Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Аль Дайни Саба
Хади Бенайед Влияние водного экстракта оливы европейской (Olea Europaea) на функционирование ферментов глиоксилатного цикла у крыс в условиях экспериментального диабета
Специальность 03.01.04 - Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Воронеж - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Воронежский государственный университет (ФГБОУ ВПО ВГУ).
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Епринцев Александр Трофимович
Официальные оппоненты: Наквасина Марина Александровна доктор биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет, профессор кафедры биофизики и биотехнологии Шуваева Галина Павловна кандидат биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет инженерных технологий, доцент кафедры микробиологии и биохимии
Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН
Защита состоится л27 декабря 2012 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., д. 1, ауд.
59.
Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ФГБОУ ВПО Воронежский государственный университет.
Автореферат разослан л26 ноября 2012 года.
Ученый секретарь диссертационного совета Грабович Маргарита Юрьевна ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. При индуцированном аллоксаном экспериментальном диабете в организме включаются многие защитные механизмы. Среди этих способов защиты важную роль играют природные вещества, содержащиеся в экстрактах растений. Считается, что оливковое дерево обладает высокой антиоксидантной активностью, причем это характерно для листьев, плодов и полученного из них масла. Известно, что листья оливкового дерева содержат в своем составе молекулы таких веществ, как олеуропеин, гидрокситирозол, олеуропеина агликон и тирозол (Corona et al., 2006; Manna et al., 2004). Основными фенольными соединениями листьев оливы являются гликозилированные формы олеуропеина и лигстрозида. Наиболее активным компонентом листьев оливы считается экстракт олеуропеина, естественный продукт иридоидной группы. Механизм подавления гипергликемии с помощью олеуропеина до сих пор не изучен (Saenz et al., 1998; Visioli et al., 1998).
Подробные исследования эффективности гидрокситирозола, выделенного из листьев оливкового дерева, в отношении моделирования оксидативного стресса, ассоциированного с сахарным диабетом у экспериментальных животных, отсутствуют. Следовательно, настоящее исследование было проведено для изучения возможных гипогликемических и сахароснижающих эффектов водного экстракта листьев оливы. Изменения метаболизма липидов и липопротеинов на фоне сахарного диабета связаны с трансформацией функционирования глиоксилатного цикла. Ранее на кафедре была установлена возможность индукции ключевых ферментов глюконеогенеза в печени и почках крыс при голодании и экспериментальном диабете (Епринцев и др., 2007). Особый интерес вызывает функционирование изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1), малатсинтазы (КФ 4.1.3.2) и других ключевых ферментов в разных органах крыс при экспериментальном диабете на фоне введения в организм животного водного экстракта оливы европейской (ВЭО). Выяснение механизма изменения активности маркерных и ключевых ферментов глиоксилатного цикла открывает перспективы для разработки модели адаптивной реакции клеточного метаболизма, включающей ферментативную оборону, что обеспечивает адаптацию организма к сахарному диабету.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование действия водного экстракта оливы европейской на функционирование ферментов глиоксилатного цикла у крыс при экспериментальном диабете. Исходя из цели, были поставлены следующие задачи.
1. Создание экспериментальной модели диабета с использованием инъекций индуктора диабета аллоксана экспериментальным животным.
2. Изучение динамики развития экспериментального диабета при введении крысам перорально водного экстракта оливы.
3.Проведение гистологических исследований печени и поджелудочной железы у контрольных крыс, животных, подвергшихся аллоксановому диабету, и крыс с аллоксановым диабетом, получавших ВЭО.
4. Исследование изменения активности и изоферментного состава ряда ферментов глиоксилатного цикла и цикла Кребса в различных тканях опытных и контрольных крыс.
5. Изучение субклеточной локализации маркерных ферментов глиоксилатного цикла в печени и почках крыс с экспериментальным диабетом, получавших водный экстракт оливы.
6. Получение электрофоретически гомогенных препаратов изоцитратлиазы и малатсинтазы с помощью многостадийной очистки из опытных животных.
7. Исследование физико-химических и каталитических свойств маркерных ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы из почек и печени экспериментальных крыс.
Научная новизна. Показано, что экспериментальный диабет, вызывающий индукцию изоцитратлиазы и малатсинтазы, в гепатоцитах и клетках почек крыс, полностью блокируется введением водного экстракта листьев оливы европейской (Olea Europea). Протекторное действие экстракта оливы проявляется в снятии индукции маркерных ферментов глиоксилатного цикла, в частности, их активность отсутствует в печени и почках. При введении водного экстракта листьев оливы наблюдается уменьшение размера островков по сравнению с панкреатическими островками у крыс с аллоксановым диабетом. Получены гомогенные препараты изоцитратлиазы и малатсинтазы из тканей крыс с аллоксановым диабетом. Показано, что при экспериментальном диабете происходит образование новых изоформ малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы, локализованных в пероксисомальной фракции гепатоцитов, при этом их индукция полностью снимается при введении водного экстракта оливы крысам.
Практическая значимость. Результаты диссертационной работы позволяют углубить современные представления о механизмах сопряжения анаболических и катаболических процессов в клетках животных.
Протекторное действие водного экстракта листьев оливы европейской открывает перспективы для использования его как гипогликемического средства при сахарном диабете. Предлагается способ хранения фермента изоцитратлиазы, обеспечивающий его функциональную сохранность в течение длительного времени, что позволяет использовать препарат для биохимических анализов в лабораторной практике.
Материалы работы применяются в учебном процессе на биологопочвенном факультете Воронежского госуниверситета при чтении лекций по биохимии, а также в спецкурсах по энзимологии. Кроме того, они используются при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях и были представлены на IV Международной научнопрактической конференции Наука на рубеже тысячелетия, Барселона - Санта Сусанна, Испания, 2012; на III международной научно-практической конференции Роль науки в развитии общества, Хургада, Египет, 2011; на международной научно-практической конференции Высокие технологии.
Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии, Санкт-Петербург, 2010; на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи; на X-ой международной научнопрактической конференции Актуальные проблемы профессионального образования: подходы и перспективы; ежегодных научных секциях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета.
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в одиннадцати публикациях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы 256 источников. Иллюстрационный материал включает 23 рисунка, 7 таблиц.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объектов исследования использовали самцов беспородных лабораторных крыс (Rattus rattus L.), которые выращивались при нормальном питании. Контрольные животные выращивались при обычном пищевом режиме без введения аллоксана. Для экспериментов использовали животных в возрасте приблизительно пяти месяцев. Их масса к этому времени составляла от 250 до 300 г.
Формирование модели аллоксанового диабета у крыс. Опытным крысам вводили подкожно аллоксан в дозе 200 мг/кг. Контрольным животным производили инъекцию физиологического раствора в том же объеме. Наличие аллоксанового диабета у крыс определяли по уровню изменения концентрации глюкозы в крови. Концентрацию глюкозы определяли ферментативно. Для этого использовали готовый глюкозный реактив, содержащий трис-буфер рН 8,4, смесь ферментов (глюкозооксидаза, пероксидаза), хромоген. Глюкозу определяли в плазме крови. По 3 мл глюкозного реактива смешивали с 0,01 мл плазмы крови, 10 ммоль глюкозой и с водой, затем инкубировали в течение 30 мин. при 37оС в темноте.
Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 480520 нм пробы (А) и этанола (В) против контрольного раствора. Концентрацию глюкозы рассчитывали по формуле: Глюкоза (ммоль/л) = 10 * А / В.
Концентрация глюкозы в крови в норме составляла 6-8 ммоль/л. Через десять дней после инъекции концентрация глюкозы в крови крыс составляла 14-ммоль/л. Такое существенное увеличение концентрации глюкозы в крови нами рассматривалось как критерий индукции у опытных животных аллоксанового диабета.
Получение водного экстракта из листьев оливы. Для приготовления горячего водного экстракта 10 граммов растительного порошка смешивали со 100 мл кипящей дистиллированной воды и помещали в термостат на минут при температуре 70С для получения сухого порошка экстракта.
Экстракт имел рН-6,3, что достаточно близко к значению рН крови (El FallaKattan, 1997).
Выделение клеточных органелл. Выделение субклеточных фракций из органов проводили методами дифференциального центрифугирования и изоплотностного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.
Один грамм органа гомогенизировали в 10 мл среды выделения (рН 7,5), содержащей 50 мМ трис-НСl 0,25 М сахарозы, 1 мМ MgC12, 1 мМ дитиотрейтол и 1 мМ ЭДТА. Осадок, содержащий в основном митохондрии и пероксисомы, ресуспедировали в среде выделения. Затем митохондрии и пероксисомы разделяли с помощью изоплотностного центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы. Наличие в исследуемой фракции сахарозного градиента митохондрий и пероксисом определяли по активности маркерных ферментов: сукцинатдегидрогеназы, фумаратгидратазы и каталазы.
Определение активности ферментов. Определение активности ферментов проводили спектрофотометрически при 25С.
Изоцитратлиазу (ИЦЛ, КФ. 4.1.3.1) определяли при 324 нм по методу Диксона и Корнберга (Dixon, Kornberg, 1959).
Малатсинтазу (МС, КФ 4.1.3.2) измеряли при 412 нм по формированию комплекса CoA-SH и дитио-бис-нитробензойной кислоты (ДТНБ).
Активность малатдегидрогеназы (МДГ, КФ 1.1.1.37) измеряли спектрофотометрически при 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, определяемой скоростью образования или расходования НАДН.
Для измерения активности аконитатгидратазы (АГ, КФ 4.2.3.1) применяли метод, основанный на учете разности поглощения цитрата и изоцитрата по сравнению с цис-аконитатом при 240 нм.
Для определения активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3.99.1) спектрофотометрировали при длине волны 600 нм по методу Т.
Cooper с сотр. (1969). Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли спектрофотометрически при 230 нм (Breidenbach et al., 1968).
Цитратсинтазу (ЦС, КФ 4.1.3.7) определяли при длине волны 412 нм.
За единицу ферментативной активности (Е) принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль продукта за 1 минуту при 25С.
Выделение и очистка ферментов. Для получения высокоочищенных препаратов ИЦЛ и МС был разработан метод, включающий несколько стадий очистки. После гомогенизации материала проводили фракционирование белков сульфатом аммония. От низкомолекулярных соединений ферменты отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-Toyopearl или ДЭАЭцеллюлозе, и гельхроматографию на Toyopearl HW-55 или сефадексе G-150.
Исследование кинетических характеристик ферментов.
Кинетические и регуляторные свойства ферментов изучали на электрофоретически гомогенных или высокоочищенных препаратах.
Определение констант Михаэлиса, констант ингибирования осуществляли с использованием линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов (Диксон, Уэбб, 1982).
Аналитический электрофорез. Электрофоретическое исследование проводили по методу Девиса и Орнстейна (Davis, Ornsttin, 1959). Разделение белкового раствора осуществляли на разделяющем (мелкопористом) геле, который содержал 7,5% полиакриламида. Применение концентрирующего (крупнопористого) геля, содержащего 2% акриламида, обеспечивало концентрацию белка. Разделение исследуемых белков проводили в основной буферной системе, рН 8,9. Электрофоретическое разделение белков проводили на холоду (0, +2). Для определения гомогенности очищенной ИЦЛ наносили на одну полосу исследуемый раствор, содержащий 10-15 мкг белка. После электрофореза гелевые пластинки окрашивали универсальным красителем на белки - нитратом серебра или кумасси голубым.
Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в 3-4 кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. В таблицах и на рисунках приводятся данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из трех определений. Для контроля достоверности результатов исследований применяли метод вариационной статистики. Полученные данные обрабатывали с использованием статистических критериев. Обсуждаются статистически достоверные различия при р < 0,05 (Лакин, 1980). Для построения графиков использовали данные, обработанные с помощью программ линейной и параболической аппроксимации.
ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ИНДУКЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИАБЕТА У КРЫС Введение аллоксана самцам лабораторных крыс способствовало увеличению концентрации глюкозы в крови до 15,8 ммоль/л, спустя 9 дней после инъекции. У контрольных крыс концентрация глюкозы составила порядка 5,5 ммоль/л (рис. 1). У группы животных с аллоксановым диабетом при введении им перорально водного экстракта оливы европейской наблюдали устойчивое снижение концентрации глюкозы, которое не превышало 6-8 ммоль/л.
Воздействие аллоксана приводит к разрушению -клеток островков Лангерганса в поджелудочной железе, вследствие чего возникает недостаток инсулина и развивается инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД).
Рис. 1. Динамика изменения уровня глюкозы в крови у крыс Было показано, что уровень глюкозы в крови у крыс с аллоксановым диабетом, получавшим ежедневно ВЭО, значительно снижался на всем протяжении проведения эксперимента по сравнению с группой крыс с аллоксановым диабетом.
Гистологический анализ образцов печени крыс в норме и при аллоксановом диабете. В контрольных срезах печени состояние центрального сосуда и триады (поддольковые печеночные вены) не изменено. Размеры их находятся в норме, просвет нормальный, хорошо видны макрофаги. При диабете печень отреагировала появлением лимфоидной ткани, сосуды уменьшились, следовательно, их просвет сужался (рис. 2). У группы животных с аллоксановым диабетом, получавшей ВЭО, клетки имели нормальную структуру и мало отличались от гистологических срезов, сделанных с клеток печени контрольных крыс.
В контрольном образце среза поджелудочной железы изменений в строении клеток островков Лангерганса нет. В тканях опытных крыс с индуцированным диабетом, в островках Лангерганса наблюдается патология в их строении. При диабете их количество и размер заметно уменьшается.
Были выявлены изменения в размере и форме островковых клеток и умеренная дегрануляция -клеток.
1 2 Рис. 2. Гистологические срезы образцов печени в районе центральной вены крыс в норме (1), при аллоксановом диабете (2), у крыс с аллоксановым диабетом в присутствии экстракта оливы (3).
Однако, панкреатические островки в группе крыс с аллоксановым диабетом, получавшей водный экстракт оливы, и в контрольной группе имели нормальную структуру с умеренной дегрануляцией и полнокровными кровеносными сосудами. В группе животных с аллоксановым диабетом, получавших ВЭО, были выявлены нормальные панкреатические островки правильной формы аналогичные островкам в контрольной группе крыс.
ИНДУКЦИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ГЛИОКСИЛАТНОГО ЦИКЛА В ТКАНЯХ КРЫС В УСЛОВИЯХ АЛЛОКСАНОВОГО ДИАБЕТА И ПРИ ВВЕДЕНИИ ВОДНОГО ЭКСТРАКТА ОЛИВЫ Активность ключевых ферментов центральных метаболических путей в печени и почках крыс. Анализ изменения активности ферментов, обеспечивающих функционирование глиоксилатного цикла, приведен в таблице 1. Контролировалась активность аконитатгидратазы, Таблица 1.
Активность ключевых ферментов, участвующих в протекании основных метаболических процессов в печени и почках крыс Ферменты Активность ферментов Печень Почки Норма Аллоксан Аллок- Норма Аллоксан Аллоксан + сан + экстракт экстракт оливы оливы Цитратсинтаза, 1,983 2,850 1,953 0,896 1,231 0,905 Е/г сырой 0,102 0,082 0,073 0,039 0,041 0,0массы Аконитат- 2,951 7,212 2,861 3,052 6,715 3,210 гидратаза, Е/г 0,059 0,037 0,031 0,012 0,101 0,1сырой массы Малатдегидро- 38,106 79,211 39,201 43,314 100,300 52,301 геназа, Е/г 1,132 2,116 1,083 1,410 2,514 2,0сырой массы Сукцинатде- гидрогеназа, 1,218 1,728 1,251 0,911 1,342 1,264 Е/г сырой 0,034 0,041 0,043 0,012 0,019 0,0массы Изоцитрат- 0 2,806 0 0 0,926 лиаза, Е/г 0,073 0,0сырой массы Малатсинтаза, 0 1,318 0 0 0,516 Е/г сырой 0,026 0,0массы АсАТ, мк кат/л 1,489 1,790 1,521 1,293 0,101 1,189 0,071 0,085 0,067 0,043 0,032 0,0ААТ, мк кат/л 3,519 6,958 3,601 0,319 0,474 0,309 0,173 0,292 0,115 0,011 0,021 0,0малатдегидрогеназы, цитратсинтазы, сукцинатдегидрогеназы, ААТа и АсАТа в печени и почках интактных и опытных крыс. У животных одной группы индуцировался экспериментальный диабет, а крысам второй группы вводили перорально дополнительно водный экстракт оливы. Было установлено, что в период эксперимента активность всех ферментов увеличивалась при возникновении аллоксанового диабета. К 5 дню опыта по сравнению с контрольными животными резко возрастала активность ферментов глиоксилатного цикла, составляющая для МДГ и ЦС из печени 79,211 и 2,850 ед. на 1 г сырой массы, а из почек 100,300 и 1,231 ед. на г сырой массы, соответственно (табл. 1). Интересно отметить, что наблюдается индукция маркерных ферментов глиоксилатного пути МС и ИЦЛ, которая полностью отсутствует в печени и почках контрольных животных. Введение крысам перорально водного экстракта оливы европейской полностью снимало индукцию маркерных ферментов и увеличение активности других исследуемых энзимов под влиянием экспериментального диабета. Изменение активности исследуемых ферментов в группе крыс с аллоксановым диабетом, которым вводили перорально водный экстракт оливы, совпадало с тенденциями, характерными для энзимов контрольной группы животных (табл.1).
Экстракт оливы, введенный крысам, оказывал нивелирующее действие на изменение ферментативной активности, обуславливающей протекание катаболических и анаболических процессов.
Индукция ферментов глиоксилатного цикла в тканях крыс.
Доказательством функционирования глиоксилатного цикла у экспериментальных крыс являются активности ИЦЛ и МС в различных тканях и органах крыс, подвергшихся воздействию аллоксана. В тканях нормальных крыс активности маркерных ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы не обнаружены. Интересно отметить, что активность этих ферментов глиоксилатного цикла в печени, почках и других органах крыс с аллоксановым диабетом, получавших водный экстракт оливы, не выявлена. На пятый день эксперимента активность изоцитратлиазы и малатсинтазы была максимальной и составила для гомогената тканей печени 0,10 и 0,060 ед. на 1 мг белка, соответственно (рис.3). Такая же динамика индукции характерна и для ИЦЛ и МС из почек. Однако, абсолютные значения активности изучаемых ферментов были ниже.
Рис. 3. Индукция ключевых ферментов глиоксилатного цикла в условиях аллоксанового диабета крыс.
1 - динамика активности изоцитратлиазы;
2 - динамика активности малатсинтазы Известно, что как ИЦЛ, так и МС отсутствуют в животных тканях, обнаруживаясь только в микроорганизмах и высших растениях (Beevers, 1979). Однако, во время личиночных стадий онтогенеза и в эмбриогенезе некоторых нематод была показана индукция ферментов глиоксилатного цикла (Khan, McFadden, 1980). Для их личинок было установлено, что изоцитратлиаза и малатсинтаза локализованы в митохондриях и обеспечивают синтез гликогена из жирных кислот (Rubin, Trelease, 1976).
Кроме того, некоторые биохимические и цитохимические исследования показали присутствие ключевых ферментов глиоксилатного цикла в тканях высших животных. Так активность изоцитратлиазы и малатсинтазы обнаруживалась в почечных канальцах Bufo marinus (Goodman et al., 1980), в печени морских свинок (Jones, 1980) и цыплят (Davis et al., 1990).
Очень интересно отметить, что существуют данные об обнаружении активности изоцитратлиазы и малатсинтазы в гепатоцитах человека (Davis et аl., 1992).
Изоферментный состав ключевых ферментов глиоксилатного цикла у крыс в различных условиях. Увеличение активности энзимов может быть связано с дополнительным синтезом ферментов и появлением их новых изоформ (рис. 4). У крыс в норме обнаружено два изофермента малатдегидрогеназы и три изоформы, обладающие аконитатгидратазной активностью. Полностью отсутствует активность маркерных ферментов Рис. 4. Изоферментный состав малатдегидрогеназы (I), аконитатгидратазы (II) и изоцитратлиазы (III) в гепатоцитах крыс в норме (1), крыс с экспериментальным диабетом (2) и крыс с экспериментальным диабетом, получавших водный экстракт оливы (3) глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы. В печени крыс в условиях экспериментального диабета происходит индукция маркерных ферментов глиоксилатного пути и перестройка изоферментного состава других ключевых ферментов центральных метаболических путей - малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы. Наблюдается сопряженное с возрастанием активности этих энзимов увеличение количества их изоформ (рис.4). Так, с помощью электрофореза выявлено появление одной изоформы малатдегидрогеназы в печени крыс в условиях аллоксанового диабета.
Введение крысам водного экстракта оливы полностью снимает эффект изменения активности исследуемых ферментов в печени и почках. В частности, отсутствует изоцитратлиазная и малатсинтазная активность.
Кроме того, у крыс принимающих водный экстракт оливы европейской, не наблюдали индукцию дополнительных изоформ малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы под действием аллоксанового диабета. Следовательно, анализ полученных данных свидетельствует о протекторном действии экстракта оливы на функционирование глиоксилатного цикла в печени и почках крыс при введении им аллоксана.
СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ МАРКЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ ГЛИОКСИЛАТНОГО ЦИКЛА В ПЕЧЕНИ И ПОЧКАХ КРЫС Картина распределения маркерных ферментов в гепатоцитах крыс с аллоксановым диабетом, которым вводился водный экстракт оливы, приведена на рисунке 5. Данная группа животных не обладала МДГ и ЦС.
Рис. 5. Субклеточная локализация ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс в условиях совместного действия аллоксана и водного экстракта оливы.
1 - изоцитратлиаза;
2 - малатсинтаза;
3 - цитратсинтаза;
4 - малатдегидрогеназа;
5 - аконитатгидратаза изоцитратлиазной и малатсинтазной активностями, так как проявилось протекторное действие водного экстракта оливы. Уровень активности других ферментов совпадал со значениями активности энзимов в контрольном варианте. Похожая картина распределения ИЦЛ и МС по субклеточным фракциям наблюдается в тканях почек. Также как и в гепатоцитах максимальная активность ИЦЛ и МС обнаружена во фракции с плотностью градиента 1,25 г/см3 и максимальной активностью каталазы, т.е. во фракции микротелец. Однако, общая активность ключевых ферментов глиоксилатного цикла здесь в среднем в 1,3 - 1,5 раза ниже. При изучении субклеточной локализации остальных ферментов, обеспечивающих функционирование глиоксилатного цикла в гепатоцитах крыс, установлено, что увеличение активности МДГ, ЦС также связано с пероксисомальной фракцией.
Активность МДГ и ЦС увеличивалась во фракции митохондрий и в цитозоле в 1,5 раза, тогда как увеличение их активности в пероксисомальной фракции достигает 6 и 7 раз соответственно.
В отличие от пероксисомальной фракции печени в пероксисомальной фракции почек экспериментальных животных не наблюдается существенного увеличения активности.
ОЧИСТКА И СВОЙСТВА МАРКЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ПЕЧЕНИ И ПОЧЕК КРЫС ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ Очистка и свойства изоцитратлиазы из печени и почек крыс.
Последовательное применение нескольких стадий очистки позволило получить ферментный препарат ИЦЛ с удельной активностью 10,2 Е на мг белка, что соответствует очистке в 135 раз. Выход фермента составил 16%.
Электрофоретические исследования полученных ферментативных препаратов изоцитратлиазы из печени крыс показали наличие лишь одной белковой полосы (при окрашивании на белок кумасси бриллиантовым голубым и амидочерным 10 В) с относительной электрофоретической подвижностью 0,34. Следовательно, полученный нами препарат был электрофоретически гомогенен (рис. 6). Выход активности изоцитратлиазы и общего белка при фракционировании на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (рис.7).
Субъединичное строение изоцитратлиазы. Получение в высокоочищенном состоянии фермента позволило исследовать их физикохимические, каталитические и регуляторные свойства. Было показано, что изоцитратлиаза является изологическим тетрамером, при этом молекулярная масса одной субъединицы равняется - 45 КДа.
Каталитические свойства изоцитратлиазы. рН оптимум изоцитратлиазы из печени экспериментальных крыс при определении в мМ трис-НС1-буфере равен 7,5, в 50 мМ калий- фосфатном буфере - 7,4, а в 20 мМ трис-HEPES оптимум рН составил 7,5. Как видно из графика, представленного на рисунке 17, наибольшая активность ИЦЛ из печени проявляется в трис-НС1-буфере. После выяснения общего характера зависимости активности ИЦЛ из печени и почек от рН среды были определены рК ионогенных групп данных ферментов, участвующие в катализе лиазной реакции. рК ионогенных групп ИЦЛ из печени, определенные путем построения графиков зависимости lgV от рН, составляют 7,1 и 7,9. Сходные значения получены и для фермента, выделенного из почек крыс 7,1; 7,9. Таким образом, значения рК, полученные для ферментов из печени и почек, оказались схожими.
Рис. 6. Фотографии электрофореграмм изоцитратлиазы из печени (А) и почек ( Б) экспериментальных крыс при окрашивании универсальным красителем на кумасси Рис. 7. Выход активности изоцитратлиазы и общего белка при фракционировании на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой 1 - Выход белка;
2 - Выход активности.
Очистка и свойства малатсинтазы. Выделение МС из гепатоцитов крыс проводили по многостадийной схеме (табл.2). Вначале осуществляли фракционирование гомогената сульфатом аммония (0-30% насыщения). При этом большая часть МС выпадает в осадок. Отделение сульфата аммония проводили на колонке с сефадексом G-25. Наиболее активные фракции наносили на колонку с анионообменником ДЭАЭ-Fraktogel, уравновешенную 10 ммоль/л трис-HCl буфером, рН 7,4. Элюцию фермента проводили ступенчатым градиентом с шагом в 10 ммоль/л KCl, растворенным в ммоль/л трис-HCl буфере, рН 7,4. Элюируется МС с носителя при концентрации 70 - 80 ммоль/л KCl.
Таблица 2.
Очистка малатсинтазы из гепатоцитов крыс при экспериментальном диабете Стадии очистки Актив- Белок, Удельная Выход, Степень ность, мг активность, % очистки Е/мл Е/мг белка Гомогенат 11,987 197,583 0,059 100 0,214 5,819 0,0Фракционирова- ние сульфатом 7,412 44,929 0,167 65 2,аммония 0-30% 0,165 1,314 0,0насыщения Гель-фильтрация 7,115 31,677 0,226 59 3,на сефадексе 0,112 0,648 0,0G-Ионообменная хроматография на 1,121 0,369 3,015 9,1 ДЭАЭ-фрактогеле 0,039 0,074 0,1Гель- хроматография на 0,498 0,118 4,509 4,0 76,Toyopearl HW-65 0,011 0,003 0,0Каталитические свойства малатсинтазы. В наших исследованиях показано, что МС, выделенная из печени и почек крыс, характеризуется кинетикой Михаэлиса-Ментен. Определение Км проводили по графикам двойных обратных величин. При этом один из субстратов брался в избытке.
Влияние метаболитов на активность малатсинтазы из печени и почек крыс. Малат, который является продуктом данной реакции, ингибирует МС по конкурентному типу. Значение Кi для фермента из печени составило 4 мМ, для МС, выделенной из почек, 3,5 мМ. Кроме того обнаружено, что глюкозо-1-фосфат, фосфоенолпируват ингибирует данный фермент по неконкурентному типу. Кi по глюкозо-1-фосфату для МС из печени и почек - 2,2 мМ и 2,0 мМ, а по фосфоенолпирувату - 3 мМ и 2,6 мМ, соответственно. Все константы ингибирования определялись по методу Диксона (Диксон, Уэбб, 1982).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящем исследовании показаны сахароснижающие свойства листьев оливы европейской (Olea Europaea), что подтверждает гипогликемические характеристики этого известного растения. Аллоксан вызывает массивное уменьшение высвобождения инсулина в результате разрушения -клеток островков Лангерганса (Terazono et al., 1990).
Интересно отметить, что ВЭО оливы европейской (Europaea Olea) в дозе (0,30 г/кг) эффективно предотвращает повышение уровня глюкозы крови.
Поскольку аллоксан вызывает диабет, уничтожая -клетки, в настоящее время при исследовании оливы (ВЭО) было подтверждено наличие заметного антигипергликемического эффекта. Важно отметить значительное повышение уровня глюкозы крови у крыс с аллоксановым диабетом и снижение уровня глюкозы у крыс с аллоксановым диабетом, получавших ежедневно ВЭО. Наши данные подтверждают, что постоянное применение ВЭО в течение двух недель предотвращает повышение концентрации глюкозы в крови. Результаты настоящего исследования аналогичны данным, полученным в других лабораториях (Kumar, 1990; Nesseem et al., 2009), которые использовали водный экстракт полыни Herba Alba, Ziryphus spinaChristi, широко применяемый в народной медицине и установили значительное снижение уровня глюкозы у животных с сахарным диабетом.
Механизм гипогликемического действия до конца не ясен. Не исключено, что растение способно реверсировать метаболические особенности дефицита инсулина, снижать выброс глюкагона или увеличивать продукцию инсулина, стимулируя непосредственно гликолиз в периферических тканях, увеличивая утилизацию глюкозы из крови, или уменьшая всасывание глюкозы из желудочно-кишечного тракта.
Возможными действующими веществами являются содержащиеся в водном экстракте оливы олеуропеин, гидрокситирозол, олеуропеина агликон и тирозол. Наиболее активным компонентом листьев оливы считается экстракт олеуропеина, естественный продукт иридоидной группы.
Биохимический механизм подавления гипергликемии с помощью олеуропеина до сих пор не выяснен (Saenz et al., 1998; Visioli et al., 1998;
Corona et al., 2006; Manna et al., 2004).
В течение первой недели в группе животных с аллоксановым диабетом была выявлена дегрануляция -клеток, что может быть спровоцировано введением аллоксана и согласуется с более ранними исследованиями (Lengyel et al., 2007). Дегрануляция -клеток обусловлена, в основном, депонированием гликогена, а наличие гликогена связано с выраженностью и продолжительностью гипергликемии (Fraenkel et al., 2008).
Для выяснения механизма действия ВЭО на развитие экспериментального диабета у животных важное значение имеют полученные в работе результаты по трансформации функционирования маркерных и ключевых ферментов глиоксилатного цикла.
Экстракт оливы, введенный крысам, нивелировал изменение ферментативной активности, обуславливающей протекание катаболических и анаболических процессов. Наибольшее увеличение ферментативной активности обнаружено для маркерных энзимов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы. Причем, изменение профиля активности исследуемых ферментов коррелировало с длительностью экспозиции, наблюдавшейся после введения аллоксана в брюшную вену. Механизм протекторного действия ВЭО неизвестен. Хотя можно предположить влияние компонентов этого экстракта на трансформацию метаболических процессов в печени и почках экспериментальных крыс. По-прежнему считается, что ферменты глиоксилатного цикла могут индуцироваться в животном организме при интенсификации утилизации жиров (Лебкова, 2000;
Епринцев и др., 2004). В наших экспериментах был применен такой экстремальный фактор, как сахарный диабет. Ранее было установлено, что в этих условиях организм переключается на метаболизацию запасных жиров и, следовательно, интенсифицируются процессы глюконеогенеза. Нами было показано, что в условиях экспериментального диабета происходит индукция активности ИЦЛ и МС в печени и почках крыс. Данный факт получил подтверждение, т.к. аллоксан индуцировал активность маркерных ферментов глиоксилатного цикла. Однако, в гепатоцитах и клетках почек крыс с аллоксановым диабетом, которым вводили ВЭО оливы европейской, происходило снятие данного эффекта (не обнаружена активность малатсинтазы и изоцитратлиазы).
По нашему мнению, увеличение активности ферментов может быть связано с дополнительным синтезом ферментов и появлением их новых изоформ. У крыс в норме обнаружено два изофермента малатдегидрогеназы и три изоформы, обладающие аконитатгидратазной активностью.
Внутриклеточное распределение активности ИЦЛ и МС показало, что в пероксисомальной фракции гепатоцитов и клеток почек крыс с аллоксановым диабетом находится значительное количество их активности.
Причем установлено увеличение как общей, так и удельной активности. У группы крыс с аллоксановым диабетом при введении ВЭО распределение активности ключевых ферментов глиоксилатного цикла становилось аналогичным контрольным животным, что подтверждает протекторное действие водного экстракта оливы европейской на развитие биохимических изменений в экстремальных условиях (экспериментальный диабет). Очистка изоцитратлиазы и малатсинтазы подтвердила, что эти ферменты обнаруживаются только у крыс с индуцированным экспериментальным диабетом. Следует отметить, что важнейшее значение для получения гомогенных препаратов фермента сыграла ионообменная хроматография.
Анализ данных по ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭ-фрактогеле позволяет заключить, что в почках и печени индуцируется по одной изоформе изоцитратлиазы и малатсинтазы.
Проведенные исследования позволяют предположить следующий биохимический механизм приспособления крыс к экспериментальному диабету. В данных патологических условиях в организме резко возрастает липолиз в жировой ткани и выход свободных жирных кислот.
Периферические ткани интенсивно потребляют их как основной энергетический субстрат. В пероксисомах гепатоцитов и клеток крыс происходит -окисление жирных кислот с образованием ацетил-КоА, который может метаболизироваться с помощью глиоксилатного цикла, о чем свидетельствует индукция маркерных и ключевых ферментов этого метаболического пути. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что водный экстракт оливы обладает гипогликолитическим действием, проявляющимся в резком снижении концентрации глюкозы в крови крыс при аллоксановом диабете. Протекторное влияние водного экстракта оливы обнаружено для островков поджелудочной железы.
Выявлены биохимические аспекты действия ВЭО, проявляющиеся в изменении функционирования ферментов глиоксилатного цикла у крыс с экспериментальным диабетом.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что повышение концентрации глюкозы в крови, индуцируемое экзогенным аллоксаном, у крыс полностью снимается пероральным введением водного экстракта листьев оливы. При этом наблюдается значительное снижение уровня глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом до нормальных значений.
2. Гистологические исследования показали, что островки Лангерганса у крыс с гипергликемией были сильно изменены (их общий размер увеличен). В группе крыс с аллоксановым диабетом, получавших водный экстракт оливы, были выявлены островки нормальной формы, похожие на островки в контрольной группе. Можно предположить, что водный экстракт оливы способен прямо или косвенно влиять на секрецию инсулина и других гормонов, связанных с метаболизмом глюкозы.
3. Выявлено, что при экспериментальном диабете наблюдается активация большинства ферментов глиоксилатного цикла и цикла трикарбоновых кислот в печени и почках крыс. При этом наблюдается индукция маркерных ферментов глиоксилатного цикла изоцитратлиазы и малатсинтазы. Пероральное введение экстракта оливы крысам с экспериментальным диабетом снижает уровень активности исследуемых ферментов до нормальных значений.
4. Установлено, что увеличение активности малатдегидрогеназы, аконитатгидратазы и цитратсинтазы связано с появлением дополнительных изоформ. При этом применение водного экстракта оливы блокирует образование новых изоформ ферментов у крыс с экспериментальным диабетом.
5. Субклеточная локализация маркерных ферментов глиоксилатного цикла (изоцитратлиазы и малатсинтазы) в печени и почках крыс с аллоксановым диабетом связана, главным образом, с пероксисомальной фракцией. Использование водного экстракта оливы в качестве сахароснижающего вещества приводит к исчезновению изоцитратлиазной и малатсинтазной активности в пероксисомах гепатоцитов и клеток почек.
6. Получение в электрофоретически гомогенном состоянии изоцитратлиазы и малатсинтазы из печени и почек экспериментальных крыс (удельная активность составляла 11,9 Е/мг белка и 10 Е/мг белка для изоцитратлиазы и 4,5 Е/мг белка и 4,0 Е/мг белка для малатсинтазы) позволило исследовать их физико-химические и каталитические характеристики. Показано, что каталитическое действие маркерных ферментов подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен.
7. На гомогенных препаратах изоцитратлиазы из печени и почек крыс с аллоксановым диабетом установлено, что фермент состоит из четырех одинаковых субъединиц с Mr 46 кДа, то есть является гомотетрамером.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Аль Дайни Саба Х. Зависимость биохимического состава экстракта из листьев Olea Europaea от способа его получения / Аль Дайни Саба Х., А.Т. Епринцев, Н.А. Карпеченко // Организация и регуляция физиологобиохимических процессов. Воронежский государственный университет. - Воронеж. - 2010. - С.188-192.
2. Аль Дайни Саба Х. Регуляция аконитазной активности в гепатоцитах крыс в условиях экспериментального аллоксанового диабета / Аль Дайни Саба Х., Н.А. Карпеченко, В.Ю. Башмаков, А. Саба Х. // Материалы международной научно-практической конференции Высокие технологии.
Фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии. - Санкт-Петербург. - 2010, № 1, секция 2. - С.99-100.
3. Аль Дайни Саба Х. Изменение активности некоторых ферментов цикла Кребса в различных органах крыс с аллоксановым диабетом / Аль Дайни Саба Х., В.Ю. Башмаков, М.Ю. Сыромятников, А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. ВГУ. - 2011.
Ц Выпуск 11. С.134-137.
4. Аль Дайни Саба Хади Бенайед. Оценка влияния водного экстракта листьев оливы на концентрацию глюкозы и показатели липидного профиля в плазме крыс с аллоксановым диабетом / Аль Дайни Саба Хади Бенайед //Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи. - Воронеж. - 2011. - С.315-319.
5. Аль Дайни Саба Хади Бенайед. Гиполипидемические эффекты водного экстракта листьев оливы у крыс с аллоксан-индуцированным диабетом / Аль Дайни Саба Хади Бенайед, А.Т. Епринцев // Перспективы науки. - Тамбов. - 2011. - С.287-291 (ВАК).
6. Аль Дайни Саба Хади Бенайед. Анализ влияния витамина С, содержащегося в листьях Olea Europaea, на уровень основного метаболизма и липидный профиль у крыс с аллоксановым диабетом / Аль Дайни Саба Хади Бенайед, А.Т. Епринцев // Перспективы науки. - Тамбов. - 2012. - № 5[32]. - С.358-360.
7. Аль Дайни Саба Х. Протекторное действие экстракта из листьев Olea Europaea при индукции экспериментального диабета в гепатоцитах крыс / Аль Дайни Саба Х., М.Ю. Сыромятников, А.Т. Епринцев // Актуальные проблемы профессионального образования: подходы и перспективы. Материалы X-ой международной научно-практической конференции. Воронеж, Изд-во Научная книга. - 2012. - С.358.
8. Аль Дайни Саба Х. Трансформация функционирования ферментных комплексов при аллоксановом диабете / Аль Дайни Саба Х. // Актуальные проблемы профессионального образования: подходы и перспективы.
Материалы X-ой международной научно-практической конференции.
Воронеж, Изд-во Научная книга. - 2012. - С.359.
9. Аль Дайни Саба Хади. Индукция дополнительных изоформ малатдегидрогеназы и аконитатгидратазы в печени крыс в условиях аллоксанового диабета / Аль Дайни Саба Хади, М.Ю. Сыромятников, А.Т.
Епринцев // Вестник Воронежского госуниверситета. Серия Химия, биология, фармация. - 2012. - С.176-181.
10. Епринцев А.Т. Особенности функционирования аконитатгидратазной ферментной системы в органах крыс в условиях аллоксанового диабета / А.Т. Епринцев, Х. Аль Дайни Саба, М.Ю.
Сыромятников, М.А. Гати // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2012. - № 3. - С.38-44.
11. Аль Дайни Саба Х. Выделение и очистка малатсинтазы из гепатоцитов крыс при экспериментальном диабете / Х. Аль Дайни Саба, А.Т.
Епринцев //Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж. - ВГУ. - 2012. - С.159-165.
Работы №5, №6, №9 и №10 опубликованы в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.