Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

КРАСНОПЕРОВА

Юлия Юрьевна

Характеристика изменений патогенного потенциала микроорганизмов-симбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях

03.00.07 Ц Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Оренбург Ц 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО Ульяновский государственный университет

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

Официальные оппоненты:        

доктор биологических наук, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова, профессор	Щербаков Анатолий Анисимович
доктор медицинских наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией коллекционных штаммов отдела Государственной коллекции патогенных бактерий  ФГУЗ РосНИПЧИ Микроб	Плотников Олег Петрович
доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней ФППС ГОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии	Каган Юда Давидович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Самарский государственный медицинский университет

Защита состоится л _   __  200 года в  __  часов на заседании диссертационного совета Д.208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460000, г.Оренбург, ул. Советская, д.6, зал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан л_____________________ 200 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

д.м.н., профессор                                 Немцева Наталия Вячеславовна        

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА работы

Актуальность проблемы.  Микробное сообщество является первичным звеном любых биоценозов и экосистем (Звягинцев, Добровольская, Лысак, 1993). Подавляющее большинство микробных биоценозов представляют собой сложившиеся симбиотические ассоциации, в которых между микроорганизмами складываются сложные и неоднозначные связи (Нетрусов и др., 2004; Дяковецкая, Лапшина, Шулаева, Фёдоров, 2005).

Популяции микроорганизмов, вступая в сложные взаимоотношения - конкурентные или кооперативные, при заселении различных частей органов, тканей макроорганизма формируют специфический его микросимбиоценоз (Проворов, 2001; Бухарин и др., 2006).

Анализ направленности межмикробных взаимоотношений ассоциативных микросимбионтов позволяет прояснить патогенез широкого спектра  заболеваний, правильно оценить происхождение тех или иных аномалий в структуре микросимбионтов, приводящих к изменению их типичных или проявлению новых биологических свойств (Бухарин, Усвяцов, Хуснутдинова, 2000, 2003, 2007; Миллер, 2000).

Изменения важных характеристик вирулентности участников микросимбиоценоза, наряду с их количественной оценкой, может существенно сказаться на течении заболеваний, осложнённых дисбиозом кишечника (Воробьев, Гинцбург, Бондаренко, 2000; Постникова и др. 2004; Багдасарян, 2007).

В последние годы появились данные о важной роли в формировании патобиоценозов кишечника, помимо бактерий и грибов, таких простейших как Еntamoeba hystolytica, Giardia lamblia и Criptosporidium (Воробьев и др., 2001; Плотников, 2002; Крылов, 2004). Менее известен протозооз, обусловленный паразитированием преимущественно в толстой кишке простейших Blastocystis hominis (Guignard et al., 2000; Taamasri et al., 2000; Abe, Wu, Yoshikawa, 2003). Возбудитель бластоцистной инвазии является микроорганизмом, к усилению агрессии которого, с одной стороны, могут приводить факторы, снижающие защитные силы макроорганизма, а с другой стороны - микроорганизмы, входящие в состав биоценоза.

Известно, что в природных биоценозах простейшие могут служить хозяевами для широкого круга патогенных и условно-патогенных бактерий (Домарадский, 1998; Литвин, 2003). Наибольший интерес среди микробов, вступающих в симбиотические связи с простейшими, привлекли микобактерии, псевдомонады, иерсинии, холерные вибрионы, сальмонеллы, эшерихии, франциселлы, кампилобактеры, листерии (Ермолаева, Романова, Тартаковский, 2005).

Работами В.И. Пушкаревой и соавт. (1989, 1990, 1996, 2003) показано, что бактерии, находясь в клетке простейших, избегают массовой гибели, а их хозяева - простейшие поддерживают их численность и вирулентность.

Проводимые исследования по характеристике ассоциативного симбиоза простейших с другими микроорганизмами ограничиваются изучением механизмов выживания и их взаимодействия вне макроорганизма, который также представляет собой среду обитания для огромного количества видов микробов (Несвижский, Воробьев, Белоносов, 1997; Шендеров, 1998, 1999; Ардатская, Дубинин, Минушкин, 2001). В связи с этим, вопрос о роли простейших в изменении численности и вирулентности представителей симбиоценозов макроорганизма остается открытым.

Раскрытие механизмов межмикробных взаимодействий, определяющих формирование и поддержание ассоциативных симбиозов организма хозяина в норме и при патологических состояниях, открывает перспективы решения фундаментальных проблем микробиологии - выявления причинно-следственных связей формирования патогенных вариантов микросимбионтов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось теоретическое обоснование и оптимизация подхода к микробиологическому мониторингу патогенного потенциала микросимбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях. 

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Показать взаимосвязь между особенностями строения клеточной поверхности и вирулентностью микросимбионтов B.hominis.
2. Определить характер изменений микробиоценоза кишечника на фоне бластоцистной инвазии.
3. Дать оценку изменения вирулентности E.coli в рамках ассоциативного симбиоза с бластоцистами в условиях кишечного биотопа.
4. Провести анализ динамики численности популяций B.hominis и E.coli при совместном культивировании.
5. Исследовать взаимодействие вегетативных форм E.coli с цистами B.hominis при действии антибактериальных препаратов.
6. Выявить изменения встречаемости генетических детерминант факторов патогенности, обеспечивающих поддержание численности E.coli в ассоциации с B.hominis in vitro.
7. Дать комплексную оценку направленности изменений биологических свойств участников протозойно-бактериального симбиоценоза при взаимодействии до и после сокультивирования.

Новизна исследования. Показана взаимосвязь между структурными особенностями клеточной поверхности Blastocystis hominis и их вирулентностью. Литическое действие на клетки B.hominis различной вирулентности оказывали ферменты, обладающие протеазной, хитиназной, глюканазной, липазной и целлюлазной активностями. Отмечена закономерность изменения скорости лизиса при действии липазы на все три группы штаммов бластоцист - с усилением вирулентности замедляется скорость лизиса. Целлюлазы способны лизировать клетки только высоко- и умеренновирулентных B.hominis. Это может свидетельствовать в пользу того, что при укреплении клеточной  оболочки целлюлозой усиливаются вирулентные свойства бластоцист, а клетки умеренно- и авирулентных вариантов B.hominis имеют области незащищенной мембраны вследствие частичного или полного отсутствия защитной целлюлозной оболочки.

В опытах in vivo установлена диссоциация эшерихий по показателю вирулентности. У штаммов E.coli, выделенных в консорциуме с высоковирулентными бластоцистами значения показателя вирулентности (LD50/lg) были выше, чем с умеренновирулентными и авирулентными.

Впервые исследована динамика численности популяций B.hominis и E.coli при совместном культивировании. Показано, что в результате межмикробного взаимодействия выявлено устойчивое совместное существование популяций эшерихий и бластоцист, с сохранением высокой численности микросимбионтов.

Показано взаимодействие вирулентных и авирулентных E.coli с цистами B.hominis при действии дестабилизирующих факторов, таких как антибактериальные препараты.

Впервые установлено, что в условиях микросимбиоценоза с B.hominis, происходит увеличение частоты встречаемости генетических детерминант факторов патогенности, обеспечивающих адгезию и токсинообразование среди выделенных фенотипических групп E.coli, а также селекция клонов с сочетаниями генов, не встречавшихся у штаммов, изученных до сокультивирования и в монокультурах.

Дана оценка изменения патогенного потенциала микросимбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях после совместной инкубации. Показано, что неферментирующие и гемолитические эшерихии в тандеме с высоко- и умеренновирулентными бластоцистами обоюдно усиливали вирулентность, напротив, кишечные палочки с нормальной ферментативной активностью угнетали активность факторов патогенности бластоцист. В сообществах E.coli с нормальной ферментативной активностью и авирулентных бластоцист отмечен индифферентный характер взаимодействия.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные расширяют и углубляют представления о характере межмикробных взаимодействий, определяющих формирование и поддержание микросимбиоценозов кишечника, что позволит оптимизировать диагностику, профилактику и коррекцию риска формирования патомикробиоценозов.

Разработаны и утверждены Способ заражения экспериментальных животных бластоцистами (патент РФ №2224465), Способ воспроизведения язвы желудка на фоне экспериментального бластоцистоза (патент РФ №2239236), Способ воспроизведения ишемии толстого кишечника на фоне бластоцистной инвазии (патент РФ №2310239). Создан метод сокультивирования микроорганизмов в условиях бактериально-протозойных ассоциаций in vitro (заявка на получение патента РФ №2008147600). Данные методики могут быть использованы в практических лабораториях и научно-исследовательских учреждениях при диагностике и прогнозировании течения широкого спектра заболеваний, ассоциированных с дисбиотическими состояниями кишечника.

Результаты изучения взаимодействия вегетативных форм E.coli с цистами B.hominis при действии стрессорных факторов, а именно антибактериальных препаратов, возможно использовать для оптимизации проведения химиотерапии патологий микробного генеза.

Внедрение в практику. По материалам диссертационной работы написаны монографии Бластоцистная инвазия и дисбактериоз кишечника, Экологические параметры микробиоты кишечника при протозойных инвазиях Простейшие Blastocystis hominis и их влияние на макроорганизм; практические рекомендации: Экологическая характеристика микробиоценоза кишечника, Особенности микроэкологии кишечника больных псориазом, Биологические свойства микробов-симбионтов в условиях протозойно-бактериальных ассоциаций макроорганизма, Дисбиоз кишечника и методы его диагностики.

Основные положения и выводы диссертационной работы включены в лекционные курсы и практические занятия для студентов биологических и медицинских специальностей по темам: Микробная экология, Особенности этиопатогенеза эндогенных инфекций, Инфекционный и постинфекционный иммунитет; в практику клинической и бактериологической лабораторий ГУЗ Городской клинической больницы №1 г. Ульяновска при диагностике и оценке микробиоценоза кишечника, при определении чувствительности микробов к антибиотикам.

Положения, выносимые на защиту

1. Обоснован симбиотический подход к оценке динамики патогенного потенциала микросимбионтов в ассоциации E.coliЦB.hominis, позволяющий выявить некоторые условия селекции вирулентных эшерихий в кишечном биотопе.
2. Молекулярно-генетический анализ при изучении ассоциативных симбиотических взаимодействий способствует выявлению основных направлений взаимоадаптации микроорганизмов в изменяющихся условиях симбиоценоза.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Российской научно-практической конференции УАктуальные вопросы педиатрии и детской хирургииФ (Ульяновск, 2000); VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням "Проблема инфекции в клинической медицине" (Санкт-Петербург, 2002); Юбилейной научной конференции, посвящённой 80 - летию кафедры микробиологии Военной медицинской академии и 300 летию основания Санкт - Петербурга УСовременная микробиология  в клинической медицине и эпидемиологии (Санкт - Петербург, 2003); II Международной  научно - практическая конференция. "Медицинская Экология" (Пенза, 2003); Международной конференции, посвященной 125-летию К.И. Скрябина и 60-летию основания Лаборатории гельминтологии АН СССР - Института паразитологии РАН Основные достижения и перспективы развития паразитологии (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции  Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека (Ульяновск, 2005); Falk Symposium № 142 (Birmengem, 2005); Международной конференции Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных (Ульяновск, 2006); I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов (Ульяновск, 2007); Всероссийской конференции с международным участием Медико-физиологические проблемы экологии человека (Ульяновск, 2007). 

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 45 работ, из них 12 статей в рецензируемых научных журналах; изданы 4 практических пособия  и 3 монографии; получены 3 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на страницах машинописи, содержит введение, 5 глав, заключение, выводы, практические рекомендации, указатель литературы, включающий в себя 102 отечественных и 391 иностранных источников. Иллюстрации представлены 35 таблицами, 57 рисунками.

Основные разделы работы выполнены по плану НИР Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета Биология простейших Blastocystis hominis и их влияние на макроорганизм (№гос. регистрации 01.200.2211659).

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

Исследования микробного пейзажа кишечника проводили в период с 2002 по 2007 года на базе бактериологической лаборатории городской клинической больницы №1 г. Ульяновска (табл. 1).

                                                                                Таблица 1

Количество штаммов E.coli, изолированных из протозойно-бактериальных ассоциаций толстой кишки человека

Группы доминантных микросимбионтов E.coli	Вирулентность ассоциантов- B.hominis,  LD50/lg
	Высокая 4,40,3Ц5,30,2	Умеренная 3,20,3Ц 4,30,1	Отсутствие вирулентности	Отсутствие B.hominis
Гемолитические	130	45	-	-
Неферментирующие	69	43	36	-
С нормальной ферментативной активностью	29	32	33	134
Итого:	228	120	69	134

В работе использовали штаммы  E.coli, выделенные из фекалий 307 пациентов в возрасте от 20 до 75 лет, находившихся на лечении в условиях дневного гастроэнтерологического стационара Городской поликлиники № 5 г. Ульяновска.

Контрольную группу составили 150 практически здоровых лиц репрезентативных по полу и возрасту, из которых 134 (89,3 %) - неинфицированных данными простейшими.

При изучении микробиоценозов кишечника согласно Приказу № 535 от 22.04.85 МЗ РСФСР Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях и лечебно-профилактических учреждениях, определяли как частоту высеваемости отдельных видов, так и их количественные показатели в пересчете на 1 г фекалий (Сорокин, Федорова, 1990; Крылов, Козлович, Решетнева, 1994).

В качестве контрольных также использовали эталонные штаммы E.coli, содержащие гены, детерминирующие синтез факторов патогенности (табл. 2).

                                                                                Таблица 2

Эталонные штаммы E.coli

Ген	Фактор патогенности	Штамм E.coli	Ген	Фактор патогенности	Штамм E.coli
papC	фимбрии P	763/К, 853/63	fimA	фимбрии 1 типа	763/К, 853/63
papH	фимбрии P	763/К, 853/63	hlyB	-гемолизин	763/К, 853/63
sfaG	фимбрии S типа	763/К, 853/63	cnf1	цитотоксический некротизирующий фактор-1	763/К, 853/63
sfaA	S фимбрии типа	763/К, 853/63	stx1	шигаподобный токсин 1 типа	О157:117, Я-10, Я-23
eaeA	интимин	Н 10407	stx2	шигаподобный токсин 2 типа	О157:117 Я-10, Я-23
ehx	энтерогемолизин	О157:117 Я-10, Я-23		отрицательный контроль	J-62

Молекулярно-генетические исследования с применением полимеразно-цепной реакции (Маккреди, Чимера, 1999) проводили на базе клинико-диагностической лаборатории Государственного учреждения здравоохранения Ульяновской областной клинической больницы №1 (ГУЗ УОКБ).

Для постановки полимеразно-цепной реакции выделение бактериальной ДНК проводили по методу Boom et al. (1988) c использованием гуанидинтиоцианата (GuSCN). Подбор праймеров и температуры отжига осуществляли при использовании пакета программ Lasergene (США). Праймеры синтезированы в НПФ ДНК-технология (Россия). Для получения достаточного количества копий искомого характеристического фрагмента ДНК амплификация включает 20-40 циклов. Регистрацию результатов ПЦР осуществляли путем электрофоретического разделения продуктов амплификации на окрашенном бромистым этидием агарозном геле (Маккреди, Чимера, 1999). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерной программы Vector NTI Suite (США).

       Определение факторов патогенности таких как: гемолитическая, липолитическая, ДНК-азная, протеолитическая, лецитоветилазная проводили с использованием общепринятых методик (Биргер, 1982).

Колициногенная активность изучалась методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-культуры использовали музейный штамм E.coli К-12 ГИСК №240367 (плотность 10 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК Л.А. Тарасевича).

Чувствительность бактерий определяли к следующим антимикробным препаратам: ампициллину, стрептомицину,  цефазолину, гентамицину. Для выявления степени антибактериальной активности определяли минимальную подавляющую концентрацию химиопрепарата (Навашин, Чучалин, Белоусов, 1998).

Для получения аксеничных культур B.hominis использовали среду Suresh (Suresh, Ng, 1993), в анаэробных условиях.

Изучение действия гидролитических ферментов с известной субстратной специфичностью на клетки изолятов бластоцист проводили по методу Степной О.А. и соавт. (2003) на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г.Пущино (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН). В работе использовали следующие гомогенные, очищенные ферменты: протеазу Lysobacter sp. XL 1(7Е/мг) (10), липазу панкреатическую (EC 3.1.1.74; Sigma; 250 Е/мг), пектиназу (EC 3.1.1.73), целлюлазу (EC 3.2.1.4), -глюкуронидазу (EC 3.1.6.2; Worthington biochemical corporation; 30 Е/мг,  5 Е/мг, 0,03 Е/мг соответственно), эндоглюканазу Aspergillus terreus 5 Е/ мг (EC 3.2.1.155; любезно предоставлена Рязановой Л.П. ИБФМ им Г.К. Скрябина РАН), хитиназу Serratia marcescens ((EC 3.2.1.14; Sigma; 0,01Е/мг).

Культивирование с целью изучения взаимного влияния микробов-симбионтов в протозойно-бактериальной ассоциации проводили с использованием разработанной питательной среды (приоритетная справка №2008114890 от 5.10.2008) с определением количества взаимодействующих микробов и индекса обилия (ИО) (Степанских, 2000).

С целью изучения взаимодействия E.coli с цистами B.hominis на 21-е сутки совместного культивирования контрольные и опытные посевы подвергали действию антибактериальных препаратов ампициллина, стрептомицина, гентамицина и цефазолина в концентрации 60,6; 47,3; 39,2 и 10,4 мкг/мл, с последующим высевом для проведения качественной и количественной оценки микробов и их свойств.

Степень вирулентности микробов (LD50/lg) определяли внутрибрюшинной и кератоконъюнктивальной пробами с использованием белых мышей и морских свинок.

Полученные данные обработаны для медико-биологических работ критериями параметрической и непараметрической статистики. Для параметров указывалась точность оценки. В работе использовался 95% и 99% доверительный интервал.

При сравнении двух связанных групп использовался парный одновыборочный t-критерий; при сравнении двух независимых групп применялся непарный двухвыборочный t-критерий Стыодента. Непараметрические (качественные) данные двух независимых групп сравнивались с помощью критерия хи-квадрат Пирсона, а также подвергались корреляционному анализу по методу Спирмена.

Статистическую обработку результатов исследований выполняли на персональном ЭВМ типа IBM Pentium III, графическая обработка материалов выполнена с помощью пакета прикладных программ Exel-2000. Для статистической обработки материала, применена компьютерная программа StatSoft Statistica 6.O. (Лакин, 1990; Зайцев, 2003).

Результаты исследования 

Известно, что вирулентность микроорганизмов в значительной мере определяется строением клеточной стенки (Бухарин и др., 2004). Ранее показано, что вирулентность микросимбионтов B.hominis значительно варьирует (Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю.Красноперова, Чебан, Ильина, 2000; Красноперова, Глебова, Лазарев, Курзин, 2007), тем не менее, не изученной остается взаимосвязь степени вирулентности бластоцист и особенностей структуры клеточной стенки возбудителя.

       Основываясь на известных в литературе немногочисленных и фрагментарных данных относительно строения клеточной поверхности B.hominis мы предположили, что клетки простейших могут либо вовсе не иметь клеточных покровов, либо иметь покровы, включающие хитин (как например у корненожек, солнечников, биченосцев и инфузорий), целлюлозу, пектин (сходство с растительной клеткой). В случае если клетки бластоцист не имеют клеточной оболочки, они должны быть чувствительными к действию липаз или протеаз. Можно также предположить участие в организации клеточных покровов полисахаридов, распространенных у животных и бактерий - гиалуроновых или тейхуроновых кислот (Наумова, Шашков, 1997), и полимеров, характерных для клеточных стенок грибов - глюкана, структурных белков (Калебина, Кулаев, 2001;  Klis, 1994; Kapteyn, Van Den Ende, Klis, 1999).

       Поэтому для проверки действия на клетки B. hominis были выбраны следующие ферменты: липаза, протеаза, пектиназа, целлюлаза, глюкуронидаза,  глюканаза, хитиназа. В ходе эксперимента определяли количество жизнеспособных клеток бластоцист разной вирулентности после воздействия на них ферментов.

Результаты исследования показали различия в гидролитической активности и скорости проявления положительных эффектов изучаемых ферментов в зависимости от выраженности вирулентных свойств бластоцист. Литическое действие на клетки авирулентных, умеренно- и высоковирулентных B.hominis оказывали ферменты, обладающие протеазной (=0,95; =0,91; =0,86 соответственно), хитиназной (=0,83; =0,72; =0,72 соответственно), липазной (=0,9; =0,89; =0,88 соответственно) и глюканазной активностями (=0,79; =0,73; =0,71 соответственно). Под действием данных ферментов происходило значительное снижение популяционной численности бластоцист, уменьшение размеров клеток B.hominis с 15 мкм до 7 мкм, сжатие и затемнение цитоплазмы. Нами показаны отличия в скорости лизиса при действии липазы и целлюлазы на все три группы штаммов бластоцист. С увеличением вирулентности простейших замедлялась скорость проявления положительного действия при действии липазы от 1 до 4 часов, при воздействии целлюлазы  отмечался прямо противоположный эффект (рис. 1).

Рисунок 1 - Скорость проявления положительного литического действия на клетки бластоцист липазы и целлюлазы

Это может свидетельствовать в пользу того, что вирулентность  микроорганизма усиливается вследствие укрепления клеточной  оболочки бластоцист целлюлозой и другими полимерами, что придает микробу конкурентные преимущества в условиях кишечного биотопа и может служить лигандами при взаимодействии с пили бактерий.  Клетки умеренно- и авирулентных вариантов B.hominis имеют области незащищенной липидсодержащей мембраны вследствие частичного или полного отсутствия защитной целлюлозной оболочки.

Исследованиями, проведенными нами ранее (2003, 2004), были выявлены микроэкологические нарушения микробного сообщества толстой кишки при бластоцистной инвазии. Тем не менее, остается не изученной взаимосвязь устойчивости популяций микросимбиоценоза кишечника в сопоставлении с вирулентностью бластоцист

Данные, подтвержденные линейным регрессионным анализом, показали, при увеличении вирулентности изолированных бластоцист отмечается снижение высеваемости бактерий рода  Bifidobacterium и Lactobacillus со значений lg 9,30,4 и 8,60,3 КОЕ/г до lg 6,10,3, 4,30,3 КОЕ/г соответственно (р0,001). Коэффициенты корреляции составили r=-0,9 и r=-0,8 соответственно.

       Противоположную направленность имела зависимость, демонстрирующая обсемененность кишечника микробами родов Enterococcus, Clostridium, Staphylococcus и Candida. При изменении вирулентности паразитов от LD50/lg 0 до 5,30,2 статистически достоверно изменялась обсемененность кишечника микробами родов Enterococcus, Clostridium, Staphylococcus и Candida со значений lg 3,10,3, 6,30,2, 3,90,4 и 2,50,3 КОЕ/г до lg 8,10,3, 9,20,1, 6,20,3 и 5,70,2 КОЕ/г соответственно (р0,001). Коэффициенты корреляции составили r=0,7, r=0,9, r=0,8 и r=0,8 соответственно.

       Полученные результаты по бактериям родов Proteus и Klebsiella имели сходную направленность, но носили менее выраженный характер. Так, при усилении вирулентности бластоцист статистически достоверно увеличивалось количество Proteus и Klebsiella с lg 3,10,3, 2,80,4 КОЕ/г до lg 5,10,1, 5,20,2 КОЕ/г соответственно (р<0,05). Коэффициенты корреляции составили r=0,5 и r=0,7 соответственно.

Исследования также выявили, что вегетирование в кишечном биотопе вирулентных Blastocystis hominis, сопровождалось не только резким уменьшением общего содержания микросимбионтов Escherichia coli с нормальной ферментативной активностью, но и появлением большого количества штаммов, обладающих гемолитической и лактозонегативной активностями.

Изменение численности различных фенотипических групп бактерий E.coli под влиянием бластоцист проходило в следующих направлениях. Количество лактозонегативных и гемолитических форм эшерихий увеличилось с 0 до lg 3,80,3, 5,40,1 КОЕ/г соответственно (р0,001). Коэффициент корреляции составил r=0,8 и r=0,9 соответственно. Угол наклона линии тренда демонстрирует обратную связь изменения численности бактерий с нормальной ферментативной активностью от вирулентности простейших, где r=-0,9 (рис. 2).

Рисунок 2 Ц  Характеристика связи вирулентности B.hominis с количеством E.coli 

Полученные результаты свидетельствуют о наличии прямой взаимосвязи глубины качественных и количественных изменений внутри микробных ассоциаций кишечника от вирулентности изолятов B.hominis, в частности вегетирование умеренно- и высоковирулентных бластоцист сопровождается увеличением содержания  E.coli  с широким набором факторов патогенности.

Изменение биологических свойств условно-патогенных энтеробактерии, в частности усиление вирулентности, рассматривают в качестве одной из причин изменения этиологической структуры патологических состояний инфекционного генеза (Бондаренко, 2001). Тем не менее, исследования гетерогенности эшерихий в протозойно-бактериальных ассоциациях толстой кишки по показателю вирулентности, с последующим количественным выражением, не проводилось.

Исследования изменения вирулентности эшерихий, как механизма адаптации к ассоциативному симбиотическому взаимодействию с простейшими B.hominis, выявили увеличение данного показателя у штаммов в сообществе с высоковирулентными бластоцистами по сравнению с умеренновирулентными, который составил LD50/lg 3,7 и 3,1 ед соответственно (рис. 3).

Рисунок 3 - Показатель вирулентности микросимбионтов E.coli в протозойно-бактериальных ассоциациях толстой кишки

Показатель LD50/lg для неферментирующих изолятов E.coli, выделенных совместно с высоковирулентными бластоцистами составил 2,8, с умеренновирулентными - 1,9, с авирулентными - 1,1 ед.

Выявленная неоднородность по указанному признаку является отражением направленности межмикробных взаимодействий E.coli с B.hominis в условиях ассоциативного симбиоценоза толстой кишки. Аспекты взаимодействия бактерий и простейших требуют дальнейшего изучения на генетическом уровне.

В последние десятилетия простейшие рассматриваются как возможные хозяева возбудителей ряда инфекционных заболеваний (Коренберг, 2005). Все имеющиеся данные описывают изучение взаимодействия бактерий и простейших - обитателей почв и водоемов. Известно, что организм человека также представляет собой экологическую нишу для разнообразных микроорганизмов, заселяющих его биотопы (Нетрусов и др., 2004). Однако до сих пор, не изученными остаются формы и аспекты отношений, складывающихся между простейшими B.hominis и другими микросимбионтами как внутри макроорганизма, так и в экспериментах in vitro.

В связи с этим дальнейшим этапом нашей работы явилось проведение совместного культивирования различных фенотипических групп бактерий E.coli и простейших B.hominis.

Показано, что при сокультивировании гемолитических форм эшерихий с высоко- (рис. 4) и умеренновирулентными (рис. 5) бластоцистами через 24 часа взаимодействия численность бактерий достигла максимальных значений.

Рисунок 4 - Динамика численности гемолитических E.coli в рамках ассоциативного симбиоза с высоковирулентными B.hominis при совместном культивировании

Рисунок 5 - Динамика численности гемолитических E.coli в рамках ассоциативного симбиоза с умеренновирулентными B.hominis при совместном культивировании

В эти сроки численность бактериальных популяций составляла 1,8х1081,4 и 1,9х1071,1 КОЕ/мл соответственно (в контрольных посевах количества бактерий  находились на уровне 1,5х1072,4 и 6,7х1072,4, р>0,05). Динамика численности высоко- и умеренновирулентных бластоцист также носила положительный характер.

В последующее время наблюдений плотность популяций E.coli неуклонно снижалась, что, по-видимому, связано с активным антагонистическим действием высоко- и умеренновирулентных простейших B.hominis, и достигла минимума на 12-е и 15-е сутки соответственно. При ассоциативном симбиотическом взаимодействии с высоковирулентными бластоцистами уровень гемолитических эшерихий в это время составил 1,3х1032,2 КОЕ/мл, с умеренновирулентными - 1,5х1021,4 КОЕ/мл (в монокультурах данные показатели равнялись 1,9х1021,6 и 6,2х1031,6 КОЕ/мл соответственно, р>0,05).

Напротив, именно в эти сроки отмечена максимальная численность высоко- и умеренновирулентных простейших B.hominis, которая соответствовала 4,8х1061,9 и 9,3х1051,5 КОЕ/мл соответственно (в зоне контрольных высевов данные показатели составили 4,2х1042,4 и 4,2х1040,3 КОЕ/мл соответственно, р<0,05). КОЕ/мл. К 21 суткам численность E.coli возросла до значений 2,2х1042,3  при взаимодействии с высоковирулентными B.hominis и до 3,9х1031,5 КОЕ/мл при взаимодействии с умеренновирулентными бластоцистами (в контроле плотность популяции E.coli составляла 8,40,2 и 1,80,1 КОЕ/мл соответственно, р0,001). Количество высоко- и умеренновирулентных клеток бластоцист напротив снизилось и составило 6,7х1031,3 и 1,7х1030,9 КОЕ/мл соответственно (в контроле плотность популяции бластоцист составила 4,2х1041,5 и 3,2х1041,5 КОЕ/мл соответственно, р0,001). Повышение численности гемолитических кишечных палочек, по-видимому, связано с активизацией защитных механизмов, направленных на нейтрализацию антагонистической активности  бластоцист. Это проявлялось, во-первых, в неуклонном уменьшении числа бактерий, чувствительных к проявлениям антагонизма, во-вторых, стимулированием усиления вирулентности бактерий, приводящей к деструкции простейших.

При ассоциативных взаимоотношениях лактозонегативных эшерихий с высоко-, умеренно- и авирулентными бластоцистами все популяции продолжали существовать, сохраняя определенные количественные соотношения на протяжении всего опыта (21 сутки). Периоды увеличения численности эшерихий одновременно сопровождались снижением плотности популяции B.hominis и наоборот. Это позволяет предположить, что при антагонистических взаимодействиях внутри микросимбиоценоза активизировались механизмы взаимоадаптации. Появление более вирулентных и устойчивых клонов бактерий стимулировало формирование и более вирулентных простейших.

При анализе динамики авирулентных E.coli с высоко-, умеренно- и авирулентными B.hominis, можно сделать вывод о том, что  отсутствие вирулентности приводит к быстрому уничтожению не устойчивых к антагонистической активности эшерихий в ассоциациях с высоко- и умеренновирулентными бластоцистами - на 6-е и 15-е сутки соответственно. При сокультивировании авирулентных простейших бластоцист и E.coli с нормальной ферментативной активностью отмечен обоюдосдерживающий рост обеих культур до конца эксперимента (21-е сутки) - с доминированием популяции эшерихий (2,7х1032,7 против 1,8х1020,8 КОЕ/мл).

Способность многих патогенных и условно-патогенных бактерий сохранять свою жизнеспособность внутри свободноживущих простейших доказана многими авторами (Литвин, 2003; Пушкарева, Величко, Каминская, 2005; Пушкарева, 2006). Конкретные экологические факторы и механизмы устойчивого сохранения обитателей кишечного биотопа, обладающих потенциальной патогенностью в условиях, когда их активная жизнедеятельность и размножение затруднены или невозможны, практически не изучены.

С целью создания условий, неблагоприятных для существования кишечных палочек адекватных антибактериальной терапии, во все пробирки с протозойно-бактериальными ассоциациями и монокультурами добавляли антибактериальные препараты ампициллин, стрептомицин, гентамицин и цефазолин в концентрациях 60,6; 47,3; 39,2 и 10,4 мкг/мл соответственно.                Через 18 часов воздействия антибиотиков на посевы культур, кишечные палочки бактериологически не выявлялись (в контрольных посевах вегетативных форм также не было обнаружено). Количество бластоцист при этом существенно не менялось.

При переносе образцов с цистами из контрольных и опытных пробирок, на модифицированную среду Suresh (приоритетная справка №№2008114890 от 5.10.2008) уже через 6 часов был зарегистрирован рост как вирулентных, так и авирулентных бактерий E.coli в количестве от 0,5х1020,9 до 0,9х1021,3 КОЕ/см2 и вегетативных форм простейших на уровне 0,1х1020,4 - 1,3х1022,5 КОЕ/см2 .

Исследование материала из контрольных посевов не выявило роста бактерий кишечной палочки ни в одном случае. Полученные результаты демонстрируют взаимодействие не только вирулентных, но и авирулентных E.coli с цистами простейших B.hominis, способствующее длительному выживанию бактерий при действии стрессорных факторов, а именно антибактериальных препаратов. Данные результаты могут способствовать пониманию процессов передачи инфекций, а также развития рецидивных состояний патологий микробного генеза после проведения активной химиотерапии.

Усиление вирулентности среди гетерогенных популяций потенциально патогенных энтеробактерий в настоящее время является важным объектом исследований различных отраслей биологической и медицинской наук. Наиболее существенными для изменения патогенности условно-патогенных энтеробактерий, ввиду скачкообразного характера и кардинальности происходящих превращений микроорганизма, рассматривают генетические рекомбинации, которые определяют геномную пластичность микробов, реализуемую через несколько конкретных механизмов связанных, в частности с лостровами и лостровками патогенности (Brunder, Karch, 2000).

Используя набор праймеров, амплифицирующих фрагменты генов рaрС, рарН, sfаА, sfaG, fimА, stx1, stx2, eaeA, cnf-1 и hlyB и ehx было протестировано 417 фенотипически различных штаммов E.coli, выделенных при ассоциативных симбиотических взаимодействиях с B.hominis различной степени вирулентности, а также после их совместного культивирования и 134 штамма эшерихий выделенных из консорциумов, где бластоцисты не являлись участниками микробного сообщества.

Тестирование микросимбионтов E.coli, выделенных из ассоциации с авирулентными бластоцистами, показали, что чаще всего, независимо от периода исследования и изучаемой фенотипической группы бактерий, искомые ампликоны выявлялись при использовании праймеров к рaрС, рарН и sfаА генам. Частота встречаемости данных апмликонов у авирулентных кишечных палочек составила 33,3, 12,1 и 12,1 % соответственно (в монокультурах и до сокультивирования данные показатели составили - 6,1, 0, 0 %  и 12,1, 6,1, 6,1 % соответственно, р<0,05). В данной фенотипической группе не были выявлены ампликоны, специфичные sfaG и fimA генам.

В группе лактозонегативных эшерихий частота встречаемости генетических детерминант фимбрий P и S типа была выше по сравнению с нормальными эшерихиями. Так, фрагменты рaрС, рарН и sfаА генов после 24 часов совместного культивирования тестировались с частотой  25,0, 16,7, 16,7 % соответственно. Кроме того положительные результаты были получены с парами праймеров, амплифицирующих фрагменты генов sfaG и fimА с частотой 2,8 и 8,3 % соответственно. По истечению 21-х суток образование искомых ампликонов специфичных рaрС гену составило 38,9 %, рарН - 30,5 %, sfаА - 30,5 %, sfaG - 8,3 %, fimА - 13,9 %, что соответствовало появлению более вирулентных клонов и увеличению численности неферментирующих бактерий. До сокультивирования распространенность изучаемых нуклеотидных последовательностей была следующей: рaрС -  13,9 %, рарН - 5,6 %, sfаА - 5,6 %, sfaG - 0 %, fimА - 8,3 % (в монокультурах  5,6, 0, 0, 0, 0 соответственно, р0,001).

Далее была изучена частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез фимбрий P, S и 1 типа у микросимбионтов E.coli, выделенных из ассоциации с умеренновирулентными бластоцистами. В общем пуле исследуемых штаммов эшерихий с нормальной ферментативной активностью, отмечено увеличение частоты образования искомых ампликонов, специфичных  изучаемым генам - через 24 часа совместного культивирования, что соответствовало увеличению численности популяции бактерий, вследствие усиления их защитных механизмов от антагонистической активности бластоцист.  В группах лактозонегативных и гемолитических  E.coli также выявлено увеличение частоты встречаемости генетических детерминант фимбрий P, S и 1 типа, по сравнению с исследованиями штаммов до сокультивирования и в монокультурах, на 15-е и 21-е сутки соответственно (р0,001), как усиление механизмов защиты.

       Далее была проведена оценка частоты образования искомых ампликонов у микросимбионтов E.coli, выделенных из ассоциации с высоковирулентными бластоцистами. Результаты тестирования штаммов эшерихий с нормальной ферментативной активностью показали достоверно более широкую распространенность нуклеотидных последовательностей генов рaрС, рарН, sfаА, sfaG, fimА через 24-е часа проведения эксперимента по сравнению данными, полученными до сокультивирования и в монокультурах (р0,001).

Исследование неферментирующих штаммов кишечных палочек, показало, что достоверно чаще других после сокультивирования тестировались генетические детерминанты, обеспечивающие синтез фимбрий P и S типа (рaрС - 78,3, рарН - 42,0, sfаА - 42,0 % , р0,001). До совместного культивирования и в монокультурах показатели встречаемости всех пар праймеров были значительно ниже. Идентичная тенденция изменений распространенности изучаемых генетических детерминант отмечена и в популяции гемолитических эшерихий. Следует отметить, что показатели изменений были значительно выраженнее.

В общем пуле контрольных штаммов положительные сигналы были получены только с фрагментами гена рaрС - у 9 культур (6,9 %).

                       Проведенные тестирования показали, что после сокультивирования бактерий с вирулентными бластоцистами чаще всего искомые ампликоны выявлялись с использованием праймеров к рaрС, рарН и sfаА генам. С наименьшей частотой обнаруживались фрагменты sfaG и fimA генов. Следует также отметить, что возрастание количества положительных сигналов со всеми изучаемыми фрагментами генов совпадало с периодами увеличения плотности популяций всех фенотипических групп бактерий E.coli и появлением в среде разрушенных клеток B.hominis.

                       Из 417 протестированных штаммов с праймерами к eaeA гену, положительный сигнал был получен только с 82 культурами, что составляет 19,7 % (табл. 3).

                                                                                      Таблица 3

Частота встречаемости        нуклеотидных последовательностей eaeA гена в различных фенотипических группах бактерий кишечной палочки

Фенотипические группы E.coli	Период изучения		Частота встречаемости  фрагмента eaeA гена
			Абс.	%
		в ассоциации с авирулентными бластоцистами
с нормальной ферментативной активностью (n=33)	до сокульт-ия		1	3,0
	после 3-х суток сокульт-ия		1	3,0
	монокультуры		0	0
актозонегативные (n=36)	до сокульт-ия		1	2,8
	после 3-х суток сокульт-ия		2	5,6**
	монокультуры		0	0
		в ассоциации с умеренновирулентными бластоцистами
с нормальной ферментативной активностью (n=32)	до сокульт-ия		2	6,2
	после 21-х суток сокульт-ия		4	12,5**
	монокультуры		0	0
актозонегативные (n=43)	до сокульт-ия		4	9,3
	после 15-ти суток сокульт-ия		11	25,6**
	монокультуры		0	0
гемолитические (n=45)	до сокульт-ия		7	15,6
	после 21-х суток сокульт-ия		9	20,0*
	монокультуры		0	0
		в ассоциации с высоковирулентными бластоцистами
с нормальной ферментативной активностью (n=29)	до сокульт-ия		1	3,4
	после 24 часов сокульт-ия		5	17,2**
	после 21-х суток сокульт-ия		7	24,1*
	монокультуры		0	0
актозонегативные (n=69)	до сокульт-ия		8	11,6
	после 15-ти суток сокульт-ия		17	24,6**
	монокультуры		0	0
гемолитические (n=130)	до сокульт-ия		23	17,7
	после 21-х суток сокульт-ия		31	23,8*
	монокультуры		0	0

Примечание: * - Р<0,05;  ** - Р0,001.

Распространенность нуклеотидной последовательности eaeA гена в различных фенотипических группах бактерий кишечной палочки, как правило, возрастала после совместного культивирования с B.hominis в те же сроки, что и при обнаружении генетических детерминант фимбрий P, S и 1 типа.

Отмечен так же статистически достоверный рост встречаемости искомого ампликона при увеличении вирулентности микросимбионтов бластоцист (р0,001). В общем пуле контрольных штаммов положительные сигналы были получены у 2 культур (1,5 %).

Не вызывает сомнения, что в патогенезе любого заболевания одна из важных ролей принадлежит факторам патогенности, оказывающим прямое и косвенное токсическое воздействие. Это связано с высокой биологической активностью токсинов и их способностью вызывать функциональные и структурные повреждения клетки-хозяина. В связи с этим была поставлена задача - изучить распространенность нуклеотидных последовательностей генов токсинообразования: цитотоксического некротизирующего фактора 1 типа (cnf-1), энтерогемолизина (ehx), -гемолизина (hlyB), шигаподобных токсинов 1 и 2 типов (stx1 и stx2).

Используя праймеры, амплифицирующие нуклеотидные последовательности cnf1 гена, были получены ампликоны размером 406 пн. В исследуемых группах отмечена зависимость роста числа положительных сигналов с праймерами, специфичными к cnf1 гену от вирулентности ассоциантов B.hominis (r=0,87), как до сокультивирования, так и после (р0,001). По нашему мнению, это свидетельствует о резкой мобилизации защитных механизмов, проявляющихся в увеличении числа особей, содержащих в своем генотипе фрагменты cnf1 гена и его фенотипической экспрессии.

С целью подтверждения полученных результатов мы также изучили распространенность нуклеотидных последовательностей гена, детерминирующего выработку энтерогемолизина (ehx). Наши исследования выявили, что частота встречаемости фрагментов ehx гена во всех изучаемых фенотипических группах возрастала после совместного культивирования бактерий E.coli с простейшими B.hominis, однако распространенность нуклеотидных последовательностей была в целом ниже, по сравнению с таковой cnf1 гена. Так, среди неферментирующих кишечных палочек в консорциуме с авирулентными бластоцистами данный показатель увеличился в 2 раза; нормальных, неферментирующих и гемолитических эшерихий в ассоциации с умеренновирулентными бластоцистами - в 1,3, 1,4, 1,5, раза соответственно; нормальных, неферментирующих и гемолитических эшерихий в ассоциации с высоковирулентными бластоцистами - в 1,2, 1,4, 1,6 раза соответственно. В группе контрольных штаммов данный показатель не превышал 0,7 %. 

Далее используя праймеры, амплифицирующие нуклеотидные последовательности hlyB гена, контролирующего синтез -гемолизина, были получены ампликоны размером 542 пн, при тестировании штаммов эшерихий различных фенотипических групп. Показано, что максимальные значения встречаемости фрагментов данного гена выявлены в группах гемолитических эшерихий в ассоциации с умеренно- и высоковирулентными простейшими бластоцистами, как до так и после совместного культивирования. Значения распространенности специфичных данному гену ампликонов составили 33,3 и 34,6 % - до сокультивирования и 44,4 и 52,3 % - после. Среди штаммов других фенотипических групп E.coli не выявлено изменений данного показателя (в контроле - 1,5 %). 

       Используя праймеры, амплифицирующие нуклеотидные последовательности stx1 гена, были получены ампликоны, частота встречаемости которых варьировала в различных фенотипических группах эшерихий.        В группе бактерий с нормальной ферментативной активностью и лактозонегативных в ассоциации с авирулентными простейшими B.hominis распределение фрагментов изучаемого гена оказалось равно 0 % как до, так и после совместной инкубации. В общем пуле эшерихий с нормальной ферментативной активностью при взаимодействии с высоко- и умеренновирулентными бластоцистами отмечено статистически достоверное увеличение встречаемости фрагмента stx1 гена с 6,9 до 10,3 % и с 3,2 до 9,4 % соответственно, (р<0,05). Среди неферментирующих E.coli в консорциуме с умеренновирулентными бластоцистами отмечено статистически достоверное увеличение частоты обнаружения нуклеотидных последовательностей stx1 гена после сокультивирования с 4,6 % до 11,6 % соответственно (р<0,05). В группе неферментирующих эшерихий в консорциуме с высоковирулентными бластоцистами отмечен также статистически достоверный рост частоты обнаружения искомых ампликонов после сокультивирования с 7,2 % до 13,0 % соответственно (р0,001). Среди гемолитических штаммов кишечных палочек в консорциуме с умеренно- и высоковирулентными B.hominis увеличение данного показателя не имело достоверного характера, (р>0,05). В общем пуле контрольных штаммов данный показатель не превышал 0,7 % (1 культура). 

В группе бактерий с нормальной ферментативной активностью и лактозонегативных в ассоциации с авирулентными простейшими B.hominis распределение фрагментов stx2 гена также оказалось равно 0 % как до, так и после совместной инкубации (р>0,05). В общем пуле эшерихий с нормальной ферментативной активностью при взаимодействии с высоко- и умеренновирулентными бластоцистами отмечено статистически достоверное увеличение встречаемости фрагмента stx2 гена с 6,9 до 10,3 % и с 3,2 до 6,2 % соответственно, (р<0,05).Среди неферментирующих E.coli в консорциуме с умеренновирулентными бластоцистами отмечено статистически достоверное увеличение частоты обнаружения нуклеотидных последовательностей stx2 гена после совместного культивирования с 4,6 % до 9,3 % соответственно (р<0,05). В группе неферментирующих эшерихий в консорциуме с высоковирулентными бластоцистами отмечен также статистически достоверный рост частоты обнаружения искомых ампликонов после сокультивирования 7,2 % до 11,6 % соответственно (р<0,05). Среди гемолитических штаммов кишечных палочек в консорциуме с умеренно- и высоковирулентными B.hominis увеличение данного показателя не имело достоверного характера, (р>0,05). В группе контрольных штаммов данный показатель не превышал 0,7 % (1 культура). 

       Анализ полученных результатов показал, что в общем пуле штаммов эшерихий с нормальной ферментативной активностью после проведения совместного культивирования с авирулентными, умеренно- и высоковирулентными B.hominis, увеличилась частота выявления изучаемых нуклеотидных последовательностей в 0,80,06, 1,20,6 и 2,10,7 раза соответственно, в группе неферментирующих E.coli в 1,50,5, 2,30,4 и 2,70,2 раза соответственно. Количество встречаемости фрагментов генов патогенности гемолитических E.coli при взаимодействии in vitro  с умеренно- и высоковирулентными B.hominis возросло в 2,40,3 и 2,90,4 раза соответственно.

Полученные данных при изучении генетических детерминант факторов патогенности E.coli, при ассоциативных симбиотических взаимодействиях с бластоцистами, демонстрируют статистически достоверное увеличение встречаемости изучаемых генов, индуцированное усилением вирулентности симбионтов B.hominis.

Как показано на рисунке 6 статистически достоверными при формировании генетических комбинаций в геноме микросимбионтов E.coli во всех протозойно-бактериальных ассоциациях до проведения сокультивирования являлись показатели совместного обнаружения фрагментов рарС и hlyB генов (р=0,00071).

Рисунок 6 - Изменение встречаемости комбинаций генов патогенности E.coli в результате ассоциативных взаимоотношений с B.hominis in vitro

После взаимодействия in vitro частота совместного обнаружения данных генетических комбинаций сократилась, в то же время выявлено большое количество особей с комбинациями генов, не встречавшихся у исходных штаммов и в монокультурах. Так, высокая частота встречаемости отмечена для комбинаций генов рарС, рарН, sfaA и hlyB  и papC, fimA и ehx. Это свидетельствует о механизмах формирования вирулентных вариантов и адаптации E.coli к изменившимся условиям среды.        

итературные данные и результаты собственных исследований показывают высокую частоту встречаемости простейших B.hominis как среди людей, так и среди животных (Larrosa-Haro, Ruiz-Perez, 2002; Wang, Li, Wang, 2002). При формировании патобиоценозов толстой кишки, происходит снижение популяционного уровня негемолитических форм Esсherichia coli, обладающих высокой антагонистической активностью, создавая условия для избыточной колонизации лактозонегативными, и обладающими гемолитической активностью штаммами, размножение которых в нормальных условиях подавлено конкуренцией активных симбионтов (Леванова, Алешкин, Воробьев, Леванова, Бондаренко 2002). Тем не менее, не изученными остаются изменения биологических свойств бактерий кишечной палочки в ходе межмикробных взаимодействий, в частности в протозойно-бактериальных ассоциациях.

В связи с этим следующим этапом нашего исследования явилось изучение направленности изменений биологических свойств, таких как: сахаролитическая, протеолитическая, гемолитическая, колициногенная и антибиотикорезистентность бактерий E.coli, а также  гемолитическая, ДНК-азная, протеолитическая, лецитоветилазная и липолитическая ферментативная активности Blastocystis hominis до и после совместного культивирования.

Проведя статистический анализ полученных данных, было выявлено, что в результате совместного культивирования вирулентных бластоцист с вирулентными эшерихиями отмечено статистически достоверное усиление биологической активности взаимодействующих микросимбионтов, а именно гемолитической протеолитической колициногенной активностей и антибиотикорезистентности со стороны бактерий (р=0,00047), также гемолитической, ДНК-азной, лецитоветилазной, липолитической активностей со стороны простейших (р=0,0006). Напротив, после сокультивирования авирулентных эшерихий с вирулентными бластоцистами выявлено статистически достоверное угнетение активности изучаемых ферментов как среди E.coli (р=0,00046) так и среди B.hominis (р=0,00653). Все проведенные исследования демонстрируют нестабильность ассоциативных микросимбиоценозов, участниками которых являются гемолитические и неферментирующие бактерии кишечной палочки а также высоко- и умеренновирулентные простейшие бластоцисты. Высокий уровень ассоциативных симбиотических взаимодействий, изменяющих выраженность факторов патогенности (усиливая или подавляя их), свидетельствует об активных процессах взаимоадаптации и селекции биоваров с различным уровнем вирулентности.

                                                          Таблица 4

Изменение биологических свойств микроорганизмов в

протозойно-бактериальных ассоциациях после взаимодействия in vitro, %

Ферментативная активность		Ассоциации вирулентных E.coli и вирулентных B.hominis			Ассоциации  авирулентных E.coli и вирулентных B.hominis			Ассоциации  авирулентных E.coli и авирулентных B.hominis
		Усиление	Ослабление	Индифф-ое влияние	Усиление	Ослабление	Индифф-ое влияние	Усиление	Ослабление	Индифф-ое влияние
E.coli	Гемолитическая	97,71,7	1,10,3	1,20,3	5,10,8	93,51,9	1,40,4	0,90,04	1,40,5	97,71,6
	Колициногенная	97,11,1	0,60,02	2,30,8	1,20,3	96,12,1	2,70,5	3,10,5	3,20,7	93,71,4
	Протеолитическая	93,71,2	1,10,5	5,20,6	0,60,03	94,61,7	4,80,5	4,00,5	6,40,9	89,61,5
	Сахаролитическая	2,80,6	96,61,9	0,60,03	11,11,6	87,51,5	1,40,2	12,91,2	1,80,6	85,31,5
	Антибиотикорезист-сть	63,41,6	5,10,6	31,51,8	5,50,7	89,31,8	5,21,4	3,40,8	4,21,3	92,41,6
а	Р	Р=0,00047	а		а	Р=0,00046	а	а		Р=0,0001
B.hominis	Гемолитическая	75,01,9	3,60,6	21,41,1	7,10,8	81,71,3	11,20,9	3,40,6	3,50,4	93,11,8
	ецитоветилазная	58,91,4	2,40,4	38,71,7	9,41,1	67,41,2	23,21,4	5,70,2	6,80,7	87,51,4
	ДНК-азная	81,41,6	5,60,7	13,01,2	7,11,1	92,51,7	0,40,01	8,00,8	7,30,9	84,71,1
	иполитическая	96,91,6	2,40,6	0,70,04	6,40,9	85,21,4	8,41,2	5,60,9	2,30,4	92,11,3
	Протеолитическая	52,41,7	6,10,5	41,51,3	8,30,8	63,81,6	27,91,5	5,20,4	1,70,5	93,11,9
а	Р	Р=0,0006	а	а	а	Р=0,00653	а	а	а	Р=0,0001

Оценка направленности изменений биологических свойств в ассоциативных микросимбиоценозах авирулентных E.coli и авирулентных простейших бластоцист показала только индифферентное взаимодействие в отношении всех изучаемых видов активностей, что позволяет рассматривать сообщества данных видов микробов как стабильные.

Направление отбора в сторону усиления патогенности среди гетерогенных микроорганизмов, обнаруженное in vitro, не всегда позволяют составить полное представление о патогенном потенциале изучаемого объекта ввиду не идентичности условиям in vivo. Последние часто определяют уровень экспрессии всех факторов патогенности, причем недостаточная изученность регуляторных механизмов этого повышает значимость оценки патогенности в эксперименте на лабораторных животных (Фиалкина, 2004).

Далее с целью подтверждения изменения вирулентности эшерихий под влиянием бластоцист проводили кератоконъюнктивальную пробу. Для постановки пробы использовали только E.coli с нормальной ферментативной активностью, которые после сокультивирования с вирулентными бластоцистами, приобретали свойства, не характерные для данных бактерий. 

Этот метод позволяет исключить действие  других представителей кишечной микробиоты на выраженность кератита и конъюнктивита.

Проведенные исследования показали, что заражение животных E.coli с нормальной ферментативной активностью, полученных до взаимодействия in vitro приводило к развитию слабо выраженных кератита и конъюнктивита. Введение этих же штаммов после сокультивирования с B.hominis, сопровождалось формированием прогрессирующих конъюнктивита и кератита, характеризующихся склеиванием изъязвленных век, обильным гнойным или гнойно-творожистым экссудатом, интенсивным помутнением роговицы. Кроме того, было показано, что на выраженность кератоконъюнктивальной пробы влияет количество генов патогенности в геноме штаммов E.coli, использованных для заражения животных.

        Полученные данные свидетельствуют, об изменении экологических возможностей бактерий под воздействием ассоциантов бластоцист, приводящим к селекции и накоплению вирулентных вариантов в гетерогенной бактериальной популяции, с адекватными данным условиям существования биологическими свойствами.

       Таким образом, проведенная работа по характеристике патогенного потенциала микроорганизмов-симбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях выявила перспективность использования комплексного симбиотического подхода в решении фундаментальных и прикладных задач микробной экологии, что позволило выделить два основных момента:

       Во-первых, оценка динамики патогенного потенциала микросимбионтов в ассоциации E.coliЦB.hominis позволила выявить некоторые условия формирования и функционирования микробиоценозов, которые необходимо учитывать при диагностике и прогнозировании течения широкого спектра заболеваний, ассоциированных с дисбиотическими состояниями.

       Во-вторых, показана молекулярно-генетическая основа формирования патогенных вариантов эшерихий в рамках ассоциативных симбиотических взаимодействий, где накопление и рекомбинация фрагментов генов патогенности - пусковой механизм клонально-селекционного процесса, направленного на взаимоадаптацию микроорганизмов к изменяющимся условиям биотопа.

ВЫВОДЫ

1. итическую активность по отношению к B.hominis различной вирулентности проявляли ферменты протеаза, хитиназа, глюканаза, липаза и целлюлаза. С увеличением вирулентности простейших изменялась скорость литического действия липазы и целлюлазы.
2. Выявлена прямая взаимосвязь между нарушениями микробиоценоза кишечника и вирулентностью B.hominis, сопровождающимися снижением высеваемости бифидобактерий и лактобацилл, а также увеличением количества микробов родов: Proteus, Klebsiella, Staphylococcus, Clostridium, Candida, Enterococcus.
3. Установлено, что вегетирование в микробиоценозе кишечника вирулентных бластоцист сопровождалось накоплением атипичных штаммов и повышением показателя вирулентности одного из основных микросимбионтов - E.coli с LD50/lg 1,10,4 до 3,70,3 ед.
4. Динамика численности взаимодействующих in vitro эшерихий и бластоцист демонстрирует активизацию механизмов группового отбора, направленных на подавление антагонистической активности ассоциативных микросимбионтов, характеризующихся изменением их биологических свойств. Усиление вирулентности бактерий сопряжено с изменением патогенного потенциала B.hominis.
5. Показано, что взаимодействие E.coli с цистами B.hominis способствовало выживанию бактерий в изменившихся условиях среды обитания, в частности при действии антибактериальных препаратов.
6. Выявлено, что в результате ассоциативного симбиотического взаимодействия E.coli с B.hominis in vitro происходило увеличение частоты выявления генетических детерминант факторов патогенности эшерихий, обеспечивающих адгезию и токсинообразование. Отмечена высокая частота встречаемости комбинаций генов рарС, рарН, sfaA, hlyB, и papC, fimA, ehx, что свидетельствует об их значимости в процессах адаптации к изменившимся условиям.
7. При исследовании ассоциативных взаимоотношений эшерихий и бластоцист установлено стимулирующее, ингибирующее и индефферентное действие в отношении биологических свойств микросимбионтов, что свидетельствуют об активных процессах взаимоадаптации и селекции биоваров с различным уровнем вирулентности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  Публикации в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Характеристика кишечного микробиоценоза людей инвазированных бластоцистами / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, И.Н. Исаева, Н.А. Ильина // Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - Москва, 2002. - №5. - С. 216.
2. Оценка желчевыделительной функции печени при экспериментальном бластоцистозе / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, И.Н. Исаева, Н.А. Ильина // Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - Москва, 2002. - №5. С. 473.
3. Влияние простейших B.hominis на функциональную активность печени / Н.И. ПотатуркинаЦНестерова, Ю.Ю. Красноперова,  Н.А. Квасова, И.Н. Исаева // Мед. паразитология и паразитарные болезни. - Москва, 2003. - №2. - С. 16-18.
4. Бластоцистоз - протозооз человека / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова,  Н.А. Квасова, И.Н. Исаева и соавт. // Мед. паразитология и паразитарные болезни - Москва, 2004.- №4. - С.58-61.
5. Результаты определения чувствительности простейших Blastocystis hominis к антипротозойным препаратам / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, О.Е. Фалова, А.С. Нестеров // Вестник Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова. - Саратов, 2004.- №4.- С.29-32.
6. Влияние микробиоценоза кишечника на формирование и тяжесть течения экспериментальной язвы желудка, ассоциированной с бластоцистозом / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.В. Бугеро, Е.А. Зубкова // Вестник Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова. - Саратов, 2005.- №1.- С.17-19.        
7. Красноперова Ю.Ю. Биологические формы простейших Blastocystis hominis / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, О.Е.  Фалова // Вестник Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова. - Саратов, 2005.- №2.- С.25-28.        
8. Антиинтерферонная активность простейших Blastocystis hominis / Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро, Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова // Вестник Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова. - Саратов, 2005.- №2.- С.7-9.        
9. Изменение функциональной активности системы фагоцитоза при нарушениях микроэкологии кишечника, связанной с бластоцистной инвазией / Ю.Ю. Красноперова, В.М. Кудрова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, А.С. Нестеров // Вестник новых медицинских технологий. - Тула, 2007.- №2.- Т.XIV.- С. 195-196.
10. Красноперова Ю.Ю. Изучение динамики популяционной численности различных по вирулентности простейших Blastocystis hominis и бактерий Еscherichia coli при совместном культивировании / Ю.Ю. Красноперова // Проблемы региональной экологии. - Москва, 2008. - №5. Ц  С. 153-157 
11. Красноперова Ю.Ю. Мониторинг микробиоты при экспериментальной ишемии на фоне бластоцистной инвазии с последующим анализом патогенного потенциала микроорганизмов-симбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях кишечника / Ю.Ю. Красноперова, А.М. Лазарев, А.В. Курзин // Проблемы региональной экологии. - Москва, 2009. - №1. - С.  74-78
12. Красноперова Ю.Ю. Некоторые молекулярно-генетические механизмы взаимоадаптации штаммов Еscherichia coli до и после сокультивирования с простейшими Blastocystis hominis / Ю.Ю. Красноперова, Р.В. Асеинова // Вестник новых медицинских технологий. - Тула, 2009. - № 1. - С. 12-14.

Публикации в других изданиях

13. Изменения микрофлоры кишечника на фоне бластоцистной инвазии / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, И.Н. Исаева // Материалы VIII съезда Итало-Российского общества по инфекционным болезням. "Проблема инфекции в клинической медицине". - Санкт-Петербург, 2002. - С.268 -269.
14. Значение B.hominis в патологии кишечника / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, И.Н. Исаева // Юбилейная научная конференция, посвящённая 80Цлетию кафедры микробиологии Военной медицинской академии и 300 летию основания Санкт - Петербурга Современная микробиология  в клинической медицине и эпидемиологии. - Санкт - Петербург, 2003. - С. 84.
15. Роль бластоцист в изменении микробиоценоза кишечника / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Квасова, И.Н. Исаева и соавт. // Международная  научно - практическая конференция. "Медицинская Экология ". -  Пенза, 2003. - С. 81 Ц84.
16. Бластоцистная инвазия и дисбактериоз кишечника / Н.И. ПотатуркинаЦНестерова, Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Квасова, А.С. Нестеров.- Ульяновск, 2003. - 211 с.
17. Ассоциации бластоцистоза с другими паразитозами / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, И.Н. Исаева и соавт. // Материалы VI Российского съезда врачей инфекционистов. - Санкт - Петербург, 2003. - С. 309.
18. Бластоцистная инвазия у гастроэнтерологических больных / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро и соавт. // Медлайн-экспресс. - Москва, 2003.- №12. - С.3-5.
19. Реализация потенциала патогенности простейших Blastocystis hominis в условиях пониженной резистентности макроорганизма / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро и соавт. // Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых Актуальные проблемы современного здравоохранения и экологии. - Ульяновск, 2003. - С. 64-65        
20. Микроэкология кишечника как показатель здоровья населения Ульяновкой области / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро и соавт. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции УРоль социальных и биологических факторов в становлении возрастных особенностей здоровья населенияФ. - Пенза, 2003.-С. 68-70.
21. Бластоцистная инвазия у лиц с заболеваниями пищеварительной системы / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро и соавт. // Материалы Международной конференции, посвященной 125-летию К.И. Скрябина и 60-летию основания Лаборатории гельминтологии АН СССР Института паразитологии РАН Основные достижения и перспективы развития паразитологии. - Москва, 2004. - С.239-241.        
22. Патогенные свойства штаммов Blastocystis hominis /  Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро и соавт. // Материалы выездного пленума НОГР Новые горизонты гастроэнтерологии. - Новосибирск, 2004.- С.303-304.
23. Влияние микробиоценоза кишечника на формирование и тяжесть течения экспериментальной язвы желудка, ассоциированной с бластоцистозом / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро и соавт. // Сборник статей НИИ Кардиологии ТНЦ СО РАМН Науки о человеке. - Томск, 2004.-С.147-148.        
24. Некоторые показатели микробиоценоза при бластоцистной инвазии / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро и соавт. // Материалы выездного пленума НОГР Новые горизонты гастроэнтерологии. - Новосибирск, 2004.-С.142-143.        
25. Формирование язвы желудка на фоне инвазии Blastocystis hominis / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро и соавт. // Материалы Международной конференции, посвященной 125-летию К.И. Скрябина и 60-летию основания Лаборатории гельминтологии АН СССР - Института паразитологии РАН Основные достижения и перспективы развития паразитологии. - Москва, 2004.- С.146-148.        
26. Красноперова Ю.Ю. Значение антиинтерферонной активности Blastocystis hominis / Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Квасова, Н.В. Бугеро //        Материалы XI межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и соискателей Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных. - Пенза, 2004.-С.23-26.                
27. Krasnoperova Y.Y.The usage of antiprotozoal medications at complex treatment for colitis associated with enteric blastocystosis / Y.Y. Krasnoperova, N.I. Potaturkina-Nesterova  // Falk Symposium № 142. Birmengem, 2005. - Р.42.
28. The diagnostic value of disclosing blastocysts at colitis patients / Y.Y. Krasnoperova, N.I. Potaturkina-Nesterova, N.A. Ilina, N.V. Bugero, A.S. Nesterov  // Falk Symposium № 142. Birmengem, 2005. - P.56.
29. Красноперова Ю.Ю. Состояние микрофлоры толстой кишки при экспериментальной ишемии на фоне бластоцистной инвазии / Ю.Ю. Красноперова, А.М. Лазарев // Труды молодых ученых Ульяновского государственного университета. - Ульяновск, 2005. - С. 21-23.        
30. Чувствительность к химиопрепаратам бластоцист, выделенных у гастроэнтерологических больных / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Квасова, Е.А. Зубкова  // Медлайн-экспресс. - Москва, 2005.-  №3. - С.23-24.        
31. Состояние микрофлоры толстой кишки на фоне инвазии простейшими Blastocystis hominis / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, А.М. Лазарев, Е.А. Зубкова // Успехи современного естествознания. - Москва, 2006.-№1.- С.93.
32. Некоторые вопросы эпидемиологии бластоцистоза / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.А. Ильина, И.С. Немова // Материалы Международной конференции Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных. 21-23 июня 2006г - Ульяновск, 2006. - С.322-327.        
33. Изменение состава микрофлоры кишечника при дисбиозе, вызванном инвазией простейшими Blastocystis hominis / Ю.Ю. Красноперова, Н.С. Глебова, А.М. Лазарев, А.В. Курзин  // Материалы I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов. - Ульяновск, 2007. - С. 51-52.
34. Результаты определения чувствительности простейших к антибактериальному ферментному препарату / Ю.Ю. Красноперова, Н.Г. Гумаюнова, А.М. Лазарев, Е.А. Зубкова // Материалы I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов. - Ульяновск, 2007. - С. 140-141.        
35. Микробная экология кишечника при экспериментальной ишемии, отягощенной бластоцистной инвазией / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, А.М. Лазарев, А.В. Курзин // Материалы Всероссийской конференции с международным участием Медико-физиологические проблемы экологии человека. 24-28 сентября 2007г. - Ульяновск, 2007. - С. 145-146.        
36. Определение чувствительности простейших Blastocystis hominis к различным концентрациям и фракциям ферментного препарата лизоамидаза / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, О.А. Степная, Е.А. Зубкова // Материалы Всероссийской конференции с международным участием Медико-физиологические проблемы экологии человека. 24-28 сентября 2007г - Ульяновск, 2007. - С. 202-203.                
37. Красноперова Ю.Ю. Экологические параметры микробиоты кишечника при протозойных инвазиях / Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Ильина, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Касаткина и соавт. - Ульяновск, 2009. - 79 с.
38. Красноперова Ю.Ю. Простейшие Blastocystis hominis и их влияние на макроорганизм / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Квасова, О.Е. Фалова и соавт. - М.: Наука, 2009. - 215 с.

Изобретения по теме диссертации

39. Способ заражения экспериментальных животных бластоцистами. Патент РФ на изобретение №2224465 / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, Н.А. Ильина, И.Н. Исаева, Р.Ф. Бурганова, Н.М. Чебан // Бюл., 2004.-№        6.
40. Способ воспроизведения язвы желудка на фоне экспериментального бластоцистоза. Патент на изобретение №2239236 / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова // Бюл., 2004 - №30.
41. Способ воспроизведения ишемии толстого  кишечника на фоне бластоцистной инвазии. Патент на изобретение №2310239 / Ю.Ю. Красноперова, А.М. Лазарев // Бюл., 2007. - №31.

Методические материалы

42. Экологическая характеристика микробиоценоза кишечника. Практические рекомендации / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, Н.В. Бугеро, О.Е. Фалова, Н.А. Квасова, И.С. Немова, Г.М. Кулагина, Л.К. Богомолова. Ульяновск, 2004. - 23 с.        
43. Особенности микроэкологии кишечника больных псориазом. Практические рекомендации / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, Н.В. Бугеро, О.Е. Фалова, Н.А. Квасова, И.С. Немова, Г.М. Кулагина, А.С. Нестеров. Ульяновск, 2004. - 19 с.
44. Биологические свойства микробов-симбионтов в условиях протозойно-бактериальных ассоциаций макроорганизма. Практические рекомендации / Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, А.С. Нестеров. Ульяновск, 2009. - 20 с.
45. Дисбиоз кишечника и методы его диагностики. Практические рекомендации / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, А.М. Лазарев, М.А. Орлина, А.В. Курзин.  Ульяновск, 2009.- 33 с.

КРАСНОПЕРОВА

Юлия Юрьевна

Характеристика изменений патогенного потенциала микроорганизмов-симбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

_____________________________________________________________________

Подписано в печатьЕ Тираж 100 экз. Заказ №Е

Ориг7инал-макет изготовлен с помощью текстового редактора Microsoft Word 2003 for Mindowsтм. Гарнитура таймс. Печать офсетная. Усл.печ.листов - 2,0. Формат 64х84  1/16

Отпечатано:

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии