Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
осенок Сергей Анатольевич
ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫЕ И ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ ЭТАНОЛОМ В СОЧЕТАНИИ С ЭНЕРГИЗАТОРАМИ И АНТИОКСИДАНТАМИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ НАРУШЕНИЯ ГОМЕОСТАЗА
14.00.25 Ц фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Курск - 2009
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор Бровкина Инна Леонидовна
доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович
Официальные оппоненты:
член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор епахин Владимир Константинович
доктор медицинских наук, профессор Провоторов Владимир Яковлевич
доктор медицинских наук, профессор Яворский Александр Николаевич
Ведущая организация:
ОАО Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ.
Защита состоится л______________2009 г. в л_____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Росздрава (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, 3)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Курский государственный медицинский университет Росздрава
Автореферат разослан л_______________200 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета ПАШИН Е.Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Состояние стресса и возникновение патологических процессов приводят к развитию однотипных метаболических изменений, выражающихся в усилении генерации активных метаболитов кислорода, повышению интенсивности перекисного окисления липидов клеточных мембран, снижению энергообеспечения и функциональной активности клеток, нарушению иммунологических функций. Последние в свою очередь оказывают влияние на метаболические процессы и физиологические функции организма. Возникает сложная последовательность взаимосвязанных отклонений гомеостаза, требующих эффективной коррекции (Л.Г. Прокопенко и др., 2000; 2003). Естественно ожидать, что универсальными корректорами могут быть препараты, повышающие антиокислительный и энергетический потенциалы клеток. Можно было предположить, что в условиях стресса и патологии эффективными корректорами нарушенных функций являются антиоксиданты и средства, активирующие энергетический обмен (энергизаторы). Учитывая, что процессы, лежащие в основе сохранения окислительно-энергетического гомеостаза, связаны с мембранными структурами клеток, вероятно, целесообразным является сочетание антиоксидантных и энергизирующих препаратов со средствами, модифицирующими структуры и функции клеточных мембран эритроцитов, тромбоцитов, иммуноцитов, гепатоцитов, в частности с фосфолипидами (Г.А. Лазарева и др., 2006).
Среди различных форм нарушения окислительно-энергетического гомеостаза особое место занимает алкоголизация, что обусловлено частотой неконтролируемого приема этанола. Нередко на фоне длительного поступления этанола организм подвергается действию различных экстремальных факторов (охлаждению, перегреванию, травматизации, в том числе сочетающимся с кровопотерей), принимает избыточное количество пищи или, напротив, голодает, выполняет интенсивные физические нагрузки. Прием этанола, особенно в сочетании с другими нарушающими гомеостаз условиями является причиной поражения печени, изменения метаболических и функциональных параметров клеток этого органа (И.М. Рослый и др., 2004).
Последствия длительного и кратковременного поступления в организм этанола, как правило, оппозитны. Первое ведет к развитию патологического процесса, второе может вызвать развитие реакций, направленных на коррекцию функций различных органов, нарушенных действием стрессорного агента или патогена (Н.А. Алиев, 1989). Последнее постулируется, но недостаточно обосновано строгими экспериментальными исследованиями. Этанол, как и фосфолипиды, индуцирует возникновение структурных перестроек клеточных мембран, однако направленность их действия в известной степени противоположна. Фосфолипиды в широком диапазоне доз упорядочивают структуру билипидного слоя мембран, снижают их текучесть (А.Д. Гордиенко, 1990; 1992), а этанол разрыхляет мембрану, увеличивает ее текучесть (С.И. Сторожок и др., 2001; В.Д. Прокопьева и др., 2005).
Принимая во внимание изложенное большой интерес представляет изучение эффектов взаимосвязанного влияния препаратов модифицирующих мембраны (фосфолипиды, этанол) и активирующих метаболические процессы (витамины, антиоксиданты и антигипоксанты) на состояние гепатоцитов, свойства эритроцитов и функциональную активность иммуноцитов при различных формах нарушения окислительно-энергетического гомеостаза.
Целью работы было изучение гепатопротекторных и иммунометаболических эффектов интра - и экстракорпорального применения этанола в сочетании с энергизаторами и антиоксидантами при различных формах нарушения гомеостаза.
Задачи
- Изучение иммунометаболических эффектов сочетанного применения полиненасыщенных фосфолипидов и активаторов энергетического обмена при интенсивных физических нагрузках.
- Изучение иммунометаболических эффектов сочетанного применения полиненасыщенных фосфолипидов, активаторов энергетического обмена и жирорастворимых витаминов при кровопотере.
- Изучение иммунометаболических эффектов сочетанного применения полиненасыщенных фосфолипидов и активаторов метаболических процессов при длительном поступлении в организм этанола.
4. Изучение иммунометаболических эффектов, вызываемых кратковременным поступлением в организм этанола.
- Изучение эритроцитзависимых иммунометаболических эффектов вызываемых этанолом и жирорастворимыми витаминами при кровопотере и физической нагрузке.
- Изучение иммуномодулирующего и гепатопротекторного действия этанола и полиненасыщенных фосфолипидов при нарушении энергетического гомеостаза.
7. Изучение роли эритроцитов и тромбоцитов в развитии иммуносупрессии при различных формах нарушения энергетического гомеостаза.
8. Выяснение роли эритроцитов и тромбоцитов во взаимосвязанном иммуномодулирующем и гепатопротекторном действии полиненасыщенных фосфолипидов, этанола, активаторов обменных процессов при нарушении гомеостаза.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
Выявлены особенности иммуномодулирующего и гепатопротекторного действия активаторов метаболических процессов после кровопотери, интенсивной физической нагрузки, длительного поступления в организм этанола.
Показан механизм развития тромбоэритроцитарной иммуносупрессии после выполнения физической нагрузки высокой интенсивности и длительного поступления в организм этанола.
Установлена высокая эффективность сочетанного применения полиненасыщенных фосфолипидов с активаторами энергетического обмена иммунокоррегирующего и гепатопротекторного действия, после кровопотери, интенсивной физической нагрузки и алкоголизации.
Выявлены особенности иммунометаболических эффектов кратковременного и длительного поступления в организм этанола.
Установлена значительная роль эритроцитов в реализации иммуномодулирующего и гепатопротекторного действия полиненасыщенных фосфолипидов, жирорастворимых витаминов, этанола и активаторов метаболических процессов.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Экспериментально обоснована целесообразность совместного применения фосфолипидов и кудесана и фосфолипидов с мексидолом для достижения иммуномодулирующего и гепатопротекторного эффектов после кровопотери соответственно. Установлена неэффективность раздельного использования полиненасыщенных фосфолипидов, жирорастворимых витаминов и активаторов энергетического обмена для коррекции иммунометаболических нарушений после кровопотери, интенсивной физической нагрузки и алкоголизации. Доказана возможность коррекции тромбоэритроцитарной иммуносупрессии, вызываемой физической нагрузкой высокой интенсивности, сочетанным введением полиненасыщенных фосфолипидов и милдронатом.
Установлена целесообразность совместного применения фосфолипидов и милдроната, а так же фосфолипидов и менадиона для коррекции иммунометаболических процессов, нарушенных длительным поступлением в организм этанола. Доказано индуцирующее влияние сочетанного использования полиненасыщенных фосфолипидов, жирорастворимых витаминов, активаторов энергетического обмена и этанола на повышение иммуногенных свойств эритроцитов. Экспериментально обоснована целесообразность совместного применения малых доз этанола и жирорастворимых витаминов для коррекции иммунометаболических нарушений, вызываемых кровопотерей и интенсивной физической нагрузкой.
Материалы диссертации включены в рабочие программы по фармакологии, патофизиологии, медицине катастроф, фармацевтической химии, биохимии на кафедрах Курского государственного медицинского университета, Воронежской государственной медицинской академии, Белгородском и Орловском государственных университетах.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Активаторы метаболических процессов (регуляторы обмена, энергоносители, антигипоксанты, антиоксиданты), применяемые по отдельности не вызывает существенно выраженного иммунометаболического и гепатопротекторного эффектов при состояниях характеризующихся нарушением энергетического гомеостаза (кровопотере, интенсивных физических нагрузках, алкоголизации).
2. Сочетанное применение активаторов метаболических процессов с полиненасыщенными фосфолипидами вызывает выраженные иммуномодудирующий и гепатопротекторный эффекты в условиях нарушения энергетического гомеостаза.
3. Длительное поступление в организм этанола вызывает иммуносупрессорный и гепатопатический эффекты, кратковременное введение этанола стимулирует развитие клеточной и гуморальной форм иммунного ответа в норме и при различных формах нарушений энергетического гомеостаза.
4. Кратковременное введение этанола в сочетании с инъекциями жирорастворимых витаминов при нарушении энергетического гомеостаза вызывает более выраженные иммуно- и гепатопротекторный эффекты, чем раздельное введение препаратов. Наиболее эффективное сочетание - этанол и менадион.
5. Иммуномодулирующее и гепатопротекторное действие эссенциале, этанола и активаторов метаболических процессов реализуется при участии эритроцитов и тромбоцитов крови.
Апробация работы
Материалы диссертации обсуждены на заседаниях Международного конгресса Иммунитет и болезни от теории к терапии (Москва, 2005) Всероссийский научно-практической конференции, посвященной 120- летию ветеринарной службы Курской области (Курск, 2005), VI Всероссийского научного форума РеаСпоМед 2006 (Москва, 2006), XII и XIII Международных конгрессов по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Паттайя, Таиланд; Дубай, ОАЭ,2007;2008), IV Международной конференции. Физиология и патология иммунной системы (Москва, 2008), научных сессий Курского государственного медицинского университета отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2006, 2008) и межкафедральной научно-практической конференции кафедр фармакологии, биологической химии, микробиологии, патологической физиологии, спортивной медицины и медицинской реабилитации Курского государственного медицинского университета (2008).
Публикации
Опубликовано 26 научных работ, в том числе 14 в реферируемых изданиях и в 1 монографии. Работы содержат полный объем информации, касающейся темы диссертации.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 207 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами и 20 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список использованных работ включает 349 источников (267 на русском и 82 на иностранных языках).
Материалы и методы исследования
Объект исследования. Исследования проведены на крысах Вистар массой 180 - 200 г. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8 - 10 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал 10%. Исследования проводили с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986).
Экспериментальные модели.
Кровопотеря. Под легким эфирным наркозом из бедренной артерии крыс одномоментно получали кровь в количестве приблизительно 1% массы тела. Содержание жидкости в кровеносном русле восстанавливали введением соответствующего объема 0,15 М натрия хлорида.
Физическая нагрузка. Однократное плавание в течение 4 часов с грузом 4,5- 5% массы тела при температуре воды 30 10С (Ю.Г. Бобков и др., 1984). В крови плававших животных определяли концентрацию глюкозы и лактата (В.В. Меньшиков, 1987), активность пирофосфатзависимой фосфофруктокиназы (Б.Ф. Коровкин и др., 1999).
Алкогольная интоксикация. В ходе проводимых нами исследований этанол использовали по схемам представленным в таблице 1:
Таблица 1
Введение этанола
№ п/п | Способ введения | Кратность введения | Интервал ч. | Разовая доза |
1. 2. 3. 4. 5. | Внутрижелудочно через зонд Внутрижелудочно через зонд Внутрижелудочно через зонд Внутрижелудочно через зонд Внутрижелудочно через зонд | 70 60 30 7 1 | 24 24 24 24 - | 3 г/кг 3 г/кг 3 г/кг 3 г/кг 30 г/кг |
Выделение и изучение функциональной активности клеток селезенки и лимфоцитов периферической крови.
Клетки селезенки фракционировали по их способности прилипать к стеклянной поверхности (П. Дерфлинг, З. Вихнер, 1987).
Прилипающие к стеклу клетки дополнительно фракционировали при температурном градиенте (С.В. Родионов и др., 1985). Клетки культивировали в среде 199 (107 клеток на 1 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин и стрептомицин) в течение 4-6 ч. и готовили пул супернатантов прилипающих и не прилипающих к стеклу спленоцитов (СПС и СНС), содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных (А.И. Конопля, Л.Г. Прокопенко, 1982). Белки СПС и СНС после диализа и концентрирования фракционировали на сефадексе G-150 (Г. Детерман, 1970). Получали три фракции белков: фракция I содержала белки с молекулярной массой (ММ) более 150 кД, фракция II - белки с ММ 50-60 кД и фракция III - белки с ММ менее 15 кД. Концентрацию белков во фракциях устанавливали по Бредфорду, используя краситель Кумаси G-250 (С.С. Шишков, 1989). Активность фракций оценивали путем введения их крысам в объеме, содержавшем 500 мкг белка (внутрибрюшинно 3-кратно с интервалом 12 часов) и последующей иммунизацией животных ЭБ.
Антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) спленоцитов оценивали по величине индекса цитотоксичности (Ю.И. Зимин, В.Ф. Ляхов, 1985).
Выделение и фракционирование эритроцитов крыс. Кровь отстаивали дважды в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН=7,4), содержащем 0,9% хлорида натрия и 3% декстрана Т-500 и последующей очисткой с помощью НВS-целлюлозы в Na-фосфатном буфере. (Beutler, 1985). Эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина (Т.В. Кобзев и др., 1978). Получали фракции легких эритроцитов (плотность ниже 1,079 г/см3) и тяжелых эритроцитов с плотностью, превышающей 1,117.
Получение фракции эритроцитов тщательно отмывали от альбумина 0,15 М хлоридом натрия и использовали для введения аллогенным животным (внутрибрюшинно по 107 клеток трехкратно с интервалом 12 ч).
Получение плазмы, дефицитной по тромбоцитам и обогащенной тромбоцитами. Гепаринизированную кровь центрифугировали 5 мин при 180g. После расслоения крови на плазму, лейкоцитарный слой и эритроциты, отбирали первые два слоя и центрифугировали в течение 10 мин при 600 g. Супернатант представлял собой плазму, обогащенную тромбоцитами (ПОТ). Для получения плазмы, дефицитной по тромбоцитам (ПДТ), ПОТ центрифугировали в течение 20 мин при 1000g (А.Х. Коган и др., 1992). ПОТ и ПДТ использовали для обработки эритроцитов (107 клеток инкубировали в 1 мл плазмы в течение 1 часа при 37С). Иммуномодулирующую активность инкубата определяли путем введения в инкубационную среду мононуклеаров.
Включение менадиона в строму эритроцитов крыс. Для включения менадиона в строму эритроцитов использовали метод гипоосмотического гемолиза (Т.П. Генинг и др.,1988; Ж.Ш. Жумадилов, Р.В. Макаренкова, 1990). Эритроциты дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования. К осадку эритроцитов добавляли семикратный объем охлажденной до 0С дистиллированной воды и снова центрифугировали. К полученной строме приливали пятикратный объем менадиона, растворенного в охлажденной до 5С дистиллированной воде. Концентрация препарата в инкубационной среде составляла 1, 2 или 3 мг/мл. Взвесь инкубировали в течение 20 мин при 4С, затем добавляли 1/10 объема 10% хлорида натрия для восстановления целостности стромы и инкубировали в течении 30 мин при 37С. После включения менадиона в стромальные сферы, последние дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида, затем осаждали при1500g в течении 10 мин.
Изученные препараты. В работе использовали следующие препараты: ретинола ацетат (АО Ай-Си-Эн Октябрь, Россия); токоферола ацетат (АО Ай-Си-Эн Октябрь, Россия); менадиона бисульфат натрия (Индия, LTD); эссенциале (полиненасыщенные фосфолипиды), (Рон-Пуленк-Рорер); рибоксин (инозин) (ОАО Дальхимфарм); милдронат (Grendex); мексидол (ООО М - Элара); кудесан (КоQ и витамин Е) (ЗАО Аквион); гипоксен (ЗАО Олефин); тиамин хлорид (ЗАО Верофарм); пиридоксин (ЗАО Верофарм); кобаламин (ЗАО Верофарм); фолиевая кислота (Борисовский химфармзавод), филлохинон (Serva, ФРГ).
Способ введения препарата соответствовал рекомендациям, приведенным в справочнике М.Д. Машковского Лекарственные средства и аннотациях к использованию препаратов. Выбор разовых доз основывался на экспериментальных данных, приведенных в литературе о влиянии препаратов на состояние мембран клеток, в первую очередь эритроцитов (табл. 2).
Иммунологическую реактивность животных, функционально-метаболическую активность нейтрофилов, энергетический, антиоксидантный статус и перекисное окисление липидов эритроцитов и гепатоцитов, метаболические маркеры клеток крови, метаболическое состояние гепатоцитов, параметры белкового и липидного обмена, иммуномодулирующие соединения крови оценивали с помощью стандартных методов исследования (табл. 3).
Статистическая обработка материала. Вычисляли средние арифметические величины определявшихся показателей и их стандартные ошибки. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента (Г.Ф. Лакин, 1980), Вилкоксона, Манна-Уитни (Е.В. Гублер, А.А. Генкин, 1973). Рассчитывали коэффициенты парной, парциальной и множественной корреляции между показателями, а так же показатели их прямолинейной регрессии (Н.С. Мисюк и др., 1975).
Таблица 2.
Применение препаратов
| Название препарата | Способ введения | Разовая доза, мг/кг | Схема введения | |
Количество инъекций | Интервал между инъекциями (введениями), ч. | |||
Гипоксен | внутрижелудочно | 5 | 5 | 12 |
Кудесан | внутрижелудочно | 1 | 5 | 12 |
Мексидол | внутримышечно | 5 2 | 5 5 | 12 12 |
Менадион | внутрижелудочно | 1 10 | 5 1 | 12 - |
Милдронат | внутримышечно | 5 2,5 | 5 5 | 12 12 |
Ретинола ацетат | внутрижелудочно | 5 5 | 5 1 | 12 - |
Рибоксин | внутримышечно | 2 1 | 5 5 | 12 12 |
Токоферола ацетат | внутрижелудочно | 10 30 | 5 1 | 12 - |
Тиамин | внутримышечно | 2 | 5 | 12 |
Пиридоксин | внутримышечно | 2,5 | 5 | 12 |
Фолат (фолиевая кислота) | внутримышечно | 1 | 5 | 12 |
Кобаламин | внутримышечно | 15 | 5 | 12 |
Филлохинон | внутрижелудочно | 10 | 5 | 12 |
Эссенциале | внутривенно внутривенно внутривенно | 5 2 10 | 5 5 1 | 12 12 - |
Примечание: при сочетанном применении дозу препаратов уменьшали в 2 раза.
Таблица 3
Материалы и методы
Объект | Крысы Вистар | |||||||||||||||
Модель | Интенсивная физическая нагрузка | Кровопотеря | Алкогольная интоксикация | |||||||||||||
Показатели | ||||||||||||||||
Иммунная реактивность | ГИО (гуморальный иммунный ответ) (К. Мальберг, Э. Зигль, 1987) | |||||||||||||||
АОК (антителообразующие клетки) к ЭБ | АОК (антителообразующие клетки) к ЛПС | |||||||||||||||
ГЗТ (гиперчувствительность замедленного типа) | ||||||||||||||||
РМЛ (разница массы лимфоузлов) (Федосеева В.Н. и др., 1993) | ||||||||||||||||
Функционально-метаболическая активность нейтрофилов | Фагоцитарная активность (А.Н.Медведев, В.В. Чаленко, 1991) | |||||||||||||||
ФИ (фагоцитарный индекс) | ФЧ (фагоцитарное число) | |||||||||||||||
Кислородзависимая активность (В.И. Щербаков, 1989) | ||||||||||||||||
НСТ-сп. (тест восстановления нитросинего тетразолия спонтанный) | НСТ-ст. (тест восстановления нитросинего тетразолия индуцированный) | |||||||||||||||
Энергетический, антиоксидант-ный статус и ПОЛ эритроцитов (Э) и гепатоцитов (Г) | Энергетичский статус (И.Л. Виноградова и др., 1980) | |||||||||||||||
БФГ (бифосфоглицерат) (Э) | АТФ (аденозинтрифосфат) (Э) | |||||||||||||||
Антиоксидантный статус | ||||||||||||||||
СОД (супероксиддисмутаза) (Э, Г) (Е.В. Макаренко, 1988) | Каталаза (Э, Г) (М.А. Подильчак 1967) | ГП (глутатионпероксидаза) (Э) (А.П. Гаврилюк, Н.Ф. Хмара, 1986) | ГР (глутатионредуктаза) (Э) (Е.В. Макаренко, 1988) | |||||||||||||
ПОЛ | ||||||||||||||||
МДА (малоновый диальдегид) (Э, Г) (И.Д.Стальная, 1977) | ДК (диеновые коньюгаты) (Г) (И.Д.Стальная, 1977) | АГП (ацетилгидроперекиси) (Э) (В.И.Бенисевич, И.Л.Идельсон, 1973) | ||||||||||||||
Метаболические маркеры клеток крови | Полиморфноядерные лейкоциты: | Активность НАДФН-оксидазы (Л.В. Никанкина и др., 2001) | ||||||||||||||
Лимфоциты: | Содержание фруктозо-2,6-дифосфатазы (Б.Ф. Коровкин и др., 1999) | |||||||||||||||
Эритроциты: | Активность Mg2+-АТФ-азы (Г.Ф. Рыжкова, С.И. Вишняков, 2005) | |||||||||||||||
Тромбоциты: | Содержание МДА (Е.В. Негреску, 1992) | |||||||||||||||
Метаболическое состояние гепатоцитов | АЛТ (аланинаминотрансфераза) (В.В.Меньшиков, 1987) | АСТ (аспартатаминотрансфераза) (В.В.Меньшиков, 1987) | ЩФ (щелочная фосфатаза) (В.В.Меньшиков, 1987) | ОБ (общий билирубин) (В.В.Меньшиков, 1987) | Параметры белкового и липидного обмена ФКК (фосфокреатинкеназа) ТАГ (триацилглицеролы), ХС (холистерин) (В.В.Меньшиков, 1987) | |||||||||||
Иммуномодули рующие соединения крови | НП (липопротеиды низкой плотности) (В.Г. Кобл, В.С. Камышников, 1976) | ААП ( 1-антипротеаза) (В.Ф.Нартикова, Г.С. Пасхина, 1979) | АМГ (2-макроглобулин) (В.Ф. Нартикова, Г.С. Пасхина, 1979) | |||||||||||||
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Иммунометаболические эффекты сочетанного применения эссенциале и витаминов при кровопотере.
Установлено, что введение эссенциале здоровым животным или крысам, подвергнутым кровопусканию (КПК) не оказывало влияния на функционально-метаболическую активность полиморфноядерных лейкоцитов (ФМА ПЯЛ), развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ. Инъекции тиамина, пиридоксина, фолата или кобаламина не изменяли активность нейтрофилов периферической крови и иммунологическую реактивность у здоровых крыс, но повышали выраженность иммунологических функций у КПК. Наиболее выраженным было иммуномодулирующее действие пиридоксина, однако даже в случае введения этого витамина параметры иммунологических функций не нормализовались полностью.
Сочетанное применение эссенциале с тиамином, пиридоксином, фолатом или кобаламином вызывало у КПК существенное повышение всех показателей, характеризующих ФМА нейтрофилов и выраженность развития ГИО на ЭБ, однако только при сочетании эссенциале с кобаламином их величины достигали контрольного уровня.
Таким образом, эссенциале проявляли себя как усилитель иммуномодулирующей активности тиамина, фолата и особенно кобаламина. Совместное введение эссенциале с пиридоксином не усиливало иммуномодулирующей активности последнего. Это, вероятно, объясняется биокаталитической самодостаточностью пиридоксина, коферментная форма которого, фосфопиридоксаль, участвует в катализе большого числа реакций аминокислотного, витаминного и гормонального метаболизма. Совокупность этих реакций, по-видимому, достаточна для коррекции иммунологических функций при кровопотере без изменения скорости процессов, активируемых эссенциале.
В крови КПК имело место снижение содержания эритроцитов и гемоглобина. В эритроцитах уменьшалась концентрация макроэргических соединений (БФГ и АТФ), активность антиоксидантных ферментов (СОД и каталазы), повышалось содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (АГП и МДА). Легкие эритроциты КПК при аллогенном переносе угнетали ФМА нейтрофилов, развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ.
Введение после кровопотери витаминов по отдельности не оказывало существенного влияния на энергетический и антиоксидантный потенциал эритроцитов, на содержание в них продуктов ПОЛ и иммуносупрессирующие свойства легких клеток и индуцировало появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов. Эссенциале с тиамином повышали концентрацию БФГ и АТФ, активность СОД и каталазы, снижали содержание АГП и МДА в эритроцитах КПК. В легких эритроцитах эти сдвиги были выражены сильнее, чем в тяжелых. Введение эссенциале с фолатом или кобаламином уменьшало выраженность метаболических изменений преимущественно в тяжелых эритроцитах.
Кровопотеря приводила к усилению гемолиза эритроцитов и накоплению в крови фрагментов стромы легких и тяжелых эритроцитов (ФСЛЭ и ФСТЭ). Учитывая это, интересно было выяснить влияние препаратов на иммуномодулирующее действие ФСЛЭ и ФСТЭ.
Оказалось, что ФСЛЭ и ФСТЭ КПК не влияют на развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ у интактных крыс. Не обладала иммунотропной активностью также строма эритроцитов КПК, получавших инъекции эссенциале и тиамина. ФСЛЭ КПК, получавших эссенциале и фолат или кобаламин, была не активна, а ФСТЭ крыс, которым после кровопотере вводили препараты, при аллогенном переносе стимулировали развитие ГИО на ЭБ. В большей степени это было выражено при введении эссенциале с кобаламином.
Большой интерес представляет изучение иммуномодулирующего действия эссенциале и жирорастворимых витаминов. Введение КПК ретинола ацетата, токоферола ацетата и филлохинона повышали (но не нормализовали) ФМА нейтрофилов, иммунологическую реактивность в организме в отношении ЭБ. Инъекции эссенциале не влияли на эффекты, вызываемые токоферола ацетатом, но усиливали иммуномодулирующее действие ретинола ацетата и, особенно, филлохинона.
Совместное введение КПК эссенциале и филлохинона не влияло на иммунометаболическое состояние легких эритроцитов, но уменьшало выраженность сдвигов показателей, характеризующих энергетический потенциал, антиоксидантный статус и интенсивность ПОЛ тяжелых эритроцитов, а также индуцировало появление иммуностимулирующих свойств у этих клеток. Выраженной иммуностимулирующей активностью обладали ФСТЭ КПК, получавших инъекции филлохинона и эссенциале.
Все изложенное позволяет постулировать участие триады лэссенциале - кобаламин - филлохинон в механизме индукции иммуномодулирующих свойств у тяжелых эритроцитов. Для подтверждения этого постулата проведены следующие варианты экспериментов: после кровопотери животным, получавшим инъекции эссенциале, вводили эктракорпорально обработанные кобаламином или филлохиноном ФСТЭ интактных крыс (вариант 1); КПК, получавшим инъекции кобаламина или филлохинона, вводили экстракорпорально обработанные эссенциале ФСТЭ интактных крыс (вариант 2).
В первом варианте имел место иммуномодулирующий эффект, во втором такой эффект не выявлен. Это позволяет считать, что участие кобаламина и филлохинона в индукции иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов реализуется на уровне их взаимодействия с мембранными структурами клеток, а эссенциале являются активатором эффектов, вызываемых кобаламином и филлохиноном в мембране эритроцитов. Для проверки последнего предположения ФСТЭ экстракорпорально обрабатывали кобаламином и эссенциале, филлохиноном и эссенциале, или сочетанием всех трех соединений (табл. 4).
Таблица 4
Влияние витаминов и ФСТЭ здоровых животных, экстракорпорально обработанных витаминами, на ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность КПК
Условия опыта | ИАФ, ед | ОРН, ед | АОК, 103/орган | РМЛ, мг |
1. Контроль | 53,65,1 | 26,42,8 | 27,53,0 | 5,80,6 |
2. Кровопотеря | 14,92,1*1 | 11,21,4*1 | 9,21,1*1 | 2,40,2*1 |
3. Кровопотеря, введение эссенциале и ФСТЭ, обработанных кобаламином | 31,83,2*1,2 | 17,41,4*1,2 | 18,22,3*1,2 | 3,60,3*1,2 |
4. Кровопотеря, введение эссенциале и ФСТЭ, обработанных филлохиноном | 46,44,6*1-3 | 22,12,3*1-3 | 23,32,5*1-3 | 4,70,5*1-3 |
5. Кровопотеря, введение кобаламина и ФСТЭ, обработанных эссенциале | 16,11,5*1,3,4 | 12,81,3*1,3,4 | 10,11,2*1,3,4 | 2,60,7*1,3,4 |
6. Кровопотеря, введение филлохинона и ФСТЭ, обработанных эссенциале | 16,91,6*1,3,4 | 12,21,0*1,3,4 | 8,80,9*1,3,4 | 2,40,2*1,3,4 |
Примечание: в этой и следующих таблицах * - существенность различий с вероятностью р<0,05.
Установлено, что ФСТЭ, обработанные кобаламином и эссенциале, при аллогенном переносе не вызывают иммуномодулирующего эффекта, ФСТЭ, инкубированные с филлохином и эссенциале обладали слабо выраженной активностью, а строма, экстракорпорально взаимодействовавшая с кобаламином, филлохиноном и эссенциале значительно повышала ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность у КПК (табл. 5).
Кобаламин, филлохинон и эссенциале в парных комбинациях коррегируют состояние мембран гепатоцитов, окислительно-энергетический потенциал эритроцитов и функционально-метаболическую активность иммуноцитов. Кобаламин ограничивает угнетающе влияние кровопотери на ФМА нейтрофилов. Это, по-видимому, обусловлено стимулирующим влиянием кобаламина на ферменты гликолиза, являющегося основным источником энергообеспечения клеток этого типа. Филлохинон предотвращает вызываемые кровопотерей появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов. В основе этого лежит нормализующее влияние филлохинона на окислительно-энергетический потенциал эритроцитов (Л.Г. Прокопенко, И.Л. Бровкина, 2003). Эссенциале стабилизирует клеточные мембраны за счет антиоксидантного и заместительного эффектов (Г.А. Лазарева и др., 2006). Стабилизация мембран служит необходимым условием эффективного действия витаминов, этим объясняется высокая эффективность после кровопотери изученных парных сочетаний препаратов.
Таблица 5
Влияние ФСТЭ здоровых крыс, экстракорпорально обработанных эссенциале, кобаламином и филлохиноном, на ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность КПК
Условия опыта | ИАФ, ед | ОРН, ед | АОК, 103/орган | РМЛ, мг |
1. Контроль | 53,65,1 | 26,42,8 | 27,53,0 | 5,80,6 |
2. Кровопотеря | 14,92,1*1 | 11,21,4*1 | 9,21,1*1 | 2,40,2*1 |
3. Кровопотеря, введение ФСТЭ, обработанных эссенциале и кобаламином | 15,61,9*1,2 | 12,71,6*1,2 | 10,71,1*1,2 | 2,60,3*1,3 |
4. Кровопотеря, введение ФСТЭ, обработанных эссенциале и филлохиноном | 23,72,8*1-3 | 19,42,2*1-3 | 18,32,1*1-3 | 3,10,3*1-3 |
5. Кровопотеря, введение ФСТЭ, обработанных эссенциале, кобаламином и филлохиноном | 41,84,3*1-4 | 23,12,5*1-4 | 23,62,7*1-4 | 4,50,4*1-4 |
Иммунометаболические эффекты сочетанного применения эссенциале и регуляторов энергетического обмена при кровопотере.
Изучено влияние сочетанного применения препарата полиненасыщенных фосфолипидов - эссенциале и регуляторов энергетического обмена - мексидола, кудесана и гипоксена на иммунологические функции и метаболические процессы в печени после острой кровопотери.
Установлено, что в эритроцитах крыс, подвергнутых кровопотере снижалась концентрация БФГ и АТФ, активность СОД и ГР, повышалось содержание АГП и МДА. Легкие эритроциты крыс при аллогенном переносе вызывали иммуносупрессирующий эффект. В плазме крови повышалась активность АЛТ, АСТ и ЩФ. Кровопотеря подавляла ФМА лейкоцитов, угнетала развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ.
Введение каждого из исследованных препаратов по отдельности не оказывало существенного влияния на величины определявшихся параметров. Мексидол в сочетании с кудесаном уменьшал выраженность снижения показателей, характеризующих ФМА лейкоцитов и развитие ГИО или нормализовал их величины. На развитие ГЗТ сочетание указанных препаратов не оказывало существенного влияния.
Мексидол в сочетании с кудесаном и мексидол, введенный с гипоксеном снижали активность АЛТ, АСТ и ЩФ, повышали концентрацию ОБ, а также сокращали время наркотического сна. Таким образом, иммунологические функции эффективно корригируются сочетанным применением мексидола с кудесаном, а метаболическая активность гепатоцитов - применением обоих сочетаний препаратов.
Во всех парных сочетаниях препараты повышали активность антиоксидантных ферментов и снижали содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах, но не влияли на концентрацию в них макроэргических соединений (табл. 6).
Таблица 6
Влияние мексидола, кудесана, гипоксена на окислительно-энергетический потенциал эритроцитов после кровопотери
Условия опыта | СОД, ЕД/мл | ГР, мкмоль/л | АГП, D233/мл | МДА, мкмоль/л | БФГ, мкмоль/л | АТФ, мкмоль/л |
1. Контроль | 54,74,0 | 112,912,2 | 1,40,2 | 33,73,9 | 5,30,6 | 1,70,2 |
2.Кровопотеря | 40,83,7*1 | 109,410,5 | 3,10,7*1 | 48,24,7*1 | 3,20,3*1 | 0,80,1*1 |
3.Кровопотеря, введение мексидола и кудесана | 51,74,1*2 | 114,713,5 | 1,80,3*2 | 35,44,2*2 | 3,00,3*1 | 0,60,1*1 |
4.Кровопотеря, введение мексидола и гипоксена | 46,84,3*1,2 | 117,111,4 | 1,50,2*2 | 35,03,8*2 | 3,40,3*1 | 0,80,1*1 |
5.Кровопотеря, введение кудесана и гипоксена | 49,84,5*2 | 106,010,8 | 1,70,3*2 | 36,94,0*2 | 3,10,3*1 | 0,70,1*1 |
Совместное введение препаратов после кровопотери не уменьшало выраженность иммуносупрессирущих свойств эритроцитов КПК. Обращает на себя внимание тот факт, что мексидол в сочетании с кудесаном не влиял на иммуносупрессирующие свойства эритроцитов, но повышал ФМА лейкоцитов и иммунологическую реактивность в отношении ксеногенных эритроцитов. Вероятно, совместное применение мексидола с кудесаном повышало резистентность иммуноцитов к действию эритроцитов, приобретающих после кровопотери иммуносупрессирующие свойства.
Изучено влияние эссенциале на протективные эффекты, вызываемые мексидолом, кудесаном и гипоксеном в отношении метаболических процессов в печени и иммунологических функций.
Установлено, что введение крысам после кровопотери эссенциале с кудесаном нормализовало величины показателей ФМА ПЯЛ и иммунологической реактивности. Эссенциале с мексидолом нормализовали большинство показателей метаболических функций печени. Каждое из парных сочетаний уменьшало выраженность изменений некоторых показателей других функций, однако избирательность влияния эссенциале на действие мексидола, кудесана и гипоксена была очевидной.
Эссенциале в сочетании с мексидолом повышало активность антиоксидантных ферментов и снижал содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах, совместное применение эссенциале с кудесаном или гипоксеном наряду с антиоксидантным эффектом повышали в эритроцитах концентрацию макроэргических соединений. Эссенциале с мексидолом предотвращали появление в крови КПК легких эритроцитов, обладающих иммуносупрессирующими свойствами, а эссенциале с кудесаном помимо указанного эффекта, индуцировали появление у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующей активности.
Введение эссенциале с гипоксеном не оказывало влияния на иммунологическую активность легких и тяжелых эритроцитов. Сопоставление особенностей сочетанного влияния эссенциале другими препаратами на метаболическое состояние эритроцитов и их иммунологическую активность позволяет считать, что нормализация окислительно-энергетического потенциала эритроцитов является необходимым условием отмены иммуносупрессирующих свойств у легких и появления иммуностимулирующей активности у тяжелых клеток.
Результаты проведенных исследований показывают, что эссенциале оказывает селективное влияние на протективную активность мексидола и кудесана в отношении функций гепатоцитов и иммуноцитов при кровопотере. Они свидетельствуют о важной роли эритроцитов в регуляции иммунологических функций.
Иммунометаболические эффекты сочетанного применения эссенциале и регуляторов энергетического обмена при физических нагрузках. Изучено влияние физической нагрузки высокой интенсивности на иммунометаболические параметры организма и возможность их коррекции эссенциале и регуляторами энергетического обмена (рибоксином, милдронатом, мексидолом).
Установлено, что плавание приводило к значительному увеличению в крови активности фосфофруктокиназы (до 12,8 9,7, после 85,7 9,8 ммоль/(л.с.)). В крови плававших крыс снижалась концентрация глюкозы (до 5,7 0,8, после 4,2 0,7 ммоль/л) и увеличивалась концентрация лактата (до 2,5 0,7 ммоль/л, после 3,8 1,2 ммоль/л). Показатели кислотно-основного равновесия после плавания не отличались от контроля. Результаты исследований показали, что в условиях проведенных экспериментов, крысы выполняли нагрузку высокой (но не максимальной или субмаксимальной) интенсивности, плавание снижало ИАФ и ОРН, тормозило развитие ГИО и ГЗТ. При раздельном применении рибоксин, милдронат, мексидол и эссенциале не оказывали существенного влияния на ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность плававших крыс. Эссенциале в сочетании с рибоксином или мексидолом повышали параметры, характеризующие иммунологические функции животных, а эссенциале с милдронатом нормализовали их.
Плавание существенно снижало выраженность АЗК - спленоцитов (до плавания - 12,3 1,2%, после плавания 6,3 0,7%). Введение плававшим крысам эссенциале с рибоксином или эссенциале с мексидолом уменьшало степень снижения АЗК - (соответственно 8,7 0,9% и 8,3 0,8%), а инъекции эссенциале с милдронатом нормализовали выраженность этого феномена (11,0 1,3%).
В регуляции механизмов иммунологической защиты организма важную роль играют полиморфноядерные лейкоциты, мононуклеары, модифицированные различными агентами эритроциты и активированные тромбоциты.
Плавание подавляло активность НАДФН - оксидазы ПЯЛ, Mg2+ АТФазы эритроцитов, снижало концентрацию ФДФ в лимфоцитах и повышало содержание МДА в тромбоцитах. Инъекции плававшим крысам рибоксина уменьшали выраженность снижения активности Mg2+ - АТФазы стромы эритроцитов, введение мексидола повышало активность НАДФН - оксидазы ПЯЛ, а инъекции милдроната увеличивали концентрацию ФДФ в лимфоцитах. Эссенциале, введенный по отдельности, не влиял на метаболические параметры клеток крови, а в сочетании с рибоксином нормализовал активность Mg2+ - АТФазы стромы эритроцитов, с мексидолом - НАДФН - оксидазы ПЯЛ, а с милдронатом содержание ФДФ в лимфоцитах и МДА в тромбоцитах (табл. 7).
В условиях проведенных нами экспериментов в эритроцитах снижалась активность СОД и каталазы, повышалась концентрация АГП и МДА. Физическая нагрузка высокой интенсивности проводила к снижению активности СОД и каталазы, повышению ДК и МДА в печени.
Введение после интенсивной физической нагрузки регуляторов энергетического обмена по отдельности не влияло на метаболические параметры эритроцитов и печени. Совместное применение эссенциале и рибоксина повышало, но не нормализовало активность СОД и каталазы в эритроцитах. Эссенциале с мексидолом или милдронатом нормализовали активность СОД и каталазы, а также уменьшали выраженность изменений содержания АГП и МДА в эритроцитах и печени.
Результаты проведенных экспериментов показывают, что угнетение иммунологических функций после интенсивной физической нагрузки возникает на фоне нарушения антиоксидантного статуса и процессов перекисного окисления липидов в печени и эритроцитах. Введение длительно плававшим животным полиненасыщенных фосфолипидов, в сочетании с активаторами различных звеньев процессов энергообеспечения, вероятно, предотвращает окислительное модифицирование липопротеинов низкой плотности и появление иммуносупрессирующей активности у тромбоцитов и эритроцитов (эффект фосфолипидов и рибоксина), снижение функциональной активности нейтрофилов и лимфоцитов (эффект милдроната и мексидола).
Таблица 7
Влияние регуляторов энергетического обмена и эссенциале на показатели функциональной активности клеток крови после ИФН
Условия опыта | НАДФН-оксидаза ПЯЛ | ФДФ лимфоцит | Mg2+ - АТФазы эритроцит | МДА тромбоцит |
!1. Контроль(без плавания и введения препаратов) | 1,320,21 | 0,960,14 | 0,660,08 | 0,610,06 |
2. Плавание | 0,530,10*1 | 0,400,09*1 | 0,320,03*1 | 0,900,09*1 |
3. Плавание, введение рибоксина | 0,600,12 | 0,430,08*1 | 0,460,05*1,2 | 0,870,08*1 |
4. Плавание, введение милдроната | 0,560,09*1 | 0,660,11*1-3 | 0,270,03*1,3 | 0,930,09*1 |
5. Плавание, введение мексидола | 0,910,16*1-4 | 0,430,10*1,4 | 0,330,04*1,3 | 0,860,10*1 |
6. Плавание, введение эссенциале | 0,640,10*1 | 0,420,10*1,3-5 | 0,350,03*1,3 | 0,840,11*1 |
7. Плавание, введение рибоксина и эссенциале | 0,770,13*1-6 | 0,680,13*1,3 | 0,690,08*2-6 | 0,920,10*1 |
8. Плавание, введение милдроната и эссенциале | 0,680,13*1,5 | 0,940,20*2-7 | 0,440,06*1,2,4-7 | 0,580,062-7 |
9. Плавание, введение мексидола и эссенциале | 1,350,23*2-8 | 0,700,15*1-3,4-6 | 0,280,03*1,3,7,8 | 0,880,11*1,8 |
Возникновение кровотечения реальных условиях нередко происходит на фоне интенсивных физических нагрузок. Усиление свободно-радикальных процессов при кровопотере и физических нагрузках сопровождается снижением энергообеспечения клеток. В связи с этим можно предположить, что эффективная коррекция иммунометаболических процессов при кровопотере и физической нагрузке будет иметь место в случае применения эссенциале с активаторами цикла трикарбоновых кислот и окислительной цепи митохондрий.
Экспериментальная проверка этого предположения показала, что после кровопотери в сочетании с физической нагрузкой введение мексидола или кудесана не влияло на иммунометаболические параметры, а применение этих препаратов с эссенциале уменьшало выраженность изменения (но не нормализовало) определявшихся параметров.
Таким образом, кровопотеря на фоне интенсивных физических нагрузок становятся причиной развития резко выраженных, трудно поддающихся коррекции иммунометаболических нарушений.
Изменение иммунометаболических параметров и их коррекция милдронатом, рибоксином и эссенциале при длительном поступлении в организм этанола. Изучено влияние многократного (30 дней подряд и длительного (70 дней подряд) поступления в организм низких доз этанола (0,3 г/100 г массы тела) на неспецифическую резистентность и иммунологическую реактивность организма, метаболизм и функциональную активность гепатоцитов и эритроцитов, а также на содержание в плазме крови соединений, характеризующих состояние углеводного, липидного и белкового обменов.
Установлено, что после многократного введения этанола наблюдалось нерезко выраженное снижение ФМА нейтрофилов и угнетение развития ГИО на ЭБ и ЛПС.
В печени увеличивалась активность СОД и каталазы, содержание ДК и МДА. В эритроцитах после многократного введения этанола увеличивалась активность СОД и каталазы, повышалось содержание АГП и МДА. Все остальные определявшиеся показатели (БФГ и АТФ, активность Mg2+- АТФ-азы, ГП и ГР) не отличались от уровня контроля (рис.1).
В крови алкоголизированных животных активность АСТ не отличалась от нормы, а АЛТ была значительно повышена. Существенно снижался коэффициент де-Ритиса (АСТ/АЛТ). Повышалась активность ЩФ, концентрация ТАГ и холестерина. Не изменялось активность фосфокреатинкиназы (ФКК) и концентрация белка и мочевины.
При длительном приеме этанола у животных ФМА нейтрофилов была существенно подавлена, а развитие ГИО на ЭБ и ЛПС резко угнетено.
В печени крыс активность СОД и каталазы была существенно снижена, а концентрация ДК и МДА увеличена. В эритроцитах имело место снижение содержания БФГ и АТФ. Снижалась активность Mg2+- АТФ-азы, СОД, ГП, ГР и каталазы. Увеличивалось содержание АГП и МДА.
В крови животных второй группы повышены активность АЛТ и, особенно АСТ (коэффициент де-Ритиса становится выше 1), ЩФ, увеличивалась концентрация общего билирубина, ТАГ, холестерина, ДК и МДА. Повышалась активность ФКК и снижалась концентрация белка.
Изучено иммуномодулирующее действие милдроната, рибоксина и эссенциале при длительном поступлении в организм этанола. Этанол вводили внутрижелудочно через зонд 60-кратно с интервалом 24 часа по 0,3 г/100 г массы тела.
Введение милдроната усиливало, но не нормализовало выраженность показателей ФМА ПЯЛ, иммунологическую реактивность и состояние мембраны гепатоцитов. Рибоксин и эссенциале в выбранных дозах не оказывали существенного влияния на функции иммуноцитов и состояние мембран.
В сочетании с рибоксином милдронат нормализовал ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ. Совместное применение милдроната с эссенциале нормализовало большинство определявшихся показателей функциональной активности иммуноцитов и гепатоцитов.
Рисунок 1. Влияние этанола на концентрацию макроэргических соединений (БФГ и АТФ), активность антиоксидантных ферментов (СОД, КАТ, ГП и ГР) и содержание продуктов перекисного окисления липидов (ДК и МДА) в эритроцитах.
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ: 1-контроль (без введения этанола); 2-введение этанола 30-кратно; 3-введение этанола 70-кратно.
-существенность различий (р Л 0,05) относительно 1;
-существенность различий (р Л 0,05) относительно 2.
В эритроцитах крыс, получавших этанол, милдронат и рибоксин или эссенциале, уменьшалась выраженность изменений БФГ, АТФ, СОД, АГП и МДА. Легкие эритроциты таких животных при аллогенном переносе не влияли на ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ (рис. 2)
На основании полученных данных можно прийти к заключению о важной роли эритроцитов в развитии иммуносупрессии при алкогольной интоксикации и в реализации иммуномодулирующего действия регуляторов энергетического обмена и полиненасыщенных фосфолипидов.
Рисунок 2. Влияние милдроната, рибоксина и эссенциале на иммуносупрессирующие свойства эритроцитов при алкогольной интоксикации.
Примечания: А - АОК; Б - РМЛ. По оси абсцисс: 1. Контроль (без введения этанола и эритроцитов); 2. Введение эритроцитов, получавших этанол крыс; 3. Введение эритроцитов, получавших этанол, милдронат и рибоксин; 4. Введение эритроцитов крыс, получавших этанол, милдронат и эссенциале.
Иммуномодулирующее действие иммобилизованного эритроцитами менадиона и эссециале в норме и после длительного поступления в организм этанола. Изучено влияние синтетического водорастворимого аналога витамина К2 - менадиона на свойства эритроцитов. Эритроциты интактных и алкоголизированных крыс инкубировали с менадионом (0,1, 0,2 или 0,5 мг препарата в 1 мл изотонического раствора NaCl + 107 эритроцитов; инкубация 30 мин при 37С). После инкубации эритроциты интактных и алколизированных крыс приобретали иммуностимулирующие свойства. Наиболее выраженными они были после обработки 0,2 мг препарата.
Изучено влияние стромы эритроцитов включившей менадион (СЭВМ) интактных крыс, на развитие иммунного ответа индуцированного ЭБ у здоровых и алкоголизированных крыс. СЭВМ вводили внутрибрюшинно 5-кратно с интервалом 24 ч по 108 клеток на 1 кг массы тела интактным и алкоголизированным крысам. Одновременно с первой инъекцией СЭВМ животных иммунизировали ЭБ. Контролем служили животные, получавшие инъекции стромы эритроцитов, не содержащей менадион.
СЭВМ стимулировал развитие иммунного ответа на ЭБ у интактных крыс. Наиболее эффективной была строма с включенными в нее менадионом при содержании его в инкубационной среде в дозе 0,2 мг. Строма эритроцитов, полученная при содержании менадиона 0,2 мг, нормализовала развитие иммунного ответа у алкоголизированных крыс, а строма, в которую менадион включался при содержании его в среде в дозе 0,1 мг или 0,5 мг, усиливала, но не нормализовала этот процесс у алкоголизированных животных.
Изучено влияние СЭВМ и менадиона, адсорбированного на эритроцитах (МАЭ), на выделение цитокинов клетками селезенки крыс. Оказалось, что МАЭ индуцирует выделение иммуностимулирующего фактора прилипающими к стеклу клетками селезенки, а СЭВМ активирует выделение иммуностимулирующего фактора прилипающими и неприлипающими клетками. Супернатант прилипающих спленоцитов нормализует или снижает величины показателей ПОЛ и антиоксидантного статуса алкоголизированных животных. Иммунологически активный супернатант неприлипающих клеток не оказывал влияния на определявшиеся показатели антиоксидантного статуса.
Стабильность восстановленной стромы эритроцитов, вероятно, можно повысить путем обработки ее эссенциале. Полиненасыщенные фосфолипиды этого препарата, включаясь в билипидный слой стромы, по-видимому, будут служить дополнительным фактором сшивки и вызывать изменения композиции эпитопов поверхностного слоя мембраны. Последнее может быть причиной повышения активности взаимодействия стромы с макрофагальными и лимфоидными клетками, приводящего к выделению иммунорегуляторных цитокинов. Принимая во внимание эти исходные положения, была предпринята попытка получения соиммобилизированных с помощью стромы эритроцитов менадиона и полиненасыщенных фосфолипидов эссенциале. С этой целью получали СЭВМ и инкубировали его с эссенциале (108 частиц восстановленной стромы + 1мл эссенциале, инкубация 2 ч при 37С). После инкубации строму 2 раза отмывали холодным изотоническим раствором NaCl. Полученный препарат вводили по принятой схеме интактным и алкоголизированным крысам, иммунизированным ЭБ. Установлено, что менадион и эссенциале, соиммобилизованные с помощью стромы эритроцитов (МЭССЭ), стимулировали развитие иммунного ответа на ЭБ в большей степени, чем СЭВМ (табл. 8).
Таблица 8
Иммуномодулирующая активность МАЭ, СЭВМ и МЭССЭ.
Условия опыта | АОК, интактных животных, 103/орган | АОК, алкоголизированных крыс, 103/орган |
1. Контроль (без введения иммобилизированных препаратов) | 24,72,8 | 8,60,9 |
2. Введение МАЭ | 56,46,9*1 | 17,816,2*1 |
3. Введение СЭВМ | 84,09,6*1,2 | 20,62,1*1 |
4. Введение ЭОЭ | 79,88,7*1,2 | 18,51,9*1 |
5. Введение МЭССЭ | 118,512,0*1-4 | 27,43,1*1-4 |
Примечание: ЭОЭ - эритроциты, обработанные эссенциале.
Существенной характеристикой эффективности иммуномодулирующего действия различных средств является продолжительность вызываемого ими эффекта. Установлено, что МЭССЭ вызывал более длительный иммуностимулирующий эффект, чем СЭВМ, а действие МАЭ оказалось двухфазным. Эффект стимуляции сохранялся в течение 24 ч после заключительной инъекции МАЭ, 72 ч после СЭВМ и 120 ч после введения МЭССЭ. Иммунизация через 72 ч после введения МАЭ индуцировала развитие иммунного ответа, выраженность которого была меньше, чем у контрольных животных. Спустя 120 ч, реактивность животных не отличалась от контроля.
Изучение влияния СЭВМ и МЭССЭ на иммунологическую реактивность алкоголизированных животных, показало, что обе иммобилизованные формы усиливают развитие иммунного ответа на ЭБ, причем эффект усиления при инъекциях алкоголизированным крысам МЭССЭ был выражен сильнее, чем при введении СЭВМ.
Результаты проведенных экспериментов показывают, что МЭССЭ являются более эффективным, чем СЭВМ, иммуномодулятором как в норме, так и при длительном введении этанола.
СЭВМ и МЭССЭ, в отличие от МАЭ, индуцируют выделение иммуномодулирующих факторов не только прилипающими, но и не прилипающими к стеклу спленоцитами. Некоторые из выделяемых прилипающими клетками цитокины усиливают выделение гепатоцитами белков острой фазы (С.А. Кетлинский и др., 1992).
К их числу относятся Ц1-антипротеазы (ААП) и -2-макроглобулины (АМГ), обладающие выраженными иммуносупрессорными свойствами (Л.Г. Прокопенко и др., 1994). В связи с изложенным, возникло предположение, что среди цитокинов, выделяемых не прилипающими к стеклу клетками селезенки животных, получавших инъекции МЭССЭ, есть не только соединения, стимулирующие развитие иммунного ответа, но и факторы, участвующие в сохранении иммунного гомеостаза. Для проверки этого предположения проведены эксперименты на крысах Вистар, получавших инъекции МЭССЭ. Исследовали супернатанты прилипающих и неприлипающих клеток селезенки этих животных. Определяли иммуномодулирующую активность полученных супернатантов и исследовали их иммунорегулирующее действие. С этой целью супернатанты прилипающих и неприлипающих спленоцитов, содержащие иммуностимулирующие факторы вводили интактным животным, полученные сыворотки использовали для обработки нативных эритроцитов интактных аллогенных крыс (Л.Г. Прокопенко, Ю.О. Яхонтов, 1976). После обработки эритроцитов сывороткой их инкубировали с менадионом. В части опытов сыворотку, используемую для обработки эритроцитов, предварительно истощали кроличьими сыворотками, содержащими антитела к ААП и АМГ (антиААП и антиАМГ). Использовали антиААП с титром антител 1:64 и антиАМГ с титром 1:128. Инъекции СПС приводили к повышению концентрации ААП и АМГ в крови аллогенных интактных крыс, а инъекции СНС не влияли на содержание в крови этих белков.
Принимая во внимание тот факт, что ААП и АМГ обладают иммуносупрессирующими свойствами, изучали иммуномодулирующую активность сыворотки крыс, получавших инъекции СПС и СНС (СКСПС и СКСНС). Сыворотки вводили внутрибрюшинно 5-кратно с 12-часовым интервалом по 0,2 мл. Одновременно с первой инъекцией сыворотки животных иммунизировали ЭБ. Установлено, что СКСНС при аллогенном переносе не оказывала влияния на развитие иммунного ответа, а СКСПС обладала иммуносупрессирующими свойствами.
Большой интерес представляет вопрос об иммуномодулирующих свойствах цитокинов, выделяемых неприлипающими клетками селезенки. Выше было показано, что СНС крыс, получавших МЭССЭ, не влияют на содержание ААП и АМГ, в сыворотке крови интактных животных, а СКСНС не обладают иммуносупрессирующими свойствами. В связи с этим, возникло предположение, что в составе СНС крыс, получавших инъекции МЭССЭ, есть соединения, влияющие на накопление в крови ААП и АМГ индуцируемые СПС. Для проверки этого предположения интактным крысам одновременно вводили СПС и СНС крыс, получавших инъекции МЭССЭ, и иммунизировали их ЭБ. Оказалось, что в сыворотке крови таких животных активность ААП и АМГ не отличалась от контроля. Сыворотки крови крыс, получавших инъекции СПС и СНС, не влияли на развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ, у аллогенных реципиентов и не индуцировали появление у эритроцитов резистентности к менадиону.
Обработка эритроцитов интактных крыс СКСНС или СКСПС не приводила к появлению у них иммуномодулирующих свойств. После обработки менадионом эритроциты, предварительно инкубированные с СКСНС, приобретали иммуностимулирующие свойства. У эритроцитов, инкубированных с СКСПС, менадион не индуцировал появления иммуностимулирующих свойств.
Это свидетельствует о наличии в СКСПС фактора, повышающего резистентность эритроцитов к действию менадиона. Инкубация эритроцитов с равной по белку смесью СПС и СНС увеличивала резистентность к действию менадиона. На основании полученных данных, можно заключить, что в составе СНС есть соединения, блокирующие выделение в сосудистое русло веществ, индуцирующих выделение субстанций, обладающих иммуносупрессорными свойствами и повышающих резистентность эритроцитов к действию менадиона. Вместе с тем, СНС, по-видимому, не содержит соединений, блокирующих действие факторов СПС на уровне мембраны эритроцитов.
В связи с тем, что введение животным СКСПС приводит к повышению концентрации в крови ААП и АМГ, возникло предположение, что появление у эритроцитов резистентности к менадиону обусловлено связыванием с их мембраной антипротеолитических белков СКСПС. Истощение СКСПС антиААП не влияло на ее свойство индуцировать появление у эритроцитов резистентности к действию менадиона. Вместе с тем, СКСПС теряла это свойство после истощения антиАМГ.
Проведенные эксперименты показывают, что резистентность эритроцитов к действию менадиона обусловлена связыванием с их мембраной АМГ. Повышение концентрации этого белка под влиянием цитокинов, выделение которых индуцируется МЭССЭ, снижает чувствительность к действию менадиона и таким путем ограничивает выраженность иммуномодулирующего эффекта, вызываемого этим препаратом. Вместе с тем, факторы, выделяемые под влиянием МЭССЭ неприлипающими клетками селезенки, ингибируют выделение антипротеаз в сосудистое русло.
Вероятно, с выделением указанных факторов неприлипающими к стеклу клетками селезенки, наблюдающемся при введении СЭВМ и МЭССЭ, и отсутствие этого эффекта при инъекциях МАЭ является причиной выпадения супрессорной фазы и большей продолжительности иммуностимулирующего эффекта, вызываемого СЭВМ и МЭССЭ. На основании этих данных, можно считать, что эритроциты, цитокины, выделяемые различными популяциями спленоцитов, и клетки, секретирующие АМГ, образуют функциональную систему, обеспечивающую сохранение иммунного гомеостаза при введении в организм нафтохинонов.
Эритротромбоцитарный механизм развития иммуносупрессии при интенсивных физических нагрузках и алкогольной интоксикации.
Изучено влияние липопротеидов и тромбоцитов на иммуносупрессирующие свойства эритроцитов, после выполнения интенсивной физической нагрузки и возможность коррекции этого влияния с помощью эссенциале и милдроната.
В ходе проведенных исследований установлено, что после инкубации с суммарной фракцией липопротеидов низкой и очень низкой плотности (ФЛП) интактных или плававших крыс, а также с тромбоцитами интактных крыс, эритроциты интактных животных не приобретали иммуносупрессирующих свойств. В отличие от этого эритроциты интактных крыс, инкубированные с тромбоцитами плававших животных, обладали иммуномодулирующей активностью. Это можно расценить как возможность индуцирования иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов без участия ФЛП, или как способность последних индуцировать появление у тромбоцитов свойства вызывать появление супрессирующей активности у эритроцитов. Для выяснения этого вопроса поставлено два варианта экспериментов. В первом эритроциты интактных крыс обрабатывали ФЛП плававших животных, и после осаждения центрифугированием их инкубировали с тромбоцитами интактных крыс, во втором эритроциты интактных крыс инкубировали с тромбоцитами интактных животных, предварительно инкубированных с ФЛП плававших крыс. В первом варианте экспериментов эритроциты не приобрели иммуносупрессирующей активности, во втором они становились способными вызывать при аллогенном переносе супрессирующий эффект. Результаты этих наблюдений позволяют считать, что феномен тромбоэритроцитарной иммуносупрессии возникает вследствие появления у тромбоцитов под влиянием ФЛП свойства индуцировать появление иммуносупрессирующей активности у эритроцитов. Вероятно, это свойство ФЛП обусловлено изменением их жирнокислотного состава (табл. 9).
Таблица 9
Влияние ФЛП и тромбоцитов плававших крыс на активность эритроцитов интактных крыс
Условия опыта | ИАФ, ед | ОРН, ед | АОК, 103/орган | РМЛ, мг |
1. Контроль (без введения эритроцитов) | 65,37,1 | 18,41,9 | 26,33,0 | 5,30,5 |
2. Введение эритроцитов интактных крыс. | 68,07,5 | 19,11,8 | 28,03,2 | 5,50,6 |
3. Введение эритроцитов интактных крыс, инкубированных с ФЛП интактных крыс. | 64,97,3 | 17,61,7 | 25,83,2 | 5,20,5 |
4. Введение эритроцитов интактных крыс, инкубированных с ФЛП плававших крыс. | 67,86,5 | 19,12,0 | 27,13,3 | 5,40,5 |
5. Введение эритроцитов интактных крыс, инкубированных с тромбоцитами интактных крыс. | 65,77,0 | 18,91,7 | 24,71,6 | 5,30,6 |
6. Введение эритроцитов интактных крыс, инкубированных с тромбоцитами плававших крыс. | 43,65,8*1-5 | 9,51,4*1-5 | 13,21,7*1-5 | 3,20,4*1-5 |
7. Введение эритроцитов интактных крыс, обработанных ФЛП плававших крыс и инкубированных с тромбоцитами интактных крыс. | 63,97,4*6 | 17,31,8*6 | 28,83,1*6 | 6,20,8*6 |
8. Введение эритроцитов интактных крыс, инкубированных с тромбоцитами интактных крыс, обработанных с ФЛП плававших крыс. | 44,85,7*1-5,7 | 9,81,3*1-5,7 | 14,61,6*1-5,7 | 3,40,4*1-5,7 |
Эритроциты интактных крыс, получавших эссенциале, после инкубации с тромбоцитами плававших крыс не приобретали иммуносупрессирующей активности. Инкубация эритроцитов интактных крыс, которым вводили милдронат, с тромбоцитами плававших крыс индуцировала появление у эритроцитов иммуносупрессирующих свойств. Такой же эффект наблюдался при инкубации эритроцитов интактных крыс с тромбоцитами плававших крыс, получавших эссенциале. В отличие от этого эритроциты интактных крыс, инкубированные с тромбоцитами плававших крыс, получавших милдронат, оставались иммунологически неактивными (табл. 10).
Таблица 10
Влияние эссенциале и милдроната на феномен тромбоэритроцитарной иммуносупрессии
Условия опыта | ИАФ, ед | ОРН, ед | АОК, 103/орган | РМЛ, мг |
1. Контроль (без введения эритроцитов) | 65,37,1 | 18,41,9 | 26,33,0 | 5,30,5 |
2. Введение эритроцитов интактных крыс. | 68,07,5 | 19,11,8 | 28,03,2 | 5,50,6 |
3. Введение эритроцитов интактных крыс, инкубированных с тромбоцитами плававших крыс. | 44,14,6*1 | 9,30,9*1 | 12,31,4*1,2 | 3,20,4*1,2 |
4. Введение эритроцитов интактных крыс, получавших эссенциале, инкубированных с тромбоцитами плававших крыс. | 63,46,8*3 | 17,61,7*3 | 27,13,0*3 | 5,20,6*3 |
5. Введение эритроцитов интактных крыс, получавших милдронат, инкубированных с тромбоцитами плававших крыс. | 43,84,4*1,2,4 | 9,81,2*1,2,4 | 10,81,4*1,2,4 | 3,40,4*1,2,4 |
6. Введение эритроцитов интактных крыс, инкубированных с тромбоцитами крыс, получавших эссенциале. | 42,54,2*1,2,4 | 10,31,2*1,2,4 | 15,01,6*1,2,4 | 3,30,4*1,2,4 |
7. Введение эритроцитов интактных крыс, инкубированных с тромбоцитами крыс, получавших милдронат. | 66,37,1*3,5,6 | 20,52,1*3,5,6 | 27,93,1*3,5,6 | 5,40,6*3,5,6 |
Обобщение приведенных данных позволяет прийти к заключению о том, что ФЛП играют роль ключевого звена в развитии тромбоэритроцитарного механизма иммуносупрессии при интенсивных физических нагрузках. Эти соединения (вероятно, после окислительной модификации) приводят к возникновению у тромбоцитов свойства индуцировать появление у легких эритроцитов иммуносупрессирующей активности. На основе полученных данных можно сделать вывод, что отмена тромбоэритроцитарной супрессии может быть достигнута вызванным эссенциале повышением резистентности эритроцитов к действию модифицированных ФЛП и тромбоцитов или разобщением взаимодействия ФЛП и тромбоцитов под влиянием милдроната.
Ранее было показано, что появление иммунологической активности у эритроцитов коррелируют с активностью в их строме Mg2+ - АТФазы, обеспечивающей перенос в эритроциты ионов Mg2+, активирующих практически все ферменты гликолиза (А. Ленинджер, 1985) . Учитывая это, изучено влияние тромбоцитов, выделенных из крови плававших крыс, на активность Mg2+ - АТФазы стромы эритроцитов интактных животных.
Установлено, что инкубация тромбоцитов плававших крыс с цельными эритроцитами интактных животных или с их стромой (соотношение тромбоцитов и эритроцитов или стромальных частиц - 10:1) существенно снижает активность Mg2+ - АТФазы в стромальных частицах (активность Mg2+ - АТФазы в строме равнялась 0,63 0,08, активность фермента после инкубации стромы с тромбоцитами - 0,42 0,06 мкмоль фосфата на 1 г белка в час). В связи с изложенным возник вопрос о влиянии тромбоцитов на функциональную активность лейкоцитов периферической крови. С целью его выяснения тромбоциты плававших крыс инкубировали с лейкоцитами сенсибилизированными антисывороткой к ЭБ, а также несенсибилизированными ПЯЛ или лимфоцитами интактных животных. Оказалось, что тромбоциты не влияли на активность НАДФН - оксидазы ПЯЛ (до инкубации 1,31 0,19, после инкубации 1,27 0,16 п моль/(мин 103 клеток)) и содержание ФДФ в лимфоцитах (до инкубации 0,92 0,18, после инкубации 0,86 0,17 п моль/106 клеток). Вместе с тем тромбоциты снижали выраженность феномена АЗК - (до инкубации 11,6 1,3%, после инкубации 7,2 0,8%).
В ходе дальнейших исследований изучено влияние эссенциале и регуляторов энергетического обмена на вышеуказанные иммунометаболические параметры. Установлено, что введение плававшим крысам эссенциале с рибоксином отменяло способность тромбоцитов снижать активность Mg2+ - АТФазы стромы эритроцитов интактных животных, но не влияло на вызываемое ими снижение выраженности феномена АЗКЦ. После инъекции, плававшим животным, эссенциале с мексидолом или милдронатом тромбоциты сохранили способность снижать Mg2+ - АТФазы стромы эритроцитов и теряли свойство снижать выраженность феномена АЗКЦ.
Результаты проведенных экспериментов показали, что тромбоциты участвуют в возникновении иммуносупрессорного эффекта, взаимодействуя с эритроцитами и некоторыми популяциями лейкоцитов. Характер взаимодействия эритроцитов и лейкоцитов не одинаков, так как оно избирательно корригируется сочетанием эссенциале с другими препаратами. Вероятно, в реализации этого взаимодействия участвуют генерируемые тромбоцитами активные метаболиты кислорода, стабильные и радикальные формы окислов азота, а также продукты перекисного окисления липидов.
В ходе дальнейших исследований изучали механизм развития эритротромбоцитарной иммуносупрессии при длительном поступлении этанола и возможность её коррекции эссенциале и регуляторами энергетического обмена. Выраженная имуносупрессирующая активность характерна для окислительно-модифицированных липопротеинов низкой плотности. Они индуцируются активированными формами кислорода, генерация которых резко усиливается при токсических поражениях печени, вызываемых ксенобиотиками и этанолом (В.В. Зинчук, М.Н. Ходосовский, 2006). Одним из наиболее часто возникающих окислителей является стабильный оксид азота (NO) и его радикал (NO), генерируемые в больших количествах клетками печени и крови (И.П. Серая, Я.Р. Нарциссов, 2006). Учитывая это, можно было предположить, что NO является одним из метаболитов, вызывающих окислительную модификацию липопротеинов. Проведенные для проверки этого предположения эксперименты показали, что нейтрофилы алкоголизированных крыс, инкубированные в полной среде (30 мин., 37С), выделяют большее количество оксида азота (N0), чем нейтрофилы интактных животных (содержание NО в среде соответственно равнялось 0,45 и 1,15 нмоль/5х106 клеток). Клетки осаждали центрифугированием, к надосадочной жидкости добавляли ФЛП интактных крыс и инкубировали 1 час. После инкубации в среде увеличивалось содержание МДА на 7-12% по сравнению с исходным уровнем в той же пробе. Это позволяет считать, что под влиянием NO среды происходит окислительная модификация ЛНП и ЛОНП.
После инкубации тромбоцитов интактных крыс с ФЛП алкоголизированных животных определяли в них содержание МДА. До инкубации оно равнялось 0,54, после инкубации 1,63 нмоль/108 тромбоцитов. Таким образом, под влиянием ФЛП произошла окислительная модификация тромбоцитов (ОМТ).
Эритроциты интактных животных инкубировали с окислительно-модифицированными тромбоцитами. После инкубации и отделения тромбоцитов в эритроцитах обнаруживалось увеличение содержания продуктов ПОЛ и снижение концентрации БФГ. Такие эритроциты при аллогенном переносе супрессировали развитие иммунного ответа у интактных крыс (в норме АОК - 26,42,1 тыс/селезенка после инкубации с тромбоцитами - 12,61,0 тыс/селезенка). Инкубация ОМТ с нейтрофилами интактных животных ингибировала их ФМА (в норме ИАФ = 64,25,8, ОРН = 17,81,5; после инкубации с тромбоцитам ИАФ=47,53,9; ОРН=9,41,0). ОМТ in vitro не влияли на величину метаболических маркеров активации лимфоцитов (содержание в них фруктозо-2,6-дифосфата и концентрация лактата после инкубации с тромбоцитами оставались таким же как до нее).
Эффекты вызываемые действием тромбоцитов на функциональную активность клеток опосредуются многими факторами, не исключено, что одним из которых является индукция образования вторичных мессенджеров в том числе простагландинов и Са2+. Учитывая это, исследовано влияние ингибитора циклооксигеназы, диклофенака, блокатора Са2+-каналов L-тина, изоптина, на вызываемое тромбоцитами алкоголизированных животных появление иммуносупрессирующей активности у эритроцитов и снижение ФМА нейтрофилов. Установлено, что внесение в среду инкубации тромбоцитов и эритроцитов диклофенака или изоптина не влияло на появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов. Вероятно появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов не зависит от изменения содержания простагландинов и Са2+ в эритроцитах. Добавление в среду инкубации тромбоцитов и нейтрофилов диклофенака увеличивало ФМА последних, а внесение изоптина не влияло на показатели защитной функцией этих клеток.
Таким образом, угнетающее влияние тромбоцитов алкоголизированных крыс на ФМА нейтрофилов in vitro зависит от активности циклооксигеназы. Это предполагает непосредственное участие простагландинов, способных ингибировать функциональную активность нейтрофилов через увеличение в них цАМФ. Вместе с тем угнетающее влияние тромбоцитов не зависит от состояния Са2+-каналов, блокируемых изоптином. Это может рассматриваться как низкая чувствительность поглотительной и окислительной функции нейтрофилов к изменению содержания Ca2+ или как проникновение в клетку Ca2+ или как проникновение в клетку Сa2+ через каналы не блокируемые изоптином.
Введение алкоголизированным крысам эссенциале предотвращало появление у тромбоцитов свойства оказывать влияние на метаболизм и функцию эритроцитов и нейтрофилов интактных крыс. Рибоксин и милдронат такого эффекта не вызывали. Инъекции интактным животным рибоксина предотвращали снижение содержания БФГ и увеличение концентрации МДА в эритроцитах, а также появление иммуносупрессирующих свойств у этих клеток после инкубации их с тромбоцитами алкоголизированных крыс. Эссенциале не снижал чувствительность эритроцитов и нейтрофилов интактных крыс к действию тромбоцитов алкоголизированных животных. При введении интактным крысам милдроната нейтрофилы приобретали резистентность, эритроциты сохраняли чувствительность к действию тромбоцитов алкоголизированных животных.
Однонаправленность действия милдроната, рибоксина и эссенциале при введении в организм алкоголизированных животных и в культуральную среду, содержащую тромбоциты крыс получавших этанол позволяет считать, что тромбоциты во взаимодействии с эритроцитами играют важную роль в развитии иммуносупрессии при длительном поступлении в организм этанола и в реализации иммуномодулирующего действия изученных препаратов.
Иммунометаболические эффекты, вызываемые кратковременным поступлением этанола. Изучено влияние кратковременно поступающих в организм малых доз этанола на иммунометаболические параметры организма и о роли эритроцитов в реализации этого влияния.
Эксперименты проведены на крысах Вистар, которым вводили внутрижелудочно через зонд этанол в дозе 0,3 г/100 г массы тела 7- кратно с интервалом 24 часа.
Установлено, что после 7-кратного введения этанола наблюдалась выраженная стимуляция развития ГИО на ЭБ. Количество АОК в селезенке контрольных крыс после иммунизации ЭБ равнялась 24,52,6 тыс., а в селезенке животных, получавших этанол 51,45,3 тыс. Выраженность ГИО на ЛПС после введения этанола не отличалось от контроля (соответственно 18,52,0 тыс. и 17,41,9 тыс.).
Семикратное введение малых доз этанола не оказывало существенного влияния на содержание триацилглицеролов, холестерина и общего билирубина, активность щелочной фосфатазы, повышало активность аланин- и аспартатаминотрансфераз в сыворотке крови, увеличивала активность супероксиддисмутазы и каталазы, не влияла на концентрацию диеновых коньюгатов и малонового диальдегида в клетках печени. В эритроцитах увеличивалось содержание 2,3 - бисфосфоглицерата и аденозинтрифосфата, повышалась активность супероксиддисмутазы и каталазы, не изменялось содержание ацилгидроперекисей и малонового диальдегида (табл. 11).
Таблица 11.
Влияние малых доз этанола на метаболические параметры
Биохимические параметры | До поступления этанола | После 7 кратного поступления 0,3г/100г массы тела этанола | После однократного поступления 3г/100г массы тела этанола | После 7-кратного поступления 0,3 г и однократного поступления 3 г этанола |
Сыворотка крови | ||||
ТАГ, моль/л | 1,70,2 | 1,80,3 | 1,50,2 | 1,70,3 |
Холестерин, моль/л | 4,30,3 | 4,70,3 | 4,30,4 | 4,60,4 |
АЛТ, ммоль/ч х л | 1,80,6 | 8,61,3*1 | 5,30,9*1,2 | 5,60,9*1,2 |
АСТ, ммоль/ч х л | 1,40,3 | 3,90,5*1 | 2,60,4*1,2 | 2,80,5*1,2 |
ЩФ, ммоль/ч х л | 7,21,2 | 7,81,3 | 7,51,4 | 7,01,1 |
ОБ, моль/л | 8,40,7 | 8,10,6 | 8,80,9 | 8,60,8 |
Эритроциты | ||||
БФГ, мкмоль/л | 5,80,3 | 7,10,4*1 | 5,30,4 | 5,20,4*2 |
АТФ, мкмоль/мл | 1,20,1 | 1,60,1*1 | 3,10,1*2 | 1,40,1 |
СОД, ЕД/мл | 59,42,8 | 72,33,1*1 | 42,62,6*1,2 | 5,72,0*1,3 |
Каталаза, ЕД/мл | 11,40,5 | 19,50,7*1 | 0,70,3*1,2 | 12,34,1*2,3 |
АГП, D233/мл | 1,40,3 | 1,60,4 | 1,60,3 | 1,50,4 |
МДА, мкмоль/л | 45,03,7 | 48,04,1 | 43,84,0 | 45,24,1 |
Ткань печени | ||||
СОД, ЕД/мл | 4,10,2 | 6,30,4*1 | 3,20,2*1,2 | 5,40,3*1,3 |
Каталаза, ЕД/мл | 20,91,3 | 27,72,1*1 | 13,51,8*1,2 | 18,82,0*2,3 |
ДК, нмоль/л | 52,72,4 | 49,62,3 | 63,33,7*1,2 | 55,12,6*2,3 |
МДА, мкмоль/л | 22,61,5 | 20,81,7 | 28,11,8*1,2 | 23,61,6*3 |
Приведенные данные показывают, что метаболические изменения после приема малых доз этанола направлены в основном на сохранение антиоксидантного статуса и энергетического потенциала клеток. Повышение аспартат- и аланинаминотрансфераз, преимущественно последней (коэффициент де-Ритиса до поступления этанола - 0,78, после поступления - 0,45), вероятно следует рассматривать не как следствие повреждения цитоплазматических мембран гепатоцитов, а как усиление анаболической направленности обменных процессов (И.М. Рослый и др., 2004).
Можно предположить, что предварительное поступление малых доз этанола будет индуцировать возникновение иммунометаболических сдвигов, противодействующих последующему деструктивному влиянию на организм больших доз этого препарата (явление гомеостаза).
Однократное введение большой дозы этанола снижало показатели ФМА нейтрофилов и иммунологической реактивности в отношении ЭБ и ЛПС, повышало активность АЛТ и АСТ в крови, снижало активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах и гепатоцитах, увеличивало содержание продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах и печени. Предварительное кратковременное введение малых доз этанола ослабляло иммуносупрессорное действие и ограничивало снижение антиоксидантных ферментов в эритроцитах и печени (табл. 11).
Полученные данные свидетельствуют о важной роли антиокислительного состояния клеток в реакции иммуномодулирующего действия низких доз этанола.
Повышение иммунологической активности, наблюдающееся после действия некоторых стрессиндуцирующих агентов (умеренно высокой внешней температуры, физической нагрузки низкой интенсивности, дозированной кровопотери), а так же после введения некоторых лекарственных средств (протео- и гликолитических ферментов, жирорастворимых витаминов) обусловлено появлением в крови эритроцитов, обладающих иммуностимулирующими свойствами (Л.Г. Прокопенко, И.Л. Бровкина, 2003). В связи с этим возникло предположение, что такие эритроциты могут накапливаться в крови и при поступлении в организм низких доз этанола. Установлено, что после 7-дневного введения 0,3 г/100 г массы тела этанола в сосудистом русле животных появляются эритроциты, стимулирующие у аллогенных реципиентов развитие ГИО на ЭБ и не влияющие на иммунный ответ индуцированный ЛПС. Иммуномодулирующими свойствами обладали тяжелые эритроциты, легкие клетки такого эффекта не вызывали.
Результаты проведенных исследований показывают, что при кратковременном поступлении в организм небольших доз этанола в сосудистом русле появляются эритроциты, оказывающие влияние на иммунологическую реактивность организма. Тяжелые эритроциты животных, кратковременно получавших этанол, стимулируют развитие Т-зависимого иммунного ответа, но не влияют на интенсивность Т-независимого ответа. Это свидетельствует о том, что иммуностимулирующее действие эритроцитов реализуется при участии иммунорегуляторных популяций макрофагов и Т-лимфоцитов.
Регуляторный эффект этих клеток опосредуется выделяемыми ими гуморальными факторами. Учитывая это, исследовано влияние тяжелых эритроцитов крыс, кратковременно получавших этанол, на выделение прилипающими и не прилипающими к стеклу клетками селезенки интактных крыс факторов, модулирующих развитие иммунного ответа.
Установлено, что супернатанты прилипающих и не прилипающих спленоцитов крыс, получавших инъекции эритроцитов интактных крыс не обладали иммуномодулирующей активностью, не вызывал иммуномодулирующего эффекта так же супернатант неприлипающих клеток селезенки крыс, получавших этанол. Вместе с тем супернатант прилипающих к стеклу спленоцитов крыс, получавших инъекции эритроцитов кратковременно алкоголизированных крыс стимулировал у неалкоголизированных аллогенных реципиентов развития Т-зависимого иммунного ответа, но не влияли на выраженность Т-независимого иммунного ответа.
Фракционирование супернатантов прилипающих клеток на сефадексе G-150 позволила выделить три белковые фракции. Установлено, что фракция III повышала иммунологическую реактивность реципиентов в отношении ЭБ, но не влияла на реактивность в отношении ЛПС.
Результаты проведенного исследования показывают, что иммуномодулирующее действие кратковременного поступления в организм этанола опосредовано различными соединениями, выделяющимися прилипающими к стеклу клетками селезенки, после активации их модифицированными тяжелыми эритроцитами алкоголизированных крыс.
Иммуномодулирующие эффекты полиненасыщенных фосфолипидов и жирорастворимых витаминов опосредуются эритроцитами, поэтому интересно было выяснить влияние малых доз этанола на иммуномодулирующее действие этих соединений.
Установлено, что введение эссенциале или менадиона не оказывало влияния на развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Введение этанола с указанными выше препаратами приводило к значительно более выраженному усилению иммунного ответа, чем при введении только этанола.
Однократное поступление в организм этанола, а также введение эссенциале, менадиона, ретинола ацетата или токоферола ацетата не приводило к появлению в крови животных эритроцитов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Поступление этанола, сочетающееся с введением эссенциале, менадиона или ретинола ацетата индуцировало появление иммуностимулирующих свойств у эритроцитов. Введение этанола и токоферола ацетата не сопровождалось возникновением иммуномодулирующих свойств у эритроцитов.
Результаты экспериментов позволяют считать, что этанол или метаболиты, накапливающиеся в крови после введения этанола, не индуцируя появление иммуномодулирующих свойств у эритроцитов, повышают чувствительность эритроцитов к действию фосфолипидов, витаминов К и А.
Эритроцитзависимые иммунометаболические эффекты, вызываемые кратковременным поступлением этанола в сочетании с жирорастворимыми витаминами и эссенциале при кровопотере и физической нагрузке. Изучено влияние эритроцитов интактных крыс, экстракорпорально обработанных этанолом, на развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ у животных, получавших инъекции препаратов фосфолипидов и жирорастворимых витаминов.
Обработка эритроцитов раствором этанола различных концентраций показала, что при инкубации с 0,5% раствором этанола эритроциты не приобретали иммуномодулирующих свойств. Обработка 1 и 5% этанолом индуцировало появление иммуностимулирующих свойств.
Инъекции крысам эритроцитов экстракорпорально обработанных этанолом (ЭЭОЭ), или одного из вышеуказанных лекарственных препаратов не влияли на выраженность иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Введение ЭЭОЭ животным, получавшим эссенциале, менадион или ретинола ацетат, стимулировало у них развитие иммунного ответа. Введение ЭЭОЭ крысам, получавшим токоферол ацетат, не усиливало их реакции на ЭБ.
Результаты этих экспериментов свидетельствуют о возможности усиления иммуномодулирующего эффекта эссенциале, менадиона и ретинола ацетата путем введения животным ЭЭОЭ.
Принимая во внимание наиболее высокую иммуномодулирующую эффективность сочетаний менадиона с этанолом и менадиона с ЭЭОЭ в норме, было изучено влияние этих сочетаний при кровопотере и физической нагрузке.
Оказалось, что введение после кровопотери или плавания этанола с менадионом усиливало (но не нормализовало) развитие ГИО и ГЗТ. Вместе с тем инъекции менадиона с ЭЭОЭ нормализовало развитие обеих форм иммунного ответа.
Таким образом, инъекции ЭЭОЭ потенцируют иммуномодулирующее действие менадиона в большей степени, чем введение свободного этанола.
Состояние иммунологической реактивности в условиях стресса и патологии в значительной степени определяется функциональной активностью клеток крови - лимфоцитов, нейтрофилов и эритроцитов, активирующих иммунные процессы, а также тромбоцитов, вызывающих иммуносупрессирующий эффект (Л.Г. Прокопенко, И.Л. Бровкина, 2003).
После кровопотери или физической нагрузки содержание ФДФ2 в лимфоцитах, активности НАДФН - оксидазы в нейтрофилах и Mg2+- АТФазы мембраны эритроцитов значительно снижались, а содержание МДА в тромбоцитах увеличивалось.
Введение после кровопотери и физической нагрузки менадиона с этанолом уменьшало выраженность изменения этих параметров, а инъекции менадиона с ЭЭОЭ нормализовало их величины (табл. 12).
Изучено влияние менадиона, этанола и ЭЭОЭ на метаболические параметры гепатоцитов и эритроцитов после кровопотери и физической нагрузки. Установлено, что раздельное введение менадиона, этанола или ЭЭОЭ не влияло на показатели антиоксидантного потенциала и интенсивности ПОЛ гепатоцитов и эритроцитов. Совместное введение менадиона с этанолом уменьшало выраженность, вызванных кровопотерей снижения активности СОД и каталазы, повышения содержания ДК, АГП и МДА в гепатоцитах и эритроцитах. Инъекции менадиона с ЭЭОЭ нормализовали показатели антиоксидантной защиты и интенсивности ПОЛ гепатоцитов и эритроцитов.
Таблица 12
Влияние менадиона, этанола и ЭЭОЭ на метаболические маркеры функциональной активности клеток крови.
Условия опыта | НАДФН оксидаза ПЯЛ, пмоль/мин 103 клеток | ФДФ2 лимфоцитов пмоль/мин 106 клеток | Mg2+ АТФазы эритроцит, мкмоль Р/г х ч | МДА тромбоцит, Мкмоль/106 клеток |
1. Контроль | 1,340,25 | 0,950,18 | 0,660,08 | 0,610,06 |
2. Кровопотеря | 0,540,09*1 | 0,450,08*1 | 0,330,04*1 | 0,90,14*1 |
3. Кровопотеря, введение менадиона и этанола | 0,950,15*1,2 | 0,680,11*1,2 | 0,470,06*1,2 | 0,780,12*1,2 |
4. Кровопотеря, введение менадиона и ЭЭОЭ | 11,290,17*2,3 | 0,970,16*2,3 | 0,710,08*2,3 | 0,660,10*2,3 |
После физической нагрузки нормализация метаболических параметров гепатоцитов и эритроцитов наблюдалась как при инъекции менадиона с ЭЭОЭ, так и в случае введения менадиона со свободным этанолом.
Результаты проведенных экспериментов показывают, что при состояниях, характеризующихся нарушением энергетического гомеостаза, угнетение иммунологической реактивности сочетается с нарушением функциональной активности гепатоцитов, нейтрофилов, эритроцитов и тромбоцитов. В основе этого лежит усиление генерации активных метаболитов кислорода, индуцирующих перекисное окисление липидов, нарушение структуры двойного фосфолипидного слоя клеточных мембран и их функций. Из гепатоцитов в кровь поступают окислительно-модифицированные липопротеины и продукты перекисного окисления липидов. Они модифицируют мембрану легких эритроцитов, вследствие чего эти клетки приобретают свойство индуцировать выделение прилипающими к стеклу спленоцитами иммуносупрессирующих цитокинов (Л.Г. Прокопенко и др., 1995).
Тяжелые эритроциты, модифицированные этанолом ускоряют секрецию цитокинов, стимулирующих развитие различных форм иммунного ответа, а так же соединений, обладающих антиоксидантной активностью (М.В. Павлова, 2007). Не исключено, что эти цитокины усиливают эффекты, вызываемые менадионом и другими соединениями, взаимодействующими со структурными компонентами мембраны эритроцитов (фосфолипидами, глико- и протеолитическими ферментами).
Для проверки этого предположения спленоциты здоровых крыс, получавших инъекции ЭЭОЭ, фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре. Супернатанты фракционировали на сефадексе G-150, полученные фракции вводили крысам внутрибрюшинно, подвергнутыми кровопотере или выполнявшим интенсивную физическую нагрузку одновременно с внутримышечными инъекциями менадиона, ретинола ацетата или токоферола ацетата. Через 6 ч после введения супернатантов и препаратов жирорастворимых витаминов определяли активность НАДФН - оксидазы в нейтрофилах, содержание ФДФ в лимфоцитах. Кроме того устанавливали активность СОД и каталазы, содержание ДК и МДА в гепатоцитах.
Оказалось, что высокомолекулярная фракция I (ММ>150 кД) супернатанта спленоцитов прилипающих к стеклу при 32-37С усиливала влияние витаминов на активность СОД и каталазы, содержание ДК и МДА в гепатоцитах. В отличие от этого низкомолекулярная фракция III (ММ<15 кД) супернатанта потенциировала вызываемое менадионом и ретинола ацетатом увеличение содержания ФДФ в лимфоцитах и активность НАДФН - оксидазы в нейтрофилах (рис. 3).
Таким образом, различные по молекулярной массе соединения супернатанта спленоцитов неодинаково влияют на метаболические изменения, вызываемые витаминами в гепатоцитах и клетках периферической крови.
Эргопротекторное действие этанола. После 7-кратного введения этанола (0,3 г/100г массы тела с интервалом 24 ч) физическая работоспособность, тестируемая по максимальной продолжительности плавания с грузом 8% массы тела значительно возросла. До введения этанола максимальная продолжительность плавания крыс с грузом 8% массы тела равнялась 7,61,3 мин, а после введения этанола 15,22,4 мин. Этанол увеличивал также продолжительность плавания с грузом 30% массы тела (в контроль 1,80,3 мин, после введения этанола 3,70,5 мин).
Семикратное введение малых доз этанола увеличивало активность супероксиддисмутазы и каталазы, не влияло на концентрацию диеновых коньюгатов и малонового диальдегида в клетках мышц.
Можно предположить, что предварительное поступление малых доз этанола будет индуцировать возникновение эргопротекторного эффекта, противодействующего последующему деструктивному влиянию на организм больших доз этого препарата (явление гомеостаза).
Подтверждение этому служат эксперименты в которых продолжительность плавания крыс с грузом 30% (ФНСИ) после однократного введения большой дозы этанола (3 мг/100 г массы тела) была существенно ниже чем у контрольных (не получавших этанол) животных (в контроле 1,80,3 мин, после приема этанола 0,80,1 мин), а у крыс, однократно получивших 3 мг/100 г этанола после 7- кратного введения малых доз этого соединения (0,3 мг/100 г) способность выполнять ФНСИ не отличалось от контроля (1,70,3 мин).
Рисунок 3. Влияние фракций прилипающих к стеклу при 32-37С спленоцитов крыс, получавших инъекции ЭЭОЭ на метаболические параметры лейкоцитов (ФДФ2 и НАДФН-окс.) и гепатоцитов (СОД, КАТ, ДК и МДА) плававших крыс, получавших инъекции менадиона.
1 - контроль; 2 - плавание; 3 - плавание, введение фракции I и менадиона; 4 - плавание, введение фракции III и менадиона.
Однократное введение большой дозы этанола снижало активность супероксиддисмутазы и каталазы в мышцах, увеличивало содержание продуктов перекисного окисления липидов в миоцитах. Предварительное кратковременное введение малых доз этанола ослабляло иммуносупрессорное действие и ограничивало снижение антиоксидантных ферментов мышцах. Полученные данные свидетельствуют о важной роли антиокислительного состояния клеток в реакции эргопротекторного действия низких доз этанола.
В ходе дальнейших исследований установлено, что введение интактным крысам тяжелых эритроцитов, полученных от аллогенных животных после 7-кратного введения этанола, повышало их способность выполнять физическую работу субмаксимальной и высокой интенсивности.
Проведенные исследования показали, что при кратковременном поступлении в организм небольших доз этанола в сосудистом русле появляются тяжелые эритроциты, оказывающие влияние на физическую работоспособность организма. Регуляторный эффект этих клеток опосредуется выделяемыми ими гуморальными факторами. Учитывая это, исследовано влияние тяжелых эритроцитов крыс, кратковременно получавших этанол, на выделение прилипающими и не прилипающими к стеклу клетками селезенки интактных крыс факторов, модулирующих физическую работоспособность.
Установлено, что введение животным супернатантов, обладающих иммуностимулирующей активностью, повышали способность неалкоголизированных крыс выполнять физические нагрузки субмаксимальной интенсивности и не влияли на возможность выполнения нагрузок высокой интенсивности. После фракционирования супернатантов прилипающих клеток на сефадексе G-150 оказалось,что при аллогенном переносе фракции I увеличивалась продолжительность плавания крыс с грузом 30% массы тела (рис. 4).
Рисунок 4. Влияние фракций супернатантов прилипающих к стеклу спленоцитов крыс, получавших инъекции тяжелых эритроцитов алкоголизированных крыс, на физическую работоспособность аллогенных животных, не получавших этанол.
Рисунок А: Продолжительность плавания с грузом 30%
Рисунок Б: Продолжительность плавания с грузом 8%
По оси абсцисс: продолжительность плавания в мин. По оси ординат: К-контроль (без фракции супернатантов) I, II и III - введение фракций I, II и III соответственно.
Результаты проведенного исследования показывают, что эргопротекторное действие кратковременного поступления в организм этанола опосредовано различными соединениями, выделяющимися прилипающими к стеклу клетками селезенки, после активации их модифицированными тяжелыми эритроцитами алкоголизированных крыс.
ВЫВОДЫ
1. Полиненасыщенные фосфолипиды, активаторы энергетического обмена и жирорастворимые витамины, введенные по отдельности, не оказывают существенного влияния на функционально-метаболическую активность нейтрофилов, развитие гуморального и клеточного иммунного ответа и метаболические процессы в печени после кровопотери, интенсивной физической нагрузки и длительного поступления в организм этанола.
2. Полиненасыщенные фосфолипиды в сочетании с активаторами энергетического обмена после кровопотери вызывают иммуномодулирующий и гепатопротекторный эффекты. Иммуномодулирующее действие наиболее выражено при совместном введении фосфолипидов и кудесана, гепатопротекторное действие при сочетании фосфолипидов с мексидолом.
3. Полиненасыщенные фосфолипиды в сочетании с активаторами энергетического обмена эффективно коррегируют функционально- метаболическую активность нейтрофилов и иммунологическую реактивность животных после выполнения физической нагрузки высокой интенсивности.
4. Физическая нагрузка высокой интенсивности индуцирует выделение в сосудистое русло окислительно модифицированных липопротеинов низкой и очень низкой плотности под влиянием которых, тромбоциты приобретают свойство вызывать появление у легких эритроцитов иммуносупрессирующих свойств. Фосфолипиды введенные с милдронатом подавляют развитие тромбоэритроцитарной иммуносупрессии.
5. Фосфолипиды в сочетании с активаторами энергетического обмена коррегируют иммунометаболические процессы, нарушенные длительным поступлением в организм этанола. Высокоэффективным является совместное введение фосфолипидов с милдронатом, а также фосфолипидов с менадионом фиксированном эритроцитами.
6. Иммуномодулирующей активностью обладает менадион адсорбированный на эритроцитах (МАЭ) здоровых крыс, строма эритроцитов, включившая менадион (СЭВМ), менадион и эссенциале соиммобилизованные стромой эритроцитов (МЭССЭ). Наиболее выраженный и длительно сохраняющийся иммуномодулирующий эффект у здоровых и алкоголизированных животных вызывает МЭССЭ.
7. Менадион и эссенциале соиммобилизованные стромой эритроцитов индуцируют выделение прилипающими (при 32-37С) и неприлипающими к стеклу спленоцитами алкоголизированных животных соединений, обладающих свойством усиливать развитие клеточного и гуморального иммунного ответа. Прилипающие (при 4-10С) клетки алкоголизированных крыс выделяют альфа-2-макроглобулин, супрессирующий развитие обеих форм иммунного ответа и отменяющий свойство эритроцитов приобретать иммуномодулирующую активность под влиянием МЭССЭ.
8. Этанол, кратковременно введенный в малых дозах стимулирует у здоровых животных развитие Т-зависимого иммунного ответа, уменьшал или нормализовал показатели антиоксидантного потенциала и интенсивности перекисного окисления эритроцитов и гепатоцитов алкоголизированных животных.
9. Кратковременное введение здоровым животным малых доз этанола с менадионом или ретинола ацетатом вызывало более выраженный иммуномодулирующий эффект, чем поступление каждого из этих соединений в отдельности. Инъекции менадиона или ретинола ацетата с эритроцитами экстракорпорально обработанными этанолом (ЭЭОЭ) стимулировали развитие гуморального и клеточного иммунного ответа в большей степени, чем введение препаратов витаминов со свободным этанолом.
10. Эритроциты экстракорпорально обработанные этанолом (ЭЭОЭ) стимулировали развитие различных форм иммунного ответа после острой кровопотери или выполнения физической нагрузки высокой интенсивности ЭЭОЭ уменьшали выраженность вызываемого кровопотерей и физической нагрузкой снижения антиоксидантного потенциала и повышения интенсивности перекисного окисления в гепатоцитах и эритроцитах.
11. Этанол и менадион при раздельном введении не влияли на показатели антиоксидантного потенциала и интенсивности перекисного окисления липидов гепатоцитов и эритроцитов. Совместное введение этанола с менадионом уменьшало выраженность вызванных кровопотерей и плаванием изменений антиоксидантного потенциала и перекисного окисления липидов. Инъекции менадиона с ЭЭОЭ нормализовали эти параметры гепатоцитов и эритроцитов.
12. Высокомолекулярная (>150 кД) фракция соединений выделяемых спленоцитами, прилипающими к стеклу при 32 -37С, усиливала влияние витаминов на активность антиоксидантных ферментов и продуктов перекисного окисления в гепатоцитах и эритроцитах. В отличие от этого низкомолекулярная (<15 кД) фракция соединений, секретируемых этими клетками потенциировала вызываемое менадионом и ретинола ацетатом увеличение активности лимфоцитов и нейтрофилов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Принимая во внимание наличие иммунотропного, антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов у регуляторов энергетического обмена, целесообразно дальнейшее изучение фармакологических эффектов других представителей этой группы при кровопотере, интенсивной физической нагрузке, алкогольной интоксикации.
Следует рекомендовать проведение клинической апробации иммуномодулирующей и гепатопротекторной эффективности сочетанного применения полиненасыщенных фосфолипидов с кудесаном и полиненасыщенных фосфолипидов с мексидолом соответственно, для фармакологической коррекции функций эритроцитов, иммуноцитов, гепатоцитов при острой кровопотере.
Экспериментально обоснована целесообразность кратковременного использования малых доз этанола в сочетании с менадионом или ретинола ацетатом для коррекции иммунометаболических нарушений.
Учитывая синергичность действия полиненасыщенных фосфолипидов, жирорастворимых витаминов, регуляторов энергетического обмена в отношении их иммунометаболических эффектов при кровопотере, интенсивной физической нагрузке, алкогольной интоксикации, целесообразно дальнейшее исследование различных комбинаций этих групп лекарственных веществ при других нарушениях энергетического гомеостаза.
Целесообразно рекомендовать дальнейшее изучение иммунометаболических эффектов лекарственных соединений, корригирующих тромбоэритроцитарные взаимодействия при различных формах нарушения окислительно-энергетического гомеостаза.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
- Лосенок, С.А. Иммуномодулирующее действие активаторов энергетического обмена при физических нагрузках различной интенсивности / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвященной 120-летию ветеринарной службы Курской области. - Курск, 2005. - С. 70-76.
- осенок, С.А. Коррекция иммунометаболических нарушений у спортсменов / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, М.И. Лукашов // Материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвященной 120-летию ветеринарной службы Курской области. - Курск, 2005. - С. 82-85.
- осенок, С.А. Взаимосвязь иммуномодулирующего действия регуляторов энергетического обмена, гликозаминогликанов и фосфолипидов / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Материалы Междунар. конгр. Иммунитет и болезни: от теории к терапии (3-8 окт., Москва). - М., 2005. - С. 148.
- осенок, С.А. Актопротекторное и иммуномодулирующее действие феноболила при нарушении гомеостаза / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Университетская наука: взгляд в будущее: сб. тр. 71-й науч. конф. КГМУ и сессии Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2006. - Т. 2. - С. 244-245.
- осенок, С.А. Коррекция иммунометаболических нарушений при синдроме перетренированности у спортсменов / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Материалы VI Всерос. науч. форума РеаСпоМед 2006. - Москва, 2006. - С. 77-78.
- осенок, С.А. Коррекция тромбоэритроцитарной иммуносупрессии стабилизаторами клеточных мембран при интенсивных физических нагрузках / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Вестн. Уральской мед. академической науки. Ц 2006. - № 3 (1). Ц С. 307 Ц 309.
- Коррекция иммунометаболических нарушений, вызываемых длительным поступлением в организм этанола, регуляторами энергетического обмена и эссенциале / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Н.А. и др. // Вестн. новых мед. технологий. Ц 2007. Ц Т. XIV. - № 3. Ц С. 202 Ц 205.
- осенок, С.А. Изменение иммунометаболических параметров при алкогольной интоксикации / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Курский науч.-практ. вестн. Человек и его здоровье. - 2007. - № 1. - С. 5 - 10.
- осенок, С.А. О взаимосвязи иммуномодулирующих и актопротекторных эффектов, вызываемых этанолом / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Курский науч.-практ. вестн. Человек и его здоровье. - 2007. - № 1. - С. 11 - 18.
- Иммунометаболические эффекты, вызываемые милдронатом, рибоксином и эссенциале при длительном поступлении в организм этанола / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, М.В. Павлова и др. // Курский науч.-практ. вестн. Человек и его здоровье. - 2007. - № 2. - С. 18 - 25.
- Лосенок, С.А. Антиоксидантный и иммуномодулирующий эффекты регуляторов энергетического обмена и полиненасыщенных фосфолипидов при физических нагрузках высокой интенсивности / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Вестн. новых мед. технологий. Ц 2007. Ц Т. XIV. - № 4. Ц С. 188 Ц 190.
- Эритроцитзависимые эффекты лекарственных и физиотерапевтических средств / С.А. Лосенок, А.И. Лазарев, И.Л. Бровкина и др. - Курск, 2008. - 336 с.
- осенок, С.А. Иммунометаболические эффекты фосфолипидов и активаторов окислительной цепи при кровопотере / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Вестн. новых мед. технологий. - 2008. - Т. XV, № 1. - С. 211-213.
- Лосенок, С.А. Тромбоэритроцитарная иммуносупрессия и ее коррекция стабилизаторами клеточных мембран при интенсивной физической нагрузке / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 2008. - № 1. Ц С. 20 Ц 22.
- Иммунометаболические нарушения при синдроме перетренированности спортсменов и их коррекция / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко, Д.С. Наседкин // Воен.- мед. журн. - 2008. - Т. 329, № 2. - С. 70.
- Лосенок, С.А. Влияние алкогольной интоксикации на иммунометаболические параметры организма / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Воен.- мед. журн. - 2008. - Т. 329, № 3.- С. 90-91.
- Лосенок, С.А. Иммуномодулирующий и актопротекторный эффекты феноболила при нарушении энергетического гомеостаза / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, П.И. Лосенок // Аллергология и иммунология. Ц 2008. - Т. 9, № 1. - С. 151-152.
- Лосенок, С.А. О взаимосвязи иммуномодулирующего и антиоксидантного эффектов регуляторов энергетического обмена, полиненасыщенных фосфолипидов и гликозаминогликанов / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, П.И. Лосенок // Аллергология и иммунология. Ц 2008. - Т. 9, № 1. - С. 151.
- Лосенок, С.А. Иммунометаболические эффекты сочетанного применения эссенциале и витаминов при кровопотере / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Системный анализ и управление в биомед. системах. - 2008. - Т. 7, № 3. - С.658-661.
- Лосенок, С.А. Эритроцитзависимые иммунометаболические эффекты этанола, полиненасыщенных фосфолипидов и жирорастворимых витаминов в норме и при острой кровопотере / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Вестн. новых мед. технологий. Ц 2008. - Т. XV, № 3. Ц С. 221 Ц 222.
- осенок, С.А. Иммунометаболические эффекты сочетанного применения регуляторов энергетического обмена и полиненасыщенных фосфолипидов при интенсивных физических нагрузках / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Аллергология и иммунология. Ц 2008. - Т. 9, № 2. - С. 239-242.
- Лосенок, С.А. Иммунометаболическая коррекция защитных функций и физической работоспособности / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сессии Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2008. - Т. 1. - С. 154-157.
- Лосенок, С.А. Этанол как модулятор иммунометаболических эффектов, вызываемых водо- и жирорастворимыми витаминами / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сессии Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2008. - Т. 1. - С. 157-159.
- Лосенок, С.А. Иммунометаболические эффекты сочетанного применения эссенциале, витаминов и регуляторов энергетического обмена при кровопотере / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко / Курский науч.-практ. вестн. Человек и его здоровье. - 2008. - № 1. - С. 14-23.
- Лосенок, С.А. Коррекция иммунометаболических нарушений, вызываемых кровопотерей или физической нагрузкой после длительного поступления этанола / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко / Аллергология и иммунология. Ц 2008. - Т. 9, № 3. - С. 272.
- осенок, С.А. Потенцирующее влияние жирорастворимых витаминов на эритроцитзависимое иммуномодудирующее и гепатопротекторное действие этанола при острой кровопотере / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко / Системный анализ и управление в биомед. системах. - 2008. - Т. 7, № 4. - С. 1067 - 1069.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ААП - альфа- 1-антипротеаза, мкмоль/л
АГП - ацилгидроперекиси, D233 на 1 мл плазмы
АЗК - - антитело зависимая клеточная цитотоксичность, %
АЛТ - аланинаминотрансфераза, ммоль/ч х л
АМГ - альфа- 2- макроглобулины, мкмоль/л
АОК - антителообразующие клетки, 103 /селезенку
АСТ - аспартатаминотрансфераза, ммоль/ч х л
АТФ - аденозинтрифосфат, мкмоль/мл эритроцитов
БФГ - 2,3-бисфосфоглицерат, мкмоль/мл эритроцитов
ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа
ГИО - гуморальный иммунный ответ
ГП - глутатионпероксидаза, мкмоль/мл эритроцитов
ГР - глутатионредуктаза, мкмоль/мл эритроцитов
ДК - диеновые конъюгаты, нмоль/л
ИАФ (ФИ х ФЧ) - индекс активности фагоцитов
КПК - крысы, подвергнутые кровопусканию
НП - липопротеиды низкой плотности, условные единицы
ОНП - липопротеиды очень низкой плотности, условные единицы
ПС - липополисахарид
МАЭ - менадион адсорбированный на эритроцитах
МДА - малоновый диальдегид, мкмоль/л
ММ - молекулярная масса, kD
МЭССЭ - менадион и эссенциале, соиммобилизованные стромой эритроцитов
НСТ-сп, НСТ-инд - тест восстановления нитросинего тетразолия, спонтанный и индуцированный, %
ОБ - общий билирубин, мкмоль/л
ОМТ - окислительная модификация тромбоцитов
ОРН (НСТИНД-НСТСП) - окислительный резерв нейтрофилов
ПДТ - плазма, дефицитная по тромбоцитам
ПОЛ - перекисное окисление липидов
ПОТ - плазма, обогащенная тромбоцитами
ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты
РМЛ - разница массы регионарного и контрлатеральных лимфоузлов, мг
СКСНС - сыворотка крыс, получавших супернатант неприлипающих спленоцитов
СКСПС - сыворотка крыс, получавших супренатант прилипающих спленоцитов
СНС - супернатант неприлипающих к стеклу спленоцитов
СОД - супероксиддисмутаза, ЕД/ мл эритроцитов
СПС - супернатант прилипающих к стеклу спленоцитов
СЭВМ - строма эритроцитов, включившая менадион
ТАГ - триацилглицералы, моль/л
ФДФ - фруктозо-2,6-дифосфат, пМ/106 лимфоцитов
ФИ - фагоцитарный индекс, %
ФЛП - фракция липопротеидов низкой и очень низкой плотности
ФМА - функционально-метаболическая активность
ФНВИ - физическая нагрузка высокой интенсивности
ФНСИ - физическая нагрузка субмаксимальной интенсивности
ФСЛЭ - фрагменты стромы легких эритроцитов
ФСТЭ - фрагменты стромы тяжелых эритроцитов
ФЧ - фагоцитарное число (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит)
ЩФ - щелочная фосфатаза, ммоль/ч х л
ЭБ - эритроциты барана
ЭЭОЭ - эритроциты экстракорпорально обработанные этанолом
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине