Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ПОЛИТОВ Дмитрий Владиславович
ГЕНЕТИКА ПОПУЛЯЦИЙ И ЭВОЛЮЦИОННЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ВИДОВ СОСНОВЫХ (СЕМ. PINACEAE) СЕВЕРНОЙ ЕВРАЗИИ
03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
М о с к в а 2007
Работа выполнена в лаборатории популяционной генетики Института общей генетики им. Н. И. Вавилова Российской академии наук
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Пухальский Виталий Анатольевич доктор биологических наук Милишников Александр Николаевич доктор биологических наук Янбаев Юлай Аглямович Ведущее учреждение: Институт леса им. В. Н. Сукачева СО РАН (Красноярск)
Защита диссертации состоится _23_ октября 2007 г. на заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу:
119991, Москва, ГСП-1, ул. Губкина, 3. Факс: (495) 132 89 62.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н. И.
Вавилова РАН.
Автореферат разослан ___ сентября 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук Г. Н. Полухина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Получение данных о нативной популяционно-генетической структуре хвойных видов является основой всех мероприятий по консервации биологических ресурсов. Как виды-эдификаторы сложных лесных экосистем, хвойные должны быть первоочередными объектами охраны, поскольку от состояния их популяций зависит благополучие целого комплекса животных и растительных видов.
Интенсификация освоения лесных ресурсов в последнее время требует срочного получения знаний о генетических процессах, протекающих в популяциях древесных растений в связи с усиливающимся антропогенным воздействием, особенно заметным в индустриально развитых странах Запада, где большая часть естественных лесов заменена искусственными насаждениями. Только глубокое знание тонкой популяционно-генетической структуры древесных растений позволит проводить мониторинг ее изменений и прогнозировать нарушение ее стабильного воспроизводства во времени. На территории России и в ряде регионов Восточной Азии, где еще сохранилась нативная структура лесных популяций, возможно проведение уникальных исследований, необходимых для сохранения в будущем генетического разнообразия евроазиатских древесных растений, организации охраняемых территорий и семенных банков, выработки концепции неистощительного использования лесов.
В настоящее время сложилась ситуация, когда традиционные подходы к изучению лесного богатства нашей страны уже не соответствуют современным требованиям.
Научные основы мониторинга биоразнообразия и организация рациональной неистощительной эксплуатации лесных ресурсов требуют получения количественных оценок популяционно-генетических параметров, что возможно лишь на базе молекулярно-генетических маркеров. Изоферментные генные маркеры продолжают оставаться одним из главных инструментов изучения популяционно-генетической структуры, внутри- и межвидовой дифференциации и гибридизации древесных растений. Несмотря на развитие методов анализа изменчивости ДНК, во всем мире с помощью изоферментов до сих пор получают значительную долю информации о состоянии генофондов хвойных и других древесных растений.
Цель и задачи исследования.
Цель работы - выявление факторов и механизмов поддержания генетической изменчивости в популяциях хвойных, изучение их дифференциации на внутри- и межвидовом уровнях, механизмов видообразования и гибридизации.
Задачи исследования:
1. Установить генетический контроль изоферментных систем хвойных семейства сосновых и на этой основе разработать оригинальные методы мониторинга генетического разнообразия хвойных с учетом специфики конкретных видов.
2. С помощью изоферментных локусов оценить уровни внутрипопуляционной, внутривидовой и межвидовой генетической изменчивости кедровых сосен и комплекса европейской и сибирской елей.
3. Оценить параметры системы скрещивания и проанализировать генетическую изменчивость в популяциях на стадиях зародышей и взрослых растений.
4. Изучить родственные взаимоотношения видов сосен секции Strobus.
5. Выявить межвидовые гибриды кедровых сосен и оценить роль гибридизации в эволюции и адаптации хвойных.
6. Описать механизм формирования клинальной изменчивости и интрогрессивной гибридизации у европейской и сибирской елей.
Научная новизна полученных результатов. Впервые с помощью изоферментных локусов, генетический контроль которых установлен в ходе исследования, изучена генетическая изменчивость широкораспространенных и эндемичных хвойных Палеарктики. Работа выполнена на материале, представляющем практически все части видовых ареалов кедровых сосен Евразии (европейской, сибирской, корейской, кедрового стланика), описаны уровни внутри- и межпопуляционной, а также межвидовой генетической дифференциации, дана характеристика системы скрещивания, оценены частоты перекрестного и самооплодотворения. На материале из Евразии и Северной Америки проанализированы генетические связи между кедровыми соснами, а также эволюционные взаимоотношения мягких сосен в пределах подрода Strobus рода Pinus. С помощью генетических маркеров описано явление естественной межвидовой гибридизации сибирской кедровой сосны и кедрового стланика в зоне симпатрии на Байкале.
Генетическими методами показана успешность искусственных межвидовых скрещиваний сибирской и корейской кедровых сосен и обнаружено явление гетерозиса у гибридов. У сибирской кедровой сосны впервые исследовано с помощью аллозимов явление полиэмбрионии, показано существование монозиготической (кливажной) и полизиготической полиэмбрионии, оценены их частоты в популяциях. Проведен анализ клинальной изменчивости в популяциях европейской, сибирской и гибридной финской елей (Picea abies - P. obovata complex), охарактеризован регион, затронутый интрогрессией, показана роль интрогрессивной гибридизации в формировании клин и поддержании высокого для хвойных уровня генного и аллельного разнообразия.
Показано, что одним из важнейших факторов, определяющих сравнительное однообразие аллельных частот в популяциях хвойных, является балансирующий отбор.
На ряде видов сосновых впервые проанализирована система скрещивания, определены ее параметры и их связь с экологией популяций. Данные филогении, филогеографии и гибридизации позволяют понять пути формирования хвойных лесов Палеарктики.
Практическая ценность работы. Результаты исследований могут быть использованы Федеральным агентством лесного хозяйства РФ, Рослесозащитой, лесосеменными станциями, НИИ лесной генетики и селекции, ВНИИ лесного хозяйства и региональными НИИ лесного хозяйства, кафедрами лесной генетики и селекции лесных ВУЗов для мониторинга динамики популяционных генофондов хвойных, для организации программ паспортизации лесосеменных объектов, сертификации партий семян, для обоснования выделения генетических резерватов, для научного обоснования и организации селекционных программ повышения продуктивности насаждений при сохранении оптимального уровня генетического разнообразия. Полученные данные о молекулярной филогении и гибридизации у хвойных могут быть использованы в селекции для контроля успешности гибридизационных экспериментов, для получения высокопродуктивных, а также устойчивых к патогенам и вредителям форм, а также для видовой идентификации растений в ботанических садах, арборетумах, дендрариях и других искусственных насаждениях.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработаны новые подходы к оценке внутрипопуляционной, межпопуляционной и межвидовой изменчивости хвойных Северной Евразии, основанные на сравнительном популяционно-генетическом анализе комплекса родственных видов по единому набору генных локусов.
2. Виды хвойных семейства сосновых Северной Евразии в целом характеризуются высоким уровнем аллозимного разнообразия, который выше у широкораспространенных и экологически пластичных видов, и невысоким уровнем пространственной подразделенности.
3. Инбредное потомство, возникающее на ранних стадиях развития у кедровых сосен вследствие самоопыления и близкородственных скрещиваний, элиминируется отбором. Среди взрослых деревьев наблюдаются равновесные распределения генотипов или эксцесс гетерозигот в результате балансирующего отбора.
4. Популяции хвойных представляют собой иерархическую структуру взаимосвязанных подразделенных популяций, параметры которой у разных видов определяются соотношением дезинтегрирующих (изоляция, инбридинг, дрейф генов и дизруптивный отбор) и интегрирующих (миграция и стабилизирующий отбор) факторов.
5. Традиционное выделяемые в секции Strobus рода Pinus подсекции Cembrae и Strobi не находят генетического подтверждения, а в дифференциации отдельных эволюционных линий наиболее выражена межконтинентальная компонента, что интерпретируется как свидетельство сетчатой эволюции.
6. Межвидовая гибридизация широко распространена у хвойных и играет важную роль в видообразовании и адаптации. Естественная и искусственная гибридизация являются важным источником генетического разнообразия и новых перспективных для лесной селекции форм.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены лично автором устными докладами на международной конференции IUFRO Stone Pines and Their Environment (5-11 сентября 1992, Санкт-Мориц, Швейцария); 2-го Всероссийского популяционного семинара (16-20 февраля 1998, Йошкар-Ола); международной конференции IUFRO Five-needle pine species: Genetic improvement, disease resistance, and conservation (21-24 июля 2001, Медфорд, Орегон, США); 3-й Европейской конференции по экологического моделирования (15-17 сентября 2001, Дубровник, Хорватия); Втором рабочем совещании Pan-European Network on Genetic Indicators of Biodiversity (PENGIB2, 4-6 октября 2001, Санкт-Петербург); международной конференции Европейского института леса Transformation to Continuous Cover Forestry in a Changing Environment (3-7 сентября 2004, Бангор, Уэльс, Великобритания);
совещаниях Рабочей группы 3 по генетическим индикаторам биоразнообразия социоэкономически важных видов животных, растений и рыб Европейского агентства по окружающей среде, Streamlining European Biodiversity Indicators (SEBI-2010, 10 мая 2005, Париж, Франция; 6 сентября 2005, Копенгаген, Дания); Международной рабочей школе-совещании IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) Training Workshop on Forest Biodiversity (12-25 июня 2005, Пушкино Московской обл.);
международной научной конференции Наука о лесе: история, современное состояние и перспективы развития (20-24 октября 2005, Гомель, Белоруссия); Международной конференции IUFRO (рабочая группа 2.02.15) Breeding and genetic resources of fiveneedle pines (19-23 сентября 2006, Валюг, Румыния); семинаре Популяционная и эволюционная генетика Отдела генетики популяций и природопользования ИОГен РАН (апробация диссертации, 25 апреля 2007); международной конференции Разнообразие фитобиоты: Пути восстановления, обогащения и сохранения (18-июня 2007, Кременец, Украина); стендовыми докладами на международной конференции IUFRO Monitoring and Indicators of Forest Biodiversity in Europe - from Ideas to Operationality, (12-15 ноября 2003, Флоренция, Италия); III Съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров Генетика в XXI веке:
Современное состояние и перспективы развития (12-16 июня 2004, Москва).
Материалы также были представлены на 6-м Всесоюзном симпозиуме Молекулярные механизмы генетических процессов (3-6 февраля 1987, Москва); международном симпозиуме IUFRO Population genetics and genetic conservation of forest trees (24-августа 1992, Carcans-Maubuisson, Франция); Международной научной конференции Разнообразие растительного покрова Байкальской региона (7-10 сентября 1999, УланУдэ); II(X) Съезде Всероссийского Ботанического общества Проблемы ботаники на рубеже XXI века (26-29 мая 1998, Санкт-Петербург); Всероссийской конференции Структурно-функциональная организация и динамика лесов (1-3 сентября 2004, Красноярск); научно-практической конференции Водлозерские чтения: Естественнонаучные и гуманитарные основы природоохранной и просветительской деятельности национального парка Водлозерский (21-25 апреля 2006, Петрозаводск).
Декларация личного участия автора. В диссертации использованы полевые и экспериментальные материалы, полученные лично диссертантом. Автор в течение более 20 лет лично участвовал в организации и проведении полевых работ, разработке и модификации электрофоретических методик, планировании, проведении и анализе лабораторных экспериментов, статистической обработке их результатов, сопоставлении с литературными данными и подготовке публикаций. Суммарно личное участие автора составило 75 %.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своим основным соавторам по публикациям: К.В. Крутовскому, который стоял у истоков отечественной биохимической лесной генетики, изучения кедровых сосен и елей с помощью изоферментов и был моим первым наставником в лаб. популяционной генетики ИОГен РАН, M.М. Белоконь, Ю.С. Белоконю, О.П. Малюченко, которые оказывали неоценимую помощь на всех этапах работы. За всестороннюю помощь при проведении лабораторных экспериментов я благодарен Н.Ю. Гордон, за многочисленные ценные советы и дружескую поддержку всем сотрудникам лаборатории популяционной генетики ИОГен РАН. Автор бесконечно признателен своему фактическому научному консультанту, академику Юрию Петровичу Алтухову, развитию идей которого в применении к популяциям хвойных посвящен ряд глав диссертации; к сожалению, его не стало с нами как раз незадолго до официального утверждения темы данной работы.
Осуществление настоящего исследования было бы невозможным без помощи всех, кто помогал автору в ходе многочисленных экспедиций, а также предоставлял семена для анализа и данные по количественным признакам, оказывал методическую помощь и т.
д. Перечислить всех практически невозможно, и представленный список неизбежно будет неполным: Л.И. Милютин, Г.В. Кузнецова, А.Я. Ларионова (Институт леса СО РАН, Красноярск), А.И. Ирошников (НИИЛГиС, Воронеж), В.Н. Воробьев, Н.А.
Воробьева, С.Н. Горошкевич, Е.А. Петрова (Институт экологии природных комплексов СО РАН, ныне Институт мониторинга экологических и климатических систем СО РАН, Томск), С.Г. Мальцев, А.И. Золотой (НПО Центрлессем, Пушкино Московской обл., ныне Рослесозащита), сотрудники Ивантеевского дендрария (Ивантеевка Московской области), Е.Д. Овдин (Национальный парк Забайкальский, П.А. Разумов (Дальневосточный лесотехнический институт, Хабаровск), В.В. Потенко (Дальневосточный лесотехнический институт, Хабаровск; Биолого-почвенный институт ДВО РАН, Владивосток), В.Н. Моложников (Институт лучевых технологий СО РАН, Иркутск, И.К. Дамбуева, Н.Г. Борисова (Бурятский научный центр СО РАН, Улан-Удэ), В.К. Политов, (ЦНИГРИ, Москва), С.И. Политова (НПО Аэрогеология;
Палеонтологический институт РАН, Москва), Г.А. Карпов (Институт вулканологии ДВО РАН, Петропавловск-Камчатский), Н.А. Еременко (Курильский природный заповедник), М.М. Паленова (ВНИИЛМ, Пушкино, Московская обл.), А.А. Ильинов, Б.В. Раевский (Институт леса КарНЦ РАН, Петрозаводск, республика Карелия), В.Л.
Семериков, В.Б.Федоров (Институт экологии растений и животных УрО РАН, Екатеринбург), О.А. Мочалова, Е.А. Андрианова (Институт биологических проблем Севера ДВО РАН, Магадан), Р.Т. Гут (Львовская лесотехническая академия, Львов, Украина), Г.С. Захаренко (Никитский ботанический сад, Крым, Украина), И.И.
Коршиков, А.К. Поляков, Е.А. Мудрик (Донецкий ботанический сад НАНУ, Донецк, Украина), Я.В. и Н.Н. Пирко (Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАНУ, Киев, Украина), Dr. Jerry Leverenz (Hrsholm Arboretum, Дания), Dr. Richard Sniezko (USDA Forest Service, Dorenа Tree Improvement Center, Орегон, США), Dr. R.
Hunt (Canadian Resources Center, Pacific Forestry Center, Виктория, Британская Колумбия, Канада), Prof. Fritz Bergmann, Prof. Reiner Finkeldey (Georg-August Universitt Gttingen, Германия), Prof. Ioan Blada (Forest Research Institute, Бухарест, Румыния), Prof. Huo-ran Wang (Китайская академия лесоводства, Пекин, Китай).
Исследования проводились в 1985Ц2007 гг. в лаборатории популяционной генетики ИОГен РАН. На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР лаборатории популяционной генетики при финансовой поддержке следующих грантов и проектов: гранты РФФИ №№ 96-04-49465а, 99-04-48962а, 03-0448454а, 04-04-49795а, 02-04-49022а, 02-04-63070к; ФЦП Приоритетные направления генетики, Комплексная программа научных исследований РАН "Регуляторные механизмы функционирования и развития организмов": проект Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях (2001-2002); Программа фундаментальных научных исследований Геном растений (2002-2003), Программа фундаментальных исследований Президиума РАН, Научные основы сохранения биоразнообразия России: проект Разработка подходов и методов оценки и сохранения генетического разнообразия природных видов животных и растений (2003-2005);
Программы фундаментальных исследований ОБН РАН Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами (2003-2005), Биологические ресурсы России:
Фундаментальные основы рационального использования (2006-2007) и Динамика генофондов популяций растений, животных и человека (2004-2005), Программа фундаментальных исследований РАН Биологическое разнообразие и динамика генофондов, подпрограмма Динамика генофондов (2006-2007); Программа фундаментальных исследований Президиума РАН, Происхождение и эволюция биосферы, Подпрограмма II, Направление 7: проект Закономерности структурнофункциональной реорганизации геномов в биологической эволюции (2003-2007);
ФЦНТП Миннауки РФ: Темы Сохранение и генетический мониторинг генофондов человека, животных, растений и микроорганизмов (2002-2004) и Базы данных о генофондах видов древесных растений, атлантических и тихоокеанских лососей (20022004); Гранты Президента РФ для поддержки ведущих научных школ РФ №№ 00-1597914 (2000Ц2002), НШ-1698.2003.4 (2003-2005), № НШ-8596.2006.4 (2006-2008);
ФЦНП Интеграция; грантом программы Человек и Биосфера для молодых ученых (M&B Young Scientist Award, 1997-1998), хоздоговора с Псковским управлением лесами и ФГУП Росгипролес (1995-2006). Выполнению работы способствовало научное сотрудничество с Баргузинским природным биосферным заповедником (1997), Донецким ботаническим садом НАН Украины (2006-2007), Институтом клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев (2005-2006).
Публикации. Автором всего опубликовано более 80 научных работ. В диссертации обобщены данные 52 работ, включая 2 главы в коллективных монографиях (Mосква: Наука и Washington, D.C.: Island Press), 23 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах и сборниках статей (Ogden, Utah: USDA Forest Service; Fort Collins, Colorado, USA: USDA Forest Service; Amsterdam: SPB Academic Publishing и др.), статьи в сборниках и материалах конференций, тезисы конференций и 2 методических пособия. Общий объем публикаций 531 стр., из которых лично автору диссертации принадлежит 298 стр.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из Введения, двух глав литературного обзора, посвященных объектам и методам исследований, главы материалов и методов (описание материалов и методов частично вынесено в экспериментальные главы), шести экспериментальных глав, заключения, выводов, списка публикаций по теме работы, списка цитируемой литературы и Приложения.
Работа изложена на 432 страницах, включает 67 рисунков, 55 таблиц и Приложение.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ГЛАВА 1. ГЕНОФОНДЫ ХВОЙНЫХ СЕВЕРНОЙ ЕВРАЗИИ КАК ОБЪЕКТ ИЗУЧЕНИЯ И ОХРАНЫ Глава представляет обзор мировой литературы об основном объекте исследования - хвойных растениях. Хвойные являются ключевыми видами лесных экосистем Северной Евразии и Северной Америки и, начиная с мелового периода, доминируют среди голосеменных. Семейство сосновых, Pinaceae - наиболее важная в экологическом и экономическом аспектах группа голосеменных бореальной зоны. Для генетики представляет особый интерес наличие у хвойных гаплоидного эндосперма семян, гаплотип которого соответствует гаплотипу материнской яйцеклетки. Это позволяет изучать наследование и сцепление многих маркерных генов (в том числе аллозимов и ДНК) без проведения скрещиваний, а также повышает эффективность оценок параметров системы скрещивания. Важнейшими подразделениями рода Pinus являются подроды Pinus и Strobus, выделенные в ранге секций еще в конце XIX века Энгельманном (Engelmann, 1880). К секции Strobus подрода Strobus относятся, в частности, кедровые сосны подсекции Cembrae с нераскрывающимися шишками и крупными бескрылыми семенами, а также родственные им виды подсекции Strobi с типичными для хвойных семенами, имеющими крылатки. Происхождение характерных признаков кедровых сосен с очевидностью связано с авихорией - распространением семян с помощью птиц сем. врановых, г.о. кедровок рода Nucifraga. В современных системах рода Pinus положение как группы кедровых сосен в целом, так и отдельных видов в пределах секции Strobus и всего подрода Strobus (Price et al., 1998; Gernandt et al., 2005) нестабильно и является предметом дискуссий. Ни морфология шишек, ни анатомия вегетативных тканей и органов, ни применявшиеся до настоящего времени ДНК-маркеры не позволяют однозначно реконструировать филогению группы.
На территории России естественно произрастают три вида кедровых сосен: Pinus sibirica Du Tour, P. koraiensis Sieb. et Zucc. и P. pumila (Pall.) Regel. (Бобров, 1978).
Сосна кедровая сибирская, P. sibirica, распространена от Республики Коми и северовостока Пермского края до юга Республики Саха (Якутия) на востоке и Монголии на юге. Почти неотличимый морфологически от P. sibirica вид, сосна кедровая европейская, Pinus cembra L., известна с территории бывшего СССР (из Украинских Карпат), ее ареал лежит в пределах Альпийско-Карпатской горной системы, занимая высотный пояс от 1200 до 2000, местами до 2600 м н.у.м. Сосна корейская, P. koraiensis распространена на Дальнем Востоке, при этом основная часть ареала расположена на территории России (Хабаровский край, Приморский край, Еврейская АО, юг Амурской области), в то время как в Корее и Китае площадь насаждений значительно меньше.
Обширный ареал кедрового стланика, P. pumila, простирается от Прибайкалья на западе до Чукотки на северо-востоке и до Корейского п-ва на юго-востоке. На западе Северной Америки произрастает единственный в Новом Свете представитель кедровых сосен - сосна белоствольная, Pinus albicaulis. Представители традиционной подсекции Strobi известны из Европы (P. peuce), Гималаев (P. wallichiana, P. bhutanica), Юго-Восточной Азии (P. armandii, P. parviflora, P. morrisonicola, P. fenzeliana, P. kwangtungensis, P.
dalatensis, P. dabeshanensis, P. wangii), восточного (P. strobus) и западного (P.
lambertiana, P. monticola, P, flexilis, P. strobiformis) побережий Северной Америки, а также из Центральной Америки (P. ayacahuite, P. chiapensis).
Ключевая роль кедровых сосен в лесных экосистемах несомненна, они являются эдификаторными видами на огромных территориях бореальной зоны Палеарктики.
Выяснение факторов пространственной генетической дифференциации этих видов в пределах ареалов, а также филогенетических взаимоотношений между ними и с родственными видами сосен мировой флоры и стало центральной проблемой, исследованной в данной работе. Для анализа явлений межвидовой гибридизации и интрогрессии генов и роли этих процессов в адаптации и эволюции в качестве объектов использованы, помимо кедровых соснен, также ели (Picea spp.) Северной Евразии.
ГЛАВА 2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ГЕНОВ В ИЗУЧЕНИИ ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ И СОХРАНЕНИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ХВОЙНЫХ В главе обосновывается точка зрения, согласно которой под лесными генетическими ресурсами нужно понимать всё многообразие видов и внутривидовых форм древесных растений, с непременным учётом сложившейся в результате естественной истории нативной популяционной структуры, то есть характерных для вида уровней внутрипопуляционного генного разнообразия и пространственного распределения генетической изменчивости на разных ступенях иерархической популяционной организации. Очевидна важность количественного подхода в оценке параметров генетической структуры лесных древесных растений.
Достаточно широко известны общие характеристики древесных растений (Hamrick, Loveless, 1989; Hamrick, 1979, 1983, 1987; Hamrick, Godt, 1996; Hamrick et al., 1992 и др.). Это как правило долгоживущие многолетники, с относительно поздним вступлением в репродуктивную фазу и большой продолжительностью жизни: от десятков лет до нескольких тысяч лет. Популяции лесообразующих древесных, по крайней мере, в бореальной и умеренной зонах, имеют высокую численность и, как правило, высокую плотность. Как следствие неподвижности в фазе спорофита, в большинстве случаев деревья отличает высокая пластичность и толерантность к условиям среды. Реализуя свою эврибионтную сущность, являющуюся необходимым фактором выживания столь длинноциклового организма, древесные виды имеют обычно непрерывный ареал, заполняя все варианты пригодных для их существования широких экологических ниш. В тех же относительно нечастых случаях, когда ареал прерывистый, фрагментированный, изолированные популяции обычно имеют достаточно выраженные морфологические различия, и в ботанико-систематическом смысле обычно рассматриваются в качестве подвидов или вариететов. Наиболее быстрые темпы видообразования именно в условиях изоляции хорошо документированы у растений, а механизмы этого процесса хорошо объясняются теорией (Levin, 2005). Древесные, как правило, имеют перекрестное опыление, обладают эффективными механизмами распространения семян и пыльцы, что теоретически могло бы приводить к относительно сильным потокам генов при опылении и разносе семян. Представляет как теоретический, так и практический интерес вопрос о том, насколько подобные представления о неограниченной миграции и панмиксии соответствуют реальной популяционной структуре древесных растений.
Из признаков, используемых в популяционной лесной генетике, молекулярные (включая биохимические) маркеры генов выделяются многими полезными свойствами.
Они не требуют многих лет для анализа наследования в череде поколений, многие из них обладают кодоминантным наследованием, их проявление не зависит от модифицирующего действия среды. Хронологически первыми молекулярными маркерами были аллозимы (изоферменты) - наследственные формы ферментных белков, полиморфизм которых выявляется с помощью электрофореза с последующим гистохимическим окрашиванием гелей с продуктами разделения (Hunter, Markert, 1957).
Несмотря на быстрое развитие методов анализа ДНК, изоферменты остаются очень полезными генетическими маркерами, поскольку с их помощью можно получать надежную и полную генетическую информацию за короткое время и при сравнительно небольших затратах материальных ресурсов и труда.
Преимущества аллозимного анализа голосеменных, которые предоставляет наличие гаплоидного эндосперма, обусловили широкое использование этого метода в популяционной генетике сосновых и других таксонов хвойных растений с начала 1970х гг. (Bartels, 1971a,b; Bergmann, 1971; Feret, 1971; Sakai, Park, 1971). Несмотря на развитие ДНК-технологий, вплоть до настоящего времени изоферменты поставляют наиболее значимый массив данных о генетических процессах в природных популяциях хвойных, особенно в приложениях, где требуется полная генетическая информация (многолокусные генотипы по кодоминантным локусам). Кодоминантность особенно важна при одновременном популяционно-генетическом анализе двух поколений (материнских растений и зародышей их семян).
В настоящей работе в качестве основного экспериментального метода использовался изоферментный анализ. Особенностями нашего подхода было также использование в анализе сразу нескольких (точнее, всех, для которых удалось получить растительный материал) эволюционно близких видов, объединяемых в признаваемые систематиками подразделения родов, к которым они относятся. Такой подход позволяет получать генетическую информацию, которая действительно может интерпретироваться в сравнительном аспекте для оценок уровней генного разнообразия и подразделенности на основе использования одинаковых или почти одинаковых наборов ортологичных локусов.
ГЛАВА 3. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДИКИ И АНАЛИЗ ГЕННОГО КОНТРОЛЯ ИЗОФЕРМЕНТОВ У СОСЕН ПОДРОДА STROBUS И ЕЛЕЙ ПАЛЕАРКТИКИ Даны методические основы анализа биологического материала различных типов для популяционно-генетических исследований хвойных. В качестве материала для исследований в основном использованы сборы генеративных или вегетативных тканей хвойных из природных популяций, в ряде случаев дополненные материалом из искусственных насаждений и из ботанических садов. Для различных задач использовались сборы семян с индивидуальных деревьев, массовые (смешанные) сборы семян, выборки почек.
Семена и вегетативные почки хранились при +4oC. Ткани семян гомогенизировались механически в буфере 0,005 M трис-HCl с pH 7,7 или дистиллированной воде. Экстракты из вегетативных почек готовили с добавлением сухого нерастворимого поливинилпирролидона (Polyclar AT, Serva, Германия) в 0,05 М TrisЦHCl буфере (pH 7,7), содержащего 0,05% -меркаптоэтанола и 3% растворимого поливинилпирролидона PVP-360 или PVP-40). Гомогенаты тканей замораживали при t=-18 C и размораживали непосредственно перед нанесением в гель, что улучшало экстракцию ферментов. Гомогенаты образцов наносили в стартовые лунки гелевого блока с помощью бумажных фитилей (Whatman 3MM).
Электрофорез экстрактов проводился в 13%-м крахмальном геле в трех буферных системах: 1) одна из следующих трех систем, дававших сходные результаты при разделении: A1 - морфолин-цитратная, pH 7,8 (Clayton, Tretiak, 1972); А2 - трисцитратная pH 7,4 (Konnert, Maurer, 1995); A3 - трис-цитратная pH 6,2 (Adams, Joly, 1980); 2) B - трис-ЭДТА-боратная (Markert, Faulhaber, 1965), pH 8.6; 3) C - трисцитрат/LiOH-боратная (Ridgeway et al., 1970). В таблице 1 приведены изученные ферменты, число локусов и буферные системы, использованные в анализе.
Таблица 1. Изученные ферменты кедровых сосен, число кодирующих локусов и буферные системы, использованные для электрофоретического разделения Фермент Аббреви- Номер Число Буферная атура по К.Ф. локусов1 системаAланинаминопептидаза AAP 3.4.11.1 4 (-2) C Aконитаза AСО 4.2.1.3 1 A Aлкогольдегидрогеназа ADH 1.1.1.1 2 B Формиатдегидрогеназа FDH 1.2.1.2 1 B Флюоресцентная эстераза FEST 3.1.1.1 3 (-2) 1 B Глутаматдегидрогеназа GDH 1.4.1.2 1 B, C Глутаматоксалоацетаттрансаминаза GOT 2.6.1.1 3 C, B Изоцитратдегидрогеназа IDH 1.1.1.42 1 A Менадионредуктаза (=диафораза) MNR 1.6.99.2 3(-1)1 A Лейцинаминопептидаза LAP 3.4.11.1 4 C, B Малатдегидрогеназа MDH 1.1.1.37 4 A 6-фосфоглюконатдегидрогеназа 6PGD 1.1.1.44 3 A Фосфоглюкоизомераза PGI 5.3.1.9 2 B Фосфоглюкомутаза PGM 2.7.5.1 2 B, A Фосфоенолпируваткарбоксилаза PEPCA 4.1.1.31 1 A Сорбитолдегидрогеназа SDH 1.1.1.14 1 C Шикиматдегидрогеназа SKDH 1.1.1.25 2 A Супероксиддисмутаза SOD 1.15.1.1 4 (-2, -3, -4) 1 B Для некоторых ферментов, у которых не для всех зон была возможна генетическая интерпретация, в скобках курсивом даны номера зон (в порядке от анода к катоду) и соответствующих локусов, взятых в дальнейший анализ (например, для FEST л-2 соответствует локусу Fest-2). См. текст.
Гистохимическое окрашивание гелей для выявления зон ферментативной активности проводили по стандартным методикам (Aebersold et al., 1987; Cheliak, Pitel, 1984; Conkle et al., 1982; Hunter, Markert, 1957; Kephart, 1990; Manchenko, 1994;
Sicialiano, Shaw, 1976; Vallejos, 1983) с незначительными модификациями.
Зоны активности обозначались общепринятыми сокращениями латинизированных тривиальных названий ферментов (например, алкогольдегидрогеназа = ADH). Множественные зоны активности и соответствующие генные локусы обозначались сокращенными названиями ферментов, набранными курсивом, и нумеровались в порядке убывания электрофоретической подвижности от анода к катоду (например, Adh-1, Adh-2). Аллели обозначались в соответствии с относительной электрофоретической подвижностью аллозимов по сравнению с наиболее распространенным вариантом, подвижность которого принималась за 100.
Так, наиболее частый аллель локуса фосфоглюкомутазы, контролирующего быструю зону активности, обозначался Pgm-1100 (или просто 100, если понятно из контекста, о каком локусе идет речь).
Описан генный контроль (Крутовский и др., 1987; Politov et al., 1998; Белоконь и др., 2005) 17 изоферментных систем сосен подрода Strobus и 16 изоферментных систем у елей. Всего выявлены продукты 36 аллозимных локусов. Набор ферментов варьировал при анализе внутри разных видов и для межвидовых сравнений, а также в зависимости от конкретных задач. Так, для межвидовых сравнений в пределах подрода Strobus использовался набор из 17 локусов, по которым удалось однозначно установить соответствие аллельных вариантов между видами. В то же время для сравнений в пределах кедровых сосен набор локусов был расширенным, а для изучения внутривидовой дифференциации включали все локусы (до 31), для продуктов которых было получено хорошее разделение и надежная стабильная окраска. Между временными периодами исследований (например, для Pinus sibirica) наборы локусов также несколько различались. Основным методом установления генного контроля был анализ сегрегационных отношений в гаплоидных эндоспермах семян гетерозиготных деревьев.
При анализе совместной сегрегации по парам локусов обнаружено генетическое сцепление между аллозимными локусами у Pinus sibirica (Политов и др., 1989).
Выявлены группы сцепления Pgi-2 Ц(0,301)Ц Adh-1 Ц(0,275)Ц Lap-3 и Fest-2 Ц(0,309)Ц Lap-2 (в скобках приведены средние частоты рекомбинации). Анализ литературы показал, что данные группы сцепления описаны и у других видов сосен и родов сосновых. Таким образом, подтвержден факт консерватизма групп сцепления у сосновых.
ГЛАВА 4. УРОВНИ ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ У КЕДРОВЫХ СОСЕН На основании многолокусных генотипов зародышей с помощью компьютерных программ BIOSYS-2 (Swofford, Selander, 1981), POPGENE (Rudloff et al., 1988) и GenAlEx V.5 (Peakall, Smouse, 2001) рассчитывали частоты аллелей и стандартные показатели генетической изменчивости, в т.ч. наблюдаемую и ожидаемую (в предположении равновесия Харди - Вайнберга) гетерозиготность.
Pinus sibirica Исследовано 36 выборок P. sibirica, представляющих практически весь ареал, включая северо-восток Европейской части России, Урал, Западную, Среднюю и Восточную Сибирь.
В 1985Ц1994 гг. были исследованы выборки взрослых деревьев с юго-востока Западно-Сибирской равнины (С, З-1, З-3), из Горного Алтая (Я) и предгорий северного макросклона Западного Саяна (Л, Ф, М, МК, СР) по 21 аллозимному локусу. От 42 до 52% локусов были полиморфны в разных выборках, в среднем этот показатель оказался равным 46,2%. Число аллелей на локус варьировало между популяциями незначительно, в среднем составив 1,8. Средняя наблюдаемая гетерозиготность варьировала от 0,136 (М) до 0,198 (З-1), средняя ожидаемая гетерозиготность - от 0,1(М) до 0,176 (З-1).
В 1992Ц1995 гг. исследовались выборки зародышей семян из тех же популяций, а также с севера Западной Сибири (КО, НЯ), севера Средней Сибири (ТУ) и Монголии (БУ) по 19 аллозимным локусам. Аналогично результатам предыдущего анализа, все исследованные параметры незначительно варьировали между выборками. Исключение составили выборки с северо-запада Западной Сибири (КО) и с крайнего юго-юговостока ареала, из Монголии (БУ), для которых все показатели были несколько ниже, чем для выборок из зоны оптимума вида. Средняя ожидаемая гетерозиготность изменялась в пределах от 0,081 (БУ) до 0,171 (ТУ), аллельное разнообразие составило 1,7 аллеля на локус, 1,4 аллеля с частотой более 0,05, эффективное число аллелей 1,238.
В небольших насаждениях Кедровый Остров в бассейне р. Малая Сосьва (КО) и БогдоУла (БУ) в Монголии, показатели генетического разнообразия были снижены, что объясняется изоляцией на окраинах ареала и связанной с ней инбридингом.
В Байкальском регионе были исследованы 18 выборок по расширенному набору изоферментных локусов. Всего из 31 локуса в 22 (77%) изменчивость наблюдалась, по крайней мере, в одной из популяций. В среднем на популяцию выявлялось 46% изменчивых локусов, 42% локусов были полиморфными по 95%-му критерию полиморфизма. В среднем обнаружено 1,63 аллелей на локус на популяцию (эффективное число аллелей 1,21). Средняя ожидаемая по равновесию ХардиВайнберга гетерозиготность составила 0,118 (от 0,104 в ТА до 0,144 в ЛС).
Уровни внутрипопуляционной изменчивости по аллозимным локусам у сосны кедровой сибирской по всем наборам данных оказались сходными (0,162, 0,140 и 0,130), что близко к средним значениям, характерным для сосен, сосновых и хвойных в целом. Гипотеза о более низком генетическом разнообразии северных популяций у широкораспространённых бореальных видов на материале по данному виду не подтверждается. Обнаружена тенденция к снижению изменчивости в окраинных популяциях, по-видимому, связанная с лэффектом основателя.
Pinus cembra Растительный материал был представлен шестью выборками из естественных популяций Альп и Карпат объемом не менее 70 семян из каждой и четырьмя выборками вегетативных почек размером не менее 40 индивидов на выборку с географических культур в Кужире (Румыния, объект Института лесных исследований и управления, Бухарест).
В разных популяциях от 43 до 60% (в среднем 50%) локусов были изменчивыми, от 20,0 до 43,3% (в среднем 29,4%) полиморфными (P95). В целом для вида в 73,3% локусов обнаружена изменчивость, из 22 изменчивых локусов в 14 частота наиболее распространенного аллеля не превышала 0,95 (P95=46,7%). Среднее число аллелей на локус варьировало в популяциях от 1,50 до 1,90, в среднем составив 1,68, а в целом для вида - 2,17 аллеля на локус. Среднее эффективное число аллелей на локус (Ae) варьировало в популяциях от 1,09 до 1,26 (в среднем 1,17). Все перечисленные показатели были выше в популяциях Восточных Карпат, чем в выборках из Альп. То же относится и к значениям наблюдаемой гетерозиготности, которые в среднем для Альп составили 0,057 (HO для зародышей по 27 локусам) против 0,075 в Восточных Карпатах и 0,121 в выборке РТ. Ожидаемая гетерозиготность составила в Альпах в среднем 0,0против 0,094 в Восточных Карпатах и 0,133 в южнокарпатской выборке (HE для зародышей по тем же локусам), или 0,070 против 0,106 и 0,147 по всем анализированным 30 локусам. В пяти изученных выборках зародышей (кроме ШМ) наблюдался дефицит гетерозигот по сравнению с равновесием ХардиЦВайнберга, что может быть следствием самоопыления и близкородственных скрещиваний. В Карпатах дефицит гетерозигот в среднем был сильнее, чем в Альпах. Это, по-видимому, объясняется более низкой численностью и большей фрагментированностью карпатских популяций, что ведет к более высокой степени инбридинга. Таким образом, гетерозиготность европейской кедровой сосны, P. cembra, обладающей небольшим разорванным ареалом в Альпах и Карпатах, ниже (0,082), чем у близкородственной и широкораспространенной сибирской кедровой сосны, P. sibirica (0,106), однако, лишь примерно на 20%, несмотря на несравнимые по размерам ареалы и контрастную степень их фрагментированности.
Pinus koraiensis В разных популяциях российского Дальнего Востока, Китая и Ю. Кореи от 50,до 63,3% (в среднем по 12 выборкам 55,3%) локусов были изменчивыми, от 30,0 до 43,3% (в среднем 37,5%) полиморфными. В целом для вида в 83,3% локусов обнаружена изменчивость, из 25 изменчивых локусов в 11 частота наиболее распространенного аллеля не превышала 0,95 (P95=36,7%). Среднее число аллелей на локус варьировало в популяциях от 1,67 до 2,07, в среднем составив 1,87, а в целом для вида 2,73 аллеля на локус. Среднее эффективное число аллелей на локус (Ae) в популяциях находилось в пределах от 1,20 до 1,28 (в среднем 1,23). Уровень средней ожидаемой гетерозиготности оказался довольно высоким, от 0,186 до 0,224, однако, уровень наблюдаемой гетерозиготности был выше, от 0,207 до 0,278. Значительных отличий этих параметров между выборками из разных регионов выявлено не было, не обнаружено отмеченное некоторыми зарубежными авторами (Kim et al., 2005) снижение генетического разнообразия в северных популяциях.
Pinus pumila В Байкальском регионе было исследовано 10 выборок по 32 локусам, среднее число аллелей на локус составило 2,0, средняя ожидаемая гетерозиготность 0,234. В четырёх выборках взрослых деревьев с Камчатки и из Корякии средняя наблюдаемая гетерозиготность составила 0,228 (от 0,202 до 0,264 в разных выборках), средняя ожидаемая гетерозиготность 0,231 (от 0,225 до 0,240). Значения оказались выше, чем у других исследованных нами видов и близки к максимальным для сосен и хвойных в целом.
Сравнительный анализ уровней изменчивости у кедровых сосен Анализ данных таблицы 2 показал, что для всех изученных видов кедровых сосен полученные в настоящей работе значения параметров аллозимной изменчивости лежат в пределах, характерных для видов. В то же время имеющиеся в литературе оценки параметров для одних и тех же видов весьма широко варьируют. Так, для многих видов (например, P. albicaulis, P. cembra, P. koraiensis) значения HE различаются вдвое и даже втрое. Это с очевидностью связано с использованием различных наборов аллозимных локусов. Таким образом, сравнивать межпопуляционные или межвидовые различия по таким нестандартизированным данным нецелесообразно. Нами показана тенденция, что с увеличением числа изученных локусов оценки полиморфизма падают. Это происходит оттого, что в исследованиях с малым числом локусов мономорфные локусы или с редкими альтернативными аллелями, как правило, не используются. Линейная отрицательная корреляция (r=-0,459) между числом изученных локусов и полученными на их основе оценками ожидаемой гетерозиготности была достоверной (P<0,01). На рисунке 1 приведены результаты сравнительного анализа уровней аллозимной гетерозиготности мягких сосен по идентичному набору локусов. В целом внутрипопуляционные показатели изменчивости падают в ряду P. pumila > P. koraiensis > P. sibirica > P. cembra. Относительно низкую изменчивость P. cembra, очевидно, можно связать с ограниченным и фрагментированным ареалом, низкой численностью и плотностью популяций, то есть факторами, которые приводят к дрейфу генов, и в конечном итоге - к генетическому обеднению. В то же время, масштабы этого обеднения никак не соответствуют степени изоляции. Так, для P. cembra по 30 локусам генное разнообразие составило 0,101, а для P. sibirica 0,130. Уровень изменчивости кедрового стланика максимален для изученных видов сосен, что можно связать с чрезвычайно высокой экологической пластичностью этой уникальной сосны, растущей в экстремальных для древесных растений условиях, а также с большой продолжительностью жизни, характерной для этого вида. Вероятно, высокая аллозимная гетерозиготность помогает стланику адаптироваться к суровой среде обитания.
Таблица 2. Уровни аллозимной изменчивости в популяциях сосен подрода Strobus Вид NP NL A HE Источник P. albicaulis Британская Krutovskii et al., 1995a;
1 16 1,9 0,2Колумбия Politov, Krutovskii; 19 30 20 2,2 0,096 Jorgensen, Hamrick, 1997b 9 19 2,1 0,154 Bruederle et al., 196 21 1,8 0,135 Rogers et al., 1919 12 1,9 0,262 Krakowski et al., 20P. cembra Альпы, Татры, Ю.Карпаты, 11 8 1,9 0,247 Szmidt, 19Сибирь Украинские 1 21 1,7 0,145 Пирко, 20Карпаты Италия 5 25 2,5 0,281 Belletti, Gullace, 1999a Австрия 1 20 1,6 0,100 Lewandowski, Burczyk, 20Австрия 1 22 1,6 0,085 Klumpp, Stefsky, 20Альпы и Карпаты 6 30 1,7 0,101 данное исследование Гончаренко и др., 1987;
P. sibirica 1 20 1,6 0,1Гончаренко и др., 19от Урала до 2018 1,9 - Подогас и др., 19Байкала ос.
Ц и З части Гончаренко и др., 1992b;
8 20 1,8 0,1ареала Goncharenko et al., 19 Вид NP NL A HE Источник - ч. ареала 9 19 1,8 0,158 данное исследование - и З части 13 19 1,7 0,140 данное исследование ареала Байкальский 18 31 1,6 0,130 данное исследование регион P. koraiensis Корея 8 23 2,0 0,208 Kim et al., 19Китай 4 4p 2,3 0,370 Yang et al., 19Корея 7 9 2,3 0,280 Choi et al., 19Potenko, Velikov, 1998;
Россия 19 26 1,9 0,1Потенко, Великов, 19Potenko, Velikov, 2001;
Приморье 5 26 1,8 0,1Потенко, Великов, 20Potenko, 2004;
Россия 25 24 1,9 0,1Великов, Потенко, 2006b Корея, Россия, 12 18 2,0 0,169 Kim et al., 20Китай Россия, Китай, 12 30 1,9 0,139 данное исследование Корея P. pumila Чукотка, Сахалин 5 22 2,5 0,255 Гончаренко и др., 1992a Чукотка, 6 20 2,8 0,271 Гончаренко, Силин, 19Сахалин, Итуруп Байкальский 10 32 2,0 0,234 данное исследование регион Камчатка и 4 27 0,231 данное исследование Корякия Япония 18 19 2,1 0,223 Tani et al., 19P. armandii var.
3 20 1,5 0,103 Kanetani et al., 2004a amamiana P. ayacahuite 14 23 - 0,154 Ledig, 19P. flexilis весь ареал 30 21 3,7 0,186 Jorgensen, Hamrick, 1997a Колорадо 8 10P 2,5 0,320 Schuster et al., 19Колорадо 5 28 1,7 0,162 Schuster, Mitton, 20P. lambertiana 1 19 2,8 0,275 Conkle, 19P. monticola весь ареал 28 12 1,7 0,177 Steinhoff et al., 19Британская 1 14 1,8 0,180 El-Kassaby et al., 1987b Колумбия P. parviflora Япония 16 11 2,1 0,259 Tani et al., 20P. strobus весь ареал 27 12 - 0,236 Ryu, 19Ньюфаундленд, 9 20 1,8 0,195 Rajora et al., 19Онтарио Вид NP NL A HE Источник Квебек 10 18 2,0 0,180 Beaulieu, Simon, 19Онтарио 2 54 2,3 0,153 Buchert et al., 19P. wallichiana Бутан 5 20 1,8 0,168 Lee et al., 19Индия 20 16 1,8 0,152 Bakshi, 20P. cembroides var.
4 14 2,5 0,386 Molina-Freaner et al., 20lagunae P. edulis 3 17 1,9 0,165 Betancourt et al., 19 9 10 1,7 0,213 Premoli, 19P. pinceana 5 13 2,3 0,373 Molina-Freaner et al., 20 8 27 1,9 0,174 Ledig et al., 20P. maximartinezii 1 33 1,3 0,122 Ledig et al., 19P. bungeana 10 31 1,4 0,108 Li et al., 20P. longaeva White Mts. 3 36 1,9 0,134 Lee et al., 20Great Basin 16 27 2,4 0,228 Hamrick et al., 19В. Great Basin, З.
5 14 1,5 0,327 Hiebert, Hamrick, 19плато Колорадо P. balfouriana 4 23 1,6 0,208 Hamrick, 19горы Кламат и 16 11 1,3 0,075 Oline et al., 20Сьерра-Невада P. rzedowskii 9 14 1,8 0,219 Delgado et al., 19Примечание: NP - число проанализированных популяций; NL- число локусов; HE- средняя ожидаемая гетерозиготность; A - среднее число аллелей на локус.
0,30,20,20,10,10,00,0Рис. 1. Средняя ожидаемая гетерозиготность по 17 аллозимным локусам сосен секции Strobus edulis peuce flexilis pumila sibirica cembra strobus armandii Среднее parviflora albicaulis bungeana monticola koraiensis wallichiana lambertiana strobiformis mastersiana armandii var.
morrisonicola ГЛАВА 5. СИСТЕМА СКРЕЩИВАНИЯ И ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ У КЕДРОВЫХ СОСЕН Аллозимная гетерозиготность является одной из ключевых характеристик особи и популяции, через интенсивность и пластичность метаболизма непосредственно влияющей на приспособленность (выживаемость, плодовитость, качество потомства, продолжительность жизни) и таким образом определяющей многие аспекты их взаимоотношения со средой (Алтухов, 1989a,b; 1995a; 1998a; 1999; Алтухов и др., 1986). Вопросы динамики гетерозиготности в связи с возрастом и онтогенетическими стадиями являются одними из важнейших в познании механизмов формирования и поддержания генетической структуры популяций древесных растений (Bush, Smouse, 1991; Bush, Smouse, 1992; Bush et al., 1987; Политов, 2004; Политов и др., 1992). Для кедровых сосен, как для большинства хвойных, характерна смешанная система скрещивания, т.е. комбинация ауткроссинга с определенной долей самоопыления. В результате близкородственных скрещиваний и самоопыления у них формируется частично инбредное потомство. Известно, что инбридинг может негативно влиять как на жизнеспособность отдельных особей, так и на устойчивость популяции в целом (Алтухов, 2003).
Анализ параметров системы скрещивания (однолокусные и многолокусные оценки доли ауткроссинга) проводился с помощью методов Expectation-Maximization и Ньютона - Рэфсона. Выделяют две основные группы методов оценки параметров системы скрещивания (частоты перекрестного опыления t и частоты аллелей в ауткроссном пуле пыльцы). Оценка параметров по каждому локусу отдельно называется однолокусным оцениванием (single-locus estimation), расчет t по данным о многолокусных генотипах родителей и потомков - многолокусным оцениванием (multilocus estimation). В работе использованы варианты однолокусного (Cheliak et al., 1982) и многолокусного (Green et al., 1980) методов. Те же выборки анализировались по методу Ньютона - Рэфсона с использованием компьютерной программы MLTR v.3.(Ritland, 1981). В качестве опций принимались неодинаковые частоты в пулах материнских и отцовских аллелей. Бутстрэппинг для оценки устойчивости оценок проводили как по семьям (потомки материнских деревьев), так и по индивидуальным деревьям в пределах семей. Разница между однолокусной и многолокусной оценками ауткроссинга служила показателем наличия иных, нежели самоопыление, форм инбридинга в популяции, т.е. близкородственных скрещиваний. Оценку отклонения наблюдаемых распределений генотипов от ожидаемых при равновесии Харди - Вайнберга проводили с помощью 2-теста. На основе генотипических данных для зародышей и материнских деревьев исследовалась генетическая структура сразу двух поколений растений. Коэффициент инбридинга особи относительно популяции (FIS) послужил показателем меры таких отклонений в сторону дефицита или эксцесса гетерозиготных генотипов. Таким образом, ретроспективно анализировалась динамика гетерозиготности в популяциях кедровых сосен, от ранних стадий к поздним. Хотя в данном случае онтогенетически более поздняя стадия (взрослые материнские растения) в абсолютном масштабе времени предшествует более ранней (зародыши), мы принимали допущение, что векторы изменений сохраняются неизменными на протяжении нескольких поколений.
Pinus sibirica Изучены семена из 9 локальностей (в двух из них использованы неперекрывающиеся выборки, собранные в два последовательных года). Полученные с помощью 8 локусов оценки представлены в таблице 3. В центральной части ареала частота самоопыления не превышала 15-20%, а в двух маргинальных популяциях сибирской кедровой сосны с западной окраины ареала (Вая и Шежим) оценки оказались различными (табл. 3, рис. 2). В популяции Вая многолокусная оценка была высокой (0,921) и практически равной однолокусной (0,915). В выборке Шежим обе оценки оказались ниже, причем значение tm (0,791) несколько превышало значение ts (0,736).
Таким образом, в этой популяции как самоопыление (более 20%), так и близкородственные скрещивания (порядка 6%), играют гораздо более существенную роль в формировании поколения зародышей. Таким образом, хотя P. sibirica является преимущественно перекрестноопыляющимся видом, в ряде популяций нам удалось зафиксировать довольно высокую частоту самоопыления и наличие инбридинга, связанного с близкородственными скрещиваниями.
Именно эти факторы ответственны за возникновение дефицита гетерозигот среди зародышей, который обнаруживается в большинстве выборок (по всем локусам и выборкам, в 142 случаях против 117 значения FIS были положительными, в 24 случаях - достоверно). Из 35 выборок лишь в 6 суммарное отклонение было в сторону незначительного эксцесса гетерозигот, в остальных (29 случаев) - в сторону дефицита гетерозигот, что свидетельствует о систематическом, хотя и небольшом по силе инбридинге в популяциях этого вида. В среднем, значения FIS оказались положительными, для всех локусов 0,040, а если исключить слабополиморфные - 0,053.
У взрослых деревьев среди изученных выборок наблюдается противоположная картина - по большинству локусов FIS имел отрицательные значения, свидетельствующие об эксцессе гетерозигот в репродуктивной части популяций. Отсутствие дефицита гетерозигот у взрослых деревьев, вероятно, связано с отбором против инбредных гомозигот, выравнивающим генотипические распределения, а случаи эксцесса можно объяснить балансирующим отбором в пользу гетерозигот (Bush, Smouse, 1992; Алтухов, 2003). При частоте ауткроссинга t=0,85 коэффициент инбридинга в потомстве теоретически ожидается равным 0,079, что согласуется с реально существующим уровнем (в среднем FIS=0,073). В целом корреляция между наблюдаемыми и ожидаемыми значениями F по всем изученным локусам и выборкам оказалась очень высока (r=0,58, d.f.=61, P<0,0005).
Показанное нами с помощью аллозимных локусов в ряде популяций существенное влияние самоопыления и близкородственных скрещиваний на динамику генетической изменчивости в популяциях сибирской кедровой сосны свидетельствует о важности учета системы скрещивания при анализе генетической структуры популяций данного вида, а получение количественных оценок частоты самоопыления имеет важный теоретический и практический интерес. Большое значение имеет отбор против инбредного потомства, являющийся важнейшим фактором, нивелирующим негативное действие инбридинга.
100% 80% 60% s 40% tm 20% 0% -20% Рис. 2. Оценки частоты самоопыления (черные столбики) и ауткроссинга в популяциях P. sibirica (серые столбики), P. cembra (косая штриховка) и P. koraiensis (белые столбики). Средние для видов значения выделены более жирным контуром.
Таким образом, через элиминацию инбредного потомства популяции освобождаются от генетического груза, а рост гетерозиготности выше точки равновесия по Харди - Вайнбергу может свидетельствовать об адаптивной роли части аллозимного полиморфизма (Bush, Smouse, 1992). Хотя это и не является прямым доказательством отбора именно по данным локусам, поскольку всегда существует вероятность сцепления аллозимного маркера в хромосоме с каким-то адаптивно нагруженным анонимным геном, но и прямое действие отбора на аллели и генотипы у хвойных достаточно хорошо документировано (см., например, Rothe, 1990).
Таблица 3. Значения частоты перекрестного оплодотворения в выборках P. sibirica Выборка Число Число tm s. e. (tm) ts s. e.(ts) деревьев семян Филин Ключ-85 29 565,1 0,817 0,031 0,788 0,0Филин Ключ-86 24 309,4 0,892 0,042 0,884 0,0Мутная Речка-86 50 563,3 0,980 0,019 0,959 0,0о р е ь а а я а м s о a ж ю ы ra i н о н к к н к о c и е н л ' 's ''i b к ч и и р й r Х ч ч б Ва а а ж а i n т с ян л г m к к Я e р ю Яй о ю ib в i Ре e Чо ч ч А Ке к и т л s a Ше c е r я с ц э К Кл й Гор Р Ре ь ть и х мо ы н н ko ч с от е Л я я С и и л а х х У а а л л б о н н и л т т Ма Си у Ф Со Фи М Му Ма Выборка Число Число tm s. e. (tm) ts s. e.(ts) деревьев семян Мутная Речка-87 24 239,6 0,863 0,038 0,823 0,0Малый Кебеж 15 115,1 0,960 0,072 0,933 0,0Собачья Речка 12 93,5 0,846 0,125 0,834 0,1Листвянка 41 377,1 0,912 0,031 0,871 0,0Яйлю 27 193,9 0,855 0,045 0,776 0,0Смокотино 43 338,5 0,855 0,045 0,776 0,0Среднее для 29,4 310,6 0,894 0,057 0,862 0,0центра ареала Шежим 10 60 0,791 0,215 0,736 0,1Вая 8 267 0,921 0,032 0,915 0,0Среднее для вида 25,7 283,9 0,882 0,063 0,846 0,0Примечание. tm - многолокусная оценка, ts - средняя однолокусная оценка. В скобках (s. e.) - значение ошибки, рассчитанной методом бутстрэппинга (100 репликаций) между индивидуумами внутри семей.
Pinus cembra По своей морфологии этот вид крайне близок к P. sibirica, однако, в отличие от последнего, имеет фрагментированный типом ареала. Существование сосны кедровой европейской в небольших изолятах с низкой плотностью и эффективной численностью контрастирует с типичными для сибирской кедровой сосны протяженными насаждениями. При этом по сравнению с альпийской частью ареала P. cembra в Карпатах фрагментация ареала гораздо более выражена, чем в Альпах. В данном разделе рассматривается влияние этих особенностей на систему скрещивания и динамику гетерозиготности на разных возрастных стадиях. Материалом для оценки параметров системы скрещивания послужили три выборки из Украинских Карпат:
Усть-Чорна (УЧ), Яйко (ЯК) и Горганы (ГО).
Однолокусные оценки доли ауткроссинга в изученных выборках ГО и ЯК оказались равными 0,706 и 0,645, соответственно. Многолокусные оценки были несколько выше, 0,748 и 0,700, соответственно. Таким образом, общая частота эффективного самоопыления P. cembra в Украинских Карпатах составляет 30-35%, из которых 25-30% это собственно самоопыление и примерно 5% - результат инбридинга с участием двух родителей (biparental inbreeding), т.е. близкородственных скрещиваний рядом стоящих деревьев, которые более родственны друг другу, чем случайно взятые из популяции.
Уровень инбридинга (FIS) варьировал между локусами в выборке ГО от Ц0,025 до 0,272. В среднем, значение FIS было положительным, 0,113, и для двух локусов (Adh-1 и Mdh-2) тест на соответствие равновесию Харди - Вайнберга показал высокодостоверные отклонения в пользу дефицита гетерозигот. Еще более существенными были отклонения от генотипического равновесия в выборке ЯК. По всем шести изученным локусам значения FIS находились в пределах от 0,114 до 0,419, что указывает на дефицит гетерозигот. В среднем, значение FIS составило 0,229, что значительно выше, чем у P. sibirica. По четырём локусам, Adh-1, Mdh-2, Mdh-4 и Pgm-1, распределения генотипов достоверно отклонялись от равновесных. В целом, наблюдаемые значения FIS соответствовали ожидаемым, рассчитанным из значений ts по формуле FE=(1Цt)/(1+t) (Brown et al., 1989).
Во взрослой части популяций (материнские деревья) дефицита гетерозигот не обнаруживается. Напротив, наблюдается некоторый эксцесс гетерозигот (FIS= Ц0,150 в ГО и Ц0,093 в ЯК). Если брать в расчёт лишь локусы, изученные в зародышах, соответствующие значения изменились незначительно (ГО, FIS= Ц0,112, ЯК, FIS= - 0,025). В еще одной выборке из Украинских Карпат (Усть-Чорна) объемом 16 деревьев нами также были получены низкие значения как однолокусной (0,707), так и многолокусной (0,686) оценок ауткроссинга.
Для карпатских популяций P. cembra фактором, способствующим инбридингу, с очевидностью является низкая эффективная численность и плотность насаждений. Они на 70-80% состоят из ели европейской, Picea abies (Пирко, 2006, личное сообщение), кроны деревьев которой создают экранирующий эффект для разлёта пыльцы других видов, в т. ч. Pinus cembra. Сходные низкие значения доли ауткроссинга были получены для насаждений реликтовых популяций сосны обыкновенной P. sylvestris и сосны меловой P. sylvestris var. cretacea на Украине (Мудрик, 2006).
Pinus koraiensis Оценки доли ауткроссинга в среднем для четырех выборок сосны корейской (tm=0,974; ts=0,936) оказались выше, чем у остальных кедровых сосен и в среднем у хвойных (Политов и др., 1992). Столь же высокие значения t обнаружены для ряда популяций российского Дальнего Востока (Потенко, Великов, 2002; Великов, Потенко, 2006). Во всех исследованных нами выборках зародышей наблюдались достоверные отклонения от равновесия Харди - Вайнберга, при этом семь из девяти таких случаев были связаны с дефицитом гетерозигот. При усреднении полокусных значений FIS проявлялась тенденция к дефициту гетерозиготных генотипов в трех из четырех выборках. В то же время ни в одной из выборок материнских деревьев не наблюдалось положительных значений FIS. При исключении слабополиморфных локусов тенденция к избытку гетерозигот сохранилась. Во всех выборках материнских деревьев значения индекса фиксации (-0,183, -0,049, -0,076, -0,194 для ПХ, СА, МХ и ЛА) были ниже, чем среди зародышей их семян (0,072, 0,033, -0,008 и 0,029, соответственно).
Pinus pumila Исследованы семена кедрового стланика из четырех местопроизрастаний на территории Корякского автономного округа (Пенжина, ПЕ), Камчатской области (Вочкажеч, ВЧ и Кабан, КБ) и о. Кунашир (КШ). Достоверные отклонения от равновесия Харди - Вайнберга отмечены во всех выборках: в КШ по 10 из изменчивых локусов, в ВЧ - по 12 из 18, в КБ - по 11 из 17, в ПЕ - по 7 из 17. Все случаев достоверных отклонений связаны с дефицитом гетерозигот, о чем свидетельствуют положительные значения FIS. В среднем, очевидна тенденция к дефициту гетерозиготных генотипов в целом в изученных выборках: значения FIS КШ - 0,126, в ВЧ - 0,252, в КБ - 0,171, в ПЕ - 0,080. При исключении локусов с относительно слабой изменчивостью усредненные по высокополиморфным локусам значения индекса фиксации FIS(com) в КШ практически не изменились (0,124), а в трех остальных выборках возросли (0,342, 0,211 и 0,155, соответственно). Таким образом, анализ наблюдаемых и ожидаемых распределений генотипов и отклонений от равновесия Харди - Вайнберга в выборках зародышей в целом показал наличие значительного дефицита гетерозигот.
В выборках взрослых деревьев большинство распределений генотипов оказались в равновесном по Харди - Вайнбергу состоянии. Достоверные отклонения в сторону дефицита гетерозигот отмечены в трех выборках, по трем локусам в ПЕ, двум в ВЧ и одному в КШ. В то же время в выборке КБ обнаружен достоверный эксцесс гетерозигот по трем локусам. В среднем по всем изученным локусам инбридинг (FIS=0,108, среди материнских деревьев наблюдался в выборке ПЕ, две выборки (КШ и ВЧ) были состоянии, близком к равновесному (FIS=0,023 и Ц0,010, соответственно), в то время как в выборке КБ наблюдался эксцесс гетерозигот. При исключении слабополиморфных локусов значения изменились незначительно, однако, более выраженными стали тенденции к дефициту гетерозигот в выборке ПЕ (FIS(com)=0,167) и к эксцессу - в выборке КБ (FIS (com)= Ц0,167). В трех случаях из четырех (кроме выборки ПЕ) средние значения индекса фиксации были ниже в выборках материнских растений, чем среди зародышей их семян (рис. 3).
0,0,0,0,0, FIS зародыши -0, FIS(com) зародыши FIS взрослые FIS(com) взрослые -0,Кунашир Вочкажец Кабан Пенжина Рис. 3. Значения индекса фиксации Райта (коэффициента инбридинга) в выборках зародышей и взрослых растений кедрового стланика При анализе распределений генотипов по аллозимным локусам в зародышах покоящихся семян большинства хвойных, как правило, наблюдается слабый или средней степени инбридинг (Danzmann, Buchert, 1983; Delgado et al., 1999; El-Kassaby et al., 1987a; Epperson, Allard, 1984; Fady, Westfall, 1997; Fins, Libby, 1982; Fins, Seeb, 1986;
King et al., 1984; Lewandowski et al., 1991; Muona et al., 1987; Politov, Krutovskii, 1994;
IS Значения индекса фиксации Райта, F Shea, 1985; Shea, 1987; Политов, 1989a; Политов, Крутовский, 1990; Политов и др., 1992), связанный, как обычно считается, с самоопылением, а также, в случае наличия семейной структуры насаждений, и с близкородственными скрещиваниями. Оба эти фактора могут действовать и в популяциях кедрового стланика. Более того, у этого вида, обладающего уникальной для сосен кустарниковой или стелющейся жизненной формой и столь же необычным механизмом распространения семян, их влияние может быть более выраженным, чем у типичных прямоствольных анемохорных (т.е. с распространяемыми ветром семенами) сосен. Необычным для сосен и характерным для стланика является то, что соотношение высоты типичного растения (обычно 1,5Ц4 м) и площади, которую занимает этот индивидуум, у данного вида гораздо ниже, чем у большинства хвойных.
Интересным является факт, что явление элиминации инбредного потомства не наблюдалось в выборке Пенжина (ПЕ). Из-за частых пожаров заросли стланика в этом районе молодые, несомкнутые, а отдельные растения, вероятно, еще не вступили в конкурентные отношения друг с другом. В данном случае причиной таких различий в генетической структуре с остальными выборками явилось пирогенное воздействие, в том числе и вызванное усилением антропогенной нагрузки в окрестностях районного центра Каменское. Сходное явление большей роли инбридинга в сомкнутых зарослях мы обнаружили также при изучении кедрового стланика Прибайкалья.
Таким образом, полученные в настоящем исследовании данные о превышении наблюдаемой аллозимной гетерозиготности у взрослых материнских деревьев кедровых сосен над таковой у зародышей их семян является достаточно типичными для хвойных.
В целом динамика, связанная с нарастанием гетерозиготности в ходе онтогенеза, объясняется элиминацией инбредного потомства и балансирующим отбором в пользу гетерозигот - ведущим фактором поддержания аллозимного полиморфизма в популяциях (Алтухов, 2003). Среди других факторов возрастания гетерозиготности можно отметить ассоциативное сверхдоминирование - эффект влияния гетеротического локуса на сцепленные с ним нейтральные (Strobeck, 1979).
ГЛАВА 6. ГЕНОГЕОГРАФИЯ КЕДРОВЫХ СОСЕН На основании матриц многолокусных генотипов материнских деревьев или зародышей семян рассчитывались F-статистики (Wright, 1965; 1978), а для локусов, которые анализировались только в эндоспермах, доля межпопуляционной компоненты изменчивости оценивалась с помощью FDT-статистики Нея (Nei, 1977). По данным о частотах аллелей рассчитывали стандартные генетические дистанции Нея DN (Nei, 1972b). Кластеризацию по методу UPGMA с оценкой бутстрэп-поддержки узлов ветвления проводили в модулях Neighbor и Consense пакета программ PHYLIP v3.(Felsenstein, 1989), анализ главных компонент и многомерное шкалирование матриц генетических расстояний - в пакете STATISTICA (StatSoft, 1998).
Pinus sibirica В центральной части ареала этого вида, т.е. в зоне экологического оптимума, генетическая подразделенность оказалась низкой - лишь 2,5% изменчивости распределено между популяциями. Анализ дифференциации выборок из центра и с запада ареала кластерным и многомерным анализом обнаруживает группы популяций гор юга Средней Сибири (Алтай и Саяны), юго-востока Западной Сибири (Томская обл.) и севера Западной и Средней Сибири (Ханты-Мансийск и Туруханск).
На востоке ареала, в Байкальском регионе, подразделенность оказалась несколько выше (FST=0,045). Обычно считается, что в целом слабая географическая подразделенность является следствием интенсивного потока генов (Goncharenko, 1993).
Необходимо, однако, обратить внимание на межлокусные различия в значениях FST (наиболее выражена дифференциация по локусам Adh-2 и Mdh-3). Неодинаковый вклад локусов в межпопуляционные различия может объясняться тем, что некоторые из этих локусов сами являются селективно значимыми или сцеплены с такими локусами, и, таким образом, подвержены действию отбора. При этом локусы со средними значениями FST близки к нейтральным, с низкими - подвержены действию балансирующего отбора, выравнивающего частоты аллелей, с высокими - разнообразящего отбора (Алтухов, 1989). Выборки из популяций P. sibirica Байкальского региона (рис. 4) обнаружили генетическое своеобразие по сравнению с южносибирскими низкогорными кедровниками. Методом главных координат показано, что по 10 общим локусам, изученным во всех выборках, 1-я ось дифференцирует южносибирские горные и западносибирские выборки, с одной стороны, и кедровники Байкальского региона, с другой. По 2-й главной координате различаются южносибирские горные и западносибирские выборки. Таким образом, выявлены четыре основных кластера популяций - Восточноевропейско-Северозападносибирская, Алтайско-Саянская, Западно-Сибирская равнинная и Восточносибирская группы. Как показал впервые проведенный нами анализ выборок сибирской кедровой сосны из Европейской части России (Пермская обл. и Республика Коми), они близки к западносибирским популяциям. По-видимому, они имеют общее происхождение и, возможно, распространялись по окончании последнего оледенения из уральского рефугиума. При кластеризации восточносибирских выборок (популяции бассейна оз.
Байкал и Забайкалья) методами многомерного анализа выявляются группы популяций в соответствии с их географическим положением: 1) популяции западного Прибайкалья (Иркутская обл.); 2) южной Бурятии (хр. Хамар-Дабан и Джидинский); 3) северозападной Бурятии (Байкальский хр.); 4) северо-восточного Прибайкалья (Баргузинский хр.). Несколько обособленное положение занимают популяции из Читинской обл.
(Яблоновый хр.), юго-западной Бурятии (басс. р. Иркут) и северо-восточной Бурятии (район пос. Таксимо). Подобное соответствие генетической дифференциации географическому положению популяций, как и гетерогенность полокусных оценок FST, по-видимому, отражает влияние как процессов расселения из рефугиумов, так и локальной адаптации, т.е. селективных факторов.
Рис. 4. Ординация выборок Pinus sibirica в проекции двух первых главных компонент (по данным изоферментного анализа) Pinus cembra Анализ генетической подразделённости между выборками зародышей с помощью статистики FST показал, около 95% генетической изменчивости относится к внутрипопуляционной, и лишь 5% к межпопуляционной. При включении локусов, анализировавшихся только в эндоспермах (Adh-2, Lap-2, Mdh-3), межпопуляционная компонента изменчивости FDT составила в среднем 0,075. По отдельным локусам значения FST варьировали от 0,003 (локус Pgm-2, для которого не обнаружено достоверной гетерогенности аллельных частот) до 0,13 (Sod-4). По совокупным частотным данным для десяти популяций отмечена еще более высокая дифференциация FDT=0,099. В среднем генетическая дифференциация между альпийскими выборками, относящимися к сравнительно непрерывной центральной части ареала вида (FDT=0,066, DN=0,003 - 0,025), несколько выше, чем между четырьмя восточнокарпатскими (FDT=0,024, DN=0,004 - 0,011). Две южнокарпатские выборки максимально отличаются друг от друга (FDT=0,122, DN=0,040). Генетические расстояния между двумя южнокарпатскими выборками примерно того же порядка, как и между одной из них (ПЙ) и выборкой из Швейцарии (DN=0,041).
Pinus sibirica и P. cembra - сравнительный анализ Неиерархический анализ генетической подразделённости по совокупным данным для двух видов показал, что 8,9% изменчивости распределено между популяциями, при этом полокусные значения для всех полиморфных локусов достоверно отличаются от нуля и в некоторых случаях достигают 20% (Adh-2, Fest-2). При анализе каждого из видов в отдельности порядок величин FST остался неизменным, а сами значения близкими: 6,5% для P. cembra и 5,9% для P. sibirica. Иерархический FST-анализ показал, что при общей доле межвыборочной изменчивости 10,9% на межвидовую (FPT) приходится лишь 4,7%, а на выборки внутри видов (FSP) - 6,6%. Наибольший вклад в дифференциацию между видами вносят локусы Adh-2, Fest-2, Lap-3 и Skdh-1, между популяциями P. cembra - Adh-2, Lap-2, Mdh-4 и Sod-3, а между популяциями P. sibirica - Fest-2, Mdh-3, Pgm-1 и Sod-4.
UPGMA-кластеризация на основании матрицы генетических расстояний Нея (1978) показала, что при использовании в качестве внешней группы P. koraiensis европейская и сибирская кедровые сосны не образуют отдельных кластеров. Первым выделяется кластер североевропейских выборок P. sibirica (ШЖ и ВА), затем идет разделение на виды. Кластеризация выборок P. cembra показала тенденцию к выделению трех кластеров: 1) восточная часть Южных Карпат; 2) Альпы и одна из южнокарпатских выборок, 3) остальные карпатские выборки. В пределах P. sibirica также есть тенденция к кластеризации согласно географическому происхождению выборок, однако, практически все кластеры не имеют бутстрэп-поддержки.
Полученные результаты хорошо воспроизводятся при анализе методом многомерного шкалирования (рис. 5).
2, cembra - Альпы 2, cembra - С. (В.) Карпаты 1, cembra - Ю. Карпаты 1, sibirica - С.-В. Европа sibirica - З. Сибирь (Томск) 1, sibirica - Ср. Сибирь 1, sibirica - В. Сибирь 1,0,0,0,0,0,-0,-0,-0,-0,-1,-2,0 -1,8 -1,6 -1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,Измерение Рис 5. Ординация выборок Pinus sibirica и P. cembra по данным многомерного шкалирования матрицы генетических расстояний Измерение Таким образом, проведенный впервые совместный анализ популяций P. sibirica и P. cembra показал, что внутривидовая дифференциация перекрывает межвидовую, а сам уровень межвидовых различий значительно (на порядок величин) меньше, чем между остальными видами мягких сосен. Это указывает на недавнее, по-видимому, во время атлантического периода голоцена, как это предполагал Е.Г. Бобров (1978), прекращение потока генов между этими номинативными видами и ставит вопрос об их возможной конспецифичности и необходимости таксономической ревизии. Отсутствие четких морфологических различий между этими формами уже приводило многих систематиков к подобному выводу, однако сейчас преобладает точка зрения об их видовом статусе.
Pinus koraiensis Анализ межпопуляционной дифференциации между выборками зародышей с помощью статистики FST показал, что около 98% генетической изменчивости относится к внутрипопуляционной, и лишь 2% - к межпопуляционной (при включении в анализ локусов Adh-2, Lap-2 и Mdh-3, анализированных только в эндоспермах - 2,8%). По отдельным локусам значения FST варьировали от 0,001Ц0,009 до 0,047 (Skdh-1).
Кластерный анализ по методу UPGMA, так же как и анализ главных компонент, не выявили четкого разделения выборок на отдельные кластеры.
Дифференциация выборок очень слабая (значения DN от 0,002 до 0,016) и не поддерживается значениями бутстрэп-анализа. Можно отметить близость выборок хр.
Малый Хинган (ОБ и КТ-2) и слабые различия между популяциями хр. Сихотэ-Алинь.
Генетическая дифференциация максимальна между выборкой из Южной Кореи и остальными выборками (DN от 0,006 до 0,022), что отражает их географическую удаленность и изолированность от основной части современного ареала, расположенного на территории Дальнего Востока России.
Обнаруженный у P. koraiensis низкий уровень межпопуляционной дифференциации контрастирует с достаточно выраженной внутривидовой подразделенностью близкого вида секции Strobus из Восточной Азии - сосны Арманда P. armandii. У последнего вида различия между выборками из континентального Китая были как минимум на порядок величин выше и близки к подвидовому уровню. Для тайваньской разновидности сосны Арманда дифференциация с континентальными популяциями была на уровне близких видов. Причиной этих различий служит гораздо более выраженная у сосны Арманда фрагментация ареала, в последние века резко усилившаяся в результате освоения человеком территории Китая и Тайваня.
Pinus pumila Собранный в ходе наших экспедиций материал по кедровому стланику региона оз. Байкал, зоны БАМ (Становое нагорье и Становой хр.) и Дальнему Востоку был обработан по 28 изоферментным локусам, что послужило первыми популяционногенетическим данными по западной части ареала стланика. Изученные выборки показали высокий (средняя гетерозиготность около 21%) и характерный для вида в целом уровень изменчивости, близкий к обнаруженному нами и другими авторами в ранее изученных выборках тихоокеанского побережья России, Кореи и Японии (Krutovskii et al., 1994, 1995; Политов и др., 1995; Гончаренко и др., 1997; Tani et al., 1996). Стланик более сильно дифференцирован (8% межпопуляционных различий для всей изученной части ареала), чем сибирская кедровая сосна (4%) - вид таксономически относительно близкий и имеющий примерно равную суммарную площадь ареала. При этом различия наблюдаются не только между географически удаленными выборками, но и между соседними, произрастающими в контрастных экологических условиях, что предусматривает возможную роль локального отбора в формировании генетической структуры этого вида. С помощью многомерных статистических методов выявлена закономерная кластеризация выборок в соответствии с их географическим происхождением. Полярное положение на двумерных проекциях занимают группы дальневосточных популяций и байкальские выборки, тогда как стланик зоны БАМ занимает промежуточное положение (рис. 6). Несколько обособленное положение в пределах байкальского кластера занимают выборки с хр. Хамар-Дабан (юго-восточное побережье Байкала), что объясняется, скорее всего, более выраженной изоляцией этих популяций, а также, возможно, гибридизацией с сибирской кедровой сосной (см. гл. 8).
НГ ФЕ ПД ДН СН СИ ОХ ИН МА ДВ НИ АС МГ ШУ МР ДБ МЧ ГЧ ЧЕ СБ КУ НА Байкал - Хамар-Дабан Байкал Горы В. Сибири ЛЕ Сахалин Охотоморье Фактор Рис. 6. Ординация выборок Pinus pumila по результатам анализа главных компонент.
Сравнительный анализ внутривидовой генетической подразделённости и факторы дифференциации на ареалах кедровых сосен У всех изученных видов кедровых сосен внутривидовая генетическая подразделённость по аллозимным локусам не превышала 10%. При этом центральная часть ареалов, оптимальная для произрастания видов, характеризовалась слабой подразделенностью (P. sibirica), а при включении выборок с окраин ареала, из Фактор субоптимальных условий, возрастала до 7Ц10%. При произрастании в пределах стабильного ареала, расположенного на территории, лишь опосредованно затронутой плейстоценовыми оледенениями (P. koraiensis), кластеризация выборок может не соответствовать их происхождению. Очевидно, в данном случае превалирует локальный отбор в мозаичной среде, а не клины, связанные с расселением или широтными и долготными градиентами средовых факторов. В условиях фрагментации ареала (P. cembra) дифференциация несколько возрастает, но не настолько, чтобы соответствовать модели, при которой лишь мутации и дрейф в условиях изоляции ответственны за формирование генетической структуры.
Проведённый анализ показал, что выборки из популяций кедровых сосен по генетическим маркерам кластеризуются, как правило, в соответствии с их географическим положением, что не соответствует выводам некоторых авторов по тем же видам (например, P. pumila, P. sibirica), не обнаружившим на менее репрезентативном материале такой связи (Гончаренко и др., 1992а, б). Такая кластеризация в соответствии с географическим происхождением может отражать как процессы расселения из плейстоценовых рефугиумов, так и современный локальный движущий отбор. Очень важным популяционно-генетическим следствием этого является то, что, несмотря на относительно невысокую дифференциацию, популяции генетически не равны друг другу, и, следовательно, не взаимозаменяемы. Этот факт, в свою очередь, ведет к важным выводам о необходимости организации охраны генофондов каждой локальной группировки популяций в отдельности. Потеря какойлибо из них может оказаться невосполнимой. Аллозимы как маркеры, непосредственно вовлеченные в биохимические и физиологические процессы и в некоторой степени отражающие адаптацию локальных популяций и видов в целом, показали себя хорошими индикаторами именно таких различий, существенных для решения задач сохранения генофондов и селекции.
ГЛАВА 7. МЕЖВИДОВАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ И РОДСТВЕННЫЕ СВЯЗИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ПОДРОДА STROBUS С помощью 17 аллозимных локусов проведен анализ генетической дифференциации у 18 видов и подвидов мягких сосен. UPGMA- и NJ-кластеризация по матрице расстояний Нея с использованием в качестве внешней группы Pinus edulis и P.
bungeana, объединяемых в традиционных системах в секцию Parrya (Critchfield, Little, 1966, Price et al., 1998), и оценкой устойчивости топологии с помощью бутстрэпанализа. Наиболее сильно отличаются от остальных видов P. edulis и P. bungeana, однако, расстояние между ними также весьма значительное, что ставит под вопрос валидность секции Parrya. В то же время полученные данные подкрепляют точку зрения о монофилетичности секции Strobus. На UPGMA-дендрограмме обнаруживается кластер, соответствующий подсекции Cembrae (рис. 7), который, однако, не поддерживается значениями бутстрэп-анализа. При этом сестринской группой кедровым соснам является лишь часть видов подсекции Strobi. Кедровые сосны разделяются на две группы. Наиболее близки друг к другу sibirica и cembra (см. также гл. 6), с которыми вместе кластеризуется американская albicaulis. Вторую линию кедровых сосен, также поддерживаемую бутстрэпом, образуют дальневосточные виды, koraiensis и pumila. Азиатские виды подсекции Strobi разделяются на две группы: одну образуют тайваньский вид morrisonicola и подвид сосны Арманда armandii var.
mastersiana, другую - parviflora, wallichiana и континентальная разновидность armandii.
Американская lambertiana кластеризуется вместе с европейской peuce. Остальные американские виды Strobi образуют общий кластер, в котором поддерживается бутстрэпом лишь группа видов с тихоокеанского побережья: flexilisЦstrobiformisЦ monticola. Отличия топологии NJ-дендрограммы от UPGMA незначительны.
AL CE SI 96 KO PU AR PA WA LA PE 84 FL SF MO ST 1ARM MR BU ED 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,Генетическое расстояние Нея, DN Рис. 7. UPGMA-фенограмма сходства 18 видов сосен секций Strobus и Parrya по аллозимным локусам При многомерном анализе генетических связей внутри секции Strobus (рис. 8) виды подсекции Cembrae могут быть отделены прямой линией (в эту дифференциацию вносит вклад в основном первое измерение). Второе измерение можно интерпретировать как межконтинентальные различия независимо от подсекции, т.е. от признака раскрываемости шишек. Выявленная при кластерном анализе слабая поддержка монофилетичности кедровых сосен и видов Strobi в этом случае выглядит как более тесная связь между некоторыми видами из разных подсекций (pumilaЦ wallichiana и albicaulisЦамериканские Strobi), чем внутри подсекций.
Все рассмотренные данные, с одной стороны, ставят под сомнение монофилетичность данной группы, а с другой - заставляют искать объяснение сходства видов внутри континентов. Вероятным объяснением этих данных представляется то, что эволюция группы могла идти не только дивергентным путём, но и сетчатым. Так, промежуточное положение albicaulis трактовалось как ее более базальная позиция по отношению к остальным кедровым соснам (Gernandt et al., 2005), что помещало бы центр происхождения кедровых сосен в Северную Америку. Нам это представляется сомнительным.
1,SF FL MO 0,PE 0,6 LA С. Америка 0,ST AR 0,PA AL 0,MR -0,ARM WA -0,SI CE -0,Cembrae Strobi PU -0,Евразия -1,KO -1,-1,-1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,Измерение Рис. 8. Ординация видов сосен секции Strobus по результатам многомерного шкалирования матрицы генетических расстояний Нея. Разные маркеры обозначают виды сосен подсекций Cembrae (пустые) и Strobi (заполненные) и виды Strobi Европы (ромб), Азии (кружок) и С. Америки (треугольник).
Более вероятен сценарий, предусматривающий возникновение нескольких (как минимум, двух) линий кедровых сосен в Евразии. Линия, представленная из рецентных видов дальневосточными кедровыми соснами pumila и koraiensis, вероятно, более примитивная, что видно и из морфологии шишек этих видов, менее специализированных, чем у P. sibirica. Кроме того, аллозимные данные помещают эту пару ближе к центру 2D-плота, ближе к видам с крылатыми семенами - wallichiana и parviflora. Напротив, близкие между собой sibirica и cembra обособлены от других, к ним близка лишь американская albicaulis. Учитывая высокую скрещиваемость практически всех видов мягких сосен, можно предполагать, что albicaulis, близкая к настоящим кедровым соснам, могла стать донором генов бескрылости американским Strobi и реципиентом ряда аллозимных аллелей от американских сосен. Этим может объясняться ее промежуточное положение на плоте. В то же время бескрылость у восточноазиатских видов Strobi (armandii, parviflora) может иметь независимое происхождение, но может быть также результатом контактов и обмена генами с дальневосточной ветвью кедровых сосен. По крайней мере, для parviflora такие контакты с P. pumilа в Японии хорошо документированы с помощью хп- и мтДНКмаркеров (Senjo et al., 1999; Watano et al., 1995, 1996, 2004).
Измерение ГЛАВА 8. МЕЖВИДОВАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ КЕДРОВЫХ СОСЕН Как у сосновых и хвойных в целом, так и в пределах рода Pinus, наблюдаются множество случаев межвидовой гибридизации (Коропачинский, Милютин, 2005). Повидимому, это объясняется консерватизмом генома хвойных, в котором на протяжении миллионов лет сохраняется удивительно стабильная морфология хромосом и в целом однообразный порядок генов (Conkle, 1981), а также отсутствие специфических систем самостерильности.
Между мягкими соснами подсекций Cembrae и Strobi нет четких репродуктивных барьеров. Описаны случаи естественной и искусственной гибридизации как внутри подсекций, так и между соснами из разных подсекций (Critchfield, 1986).
Гибридизация Pinus sibirica и P. pumila в Прибайкалье В отличие от Pinus sibirica, в норме являющегося крупным деревом первого яруса, а в оптимальных условиях достигающим 35-40 м высотой, P. pumila обычно имеет специфическую чашевидную кустарниковую или стелющуюся жизненную форму, чрезвычайно редко демонстрируя габитус дерева. Впервые гипотезу о возникновении древовидного стланика в результате гибридизации P. pumila с P. sibirica высказал В.Н.
Сукачев (1928), позднее об этом писал Г.И. Галазий (1954). Эти авторы основывались на том факте, что древовидный стланик имеет некоторые черты сибирского кедра, а его распространение приурочено в основном к зоне симпатрии двух видов. В то же время Е.Г. Бобров (1961, 1972, 1974, 1975, 1978), признавая широкое распространение интрогрессии у древесных, в случае стланика и кедра отрицал это явление. В.Н.
Моложников (1975), всесторонне изучивший кедровый стланик в Прибайкалье, был сторонником гипотезы о гибридизации этих видов, а П.А. Хоментовский (1995), крупный специалист по стланику, работавший вне зоны симпатрии, на Камчатке, не поддерживал эту идею. Данная глава посвящена экспериментальному изучению этого вопроса с помощью изоферментного анализа. Ранее генетических данных, подтверждающих гибридизацию этих видов, получено не было.
Зона симпатрии охватывает северо-западное и восточное Прибайкалье, где проходит западная граница кедрового стланика, и простирается до восточной границы сосны кедровой сибирской в южной Якутии (Семечкин и др., 1985). Нами был получен образец семян с дерева промежуточной мофологии, обнаруженного в зоне симпатрии на территории Баргузинского биосферного государственного заповедника в смешанном насаждении P. sibirica и P. pumila. Было высказано предположение о его гибридном происхождении. Аллозимный анализ по 28 локусам показал, что образец имел многолокусный генотип, невозможный у представителей родительских видов. По некоторым локусам обнаружены аллели и генотипы, типичные для P. sibirica и невозможные или крайне маловероятные для P. pumila (AdhЦ1, FestЦ2 и LapЦ3), тогда как по другим локусам наблюдалась комбинация аллелей, невозможная для P. sibirica (Gdh, GotЦ2, GotЦ3, PgmЦ1 и PgmЦ2). Гетерозигота по диагностическому локусу SkdhЦ дает непосредственное доказательство того, что данный образец семян происходит от гибридного дерева P. sibirica x P. pumila. Наиболее вероятным является то, что данный индивидуум является гибридом первого поколения (F1), менее вероятно, но возможно появление такого генотипа в результате возвратных скрещиваний или как F2. Гибрид был фертилен. В 8 нормально развитых семенах мы исследовали генотипы зародышей семян, вычленяя в них принесенные пыльцой аллели. Анализ показал, что отцовские гаплотипы имели несколько источников происхождения. По крайней мере, три (~38%) зародыша содержали гаплотипы, представляющие собой комбинацию отцовских аллелей от двух разных родительских видов, и, соответственно, происходили или в результате самоопыления, или от какого-то другого гибрида. Два других зародыша с наибольшей вероятностью произошли от опыления пыльцой P. pumila. Отцовские гаплотипы остальных трёх зародышей могли произойти от пыльцы P. sibirica. В этих случаях, однако, самоопыление, хотя и менее вероятно, но не может быть исключено, поскольку число видоспецифичных аллелей P. sibirica невелико.
В ходе нашей экспедиции 1997 г. мы обследовали с целью выявления естественных гибридов ряд участков побережья Байкала в местах совместного произрастания P. sibirica и P. pumila. Особи промежуточного фенотипа выявлены в ряде точек: 1) хр. Хамар-Дабан, между пос. Слюдянка и пиком Черского; 2) побережье Байкала вблизи о.п. 5375 км, в 6 км к востоку от п. Солзан; 3) западное побережье перешейка п-ва Святой Нос, урочище Мягкая Карга; 4) побережье Байкала в окрестностях п. Давша (Баргузинский биосферный государственный заповедник.
Морфологически эти формы были разнообразны. Среди них были толстые древовидные сильно ветвистые кустарники на берегу Байкала (Давша, Солзан, Нижнеангарск), невысокие или средней высоты деревья сильно сбежистой формы на склонах хребтов (Гремячая, Пик Черского), короткие деревца в субальпийском поясе (Пик Черского).
Морфология шишек и размер семян у этих деревьев были промежуточными между исходными видами. Мы протестировали все собранные образцы, имевшие семена, с помощью электрофореза по описанному выше набору локусов и подтвердили их гибридное происхождение. При этом в насаждениях стланика среди зародышей свободноопыленных семян с типичных растений были обнаружены пыльцевые аллели сибирской кедровой сосны. В ряде исследованных районов процент таких зародышей был весьма значителен. Так, в смешанном насаждении вблизи поселка Давша, где автор собирал семена в 1997 г., повторные более тщательные сборы были проведены С.Н.
Горошкевичем в сентябре 2005 г. Электрофорез и обработка этого материала, проведенные нами совместно с Е.А. Петровой (ИМКЭС СО РАН) (Petrova et al., 2006) показал, что примерно 27% зародышей в семенах P. pumila содержали отцовские аллели P. sibirica, причем 8% гаплотипов в эффективном пуле пыльцы сочетали аллели, типичные для P. pumila и P. sibirica, и были классифицированы как происходящие от гибридных растений. Напротив, при анализе типичных деревьев P. sibirica среди зародышей не было обнаружено аллелей, специфичных для P. pumila, то есть интрогрессия была односторонней. Анализ зародышей семян из шишек, собранных на гибридах, выявленных в результате морфологического и аллозимного анализа, показал наличие разных доноров пыльцы: от обоих родительских видов и, вероятно, от гибридов, в т.ч. от их самоопыления. Таким образом, было показано, что в популяциях наблюдается интрогрессия, то есть наличие бэккроссов, а также гибридов F2.
Массовость явления гибридизации на локальном уровне и высотное распределение чистых видов и гибридов изучалось в юго-западном Прибайкалье, на склонах г. Пик Черского (хр. Хамар-Дабан). С помощью аллозимов было идентифицировано гибридов. Результаты соответствовали первоначальным диагнозам, сделанным С.Н.
Горошкевичем на основании морфологии и анатомии. Таким образом, с помощью аллозимного анализа показано, что в Прибайкалье существует зона ограниченной однонаправленной интрогрессии генов P. sibirica в популяции P. pumila.
Искусственные гибриды Pinus sibirica и P. koraiensis Опыты по искусственному опылению P. sibirica пыльцой P. koraiensis и смесью пыльцы P. sibirica и P. koraiensis были проведены М.И. Докучаевой в 1964 г. в Ивантеевском дендрарии (Московская обл.). С помощью изоферментов среди исследованных 80 предполагаемых гибридов нами было выявлено 4 гибридных дерева, в то время как остальные представляли собой P. sibirica. Гибридные деревья имели гетерозиготность в среднем более чем втрое выше, чем у P. sibirica (P<0,001), также более чем втрое опережали потомков внутривидовых скрещиваний по биомассе, и были устойчивы к насекомому-вредителю - хермесу, Pineus cembrae (сем. Adelgidae).
Два гибрида дают ежегодный урожай шишек. Полученные результаты могут быть использованы при интродукции кедровых сосен в условиях, не характерных для мест обитания этих видов, введения устойчивых и быстрорастущих гибридов в культуры, предназначенные для продукционных целей и для озеленения.
Полученные результаты вместе с данными мировой литературы позволяют говорить о важной роли межвидовой гибридизации в эволюции и адаптации у хвойных, в частности, о широком распространении сетчатой эволюции.
ГЛАВА 9. ГЕНОГЕОГРАФИЯ, КЛИНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ИНТРОГРЕССИВНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ ЕЛЕЙ КОМПЛЕКСА PICEA ABIES - P.
OBOVATA Ель европейская Picea abies (L.) Karst. и ель сибирская P. obovata Ledeb. являются важнейшими лесообразующими видами как горных лесов Западной Европы, так и темнохвойной тайги Европейской части России, Урала и Сибири, и благодаря этому морфологически изучены достаточно хорошо. Принято считать (см. напр., SchmidtVogt, 1974, 1977), что P. abies распространена в Европе от Пиренеев и Альп на западе до Скандинавии и Прибалтики на северо-востоке и Средней России на востоке, а P.
obovata - в Казахстане и Сибири, достигая охотоморского побережья. В Западной Европе ареал ели разорван на три части: Альпийскую, Герцинско-Карпатскую и Северо-Балтийскую (Rubner, 1960). На восток от т. н. "польского разрыва" ареал непрерывен фактически до побережья Охотского моря. Еще в начале XX в.
исследователи обнаружили, что формы ели, произрастающие на севере Скандинавии, севере Европейской части России и на Урале имеют признаки, промежуточные между европейской и сибирской елями (обзоры у: Правдин, 1975, Бобров, 1978; Попов, 2003;
Коропачинский, Милютин, 2005), появились гипотезы, что такие формы могут являться продуктом естественной гибридизации P. abies и P. obovata, долгое время не имевшие генетического подтверждения.
Для исследования наблюдаемой клинальной изменчивости с помощью аллозимных локусов нами были использованы выборки европейской и сибирской елей из Германии, Швеции, Финляндии, Польши, Белоруссии, Украины, Нечерноземья, Севера Европейской части России, Урала и Средней Сибири (Krutovskii, Bergmann, 1995; Политов, Крутовский, 1998). Наиболее высокая внутрипопуляционная изменчивость оказалась характерна для уральских популяций. К ним близки по изученным показателям выборки с Севера Европы, с Русской равнины и Севера Украины, несколько ниже генное разнообразие сибирских и казахстанских выборок.
Минимальные значения всех показателей характерны для популяций с территории Германии. Таким образом, в предполагаемой по морфологическим данным зоне интрогрессии выявлено максимальное внутрипопуляционное генетическое разнообразие. В среднем, оценки аллельного разнообразия (2,47), полиморфности (79,6%) и гетерозиготности (0,228) близки к верхнему пределу значений у хвойных (Hamrick, 1983).
Частоты 23 аллелей оказались скоррелированы с географической долготой, аллелей - с широтой (коэффициент ранговой корреляции Спирмэна достоверно отличался от нуля при P<0,05). Для анализа формы клин были отобраны аллели с высокими значениями FST, изменчивость которых носила клинальный характер на всей рассмотренной территории или на ее части. Предварительный анализ распределений показал, что в значительном числе случаев связь частот с координатами, и в первую очередь с долготой, носит нелинейный характер. Аллели были разбиты на группы по значениям их частот и по тому признаку, была ли квадратичная (т.е. нелинейная) функция регрессии монотонной или имела экстремум. Затем проверяли форму кривой регрессии, аппроксимируя распределение функцией наименьших квадратов). Для ряда локусов (в т.ч. G6pd-1, Got-3 и Aph-2) частоты аллелей монотонно изменялись в широком диапазоне с запада на восток, переходя через 0,5, так что разные аллели были наиболее частыми на краях распределения (рис. 9). В целом полученные результаты свидетельствуют скорее о далеко зашедшем процессе интрогрессии как главном факторе формирования наблюдаемых клин. Отбор в гетерогенной среде вдоль градуально изменяющихся экологических факторов может способствовать поддержанию данных клин, не допуская полного смешения форм. Большую группу составили аллели, долготные профили частот которых имели выраженный экстремум в центре гибридной зоны, т.е. на Урале или несколько к западу от него. При этом практически все высокочастотные аллели имели в середине зоны минимум частот, а низкочастотные - максимум. Возрастание общего числа изоферментных аллелей в зонах интрогрессии объясняется появлением новых вариантов в результате внутрицистронной гибридизации, т.н. УгибризимовФ, что предполагалось ранее и для ели (Krutovskii, Bergmann, 1995).
Долгота, гр. в.д.:Aph_90_96: r = 0,7415, p = 0,000 Долгота, гр. в.д.:Aph2_100: r = -0,7478, p = 0,0001, Долгота, гр. в.д.:Got3_70_: r = -0,7548, p = 0,0000 Долгота, гр. в.д.:Got3_100: r = 0,7665, p = 0,0000 Долгота, гр. в.д.:G6p1_89_: r = 0,9221, p = 0,00 Долгота, гр. в.д.:G6p1_100: r = -0,9275, p = 0,001,0,0,0,0, Aph2_90& Aph2_1 Got3_ Got3_10, G6p1_0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 G6p1_1Долгота, гр. в.д.
Рис. 9. Связь изменчивости частот аллелей ряда аллозимных локусов с географической долготой. Показаны профили частот в 26 выборках ели.
Исходные виды представляют собой сильно дифференцированные морфологически, экологически и генетически формы (на уровне, характерном для видов), что является следствием длительной изоляции в прошлом, а именно в разных, удаленных друг от друга и находившихся в разных условиях плейстоценовых рефугиумах. При этом соседние популяции или даже удаленные, но в пределах ареалов чистых видов, обычно демонстрируют слабую дифференциацию. Если же взять более широкий масштаб, наблюдаются географические клины по частотам изоферментных аллелей и ряду морфологических признаков, так что провести четкие границы распространения чистых и гибридных форм не представляется возможным. Таким образом, комплекс переходных форм между P. abies, P. obovata является проявлением клинальной изменчивости, обусловленной историей расселения, интрогрессивной гибридизацией и поддерживаемой естественным отбором. Площадь зоны интрогрессии на Урале и в Европе больше ареала чистой P. abies, ее границы размыты, а в Сибири остаются неизвестными.
ВЫВОДЫ 1. Разработаны новые подходы к оценке внутрипопуляционной, межпопуляционной и межвидовой изменчивости хвойных Северной Евразии, основанные на сравнительном популяционно-генетическом анализе комплекса родственных видов по единому набору генных локусов.
2. Аллозимные локусы у представителей семейства сосновых обнаруживают высокую изменчивость и эффективны для получения разнообразной информации о генетической структуре популяций. Описан генный контроль 17 изоферментных систем сосен подрода Strobus и 16 изоферментных систем у елей. Обнаружено генетическое сцепление между аллозимными локусами у кедровых сосен. Выявлены группы сцепления Pgi-2 - Adh-1 - Lap-3 и Fest-2 - Lap-2 и подтвержден факт консерватизма групп сцепления у сосновых.
3. Изученные виды хвойных сем. сосновых Северной Евразии (кедровые сосны и комплекс европейской и сибирской елей) характеризуются высоким уровнем аллельного и генного разнообразия и слабой дифференциацией на ареале.
4. Уровень генного разнообразия кедровых сосен уменьшается в ряду от широкораспространенных к узкоареальным видам: Pinus pumila > (P. sibirica, P.
koraiensis) > P. cembra. Кедровый стланик имеет высокое генетическое разнообразие, близкое к максимальным значениям, известным для хвойных и растений в целом, что связано с долговечностью и адаптацией этого вида к экстремальным для древесных условиям произрастания. Европейская кедровая сосна обладает сниженным уровнем полиморфизма вследствие инбридинга в небольших изолированных популяциях.
5. Анализ системы скрещивания и равновесия распределений генотипов у кедровых сосен показал, что дефицит гетерозигот среди зародышей обусловлен инбридингом вследствие самоопыления (у большинства видов 0Ц15%) и близкородственных скрещиваний. Частота самоопыления максимальна у P. cembra (около 30%), что связано с низкой плотностью и эффективной численностью популяций этого вида.
6. У хвойных при формировании зрелого насаждения из пула зародышей происходит элиминация менее приспособленных инбредных потомков, в результате чего в выборках взрослых растений распределения генотипов, как правило, близки к равновесным. В ряде случаев наблюдается слабый эксцесс гетерозигот, обусловленный балансирующим отбором.
7. Кластеризация и многомерный анализ популяций Pinus sibirica по аллозимным данным показал, что генетическая дифференциация выборок в целом соответствует их географическому происхождению и официально принятому лесосеменному районированию. Генетическая подразделенность незначительна лишь для зоны оптимума (горы Южной Сибири), более выражена в восточной части ареала и максимальна между северными и остальными выборками.
8. У Pinus cembra, несмотря на фрагментацию ареала, уровень генетической подразделенности был близок к наблюдаемому у P. sibirica. Проведенный впервые совместный анализ популяций этих двух видов показал, что внутривидовая дифференциация перекрывает межвидовую, которая значительно меньше, чем между остальными видами мягких сосен. Это указывает на недавнее (в голоцене) прекращение потока генов между этими номинативными видами и ставит вопрос об их возможной конспецифичности и необходимости таксономической ревизии.
9. У Pinus koraiensis, в отличие от остальных видов кедровых сосен, кластеризация выборок по аллозимным данным слабо отражает их географическую локализацию, что объясняется единообразием экологических условий на ареале, способствующим балансирующему отбору и отсутствием серьезных барьеров для миграции.
10. Генетическая дифференциация популяций кедрового стланика отражает историю расселения и современное распространение вида. Три кластера выборок P. pumila соответствуют их географическому происхождению: популяции Дальнего Востока, Байкальского региона и занимающие промежуточное положение между ними популяции зоны БАМ.
11. На основании полученных данных можно заключить, что популяции хвойных представляют собой не панмиктическую общность, а иерархическую структуру взаимосвязанных подразделенных популяций. Параметры этой структуры определяются эффективной численностью популяций, миграцией (включая ветроопыление и различные способы распространения семян), системой скрещивания, плейстоценовой и голоценовой историей, а также интрогрессивной гибридизацией.
12. Аллозимная дифференциация в пределах подрода Strobus рода Pinus свидетельствует о том, что кедровые сосны не являются монофилетической группой, сестринской соснам подсекции Strobi. Виды подсекции Strobi являются парафилетической группой.
13. Выявлены и генетически протестированы естественные и искусственные межвидовые гибриды кедровых сосен. В зоне симпатрии Pinus sibirica и P. pumila наблюдается межвидовая однонаправленная гибридизация через опыление материнских растений стланика пыльцой P. sibirica, в ряде районов носящая массовый характер и приводящая к интрогрессии. Гибридизация регулярно наблюдается между эволюционно близкими видами хвойных и играет важную роль в видообразовании (лсетчатая эволюция) и адаптации. На примере искусственных гибридов P. sibirica x P. koraiensis показана перспективность межвидовых гибридов для интродукции и селекции.
14. Клинальная изменчивость по аллозимным локусам в популяциях палеарктического комплекса видов елей Picea abies - P. obovata сформировалась в результате сочетания нескольких факторов: истории расселения из разных плейстоценовых рефугиумов, широкомасштабной интрогрессивной гибридизацией и поддержания дифференциации локальным отбором в градиенте факторов среды.
15. Разработанные подходы создают основы мониторинга генетической изменчивости хвойных, что необходимо для реализации практических задач сохранения лесного биоразнообразия, рационального использования лесных генетических ресурсов, генетической паспортизации и сертификации в лесном семеноводстве.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ РАБОТЫ Главы в коллективных монографиях.
1. Политов Д.В. Природные популяции - древесные растения // Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях. М.: Наука, 2004. С.
295-351.
2. Bruederle L.P., Rogers D.L., Krutovskii K.V., Politov D.V. Population genetics and evolutionary implications // Whitebark pine communities: Ecology and restoration.
Washington D.C., USA: Island Press, 2000. P. 137-153.
Статьи в рецензируемых журналах и сборниках.
3. Белоконь М.М., Политов Д.В., Белоконь Ю.С., Алтухов Ю.П. Генетическая изменчивость европейской кедровой сосны, P. cembra L.: аллозимный полиморфизм в горных популяциях Альп и Восточных Карпат // Генетика. 2005. Т. 41. № 11. С.
1538-1551.
4. Белоконь М.М., Политов Д.В., Белоконь Ю.С., Крутовский К.В., Малюченко О.П., Алтухов Ю.П. Генетическая дифференциация сосен секции Strobus: Данные изоферментного анализа // Доклады РАН. 1998. V. 358. № 5. P. 699-702.
5. Белоконь Ю.С., Политов Д.В., Белоконь М.М., Крутовский К.В. Наследование изоферментов сосны обыкновенной, Pinus sylvestris L. в Зауралье // Генетика. 1995.
Т. 31. № 11. С. 1521-1528.
6. Гончаренко Г.Г., Падутов В.Е., Крутовский К.В., Поджарова З.С., Киргизов Н.Ю., Политов Д.В. Уровень генетической изменчивости у Pinus sibirica на Алтае // Доклады академии наук СССР. 1988. Т. 299. № 1. С. 222-225.
7. Кравченко А.Н., Ларионова А.Я., Политов Д.В., Белоконь М.М., Белоконь Ю.С.
Генетическая изменчивость и дифференциация популяций ели сибирской в Западном Саяне // Вестник Томского университета. 2004. С. 38-40.
8. Крутовский К.В., Политов Д.В., Алтухов Ю.П. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour. Сообщение I. Механизмы генного контроля изоферментных систем // Генетика. 1987. Т. 23. № 12. С. 2216-2228.
9. Крутовский К.В., Политов Д.В., Алтухов Ю.П. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour. Сообщение II. Уровень аллозимного полиморфизма в природной популяции Западного Саяна // Генетика.
1988. Т. 24. № 1. С. 118-124.
10. Крутовский К.В., Политов Д.В., Алтухов Ю.П. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour. Сообщение IV. Генетическое разнообразие и степень генетической дифференциации между популяциями // Генетика. 1989. Т. 25. № 11. С. 2009-2032.
11. Крутовский К.В., Политов Д.В., Алтухов Ю.П. Межвидовая генетическая дифференциация кедровых сосен Евразии по изоферментным локусам // Генетика.
1990. Т. 26. № 4. С. 694-707.
12. Политов Д.В., Белоконь М.М., Белоконь Ю.С. Динамика аллозимной гетерозиготности в дальневосточных популяциях кедрового стланика Pinus pumila (Pall.) Regel: сравнение зародышей и материнских растений // Генетика. 2006. Т. 42.
№ 10. С. 1348-1358.
13. Политов Д.В., Крутовский К.В. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour. Сообщение V. Анализ системы скрещивания // Генетика. 1990. Т. 26. № 11. С. 1309-1316.
14. Политов Д.В., Крутовский К.В., Алтухов Ю.П. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour. Сообщение III. Сцепление изоферментных локусов // Генетика. 1989. Т. 25. № 9. С. 1606-1618.
15. Политов Д.В., Крутовский К.В., Алтухов Ю.П. Характеристика генофондов популяций кедровых сосен по совокупности изоферментных локусов // Генетика.
1992. Т. 28. № 1. С. 93-114.
16. Chumachenko S.I., Korotkov V.N., Palenova M.M., Politov D.V. Simulation dynamics of long-term stand dynamics at different scenarios of forest management for coniferous - broad-leaved forests // Ecological Modelling. 2003. V. 170. № 2-3. P. 345-361.
17. Iroshnikov A.I., Politov D.V. Five-needle pines in Russia and neighboring countries // Five-needle pine species: genetic improvement, disease resistance, and conservation.
IUFRO Working Party 2.02.15. Proceedings RMRS-P-32 (July 24-25, 2001, Medford, OR). Fort Collins, Colorado, USA: U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Rocky Mountain Research Station, 2004. P. 64-72.
18. Krutovskii K.V., Politov D.V. Allozyme evidence for polyzygotic polyembryony in Siberian stone pine (Pinus sibirica Du Tour) // Theoretical and Applied Genetics. 1995. V.
90. № 6. P. 811-818.
19. Krutovskii K.V., Politov D.V., Altukhov Y.P. Study of genetic differentiation and phylogeny of stone pine species using isozyme loci // Proceedings - International workshop on subalpine stone pines and their environment: The status of our knowledge.
(Ed. by W. C. Schmidt and F.-K. Holtmeier). Ogden, Utah: USDA Forest Service Intermountain Research Station, 1994. P. 19-30.
20. Krutovskii K.V., Politov D.V., Altukhov Y.P. Isozyme study of population genetic structure, mating system and phylogenetic relationships of the five stone pine species (subsection Cembrae, section Strobi, subgenus Strobus) // Population genetics and genetic conservation of forest trees. Papers presented at an international symposium organized by IUFRO, held 24-28 August 1992 at Carcans-Maubuisson, France. Amsterdam, Netherlands: SPB Academic Publishing, 1995. P. 279-304.
21. Palenova M.M., Korotkov V.N., Chumachenko S.I., Politov D.V. The use of simulation model FORRUS-S in the ecological management in forestry: strategic and tactic planning // Scientia Forestalis. 2007. № 73. P. 73-90.
22. Politov D.V., Belokon M.M., Maluchenko O.P., Belokon Y.S., Molozhnikov V.N., Mejnartowicz L.E., Krutovskii K.V. Genetic evidence of natural hybridization between Siberian stone pine, Pinus sibirica Du Tour, and dwarf Siberian pine, P. pumila (Pall.) Regel // Forest Genetics. 1999. V. 6. № 1. P. 41-48.
23. Politov D.V., Krutovskii K.V. Allozyme polymorphism, heterozygosity, and mating system of stone pines (Pinus, subsection Cembrae) // Proceedings - International workshop on subalpine stone pines and their environment: The status of our knowledge. (Ed. by W.
C. Schmidt and F.-K. Holtmeier). Ogden, Utah: USDA Forest Service Intermountain Research Station, 1994. P. 36-42.
24. Politov D.V., Krutovskii K.V. Phylogenetics, genogeography and hybridization of 5needle pines in Russia and neighboring countries // Five-needle pine species: genetic improvement, disease resistance, and conservation. IUFRO Working Party 2.02.15.
Proceedings RMRS-P-32 (July 24-25, 2001, Medford, OR). Fort Collins, Colorado, USA:
U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Rocky Mountain Research Station, 2004.
P. 85-97.
25. Политов Д.В., Пирко Н.Н., Пирко Я.В., Мудрик Е.А., Белоконь М.М., Коршиков И.И. Система скрещивания и возрастная динамика уровней инбридинга в популяциях Pinus cembra L. Украинских Карпат // Науков записки Тернопльського нацонального педагогчного унверситету м. Володимира Гнатюка. Серя: Бологя.
Ц 2007. - №3 (33). - С. 80Ц85.
Статьи в сборниках.
26. Алтухов Ю.П., Крутовский К.В., Духарев В.А., Ларионова А.Я., Политов Д.В., Рябоконь С. М. Биохимическая популяционная генетика лесных древесных видов // Лесная генетика, селекция и физиология древесных растений. М.: Госкомлес СССР, 1989. С. 21-29.
27. Ильинов А.А., Политов Д.В., Раевский Б.В., Белоконь М.М. Генетическая структура малонарушенных популяций ели финской Picea x fennica (Regel) Kom. // Проблемы лесоведения и лесоводства. Гомель: Институт леса 2005. С. 147-149.
28. Ильинов А.А., Политов Д.В., Раевский Б.В., Белоконь М.М. Особенности генетической структуры коренных ельников северо-запада таежной зоны России (на примере НП Водлозерский) // Водлозерские чтения: Естественно-научные и гуманитарные основы природоохранной и просветительской деятельности на охраняемых территориях Русского Севера. Петрозаводск: 2006. С. 93-96.
29. Крутовский К.В., Политов Д.В. Изучение меж- и внутривидовой дифференциации кедровых сосен Евразии с использованием изоферментных локусов и многомерного анализа // Молекулярные механизмы генетических процессов. Москва: Наука, 1992.
С. 87-96.
30. Ларионова А.Я., Экарт А.К., Кравченко А.Н., Яхнева Н.В., Политов Д.В., Белоконь М.М., Белоконь Ю.С. Генетическое разнообразие хвойных в Сибири // Структурнофункциональная организация и динамика лесов. Красноярск: 2004. С. 53-55.
31. Малюченко О.П., Политов Д.В., Белоконь Ю.С., Белоконь М.М. Генетическая дифференциация кедрового стланика Pinus pumila (Pall.) Regel в Прибайкалье // Жизнь популяций в гетерогенной среде. Часть 2. Йошкар-Ола: Периодика Марий Эл, 1998. Т. 2. С. 38-45.
32. Мудрик О.А., Привалхн С.М., Прко Н.М., Полтов Д.В. Генетична мнливсть материнських дерев та зародкв х насння у рзновисотних популяцях Picea abies (L.) Karst. в Укранських Карпатах // Промышленная ботаника. - 2006. - Вып. 6. - С.
187Ц192.
33. Петрова Е.А., Горошкевич С.Н., Политов Д.В., Белоконь М.М., Белоконь Ю.С.
Эколого-географическая дифференциация популяций сосны кедровой сибирской // Проблемы лесоведения и лесоводства. Гомель: Институт леса 2005. С. 176-178.
34. Политов Д.В., Крутовский К.В. Клинальная изменчивость и интрогрессивная гибридизация в популяциях европейской и сибирской елей // Жизнь популяций в гетерогенной среде. Йошкар-Ола: Периодика Марий Эл, 1998. P. 78-89.
Тезисы докладов на конференциях:
35. Белоконь М.М., Политов Д.В. Оценка генетического разнообразия в популяциях корейской кедровой сосны (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.) // 1-ая молодежная школаконференция "Сохранение биоразнообразия природных ресурсов" (27-30 сентября, 2000). Москва: ФГП "Интеграция", МГУ и РАН, 2000. С. 13.
36. Белоконь Ю.С., Политов Д.В., Белоконь М.М., Крутовский К.В. Генетическая дифференциация болотной и суходольной популяций сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) // Жизнь популяций в гетерогенной среде. Часть 2. Йошкар-Ола:
Периодика Марий Эл, 1998. С. 23-24.
37. Белоконь Ю.С., Белоконь М.М., Голиков А.М., Политов Д.В. Сравнительный анализ генетической структуры сосняков Псковской области // Генетика в XXI веке:
Современное состояние и перспективы развития. Москва: 2004. С. 192.
38. Белоконь М.М., Политов Д.В., Белоконь Ю.С. Геногеография сосны кедровой корейской (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.) и ее отношения с близкими видами сосен // Наука о лесе: история, современное состояние и перспективы развития. Гомель:
Институт леса, 2005. С. 195.
39. Крутовский К.В., Политов Д.В. Аллозимный полиморфизм в природной популяции сосны сибирской Pinus sibirica Du Tour // Проблемы прикладной и популяционной генетики. М.: 1987. С. 142.
40. Малюченко О.П., Белоконь Ю.С., Белоконь М.М., Политов Д.В. Генетические особенности береговых и горных популяций кедрового стланика в Прибайкалье // Разнообразие растительного покрова Байкальского региона. Материалы международной конференции (7 - 10 сентября 1999 г.). Улан-Удэ: Изд-во Бурятского госуниверситета, 1999. С. 45-46.
41. Малюченко О.П., Белоконь Ю.С., Белоконь М.М., Политов Д.В. Параметры системы скрещивания межвидового гибрида Pinus sibirica x Pinus pumila по данным изоферментного анализа // Научная генетическая конференция МСХА. М.: МСХА, 2002. С. 224-225.
42. Малюченко О.П., Политов Д.В., Белоконь Ю.С. Аллозимная гетерозиготность и инбридинг в популяциях кедрового стланика // Научная конференция молодых ученых Ломоносов. Москва: Московский государственный университет, 1996.
43. Политов Д.В. Генетика популяций кедровых сосен // Проблемы лесоведения и лесоводства. Гомель: Институт леса, 2005. С. 178-179.
44. Политов Д.В., Белоконь М.М., Белоконь Ю.С., Крутовский К.В., Алтухов Ю.П.
Генетика популяций кедровых сосен // Генетика в России и в мире. Материалы международной конференции. Москва: Институт общей генетики РАН, 2006. С. 156.
45. Политов Д.В., Белоконь М.М., Малюченко О.П., Белоконь Ю.С., Крутовский К.В.
Генетические доказательства естественной гибридизации между сибирской кедровой сосной Pinus sibirica и кедровым стлаником Pinus pumila (Pinaceae) // Проблемы ботаники на рубеже XX - XXI веков. Тезисы докладов представленных II (X) съезду Русского ботанического общества, 26 - 29 мая 1998 г. Санкт-Петербург:
1998. Т. 2. С. 180.
46. Politov D.V. Population genetic structure dynamics in forest tree species with continuous and fragmented types of species ranges // Transformation to Continuous Cover Forestry in a Changing Environment, EFI conference. Bangor, Wales: European Forest Institute, 2004.
P. 73.
47. Politov D.V., Palenova М.М., Korotkov V.N., Belyaeva T.V., Chumachenko S.I.
Genecological database of Norway spruce in population genetic studies and ecomodelling // IUFRO Conference "Monitoring and Indicators of Forest Biodiversity in Europe - from Ideas to Operationality", 12 - 15 November 2003, Florence, Italy. 2003. P. 45.
48. Belokon M.M., Politov D.V., Belokon Yu.S. Contrasting patterns of spatial genetic differentiation in two East Asian five-needle pine species, Pinus koraiensis and P.
armandii // IUFRO Working Party 2.02.15 The Breeding and Genetic Resources of FiveNeedle Pines Conference, Vliug, Romania, Sept. 19-23, 2006. P. 6-7.
49. Politov D.V., Belokon M.M., Belokon Yu.S. Allozyme variation in Swiss stone pine, Pinus cembra L. and Siberian stone pine, P. sibirica Du Tour: differentiation between populations and species // IUFRO Working Party 2.02.15 The Breeding and Genetic Resources of Five-Needle Pines Conference, Vliug, Romania, Sept. 19-23, 2006. P. 1011.
50. Petrova E.A., Goroshkevich S.N., Politov D.V., Belokon M.M., Belokon Yu.S. Genetic Structure and Mating System of Pure Species and Hybrids in the Hybrid Zone Between Pinus sibirica Du Tour and Pinus pumila (Pall.) Regel // IUFRO Working Party 2.02.The Breeding and Genetic Resources of Five-Needle Pines Conference, Vliug, Romania, Sept. 19-23, 2006. P. 7-8.
Методические пособия.
51. Политов Д.В., Салменкова Е.А., Глазер В.М. Метод электрофоретического анализа изоферментных систем: изучение генетического полиморфизма белков в популяциях. Методическое пособие к Большому практикуму по генетике на кафедре генетики и селекции Биологического факультета МГУ. М.: Диалог-МГУ, 2000. 22 с.
52. Сулимова Г.Е., Салменкова Е.А., Политов Д.В., Зинченко В.В., Глазер В.М.
Практикум по полиморфизму ДНК и белков. Методическое руководство. М.: Ойкос, 2002. 80 с.