Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

БЕЛОГЛАЗОВА Елена Викторовна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ПЕТУХОВ КАК МИШЕНЕЙ ДЛЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ МАНИПУЛЯЦИЙ

03.02.07 - Генетика

03.03.01 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

п. Дубровицы, Московская обл.

2012

Работа выполненав Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители:	доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна;
	доктор биологических наук Волкова Наталья Александровна.

Официальные оппоненты:	доктор биологических наук Коршунова Людмила Георгиевна ГНУ ВНИТИ птицеводства, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии;
	доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич - пенсионер.

               

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится л11декабря 2012 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института:  142132 Московская область, Подольский район,  пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ,  т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖ.

Автореферат разослан л___ ноября2012 года.

Ученый секретарь Cовета Д 006.013.03                                        И.В. Гусев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Использование клеток гонад рассматривается как один из перспективных методов получения трансгенных животных, в том числе птицы [Коржикова С.В., 2002; Савченкова И.П. и др., 2006;  Новгородова И.П. и др., 2008;Эрнст Л.К. и др., 2008;Волкова Н.А. и др., 2011].Несмотря на наличие целого ряда методов доставки рекомбинатной ДНК в эмбриональные клетки птиц [SangH., 2004.PetitteJ. etal., 2004; Kamihira М. etal., 2005; KawabeY. etal., 2006;Эрнст Л.К. и др., 2009], интерес к использованию клеток семенников сохраняется вследствие их природной способности поглощать чужеродную ДНК и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения. При этом интегрированная в геном организма чДНК может устойчиво передаваться в ряде поколений. Ввиду проведения манипуляций на взрослых животных значительно сокращаются материальные и временные затраты на получение трансгенного потомства.

Среди всех типов клеток сперматогенного эпителия интерес исследователей сосредоточен на использовании стволовых клеток сперматогоний. Популяция данного типа клеток постоянно обновляется, что открывает широкие возможности реализации их потенциала при получении трансгенной птицы: репликация сперматогонийинициирует комплексный процесс их дифференцировки, приводящий к появлению высоко специализированных половых клеток - спермиев. 

Вместе с тем, не смотря на ряд преимуществ использования половых клеток в качестве объекта для адресной доставки ДНК, на сегодняшний день нет однозначных данных о молекулярных механизмах транспорта генов в данные клетки-мишени и эффективных способах их трансформации. Решение данной проблемы позволит получить простой и удобный способ создания трансгенных животных, т.к. искусственное осеменение давно успешно используется в сельскохозяйственной практике.

Цель и задачи.Целью диссертационной работы явилась характеристика половых клеток петухов как мишеней для генно-инженерных манипуляций.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить гистологические особенности семенников у разновозрастных петухов.
2. Дать характеристику популяций клеток сперматогенного эпителия в зависимости от возраста петухов.
3. Выявить оптимальныйвозраст петухов для проведения генно-инженерных манипуляций с клетками сперматогеного эпителия.
4. Определить эффективность генетической трансформации клеток семенников петуховinvitro с использованием ретровирусных векторов.
5. Изучить результативность генетической трансформациисперматогенных клеток петуховinvivo.

Научная новизна. Впервые подробно изучены гистологические особенности семенников петухов, находящихся на различных физиологических стадиях сперматогенеза. Дана характеристика популяций клеток сперматогенного эпителия семенных канальцев в динамике. Исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителияпосредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток сперматогенного ряда семенниковinvivo.

Практическая значимость. Определен возраст петухов, при котором в семенниках наблюдается максимальное количество сперматогоний - перспективных клеток-мишеней для генно-инженерных манипуляций. Отработан метод введения генных конструкций в семенники петуховinvivo. Оптимизированы условия введения ретровирусных векторов в данный орган-мишень. Показана способность трансформированных сперматогоний к дальнейшей дифференцировке: наличие рекомбинантной ДНК установлено в спермиях по достижении половой зрелости. 

Основные положения, выносимые на защиту

• Соотношение клеток разных типов в семенных канальцах семенников петухов изменяется в зависимости от возраста.
• В сперматогенном эпителии семенных канальцев петухов постоянно присутствуют стволовые клетки сперматогонии, число которых изменяется в процессе онтогенеза.
• Клетки сперматогенного эпителия петухов могут быть трансформированы invivo с использованием ретровирусных векторов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: научной конференции Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра, С.-Петербург, 2010 г., Высокие технологии, исследования, промышленность, С.-Петербург, 2010 г., научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, 2011, 2012 гг.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 3.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 100  страницах, содержит 9 таблиц, 28 рисунков. Список литературы содержит 150 источников, в том числе 112 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2008 по 2012 гг. в Центре физиологическом дворе ГНУ ВИЖРоссельхозакадемии согласно схеме, представленной на рисунке 1.

Примечание: ПЦР - полимеразная цепная реакция, ИГХ Циммуногистохимия

Рис.1.Схема исследований

Объектом исследований служили петухи кросса Птичное. Образцы семенников отбирался при убое птицы.Гистологические исследования семенников петухов (n=95) проводились в 19 возрастных категориях (от 1 недели до 12 месяцев). В каждой группе было исследовано по 5 голов.

Для фиксации ткани семенников использовался раствор Буэна. Дегидратацию исследуемых образцов ткани и их заливку в парафин проводили по общепринятой методике[Ромейс Б., 1953]. Срезы семенников готовили на ротационном микротоме и окрашивали растворами гематоксилина и эозина. Анализ полученных гистопрепаратов осуществляли на микроскопе Opton (Германия), объективы х40, х16, с использованием программы ImageScope (г. Москва, ООО Системы для микроскопии и анализа).При анализе учитывались только семенные канальцы, имеющие округлую  форму. От каждого опытного петуха было проанализировано не менее 30 семенных канальцев.Клетки сперматогенного эпителия идентифицировали по их морфологии.Содержание ДНК в сперматогенныхклетках определяли при окраске гистопрепаратовпо Фельгину[Микроскопическая техника:Руководство, 1996].

Для трансформации клеток сперматогенного эпителия петухов использовали ретровирусныегенные конструкцииpLgfpSN и pBMN-lacZ, содержащие, соответственно, репортерные гены GFP (зеленый флюоресцирующий белок) и lacZ.Трансформацию клеток сперматогенного эпителия invitroосуществляли путем совместного культивирования с клетками-упаковщицами и добавлениявирусного препарата, представляющего собой среду культивирования клеток-упаковщиц и содержащего рекомбинантный ретровирус[Новое в клонировании ДНК, 1989]. Частоту генетической трансформации определяли как отношение числа генетически трансформированных клеток к общему числу клеток.

Введение генных конструкций (суспензия клеток-упаковщиц и вирусный препарат)в семенники петуховinvivoосуществляли в возрасте 2-2,5 месяцев. Для получения инъекционного раствора клеток-упаковщицихресуспензировали в среде DMEM, содержащей полибрен (8мкг/мл). Вирусный препарат также вводили с добавлением полибрена (8 мкг/мл).

Выделение ДНК из эмбрионов кур осуществляли солевымметодом[Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Наличие рекомбинантной ДНК в эмбрионах кур определяли методом ПЦР.Экспрессию рекомбинантных белков в клетках сперматогенного эпителия семенников петуховизучали методом иммуногистохимии с использованием первых антител, специфичных к GFP.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием стандартной компьютерной программы MicrosoftExcel.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.  Особенности сперматогенеза петухов в различные возрастные периоды

Гистоструктура семенных канальцев петуха характеризовалась наличием соединительно-тканной оболочки, внутренний слой которой был образован сперматогенным эпителием. Данный слой был представлен двумя популяциями клеток: поддерживающими клетками (клетки Сертоли) и сперматогенными клетками на разных стадиях дифференцировки (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды, спермии).

С возрастом число семенных канальцев на единицу площади ткани семенника изменялось (табл. 1).

Табл. 1.Морфологическая характеристика гистоструктуры семенника петуха

Возраст	Среднее число семенных канальцев на 1 мм2	Среднее число сперматогенных клеток в семенном канальце, n	Диаметр  семенных канальцев	Площадь семенных канальцев
1 нед	20122	250,3	50,51,2	187182
2 нед	1889	300,3	61,41,1	271593
3 нед	1707	300,2	60,80,9	263874
4 нед	1459	310,3	62,10,5	277140
5 нед	1368	300,3	62,10,6	279559
6 нед	1276	400,4	67,00,8	320771
7 нед	12911	380,4	66,70,6	320355
8 нед	1319	440,4	65,00,8	303676
9 нед	12210	500,8	68,00,9	333197
10 нед	1169	580,5	69,11,0	336890
11 нед	1178	540,5	73,01,5	3862153
12 нед	10812	620,4	86,20,9	5348116
3,5 мес	883	700,6	97,22,3	6963306
4 мес	747	2261,7	111,71,1	8962172
4,5 мес	626	2911,8	169,010,8	17787282
5 мес	172	7115,6	191,92,0	27092564
5,5 мес	152	9136,0	195,02,6	27877525
6 мес	182	11547,6	186,82,0	23760491
12 мес	153	114810,6	216,26,3	362542297

В период с 7-дневного до 3,5-месячного возраста наблюдалось постепенное снижение числа семенных канальцев на 1 мм2срезапри равномерном увеличении клеток сперматогенного эпителия -в 2,3 и 2,8 раза, соответственно. В последующий период с 3,5 до 5 месяцев данные изменения были более выраженными. За счет значительного увеличения размеров канальцев наблюдалось снижение их числа на единицу площади среза в 5,2 раза по сравнению с предыдущим периодом. Это было связано, прежде всего, с увеличением числа клеток сперматогенного эпителия в семенных канальцах более чем в 10 раз по сравнению с 3,5-месячным возрастом. В период с 5 до 12 месяцев размеры канальцев и число клеток в них изменялись незначительно: различия по данным показателям не превышали 38%.

Вариабельность возрастных изменений в гистоструктуре ткани семенника петуха была обусловлена особенностями развития клеток сперматогенного эпителия.В возрасте 7 дней в семенных канальцах петуха встречались 2 типа клеток: клетки Сертоли и ранние половые клетки - сперматогонии,  число которых в одном семенном канальце достигало, соответственно, 160,3 и 90,2. Клетки Сертоли располагались на периферии семенного канальца и имели ядро пирамидальной или овальной форм, расположенное перпендикулярно базальной мембране.Сперматогонии характеризовались наличием хорошо оформленного крупного ядра со светлой цитоплазмой и встречались как на периферии, так и внутри семенного канальца. На данной стадии развития просвет семенного канальца отсутствовал.

В возрасте 14 дней наблюдалась концентрация сперматогоний  по периферии семенного канальца. Между петлями извитых канальцев, в рыхлой неоформленной соединительной ткани встречались хорошо различимые  интерстициальные клетки. Число клеток Сертоли в семенном канальце увеличивалось до 230,2. Количество сперматогоний при этом не изменялось Ц70,1.

В возрасте 3-х недель в отдельных семенных канальцах появлялся просвет. При этом число половых клеток значительно не менялось.

На  срезах семенников петухов 4-х недельного возраста число клеток Сертоли в семенном канальце снижалось до 200,2. При этом количество сперматогоний незначительно увеличивалось до 110,1.

В пяти недельном возрасте практически во всех семенных канальцах отчетливо выявлялся просвет. Клетки сперматогенного ряда располагались по базальной мембране. Наблюдалась физиологическая гибель части клеток Сертоли. Количество данного типа клеток в семенном канальце снижалось до 140,3. Число сперматогоний, напротив, увеличивалось до 15,50,2. При этом отмечались делящиеся формы сперматогоний в стадиях профазы и метафазы - промежуточные клетки.

В возрасте 6-7 недель наблюдалось дальнейшее увеличение размеров семенных канальцев, внутри них четко выявлялся просвет. Между клетками Сертоли почти сплошным слоем располагались сперматогонии. Число клеток Сертоли значительно не менялось - 130,2. Количество сперматогоний увеличивалось до 24,10,2. Выявлялся новый тип клеток сперматогенного ряда - сперматоциты первого порядка. Данные клетки располагались во втором ряду от мембраны и имели округлую форму, большое ядро и светлую цитоплазму. Число их составляло 3,30,2.

В 8-12 недельном возрасте наблюдалось незначительное увеличение числа клеток сперматогенного эпителия(рис. 2). Клетки Сертолирасполагались на стенке канальцев в один ряд.  Между ними почти сплошным слоем залегали сперматогонии, количество которых практически не изменялось и варьировало от 260,1 до 290,2. Отмечалось значительное увеличение числа сперматоцитов первого порядка - до 240,2.

В семенных канальцах видны сперматогонии и сперматоциты первого порядка на разных стадиях мейоза. 1 - сперматогония, 2 - сперматоцит 1 порядка, 3 - клетка Сертоли.  Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: об.х40, ок. х15.

Рис.2.Гистоструктурасеменника петуха в возрасте 12 недель

В возрасте 3,5 месяцев в отдельных семенных канальцах семенников петухов выявлялся новый тип клеток - сперматоциты второго порядка. Их количество в одном канальце не превышало 2,70,1.

Семенные канальцы 4-месячных петухов характеризовались наличием всех клеток сперматогенного эпителия, за исключением спермиев. Сперматогонии располагались на базальной мембране сплошным слоем, между ними были видны клетки Сертоли, имеющие типичную пирамидальную форму. Над сперматогониями в 2-3 ряда располагались сперматоциты и ранние сперматиды. Число клеток Сертоли составляло 70,1, сперматогоний - 310,7, первичных - 250,4и вторичных сперматоцитов - 14,50,4на разных стадиях мейоза и молодых круглых сперматид - 1482,7.

В возрасте 4,5-5 месяцев сперматогенные клетки достигали уровня развития поздних грушевидных сперматид и зрелых спермиев (рис. 3). В семенных канальцах были видны все сперматогенные клетки, характерные для активного сперматогенеза, значительная часть семенных канальцев содержала зрелые спермии.Число клеток сперматогенного эпителия в этом возрасте колебалось в следующих пределах: сперматогонии - 362,0; сперматоциты первого порядка - 2094,7 и второго - 1461,8, сперматиды - 1511,9, спермии - 1622,1 и клетки Сертоли - 70,1.

В возрасте 6-ти и 12-ти месяцев число клеток сперматогенного эпителия значительно не изменялось и варьировало в следующих пределах: сперматогонии - 40±2,5 и 381,4, сперматоциты первого порядка - 3501,4 и 3217,4,  второго - 2635,8 и 2623,8, сперматиды - 2164,2 и 2623,8, спермии - 2791,6 и 2773,6 и клетки Сертоли - 6±0,2 и 70,3, соответственно.

В семенных канальцах представлены сперматогонии, сперматоциты первого и второго порядка, сперматиды и спермии. 1 - сперматогония, 2 - сперматоцит 1-го порядка, 3 - сперматоцит 2-го порядка, 4 - сперматида, 5 - спермии. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: об.х40, ок. х15.

Рис. 3.Гистоструктура семенника петуха в возрасте 5 месяцев

Динамика изменения морфологического состава клеток сперматогенного эпителия семенников петухов в зависимости от возраста представлена на рисунке 4.

Рис.4.Морфологический состав клеток сперматогенного эпителия семенников петухов в динамике

3.2.Пролиферативная активность клеток сперматогенного эпителия петухов

Ввиду того, что для генетической трансформации клеток семенников петухов планировалось использование генных конструкций на основе рекомбинантных ретровирусов, были проведены дополнительные исследования по оценке содержания ДНК в ядрах сперматогоний разновозрастных петухов, т.к. этот показатель является критерием пролиферативной активности клеток.

Высокое содержание ДНК в ядрах сперматогоний  было установлено в возрасте от 2 недель до 3 месяцев  - до 47,41,1отн. ед.(табл. 2). Исходя из этого, с учетом процентной доли сперматогоний в семенных канальцах в качестве оптимального возрастного периодадля введения генных конструкций в семенники петухов invivoбыл выбран возраст от 1,5 до 3 месяцев.

Табл. 2.Морфофункциональная характеристика сперматогониев петухов в различные возрастные периоды, Mm (Cv,%)

Возраст	Количество сперматогониев в одном семенном канальце		Содержание ДНК, отн. ед.
	n	%
2 нед	6,70,1(16)	22,3	37,60,9 (22)
1 мес	10,80,2 (21)	34,8	44,01,1 (23)
1,5 мес	24,30,3(13)	60,8	47,41,1 (22)
2 мес	29,20,4(11)	66,4	40,71,2 (27)
2,5 мес	28,70,3(10)	51,3	38,80,9 (21)
3 мес	28,60,2(11)	46,1	38,01,0(24)
4 мес	31,10,2(9)	13,8	36,30,7(19)
5 мес	32,30,5 (13)	4,5	30,90,9(28)
6 мес	39,60,4(11)	3,4	26,10,8(29)
12 мес	38,40,4(9)	3,3	29,90,8(26)

3.3. Эффективность трансфекции клеток семенников петухаретровирусными векторами в культуре invitro

На первом этапе с целью оценки тропности используемых ретровирусных генных конструкций был проведен ряд экспериментов по переносу экзогенной ДНК в клетки семенника петуха в культуре invitro.

Проведенные исследования показали эффективность использования данных векторов для трансформации клеток семенника петуха. При этом частота генетической трансформации данных клеток-мишеней варьировала в зависимости от типа используемого ретровирусного препарата. Так, при использовании ретровирусного вектора pBMN-lacZ наибольшее число генетически трансформированных клонов было получено при совместном культивировании клеток-мишеней с клетками-упаковщицами. В данном случае из 1000 инфицированных клеток было получено 4 трансформированных клона, в которых наблюдалась экспрессия репортерного гена lacZ. При инфицировании эмбриональных клеток кур вирусным препаратом, представляющим собой среду культивирования клеток-упаковщиц, эффективность трансформации клеток-мишеней была в 2,8 раз ниже и составила 1,4*10-3.

Аналогичные данные были получены и при использовании ретровирусного вектора pLgfpSN. В данном случае эффективность генетической трансформации первичной культуры клеток семенника петуха была несколько выше по сравнению с использованием ретровирусного вектора pBMN-lacZ и составила при использовании клеток-упаковщиц 5,5*10-3, а при инфицировании вирусным препаратом 3,2*10-3.

Результаты исследований, полученные в опытах in vitro, послужили основой для проведения дальнейших исследований по переносу рекомбинантной ДНК в семенники петухов in vivo.

3.2. Введение ретровирусных генных конструкций в клетки

семенников  петуховinvivo

Введение генной конструкции pLgfpSNв семенники петухов осуществляли по схеме, представленной в таблице 3.

Табл. 3.Схема эксперимента по введению генной конструкции pLgfpSNв семенники петухов in vivo

Показатели	Группа
	I	2	3	4
Способ подготовки генной конструкции для инъекции	ВП	КК	КК	КК
Объем суспензии, мл/сем	1	1	1	1
Концентрация вирусного препарата, КОЕ/мл	4,2 х 105	-	-	-
Концентрация клеток-упаковщиц, млн. клеток	-	0,5	1	2
Возраст животных, мес.	2	2	2	2
Количество животных, n	3	3	3	3

Примечание: КК - суспензия клеток-упаковщиц, ВП - вирусный препарат.

Интеграция и экспрессия генаGFP в клетках сперматогенного ряда была установлена как при введении вирусного препарата, так и после инъекции суспензии клеток-упаковщиц (рис. 5). Число трансформированных сперматогенных клеток в одном семенном канальце варьировало от 1 до 26 независимо от используемого источника генной конструкции.

При введении в семенники самцов петухов вирусного препарата из 60 проанализированных срезов только в 51  из них было выявлено наличие семенных канальцев с трансформированными сперматогенными клетками:  доля таких канальцев на одном срезе достигала 15,7±2,1%(табл. 4).

1а	1б
2а	2б

Примечание:1 - в возрасте 3 месяцев, 2 - в возрасте 6 месяцев; а - опыт, б - контроль. Трансформированные клетки выделены рамкой. Увеличение: х100 (2а, 2б), х400 (1а, 1б).

Рис.5.Иммуногистохимическое окрашивание семенников петухов на экспрессию репортерного гена GFP

Процент трансформированных клеток в семенных канальцах варьировал от 1,8 до 32,2% и составил в среднем по группе 1,5±0,3%.  Общая эффективность трансформации семенных канальцев и клеток сперматогенного слоя (отношение числа  трансформированных семенных канальцев и клеток к общему их числу во всех исследованных срезах, выраженное в процентах) составила, соответственно, 13,32,3 и 1,30,3%.

С целью повышения эффективности трансгенеза был проведен ряд экспериментов по оптимизации дозы вводимой генной конструкции в семенники самцов in vivo. В качестве источника генной конструкции использовали суспензию клеток-упаковщиц в концентрации от 0,5 до 2 млн. клеток. Предполагалось, что увеличение концентрации вводимых клеток-упаковщиц позволит повысить эффективность трансгенезасперматогенных клеток семенников петухов. Однако с увеличением дозы введения клеток-упаковщиц наблюдалась обратная тенденция(табл. 4).

Табл. 4.Эффективность генетической трансформации семенных канальцев  и клеток сперматогенного эпителия семенников петухов in vivo генной конструкцией pLgfpSN

Показатель	Группа
	1	2	3	4
Концентрация вирусного препарата, КОЕ/мл	4,2х105	-	-	-
Количество клеток-упаковщиц, млн/семенник	-	0,5	1	2
Исследовано от каждого петуха срезов, n	20	20	20	20
Доля срезов с трансформированными семенными канальцами, %	85	85	50	35
Доля трансформированных семенных канальцев на срезе, %: - минимальная; - максимальная; - в среднем по группе	1,7 31,0 15,7±2,1	5,9 47,1 18,12,6	1,7 31,3 10,72,2	2,5 13,2 5,80,9
Общая эффективность трансформации семенных канальцев, %	13,32,3	9,12,7	8,62,2	2,30,9
Доля трансформированных сперматогенных клеток в семенных канальцах, %: - минимальная; - максимальная; - в среднем по группе	1,8 32,2 1,5±0,3	1,3 47,2 1,00,3	0,1 21,1 0,60,2	0,7 11,1 0,30,05
Общая эффективность трансформации клеток в семенных канальцах, %	1,30,3	0,50,2	0,30,2	0,10,04

Примечание: Общая эффективность трансформации семенных канальцев - отношение числа трансформированных семенных канальцев к общему числу исследованных семенных канальцев, выраженное в процентах. Общая эффективность трансформации сперматогенных клеток - отношение числа трансформированных сперматогенных клеток к общему числу исследованных клеток, выраженное в процентах.

Результативность переноса рекомбинантной ДНК в семенные канальцы и клетки сперматогенного слоя семенников петухов была ниже по сравнению с использованием вирусного препарата. Так, при инъекции в семенники самцов петухов суспензии клеток-упаковщиц в концентрации 0,5 млн. клеток общая эффективность трансформации семенных канальцев составила 9,12,7%, сперматогенных клеток - 0,50,2%, что было в 1,5-2,6 раз ниже аналогичных показателей, полученных при введении вирусного препарата. При введении клеток-упаковщиц в концентрации 2 млн. клеток на семенник различия по данным показателям были больше: эффективность трансформации семенных канальцев не превышала 2,30,9%, клеток сперматогенного слоя - 0,10,04%. Снижение эффективности трансформации сперматогенных клеток семенников при увеличении концентрации вводимых клеток-упаковщиц, возможно, связано с иммунной реакцией организма в ответ на введение чужеродных для него клеток.

Таким образом, проведенные исследования позволили оптимизировать условия введение генных конструкций в семенники петухов in vivo. Максимальная эффективность трансформации клеток сперматогенного слоя семенников установлена при использовании в качестве источника генной конструкции вирусного препарата. Исходя из этого, данный способ подготовки генных конструкций был использован нами в дальнейших исследованиях.

С целью изучения результативности передачи трансгена потомству была выполнена генетическая модификация семенников петухов in vivo (n=6) с использованием в качестве источника генных конструкций вирусного препарата.

Введение генной конструкции семенники петухов осуществляли в возрасте 2,5 месяцев. С целью объективной оценки эффективности передачи трансгена потомству исследования проводили на уровне эмбрионов. От каждого подопытного петуха было получено и проанализировано на наличие трансгена не менее 100 эмбрионов.Наличие рекомбинантной ДНК в эмбрионах кур определяли методом ПЦР.

Возможность передачи трансгена потомству была подтверждена у всех подопытных петухов. Однако количество полученных трансгенных эмбрионов  варьировало от 1 до 7 и составило в среднем 4,2%.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования генных конструкций на основе рекомбинантных ретровирусов для генетической трансформации клеток семенников петухов in vivo, что позволяет рассматривать перенос генов,опосредованный ретровирусными векторами, как альтернативный метод получения трансгенной птицы, характеризующийся невысокими временными и материальными затратами.

ВЫВОДЫ

1. Установленывозрастные периоды в онтогенезе петухов, характеризующие основные изменения гистоструктуры семенников. Показано, что в период с 7-дневного до 3,5-месячного возраста наблюдается постепенное снижение числа семенных канальцев на единицу площади ткани семенника (от 20122 до 883на 1 мм2) при относительно равномерном увеличении среднего числа клеток в них с 250,3до 700,6. Изменение данных показателей при возрастном интервале в 1-2 недели варьируют от 5 до 10%. Интенсивные изменения в гистоструктуре семенника отмечаются в возрасте от 3,5 до 5 месяцев. Площадь семенных канальцев и число клеток в них увеличиваются по сравнению с предыдущим периодом в 5,2 и 10,2 раза, соответственно. Максимальное развитие сперматогенного эпителия петухов наблюдается в возрасте 6 месяцев: число семенных канальцев на 1 мм2 ткани семенника снижается до 182при увеличении клеток в них до 11547,6.
2. Изучен морфологический состав клеток сперматогенного эпителия семенников у разновозрастных петухов.Установлено, что основным типом сперматогенныхклеток семенных канальцев ввозрасте 1-6 недель являются сперматогонии. С 7-недельного возраста в семенных канальцах визуализируются сперматоциты первого порядка, а с 3,5-4 месяцев - сперматоциты второго порядка и сперматиды. В возрасте 5 месяцев в семенных канальцах впервые выявляются спермии, число которых увеличивается к достижению возраста 6 месяцев и остается практически неизменным в возрасте 12 месяцев.
3. Установлен оптимальный период для проведения генно-инженерных манипуляций с клетками сперматогенного эпителия семенников петухов. Максимальныйпроцент сперматогоний в семенных канальцах и высокая пролиферативная активность данного типа клеток наблюдается в возрасте от 1,5 до 3 месяцев. В данный период доля сперматогоний от общего числа клеток сперматогенного эпителия достигает 66,4% при максимальном содержании ДНК в них - до 47 отн. ед.
4. Установлена компетентность сперматогенных клеток семенников петухаinvitro к рекомбинантным ретровирусам. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала от 1,4*10-3 до 5,5*10-3в зависимости генной конструкции и метода трансфекции.
5. Показана результативность введения ретровирусных векторов в семенники петуховinvivo с общей эффективностью трансформации семенных канальцев и клеток сперматогенного эпителия до18,12,6 и 1,30,30%, соответственно. Выявлена возможность передачи трансгена потомству с эффективностью 4,2%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

абораториям, занимающимся созданием и изучением трансгенных форм животных и птицы, рекомендуем:

1. Для генетической трансформации половых клеток петухов использовать генные конструкции, полученные на основе рекомбинантных ретровирусов.
2. Для эффективной трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников invivo осуществлять введение ретровирусных векторов в виде вирусного препарата в возрасте от 1,5 до 3 месяцев.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В журналах, рекомендованных ВАК

1. Эрнст, Л.К. Некоторые аспекты соматического переноса генов в половые клетки самцов сельскохозяйственных животных /Л.К. Эрнст, Е.В.Белоглазова,  Е.К. Томгорова, Н.А. Волкова, В.А. Багиров, Н.А. Зиновьева, Л.А.Волкова // Достижения науки и техники АПК. - 2009. - № 10. - С. 71-72.
2. Волкова, Н.А. Генетическая трансформация сперматогониев петухов in vivo / Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.А. Волкова, Е.В. Белоглазова, Т.О. Котова, Л.К. Эрнст // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2011. - № 1. - С. 45-47.
3. Белоглазова,Е.В.Возрастная динамика сперматогенеза у петухов в связи с оптимизацией сроков проведения биоинженерных манипуляций / Е.В. Белоглазова, Т.О.Котова, Н.А.Волкова, Л.А.Волкова, Н.А.Зиновьева, Л.К. Эрнст // Сельскохозяйственная биология. - 2011. - №6. -С. 60-64.

В других изданиях

4. Белоглазова, Е.В. Влияние различных факторов на эффективность соматического переноса генов в половые клетки петухов / Е.В.Белоглазова, Т.О.Котова, Н.А.Волкова, Л.А.Волкова, Н.А. Зиновьева// Сборник трудов Высокие технологии, исследования, промышленность. - 2010. - т. 4. - C. 95-96.
5. Тулякова, А.О. Эффективность использования ретровирусных векторов для локального трансгенеза кур / А.О.Тулякова, Е.В. Белоглазова, Д.В.Белоглазов, Н.А.Волкова, Л.А.Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Сборник материалов научной конференции Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра. - 9-11 июня 2010 г. - C. 217-220.
6. Зиновьева Н.А., Некоторые аспекты генетической трансформации сперматогониев петухов in vitro и in vivo/ Зиновьева Н.А., Волкова Н.А., Белоглазова Е.В., Томгорова Е.К.// Материалы VIII международной научно-практической конференции Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности, 2009, C. 120-121.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии