суспензии штамма S. enteritidis E23 повышалась до значений, равных о.е., за 2,5 часа культивирования, то в случае S. enteritidis E23/pcDNA-TCI этот показатель составлял 4 часа. Кроме того, исследуемые штаммы отличались чувствительностью к антибиотику. Рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI обладал способностью к росту на среде с ампициллином, что объясняется наличием в составе плазмиды pcDNA-TCI гена bla, кодирующего bлактамазу и обеспечивающего тем самым устойчивость рекомбинантного штамма к антибиотику в концентрации 100 мкг/мл. В отличие от рекомбинантного, исходный штамм S. enteritidis E23 не рос на среде с ампициллином.
В отдельной серии экспериментов было проведено определение антигенной структуры штамма S. enteritidis E23 и рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI. Исследуемые штаммы высевали на среду эндо для получения отдельных колоний. Полученные колонии исследовали в реакции агглютинации на стекле с использованием адсорбированной поливалентной О-сыворотки к сальмонеллам групп A, B, C, D, E согласно антигенно-диагностической схеме Кауфмана-Уайта. Каждый индивидуальный штамм испытывали также с Осывороткой каждой группы отдельно. Было показано, что исследуемые штаммы относятся к D группе. После этого определяли полную структуру О-антигенов с помощью агглютинирующих моновалентных сывороток, содержащих антитела к О1, О4, О5, О9, О12 антигенам, присущим представителям указанной группы сальмонелл. При определении Н- антигенов штаммы сначала типировали наборами (пулами) Н-антисывороток. После этого штаммы типировали индивидуальными сыворотками, входящими в тот набор (пул), с которым наблюдался положительный результат. В результате проведенных экспериментов было установлено, что бактериальная культура исследуемого штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI имела антигенную формулу О: 1, 9, 12, Н: g, m., и таким образом, по антигенным характеристикам соответствовала культуре штамма S. enteritidis E23.
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что рекомбинантный штамм Salmonella enteritidis Е23/pcDNA-TCI достоверно определяется как представитель рода Salmonella, и по антигенной структуре соответствует серовару исходного бесплазмидного штамма Salmonella enteritidis Е23. Рекомбинантный штамм отличается от исходного по скорости роста в жидкой питательной среде и чувствительности к антибиотику ампициллину.
Оценка патогенности S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI В ходе оценки вирулентности исходного и рекомбинантного штаммов было показано, что клинические симптомы заражения и гибель животных наблюдались в течение первых 15 дней у мышей, которым оба исследованных штамма вводили внутрибрюшинно в дозах от 106 до 109 микробных клеток/животное. Гибели мышей при внутрижелудочном способе введения, а также крыс при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении бактериальных препаратов в вышеуказанных дозах не наблюдалось. Показатель ЛД50 штамма S. enteritidis Eпри внутрибрюшинном заражении составил для белых мышей (6,8 0,3)х1микробных клеток/животное, для штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI - (2,9 0,4)х108 м.к./животное. В соответствии с общепринятой классификацией (МУ № 1743-77, МУК № 4.2.2602-10.4.2.26) бактериальные препараты, значение ЛДкоторых (в lg на животное) при внутрибрюшинном способе введения мышам и крысам превышает, соответственно, 6 lg и 7 lg, а при внутрижелудочном введении - 9 lg, относятся к невирулентным штаммам. Следовательно, можно заключить, что как вакцинный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, так и исходный штамм S. enteritidis E23 являются невирулентными штаммами, вместе с тем, значение ЛДдля рекомбинантного штамма было выше, чем для исходного.
Анализ динамики гибели животных в течение 15 дней после внутрибрюшинного введения культур, подвергнутых термической обработке, показал, что ЛД50 для S. enteritidis E23 составила (4,70,2)х108 микробных клеток /животное, для S. enteritidis E23/pcDNA-TCI- (5,20,5)х108 клеток/животное. То есть, согласно классификации (МУ № 1743-77, МУК № 4.2.2602-10.4.2.), оба штамма могут быть отнесены к малотоксичным (ЛД50 - 7 - 9 lg на животное).
В эксперименте по оценке токсигенности исследуемых штаммов сальмонелл в течение 15 дней после введения фильтратов клеточных культур гибели животных в опытных и контрольных группах не зарегистрировано. Показатель ЛД50 для обоих штаммов составил более 1,6 мл/животное при внутрибрюшинном и более мл/животное при внутрижелудочном введении для 3-7-суточных культур, что позволяет охарактеризовать исследуемые штаммы сальмонелл как нетоксигенные.
Анализ данных, полученных в ходе комплексной оценки патогенности исследованных штаммов, позволил заключить, что рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, также как штамм-реципиент S. enteritidis E23, являются невирулентными, малотоксичными, нетоксигенными и могут быть отнесены к штаммам, непатогенным для теплокровных животных. Более того, показано, что по уровню вирулентности штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI является менее патогенным, чем штамм S. enteritidis E23. Одной из гипотез, объясняющих вышеуказанный факт, является присутствие в клетках рекомбинантного штамма плазмиды pcDNA-TCI. Поскольку бактериальная клетка вынуждена тратить свои ресурсы на репликацию плазмиды, это приводит к уменьшению скорости деления бактерии, что, в свою очередь, вероятно, позволяет организму легче справиться с плазмидсодержащей сальмонеллой. Следствием этого является уменьшение жизнеспособности, а значит, и патогенности бактериального штамма в клетках млекопитающих.
Оценка стабильности плазмиды pcDNA-TCI в составе S. enteritidis E23/pcDNA-TCI in vitro Стабильность рекомбинантной плазмиды pcDNA-TCI в составе рекомбинантных клеток Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI определяли стандартным способом путем пересева на чашку с агаром, содержащим ампициллин (100 мкг/мл) или не содержащим антибиотик. Исследование показало, что плазмида стабильно сохраняется в составе клеток аттенуированного штамма S. enteritidis E23. Не обнаружено статистически значимого уменьшения количества клеток, несущих плазмиду, в течение 10 пересевов. После последнего пересева было проведено сравнение генетической идентичности плазмиды pcDNA-TCI, выделенной из клеток рекомбинантной сальмонеллы S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, со стандартным образцом. Плазмидная ДНК pcDNA-TCI была проанализирована с помощью рестрикционного анализа. На рисунке 2 приведена электрофореграмма продуктов реакции гидролиза pcDNA-TCI. В качестве положительного контрольного образца был использован образец плазмидной ДНК pcDNA-TCI, задепонированной под номером № 2342 в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГН - ВБ Вектор. Показано, что исследуемый образец плазмидной ДНК pcDNA-TCI по рестрикционному профилю соответствует музейному образцу.
М 1 Рис. 2. Электрофореграмма в 1 %-ном агарозном геле ДНК- фрагментов, полученных гидролизом плазмиды П.н.
П.н.
pcDNA-TCI эндонуклеазами рестрикции BglII и PsiI: дорожка М- 1 кb ДНК 30маркер, длины фрагментов составляют 23 2010000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 14 153000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 и 11250 п.н., дорожка 1-плазмида pcDNA-TCI 1000 9(из Коллекции микроорганизмов ГН - ВБ 500 4Вектор), дорожка 2-плазмида pcDNA2TCI, выделенная из культуры клеток S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.
Персистенция штаммов S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных, иммунизированных указанными штаммами в составе суппозиториев. Оценка стабильности плазмиды pcDNATCI в составе S. enteritidis E23/pcDNA-TCI in vivo Для определения длительности нахождения штаммов S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме животных эксперимент проводили следующим образом. Лабораторных мышей иммунизировали перректально штаммами S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев массой 100 мг каждый, содержащих 108 клеток, однократно или двукратно.
Суппозитории были изготовлены по технологии, разработанной в ИМБТ ФБУН ГН - ВБ Вектор. Через 6 часов и на 2, 4, 5, 10, 16, 28, 35, 63, 70 сутки животных подвергали эвтаназии, после чего забирали образцы крови и внутренних органов животных (легкие, печень, селезенка, тонкий кишечник, пейеровы бляшки).
Гомогенаты органов высевали на чашки с агаризованной питательной средой LB.
После 18 часов инкубации при 37oС подсчитывали выросшие на чашках колонии.
Проведенные эксперименты показали, что ни в один из сроков наблюдения после однократной и двукратной перректальной иммунизации мышей не удалось обнаружить бактерий штаммов S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в легком и крови иммунизированных животных. Было показано, что исследуемые штаммы высевались из печени, селезенки, тонкого кишечника и пейеровых бляшек. На рисунке 3 приведены графики, отражающие персистенцию сальмонеллы в селезенке при однократном и двукратном введении штаммов S.enteritidis E23 и S.enteritidis E23/pcDNA-TCI.
А 181614Рис. 3. Длительность 12нахождения клеток 10S. enteritidis E23 и 8S. enteritidis E23/pcDNA6TCI в селезенке 400 иммунизированных мышей при однократном 2(а) и двукратном (б) 5 10 16 28 35 63 70 перректальном введении дни после иммунизации соответствующих S.enteritidis E23, высев на среде без Ар, однократно штаммов сальмонелл в S.enteritidis E23/pcDNA-TCI, высев на среде с Ар, однократно виде суппозиториев.
Б Различия в значениях 18показателя между 16исходным и 14рекомбинантным 12штаммами недостоверны 10(р>0,05).
86425 10 16 28 35 63 дни после иммунизации S.enteritidis E23, высев на среде без Ар, двукратно S.enteritidis E23/pcDNA-TCI, высев на среде с Ар, двукратно Видно, что единичные клетки сальмонелл штаммов S.enteritidis E23 и S.enteritidis E23/pcDNA-TCI появляются в селезенке на 5 сутки, максимальное количество клеток в органе обнаружено на 16 сутки в количестве 400300 и 1200400 КОЕ/селезенку соответственно. Штаммы сальмонелл продолжали высеваться из селезенки до 63 суток после однократного введения. После второй количество КОЕ на орган количество КОЕ на орган иммунизации на 28 сутки наблюдается повторное повышение количества клеток сальмонелл штаммов S.enteritidis E23 и S.enteritidis E23/pcDNA-TCI в органе до уровня 10070 и 400100 КОЕ/селезенку соответственно, однако в этом случае более высоких значений показателя не наблюдалось. После двукратного введения сальмонелл на 70-ый день от начала иммунизации клетки обоих штаммов в селезенке не обнаруживаются. Различия между группами мышей, иммунизированных S.enteritidis E23 и S.enteritidis E23/pcDNA-TCI, были статистически недостоверны (при уровне значимости р>0,05).
В ткани тонкого кишечника бактерии штаммов S.enteritidis E23 и S.enteritidis E23/pcDNA-TCI выявлялись уже через 6 часов после иммунизации и продолжали регистрировать в дальнейшем в течение 4 дней. В пейеровых бляшках штаммы S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI обнаруживались со 2 по 15 день после однократного введения.
Таким образом, показано, что введение плазмиды pcDNA-TCI не повлияло на свойство рекомбинантного штамма, связанное со способностью персистировать в организме животных только ограниченное время.
Для проверки фенотипической подлинности бактерии, выделенные из селезенки, печени и пейеровых бляшек, высевали на чашки с агаром, затем выращивали в жидкой питательной среде LB. Было показано, что колонии бактерий по культуральным и биохимическим характеристикам соответствовали штаммам S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI. Полученные данные подтверждают данные авторов штамма (Рыжова и Бойченко, 1997), которые показали, что S. enteritidis E23 сохраняет свой авирулентный фенотип при многократном пассировании через организм мышей.
Из бактериальных клеток сальмонелл, полученных после высевов из исследуемых органов, была выделена плазмидная ДНК для проведения рестрикционного анализа. Анализ показал, что плазмида была идентична музейному варианту плазмиды pcDNA-TCI (Коллекция бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГН - ВБ Вектор, №2342) (рис. 4).
Рис. 4. Электрофореграмма в 1%-ном агарозном геле ДНК- фрагментов, M 1 2 3 полученных гидролизом плазмиды pcDNATCI эндонуклеазами рестрикции BglII и PsiI: дорожка 1-плазмида pcDNA-TCI П.н.
(Коллекция бактерий, бактериофагов и П.н.
грибов ФБУН ГН - ВБ Вектор), дорожка 342-плазмида pcDNA-TCI, выделенная из 26 23печени мышей, иммунизированных 18S. enteritidis E23/pcDNA-TCI на 35 день 14 14после иммунизации, дорожка 3- плазмида 119 9pcDNA-TCI, выделенная из селезенки мышей, иммунизированных S. enteritidis 4E23/pcDNA-TCI на 35 день после 4иммунизации, дорожка 4- плазмида 2pcDNA-TCI, выделенная из пейеровых бляшек мышей, иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI на 15 день после иммунизации, дорожка М- /StyI, длины фрагментов составляют 19329, 7743, 6223, 4254, 3472, 2690, 1882, 1489, 925, 4и 74 п.н.
Доказательство экспрессии гена, кодируемого pcDNA-TCI, in vivo Как известно, пейеровы бляшки являются одним из основных органов расселения сальмонелл и иммунологически важной структурой в отношении формирования мукозального иммунного ответа. Для проверки эффективности доставки плазмиды pcDNA-TCI in vivo с использованием аттенуированной сальмонеллы из пейеровых бляшек мышей на 3 день после иммунизации S. enteritidis E23/pcDNA-TCI была выделена тотальная клеточная РНК.
Предполагаемая транскрипция гена TCI была исследована с помощью реакции ОТПЦР. Как показано на рисунке 5, фрагмент ДНК с длиной 1191 пар оснований был амплифицирован только с РНК мыши, иммунизированной S. enteritidis E23/pcDNATCI. В то же время не было обнаружено ДНК- фрагментов, амплифицированных в ОТ-ПЦР с РНК контрольной мыши, иммунизированной S. enteritidis E23.
Полученный ДНК- фрагмент соответствует по длине гену TCI.
1 М Рис. 5. Электрофореграмма ОТ-ПЦР- продуктов в 1 %-ном агарозном геле:
дорожка М - маркер /StyI-гидролизат, длина фрагментов 19 329, 7743, 6223, 4254, 3472, 2690, 1882, 1489, 925, 421 и 14п.о.; дорожка 1-продукт ОТ-ПЦР, 11925 полученный с использованием РНК мышей, иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI; дорожка 2 - продукт ОТ4 ПЦР, полученный с использованием РНК мышей, иммунизированных S. enteritidis E23 (контрольный образец).
Иммуногенные свойства S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиторной формы.
Т-клеточный иммунный ответ, индуцированный штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI Как известно, ДНК-вакцина pcDNA-TCI кодирует полиэпитопный иммуноген TCI, который был сконструирован с учетом ЦТЛ-эпитопов, рестриктированных молекулами HLA человека. Поэтому для представления иммунной системе человека основная часть эпитопов может адекватно процессироваться только в клетках человека. Для оценки специфической активности вакцины на стадии доклинического изучения на животных (мышах и обезьянах) в последовательность белка TCI были введены несколько эпитопов мыши (H-2d) и обезьяны Macaca mulatta (Mamu).
Т-клеточный иммунный ответ был проанализирован методом ELISpot по наличию ИНФ--продуцирующих лимфоцитов в селезенках иммунизированных мышей с использованием рекомбинантного белка TCI, а также пептидов из белка Env ВИЧ-1, рестриктированных молекулами МНС I класса (пептид N15DRVIEVVQGAYRAIR и пептид N16 -KQIINMWQEVGKAMYA).
Результаты ELISpot представлены на рисунке 6. Полученные данные свидетельствуют о появлении IFN-- продуцирующих клеток при стимуляции ВИЧ-специфическими антигенами уже на 16 сутки от начала иммунизации. Их уровень превышает в 2,5 (в случае специфических пептидов) и в 4 раза (в случае рекомбинантного белка TCI) количество клеток, стимулированных неспецифическим пептидом EHEC. Максимальный Т-клеточный иммунный ответ наблюдали на 35 сутки от начала иммунизации, далее на 63 день (на 35-е сутки от второй иммунизации) происходило его некоторое снижение.
Эти результаты подтверждают тот факт, что после иммунизации мышей штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI происходит экспрессия целевого гена и синтез белка TСI, который процессируется и представляется соответствующему клону CD8+ лимфоцитов, являющихся продуцентами IFN-. На основании полученных данных можно утверждать, что рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущий ДНК-вакцину, введенный в организм животных в составе ректальных суппозиториев, обеспечивает антиген-специфическую активацию цитотоксических Т-лимфоцитов у иммунизированных мышей.
2* 2* S. enteritidis E23 (контроль) 1* S. enteritidis * E23/ pсDNA1TCI * * 16 35 сутки после иммунизации Рис. 6. Количество IFN-- продуцирующих спленоцитов у мышей, двукратно иммунизированных штаммами S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев, содержащих 108 клеток сальмонелл. Для обеих групп животных спленоциты были рестимулированы пептидами DRVIEVVQGAYRAIR, KQIINMWQEVGKAMYA, белком TCI и полипептидом EHEC в качестве отрицательного контроля. Результаты представлены как среднее значение IFN-- продуцирующих клеток на 5х105 спленоцитов стандартное отклонение (n = 5). *-Различия между показателями опытной и контрольной групп достоверны, р<0,05.
/500000 спленоцитов TCI TCI TCI EHEC EHEC EHEC P15+PP15+PP15+Pколичество IFN-gamma продуцирующих клеток Гуморальный иммунный ответ, индуцированный штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI Следует отметить, что при конструировании белка TCI (T- cell immunogen) были выбраны эпитопы из основных белков ВИЧ-1 Env, Gag, Pol и Nef (субтипов А, В и С), которые индуцируют как CD8+ ЦТЛ, так и CD4+ Т-хелперы (Бажан и др., 2004). В последовательностях нативных вирусных белков эти эпитопы локализованы в нескольких непрерывных областях как частично, а иногда и полностью перекрывающиеся пептиды. Эти непрерывные районы содержат ряд Вклеточных эпитопов, которые перекрываются с Т-клеточными эпитопами. Именно поэтому иммунизация мышей плазмидой pcDNA-TCI, кодирующей белок TCI, способна индуцировать как Т-клеточный, так и В-клеточный иммунные ответы против ВИЧ-1.
Следующей задачей нашей работы была оценка возможности индукции гуморального иммунного ответа у мышей, иммунизированных штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев. Для исследования иммуногенных свойств рекомбинантного штамма была проведена однократная и двукратная перректальная иммунизация мышей линии BALB/c штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев, содержащих 108 клеток сальмонелл. Способность рекомбинантной S. enteritidis E23/pcDNA-TCI индуцировать системный гуморальный иммунный ответ у лабораторных животных оценивали путем измерения уровня антител к рекомбинантному белку TCI в образцах сывороток с помощью ИФА. Получение рекомбинантного белка TСI проводили по методике, описанной в работе (Лебедев и др., 2008). Чистота и гомогенность белка TCI, определенная методом электрофореза в 13% полиакриламидном геле, составляла 95%. ИФА проводили в соответствии с СОП №4-006/01-12. Было показано, что иммунизация мышей индуцирует продукцию специфических IgG антител к белку TCI (рис. 7).
После однократной иммунизации специфические антитела в крови мышей появлялись уже на 16 день (рис. 7а). Максимальный титр антител наблюдался на сутки после иммунизации и составлял 1:245. Повторная иммунизация на 28 сутки после первой вызывала усиление продукции специфических антител.
Максимальных значений титр антител (1:4050) достигал на 35 сутки после первой инъекции (7 день после повторной иммунизации), после чего наблюдалось его снижение в течение 28 суток до уровня 1:470 (рис. 7б).
Дополнительное подтверждение специфичности сывороток крови мышей, иммунизированных штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев, было получено при использовании метода иммуноблотинга (рис. 8). Анализ проводили с использованием коммерческой тест-системы New-Lav-Blot1 (BioRad), на стрипах которой нанесен лизат белков ВИЧ-1, предназначенный для выявления наличия специфических антител к нативным белкам вируса.
А Б 350 50* * 45340235302251201511000 * * 516 35 16 35 дни после иммунизации дни после иммунизации Рис. 7. Титры анти-TCI IgG после иммунизации мышей S. enteritidis E23/pcDNA-TCI и S. enteritidis E23 в виде суппозиториев, содержащих 108 клеток сальмонеллы (а, однократная иммунизация и б, двукратная иммунизация). - анти-TCI IgG в группе контрольных животных, иммунизированных S. enteritidis E23; - анти-TCI IgG в группе мышей, иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI. Данные представлены как средний титр антител стандартное отклонение (n = 5). *-Различия между показателями опытной и контрольной групп достоверны, р<0,05.
титры антител титры антител Рис. 8. Анализ специфичности сывороток Gp 1мышей, иммунизированных S. enteritidis Gp 110/1E23/pcDNA-TCI и S. enteritidis E23 в виде суппозиториев, содержащих 108 клеток, P68/методом иммуноблотинга с использованием Pтест-системы УNew-Lav-Blot1Ф(Bio-Rad).
P52/GpА - Объединенная сыворотка мышей, Pиммунизированных штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев, P34/получена на 35 сутки (двукратная P24/25 иммунизация).
В - К+ (положительный контроль - P18/17 сыворотка ВИЧ-положительного человека из набора УNew-Lav-Blot1Ф).
С - объединенная сыворотка мышей, иммунизированных штаммом S. enteritidis E23 в составе суппозиториев, получена на 35 сутки (двукратная иммунизация).
A B C Антитела, продуцируемые в ответ на иммунизацию мышей S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев, содержащих 108 клеток, специфически распознавали вирусные белки ВИЧ-1 на стрипах из набора УNew-Lav-Blot1Ф, в то же время на стрипе, инкубированном с контрольной сывороткой, окрашивания не наблюдалось. Таким образом, была показано, что суппозитории, содержащие S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, индуцируют наработку антител, специфично узнающих природные белки ВИЧ-1.
Мукозальный иммунный ответ, индуцированный штаммом S.enteritidis E23/pcDNA-TCI Сыворотки, полученные после иммунизации лабораторных мышей штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев, были исследованы на наличие специфичных IgА против TCI.
В результате было показано, что при однократном введении рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI лабораторным мышам максимальный титр сывороточных IgA против TCI наблюдался на 35 сутки и составлял 1:100 (рис.9а). На 63 сутки он снижался до уровня 1:50.
А 1* Рис. 9. Титры анти-TCI 1IgА после иммунизации мышей S. enteritidis E23/pcDNA-TCI и S. enteritidis E23 в виде * суппозиториев, cодержа* щих 108 клеток сальмонеллы (а, однократная иммунизация и б, двукратная иммунизация).
- анти-TCI IgА в группе контрольных животных, иммунизированных 16 35 S. enteritidis E23; - антисутки после иммунизации TCI IgА в группе мышей, Б иммунизированных 5* S. enteritidis E23/pcDNA4TCI.
4Данные представлены как 3средний титр антител 3стандартное отклонение (n 250 = 5). *-Различия между показателями опытной и 2* контрольной групп 1достоверны, р<0,05.
1* 16 35 сутки после иммунизации Максимальный титр IgA против TCI при двукратном введении наблюдался на 35 сутки (7 сутки после повторной иммунизации) и составлял 1:400, на 63 сутки происходило его снижение до 1:100 (рис. 9б).
Согласно имеющимся литературным данным, титры специфических IgA антител в сыворотке могут косвенно свидетельствовать о наличии и специфических секреторных IgA (Bemark et al., 2012).
Таким образом, в ходе проделанной работы был подробно охарактеризован аттенуированный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, подтверждена его способность индуцировать как системный Т- клеточный и гуморальный, так и титр антител титр антител мукозальный иммунный ответ при введении в виде суппозиториев. Показано, что штамм обладает ограниченной персистенцией и безвреден для организма теплокровных животных. Полученные данные позволяют утверждать, что аттенуированный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI пригоден для разработки кандидатной вакцины против ВИЧ-1 СаВИЧ Д.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что клетки штамма S. enteritidis E23 и рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, содержащего плазмиду, имеют одинаковые биохимические свойства и антигенные маркеры, при этом рекомбинантный штамм устойчив к ампициллину и растет в 1,6 раза медленнее.
2. Установлено, что плазмида pcDNA-TCI стабильно сохраняет свою структуру в клетках S. enteritidis E23 в условиях in vitro и in vivo.
3. Показано, что штаммы S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI имеют показатель ЛД50 при внутрибрюшинном заражении белых мышей (6,80,3)х106 и (2,90,4)х108 микробных клеток/животное, соответственно, что позволяет отнести их к невирулентным. Термически инактивированные культуры S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI являются малотоксичными и имеют показатели ЛД50, равные (4,70,2)х108 и (5,20,5)х108 микробных клеток/животное, соответственно. Показатель ЛД50 для фильтратов клеточных культур обоих штаммов составил более 1,6 мл/животное, что позволяет сделать вывод об отсутствии у бактериальных штаммов токсигенных свойств.
4. Установлено, что штаммы S. enteritidis E23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI обладают ограниченной способностью к персистенции в организме мышей при введении суппозиториев, содержащих 108 клеток соответствующего штамма.
Клетки S. enteritidis E23/pcDNA-TCI обнаруживаются в селезенке иммунизированных мышей вплоть до 63-го дня после однократного и до 70 дня после двукратного введения суппозиториев. В пейеровых бляшках как рекомбинантный, так и исходный штаммы обнаруживаются со 2-го по 15-ый день после однократного введения. В крови и легких иммунизированных животных сальмонелл не обнаружено в течение всего срока наблюдения.
5. Показано, что препарат суммарной РНК из клеток пейеровых бляшек мышей, иммунизированных S. enteritidis E23/ pcDNA-TCI в составе суппозиториев, содержит специфическую РНК, соответствующую гену TCI, что свидетельствует об экспрессии гена TCI в данных клетках лабораторных животных.
6. Показано, что введение мышам S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев вызывает индукцию ВИЧ-специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунного ответа. Схема иммунизации, основанная на двукратном введении S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, является более эффективной, чем на однократном.
Публикации в отечественных и зарубежных журналах 1. Karpenko L.I., Danilenko A.V., Bazhan S.I., Danilenko E.D., Sysoeva G.M., Kaplina O.N., Volkova O.Y., Oreshkova S.F, Ilyichev A.A. Attenuated Salmonella enteritidis E23 as a vehicle for the rectal delivery of DNA vaccine coding for HIV-polyepitope CTL immunogen // Microbial Biotechnology. - 2012 - Т.5, №2. - Р.241250.
2. Даниленко А.В., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Даниленко Е.Д., Бабенко О.А., Батенева А.В., Каплина О.Н., Ильичев А.А.. Иммуногенные свойства ДНК вакцины, кодирующей ВИЧ-1 полиэпитопный CTL иммуноген в составе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23 // Сиб. мед. журн. - 2009. - Т.24, №4, вып. 1. - С.67-72.
3. Даниленко А.В., Карпенко Л.И., Даниленко Е.Д., Бабенко О.А., Батенева А.В., Акулова Н.И., Ильичев А.А, Каплина О.Н. Изучение гуморального иммунного ответа у лабораторных животных на рекомбинантный аттенуированный штамм сальмонеллы, несущий ДНК-вакцину pcDNA-TCI, при различных схемах иммунизации // Достижения современной биотехнологии: сб. науч.тр. / Под ред.
проф. И. Г. Дроздова.-Новосибирск - 2008. - С.147-156.
Публикации в материалах всероссийских и международных конференций 1. Даниленко А.В., Карпенко Л.И., Даниленко Е.Д., Каплина О.Н., Бабенко О.А., Батенева А.В., Ильичев А.А. Изучение гуморального иммунного ответа и различных аспектов персистенции CYA, CRP-аттенуированного рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при перректальном способе иммунизации // Дни иммунологии в Сибири: Всерос. науч.-практ. конф с международным участием, Красноярск, 1-3 марта 2010 г.: сб. тез.- Крас., 2010., С.18-19.
2. Даниленко А.В., Карпенко Л.И., Даниленко Е.Д., Бабенко О.А., Батенева А.В., Каплина О.Н., Ильичев А.А. Исследование гуморального иммунного ответа и длительности персистенции аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при различных способах введения // Конференция по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, (3; 2009; Москва): сб. тез. - М., 2009. - Т.2. - С. 3. Даниленко А.В., Даниленко Е.Д., Бабенко О.А., Батенева А.В., Акулова Н.И., Каплина О.Н., Карпенко Л.И. Кандидатная ВИЧ-1 вакцина на основе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI. Исследование гуморального иммунного ответа и длительности персистенции // Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Всерос. науч.-практ. конф., - Москва, 11 - 12 нояб. 2008 г.: сб. тез.-М., 2008.-С.4. Даниленко А.В., Карпенко Л.И., Батенева А.В., Даниленко Е.Д., Бабенко О.А., Акулова Н.И., Ильичев А.А. Исследование длительности персистенции аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при различных способах введения // Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний: Всерос. науч.
конф.: сб. тез. - СПб., 2008.- С.30.
5. Karpenko L.I., Veremeiko T.A., Danilenko A.V., Levagina G.M., Danilenko E.D., Bazhan S.I., Ilyichev A.A. HIV-polyepitope DNA vaccine in suppositories. Results of Preclinical study // HIV Vaccines: Progress and Prospects, March 27 - April 1, 2008, Banff, Alberta (Canada). Abstr. Book.-2008.-(A 223).-P.102.-Keystone Symposia Global Health Ser.
БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает благодарность сотрудникам отдела биоинженерии ФБУН ГН - ВБ "Вектор": Каплиной О.Н. за помощь в проведении ИФА и ELISPOT, Слесаренко Л.В. за техническую помощь в работе и дружеское участие, и всем остальным сотрудникам отдела за ценные советы и помощь в экспериментальной работе и оформлении диссертации. Автор также благодарит сотрудников Института медицинской биотехнологии Терещенко Т.А., Левагину Г.М. за помощь в получении суппозиториев, Лебедева Л.Р. за помощь в получении рекомбинантного белка TCI.