Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ЕФРЕМЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ:
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ 03.00.02 - биофизика 03.00.23 - биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2009
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научный консультант: Варфоломеев Сергей Дмитриевич, доктор химических наук, профессор член- корреспондент РАН
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Ревин Виктор Васильевич доктор химических наук, профессор Розанцев Эдуард Григорьевич доктор технических наук, профессор Гернет Марина Васильевна
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита состоится 14 октября 2009 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ Автореферат разослан _________________ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук М.А. Смотряева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Биотехнологические процессы, реализуемые при использовании гетерогенных биокатализаторов (ГБК) в виде иммобилизованных клеток (ИмК) микроорганизмов, позволяют получать целевые продукты как результат сложных многостадийных биохимических превращений исходных субстратов. Иммобилизация клеток, означающая любое ограничение свободы их физического движения в пространстве, давно обсуждается как эффективный подход к решению задач по интенсификации и повышению экономической привлекательности современных биотехнологических процессов, основанных на применении различных микроорганизмов.
ГБК на основе ИмК обеспечивают возможность создания биотехнологических процессов, в которых клетки длительно используются с высоким выходом целевых продуктов, при этом техническое решение таких процессов существенно упрощено по сравнению с процессами на основе свободных (суспензионных) клеток. Вместе с тем, широкомасштабная реализация биотехнологических процессов, основанных на применении ИмК, сегодня сдерживается несколькими основными причинами: - существованием традиционных подходов к проведению процессов; - отсутствием адекватных и экспрессных методов контроля биокаталитической активности ИмК микроорганизмов в составе ГБК; - коротким перечнем ГБК, производство и применение которых можно масштабировать и осуществить в промышленных условиях; - недостатком научных фундаментальных знаний о биокаталитических системах на основе ИмК и кинетических закономерностях, лежащих в основе их функционирования. Объективность существования этих причин подтверждается тем огромным научным и практическим интересом, который существует уже несколько десятилетий по отношению к ГБК на основе ИмК микроорганизмов и находит свое выражение в числе публикаций, которое с каждым годом растет, и рост этот носит экспоненциальный характер.
Проведенный анализ динамики развития исследований ГБК, которые ведутся во всем мире, показал, что в начале 21 века произошло резкое увеличение числа научных изысканий в этой области, которые преимущественно оказались связанными с изучением ИмК бактерий, причем включенных в ГБК нативно, то есть самоиммобилизованных в природных условиях, как правило, в биопленки.
Известно, что иммобилизация клеток - это широко распространенный в природе феномен, который играет особую роль в стратегии выживания и сохранения максимального числа каталитических функций у клеток. Формирующиеся при этом ГБК в виде биопленок с включенными в них клетками оказались суперэффективными катализаторами различных негативных процессов (биокоррозия металлических конструкций, возникновение воспалительных процессов, деструкция пластиковых материалов и др.). Попытки исследователей биопленок применить к своим объектам информацию о закономерностях функционирования искусственно создаваемых в течение многих лет ГБК на основе ИмК микроорганизмов ярко высветили существующие пробелы в знаниях об этих биокаталитических системах, способах их контроля и управления ими.
Сложилась парадоксальная ситуация с ГБК на основе ИмК, когда понимание существующих преимуществ этих систем (высокая операционная стабильность, резистентность к воздействию негативных факторов, продолжительные временные периоды активного биокаталитического действия, высокие выходы целевых продуктов) перед свободными клетками, традиционно используемыми в биотехнологических процессах, стимулировало на протяжении многих лет развитие исследований, направленных на внедрение их в промышленность (конструирование биореакторов, организация непрерывных процессов и др.), на фоне недостатка фундаментальных знаний о причинах существования этих преимуществ, а также о биофизических (кинетических) принципах, лежащих в основе функционирования ГБК с такими преимуществами. В связи с этим, исследования, позволяющие сократить пробелы на информационном поле в отношении ГБК, основу которых составляют ИмК микроорганизмов, являются крайне актуальными и имеют большое научно-практическое значение.
Целью данной работы было решение комплекса научно-практических задач, связанных с разработкой подходов к получению высокоэффективных ГБК на основе ИмК микроорганизмов, способных обеспечить реализацию различных биотехнологических процессах, а также исследование их биохимических свойств и основных кинетических закономерностей функционирования.
В рамках этой работы были поставлены следующие основные задачи:
- разработать научно-методологический подход, базирующийся на использовании биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного аденозин-5'-трифосфата (АТФ) в ИмК различных микроорганизмов, к адекватной оценке эффективности их каталитического действия и установить возможность использования данного биофизического метода исследования на разных стадиях изучения (получение, применение и хранение) иммобилизованных ГБК в качестве одного из главных аналитических инструментов;
- исследовать возможность создания полифункциональных ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов, определить факторы, позволяющие направленно регулировать каталитические характеристики иммобилизованных ГБК в процессе их получения;
- провести критический сравнительный анализ биохимических и каталитических характеристик свободных и иммобилизованных клеток, позволяющий обобщить характерные особенности действия ГБК, и на основе результатов аналитического обобщения составить гипотезу о фундаментальных принципах, лежащих в основе закономерностей функционирования биокаталитических систем на основе ИмК;
- разработать новые ГБК на основе ИмК природных и рекомбинантных штаммов микроорганизмов с использованием криогеля поливинилового спирта (ПВС) в качестве носителя и исследовать возможность их эффективного применения в различных биотехнологических процессах с целью создания научнопрактических основ для реализации инновационных технических решений уже существующих процессов или организации принципиально новых биотехнологий.
Научная новизна работы состоит в том, что:
- широко апробирован биолюминесцентный метод анализа внутриклеточной концентрации АТФ для осуществления направленного получения высокоактивных ГБК на основе ИмК микроорганизмов, являющихся продуцентами различных целевых продуктов. Многочисленные экспериментальные данные в совокупности формируют научно-методологический подход к исследованию ГБК, базирующийся на выборе наиболее благоприятных условий подготовки клеток к иммобилизации и получения ГБК с использованием концентрации внутриклеточного АТФ в качестве критерия такого выбора. Данный биофизический подход позволяет выявить и обосновать основные закономерности изменения характеристик ИмК и может быть рекомендован для широкого применения в исследованиях ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов в качестве эффективного аналитического инструмента;
- впервые показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования влияния различных факторов на кинетику развития смешанных культур в составе ГБК; установлены кинетические характеристики и закономерности формирования коррозионно-опасных биопленок (КОБ) в проточных системах; разработан подход к оценке биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к различным КОБ на основе биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ;
установлено, что эффективность применения биоцидов с целью подавления развития КОБ зависит от их стадии роста;
- впервые установлено влияние условий формирования ГБК, а также условий и длительности их функционирования в периодическом режиме на прочностные характеристики ГБК, разработанных на основе ИмК мицелиальных грибов.
Показана возможность создания полифункциональных ГБК с использованием общих подходов, базирующихся на варьировании условий формирования иммобилизованного мицелия при исходной иммобилизации спор одной и той же культуры;
- показана возможность создания полифункциональных ГБК на основе клеток дрожжей. Установлено, что использование оптимизированного способа получения ГБК для клеток рода Saccharomyces, позволяет получить ИмК, применение которых возможно в разнообразных биотехнологических процессах, базирующихся на конверсии моносахаридов в этанол (шампанизация вина, получение образцов красного и белого вина, повышение качества некондиционной винной продукции, получение этанола из различных отходов сельского хозяйства и промышленности);
- впервые установлена возможность трансформации клеток в иммобилизованном состоянии плазмидной ДНК. Показано, что компетентные ИмК могут быть использованы для получения полифункциональных ГБК путем их трансформации новыми генетическими конструкциями;
- впервые выдвинута гипотеза о том, что в основе стабильного и длительного функционирования клеток в составе ГБК, разрабатываемых на основе ИмК, лежит система глобальной регуляции экспрессии генов, чувствительная к концентрации клеток. Иммобилизация клеток в высоких концентрациях активирует проявления генетически запрограммированного ответа клеток, приводящего к изменению их генетического и биохимического статуса. Научная гипотеза, основана на экспериментальных данных и расширяет представления о фундаментальных принципах, лежащих в основе закономерностей функционирования биокаталитических систем на основе ИмК, а также о подходах, которые могут быть применены на стадии получения ГБК и регулирования эффективности их действия в биотехнологических процессах;
- исследованы каталитические и физико-химические свойства новых белков - генетически модифицированных аналогов органофосфатгидролазы (ОРН).
Впервые показана высокая эффективность разложения фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ), катализируемая ферментом His6-OPH. Разработаны новые ГБК на основе ИмК, содержащих ферменты с ОРН-активностью, и показана высокая эффективность их каталитического действия в реакциях разложения фосфорорганических соединений;
- разработано 25 новых ГБК на основе ИмК микроорганизмов для разнообразных процессов. Новизна и оригинальность этих разработок подтверждена 14 Патентами РФ и 2 Авторскими свидетельствами СССР на изобретения. Показано превосходство данных ГБК по своим характеристикам над известными аналогами или установлено, что аналоги отсутствуют.
Практическая значимость результатов работы:
- установлены удельные концентрации внутриклеточного АТФ, характерные для большого числа клеток микроорганизмов, а также пределы варьирования этого параметра среди различных культур. Разработан ряд методик, адаптирующих применение биолюминесцентного метода к анализу ИмК разных микроорганизмов, показана адекватность оценки каталитических характеристик ГБК на основе результатов, получаемых при использовании этого биофизического метода, представлена корреляции полученных значений концентраций внутриклеточного АТФ в ИмК с другими их биохимическими характеристиками. Разработан дифференцированный метод анализа концентрации ИмК в составе ГБК, полученных на основе смешанных культур;
- разработан общий подход к получению ГБК на основе клеток мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта;
показана возможность получения различных гидролитических ферментов с использованием разработанных ГБК в течение длительного времени, а также продемонстрирована эффективность применения таких ГБК для снижения уровня ХПК сточных вод предприятий пищевой промышленности при использовании их в качестве сред для культивирования ИмК;
- показано, что разработанный ГБК на основе клеток дрожжей рода Saccharomyces перспективен как объективная альтернатива свободным клеткам, традиционно используемым в промышленных условиях, и может служить основой для разработки новых биотехнологий, способных заменить существующие в области этанольного конверсии сахаров;
- показана возможность получения иммобилизованных компетентных клеток с пролонгированным сроком хранения и создания на их основе ГБК с новыми свойствами, в частности, с ОРН-активностью. На основе полученных результатов обоснованы рекомендации о проведении процессов c ГБК на основе ИмК в асептических условиях с целью обеспечения генетической неизменности используемых штаммов-продуцентов;
- впервые определены минимальные ингибирующие концентрации (МИК) для широкого ряда ингибиторов коррозии (ИК), обладающих биоцидным действием в отношении биопленок разного микробного состава. Полученные данные могут быть рекомендованы к использованию в антикоррозионных программах, составляющих основу мониторинга и применения ИК и биоцидов на практике;
- созданы генетические конструкции и рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие цитоплазматический биосинтез ОРН и ее генетически модифицированных аналогов, оптимизированы условия их получения в растворимой и каталитически активной форме. Показана целесообразность их использования в иммобилизованном виде для биосенсорного определения фосфорорганических нейротоксинов или для разложения фосфорорганических пестицидов.
Практическое применение результатов работы, в том числе разработанных ГБК и процессов с их участием, может быть реализовано в биотехнологической (производство гидролитических ферментов, молочной кислоты), нефтяной (для устранения коррозионных ситуаций, развитие которых провоцируют КОБ), химической и биотопливной промышленности (получение этанола), в разных отраслях пищевой промышленности с целью получения различных целевых продуктов (пробиотических продуктов питания, продукции винодельческой промышленности, глюкозо-фруктозных сиропов), при решении различных экологических задач в сельском хозяйстве, на предприятиях оборонного комплекса МО РФ и пищевой промышленности (очистка сточных вод, разложение пестицидов, утилизация целлюлозо- и лактозосодержащих отходов), для решения вопросов, связанных с выполнением международных обязательств РФ по уничтожению химического оружия (биоразложение реакционных масс различного химического состава, полученных после химической ликвидации ФОВ).
Основные положения, выносимые на зищиту - общий научно-методологический подход, основанный на оценке энергетического статуса ИмК по концентрации внутриклеточного АТФ, определяемой биолюминесцентным методом, может быть применен к получению новых ГБК на основе ИмК разных микроорганизмов, установлению оптимальных условий их функционирования и хранения, а также к мониторингу каталитической эффективности их действия в различных биотехнологических процессах;
- биолюминесцентный метод определения АТФ может быть эффективно использован как аналитический инструмент при создании ГБК на основе иммобилизованных смешанных культур и исследовании кинетики их функционирования;
- на основе общих принципов, но индивидуальных подходов к получению ГБК с использованием ИмК разных микроорганизмов (дрожжей, мицелиальных грибов, бактерий), могут быть созданы полифункциональные биокатализаторы;
- целесообразно конструирование и использование рекомбинантных штаммов бактерий для получения ГБК на основе ИмК с моноферментной целевой активностью;
- в основе стабильного и длительного функционирования клеток в составе искусственно полученных ГБК лежит система регуляции экспрессии генов, чувствительная к концентрации клеток;
- разработанные образцы ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов могут найти высокоэффективное применение в качестве инновационных элементов в уже существующих процессах, а также могут быть использованы при реализации новых биотехнологических процессов.
Связь работы с крупными научными программами и проектами.
Представленные результаты были получены в ходе исследований, проводившихся в 1987-2009 гг. в рамках следующих научных программ и проектов, участником и руководителем которых была соискатель: ФЦНТП УИсследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначенияФ направление Инженерная энзимология (1994-1997, 1998-1999); ФЦНТП УИсследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, направление Технологии живых систем (2002-2004), НАТО грант LG 941411 УРазработка новых биокатализаторов на основе криоиммобилизованной фосфотриэстеразыФ (1994-1995); НАТО грант LG 96-54378 Разработка микробного консорциума для полной минерализации фосфорорганических соединений (19961997); Грант CRDF RP-359 Биотехнологические подходы к детекции и детоксикации нейротоксичных пестицидов сельскохозяйственного и коммунального применения (1997-1998); Грант CRDF RP1-359 Y/S Биотехнологические системы на основе нативных и иммобилизованных клеток для детоксикации нейротоксичных соединений (1998-1999); Грант IPP 325732-AG2 УРазработка дискриминационной биосенсорной системы для анализа фосфорорганических соединений и карбаматовФ в рамках Международного проекта 43.073.1.1.2505 Предотвращение угрозы распространения оружия массового поражения (2000-2002); Госконтракт № 43.073.1.1.2505 с Министерством науки и технологии РФ Биокаталитические технологии для химического синтеза, аналитических систем и медицины (2002-2004); НАТО грант LST.CLG.9778УКонверсия отходов пищевой промышленности в ценные химические продуктыФ (2001); НАТО грант LST.CLG.979437 УПостгеномный структурный анализ фторсодержащих белковФ(2001-2003); Грант IUPAC 2001-005-1-300 УПостгеномная химияФ(2001-2003); ФЦНТП УИсследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, направление №5 Технологии живых систем, проект Биокаталитические технологии (2000-2001); Госконтракты с Федеральным управлением по безопасному хранению и уничтожению химического оружия МО РФ Обоснование способов биотехнологической очистки продуктов детоксикации ФОВ при различных технологиях уничтожения (утилизации), шифр Локус (1998-1999); Исследование возможности использования метода биодеградации для переработки реакционных масс, образующихся при уничтожении отравляющих веществ, шифр Богема (2004-2006); Оптимизация технологических параметров процесса переработки реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ, методом биодеградации, шифр Биозащита (2007-2008); Проект НШ-1776.2003.Химическая энзимология (Ведущая научная школа) (2003-2005); Грант РФФИ 0204-48981 Исследование факторов, определяющих каталитическую активность и конформационную стабильность органофосфатгидролазы, методами белковой инженерии (2002-2004), Грант МНТЦ 2245р УИсследование, диагностика и защита от микробиологически индуцированной коррозии в российской нефтяной и газовой промышленности (2002-2005); Госконтракты с Федеральным агентством по науке и инновациям - №02.447.11.3001 (ЖС-22.4/005) Ферменты и биокаталитические системы для ремедиации окружающей среды (2005-2006) и № 02.434.11.30(ЖС-12.4/005) Биосинтез мономеров для полимерной химии (2005-2006); гранты РФФИ - 05-04-0818-офи-а Новые высокоэффективные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов, продуцирующих секретируемые ферменты (2005-2007) и 08-04-12050-офи Новый тип высокоэффективных биокатализаторов для обнаружения и обезвреживания фосфорорганических токсикантов (2008-2009); НАТО грант CBP.NRCLG 981752 Химерные белки для разложения фосфорорганических нейротоксинов (2005-2007); Проекты программ Фундаментальных исследований Президиума РАН Фундаментальные проблемы энергетики (2006-2007) и Химические аспекты энергетики(2009-2010).
Апробация работы. Результаты диссертации представлялись и обсуждались на Международных конгрессах по биосенсорам (Новый Орлеан, США, 1994; Сан Диего, США, 2000), по биокаталитической деградации химических боевых материалов (Эджевуд, США, 1995); по биокатализу (Пущино, 1998; Москва, 2000;
2002, Москва-Санкт-Петербург, 2007); VI Европейском конгрессе по биотехнологии (Фиренце, Италия, 1993), Международных конференциях НАТО Химические и биологические технологии для определения, деструкции и деконтаминации боевых отравляющих веществ (Москва, 1996), Ферменты в гетероатомной химии: зеленое решение химических проблем (Наймеген, Нидерланды, 1999); УЗоль-гелевые материалы для контроля загрязнений, очистки воды и ремедиации почв (Киев, Украина, 2007); 1ом, 2ом, 3ем, 4ом, 5ом Московских Международных конгрессах УБиотехнология - состояние и перспективы развитияФ (Москва, 2002, 2003, 2005, 2007, 2009); V, VI, IX, X и XI Международных симпозиумах по биоинкапсулированию (Потсдам, Германия, 1996; Барселона, Испания, 1997; Варшава, Польша, 2001; Витория, Испания, 2004; Кингстон, Канада, 2005; Лозанна, Швейцария, 2006; Вена, Австрия, 2007); Международной конференции Применение ферментов для химической и биологической защиты (Майами, США, 2001); Международной конференции Энзимология, молекулярная биология и биогеохимия термофилов (Петропавловск-Камчатский, 2000);
Международном симпозиуме по научным разработкам в области выполнения конвенции по химическому оружию (Берген, Норвегия, 2002); на 7ой, 8ой, 9ой, 10ой, 11ой и 12ой Пущинских конференциях Биология - наука ХХI века (2003, 2004;
2005, 2006, 2007, 2008); Международной конференции От фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии (Тверь, 2002); 7ом Международном симпозиуме по биоорганической химии (Торонто, Канада, 2002); Международной конференции Биотехнология микробов (Москва, 2004), Международной конференции Прогресс в биотехнологии и нейробиологии (Хургада, Египет, 2004); XVIII Международном химическом конгрессе (Карс, Турция, 2004), Международной конференции Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды (Саратов, 2005);
6ой Международной конференции ICEP по загрязнению окружающей среды (Пермь-Казань, 2005), 6ой Бакинской Международной Мамедалиевской конференции по Нефтехимии (Баку, Азербайджан, 2005); Международном конгрессе по биопроцессам в пищевой промышленности (Патрас, Греция, 2006), 1ом Международном конгрессе Экологический биокатализ: от ремедиации с ферментами к новым зеленым процессам (Кордоба, Испания, 2006), ХVIII Менделеевском конгрессе по общей и прикладной химии (Москва, 2007), Международном конгрессе Молекулярные и наноразмерные системы для конверсии энергии (Москва, 2007), 1ой и 2ой Международных конференциях УНовые технологии в экспериментальной биологии и медицинеФ (Ростов-на-Дону, 2007, 2008) и др..
ичный вклад автора. Автору принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач проведенных исследований, планирование экспериментов, непосредственное участие в них или руководство ими, анализ и обобщение результатов, подготовка научных публикаций и патентов.
Публикации. Материалы диссертации отражены в 225 печатных работах, в том числе в 9 обзорах, 44 экспериментальных статьях, опубликованных в международных и российских изданиях, из них 38 - в журналах, включенных в список ВАК, а также в 14 Патентах РФ и 2 Авторских свидетельствах СССР на изобретения.
Структура работы и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 425 страницах, состоит из введения, шести глав, обобщающего заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 606 ссылок, и приложения в виде списка публикаций автора. Работа содержит 118 таблиц и 136 рисунков.
В главе 1 изложена обобщающая информация о методах, используемых при исследовании ГБК на основе ИмК микроорганизмов, и показана эффективность применения биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ на разных стадиях работы с ГБК. В главе продемонстрированы подходы к получению полифункциональных ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов (дрожжей, бактерий, мицелиальных грибов), обсуждается научная новизна и практическая значимость полученных результатов.
В главе 3 дан анализ причин существующих различий в характеристиках свободных клеток и ИмК микроорганизмов. Глава 4 посвящена ГБК на основе ИмК с моноферментной активностью, подходам к их получению и анализу их каталитических характеристик. В главе 5 представлены разработанные оригинальные ГБК и процессы на их основе. В главе 6 суммированы основные экспериментальные методы, использованные в работе.
ГЛАВА I. ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ АТФ - КЛЮЧЕВОЙ ПАРАМЕТР ПРИ РАЗРАБОТКЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИИ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК Использование экспрессных методов, позволяющих в реальном времени проводить анализ состояния ИмК, является ключевым моментом при разработке любых новых ГБК и необходимым условием для обеспечения их высоко эффективного применения. Основным требованием к анализу ГБК на основе ИмК является его проведение без обработки объектов исследования, способной искажать получаемый результат. Этому требованию отвечает биофизический метод определения внутриклеточной концентрации АТФ, основанный на регистрации интенсивности биолюминесценции, возникающей в результате высокоспецифичной ферментативной АТФ-зависимой реакции окисления люциферина люциферазой светляков (ЕС 1.13.12.5). При образовании каждой молекулы продукта этой реакции выделяется один квант света.
Известно, что АТФ присутствует только в живых клетках и является основным связующим звеном между процессами, протекающими с потреблением энергии, и процессами, сопровождающимися выделением и накоплением энергии. Изменение интегральной концентрации внутриклеточного АТФ в биомассе клеток, например, в 1 мг, относительно установленного контрольного значения позволяет судить об их жизнеспособности и метаболической активности. В этой связи было проведено всестороннее изучение возможности использования биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ на разных стадиях работы с ГБК на основе ИмК.
Для выявления и лучшего понимания существующих общих закономерностей в получении ГБК с определенными характеристиками и закономерностей в функционировании ИмК различных микроорганизмов в работе в большинстве случаев использовался один и тот же способ и носитель для иммобилизации клеток - включение их в гелевую матрицу, в качестве которой применялся макропористый криогель поливинилового спирта (ПВС) [Лозинский В.И., 1998]. Иммобилизация клеток бактерий и дрожжей в этот носитель происходила в результате приготовления их суспензии в концентрированном растворе полимера, последующего ее замораживания, выдерживания при температуре замораживания в течение времени, необходимого для формирования прочной матрицы носителя, и последующего размораживания системы.
Первоначально для различных микроорганизмов (всего 45 разных культур бактерий, дрожжей, микроскопических грибов и микроводорослей), являвшихся объектами исследования в этой работе, были установлены (впервые для подавляющего большинства культур) удельные концентрации внутриклеточного АТФ в тех условиях и средах, в которых далее предполагалось использовать ИмК.
Для разных микроорганизмов были оптимизированы условия (агенты, экстрагирующие АТФ из клеток, их соотношение с биомассой клеток, длительность обработки клеток экстрагирующими агентами, температура процесса), обеспечивающие максимальную экстракцию АТФ из анализируемых образцов. Результаты, полученные при работе со свободными клетками, послужили основой для разработки методик, предназначенных для анализа клеток, искусственно иммобилизованных в ГБК и самоиммобилизующихся в биопленки.
С использованием биолюминесцентного метода определения АТФ было установлено влияние ряда факторов на эффективность действия получаемых ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов (бактерий и дрожжей), при этом для подтверждения значимости выводов, сделанных на основе АТФ-метрии, были проанализированы изменения других биохимических параметров клеток (состава жирных кислот в липидах клеток, концентрации трегалозы, ферментативных активностей клеток и др.). Согласно полученным данным, следующие факторы могут служить инструментом для направленного регулирования характеристик разрабатываемых ГБК на основе ИмК:
- условия подготовки клеток к иммобилизации (фаза роста клеток, условия культивирования - состав и рН среды, температура). На примере 5-ти штаммов дрожжей Saccharomyces сerevisiae показано, что разница в выборе клеток для иммобилизации, взятых в конце логарифмической фазы роста (максимальная удельная концентрация АТФ в клетках) и в начале стационарной фазы роста (максимум накопления биомассы клеток), обеспечивает для разных штаммов 2545% разницу в функциональных характеристиках получаемых ГБК (табл.1).
На примере разных бактериальных культур (Zymomonas mobilis-113 и Escherichia coli DH5) также было показано, что определенная фаза роста клеток с характерным для этой фазы энергетическим статусом, определяемым концентрацией внутриклеточного АТФ, является важнейшим критерием для их отбора с целью иммобилизации и предопределяет свойства получаемых ГБК.
Таблица 1. Результаты анализа кинетики накопления основных метаболитов в реакторах с клетками дрожжей S. сerevisiae, иммобилизованными в криогель ПВС, в процессе шампанизации вина (для получения ГБК исходно взяты клетки с разной концентрацией внутриклеточного АТФ).
ГБК, Удельная Уровень Выход этонола Начальная Начальная полученный на концентрация накопления от теоретически скорость скорость основе клеток, АТФ биомассы возможного накопления накопления выращенных в свободных свободных после 28 сут. этанола при СО2 в в течение клетках перед их клеток в среде ведения процесса использовании реакторе с указанного иммобилизацией, в момент их с использованием ГБК, ГБК времени моль/мг клеток использования, ГБК, % г/л/сут кПа/сут г/л Cremanti, 19 ч 8,25 х 10-10 4,0 98,2 1,26 45,Cremanti, 22 ч 4,35 х 10-10 4,6 97,2 0,87 30,Fermivin PDM, 21 ч 7,40 х 10-10 5,0 98,4 2,30 70,Fermivin PDM, 24 ч 3,80 х 10-10 5,5 97,3 1,90 55,- условия проведения самой иммобилизации (температуры и длительности процесса, концентрации полимера, формирующего носитель, концентрации клеток, вводимой в носитель и др.). Так, на примере клеток Zymomonas mobilis-1 продемонстрировано влияние скорости замораживания суспензии клеток в растворе ПВС на метаболические характеристики получаемого ГБК в процессах получения этанола. Для клеток E. coli DH5, содержащих фермент органофосфатгидролазу (ОРН) в периплазме и иммобилизованных в криогель ПВС, установлено существенное влияние скорости размораживания клеток после их иммобилизации на уровень их жизнеспособности и целевую ферментативную активность (табл.2).
На примере клеток пурпурных фотобактерий Rhodobacter capsulatus В10, иммобилизованных в криогель ПВС и продуцирующих водород, было показано влияние исходной концентрации биомассы клеток, вводимой в состав ГБК, на его функциональные характеристики (табл.3). Оптимальной оказалась 4,75% (масс.) концентрация клеток в гранулах ГБК, которая обеспечивала максимальную скорость накопления целевого продукта (3870 мл Н2/ч/л матрицы) и длительность функционирования ГБК (до 550 сут), существенно превосходящие те же характеристики известных аналогов. Новизна и высокие показатели функциональной активности этого ГБК послужили основанием для получения Патента РФ на изобретение № 2323975 (2008).
Таблица 2. Влияние скорости размораживания гранул ГБК с клетками E. coli DH5, содержащими фермент органофосфатгидролазу (ОРН) в периплазме и иммобилизованными в криогель ПВС, на их каталитическую активность и концентрацию внутриклеточного АТФ.
Скорость размораживания гранул ГБК с Исследуемые образцы ГБК с ИмК иммобилизованными клетками, оС/мин после размораживания гранул 0,20 0,025 0,20 0,0от -20оС до +4оС ОРН-активность, АТФ, ед/г клеток х10-10 моль/мг клеток - сразу после размораживания гранул 4,0 0,4 8,6 1,2 0,13 0,03 0,67 0,- через 24 ч в питательной среде после размораживания гранул 3,4 0,3 25,6 3,1 0,18 0,02 1,41 0,Таблица 3. Показатели, характеризующие процесс продуцирования водорода клетками Rhodobacter capsulatus В10, иммобилизованными в криогель ПВС, в периодических условиях.
Концентрация Максимальная Максимальная [АТФ], иммобилизо- продуктивность удельная х10-11 моль/мг ГБК ванных клеток в процесса, продуктивность сразу после после 450 ч гранулах ГБК мл Н2/ч/л среды ГБК, приготовления использования ГБК масс.% мл Н2/ч/л матрицы* образца ГБК для получения Н1,25 0,6 1765 0,18 0,01 0,25 0,2,50 1,5 2205 0,46 0,03 0,53 0,4,75 5,1 3870 0,95 0,05 1,63 0,10,00 5,5 3900 1,15 0,08 1,77 0,*Объем носителя с ИмК, используемый для получения водорода.
Впервые была показана возможность использования биолюминесцентной АТФ-метрии для мониторинга состояния ИмК различных микроорганизмов в составе ГБК при их длительном хранении, а также возможность использования данного метода для выбора наиболее благоприятных условий хранения ИмКЦ температуры, среды, исходной концентрации клеток, иммобилизованных в носителе и др.. При этом впервые было проведено длительное хранение (24 месяца) при Ц180С различных микроорганизмов (всего - 6 культур грамположительных и грамотрицательных бактерий, природных и рекомбинантных клеток, дрожжей и мицелиальных грибов), иммобилизованных в криогель ПВС. Исследовалось влияние условий хранения на выживаемость, репродуктивную способность и функциональную активность ИмК.
Мониторинг концентрации АТФ в клетках различных микроорганизмов, хранившихся в иммобилизованном и замороженном состоянии, позволил установить наличие слабых изменений в величине исследуемого параметра по сравнению с исходным уровнем во всех анализируемых образцах (рис.1). Был установлен высокий уровень метаболической активности у суспензионных клеток (Streptomyces anulatus, Rhyzopus oryzae, Escherichia coli, продуцирующих, соответственно, антибиотик аурантина, L(+)-молочную кислоту и рекомбинантный фермент ОРН), нарастающих в среде при использовании ИмК разного срока хранения в качестве инокулята. Для ИмК дрожжей впервые было установлено появление аскоспор в составе ГБК при его длительном хранении. В целом для большинства культур исследования показали возможность длительного хранения ГБК (как минимум 2 года) перед их использованием в биотехнологических процессах. Эти результаты могут составить научный и практический интерес для держателей коллекций микроорганизмов, сохраняющих длительное время различные культуры с помощью различных методов.
Рис.1. Изменение концентрации внутриклеточного АТФ в гранулах криогеля поливинилового спирта с иммобилизованными клетками различных микроорганизмов исходно составлявших 10,4% масс. (светлые символы) и 30% масс. (черные символы) в составе ГБК, от продолжительности их хранения в замороженном состоянии:
Rhodococcus erhytropolis (, ), Streptomyces anulatus (, ), Pseudomonas putida (, ).
С использованием биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ были установлены наиболее благоприятные условия применения ряда разработанных ГБК. Были установлены условия эффективного использования ГБК на основе криогеля ПВС и термофильных клеток бактерии Clostridium thermocellum, осуществляющих секрецию эндо-1,4--глюканазы (EC 3.2.1.4) при 60оС, с целью длительного (в течение 6 месяцев) получения фермента в периодических условиях (рабочий период -3-3,5 сут.). При этом было показано, что периодическое снижение концентрации АТФ в ИмК четко скоррелировано с процессом синтеза секретируемого целевого фермента.
Аналогичные тенденции в изменении концентрации внутриклеточного АТФ были установлены для ИмК E.coli, в которых также наблюдалось снижение АТФ на стадии интенсивного синтеза внутриклеточного фермента ОРН. Эти результаты позволили заключить, что снижение концентрации АТФ в 3-6 раз в ИмК бактерий, может быть маркером активных биосинтетических процессов.
Метод АТФ-метрии был успешно применен при исследовании возможности длительного использования ГБК на основе клеток бактерии Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidans (SH91), иммобилизованных в криогель ПВС и способных утилизировать в качестве единственного источника углерода тиодигликоль (ТДГ), являющийся продуктом разложения иприта (отравляющего вещества кожно нарывного действия). Было установлено, что применение ГБК на основе ИмК позволяет увеличить скорость разложения ТДГ в 5,5 раз по сравнению со свободными клетками и ввести в среду для биодеградации концентрацию ТДГ в 1,раза превышающую ту, которая может быть использована для обработки суспензионной культурой (рис.2).
Разработанный ГБК непрерывно использовался в реакторе периодического действия в течение 276 ч для разложения максимальной концентрации ТДГ (145 мМ) которая может присутствовать в реакционных массах, получаемых после химического уничтожения иприта в щелочных средах. При этом было показано, что адекватная оценка метаболической активности ИмК, а также прогнозирование их потенциальных возможностей при Рис.2. Зависимость скорости деградации тиодигликоля от его исходной концентрации в длительном использовании в среде. Концентрация гранул ГБК с целевом процессе могут быть иммобилизованными клетками в среде - 200 г/л.
сделаны на основе результатов биолюминесцентного анализа концентрации внутриклеточного АТФ.
При изучении многокомпонентных ГБК, содержащих одновременно ИмК различных микроорганизмов, которые целенаправленно создаются и используются в биотехнологических процессах или самопроизвольно формируются в природных условиях, был разработан способ дифференцированного определения концентраций разных бактерий в смешанных культурах, находящихся в составе ГБК на основе ИмК, с использованием преимуществ биолюминесцентного метода определения АТФ. Способ реализовался за счет применения комбинированного подхода, сочетающего в себе микробиологические приемы работы с клетками микроорганизмов, основанные на использовании селективных питательных сред для культивирования клеток, биолюминесцентный метод анализа концентрации внутриклеточного АТФ, позволяющий достоверно оценить концентрации клеток в образцах и получать информацию о кинетике роста клеток, а также стандартные математические методы обработки данных по кинетике роста микроорганизмов, позволяющие установить начальную концентрацию клеток в образце (рис.3).
Применение селективных сред, предназначенных для культивирования определенных клеток, позволяло осуществлять их дифференциацию в процессе культивирования образца смешанных культур. При этом культивирование ИмК, входящих в состав ГБК, проводилось в условиях, оптимальных для клеток, принадлежащих к дифференцируемой группе бактерий. Культивирование ИмК осуществлялось до достижения свободными клетками, являющимися потомственными генерациями ИмК, конца логарифмической фазы роста. Таким образом, ИмК, введенные в среду культивирования, служили инокулятом. В процессе роста свободных клеток производился отбор проб культуральной жидкости, начиная с момента посева анализируемых проб, в которых определялась концентрация АТФ. Применение АТФ-метрии для определения концентрации клеток и построения кривых роста обеспечило оперативность и точность определения, а также сократило время, необходимое для количественного анализа.
Участки кривых роста, соответствующие экспоненциальной фазе роста свободных клеток, линеаризовались в полулогарифмических координатах с целью определения начальных концентраций клеток в образцах смешанных культур. В качестве контроля в этих исследованиях использовался классический микробиологический метод. Результаты двух методов характеризовались высокой степенью тождественности (табл.4). Такой комбинированный подход, который был предложен и впервые применен в этой работе для дифференцированного определения численности бактериальных клеток в составе смешанных культур, присутствующих в составах различных ГБК на основе ИмК микроорганизмов, является оригинальным, и это было подтверждено Патентом РФ №2263148 (2005).
Исследование I II III кинетики роста ключевой культуры в Селективная каждой селективной среда среде Смешанные Селективная культуры среда микроорганизмов ЕЕ.
ln[АТФ0] Селективная Время среда n Время Рис.3. Принципиальная схема дифференцированного анализа концентрации клеток отдельных культур в составе ГБК на основе иммобилизованных смешанных культур: I - использование образцов иммобилизованных смешанных культур в качестве инокулята для накопления биомассы свободных клеток в селективных средах (число n сред соответствует числу определяемых культур в смеси); II- исследование кинетики роста свободных клеток в селективных средах биолюминесцентным методом; III - математическая обработка кинетических данных и определение исходной концентрации клеток каждой культуры через известную удельную концентрацию АТФ, характерную для каждой культуры в применяемых условиях культивирования.
Показана эффективность применение биолюминесцентного метода определения АТФ для разработки и анализа биокаталитических систем, искусственно создаваемых на основе ИмК смешанных бактериальных культур. Так с использованием дифференцированного метода определения концентрации клеток отдельных культур в составе ГБК на основе смешанных культур был разработан способ получения пробиотических желированных мясных продуктов, содержащих ИмК пробиотиков, в основу которого была положена технология производства мясных изделий в желе (ТУ 9213-049-13160604-00).
Способ введения молочно-кислых бактерий (МКБ) в мясные продукты предполагал использование природного полимера (желатин, агар), образующего термотропный гель, который, с одной стороны, служил желирующей основой для функциональных мясных продуктов, а с другой стороны - выполнял функцию носителя для МКБ, соиммобилизация которых осуществлялась включением клеток смешанных культур (Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus) в гелевую матрицу. Биолюминесцентный метод определения концентрации внутриклеточного АТФ был использован для оценки влияния условий иммобилизации смешанной культуры на остаточную концентрацию МКБ в составе получаемых ГБК, которая составила не менее 107 кл/г (табл. 4) и не изменялась после их хранении при 8оС в течение 120 ч, что в 2,5 раза превышало требуемый ln[ATФ] [АТФ] срок хранения. Результаты исследований были отражены в Патенте РФ № 22292(2004), согласно которому ГБК, разработанные в виде желированных пробиотических продуктов, предназначены для профилактического питания в той группе населения, которая характеризуется наличием лактазного дефицита.
Таблица 4. Начальные концентрации различных клеток, присутствовавших в составе биопленок, полученных на основе самоиммобилизованных клеток смешанных культур, а также в составе ГБК с ИмК смешанных культур, определение которых проводилось микробиологическим и биолюминесцентным (дифференцированным) методами анализа.
Начальная концентрация клеток, кл/см№ ГБК на основе ИмК смешанных культур Микробиологи- Биолюминесцентческий метод ный метод 1 Коррозионно-опасные биопленки на основе смешанных культур:
Pseudomonas putida (1,60,1)х106 (1,40,1)x1Desulfovibrio vulgaris 106 (7,20,3)x1Pseudomonas putida (4,30,2)х106 (5,50,4)x1Desulfovibrio vulgaris 105 (4,20,1)x1Pseudomonas putida (1,30,1)х102 (1,90,2)x1Desulfovibrio vulgaris 104 (5,40,2)x1Pseudomonas putida (6,90,5)х103 (7,50,3)x1Desulfovibrio vulgaris 107 (2,20,2)x1Начальная концентрация клеток, кл/г 2 ГБК для биодеградации фософорорганических пестицидов Escherichia coli (3,30,7)x103 (4,60,4)x1Pseudomonas putida (4,40,8)x106 (5,20,5)x13 ГБК для введения в пищевые функциональные продукты Lactobacillus acidophilus (1,50,2)x107 (2,50,3)x1Streptococcus thermophilus (2,90,6)x107 (4,00,3)x1Показана высокая эффективность использования биолюминесцентной АТФ-метрии в исследованиях природных биокаталитических систем на основе самоиммобилизующихся клеток в виде биопленок. Для исследования кинетики роста коррозионно-опасные биопленок (КОБ) впервые в рамках данной работы использовался биолюминесцентный метод определения концентрации АТФ, и проводился дифференцированный анализ микробного состава биопленок.
Определено, что в формировании КОБ основную роль играют сульфатвосстанавливающие бактрии (СВБ). На всех стадиях роста состав КОБ имеет гетерогенный микробный состав, а присутствие аэробных гетеротрофных бактерий (ГБ) существенно ускоряет формирование КОБ.
Помимо влияния микробного состава планктонной смешанной культуры в среде, где идет формирование КОБ, выявлена зависимость скорости формирования КОБ от следующих факторов: - присутствие осадка сульфида железа на металлических поверхностях, где формируются КОБ; - присутствие нефти в среде роста КОБ; - тип функционирования системы (стационарная или проточная, замкнутая или открытая), в которой происходит формирование биопленок.
Различия в величинах удельных скоростей роста КОБ в стационарной (0,063 ч-1), замкнутой проточной (0,16 ч-1) и открытой проточной (0,30 ч-1) системах свидетельствуют о том, что в условиях открытых проточных систем, к числу которых относится большинство всех трубопроводов, величина этого параметра является максимальной. Показано, что сформировавшиеся КОБ характеризуются повышенной скоростью коррозии металла, вызываемой ими, в сравнении с еще только формирующимися КОБ, при этом коррозия металла сопровождается активным накоплением сульфида железа в составе самой КОБ (рис.4).
Рис.4. Изменение контролируемых параметров в процессе роста коррозионноопасных биопленок:
- массового показателя коррозии, мг/см2, - lg [конц.клеток в биопленке, кл/см2], - концентрации 2сульфида железа в составе биопленки, мкг/см.
Была показана возможность использования АТФ-метрии для оценки действия ингибиторов коррозии (ИК), использующихся на практике, как биоцидов по отношению к разным бактериальным клеткам, участвующим в формировании КОБ.
В связи с этим было проведено определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) разных ИК, которые обеспечивали снижение численности клеток в анализируемых образцах до недетектируемого уровня (табл.5). Показано, что МИК, определенные для ИК биолюминесцентным методом, отражали концентрации, являющиеся действительно биоцидными по отношению к клеткам, тогда как микробиологический метод позволял определить лишь бактериостатические концентрации веществ, вызывающие переход клеток в некультивируемое состояние. Установлено, что для подавления роста и коррозионной активности клеток в составе КОБ требуются в 3-6 раз более высокие концентрации ИК, проявляющих свойства биоцидов, по сравнению с суспензионными клетками (табл.5). Биопленки, сформированные смешанными культурами, более устойчивы к воздействию биоцидов, при этом биоцидная активность ИК по отношению к КОБ бала заметно выше на начальной стадии их формирования (табл.6).
Таблица 5. Минимальные ингибирующие концентрации ИК для КОБ и планктонных клеток, участвующих в их формировании.
МИК для разных ИК, мг/л КОБ и планктонные клетки, участвующих в их формировании Катон Хазар Нитро-1 ВФИКС-Суспензионные клетки:
- Pseudomonas putida 117 55 57 1- Desulfovibrio vulgaris 229 174 169 3Биопленка, сформированная на основе:
- монокультуры СВБ (D. vulgaris) 750 1000 800 10- природной ассоциации клеток 800 1000 900 11Таблица 6. Удельные скорости роста () КОБ, определенные при внесении ИК (Катона) в среду на разных стадиях их формирования.
Концентрация , ч-1 (при внесении Снижение , ч-1 (при внесении Снижение Катона, Катона в среду до удельной Катона в среду в удельной мг/л начала формирования скорости экспоненциальной скорости биопленок) роста, % фазе роста биопленок) роста, % 0 0,086 контроль 0,070 контроль 50 0,060 30 0,061 100 0,045 48 0,049 150 0,031 65 0,038 Следует отметить, что ранее подобных исследований не проводилось, поскольку это было связано с существующими ограничениями микробиологического метода анализа, который мог быть применен для подобного рода исследований.
ГЛАВА 2. ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 2.1. Разработка многоцелевых ГБК на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС Дрожжи как объект исследования вызывают большой интерес, поскольку являются основными катализаторами процессов этанольного брожения и, с точки зрения биотехнологического применения этих микроорганизмов в свободном и иммобилизованном виде, неоспоримое преимущество по объемам потребления таких ГБК и разнообразию условий их применения имеет винодельческая и спиртовая, а в последнее время и топливная промышленность.
Первоначально был разработан способ получения ГБК на основе клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса Шампанская-39, включенных в криогель ПВС. С использованием биолюминесцентного метода определения АТФ были оптимизированы условия подготовки клеток к иммобилизации (состав среды культивирования, температурный режим и фаза роста клеток), установлен оптимальный компонентный состав ГБК, а также условия формирования криогеля ПВС как носителя. Этот споб получения ГБК и его последующее применение гарантировало получение конечного продукта (шампанского) самого высокого качества (по биохимическим и органолептическим характеристикам) при сокращении длительности процесса (с 28 до 21 сут.) в сравнении с его классическим вариантом, основанным на использовании свободных клеток. Ввиду оригинальности разработанного способа получения этого ГБК и его характеристик, он был запатентован (Патент РФ № 2322499, 2008), и была исследована возможность применения этого способа для получения ГБК с использованием различных штаммов дрожжей рода Saccharomyces (S. vini 47K, S. vini Бордо 20, S.
vini Кокур 3, S. vini-Ленинградская, S. vini Каберне 5, S. vini Массандра 3, S. vini Кислотопонижающая раса, S. cerevisiae ph. v. bayanus (Zymasil killer), S. cerevisiae Red fruit, S. cerevisiae Vintage white, S. cerevisiae(bayanus) 8906 Fermivin PDM, S.
cerevisia(bayanus) AD-906 France Champagne Premium, S. cerevisiae Killer (bayanus) IOC 18-2007, S. baynus Cremanti), катализирующих биотехнологические процессы, в основе которых лежит конверсия моносахаридов в этанол (получение белых и красных столовых вин, устранение недобродов с целью получения кондиционной продукции). В каждой разновидности тестируемого биотехнологического процесса использовался для исследований не один, а несколько штаммов. Таким образом, определялась универсальность того подхода, который был положен в основу способа получения ГБК на основе клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, а, следовательно, и полифункциональность того ГБК, который мог быть получен при замене всего одной единственной составляющей - штамма клеток рода Saccharomyces. Следует отметить, что подобная научная задача решалась впервые.
Проведенный биохимический и органолептический анализ образцов вина, полученных с использованием приготовленных ГБК на основе ИмК разных штаммов, выявил наличие общих тенденций в изменении концентраций отдельных компонентов сред, накапливающихся в процессе этанольного брожения, по сравнению с образцами сред, приготовленных с применением свободных клеток тех же штаммов дрожжей. Так, по сравнению со свободными клетками в средах с ИмК регулярно отмечалась более высокая (на 6-12%) концентрация этанола и меньшая остаточная концентрация сахарозы (в 1,5-2 раза), что свидетельствовало о большей степени потребления исходного субстрата ИмК и более полной его конверсии в основной продукт метаболизма (этанол). Для ИмК было отмечено заметное снижение концентраций ряда метаболитов: глицерина - на 30%, этилацетата - в 2-17 раз, молочной кислоты - в 1,2-2,3 раза, различных спиртов (метанола, пропанола, изобутанола, изоамилового спирта) - в 2-5 раз, уксусной кислоты - в 1,25-3,0 раза (табл.7, табл.8). Эти результаты свидетельствовали о преимущественной конверсии потребленного субстрата в основной продукт гликолиза - этанол. При этом во всех образцах сред, полученных с использованием ИмК, наблюдалось 25-33%-ное увеличение концентрации яблочной кислоты по сравнению с теми винами, где применялись свободные клетки дрожжей.
Таблица 7. Концентрация органических кислот в белом столовом вине, полученном с использованием свободных и иммобилизованных клеток разных штаммов дрожжей S. vini.
Органические кислоты*, мг/л Штамм дрожжей S. vini 1 2 3 4 5 6 7 47 K Свободные клетки 3566 83 1820 27 1709 11 736 3 Иммобилизованные 3326 66 1512 19 1875 16 535 3Кокур Свободные клетки 3387 64 1256 29 1729 18 620 3 Иммобилизованные 3355 54 1255 26 1842 13 534 3Ленинградская Свободные клетки 3332 61 1410 27 1513 16 1288 4 Иммобилизованные 3330 60 1276 27 1896 13 575 3Kислотопонижающая Свободные клетки 3483 73 1160 26 1617 11 527 4 Иммобилизованные 3438 64 1137 23 2139 14 525 4Mассандра Свободные клетки 3494 57 1483 25 1841 15 463 3 Иммобилизованные 3264 57 1252 27 1939 16 467 3*1 - винная (4343 мг/л), 2 - лимонная (105 мг/л), 3 - янтарная (230 мг/л), 4 - фумаровая (6 мг/л), 5 - яблочная (1454 мг/л), 6 - пировиноградная (16 мг/л), 7 - молочная (0 мг/л), 8 - уксусная (0 мг/л) кислоты. В скобках указаны начальные концентрации органических кислот, исходно присутствовавшие в виноградном соке.
Совокупность проанализированных характеристик продуктов различных биотехнологических процессов подтвердила, что применение ГБК на основе клеток дрожжей, иммобилизованных согласно разработанному способу, обеспечило приготовление шампанского, красного и белого вина, превосходящих по качеству (по всем основным физико-химическим и органолептическим характеристикам) образцы вина, полученного с использованием свободных клеток дрожжей тех же тестированных коммерческих и промышленных штаммов.
Также впервые была продемонстрирована высокая эффективность использования ГБК на основе ИмК дрожжей, полученных по разработанному способу, для устранения винных недобродов, представляющих собой виноматериалы, содержащие высокую остаточную концентрацию сахарозы, не соответствующую требованиям, предъявляемым к качественной продукции.
Доведение подобных виноматериалов до необходимого уровня качества является трудно решаемой задачей, так как в таких средах уже содержатся довольно высокие концентрации накопившегося этанола, выступающего ингибитором метаболической активности свободных клеток дрожжей. В данной работе обработка виноматериалов с исходно высокой концентрацией этанола (82,8 г/л и 106,5 г/л) полученным ГБК на основе ИмК S. cerevisiae phv bayanus в течение сут. позволила заметно (в сравнении со свободными клетками) улучшить их качество (рис. 5), повысив содержание в них этанола.
Таблица 8. Содержание различных ароматических веществ в столовом красном вине, приготовленном с использованием свободных и иммобилизованных клеток различных штаммов винных дрожжей S. vini Контролируемые Клетки разных штаммов дрожжей S. vivi вещества, мг/л 47 К Каберне-5 Массандра-Свобод. Иммоб. Свобод. Иммоб. Свобод. Иммоб.
Ацетальдегид 14,8 14,8 23,4 13,5 19,7 16,Этилацетат 18,3 18,2 24,8 13,0 18,9 18,Метанол 29,0 28,6 52,4 27,0 48,6 46,Пропанол 37,9 34,6 31,3 9,7 38,9 37,Изобутанол 37,6 32,1 37,0 6,8 37,1 34,Изоамиловый спирт 166,0 146,5 329,3 158,7 289,8 166,Уксусная кислота 125,0 91,0 315,0 104,0 216,0 100,Бутиленгликоль 150,8 166,3 149,3 168,6 161,0 175,Фенилэтиловый спирт 31,1 33,2 43,2 31,1 41,0 32,Глицерин 11000 10500 10700 10300 11000 107Изоамилацетат 2,34 2,85 2,44 2,25 2,72 1,*Дегустационная оценка 7,8 7,9 7,7 7,8 7,6 7,*Дегустационная оценка по 8-ми бальной системе проводилась комиссией профессиональных экспертов отдела химии и биохимии вина Национального института винограда и вина Магарач (г. Ялта, Украина).
Рис. 5. Кинетика накопления этанола (устранения некондиционности виноматериалов) в средах, уже содержащих разную концентрацию этанола, под действием свободных и иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей S. cerevisiae phv bayanus.
Свободные и иммобилизованные клетки дрожжей обозначены черными и белыми символами, соответственно. Средам с исходной концентрацией этанола 82,8 г/л и 106,5 г/л соответствуют круглые и треугольные символы.
Таким образом, на основе клеток дрожжей рода Saccharomyces, включенных в криогель ПВС, была установлена универсальность разработанного способа иммобилизации клеток, а также показана полифункциональность ГБК, получаемого таким способом и имеющего высокую эффективность действия в различных процессах, связанных с конверсией сахаров в этанол.
2.2. Установление общих закономерностей в формировании гетерогенных ГБК на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов, создание полифункциональных биокатализаторов и исследование их характеристик При получении различных образцов ГБК на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов, включенных в матрицу криогеля ПВС, в данной работе была применена одна и та же общая схема эксперимента, состоящая из следующих основных стадий: 1 - включение спор мицелиальных грибов в криогель ПВС;
2 - проращивание иммобилизованных спор в питательной среде определенного состава с целью накопления метаболически активного мицелия в объеме носителя и формирование, таким образом, целевого ГБК.
На основе предварительного скрининга продуцентов для создания ГБК на основе ИмК, предназначенных для применения в биотехнологических процессах с разными целевыми продуктами, был отобран штамм Rhizopus oryzae F-814, обладавший способностью к продуцированию различных целевых продуктов (липолитических и амилолитических ферментов, а также молочной кислоты). Была исследована возможность создания полифункциональных ГБК на основе этого штамма при использовании одних и тех же иммобилизованных спор, но с проведением формирования иммобилизованного мицелия в питательных средах разного состава, содержащими индукторы, необходимые для приобретения ИмК определенных каталитических свойств, например, амилолитической или липолитической активности. Подобные исследования были проведены впервые.
При формировании всех разрабатываемых ГБК подбирались условия (состав питательной среды, длительность процесса, концентрация гранул ГБК в среде и др.), обеспечивающие получение за минимальное время готовых ГБК с максимальной метаболической активностью иммобилизованного мицелия. В результате было обнаружено, что при использовании одинаковых исходных спор, включенных в криогель ПВС, и сред определенного состава может быть сформирован высоко активный иммобилизованный мицелий, продуцирующий: - L(+)-молочную кислоту (МК) - при его формировании в среде, содержащей глюкозу как основной источник углерода (рис.6); - амилолитические ферменты - при его формировании в среде, содержащей крахмал (рис.7); - липолитические ферменты - при его формировании в среде, содержащей триацилглицериды (табл.9). Таким образом, впервые была продемонстрирована возможность получения полифункциональных ГБК на основе клеток мицелиальных грибов.
Рис. 6. Кинетика процесса формирования ГБК на основе иммобилизованного в криогель ПВС мицелия Rhizopus oryzae F-814 при использовании глюкозосодержащей питательной среды:
- биомасса в составе гранул ГБК, - концентрация АТФ, - молочная кислота (МК), - глюкоза.
Независимо от типа использованной среды были выявлены общие закономерности в формировании ГБК: отмечено равномерное прорастание мицелия по всему объему гранул криогеля ПВС и увеличение массы и размеров гранул ГБК за счет нарастающего мицелия. Установлено снижение влажности гранул ГБК с до 85%, связанное с увеличением плотности упаковки мицелия внутри гранул по мере роста клеток. Определение суммарной концентрации внутриклеточного АТФ в гранулах ГБК выявило ее корреляцию с накоплением биомассы, определяемой по изменению сухого веса гранул. Вместе с этим были установлены явные различия в морфологии иммобилизованного мицелия одного и того же гриба, сформированного в разных средах, что отражалось не только на внешнем виде гранул ГБК (рис.8), но и на их прочностных характеристиках (табл.10).
Рис. 7. Амилазная активность, накапливающаяся в среде при использовании ГБК на основе иммобилизованного в криогель ПВС мицелия гриба R. oryzae в периодическом процессе для получения амилолитических ферментов в среде с разными концентрациями крахмала (концентрация ГБК в среде - 65 г/л. Длительность одного рабочего цикла ГБК -40 ч).
Таблица 9. Характеристики процесса формирования ГБК на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба R. oryzae в результате роста мицелия в гранулах носителя Основной источник , Сmах, Qc*, Qлип* Алип мах, УАлип *, углерода ч-1 г/л г им.биом./л/ч Ед/ л/ч Ед/л Ед/г им.биомассы Концентрация основного источника углерода - 10 г/л Рапсовое масло ** 0,41 48 0,41 51 5750 1Подсолнечное масло ** 0,25 29 0,25 32 3600 1Оливковое масло 0,22 43 0,41 46 4650 Оливковое масло ** 0,27 35 0,31 70 7100 1Кукурузное масло 0,33 48 0,47 65 6000 1Кукурузное масло ** 0,26 47 0,44 67 6300 1Маргарин 0,64 78 0,65 84 9200 1Маргарин ** 0,53 71 0,67 116 9800 1Концентрация основного источника углерода - 20 г/л Маргарин ** 0,60 72 0,67 136 10000 1Маргарин *** 0,65 74 0,70 138 11000 1Маргарин **** 0,23 90 0,84 200 21000 1* - указано среднее значение за 100 ч; ** - с добавками в питательную среду твина 20 (10 г/л) *** - с добавками в питательную среду фосфолипидов (10 г/л) **** - с добавками в питательную среду твина 20 (10 г/л) и фосфолипидов (10 г/л) - удельная скорость роста мицелия, Qс - продуктивность процесса по биомассе, Qлип - продуктивность процесса по липолитической активности, УАлип - удельная внеклеточная липолитическая активность, Сmax (концентрация биомассы) и Алип мах (внеклеточная липолитическая активность), максимально полученные за время проведения эксперимента. Все данные приведены относительно сухого веса мицелия.
1 мм 1 мм а б в г Рис. 8. Фотографии поверхности гранул криогеля ПВС с включенными в него спорами гриба Rhizopus oryzae F-814 (а), использованные для формирования ГБК на основе иммобилизованного мицелия в среде с триацилглицеридами (б) и в глюкозосодержащей среде (в, г).
Таблица 10. Модуль упругости (кПа) гранул ГБК на основе мицелия гриба Rhizopus oryzae, формирующегося в средах с разным основным источником углерода.
Основной источник Время формирования ГБК, ч углерода 0 24 48 72 Глюкоза 55,63,1 69,86,6 80,29,1 77,67,0 78,93,Крахмал 55,63,1 76,32,3 69,26,4 77,16,1 79,63,Маргарин 54,87,1 57,54,5 34,64,8 32,57,5 30,93,4 о *Условно-мгновенный модуль упругости полученных образцов ГБКК определяли при 211 С методом одноосного сжатия при постоянной нагрузке 4,910-3 Н.
В средах, содержащих различные сахара или полисахариды (крахмал, пектин) наблюдалось упрочнение гранул ГБК, а в жиросодержащих средах, наоборот, отмечалось снижение модуля упругости гранул. Анализ этой же характеристики у гранул ГБК после их длительного использования в соответствующих процессах показал, что она практически не изменяется, оставаясь на постоянном уровне.
В целом в работе на основе клеток мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель ПВС, было получено 4 новых иммобилизованных ГБК, предназначенных для получения липолитических и амилолитических ферментов (Rhizopus oryzae), пектиназ (Aspergillus foetidus), а также щелочных протеаз (Heleococcum alkalinum). Новизна этих разработок отражена в двух Патентах РФ:
№ 2253677 (2005) и № 2315102 (2007). Впервые было показано, что сочетание таких компонентов, как криогель ПВС и клетки мицелиальных грибов в составе ГБК обеспечивает получение биокаталитических систем, характеризующихся длительным и стабильным биосинтезом различных гидролитических ферментов вне зависимости от используемого штамма-продуцента (рис.7 и рис.9). Кроме того, в данной работе впервые было установлено наличие у недавно выделенного и охарактеризованного галоалкалофильного гриба Heleococcum alkalinum [Козлова М.В., 2006] высокой протеолитической активности, проявляемой им в широком диапазоне рН и сохраняемой в иммобилизованном виде (рис.9). Уровень протеолитической активности (10000 Ед/л) разработанного ГБК в 5 раз превышал известный уровень одного из лучших продуцентов внеклеточных протеаз - мицелиального гриба Aspergillus niger ATCC 13496 [Papagianni M, 2002].
Рис. 9. Многократное использование ГБК на основе клеток гриба H.alkalinum, иммобилизованных в криогель ПВС, для получения внеклеточной протеолитической активности в среде с 1% крахмалом (рН 10). Концентрация ГБК в среде - 90 г/л. Протеолитическая активность определялась при рН 7,5 Ц, рН 9,0 Ц, рН10,0 Ц.
Сравнительный анализ ферментативных комплексов, синтезируемых свободными и иммобилизованными клетками грибов (рис.10), позволил установить расширение спектра внеклеточных липолитических ферментов, а также констатировать увеличение концентрации белков (на 25-35%) в каждой фракции, полученной при хроматографическом разделении белков с липолитической активностью. Общий хроматографический анализ белков, присутствовавших в культуральной жидкости ИмК и отобранных в градиенте 0-0,07 М NaCl, показал наличие 3-х фракций (0,042, 0,049 и 0,066 М NaCl), полностью отсутствовавших в препарате свободных клеток, которые характеризовались относительно высоким по сравнению с суммарно-нанесенным на колонку содержанием белка (1%, 0,7% и 1%, соответственно).
Рис. 10. Характеристики фракций с липолитической активностью, полученных при хроматографическом разделении белков, содержавшихся в культуральной жидкости свободных (столбцы белого цвета) и иммобилизованных (столбцы серого цвета) клеток гриба R.oryzae.
Таким образом, было установлено, что комплексы внеклеточных ферментов свободных клеток и ИмК гриба R. oryzae имеют отличия. ИмК секретируют более широкий спектр белков или большее количество их изоформ. Эти различия в ферментативных комплексах свободных клеток и ИмК были выявлены впервые и имеют фундаментальное значение.
2.3. Гетерогенные биокатализаторы, полученные в результате трансформации компетентных иммобилизованных клеток бактерий Было проведено исследование возможности трансформации ИмК бактерий.
Помимо ответа на фундаментальный вопрос, связанный с расширением представлений о свойствах ИмК и о возможности изменения ими генетического статуса в результате восприятия чужеродной ДНК, это исследование открывало путь к решению практических задач, например, к получению полифункциональных ГБК на основе одних и тех же ИмК с использованием для трансформации различных генетических конструкций.
Использованный в работе подход к получению ГБК на основе иммобилизованных рекомбинантных клеток включал четыре основные стадии:
1 - приготовление компетентных клеток, способных воспринять чужеродную ДНК; 2 - иммобилизация компетентных клеток в криогель ПВС; 3 - трансформация иммобилизованных компетентных клеток; 4 - культивирование иммобилизованных трансформантов. Таким образом, иммобилизовались не заранее полученные рекомбинантные клетки, а трансформация клеток проводилась уже после их иммобилизации. Подобные исследования были проведены впервые.
Как правило, свободные компетентные клетки получают в достаточном количестве в различных лабораториях, где они применяются, их хранят в замороженном состоянии при -70С до момента использования с целью получения трансформантов. Хотя компетентные клетки могут храниться в указанных условиях весьма длительное время, эффективность их трансформации со временем снижается, так как в процессе хранения уменьшается концентрация живых клеток, способных к восприятию чужеродной ДНК и к пролиферации, а, значит, при использовании таких компетентных клеток для трансформации резко снижается выход числа трансформантов. Применение криогеля ПВС как носителя для ИмК могло позволить решить ряд практических задач, например, заметно повысить температуру хранения компетентных клеток (от -70оС для свободных клеток до 20С (температура образования криогеля ПВС), улучшив экономическую сторону процесса, а также продлить период хранения иммобилизованных компетентных клеток по сравнению со свободными.
В этой части работы использовалась для трансформации ИмК специально сконструированная плазмида рОРf1, которая содержала ген устойчивости к ампициллину и ген, кодирующий синтез органофосфатгидролазы (ОРН), катализирующей гидролиз фосфоорганических соединений (ФОС). Выбор фермента был обусловлен его чрезвычайно высокой каталитической активностью в реакции гидролиза субстрата Параоксона, а факт накопления p-нитрофенолят-иона, как продукта этой реакции, легко контролировался спектрофотометрически (=4нм, рН 9,0). Таким образом, трансформированные иммобилизованные компетентные клетки обладали антибиотикоустойчивостью и ОРН-активностью. В предварительных экспериментах было показано, что ОРН-активность клеток E. coli C600, включенных в гранулы криогеля ПВС, пропорциональна количеству ИмК, содержащих плазмиду с геном, кодирующим синтез ОРН. В этой связи ОРНактивность, обнаруживаемая в ИмК, была выбрана в качестве критерия, характеризующего эффективность произошедшей трансформации ИмК.
Процесс трансформации клеток состоит из двух ключевых стадий: 1Ц это адсорбция молекул ДНК на поверхности клеток (обратимый процесс); 2- проникновение генетического материала в клетки (необратимый процесс) при их прогреве при 42С, в результате, так называемого, термошока.
Установлено, что иммобилизованные компетентные клетки могут быть успешно трансформированы даже очень низкими концентрациями плазмидной ДНК (рис.11). При этом иммобилизованное состояние клеток не является тому препятствием, а наоборот оказывает позитивное влияние, которое было показано при варьировании температуры проведения термошока (табл.11).
Рис.11. Влияние концентрации плазмидной ДНК, взятой для трансформации иммобилизованных компетентных клеток, на органофосфатгидролазную активность получаемых трансформантов, определяемую через 2,5 ч после трансформации.
Таблица 11. Влияние температуры теплового шока, применяемого в процессе трансформации клеток E.coli C600, на ОРН-активность получаемых иммобилизованных трансформантов.
Температура ОРН-активность иммобилизованных Снижение термошока трансформантов, ед/ г ГБК эффективности (через 2,5 ч после трансформации) трансформации, % 42оС 0,62 0,010 Контроль 47оС 0,51 0,008 18 1,52оС 0,35 0,015 45 2,Было обнаружено, что при повышении температуры этой процедуры на 10оС наблюдается всего лишь 45%-ное снижение эффективности трансформации ИмК.
При этом для свободных клеток в тех же условиях не было получено ни одного трансформанта. Иммобилизованные компетентные клетки E.coli, включённые в гранулы криогеля ПВС, сохраняли способность к трансформации как одно-, так и двухцепочечной плазмидной ДНК, то есть молекулами ДНК с разной структурой.
Также была показана возможность использования для трансформации иммобилизованных компетентных клеток после их хранения в замороженном состоянии в течение 12 месяцев при температуре -20оС всего с 15%-снижением эффективности трансформации.
Таким образом, впервые была показана возможность генетической модификации ИмК бактерий. Полученные в работе результаты аргументируют в пользу проведения процессов c ГБК на основе ИмК в асептических условиях с целью обеспечения генетической неизменности используемых штаммовпродуцентов.
ГЛАВА 3. БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ: ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ Биокаталитические системы на основе ИмК, как известно, обладают рядом преимуществ перед свободными, а именно, повышенной устойчивостью к воздействию негативных факторов (рН, температуры, компонентов среды культивирования, и др.), а также длительным сохранением метаболической активности при их многократном использовании в биотехнологических процессах при отсутствии заметного лизиса клеток. Отсутствие четкого понимания причин, лежащих в основе подобных изменений характеристик ИмК в сравнении со свободными клетками, не позволяет осознанно управлять ими и не стимулирует использование ГБК в промышленных процессах. К тому же за последние 10 лет накопилась новая информация о свойствах ИмК, которая вошла в противоречие с ранее существовавшими общими научными представлениями о ИмК и закономерностях их функционирования. Так в противовес общепринятой концепции об отсутствии роста у ИмК, было установлено, в том числе и в данной работе (табл.12), что ИмК сохраняют пролиферативную функцию, причем как непосредственно после иммобилизации, так и после длительного их использования в биотехнологических процессах. При этом кинетические характеристики роста (удельная скорость роста и время удвоения) ИмК не существенно отличаются от аналогичных характеристик свободных клеток. Отмеченные тенденции в изменении кинетических характеристик клеток при их иммобилизации оказываются общими для разных микроорганизмов (бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов), и в целом отсутствует зависимость этих тенденций от носителей и методов, используемых для иммобилизации клеток.
Таблица 12. Удельные скорости роста свободных (свк) и иммобилизованных (имк) в криогель ПВС клеток различных микроорганизмов.
Rhodococcus erhytropolis свк = 0,110 ч-1 имк = 0,081ч-Pseudomonas putida свк = 0,21 ч-1 имк = 0,19 ч-Streptomyces anulatus свк = 0,010 ч-1 имк = 0,0076 ч-Rhizopus oryzae свк = 0,093 ч-1 имк = 0,079 ч-Aspergillus foetidus свк = 0,368 ч-1 имк = 0,307 ч-Heleococcum alkalinum свк = 0,150 ч-1 имк = 0,144 ч-Другой важной характеристикой ИмК, отличающей их от свободных клеток, является их длительная функциональная активность, в качестве объяснения которой существует предположение о том, что носитель играет роль защитного барьера для ИмК, лэкранируя их от негативного воздействия метаболитов и препятствуя их проникновению в матрицу [Nedovi V., 2004]. Но, согласно ранее изложенным в этой работе результатам по трансформации ИмК (п.2.3), матрица носителя не является препятствием для проникновения в клетки даже столь высокомолекулярных соединений, как ДНК. Также длительная операционная стабильность ГБК на основе клеток, иммобилизованных адсорбционно на поверхности носителей, не может быть объяснена защитными характеристиками носителя.
Анализ собственных и литературных данных позволил говорить об изменении биохимического статуса разных ИмК в сравнении со свободными, выражающемся в увеличении уровня синтеза ферментов основного метаболизма в 2-3,5 раза.
Сопоставление полученных данных и результатов, опубликованных разными авторами, по характеристикам ИмК дрожжей, позволило заключить, что в ИмК увеличивается в 2-3 раза концентрация гексокиназы, пируваткиназы и алкогольдегидрогеназы, при этом происходит снижение уровня синтеза пируватдегидрогеназы и ацетальдегидрогеназы. При реализации реакций гликолиза увеличение в ИмК гексокиназной активности за счет увеличения концентрации этого фермента обеспечивало более высокую скорость потребления субстрата (глюкозы) и ее меньшую остаточную концентрацию в среде под конец процесса брожения в сравнении со свободными клетками, что многократно наблюдалось в этой работе на разных штаммах дрожжей рода Saccharomyces (п.2.1).
Для ИмК оказалось характерным увеличенное в 3 раза содержание 3-фосфоглицеринового альдегида, накопление которого в ИмК наблюдалось на фоне уменьшения (в сравнении со свободными клетками) его трансформации в глицерин (табл. 8). Фосфоенолпируват, образующийся из 3-фосфоглицеринового альдегида, который мог быть использован ИмК для биосинтеза ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана), превращался в пируват под действием пируваткиназы, чей повышенный синтез в ИмК был подтвержден.
Таким образом, ИмК, ускоряя на этой стадии процесс превращения фосфоенолпирувата в пируват, очевидно, избегали ненужного клеткам при их высокой концентрации в ГБК синтеза аминокислот и, следовательно, белков для увеличения собственной биомассы.
На следующих стадиях возможной трансформации пирувата у ИмК был установлен уменьшенный уровень синтеза пируватдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. Сниженный уровень синтеза лактатдегидрогеназы приводил к уменьшению концентрации МК, продуцируемой ИмК дрожжей, что уже отмечалось ранее, а сниженный уровень синтеза пируватдегидрогеназы, в свою очередь, замедлял трансформацию пирувата в ацетил-коферментА, регулируя, таким образом, интенсивность функционирования цикла трикарбоновых кислот у ИмК. Видимо, именно эта стадия является лузким местом в гликолизе у ИмК и способствует накоплению 3-фосфоглицеринового альдегида на ранней стадии.
Таким образом, вход в цикл трикарбоновых кислот у ИмК оказывается ограниченным, и интенсивность его функционирования ниже по сравнению со свободными клетками, что было подтверждено многократно экспериментально в этой работе (см. табл. 7 и 8). Показано, что концентрации лимонной и янтарной кислот, накапливающиеся в среде с ИмК, меньше (табл.7), чем в средах со свободными клетками, тогда как концентрация яблочной кислоты у ИмК, наоборот, существенно увеличена. Очевидно, ИмК, стараясь избежать необходимости использования оксалоацетата, образующегося из малата, на биосинтез аминокислот (аспарагина, аргинина, метионина, треонина, изолейцина), выводят существенную часть яблочной кислоты из цикла Кребса. Таким образом, в ИмК регулируется концентрация образующегося оксалоацетата, а, следовательно, и аминокислот для синтеза белков, которые клеткам при их высокой плотности в иммобилизванном состоянии и низкой удельной скорости роста, очевидно, не нужны в том же количестве, что и для свободных клеток.
В связи с изложенным, основное количество пирувата в ИмК должно превращаться в ацетальдегид, а поскольку установлена активация синтеза алкогольдегидрогеназы и снижение уровня синтеза ацетальдегидрогеназы, то последующая трансформация ацетальдегида происходит со снижением уровня накопления ацетата в среде с ИмК (табл. 7) и повышением уровня накопления этанола в среде по сравнению со свободными клетками, что также подтверждено результатами этой работы.
В целом, сопоставление разрозненной информации об основных ферментах гликолиза, функционирующих в ИмК дрожжей, с собственными экспериментальными данными, позволили найти научное объяснение тех преимуществ ИмК дрожжей перед свободными, которые проявляются в процессе конверсии глюкозы в этанол. Следует отметить, что подобное обсуждение биохимических процессов, происходящих в ИмК дрожжей, ранее никем не проводилось и является результатом научного анализа, проведенного соискателем.
Очевидно, что регуляция уровня биосинтеза ферментов основного метаболизма в ИмК происходит на уровне экспрессии соответствующих генов.
Таким образом, обсуждавшиеся характеристики ИмК - это результат их измененного генетического состояния в сравнении с тем, который имеется у свободных клеток. Прослеженные зависимости в биохимических процессах показали, что основным их регулятором и причиной изменений генетического статуса ИмК является именно их высокая концентрация, которая целенаправленно создается и длительное время удерживается в составе ГБК.
Сегодня уже довольно хорошо известна глобальная система регуляции экспрессии генов у бактерий (Quorum sensing - QS), функционирование которой предопределяется концентрацией клеток [Waters C.M, 2005; Хмель И.А., 2006]. QSсистема включает низкомолекулярные сигнальные молекулы (аутоиндукторы, АИ), которые синтезируются клетками наряду с другими метаболитами. В QS-систему также входят регуляторные белки, с которыми связываются АИ. По мере того, как популяция клеток увеличивает свою концентрацию и достигает критического уровня, концентрация АИ также накапливается до некоего порогового значения.
После этого АИ взаимодействуют с соответствующими регуляторными белками, которые в свою очередь превращаются в таком состоянии в активаторов экспрессии определенных генов. Далее развитие ответа системы происходит каскадом, то есть белки, синтезируемые de novo в клетках, являются регуляторами экспрессии других генов, причем как их активаторами, так и репрессорами.
Известно, что один АИ может участвовать в регуляции транскрипции 616 генов у клеток Pseudomonas aerugenosa и 242 генов у клеток E.coli, составляющих 5,6% генома бактерии. Также установлено, что QS-регуляция играет важнейшую роль в формировании биопленок, то есть для самоиммобилизующихся клеток [Zhu J., 2003; Ильина Т.С, 2004]. Изменение генетического статуса таких клеток выражается в изменении их протеомного состава по отношению к свободным клеткам (табл.13).
Таблица 13. Изменение протеомного состава клеток в результате их иммобилизации в сравнении со свободными клетками тех же культур.
Количество белков Микро- Носитель для всего дополнительно не Ссылка организм иммобилизации анализи- обнаружено обнаружеровалось у ИмК но у ИмК Escherichia Стеклянные 38 17 15 [Otto K, 2001] coli сферические гранулы Bacillus [Oosthuizen M.C., Оптическое 345 26 cerreus 2002] волокно 838 182 Pseudomonas [Vilain S., 2004] Частицы глины 841 62 aeruginosa 1500 765 90 [Sauer K., 2002] Силиконовые Pseudomonas трубки 1000 15 30 [Sauer K., 2001] putida Streptococcus Гидроксиапатитовый [Svenster G., 694 57 mutants штифт 2001] Rhizopus Криогель ПВС 10 4 - Данная работа orysae* * секретируемые ферменты.
Сумма вышеизложенных фактов позволила сформулировать гипотезу о том, что в основе изменения характеристик ИмК в сравнении со свободными клетками лежит именно создаваемая в интересах биотехнологических процессов их высокая концентрация в образцах ГБК и в объемах реакторов. При этом регуляция характеристик ИмК, вероятно, осуществляется QS-системами, которые пока хорошо изучены только у прокариотических клеток. Данная гипотеза, согласно которой искусственная иммобилизация клеток в высоких концентрациях активирует проявления их генетически запрограммированного ответа, приводящего к изменению генетического и биохимического статуса ИмК, а также их функциональных характеристик в составе разрабатываемых ГБК, была сформулирована впервые в отношении искусственно иммобилизованных клеток микроорганизмов и носит фундаментальный характер.
ГЛАВА 4. ГБК НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК С МОНОФЕРМЕНТНОЙ ЦЕЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ: ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ И ИХ СВОЙСТВА 4.1. ГБК на основе иммобилизованных клеток, содержащих глюкозоизомеразу в клеточной стенке Поскольку глюкозоизомераза (ГИ, ЕС 5.3.1.5) локализована в структуре клеточной стенки штаммов-продуцентов, как правило, стрептомицетов [Gromada A., 2008], то для получения глюкозо-фруктозных сиропов (ГФС), содержащих 4245% фруктозы, с ее участием создаются иммобилизованные препараты ГИ двумя путями: 1 - иммобилизацией клеток, содержащих фермент; 2 - выделением фермента из клеток и его иммобилизацией на различных носителях. Для препаратов на основе ИмК с ГИ характерен период полуинактивации (ПП) от сут. до 35 сут., а интегральная продуктивность - до 2000 кг ГФС с 1 кг ГБК. При этом для ГБК на основе иммобилизованной ГИ продуктивность составляет 40006000 кг ГФС с 1 кг ГБК, а ПП - от 83 сут до 2 лет. Несмотря на очевидную разницу в характеристиках между ГБК на основе ИмК и иммобилизованного фермента на практике находят применение и те и другие препараты, поскольку ГБК на основе иммобилизованного фермента, несмотря на выдающиеся операционную стабильность и продуктивность, обладают заметно большей стоимостью.
В данной работе был разработан высоко эффективный ГБК на основе клеток Streptomyces albogriseolus 28-3 с ГИ-активностью с использованием упрочненного в результате высушивания композиционного носителя на основе геля хитозана и гидроокиси Со2+. Испытания ГБК в непрерывном режиме функционирования (рис.12) в течение 50 сут. позволили установить, что при активности 400 ед/г ГБК (сух.в.) и ПП=42-45 сут. ГБК имеет интегральную продуктивность 2500 кг ГФС на 1 кг ГБК при следующих условиях его применения: 42% глюкозы, рН 7,0-7,5, 60оС.
Исследование механической прочности гранул ГБК до и после их использования в процессе получения ГФС показало их высокую механическую стабильность, так как относительная деформация гранул ГБК в обоих случаях не превышала 6%.
Совокупность полученных данных подтвердила перспективность использования разработанного ГБК для получения ГФС даже в сравнении с известными коммерческими аналогами.
Рис. 12. Результаты применения ГБК с глюкозоизомеразной активностью, в процессе получения глюкозофруктозных сиропов в проточном реакторе: - содержание фруктозы, %, - скорость протока субстрата, мл/ч через слой гранул разработанного ГБК.
Полученные в этой работе результаты по разработке ГБК с ГИ-активностью на основе ИмК вовлечены в образовательный процесс, так как подробно изложены в учебнике Технология ферментных препаратов (авторы - Грачева И.М., Кривова А.Ю., изд-во Элевар, 2000 г., на стр. 459-470), предназначенном для студентов и аспирантов ВУЗов, обучающихся по специальности Биотехнология. На сам иммобилизованный ГБК с ГИ-активностью были получены два Авторских свидетельства СССР на изобретения: №1634715 (1991) и № 1731815 (1992).
4.2. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных рекомбинантных клеток с активностью органофосфатгидролазы Создание рекомбинантных штаммов существенно расширяет возможности получения высокоэффективных ГБК на основе ИмК с целевой моноферментной активностью, так как появляется возможность изменения локализации фермента в клетках, возможно существенное увеличение уровня синтеза основного фермента и улучшение его каталитических характеристик.
В рамках данной работы с использованием гена, кодирующего синтез фермента органофосфатгидролазы (ОРН, ЕС 3.1.8.1), первоначально выделенного из клеток Pseudomonas diminuta В-1297 (ВКМ), было создано несколько генетических конструкций, обеспечивающих высокоэффективный синтез ОРН в растворимой форме в цитопламе клеток E. coli, которые, в свою очередь, были использованы для разработки новых ГБК на основе ИмК с ОРН-активностью.
ОРН катализирует гидролиз Р-О, Р-S и P-F-связей в производных ортофосфорной и фосфоновой кислот, обладает широкой субстратной специфичностью и потому представляет интерес для процессов биодеструкции фосфорорганических соединений (ФОС), обладающих нейротоксичностью.
Для создания генетических конструкций с геном, кодирующим синтез ОРН, использовалась плазмида pTrc-TES, содержащая несколько основных элементов, необходимых для эффективной экспрессии: сильный индуцибельный trc-промотор E. coli, синтетический усилитель трансляции TES гена 10 бактериофага T7, терминатор транскрипции фага лямбда, ген bla -лактамазы, определяющий устойчивость клеток, трансформированных плазмидой pTrc-TES, к ампициллину и участок ori инициации репликации (рис.13).
Рис. 13. Новые генетические конструкции, созданные на основе плазмиды рTrc-TES для синтеза ОРН и ее аналогов: His6-OPH, OPH- His6, His12-OPH, His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-deGFP4(AS)5-OPH.
Было разработано 6 новых генетических конструкций, обеспечивающих высокий уровень синтеза так называемых гибридных белков, содержащих в своем составе помимо молекулы ОРН еще и генетически введенную дополнительную аминокислотную последовательность различной длины (от 6 до 3аминокислотных остатков). Такие аминокислотные последовательности генетически вводятся на N- или С-конец основного белка потому, что, во-первых, они могут обеспечивать существенное упрощение процедуры выделения и очистки целевого белка из клеток за счет специфического взаимодействия с хроматографическими носителями, во-вторых, способствовать изменению каталитических характеристик целевого белка, в частности, субстратной специфичности или могут придавать целевому белку новые дополнительные свойства, например флуоресценцию, если в качестве вводимого партнера по гибридному белку используется GFP (green fluorescent protein - флуоресцентный зеленый белок) или его производные. В-третьих, партнеры основного белка по гибридному белку могут способствовать увеличению уровня накопления целевого белка в растворимой форме в клетках.
Созданные генетические конструкции (рис.13) и штаммы, которые обеспечивали их высокий уровень экспрессии, позволили получить производные ОРН, содержащие 6 или 12 остатков гистидина на N- и С-конце молекулы ОРН (соответственно, His6-OPH, OPH-His6, His12-OPH) В качестве гибридного партнера OPH был применен флуоресцентный белок deGFP4 - аналог GFP (green fluorescent protein), обратимо изменяющий флуоресцентные свойства в зависимости от pH среды. Выбор этого белка в качестве партнера для OPH по гибридному белку был интересен тем, что в процессе ферментативного гидролиза ФОС снижается pH реакционной среды из-за образования кислых продуктов. Таким образом, помимо увеличения выхода растворимой формы фермента, введение в гибридный белок молекулы deGFP4 позволяло объединить функции ОРН и возможности флуоресцентного белка как свидетеля процесса гидролиза ФОС под действием OPH. Для создания гибридных белков, состоящих из молекул OPH и deGFP4, использовалось два разных спейсера Ц(RA)5Ц и Ц(AS)5Ц, состоящих, соответственно, из остатков аргинина и аланина или аланина и серина. Их выбор предопределялся тем, что первый межмолекулярный спейсер приводил к образованию устойчивой -спирали, а второй формировал свободную структуру.
Также в работе был получен белок His6-OPH, в котором на 100% были заменены четыре из пяти остатков Tyr на F-Tyr, и на 90% такая же замена была у пятого остатка тирозина, что было подтверждено масс-спектрометрически (методом MALDI-TOF). Интерес к получению белков, содержащих фторированные аминокислоты, объясняется возможностью решения ряда фундаментальных задач в области изучения структуры белка и ее взаимосвязи со свойствами, а также возможным практическим получением и применением таких белков.
Была проведена оптимизация условий синтеза всех производных ОРН в подобранных для них штаммах клеток E.coli. Максимальные уровени накопления каталитически активной биомассы клеток, содержащих рекомбинантые белки His6OPH, His12-OPH и белки с deGFP4-партнером ОРН, были получены при использовании штамма E.coli SG13009[pREP4] в качестве продуцента. Клетки E.coli DH5 оказались лучшими продуцентами белка ОРН-His6. Плазмидные ДНК, кодирующие синтез новых гибридных белков, а также штаммы, продуцирующие их, были защищены Патентами РФ № 2232807 (2004) и №2255975 (2005) ввиду их оригинальности и высокой продуктивности по белкам с ОРН-активностью. Далее именно эти штаммы использовались для накопления биомассы клеток, последующей их иммобилизации или выделения из них белков и изучения их каталитических характеристик.
Исследование физико-химических и каталитических характеристик 7 новых рекомбинантных белков (табл.14 и 15), выделенных и очищенных до гомогенного состояния, в реакциях гидролиза различных ФОС, позволило отдать предпочтение ОРН и His6-OPH, исходя из высокой каталитической эффективности действия самих ферментов, а также характеристик роста их продуцентов. Уникальный фермент His6-OPH проявлял высокую гидролитическую активность не только по отношению к пестицидам, но и к фосфорорганическим отравляющим веществам (ФОВ) в сравнении с ОРН. В этой связи он представлял большой интерес как катализатор процессов биодеструкции остаточных концентраций ФОВ, содержащихся в реакционных массах, получаемых после химического уничтожения ФОВ, проводимого в РФ согласно Международной конвенции о химическом разоружении. Именно для продуцента этого фермента были проведены дополнительные исследования по оптимизации условий его культивирования, показана целесообразность использования дробного введения индуктора синтеза рекомбинантного белка в среду культивирования. В результате были получены клетки с удельной ОРН-активностью, равной 950 ед/г, а общий выход по активности составил 10000 ед/л. Эти данные в 100 раз превышают аналогичные характеристики рекомбинантных клеток-продукцентов ОРН, известных из литературы.
Таблица 14. Кинетические параметры реакций, катализируемых OPH и разными производными этого фермента при следующих условиях: в 0,1 M CHES-буфере (pH 9,0) для OPH и в 0,1 M карбонатном буфере (pH 10,5) для полигистидинсодержащих аналогов OPH, соответственно (н/и - не исследовалось).
Субстрат Параметр Фермент Параоксон Паратион Метилпаратион OPH 4900 100 620 40 75 His6-OPH 5100 100 530 30 310 Vmax OPH- His6 3680 100 390 20 230 /[Eo], His12-OPH 4320 100 1850 30 1230 с-F-Tyr-OPH 125 10 н/и н/и His6-deGFP4-(RA)5-OPH 25 2 н/и н/и His6-deGFP4-(AS)5-OPH 56 5 н/и н/и OPH 16 0,5 60 1,0 210 His6-OPH 10 0,5 15 0,5 73 2,OPH- His6 113 15 94 3,7 71 2,Km, His12-OPH 60 0,5 7 0,5 47 2,мкM F-Tyr-OPH 104 5 н/и н/и His6-deGFP4-(RA)5-OPH 130 8 н/и н/и His6-deGFP4-(AS)5-OPH 200 12 н/и н/и OPH (3,0 0,2)108 (8,8 0,4)106 (3,5 0,2)1His6-OPH (5,1 0,3)108 (5,0 0,3)107 (4,2 0,2)1Vmax OPH- His6 (2,1 0,2)107 (4,1 0,3)106 (3,2 0,2)1/([Eo]Km) His12-OPH (7,2 0,3)107 (2,6 0,3)108 (2,6 0,2)1M-1 с-F-Tyr-OPH (1,2 0,1) 106 н/и н/и His6-deGFP4-(RA)5-OPH (1,9 0,2)105 н/и н/и His6-deGFP4-(AS)5-OPH (2,8 0,4)105 н/и н/и Таблица 15. Результаты исследования ферментативного гидролиза фосфорорганических отравляющих веществ, проведенного с использованием ферментов His6-OPH и ОРН.
Vmax/([Eo]Km), M-1мин-1 для OPH Vmax/([Eo]Km), M-1мин-1 для His6-OPH ФОВ pH 7,5 pH 9,2 pH 7,5 pH 9,*ДФФ (1,9 0,8) x 108 (3,0 0,4) x 108 (0,6 0,1) x 106 (4,2 0,8) x 10Vx (8,7 0,9) x 106 ** (19 0,6) x 107 ** Зарин (3,0 0,1) x 107 ** (20 0,1) x 10 ** *ДФФ- диизопропилфторфосфат ** - исследования в этих условиях не проводились, Были разработаны ГБК на основе клеток-продуцентов ОРН и His6-OPH, иммобилизованных в криогель ПВС. Установлено, что ГБК с ОРН-активностью, впервые полученные в данной работе, обладают существенно улучшенными характеристиками в сравнении с известными аналогами (табл.16), а именно, ГБК, созданными на основе рекомбинантных ИмК E.coli c локализацией ОРН в периплазме [Hong M.S., 1998].
Таблица 16. Каталитические характеристики ГБК на основе ИмК с ОРН-активностью в реакции гидролиза Параоксона.
Иммобилизованные Kmэфф, Снижение остаточной ОРН-активности Aктивность, клетки мM после 90 сут. хранения ГБК ед/г ГБК E.coli c OPH 1,95 20 % [Hong M.S., 1998] 16,E.coli c His6-OPH 0,94 0,05 125,0 8,5 5 %(Данная работа) Для новых ГБК была продемонстирована высокая стабильность каталитических характеристик при хранении (табл.17) и многократном использовании в реакциях гидролиза различных пестицидов (Параоксона, Паратиона и Кумафоса): лишь 5%-ное снижение исходной активности после рабочих циклов в периодических условиях, тогда как у аналогов - 20%-ное снижение после 6 рабочих циклов [Kim J.-W., 2002].
Известно, что наиболее эффективно задачи по глубокому разложению пестицидов в природе могут решаться сложными по составу микробными консорциумами, в которых, как правило, продукты метаболизма одной культуры являются субстратами для другой. В данной работе были проведены исследования, направленные на создание искусственного консорциума на основе ИмК разных микроорганизмов, способных совместно осуществлять глубокое и эффективное разложение фосфорорганических пестицидов.
В соответствии с общей схемой разложения пестицида Паратиона (ПТ) (рис.14), для гидролиза ПТ на начальной стадии функционирования искусственного консорциума были выбраны клетки E.coli DH5 с ОРНактивностью. Для разложения р-нитрофенола (ПНФ), являющегося продуктом ферментативного гидролиза ПТ, применялись клетки Pseudomonas putida В-1091.
S E. coli DH5 N O H NOO P O EtO p-нитрофенол OEt Pseudomonas паратион putida OH + Pseudomonas fluorescens COOH OH COOH H OH O Цикл Кребса 1,2,4-бензенотриол гидрохинон малеилацетат O OH Рис.14. Принципиальная схема разложения паратиона под действием искусственного консорциума, полученного на основе ИмК разных микроорганизмов.
Исходно предполагалось, что клетки Е.coli в данной биокаталитической системе могут способствовать общему сдвигу химического равновесия в сторону образования конечных продуктов при разложении ПТ и ПНФ, так как часть метаболитов клеток P. putida могла ими использоваться для поддержания собственной жизнеспособности. Известно, что в природных консорциумах, осуществляющих разложение ФОС, часто присутствует несколько штаммов рода Pseudomonas, которые выполняют ту же функцию. В этой связи был проведен скрининг и отобраны 2 штамма клеток P. fluorescens, которые ускоряли процесс деструкции ПНФ при их введении в среду с клетками P. putida (рис.15).
Было доказано, что выбранные культуры действительно могут сосуществовать в составе создаваемого консорциума, и скорость разложения ПНФ, как лимитирующей стадии всего процесса, может быть увеличена в 2 раза (0,75 мкМ/мин) под действием нескольких культур в сравнении с результатами, получаемыми при использовании одной культуры P. putida (0,38 мкМ/мин) (рис.15). Оптимизация состава искусственного консорциума, состоящего из 4-х культур, позволила установить массовые соотношения клеток, обеспечивающие максимальную скорость деградации ПНФ, а именно: P. putida В-1091 : E. coli DH5 : P. fluorescens В-473 : P. fluorescens В-495 = 2:1:1:2. Оптимальная общая концентрация клеток в реакционной среде составила 30 г/л. Был создан ГБК на основе криогеля ПВС и оптимизированной по составу комплексной системы, состоящей из 4-х бактериальных культур, и испытан в экспериментах по разложению ПНФ и ПТ (рис.16). Максимальная скорость разложения ПНФ под действием иммобилизованного консорциума оптимизированного состава составила 1,12 мкМ/мин и была в 3 раза больше той, что характерна для индивидуальной культуры P. putida. К тому же эта скорость разложения ПНФ почти была равна той скорости разложения ПТ, которую обеспечивали клетки E. coli DH5 в составе консорциума на первой стадии процесса (1,2 мкМ/мин).
При разложении ПТ в периодических условиях было показано, что на втором цикле функционирования ИмК вышли на максимальную скорость процесса и сохраняли ее далее практически без изменения в течение 2 месяцев, пока эксперимент не был остановлен. Разработанный ГБК на основе искусственного консорциума обеспечивал разложение 0,5 мМ ПТ в течение 7 ч (рис.16).
Таким образом, создание искусственного консорциума позволило получить легко возобновляемую комплексную биокаталитическую систему оптимизированного состава, а иммобилизация клеток послужила средством стабилизации созданной системы, позволяющим поддерживать ее состав и высокие концентрации клеток в реакторе.
Контроль - только клетки P.putida Рис.15. Влияние различных дополнительно Рис. 16. Деградация 0,5 мМ Паратиона введенных культур ( - E. coli DH5, (ПТ) под действием разработанного ГБК - P. fluorescens В-473, - P. fluorescens В-495) на основе искусственного консорциума:
на скорость разложения p-нитрофенола (ПНФ) - первый и - второй циклы работы под действием ГБК на основе ИмК P. putida. ГБК.
В работе также была показана возможность многократного использования (циклов без изменения величины отклика) разработанного ГБК на основе ИмК E.coli DH5 с ОРН-активностью для целей прямой детекции ФОС в водных средах на примере пестицида Параоксона. Для регистрации продуктов ферментативной гидролитической реакции использовался потенциометрический метод, поскольку при гидролизе ФОС под действием ОРН всегда появляются H+-ионы и наблюдается снижение рН, пропорциональное концентрации гидролизованного субстрата. Была установлена линейная зависимость величины сдвига рН от концентрации Параоксона, гидролизованного под действием ИмК в диапазоне концентраций (0,510)х10-5 М.
Сравнительный анализ каталитической активности ГБК на основе ИмК с ОРНактивностью (125 ед/г - табл. 17) и препаратов иммобилизованных ферментов, также разработанных в ходе выполнения данной работы (табл.17), свидетельствует о том, что в ряде случаев ГБК на основе клеток с моноферментной активностью не уступает и даже превосходит препараты, полученные на основе ферментов, особенно в тех случаях, где применялась ковалентная иммобилизация.
Таблица 17. Различные ГБК, разработанные в рамках данной работы на основе иммобилизованных ферментов с ОРН-активностью.
Активность по Фермент Метод иммобилизации и носитель Предназначение Параоксону, ед/г Координационная иммобилизация на металл-хелатирующем носителе - His6-ОРН, криогеле полиакриламида, 200 His12-ОРН модифицированном остатками Гидролиз ФОС в иминодиуксусной кислоты и проточных заряженном ионами Cu2+ или Co2+ системах Ковалентная иммобилизация на криогеле ПВС, модифицированном 54 глутаровым альдегидом Ковалентная иммобилизация на Дискриминационный химически активированной анализ ФОС в водных 26 ОРН поверхности силикагеля средах Удаление ФОС с Ковалентная иммобилизация в различных твердых составе композиционного материала, поверхностей (включая 225 включающего в себя тканевую кожные покровы) и их основу и сульфатхитозановый гель гидролиз Составная часть Сорбция в полимерном сорбенте, многослойного His6-ОРН представляющем собой сополимер самодегазирующегося 170 акриловой кислоты и акриламида защитного материала от воздействия ФОВ Учитывая, что для иммобилизации ферментов необходимы дополнительные стадии по их выделению, а также тот факт, что при иммобилизации ферментов сохранение их каталитической активности бывает далеко от 100%, в отличие от иммобилизации клеток включением в криогель ПВС, то экономическая сторона вопроса становится более привлекательной в случае ИмК с ОРН-активностью.
Также применение ИмК с моноферментной активностью, несомненно, более целесообразно, если речь идет об участии в составе искусственных консорциумов, так как ИмК E.coli, содержащие ОРН, в данном случае являются полноценными участниками процесса глубокого разложения ФОС, в котором задействован весь их метаболический аппарат, а не одна моноферментная активность.
ГЛАВА 5. НОВЫЕ ГБК, РАЗРАБОТАННЫЕ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ, В РАЗЛИЧНЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ Согласно представленным в данной работе результатам, при решении научнопрактических задач было разработано 25 различных ГБК на основе разнообразных ИмК микроорганизмов (табл.18). Четыре разработанных ГБК будут рассмотрены подробно ввиду значимости, катализируемых ими процессов, а именно, получение этанола из отходов сельского хозяйства и промышленности, получение L(+) молочной кислоты, очистка жиросодержащих сточных вод и биоразложение фосфорсодержащих компонентов реакционных масс, получаемых при химическом уничтожении ФОВ.
Таблица 18. ГБК, разработанные на основе ИмК различных микроорганизмов № Микроорганизмы Назначение ГБК на основе ИмК Получение новых ГБК на основе иммобилизованных компетентных клеток 2 Разложение фосфорорганических нейротоксинов Escherichia coli 3 Детекция фосфорорганических пестицидов Искусственный консорциум для глубокого разложения Pseudomonas putida фосфорорганических пестицидов Pseudomonas fluorescence Pseudomonas fluorescence 5 Pseudomonas sp.78Г Разложение метилфосфоновой кислоты и ее эфиров Деградация тиодигликоля - 6 Alcaligenes xylosoxidans продукта разложения горчичного газа (иприта) 7 Rhodobacter capsulatus Получение водорода Methilosynus sporium Получение метанола в результате биохимического Methilosynus trichosporium окисления метана 9 Rhizopus oryzae Получение L(+)- молочной кислоты 10 Lactobacillus casei 11 Sacharomyces cerevisiae Получение высокосортного шампанского 12 Rhizopus oryzae Очистка стоков предприятий пищевой промышленности 13 Sacharomyces vinii Получение красного и белого вина 14 S. cerevisiae boyanus Устранение винных недобродов 15 Получение этанола из молочной сыворотки Sacharomyces cerevisiae Mucor circinelloides Получение этанола из отходов сельского хозяйства и 17 Rhizopus oryzae промышленности Fusarium oxysporium 18 Zymomonas mobilis Aspergillus awamory Aspergillus niger Rhizopus oryzae Получение гидролитических ферментов Aspergillus foetidus 20 Heleococcum alkalinum Streptococcus thermophilus Получение пробиотической композиции для ее введения в функциональные пищевые продукты Lactobacillus acidophilus 22 Streptomyces anulatus Получение антибиотика аурантина 23 Streptomyces albogriseolus Получение глюкозо-фруктозных сиропов 24 Photobacter phosphoreum Chlorella sp. Определение присутствия экотоксикантов Thallassiosira weisflogii 5.1. ГБК на основе ИмК микроорганизмов для получения топливного этанола из различных отходов промышленности и сельского хозяйства Продемонстрирована возможность продолжительного использования ГБК на основе ИмК дрожжей S.cerevisiae для конверсии в этанол моносахаридов, содержащихся в творожной сыворотке как результат ферментативного гидролиза лактозы под действием -галактозидазы. Процесс получения этанола проводился как с использованием предварительно полученных ферментативных гидролизатов творожной сыворотки, так и совмещался с ферментативным гидролизом лактозы в одну стадию (табл.19). Показано, что максимальная концентрация этанола в сыворотке (~22 г/л) накапливается к 20 часу совмещенного процесса, что составляет ~ 90% от теоретически возможного выхода, который на 20% выше, чем в 2-х-стадийном процессе получения этанола. Степень гидролиза лактозы в совмещенном процессе составляет ~ 80% (табл.19) вместо 70% при проведении 2х-стадийного процесса. ГБК обеспечивал в каждом рабочем цикле периодического процесса получение этанола на 30% больше, чем свободные клетки. Интегральная этанольная продуктивность ИмК за 10 рабочих циклов превысила ту же характеристику у свободных клеток в 14 раз.
Таблица 19. Результаты длительного использования ИмК дрожжей S.cerevisiae в совмещенном процессе ферментативного гидролиза лактозы и конверсии глюкозы в этанол в творожной сыворотке.
Клетки № Продолжи- Степень Конечная Выход этанола, дрожжей цикла тельность конверсии концентрация % от теорет.
совмещенного лактозы, этанола, г/л возможного процесса, ч % уровня 1 22 80 22,0 2 20 78 20,8 3 22 81 23,1 4 23 82 23,6 5 24 82 22,8 Иммобили6 23 80 21,8 зованные 7 22 80 21,3 8 22 78 22,2 9 23 80 21,1 10 25 81 21,3 Средние значения 22 3 80,2 1,8 22,01,1 89,6 4,Свободные 1 цикл 21 1 75 2 15,6 0,5 68 Высоко эффективным оказалось применение ГБК на основе ИмК S. bayanus для получения этанола из гексоз, содержащихся в составе ферментативных гидролизатов полисахаридного сырья, представляющего собой разнообразные отходы сельского хозяйства и промышленности (табл.20). Показано, что на выход конечного продукта, получаемого под действием ГБК, прежде всего, влияют тип используемого для ферментативной обработки сырья и состав ферментных комплексов, которыми обрабатывается сырье, а также условия проведения процесса ферментативной обработки сырья (концентрации субстрата и ферментов, темпратура и рН процесса, его длительность). Во всех экспериментах ГБК на основе ИмК обеспечивал конечные концентрации этанола и его выход более высокие, чем свободные клетки. Впервые была установлена возможность получения этанола, к тому же в высоких концентрациях за 1 сут., под действием ГБК на основе ИмК дрожжей из ферментативно предобработанных отходов переработки сои (табл.20). Наиболее эффективным применение ГБК было в процессе, объединяющем стадию ферментативного осахаривания сырья и конверсию полученных сахаров в этанол, так как это позволяло существенно (для отдельных субстратов - в 3 раза) сократить длительность процесса в целом или значительно улучшить результат по достигаемой концентрации этанола в среде и по его выходу.
Впервые была выявлена возможность применения ГБК на основе ИмК мицелиальных грибов в процессах трансформации различных сахаров в этанол, в том числе в процессе, совмещающем ферментативную обработку целлюлозосодержащего сырья и конверсию сахаров в этанол (табл.21). Выходы этанола в некоторых средах превышали теоретически возможные уровни, рассчитанные исходя из концентрации конвертируемой глюкозы. Эти превышения ожидаемых концентраций этанола появлялись за счет конверсии пентоз в этанол, в частности, арабинозы, в средах с тростниковым и свекловичным жомом (табл.21).
Таблица 20. Концентрация и выход этилового спирта в результате конверсии моносахаридов, содержащихся в ферментализатах различных отходов сельского хозяйства и промышленности, иммобилизованными в криогель ПВС и свободным клетками дрожжей Saccharomyces bayanus.
Длительность *Ферментный Свободные Иммобилизованные процесса, препарат, клетки клетки Субстрат исходная использованный Этанол, Выход, Этанол, Выход, концентрация для предобработки г/л % г/л % субстрата сырья Отходы 24 ч, нет 31,6 55,7 33,2 58,переработки сои 265 г сух.в-в/л -галактозидаза 50,50 85,0 53,7 90,Тростник.жом 8,7 92,0 9,0 95,Пергамент 90 ч, 10,3 91,9 10,8 94,BIOACE 50 г сух.в-в/л Пшеничная 11,1 87,8 11,7 92,солома **Неосветленный ферментализат Свекловичный 96 ч, B-221-151 и 6,6 36,6 13,1 72,жом 50 г сух.в-в/л Abf(A)-44 Осветленный ферментализат 8,2 45,3 15,0 82,В1 3,4 39,0 4,0 45,Кукурузная 24 ч, В1 и PCA 4,2 48,7 6,50 74,кочерыжка 50 г сух.в-в/л Spezyme CP 5,1 58,5 8,2 94,B1 и Novozyme 188 7,6 87,4 8,6 98,*BIOACE - комплексный препарат целлюлаз, продуцируемых клетками Trihoderma reesei; B1 - комплекс целлюлаз из Penicillium verruculosum; B-221-151 - целлюлазы, продуцируемые грибом рода Penicillium, PCA - полигалактуроназа из Penicillium сanescens; Abf(A)-44 - арабиноксилогидролаза, выделенная из Penicillium сanescens; Spezyme CP - комплекс целлюлаз (Genencor, США), Novozyme 188 - -глюкозидаза (Novozymes, Дания).**Ферментализат не подвергался отделению взвешенных частиц.
Таблица 21. Применение клеток мицелиальных грибов, свободных и иммобилизованных в криогель ПВС, для получения этанола из различных ферментативно предобработанных образцов целлюлозосодержаего сырья Глюкоза (г/л) после Клетки Этанол, Выход от Исходное сырье, ферментативной г/л теор.возм., мицелиальный гриб предобработки % Тростниковый жом Свободные 3,9 41,18,Mucor circinelloides Иммобилизованные 11,0 117,Пшеничная солома, Свободные 0,4 3,Mucor circinelloides Иммобилизованные 9,0 73,Свекловичный жом, Свободные 6,9 104,Mucor circinelloides Иммобилизованные 9,1 137,Пергамент, Свободные 1,4 11,Rhyzopus oryzae Иммобилизованные 9,1 77,Иммобилизованная форма оказалась крайне важной для мицелиальных грибов в процессе получения этанола, так как концентрации конечного продукта, получаемого с использованием ГБК, были выше до 22,5 раз по сравнению со свободными клетками (табл.21). Вместе с этим ИмК мицелиальных грибов обладали существенно меньшими скоростями продуцирования этанола по сравнению с ИмК дрожжей.
5.2. ГБК на основе ИмК мицелиального гриба в процессе получения L(+)-МК Разработанный ГБК на основе ИмК мицелиального гриба R. оryzae обладает лучшими каталитическими характеристиками в процессе конверсии глюкозы в молочную кислоту (МК) в сравнении с традиционно применяемыми продуцентами МК - клетками бактерий (табл.22). В этой связи была исследована эффективность его применения в процессе получения МК при варьировании условий проведения процесса (рис.17, табл.23).
Таблица 22. Каталитические константы свободных (СвК) и иммобилизованных (ИмК) в криогель ПВС клеток мицелиального гриба R. oryzae и бактерий Lactobacillus сasei в процессе получения МК из глюкозы в периодическом режиме СвК ИмК СвК ИмК Константа R. oryzae R. oryzae L. сasei L. сasei Максимальная скорость конверсии - Vm, г/л/ч 71 102 91 7Константа сродства к субстрату - Ks, г/л 272 261 211 21Константа ингибирования субстратом -Kis, г/л 3128 3467 1704 211Константа ингибирования продуктом - Kip, г/л 634 773 212 33I II а б в г Рис. 17. Кинетика процесса получения молочной кислоты при использовании ГБК на основе ИмК гриба R. oryzae в периодическом процессе (I) и в периодическом процессе с подпитками субстратом (II) (основной субстрат: а-б - глюкоза, в-г - глюкозосодержащие кислотные гидролизаты крахмала), Для б,г: 1 - концентрация молочной кислоты, 2 - концентрация глюкозы.
Стрелками отмечена замена питательной среды в реакторе с ГБК или внесение подпиток.
Было показано, что проведение процесса получения МК из глюкозы (или из глюкозосодержащих кислотных гидролизатов крахмала) в периодическом режиме культивирования ИмК R. oryzae (с подпитками субстратом и без) позволяет направлено влиять на характеристики процесса: либо обеспечивать высокую продуктивность процесса и самого ГБК (при периодическом культивировании), либо получать высокую концентрацию накапливающегося конечного продукта (при культивировании с подпитками субстратом).
Таблица 23. Характеристики периодического процесса получения молочной кислоты с внесением подпиток субстратом и без них при использовании ГБК на основе ИмК R. oryzae Исходная концентрация МКмах, Выход *Скорость *Продуктивность субстрата, г/л г/л МК, % накопления МК, г/л/ч ГБК, г МК/(ч/кг БК) Субстрат - глюкоза 100 ** 972 972 6,40,1 58120 ** 1134 944 6,20,4 60100 (270) *** 1732 641 2,80,2 43120 (297) *** 1846 622 2,40,2 37Субстрат - кислотный гидролизат крахмала 85 ** 502 592 1,60,2 24110 ** 575 524 1,80,4 2770 (200) *** 1262 632 1,70,2 22110 (244) *** 1393 571 1,00,1 16*Указаны начальные значения параметров **Периодический режим ***Периодический режим с подпитками субстратом. В скобках указано общее количество глюкозы в среде, внесенное при проведении периодического процесса с подпитками субстратом.
Было проведено масштабирование процесса получения МК с помощью ГБК на основе ИмК мицелиального гриба в условиях 5 л- реактора, а с использовнием полученных при культивировании МК-содержащих сред был разработан и запатентован эффективный способ получения высококонцентрированных очищенных растворов МК и её солей (Полож. решение о выдаче Патента РФ по заявке на изобретение № 2007135662 (30.10.2008). Способ заключался в нанесении культуральной жидкости на анионит АВ-17-8-чс, имеющий Cl- или ОН- форму, элюировании сорбированных лактат-ионов с носителя при 18-28С раствором NaCl или HCl со скоростью до 10 объемов носителя/ч с последующим пропусканием полученных элюатов через слой активированного угля со скоростью до 24 объемов носителя/ч и их концентрированием методом вакуумного выпаривания при 30-40С до концентрации 800-900 г/л. В соответствии с этим способом были наработаны образцы 80% МК и 90% лактата натрия.
Следует отметить, что сам ГБК на основе ИмК мицелиального гриба Rhizopus oryzae, способ его получения и способ получения МК с использованием этого ГБК защищены Патентом РФ № 2253677 (2005), рыночная стоимость которого, согласно экспертной оценке (ООО Спонк), на конец 2007 г. составила 2,4 млн.
рублей.
5.3. Применение ГБК, полученного на основе ИмК гриба R. oryzae, секретирующих гидролитические ферменты, в процессе очистки сточных вод предприятий пищевой промышленности Интенсификация и повышение эффективности биологической очистки сточных вод предприятий пищевой промышленности могут быть достигнуты за счет использования ГБК на основе ИмК мицелиальных грибов, осуществляющих секрецию различных гидролитических ферментов, при использовании этих сточных вод в качестве сред для культивирования ИмК. В работе исследовалась возможность эффективного и длительного использования ГБК на основе ИмК R. oryzae, способных в зависимости от состава среды культивирования осуществлять биосентез и секрецию различных гидролитических ферментов (п.2.2), для биологической обработки модельных сточных вод пищевой промышленности, имеющих различный химический состав (табл. 24).
Таблица 24. Результаты обработки модельных сточных вод иммобилизованным ГБК на основе ИмК R. oryzae в ходе одного рабочего цикла (24 ч, 280С).
№ Модельная среда пищевого Концентрация, г/л ХПК, г/л производства жиры углеводы белки исход- после удаление но обработки ХПК,% 1 Молокоперерабатывающее 2 25 1 11,0 2,6 76,(производство сливочного масла) 2 Переработка мяса птицы 5 - 0,9 3,3 1,1 66,3 Майонезное производство 21 3,7 0,2 9,6 2,5 74,4 Маргариновое производство 2 5 0,1 2,7 0,8 70,5 Молокоперерабатывающее 21 45 0,5 8,2 3,3 60,(цех по производству сметаны) 6 Переработка мясных паштетов 5 30 20 11,9 3,0 74,7 Производство мясных консервов 7 15 5 9,8 2,2 78,8 Производство картофельных чипсов 8 50 20 12,6 4,2 76,Смешанные стоки молочной 18 15 2 9,2 3,0 67,промышленности 10 Производство соевого белка 1 8 0,9 3,3 0,7 78,При использовании ГБК для обработки всех вариантов сред в течение 700 ч увеличение концентрации иммобилизованной биомассы не превысило 10-15%.
Уровни контролируемых ферментативных активностей (липолитической, амилолитической и протеолитической) зависели от состава сред культивирования.
Наблюдалось 60-78%-е снижение ХПК, не зависимо от исходного состава модельной сточной воды, за один рабочий цикл (24 ч) (табл. 24), при этом концентрация жиров в сточных водах с исходном содержанием вплоть до 21 г/л снижалась на 92-98% за 24 ч под действием использованного ГБК, тогда как для достижения подобных результатов с использованием известных аналогов при исходной концентрации жиров не более 8 г/л требовалась обработка сточных вод в течение, как минимум, 48 ч. Высокий уровень концентрации АТФ в ИмК подтверждал их активное метаболическое состояние и их способность не только синтезировать и секретировать гидролитические ферменты в течение длительного периода времени (расчетный период полуинактивации этого ГБК в процессе обработки различных модельных сточных вод в среднем составил 41 сут.), но и утилизировать продукты ферментативного гидролиза компонентов среды.
На практике обработка сточных вод с использованием разработанного ГБК может использоваться перед их подачей на основные стадии биологической очистки с применением аэробного активного ила, способствуя повышению скорости и эффективности такой очистки, сокращению объемов стоков, направляемых на обработку активным илом, и продлению срока использования самого активного ила. Новизна и высокая эффективность действия разработанного ГБК на основе ИмК мицелиального гриба Rhizopus oryzae составили основу Патента РФ №2315102 (2007).
5.4. ГБК в процессе биодеструкции ФОВ и продуктов их разложения Согласно Международным обязательствам РФ по химическому разоружению в России к 2012 г. должны быть уничтожены запасы фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ), половина из которых представлена наиболее токсичным веществом типа Vx (15,5 тыс.т). Согласно принятым в РФ технологиям химического уничтожения ФОВ, в получаемых реакционных массах (РМ) остается высокий процент неразложившихся нейротоксичных фосфорорганических соединений (ФОС), при этом их остаточные концентрации сильно различаются (табл. 25). Согласно международной конвенции по химическому разоружению, все ФОС, как наиболее токсичные компоненты РМ, должны быть максимально разложены, в том числе метилфосфоновая кислота (МФК), являющаяся продуктом разложения всех фосфонатов и, соответственно, предшественником синтеза ФОВ.
Кроме того, необходим универсальный способ разложения ФОС в составе обоих типов РМ.
Таблица 25. Реакционные массы, полученные в результате химического уничтожения вещества типа Vx по двум технологиям, принятым к использованию в РФ Компонент, вес. % *I (рН 11) *II (рН 4,5) Вещество типа Vx 0,0002 0,О,ОТ-диизобутиловый эфир метилфосфоновой кислоты (ДИБЭМФК) 12 О-изобутиловый эфир метилфосфоновой кислоты (ИБЭМФК) 20 54,2-N,NТ-диэтиламиноэтантиол 23 41,Изобутиловый спирт 10 0,вода 0,5 1,капролактам N-метилпирролидон Изобутилат калия 1,*I- РМ-РД-4М (реакционные массы, полученные по рецептуре дегазации №4М) [Уткин А.Ю., 2007];
II - РМ-ГД (реакционные массы, полученные гидролизной детоксикацией) [Заявка на патент РФ №2006133269, 2008] В работе для биоразложения фосфорорганических компонентов РМ вещества типа Vx использовался подход, основанный на последовательной обработке РМ препаратом фермента His6-OPH, (I-ая стадия, рис.18) который, как отмечалось ранее, проявлял высокую гидролитическую активность по отношению к ФОВ, взятым для разложения как в виде чистых веществ, так и в составе РМ (рис.
19), а далее ферментативные гидролизаты РМ обрабатывались ГБК, специально разработанным на основе ИмК Pseudomonas sp.78Г, способных осуществлять разложение МФК (II-ая стадия, рис.18, рис.20) и утилизировать фосфат, накапливающийся в среде с РМ после разложения всех ФОС, в качестве источника фосфора. При реализации II-ой стадии в среду деградации РМ дополнительно вводилась глюкоза как необходимый для ИмК источник углерода.
Рис. 18. Принципиальная схема биоразложения фосфорорганических компонентов РМ вещества типа Vx, использованная в работе и состоящая из трех основных стадий: I - разложение в составе РМ остаточных концентраций вещества типа Vx и эфиров МФК; II - разложение МФК, III - снижение уровня ХПК сточных вод под действием аэробного активного ила.
Рис. 20. Разложение метилфосфоновой Рис.19. Гидролиз 6х10-6 М зарина ( ) и 7х10-6 М кислоты (- 300 мг/л, - 200 мг/л) под вещества типа Vx ( ) под действием фермента действием иммобилизованных клеток His6-OPH в составе реакционных масс, Pseudomonas sp. 78Г.
получееных по технологии РМ-РД-4М (табл.26).
Было установлено, что клетки Pseudomonas sp.78Г, иммобилизованные в криогель ПВС, осуществляют 100%-ное разложение МФК в концентрации до 3мг/л со скоростью 7,2-7,5 мг/л/ч, что в 25 раз быстрее по сравнению со свободными клетками. При этом исходная концентрация МФК, которая может быть введена в реактор без риска снижения эффективности их каталитического действия, практически в 2 раза выше для ИмК, по сравнению со свободными клетками. Также была показана возможность реутилизации ГБК на основе ИмК, использованного в процессе разложения МФК. Характеристики ГБК, получаемого на основе вторично используемого раствора ПВС, который получается расплавлением гранул отработанного ГБК, отличаются от свежеприготовленного образца лишь повышенным содержанием белка, являющегося остаточным компонентом от предыдущей партии ИмК (табл.26).
Таблица 26. Характеристики образцов ГБК на основе ИмК, сформированных из свежеприготовленного раствора ПВС и повторно использованного, для разложения МФК.
ГБК, приготовленный с использованием Параметры сравнения первично приготовленного вторично раствора ПВС - используемого ПВС -АТФ, моль/г ГБК (2,01 0,11)10 (1,96 0,04)Белок, мг/г ГБК 1,97 0,05 6,51 0,Скорость разложения МФК 7,35 0,05 мг/л/ч 7,50 0,15 мг/л/ч Новизна и уникальность характеристик разработанного ГБК нашли свое отражение в заявке на Патент РФ №2007136007 (2007), получившей положительную поддержку со стороны ФИПС (Бюл №10, 2009).
Процесс двухстадийной обработки высокотоксичных РМ-ГД был оптимизирован в условиях пилотной установки. Для исследования стадии ферментативного гидролиза РМ (Vреактора=50 л) был наработан препарат фермента His6-OPH с активностью 5000 ед/мл в количестве 30 л, а для определения эффективности разложения МФК под действием ИмК Pseudomonas sp. 78Г на пилотной установке (Vреактора=650 л) было наработано 120 кг ГБК (рис.21).
Результаты разложения фосфонатов в составе РМ-ГД под действием фермента His6-OPH и ГБК (табл.27), показали, что основная доля всех фосфонатов подвергалась деструкции на ферментативной стадии обработки РМ, но ИмК, разлагая МФК и утилизируя фосфаты, способствовали сдвигу общего химического равновесия в системе в сторону образования конечного продукта (фосфата), что и обеспечивало в целом глубокое разложение ФОС в составе РМ. Показана возможность многократного применения одного и того же образца ГБК на основе ИмК Pseudomonas sp. для обработки РМ.
в б а Рис.21. Внешний вид препаратов, разработанных в рамках этой работы и наработанных для их применения на пилотной установке с целью биообработки реакционных масс, полученных после уничтожения ФОВ: а - ферментный препарат His6-OPH (Vтары=5л); б, в - ГБК на основе иммобилизованных клеток Pseudomonas sp. 78Г (Vтары=50 л).
Таблица 27. Достигаемая общая степень деструкции различных фосфорсодержащих компонентов РМ-ГД под действием фермента His6-OPH и ГБК на основе ИмК Pseudomonas sp.
78Г в процессе комплексного биоразложения.
Достигаемая общая степень разложения, % Стадия обработки ИБЭМФК ДИБЭМФК МФК Обработка ферментом 83 2 97 2 65 Обработка ГБК на основе ИмК 91 3 99 1 90 Процесс утилизации накапливающегося в среде фосфата и усвоения глюкозы ИмК сопровождался накоплением в среде метаболитов и увеличением уровня ХПК среды деградации РМ. Обработка такой среды аэробным активным илом (рис.18) позволила получить сточные воды, соответствующие по своим характеристикам нормам канализационного стока (табл.28).
Таблица 28. Состав сточных вод, обработанных аэробным активным илом после комплексного биоразложения ФОС в составе РМ-ГД под действием фермента His6-OPH и ГБК на основе ИмК Pseudomonas sp. 78Г Обнаруженная Контролируемый параметр ПДК для канализационного стока, мг/л концентрация, мг/л Азот (аммонийный) 38 2 20,Азот (нитрат) 5,9 0,3 10,Азот (нитрит) 3,6 0,4 1,Сульфаты 31 3 5Хлориды 30 1 3Фосфаты 2,5 0,4 1,Метилфосфоновая кислота < 0,1 - Изобутиловый эфир МФК < 0,1 - ХПК 460 9 5Экотоксичность < 20 Комплексная биологическая обработка РМ-ГД, содержащих 1 г/л вещества типа Vx (LD50 в 1500 раз!) и высокие концентрации различных фосфонатов (табл.25), была проведена в рамках этой работы впервые и представляет собой совершенно новый и уникальный биотехнологический процесс.
ВЫВОДЫ 1. Разработан универсальный научно-методологический подход к получению, оптимизации условий функционирования и хранения, а также мониторингу эффективности действия гетерогенных биокатализаторов (ГБК) на основе иммобилизованных клеток (ИмК) разных микроорганизмов: дрожжей, мицелиальных грибов и бактерий (грамположительных и грамотрицательных, аэробных и анаэробных, нативных и рекомбинантных, мезофильных и термофильных клеток, самоиммобилизованных в составе биопленок и искусственно иммобилизованных методом включения в полимерные носители).
Подход основан на оценке энергетического статуса ИмК по концентрации внутриклеточного АТФ, определяемой с использованием биолюминесцентного люциферин-люциферазного метода. Разработан способ дифференцированного определения клеток различных бактерий в составе ГБК на основе иммобилизованных смешанных культур, предусматривающий применение биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ.
2. Впервые показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования влияния различных факторов на кинетику развития смешанных культур в составе ГБК; установлены кинетические характеристики и закономерности формирования коррозионно-опасных биопленок в проточных системах; разработан подход к оценке биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к различным коррозионно-опасным биопленкам на основе биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ. Установлено, что на эффективность применения биоцидов с целью подавления развития коррозионно-опасных биопленок влияет стадия роста биопленок. Впервые определены минимальные ингибирующие концентрации для широко применяемых на практике ингибиторов коррозии, обладающих свойствами биоцидов, в отношении коррозионно-опасных биопленок разного микробного состава.
3. На примере ИмК дрожжей рода Saccharomyces показана возможность разработки универсального способа получения ГБК, предполагающего жесткое соблюдение условий подготовки клеток к иммобилизации, а также условий проведения самого процесса иммобилизации. Продемонстировано, что с использованием такого способа могут быть получены полифункциональные ГБК, имеющие высокую эффективность действия в различных биотехнологических процессах, связанных с конверсией сахаров в этанол.
4. Выявлены общие закономерности в формировании ГБК, получаемых на основе ИмК мицелиальных грибов, продуцирующих внеклеточные гидролазы, и показаны особенности изменения деформационных характеристик матрицы криогеля ПВС в присутствии таких ГБК на основе ИмК различных мицелиальных грибов при варьировании состава используемых сред для культивирования ИмК и длительности процесса применения ГБК. Установлена принципиальная возможность создания полифункциональных биокаталитических систем при использовании одного и того же исходного спорового материала, включенного в матрицу носителя. Показана возможность направленной индукции необходимых каталитических свойств ГБК, разрабатываемых на основе ИмК мицелиальных грибов, при варьировании состава среды культивирования. Продемонстрирована высокая стабильность каталитических свойств ГБК, полученных на основе ИмК различных мицелиальных грибов.
5. Впервые установлена возможность трансформации клеток в иммобилизованном состоянии плазмидной ДНК. Показано, что компетентные иммобилизованные клетки могут быть использованы для получения ГБК путем их трансформации различными генетическими конструкциями, что создает основу для разработки многофункциональных ГБК с новыми характеристиками на основе заранее иммобилизованных клеток.
6. Проведен критический анализ общих закономерностей изменения характеристик иммобилизованных клеток в сравнении со свободными, а также характерных особенностей функционирования ГБК на основе нативно и искусственно иммобилизованных клеток. Впервые выдвинута гипотеза о том, что в основе стабильного и длительного функционирования клеток в составе искусственно полученных ГБК лежит система регуляции экспрессии генов, чувствительная к концентрации клеток. Иммобилизация клеток в высоких концентрациях активирует проявления генетически запрограммированного ответа клеток, приводящего к устойчивому изменению их биохимического статуса.
Гипотеза основана на экспериментальных данных и расширяет представления о фундаментальных принципах, лежащих в основе закономерностей функционирования биокаталитических систем на основе иммобилизованных клеток.
7. Разработаны высокоэффективные генетические конструкции и рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие цитоплазматический биосинтез органофосфатгидролазы и ее генетически модифицированных аналогов, содержащих полигистидиновые последовательности, в растворимой и каталитически активной форме. Исследованы каталитические и физико-химические свойства новых белков. Наиболее привлекательным, с точки зрения применения для решения различных прикладных задач, оказался фермент органофосфатгидролаза с шестью остатками гистидина, генетически введенными на N-конец молекулы белка. Показана высокая эффективность его использования в процессах деструкции фосфорорганических отравляющих веществ и продуктов их деградации. Разработаны ГБК на основе клеток-продуцентов ферментов с активностью органофосфатгидролазы, показана целесообразность их использования как в виде биокаталитических систем с моноферментной активностью в процессах разложения и аналитической детекции фосфорорганических нейротоксинов, так и в виде метаболически активных клеток в составе искусственного иммобилизованного консорциума, предназначенного для комплексного разложения фосфорорганических пестицидов.
8. Разработана серия ГБК на основе ИмК микроорганизмов, обладающих уникальными каталитическими характеристиками (продуктивностью, способностью трансформировать высокие концентрации субстратов, длительной операционной стабильностью), превосходящими известные аналоги, которые могут быть рекомендованы к реализации в ряде биотехнологических процессов, в частности, для получения: топливного этанола из отходов промышленности и сельского хозяйства, получения L(+)-молочной кислоты, производства спиртосодержащих напитков, очистки сточных вод предприятий пищевой промышленности, биоаналитической детекции экотоксикантов, получения гидролитических ферментов, деградации фосфорорганических пестицидов и супертоксичных отравляющих веществ, в том числе в средах со сложным химическим составом, представляющих собой реакционные массы, полученные после химического уничтожения вещества типа Vx.
По материалам диссертации опубликовано всего 225 печатных работ, основные положения и результаты работы представлены в следующих публикациях (обозначения: ВАК - российский журнал из списка ВАК, IF - impact factor для иностранных журналов):
Обзоры 1. Ефременко Е.Н., Ямсков И.А., Мосичев М.С. (1990) Современные тенденции иммобилизации глюкозоизомеразы.// Обзор.информация- М.: ВНИИСЭНТИ Минмедбиопрома, Вып.2, 1990, 51 c.
2. Ефременко Е.Н, Сергеева В.С. (2001) Органофосфатгидролаза - фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов.// Изв.Акад.наук.
Сер.хим., №10, с.1743-1749. (ВАК) 3. Varfolomeyev S.D., Aliev T.K., Efremenko E.N. (2004) Post genomic chemistry: new problems and new challenges.// Pure Appl. Chemistry, V.76(9), p.1781-1798.(IF- 2,232) 4. Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов.//Успехи биол. химии, Т.44, 2004, с.307-340. (ВАК) 5. Varfolomeyev S., Efremenko E., Beletskaya I., Bertini I., Blackburn G.M., Bogdanov A., Cunin R., Eicjler J., Galaev I., Gladishev V., OТHagan D., Haertle T., Jarv J.,.Karyakin A, Kurochkin I., Mikolajczyk M., Poroykov V., Sakharov I., Spener F., Voyer N., Wild J. Postgenomic chemistry: // Pure Appl.Chem., 2005, V.77 (9), p.1641-1654. (IF- 2,232) 6. Efremenko E. N. (2006) Biocatalytic systems upon the immobilized cells degrading parathion and p-nitrophenol.// In book: Biocatalysis and Biocatalytic Technologies (Ed. Zaikov G.E.), Nova Science Publ. Inc., N.-Y., Ch.III, ISBN: 978-1-60021-041-4, p. 23-37.
7. Ефременко Е.Н., Лягин И.В., Завьялов В.В., Варфоломеев С.Д., Завьялова Н.В., Холстов В.И.
(2007) Ферменты в технологии уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ.// Рос.хим. ж. (Ж.Рос.хим. об-ва им.Д.И. Менделеева), Т.LI (2), с. 24-29. (ВАК) 8. Efremenko E.N., Lyagin I.V., Senko O.V., Stepanov N.A., Spiricheva O.V., Azizov R.E. (2007) Modern trends in application of immobilized cells for environmental bioremediation.// In book:
Leading-Edge Environmental Biodegradation (Ed.L.E. Pawley), Nova Science Publ. Inc., N.-Y., Ch.1, ISBN: 978-1-60021-903-0, p.11-51.
9. Efremenko E.N., Lyagin I.V., Senko O.V., Gudkov D.A., Varfolomeyev S.D. (2008) Application of gel systems with various biocatalysts detoxifying neurotoxic agents for pollution control, water purification, and self-defense. // In book: УSol-gel methods for materials processingФ Ser. NATO Science for Peace and Security (Eds: Innocenzi P., Zub Y.L, Kessler V.G.), ISBN: 978-1-40208521-5, p.77-89.
Экспериментальные статьи в журналах и книгах международных и российских изданий:
10. Ефременко Е.Н., Мосичев М.С., Ямсков И.А. (1991) Разработка условий получения стабилизированного препарата глюкозоизомеразы.// Биотехнология, №4, с.54-57. (ВАК) 11. Свириденко Ю.В., Смурыгин В.Ю., Абдуллаева Л.В., Ефременко Е.Н., Райнина Е.И. (1994) Закономерности совместного гидролиза и сбраживания молочной сыворотки.// Докл.РАСХН, №3, с.42-44. (ВАК) 12. Свириденко Ю.Я., Абдуллаева Л.В., Райнина Е.И., Ефременко Е.Н. (1994) Применение иммобилизованных дрожжей для сбраживания молочной сыворотки с гидролизованной лактозой.// Пищевая промышленность, №8, с.6-7. (ВАК) 13. Rainina E.I, Efremenсo E.N, Varfolomeyev S.D., Simonian A.L., Wild J.R. (1996) The development of a biosensor based on recombinant E.coli for the direct detection of organophosphorus neurotoxins.// Biosensors&Bioelectronics, V.11, №10, p.991-1000 (IF-5,061) 14. Rainina E.I., Kim J.W., Efremenko E.N, Engler C.R., Wild J.R. (1998) Degradation of thiodiglycol, the hydrolysis product of sulfur mustard with bacteria immobilized within poly(vinyl) alcohol cryogels.// Biotechnol. Lett., V.19, p.1067-1071. (IF-2,759) 15. Sergeeva V.S., Efremenko E.N., Kazankov G.M., Gladilin A.K., Varfolomeyev S.D. (1999) Kinetic behavior of phosphotriesterase and its non-covalent complexes with polyelectrolyte in systems with polar and non-polar organic solvents.// Biotech.Techniques,, V.13 (7), p.479-483. (IF-2,759) 16. Sergeeva V.S., Efremenko E.N., Kazankov G.M., Varfolomeyev S.D. (2000) Double effect of organic amines (activation and inhibition) on the phosphotriesterase.// J. Molec. Catalysis B:
Enzymatic, 10 (6), p.571-576. (IF- 1,973) 17. Efremenko E., Aliev T., Panina A., Badalian I., Varfolomeyev S. (2000) Genetic transformation of immobilized competent cells.// Appl. Biochem. Biotechn., 88 (1-3), p.107-117. (IF- 1,643) 18. Pojitkov A., Efremenko E., Varfolomeyev S. (2000) Unnatural amino acids in enzymes and proteins.// J. Molec. Catalysis B: Enzymatic, 10(1-3), p.47-55. (IF- 1,973) 19. Варфоломеев C.Д., Ефременко Е.Н., Верхуша В.В., Вржещ П.В. (2000) Синтетические аналоги аминокислот и свойства клеток и белков.// Вестник МГУ, Сер.2, Химия, т.41, №6, c.352-354. (ВАК) 20. Kazankov, G.M., Sergeeva, V.S., Efremenko, E.N., Alexandrova, L., Varfolomeyev, S.D., Ryabov, A.D. (2000) Highly efficient degradation of thiophosphate pesticides catalyzed by platinum and palladium aryl oxime metallacycles.// Angew.Chem.Int.Edit., 39 (7), р.3117-3119. (IF - 10,031) 21. Simonian A.L., Efremenko E.N., Wild J.R. (2001) Discriminative detection of neurotoxins in multicomponent samples.//Anal. Chim. Acta, 444(2), p.179-186. (IF - 3,186) 22. Efremenko E.N., Lozinsky V.I., Sergeeva V.S., Plieva F.M., Makhlis T.A., Kazankkov G.M., Gladilin A.K., Varfolomeyev S.D. (2002) Addition of polybrene improves stability of organophosphate hydrolase immobilized in poly(vinyl alcohol) cryogel carrier // J. Biochem.
Biophys. Methods, V. 51, p.195-201. (IF - 1,338) 23. Efremenko E., Azizov R., Makhlis T., Krupianko P., Varfolomeyev S. (2002) Bioluminescent method based on luciferase application for enumeration of oil-degrading microorganisms. // Proc.
Petrochem. Oil Refining, ISSN 1726-4685, V.1 (4), p.92-104.
24. Varfolomeyev S., Kurochkin I., Eremenko A., Efremenko E. (2002) Chemical and biological safety-biosensors and nanotechnological methods for the detection and monitoring of chemical and biological agents// Pure Appl. Chemistry, V.74 (12), p.2311-2316. (IF-2,232) 25. Нефедова Н.В., Семенов Г.В., Махлис Т.А., Ефременко Е.Н. (2003) К созданию продуктов питания с пробиотическими микрорганизмами.// Мясные технологии, Т.2 (2), с.10-11.
26. Efremenko E.N., Azizov R.E., Makhlis T.A., Varfolomeyev S.D., Abbasov V.M. (2003) Estimation of biocide activity of corrosion inhibitors by bioluminescent method.// Proc. Petrochem. Oil Refining, ISSN 1726-4685, V. 4 (15), p.70-75.
27. Efremenko E.N., Votchitseva Yu.A., Аliev T.K., Varfolomeyev S.D. (2004) Expression of recombinant organophosphorus hydrolase in active form.// In book: Biocatalytic technology and nanotechnology (Ed. G.E. Zaikov), Nova Science Publ. Inc, Ch.6, ISBN: 1-59454-117-5, p. 65-71.
28. Efremenko E.N., Spiricheva O.V., Veremeenko D.V., Lozinsky V.I. (2004) New approaches to the production of lactic acid: Biocatalyst on the base of immobilized fungi cells. // Chem. Industry, V.58, p. 116-117. (IF- 0,225) 29. Varfolomeyev S., Efremenko E., Krupyanko P., Vrjesch P. (2004) The influence of some unnatural amino acids on the growth of cell populations having different natures.// In book: Biocatalytic technology and nanotechnology, Ed.G.E. Zaikov, Nova Science Publ. Inc, Ch.10, ISBN: 1-59454117-5, p. 105-117.
30. Ефременко Е.Н., Азизов Р.Э., Махлис Т.А., Аббасов В.М., Варфоломеев С.Д. (2005) Определение биолюминесцентным методом минимальных ингибирующих концентраций веществ по отношению к бактериям, участвующим в биокоррозии // Прикл. биохим.
микробиол., T.41 (4), с. 429-434. (ВАК) 31. Efremenko E., Peregudov A., Kildeeva N., Perminov P., Varfolomeyev S. (2005) New enzymatic immobilized biocatalysts for detoxification of organophosphorus compounds.// Biocatalysis Biotransform., V. 23 (2), p.103-108. (IF- 0,907) 32. Efremenko E.N., Azizov R.E., Raeva A.A., Abbasov V.M., Varfolomeyev S.D. (2005) An approach to the rapid control of oil spill bioremediation by bioluminescent method of intracellular ATP determination // Intern. Biodeterior. Biodegr., 2005, V.56, p.94-100. (IF- 1,233) 33. Efremenko E., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. (2006) Purification of His6organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography //Appl. Microb. Biotech., V.70 (5), p.558-563. (IF- 2,441) 34. Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. (2006) Свойства гексагистидин-содержащей органофосфатгидролазы// Биохимия, Т.76 (2), с.216-222. (ВАК) 35. Гудков Д.А., Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н. (2006) Гидролиз параоксона, катализируемый органофосфатгидролазой, содержащей полигистидиновую последовательность на С-конце молекулы белка. // Вестник МГУ, сер. Хим., Т.47 (1), с.15-20. (ВАК) 36. Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. (2006) Введение в структуру белка неприродной аминокислоты: получение и свойства 3-фтортирозинсодержащей органофофсфатгидролазы.// Изв. Акад. наук. Сер.хим., №2, с.357-361. (ВАК) 37. Efremenko E.N., Azizov R.E., Abbasov V.M., Varfolomeyev S.D. (2006) Analysis of bacteria selfimmobilized into corrosive biofilms.// In book: Biocatalysis and Biocatalytic Technologies (Ed. G.E.
Zaikov), Nova Science Publ. Inc., N.-Y., Ch.IV, ISBN: 1-60021-041-4, p. 39-58.
38. Stepanov N.A., Efremenko E.N. (2006) Perspective heterogeneous biocatalyst for the wine fermentation.// In book: Biocatalysis and Biocatalytic Technologies (Ed. Zaikov G.E.), Nova Science Publ. Inc., N.-Y., Ch.VI, ISBN: 1-60021-041-4, p.67-75.
39. Efremenko E.N., Spiricheva O.V., Veremeenko D.V., Baibak A.V., Lozinsky V.I. (2006) L(+)lactic acid production using PVA-cryogel entrapped Rhizopus oryzae fungus cells. // J.Chem.Technol.Biotech., V.81, p. 519-522. (IF - 1,426) 40. Efremenko E.N., Spiricheva O.V., Lozinsky V.I., Varfolomeev S.D. (2006) Rhizopus oryzae fungus cells producing L(+)-lactic acid: kinetic and metabolic parameters of free and PVA-cryogelentrapped mycelium. // Appl. Microb. Biotech., V.72 (3), p.480-485. (IF- 2,441) 41. Efremenko E., Stepanov N., Martinenko N., Gracheva I. (2006) Cultivation conditions preferable for yeast cells to be immobilized into poly(vinyl alcohol) and used in bottled sparkling wine production.// Chem. Ind. Chem. Engin. Quart., ISSN 1451-9372, V.12 (1), p.18-23.
42. Степанов Н.А., Мартыненко Н.Н., Грачева И.М., Ефременко Е.Н. (2006) Применение иммобилизованных клеток дрожжей для производства спиртосодержащих напитков.// Изв.
Выс.Учеб. Заведений. Пищ.технология, № 6, с.45-47. (ВАК) 43. Efremenko E., Lyagin I., Votchitseva Y., Sirotkina M., Varfolomeyev S. (2007) Polyhistidinecontaining organophosphorus hydrolase with outstanding properties.// Biocatalysis Biotransform., V.
25 (1), p.103-108. (IF- 0,907) 44. Сенько О.В., Спиричева О.В., Лозинский В.И., Ефременко Е.Н. (2007) Иммобилизованный биокатализатор для очистки жиросодержащих сточных вод предприятий пищевой промышленности.// Катализ в промышленности, №1, с.55-61. (ВАК) 45. Спиричева О.В., Сенько О.В., Веремеенко Д.В., Ефременко Е.Н. (2007) Получение молочной кислоты с помощью иммобилизованных клеток гриба Rhizopus oryzae в периодическом режиме при одновременной экстракции продукта в органическую фазу.// Теорет. основы хим.
технологии, Т. 41 (2), с.161-165. (ВАК) 46. Ефременко Е.Н., Татаринова Н.Ю.(2007) Влияние длительного хранения клеток микроорганизмов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, на их выживаемость и биосинтез целевых метаболитов.// Микробиология, Т.76 (3), c.383-389. (ВАК) 47. Efremenko E., Lyagin I., Gudkov D., Varfolomeyev S.(2007) Immobilized biocatalysts for detoxification of neurotoxic organophosphorus compounds.// Biocatalysis Biotransform., V.25 (2-4), p.359-364. (IF- 0,907) 48. Гудков Д.А., Ефременко Е.Н. (2007) Рефолдинг гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы из телец включения.// Вестник МГУ, сер. Хим., Т.48 (6), с.389-394.
(ВАК) 49. Lyagin L., Gudkov D., Verkhusha V., Efremenko E. (2008) Genetic construct encoding the biosynthesis of N-His6-e-pHluorins-OPH in E.coli cells.// In book: Chemical and biochemical physics, kinetics and thermodynamics: new perspectives (Ed. G.E. Zaikov), Nova Science Publ.Inc., N.-Y., Ch.8, p.83-90.
50. Efremenko E.N., Senko O.V., Zubaerova D.H., Podorozhko E.A., Lozinsky V.I. (2008) Effective immobilized biocatalyst for the treatment of various food wastewaters.// In book: Biotechnology:
sate of the art and prospects for development (Ed. G.E.Zaikov), Nova Science Publ. Inc., N.-Y., Ch.11, ISBN: 978-1-60456-015-2, p.103-110.
51. Efremenko E.N., Lyagin I.V., Votchitseva Yu.V., Gudkov D.A., Peregudov A.A., Aliev T.K., Varfolomeev S.D. (2008) The influence of length and localization of polyhistidine tag in the molecule of organophosphorus hydrolase on the biosynthesis and behavior of fusion protein.// In book: Biotechnology: sate of the art and prospects for development (Ed. G.E.Zaikov), Nova Science Publ. Inc., N.-Y., Ch.10, ISBN: 978-1-60456-015-2, p.87-101.
52. Разумовский С.Д., Ефременко Е.Н., Сенько О.В., Махлис Т.А., Быховский М.Я., Подмастерьев В.В., Варфоломеев С.Д.(2008) Влияние иммобилизации на основные динамические характеристики реакции ферментативного оксиления метана в метанол бактериями рода Methylosinus sporium B-2121.// Изв. Акад.наук. Сер.хим., №8, с.1603-1606.
(ВАК) 53. Efremenko E., Senko O., Zubaerova D., Podorozhko E., Lozinsky V. (2008) New biocatalyst with multiple enzymatic activities for treatment of complex food wastewater.// Food Techn. Biotechn., V.
46 (2), p.208-212. (IF- 0,906) Авторские свидетельства на изобретения СССР и Патенты РФ на изобретения:
54. Ямсков И.А., Кожанова С.П., Ефременко Е.Н., Даванков В.А., Грачева И.М., Мосичев М.С.
Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью.// Авт. свид-во СССР №1634715, 1955. Ямсков И.А., Ефременко Е.Н., Мосичев М.С.Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью.// Авт. свид-во СССР №1731815, 1956. Нефедова Н.В., Семёнов Г.В., Ефременко Е.Н., Махлис Т.А. Способ получения иммобилизованной композиции функционального пищевого пробиотического желированного продукта, иммобилизованная композиция и функциональный продукт ее содержащий.// Патент РФ № 2229251 (27.05.2004), Бюл №15.
57. Варфоломеев С.Д., Ефременко Е.Н., Алиев Т.К., Вотчицева Ю.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrcTE-OPH и продуцент фермента органофосфатгидролазы// Патент РФ № 2232807 (20.07.2004), Бюл №20.
58. Ефременко Е.Н., Спиричева О.В., Варфоломеев С.Д., Синеокий С.П., Байбак А.В., Лозинский В. И. Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора // Патент РФ № 2253677 (10.06.2005); Бюл №16.
59. Ефременко Е.Н., Вотчитцева Ю.А., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. Рекомбинантная плазмидная ДНК рTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы.// Патент РФ № 2255975 (10.07.2005); Бюл №19.
60. Ефременко Е.Н., Азизов Р. Э., Махлис Т.А., Варфоломеев С.Д. Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах.// Патент РФ № 2263148 (27.10.2005), Бюл.№ 30.
61. Ефременко Е.Н., Кильдеева Н.Р., Перегудов А.А., Вихорева Г.А., Перминов П.А., Варфоломеев С.Д. Способ получения биокатализатора и биокатализатор для гидролиза фосфорорганических соединений.// Патент РФ №2261911 (10.10.2005) Бюл. № 28.
62. Ефременко Е.Н., Вотчицева Ю.А., Курочкин И.Н., Варфоломеев С.Д., Гачок И.В., Завьялова Н.В., Капашин В.П., Холстов В.И. Способ ферментативного гидролиза боевых отравляющих веществ.// Патент РФ № 2296164 (27.03.2007) Бюл. № 9.
63. Ефременко Е.Н., Сенько О.В., Спиричева О.А. Лозинский В.И., Варфоломеев С.Д.
Иммобилизованный биокатализатор для биологической очистки жиросодержащих сточных вод и способ его получения.// Патент РФ № 2315102 (20.01.2008) Бюл. № 2.
64. Ефременко Е.Н., Лягин И.В., Галаев И.Ю., Плиева Ф.М., Варфоломеев С.Д., Маттиассон Б.
Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах.// Патент РФ № 2315103 (20.01.2008) Бюл.
№ 2.
65. Ефременко Е.Н., Степанов Н.А., Мартыненко Н.Н., Грачева И.М. Способ получения иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор для производства спиртосодержащих напитков.// Патент РФ № 2322499 (20.04.2008) Бюл. № 11.
66. Ефременко Е.Н., Садраддинова Э.Р., Зотова Н.А., Нетрусов А.И. Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток фототрофных бактерий для получения водорода.// Патент РФ № 2323975 (10.05.2008) Бюл.№13.
67. Ефременко Е.Н., Завьялов В.В., Завьялова Н.В., Гореленков В.К., Гудков Д.А., Лягин И.В., Варфоломеев С.Д., Холстов В.И. Фильтрующесорбирующий самодегазирующийся материал для средств индивидуальной защиты от воздействия фосфорорганических соединений.// Патент РФ № 2330717 (10.08.2008) Бюл.№22.
68. Ефременко Е.Н., Лягин И.В., Сенько О.В., Спиричева О.В., Варфоломеев С.Д. Способ получения высоко концентрированных очищенных лактат-содержащих растворов.// Патент РФ № 2355766 (20.05.2009) Бюл.№14.
69. Ефременко Е.Н., Завьялова Н.В., Сенько О.В., Лобастов С.Л., Лягин И.В., Аксенов А.В., Варфоломеев С.Д. Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток бактерий для разложения метилфосфоновой кислоты и ее эфиров.// Положительное решение от 11.01.20о выдаче Патента РФ по заявке № 2007136007, опубл.10.04.2009, Бюл.10.
Избранные статьи в сборниках международных конференций 70. Rainina E., Harvey S., Efremenko E., Badalian I., Wild J. (1996) Construction of special consortia of сryoimmobilized microbial cells for multistep detoxification of neurotoxins from agricultural and munitions contamination.// V Intern. Workshop on Bioencapsulation, Potsdam, Germany, September 22-25, t.33 (p.97-99).
71. Aliev T., Efremenko E., Badalian I., Panina A., Varfolomeyev S., Wild J. (1997) Transformation of immobilized component cells instead of free cells and their use for protein expression.// VI Intern.
Workshop on Bioencapsulation, Barcelona, Spain, August 30-September 1, t.4 (p.19-21).
72. Rainina E., Makhlis T., Bachurina G., Efremenko E., Lozinsky V. (1997) Zymomonas mobilis cells entrapped into poly(vinyl alcohol) cryogel as the biocatalyst for the ethanol production from carbohydrate-containing wastes.// VI Intern. Workshop on Bioencapsulation, Barcelona, Spain, August 30-September 1, p.30-31.
73. Efremenko E., Rainina E., Lozinsky V., Makhlis T., Varfolomeyev S. (2001) Immobilized combined microbial preparation for organophosphates degradation.// IX Intern. Workshop on Bioencapsulation, Warsaw, May 11-13, S.VII-3 (p.1-5).
74. Efremenko E.N., Azizov R.E., Makhlis T.A., Varfolomeyev S.D., Abbasov V.M. (2004) Kinetic parameters of biluminescent reaction for screening of new biocides among corrosion inhibitors. // Intern. Conf. on Physical Chemystry, 21-23 September, Belgrade, Serbia & Montenegro, p. 273-275.
75. Ефременко Е.Н. (2004) Подходы к созданию новых функциональных продуктов с пробиотическими свойствами на основе иммобилизованных клеток.// Int.Workshop УProgress in Biotechnology and Neurobiology - Integrative medicineФ, Hurgada, Egypt, Africa, February 1424, p. 68-70.
76. Efremenko E.N., Spiricheva O.V., Veremeenko D.V., Lozinsky V.I. (2004) Immobilized fungi in the simultaneous processes of production and isolation of lactic acid.// XII Intern. Workshop on Bioencapsulation, Vitoria, Spain, September 24-26, p.117-120.
77. Stepanov N. A., Efremenko E. N. (2004) Different approaches to the prevention of cell release from biocatalyst used for preparation of sparkling wine.// XII Intern. Workshop on Bioencapsulatio, Vitoria Spain, September 24-26, p. 190-193.
78. Kochetkova N., Efremenko E. (2004) Biocatalyst for hydrogen production developed on the basis of immobilized phototrophic bacteria.// XII Intern. Workshop on Bioencapsulation, Vitoria, Spain, September 24-26, p. 202-205.
79. Senko O., Spiricheva O., Lozinsky V., Efremenko E. (2005) Examination of immobilized fungus in the treatment of fat wastewater. // XIII Intern. Workshop on Bioencapsulation, Kingston, Canada, June 24-26, p.57-58.
80. Efremenko E.N. (2005) These УunknownФ immobilized cells // XIII Intern. Workshop on Bioencapsulation, Kingston, Canada, June 24-26, p 51-52.
81. Stepanov N. A., Efremenko E. N. (2005) Highly active immobilized yeast for secondary wine making. // XIII Intern. Workshop on Bioencapsulation, Kingston, Canada, June 24-26, p.65-66.
82. Stepanov N., Efremenko E. (2006) Optimization of sparkling wine production with immobilized biocatalyst. // XIV Intern. Workshop on Bioencapsulation, Lausanna, Switzerland, 5-7 October, p.
313-316.
83. Efremenko E., Spiricheva O., Senko O., Lozinsky V. (2006) Multipurpose application of same immobilized fungous spores.// XIV Intern. Workshop on Bioencapsulation, Lausanna, Switzerland, 5-7 October, p. 305-308.
84. Ефременко Е.Н. (2007) Технологии биоразложения и утилизации отходов химической нейтрализации фосфорорганических пестицидов и отравляющих веществ на основе иммобилизованных биокатализаторов.// Росс. науч.-практ. конф. с межд. участием Рациональное природопользование, Москва, 18-19 декабря, с.52-54.
85. Efremenko E. (2007) Corrosive biofilms formed by self-immobilized bacteria cells on metal surfaces of various objects in petroleum industry.// XV Intern. Workshop on Bioencapsulation, Vienna, Austria, September 6-8, P3-12, p.1-4.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АИ - аутоиндукторы АТФ - аденозин-5'-трифосфат ГБК - гетерогенный биокатализатор ДИБЭМФК- О,ОТ-диизобутиловый эфир метилфосфоновой кислоты ИБЭМФК - О-изобутиловый эфир метилфосфоновой кислоты ИК - ингибиторы коррозии ИмК - иммобилизованные клетки КОБ - коррозионно-опасные биопленки МИК - минимальные ингибирующие концентрации МК- молочная кислота МКБ - молочно-кислые бактерии МФК - метилфосфоновая кислота ОРН - органофосфатгидролаза ПВС - поливиниловый спирт ПП - период полуинактивации ПТ - паратион ПНФ - р-нитрофенол РМ - реакционные массы СВБ - сульфатвосстанавливающие бактерии ТДГ - тиодигликоль ФОС - фосфорорганические соединения ФОВ - фосфорорганические отравляющие вещества QS - Quorum sensing - скоординированный, кооперативный ответ клеток, генерируемый их высокой концентрацией deGFP4 - белок, аналог GFP (green fluorescent protein), обратимо изменяющий флуоресцентные свойства в зависимости от pH среды.