Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Денискова Татьяна Евгеньевна
Характеристика аллелофонда свиней различных пород с использованием ISSR-маркеров
03.02.07 - генетика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Дубровицы Ц 2012
Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.
Научный руководитель: доктор биологических наук,
профессор, академик РАСХН
Зиновьева Наталия Анатольевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич,
ОАО Московское по племенной работе,
начальник лаборатории иммуногенетической экспертизы
доктор биологических наук, профессор
Калашникова Любовь Александровна,
ФГУ ВНИИплем, Лесные поляны,
заведующая лабораторией ДНК-технологий
Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московская государственная
академия ветеринарной медицины и
биотехнологии имени К. И. Скрябина
Защита состоится л____ ____________ 2012 г. в 10-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.
Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, тел./факс (4967) 65-11-01. www.vij.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЖ.
Автореферат разослан л____ _________ 2012 г.
Ученый секретарь Совета Д 006.013.03 И.В. Гусев
- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Оценка значения породы с точки зрения ее консервации требует синтеза информации из целого ряда источников, в том числе из молекулярно-генетических исследований, дающих объективные критерии изучения разнообразия в породе и между породами [Отчет FAO, 2007]. Использование молекулярных маркеров значительно расширяет возможности генетического анализа, позволяет установить межпородную и внутрипородную изменчивость отдельных участков генома и составить представление о генетической структуре пород [Калашникова Л.А., 2004; Букаров Н.Г., 2010].
Хорошо изученным и широко распространенным для характеристики генетического разнообразия видов сельскохозяйственных животных, в частности свиней, является метод микросателлитного анализа [Зиновьева Н.А. и др., 2009], однако для объективной оценки состояния и динамики аллелофонда популяций животных необходимо расширение спектра высокополиморфных ДНК-маркеров. Одним из таких типов маркеров являются межмикросателлитные последовательности, ISSR [Сулимова Г. И., 2004]. В геномах животных количество микросателлитных повторов довольно велико, что делает метод удобным для генетического анализа [Zietkiewicz E. et al., 1994].
Традиционно для обнаружения ISSR-полиморфизма применяется электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов в полиакриламидном геле с последующей визуализацией с помощью нитрата серебра или радиоизотопов. Информативность, чувствительность и производительность ISSR-анализа могут быть существенно увеличены посредством использования ДНК-анализаторов [Nagaraju J. et al., 2002; Archibald J.K., 2006].
Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явилось исследование информативности системы анализа ISSR-маркеров для характеристики аллелофонда свиней различных пород.
Для достижения указанной цели сформулированы следующие задачи:
- Разработать систему анализа ДНК-маркеров доминантного типа - межмикросателлитных маркеров (ISSR), основанную на использовании флуоресцентно меченных праймеров и лазерной детекции полиморфных фрагментов.
- Выполнить сравнительный анализ информативности разработанной системы ISSR-маркеров и генетических маркеров на основе эритроцитарных антигенов групп крови.
- Провести сравнительное исследование системы ISSR-маркеров с другим типом доминантных ДНК-маркеров на основе полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP).
- Дать сравнительную оценку информативности разработанной системы ISSR-маркеров и кодоминантных ДНК-маркеров - микросателлитов.
- Выполнить построение ISSR-профилей и дать характеристику аллелофонда свиней различных пород.
Научная новизна. Впервые смоделирована система мультиплексного генотипирования ISSR-маркеров свиней, основанная на использовании флуоресцентно меченных праймеров и лазерной детекции продуктов амплификации. Выполнено сравнительное исследование информативности системы ISSR-маркеров с генетическими маркерами на основе эритроцитарных антигенов групп крови, с другим доминантным типом ДНК-маркеров, базирующимся на полиморфизме длин амплифицированных фрагментов (AFLP), и с кодоминантными ДНК-маркерами - микросателлитами. Выполнено построение ISSR-профилей свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок различного происхождения.
Практическая значимость. Предложена высокопроизводительная система мультиплексного анализа свиней по ISSR-маркерам, пригодная для массового скрининга животных. Дана характеристика аллелофонда свиней трех основных пород, разводимых в России: крупная белая, ландрас и дюрок, - по ISSR-маркерам. Создана база данных ISSR-профилей свиней. Показана информативность ISSR-маркеров в характеристике аллелофонда свиней.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Система мультиплексного анализа ISSR-маркеров свиней, основанная на использовании флуоресцентно меченных праймеров и лазерной детекции продуктов амплификации.
- Сравнительная оценка ISSR-маркеров с генетическими маркерами на основе эритроцитарных антигенов групп крови, AFLP-маркерами и микросателлитами.
- ISSR-профили свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок различного происхождения.
- Популяционно-генетические параметры свиней трех пород, рассчитанные по ISSR-маркерам.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих научных мероприятиях:
- Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития - 2011, г. Москва, 21- 24 марта 2011 г.
- Конференция в рамках финала конкурса У.М.Н.И.К, г. Пущино, 2 июня 2011 г.
- Конференция в рамках отборочного этапа конкурса У.М.Н.И.К, п. Дубровицы, 7 октября 2011 г.
- Конференции Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, п. Дубровицы, 2010-2012 гг.
Структура и объем работы. Диссертация написана на 112 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 25 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 167 источников, в том числе 124 источника на иностранном языке.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 2 научные работы, в том числе 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ (Достижения науки и техники АПК, 2011, № 10)
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Россельхозакадемии в период с 2009 по 2012 гг. по схеме, приведенной на рисунке 1.
Молекулярно-генетические исследования были проведены на 307 головах племенных свиней пород крупная белая (3 популяции (КБ-1, КБ-2, КБ-3), n=112), ландрас (Л-1, Л-2, Л-3, n=113) и дюрок (Д-1, Д-2, Д-3, n=82).
В качестве образцов ДНК исследуемых животных были использованы пробы ткани (ушные выщипы). Выделение ДНК проводили перхлоратным методом [Зиновьева Н.А. и др., 2004]. Амплификация фрагментов ДНК проводилась согласно Методическим рекомендациям по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве [Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Праймеры для исследования были подобраны на основании анализа литературных данных о наиболее распространенных микросателлитных повторах в геноме животных [IHGSC, 2001;Марзанов Н.С. и др. 2004; Abbot P., 2001; Cotti C., 2008; Сулимова Г.Е., 2009]. Анализ полиморфизма ISSR-маркеров выполняли на 16-ти капиллярном генетическом анализаторе АВI3130xl Genetic Analyzer с помощью программы Gene Mapper 4.0.
Для сравнения информативности ISSR-маркеров с другими типами маркерных систем из базы данных Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных были выбраны профили исследуемого поголовья свиней по 16 эритроцитарным антигенам шести закрытых систем групп крови (ГК): В, D, E, F, G и L [Проскурина Н.В. и др., 2007; Проскурина Н.В., 2008]; 12 локусам микросателлитов [Тихомирова Т.Н., 2008; Сизарева Е.И., 2010] и AFLP-маркерам [Логвинова Т.И., Зиновьева Н.А., 2011].
Аллельные профили включали следующие показатели: среднее число аллелей, частоты встречаемости аллелей, число информативных аллелей, число эффективных аллелей, число приватных аллелей. Генетические дистанции рассчитывали по Nei [1983]. Индивидуальное соответствие особи породе оценивали по методу Pritchard J.K. с соавторами [2000].
Рис. 1. Схема исследований
Статистическую обработку данных генотипирования проводили с использованием программ MS Excel, Structure 2.3.1, GenAIEx 6.4.1, PAST.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Разработка системы мультиплексного генотипирования ISSR-маркеров свиней
Создание системы молекулярно-генетического анализа проводилось в два этапа. На первом этапе осуществляли подбор праймеров, экспериментальное моделирование системы и исследование спектра получаемых ампликонов. На втором этапе методика была адаптирована для изучения полиморфизма ISSR-маркеров с использованием метода капиллярного электрофореза.
В качестве праймеров были выбраны 6 нуклеотидных последовательностей, состоящих из ди- или тринуклеотидных повторов и лякорного нуклеотида.
В результате апробации различных последовательностей были отобраны праймеры ISSR-2 и ISSR-6, которые затем были маркированы флуоресцентными метками R6G и FAM, соответственно.
Следующим этапом исследования явилась адаптация методики генотипирования ISSR-маркеров для детекции продуктов амплификации на лазерном ДНК-анализаторе. Полученный в результате анализа ISSR-фингерпринт представлен набором пиков разной высоты (рис. 2).
Рис. 2. Результаты ISSR-анализа на генетическом анализаторе ABI Prism 3130xl на примере праймера ISSR-6 (фрагмент)
Вследствие доминантного характера наследования ISSR-маркеров для обработки полученных данных была сформирована бинарная матрица.
3.2. Сравнительный анализ ISSR-маркеров и генетических маркеров на основе групп крови
ISSR-анализ позволил идентифицировать 567 аллелей, среднее число которых на локус составило 1,48 0,02 аллелей: 1,660,03, 1,270,04 и 1,560,04 аллелей для свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок, соответственно. Для исследуемых групп крови (ГК) было выявлено всего 17 аллелей. Среднее их число на локус составило 1,750,11 аллелей:1,880,13,1,500,19 и 1,880,13 аллелей для свиней породы крупная белая, ландрас и дюрок, соответственно (табл. 1).
Анализ степени полиморфизма ISSR-маркеров и ГК для исследуемого поголовья показал, что в среднем по трем изучаемым породам ISSR-маркеры характеризовались на 3% большим количеством полиморфных локусов по сравнению с ГК - 73,7 и 70,8%, соответственно (рис. 3).
Табл. 1. Анализ полиморфизма ISSR и ГК у исследуемых групп свиней
Порода | n | Число аллелей ISSR | Число аллелей ГК | ||
Всего | В среднем на локус | Всего | В среднем на локус | ||
Крупная белая | 22 | 471 | 1,660,03 | 15 | 1,880,13 |
андрас | 6 | 350 | 1,270,04 | 12 | 1,500,19 |
Дюрок | 10 | 444 | 1,560,04 | 15 | 1,880,13 |
Итого* | 567 | 1,480,02 | 17 | 1,750,11 | |
Примечание:* число выявленных аллелей в трех породах (значение не является средней арифметической)
Рис. 3. Доля полиморфных локусов ISSR-маркеров и групп крови у исследуемых групп свиней
Наименьшим уровнем полиморфизма характеризовались животные породы ландрас как по ISSR-маркерам (60,7% и 1,270,04 аллелей на локус), так и по ГК (50,0% и 1,500,19 аллелей на локус). Возможно, низкий уровень полиморфизма в данной группе животных был связан с небольшой их численностью. В отношении остальных пород наблюдались значительные различия в зависимости от типа маркеров. Наивысший уровень полиморфизма по ISSR-маркерам был отмечен у свиней породы крупная белая (83,1% и 1,66 0,03 аллелей на локус), в то время как по ГК наибольшей долей полиморфных локусов характеризовались животные породы дюрок (87,5% и 1,880,13 аллелей на локус).
Результаты сравнительного генетического структурирования популяций на основании расчета коэффициента подобия (Q) с использованием ISSR-профилей и генетических профилей по ГК приведены на рисунке 4. В качестве критерия оценки принадлежности животных к популяции был выбран 75% уровень исключения. На основании анализа ДНК-профилей по ISSR-маркерам корректное отнесение индивидуумов к породе достигалось в 28,6% случаев - у крупной белой породы, 50,0% случаев - у свиней породы ландрас и в 9,1% случаев - у свиней породы дюрок.
А) ISSR маркеры
Б) Группы крови
Примечание: Ось Х - племенные свиньи соответствующих пород.
Ось Y - критерий Q принадлежности особи к породе.
Рис. 4. Результаты сравнительного генетического структурирования популяций свиней с использованием критерия Q, рассчитанного по ISSR-профилям (А) и генетическим профилям групп крови (Б)
На основании данных эритроцитарных антигенов ГК корректное отнесение индивидуумов к популяции достигалось в 14,3% случаев у свиней крупной белой породы, в 16,7% случаев у животных породы ландрас и в 54,5 % случаев у свиней породы дюрок.
3.3. Сравнительный анализ ISSR-маркеров и ДНК-маркеров, основанных на полиморфизме длин амплифицированных фрагментов (AFLP)
Табл. 2.Анализ полиморфизма ISSR и AFLP у исследуемых групп свиней
Порода | n | Число аллелей ISSR | Число аллелей AFLP | ||
Всего | В среднем на локус | Всего | В среднем на локус | ||
Крупная белая | 16 | 531 | 1,74 0,03 | 481 | 1,77 0,03 |
андрас | 24 | 587 | 1,93 0,02 | 389 | 1,43 0,04 |
Дюрок | 9 | 492 | 1,62 0,03 | 396 | 1,46 0,04 |
Итого* | 609 | 1,76 0,02 | 543 | 1,55 0,02 | |
Примечание:* число выявленных аллелей в трех породах (значение не является средней арифметической)
В таблице 2 представлены результаты сопоставления полиморфизма двух доминантных маркерных систем. Анализ ISSR-маркеров позволил детектировать 609 аллелей. Для пород крупная белая, ландрас и дюрок было выявлено 531, 587 и 492 аллелей, соответственно. Для AFLP-маркеров было отмечено меньшее число аллелей: 543 в целом и 481, 389 и 396 - для пород крупная белая, ландрас и дюрок, соответственно.
Исследование показало, что по среднему числу аллелей на локус ISSR-маркеры превосходили AFLP-маркеры (1,760,02 и 1,550,02, соответственно). Число аллелей ISSR варьировало в зависимости от породной принадлежности животных: 1,740,03 - для крупной белой породы, 1,930,02 - для породы ландрас и 1,620,03 - для породы дюрок, а по данным AFLP-анализа значения этого показателя составили 1,770,03, 1,430,04 и 1,460,04, соответственно.
Примечание:* комбинированная система ISSR- AFLP
Рис. 5. Доля полиморфных локусов у исследуемых групп свиней
Как показано на рисунке 5, ISSR-маркеры характеризовались на 11,0% большим количеством полиморфных локусов по сравнению с AFLP-маркерами в среднем по трем породам (88,1 и 77,7%, соответственно). Комбинирование аллельных профилей по ISSR и AFLP повышало средний процент полиморфных локусов до 83,2%.
Наибольшей долей полиморфных локусов по ISSR-маркерам (96,4%) характеризовались животные породы ландрас, в то время как по AFLP-маркерам для них было выявлено 71,7% полиморфных локусов. Такая же закономерность была отмечена и для свиней породы дюрок (80,8 % и 72,9% по ISSR- и AFLP-маркерам, соответственно).
На рисунке 6 представлена структура пиков ISSR- и AFLP-маркеров в исследуемых породах свиней.
А)
Б) Рис. 6. Структура пиков в исследуемых породах свиней по ISSR- (А) и AFLP-маркерам (Б)
А) ISSR-маркеры
Б) AFLP-маркеры
Рис. 7. Результаты определения породной принадлежности племенных свиней с использованием ISSR- и AFLP- маркеров
У свиней пород дюрок и крупная белая, независимо от типа маркерной системы, все идентифицированные аллели встречались с частотой более 5,0%, что свидетельствует об их информативности. У ландрасов 91,0% аллелей по ISSR- и 70,2% аллелей по AFLP-маркерам являлись информативными.
Результаты сравнительного генетического структурирования популяций на основании расчета критерия Q по ISSR- и AFLP-профилям показали, что при использовании ISSR-маркеров корректное отнесение индивидуумов к популяции достигалось в 12,5% случаев у свиней породы крупная белая, в 12,5% случаев - у ландраса и в 11,1% случаев - у дюроков (рис. 7А). По данным AFLP-маркеров значения данного показателя составили 22,2% - у свиней породы дюрок и 75,5% - у свиней породы ландрас. Ни у одного животного крупной белой породы критерий Q не достигал 75% (рис. 7Б).
3.4. Сравнительный анализ ISSR-маркеров и микросателлитов
ISSR-анализ позволил идентифицировать 638 аллелей, причем наибольшим генетическим разнообразием характеризовались свиньи породы ландрас: было детектировано 618 аллелей. По трем породам число аллелей, приходящихся на один локус, составило 1,850,01. Наибольшее количество аллелей на локус было отмечено для породы ландрас (1,940,01) (табл. 3).
Исследование 12 локусов микросателлитов (МС) показало более высокую степень полиморфизма: 5,360,25 аллелей на локус. Наибольшим аллельным разнообразием характеризовались животные породы крупная белая: 5,830,32 аллелей на локус.
Табл. 3. Анализ полиморфизма ISSR и МС у исследуемых групп свиней
Порода | n | Число аллелей ISSR | Число аллелей МС | ||
Всего | В среднем на локус | Всего | В среднем на локус | ||
Крупная белая | 34 | 593 | 1,86 0,02 | 70 | 5,830,32 |
андрас | 40 | 618 | 1,940,01 | 67 | 5,580,50 |
Дюрок | 19 | 558 | 1,75 0,03 | 56 | 4,67 0,41 |
Итого* | 638 | 1,850,01 | 91 | 5,36 0,250 | |
Примечание:* число выявленных аллелей в трех породах (значение не является средней арифметической)
Анализ степени полиморфизма ISSR-локусов в исследованных группах свиней показал, что количество полиморфных локусов варьировало в зависимости от породной принадлежности животных от 87,5% - у породы дюрок до 96,9% - у ландраса (табл. 4).
Все микросателлитные локусы характеризовались 100% полиморфизмом, что было на 8,0% выше среднего уровня ISSR-полиморфизма по трем изучаемым породам.
Табл. 4. Доля полиморфных локусов ISSR и МС у исследуемых групп свиней
Порода | n | Доля полиморфных локусов, % | |
ISSR | МС | ||
Крупная белая | 34 | 93,0 | 100 |
андрас | 40 | 96,9 | 100 |
Дюрок | 19 | 87,5 | 100 |
В среднем | 92,4 | 100 | |
Результаты сравнительного генетического структурирования популяций по значению критерия Q с использованием ISSR-маркеров и микросателлитов представлены на рисунке 8.
А) ISSR маркеры
Б) Микросателлиты
Рис. 8. Результаты анализа индивидуальной принадлежности к породе на основании анализа ISSR-маркеров (А) и микросателлитов (Б)
По данным ISSR-анализа корректное отнесение индивидуумов к популяции при уровне исключения в 75,0% достигалось в 2,9% случаев у животных породы крупная белая, в 15,0% случаев - у свиней породы ландрас и в 47,4% случаев - у породы дюрок (рис. 8А). Значения данного показателя, рассчитанные на основании ДНК-профилей свиней по МС, составили 88,2, 80,0 и 89,5%, соответственно (рис. 8Б).
3.5. Характеристика аллелофонда свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок по ISSR-маркерам
3.5.1. Анализ ISSR-профилей
В таблицах 5 и 6 представлены результаты анализа полиморфизма ISSR-маркеров в исследуемых группах свиней.
В среднем по трем породам было идентифицировано 620 аллелей, что составляет 1,900,01 аллелей на локус.
Табл. 5. Результаты анализа полиморфизма ISSR-маркеров в исследуемых группах свиней
Число аллелей ISSR-маркеров | ||||||
Крупная белая | андрас | Дюрок | В среднем | |||
КБ-1 | 515 | -1 | 390 | Д-1 | 493 | 466 |
КБ-2 | 601 | -2 | 626 | Д-2 | 595 | 607 |
КБ-3 | 477 | -3 | 463 | Д-3 | 490 | 477 |
Итого* | 629 | 615 | 617 | 620 | ||
Примечание:* число выявленных аллелей в трех популяциях (значение не является средней арифметической)
Табл. 6. Анализ полиморфизма количества аллелей, приходящихся в среднем на один локус, в исследуемых группах свиней
Число аллелей ISSR-маркеров | ||||||
Крупная белая | андрас | Дюрок | В среднем | |||
КБ-1 | 1,810,03 | -1 | 1,370,04 | Д-1 | 1,730,03 | 1,640,02 |
КБ-2 | 1,880,02 | -2 | 1,960,01 | Д-2 | 1,860,02 | 1,900,01 |
КБ-3 | 1,710,03 | -3 | 1,660,03 | Д-3 | 1,760,03 | 1,710,02 |
Итого* | 1,930,01 | 1,890,02 | 1,890,02 | 1,900,01 | ||
Примечание:* число выявленных аллелей в трех популяциях (значение не является средней арифметической)
Наибольшим уровнем полиморфизма характеризовались свиньи крупной белой породы (629 аллелей или 1,930,01 аллелей на локус). Для пород ландрас и дюрок различия в уровне полиморфизма были незначительными: 1,890,02 и 1,890,02 аллелей на локус, соответственно. Заметные различия в уровне аллельного разнообразия были выявлены между популяциями свиней внутри пород. Так, например, у свиней породы ландрас в группе Л-2 были идентифицировано 1,960,01 аллелей на локус, в то время как в группах Л-1 и Л-3 - 1,370,04 и 1,660,03 аллелей на локус, соответственно.
Все три породы характеризовались высоким уровнем полиморфизма от 94,6% для пород дюрок и ландрас до 96,5% у породы крупная белая.
Анализ структуры аллелей в изучаемых породах свиней показал, что все породы характеризуются относительно большим количеством информативных аллелей (табл. 7).
Табл. 7. Анализ распределения информативных аллелей в изучаемых группах свиней
Число аллелей ISSR-маркеров | ||||||
Крупная белая | андрас | Дюрок | В среднем | |||
КБ-1 | 410 | -1 | 390 | Д-1 | 493 | 431 |
КБ-2 | 520 | -2 | 563 | Д-2 | 536 | 540 |
КБ-3 | 311 | -3 | 293 | Д-3 | 392 | 332 |
Итого* | 507 | 496 | 497 | 332 | ||
Примечание:* число выявленных аллелей в трех популяциях (значение не является средней арифметической)
В среднем по трем породам 80,6% аллелей встречались с частотой более 5%. В группах Д-1 и Л-1 все аллели были информативными, в то время как у свиней КБ-1 этот показатель составлял 79,6% аллелей.
В таблице 8 представлен анализ наличия приватных аллелей в изучаемых группах свиней. В породном отношении наибольшим числом приватных аллелей характеризовалась крупная белая порода (21 аллель), а наименьшим - порода ландрас (4 аллеля).
Табл. 8.Анализ распределения приватных аллелей в изучаемых группах
Число аллелей ISSR-маркеров | ||||||
Крупная белая | андрас | Дюрок | В среднем | |||
КБ-1 | 55 | -1 | 4 | Д-1 | 36 | 32 |
КБ-2 | 6 | -2 | 12 | Д-2 | 4 | 7 |
КБ-3 | 20 | -3 | 21 | Д-3 | 32 | 24 |
Заметные различия в количестве приватных пиков были отмечены между популяциями внутри пород. Так, в крупной белой породе количество приватных аллелей варьировало от 6 до 55, у свиней породы дюрок - от 4 до 36 и у свиней породы ландрас - от 4 до 21. Вероятно, высокая вариабельность в количестве приватных аллелей может быть связана с тем, что не все пики являются строго породоспецифичными, а отражают принадлежность животных к определенной популяции.
3.5.2. Анализ генетических дистанций, рассчитанных на основе ISSR-маркеров между исследуемыми популяциями свиней
Результаты анализа генетических дистанций между исследуемыми группами свиней, рассчитанные по Nei M. [1983], в виде генеалогического древа представлены на рисунке 9.
Анализ структуры филогенетического древа выявил формирование двух основных кластеров, один из которых представлен животными одного хозяйства, а второй включает в себя групп свиней двух других хозяйств. Внутри второго кластера выделяется самостоятельная ветвь КБ-2 и два подкластера, представленные группами свиней двух остальных пород второго предприятия (Л-2 и Д-2) и тремя породами свиней третьего предприятия (КБ-3, Л-3 и Д-3, соответственно).
Рис. 9. Дендрограммы генетических связей девяти исследуемых популяций свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок.
Таким образом, структура генеалогического дерева, в большей степени, отражает принадлежность свиней к предприятию, чем к породе.
4. ВЫВОДЫ
1. Разработана система мультиплексного генотипирования ISSR-маркеров свиней с использованием флуоресцентно меченных праймеров и лазерной детекции продуктов амплификации на ДНК-анализаторе. Оценка системы, выполненная на свиньях трех пород (n=307), показала, что ISSR-маркеры характеризовались высоким уровнем полиморфизма - от 94,6 до 96,5% в зависимости от породы. В среднем по трем породам было идентифицировано 620 аллелей, что составляет 1,900,01 аллелей на локус.
2. Сравнительный анализ аллельных профилей свиней трех пород по ISSR-маркерам и группам крови (ГК) показал более высокую степень полиморфизма ISSR-маркеров по сравнению с ГК - 73,7 и 70,8%, соответственно. Установлено, что корректное отнесение особей к породе при 75% уровне исключения (Q) по данным ISSR-анализа достигалось в 9,1% случаев у свиней породы дюрок, в 28,6% случаев - у свиней крупной белой породы и в 50% случаев - у свиней породы ландрас, в то время как при использовании ГК значения данного показателя составили 54,5, 14,3 и 16,7%, соответственно.
3. Сравнительное исследование системы ISSR-маркеров с AFLP-маркерами показало их более высокий уровень полиморфизма: доля полиморфных локусов в среднем по трем породам составила 88,1 и 77,7%, соответственно. Идентификация породной принадлежности свиней при Q75% при использовании ISSR- и AFLP-маркеров достигалась, соответственно, в 12,5 и 0,0% случаев у свиней крупной белой породы, 12,5 и 75,5% случаев - у свиней породы ландрас и в 11,1 и 22,2% случаев - у свиней породы дюрок.
4. Сравнительная оценка полиморфизма ISSR-маркеров и микросателлитов показала более высокую долю полиморфных локусов микросателлитов (100,0 против 92,4%). Доля животных с корректно идентифицированной породной принадлежностью при использовании ISSR-маркеров и микросателлитов составила, соответственно, 2,9 и 88,2% у свиней крупной белой породы, 15,0 и 80,0% - у свиней породы ландрас 47,4 и 89,5% - у свиней породы дюрок.
5. Дана характеристика аллелофонда свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок трех свиноводческих предприятий России по ISSR-маркерам. Показано, что наибольшим уровнем полиморфизма характеризовались свиньи крупной белой породы: 629 аллелей или 1,930,01 аллелей на локус. Для свиней пород ландрас и дюрок значения данных показателей составили 615 аллелей (1,890,02 аллелей на локус) и 617 аллелей (1,890,02 аллелей на локус), соответственно. Установлено наличие приватных аллелей во всех трех исследованных породах свиней: 21 - у свиней крупной белой породы, 4 - у свиней породы ландрас и 10 - у свиней породы дюрок.
6. Основываясь на полученных ISSR-профилях, установлены генеалогические связи девяти популяций свиней трех пород. Показано, что формирующаяся структура филогенетического дерева, в большей степени, является отражением популяционной, а не породной принадлежности изучаемых групп свиней.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Молекулярно-генетическим лабораториям для повышения производительности ISSR-анализа рекомендуем использовать разработанную нами систему, основанную на использовании флуоресцентно-меченных праймеров и лазерной детекции продуктов амплификации на ДНК-анализаторе.
абораториям, занимающимся вопросами изучения генофондов сельскохозяйственных животных, в частности свиней, рекомендуем использовать ISSR-маркеры в качестве одного из критериев оценки состояния популяций.
Список опубликованных работ по теме диссертации
Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ
1. Денискова, Т.Е. Моделирование системы мультиплексного анализа ISSR-маркеров свиней / Денискова Т.Е., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И. // Достижения науки и техники АПК. - 2011, № 10. - С.55-56.
Статьи в других изданиях
2. Денискова, Т.Е. Сравнительный анализ ISSR-маркеров и ДНК-маркеров, основанных на полиморфизме длин амплифицированных фрагментов (AFLP) / Денискова Т.Е., Логвинова Т.И. // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2012, № 04 (39). - С. 27-29.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии