Geum.ru
   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

МОКРОУСОВ

Игорь Владиславович

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ЭВОЛЮЦИЯ

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:                

доктор медицинских наук, профессор        Вишневский Борис Израилевич

Официальные оппоненты:                

доктор биологических наук, профессор        Заикина Надежда Александровна

доктор медицинских наук, профессор        Бойцов Алексей Геннадьевич

доктор биологических наук                        Дмитриев Александр Валентинович

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации

Защита состоится л________________ 2009 года в _____ часов на заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН.

Автореферат разослан л___________________________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук                                                        Бурова Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время, туберкулез (ТБ), эпидемически  распространенный во многих регионах мира, относят к вновь вернувшимся заболеваниям. По оценке ВОЗ, треть населения Земли инфицирована Mycobacterium tuberculosis; общее количество заболевших и умерших от туберкулеза в 2006 г. составило 9,2 млн и 1,7 млн человек, соответственно (WHO, 2008). M. tuberculosis может адаптироваться к воздействию факторов иммунного ответа организма хозяина и селективному давлению антибиотиков посредством точечных мутаций. Последнее десятилетие прошлого века было отмечено появлением и началом широкого распространения лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя туберкулеза во многих странах мира, включая Россию.

Применение методов сполиготипирования, IS6110-RFLP- и MIRU-VNTR-анализа для эпидемиологического типирования штаммов M. tuberculosis позволило определить семейства родственных штаммов и создать компьютерные базы данных, содержащие информацию о генотипических профилях штаммов (Brudey et al., 2006). Наличие доступных, обновляющихся и представительных баз данных имеет также исключительное значение и для разработки стандартизованной терминологии для обозначения циркулирующих вариантов (генотипов) возбудителя туберкулеза.

Среди генетических линий/семейств, выделяемых внутри вида M. tuberculosis, генотип Beijing характеризуется в целом генетической однородностью и широким географическим распространением (Bifani et al., 2002; Glynn et al., 2002), что может свидетельствовать о его недавней глобальной диссеминации. В настоящее время, этот генотип привлекает внимание и с клинической точки зрения, поскольку штаммы Beijing демонстрируют повышенную вирулентность (Вишневский и др., 2003; Lopez et al., 2003), ассоциацию с лекарственной устойчивостью (Нарвская, 2003) и высокую трансмиссивность (Caminero et al., 2001; Narvskaya et al., 2002). Клональная популяционная структура и однонаправленность эволюции M. tuberculosis как вида в целом делают возможным частный анализ его отдельных филогенетических линий как редуцированной модели вида.

В этой связи, изучение особенностей генетического разнообразия и эволюционного процесса M. tuberculosis генотипа Beijing, генетических механизмов развития лекарственной устойчивости M. tuberculosis и поиск новых информативных маркеров для молекулярной эпидемиологии туберкулеза, является чрезвычайно актуальным и своевременным.

Цель исследования: Изучить микро- и макроэволюционные изменения в геноме и разработать методологические подходы для мониторинга циркулирующих штаммов M. tuberculosis.

Задачи работы:

1. Провести анализ филогенетически значимых фрагментов генома M. tuberculosis генотипа Beijing.

2. Осуществить филогеографический анализ, провести реконструкцию происхождения и путей распространения циркулирующих вариантов M. tuberculosis генотипа Beijing

3. Изучить генетические основы развития лекарственной устойчивости как формы микроэволюции M. tuberculosis.

4. Разработать методологические подходы на основе информативных молекулярных маркеров для эффективного мониторинга и диагностики лекарственной устойчивости циркулирующих штаммов M. tuberculosis.

Научная новизна

Впервые в мире проведена компьютерная реконструкция происхождения и исторических путей глобальной диссеминации штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing.

Разработана концепция существования древних и современных линий генотипа Beijing.

Впервые на основе компьютерного моделирования эволюции локусов VNTR показан ускоренный характер роста субпопуляции клонального варианта В0/Beijing в России.

Предложена переоценка роли мутаций в embB306 как маркера устойчивости к этамбутолу. Выдвинута гипотеза о дополнительном механизме устойчивости к этамбутолу M. tuberculosis, не связанном с изменениями в гене арбинозилтрансферазы embB.

Практическая значимость исследования

Созданная и обновляемая глобальная база данных по 11 локусам VNTR штаммов M. tuberculosis Beijing (1853 штамма на 30.06.2009) эффективно применяется для филогенетических исследований и эпидемиологического мониторинга циркуляции штаммов этого генотипа.

Разработан способ быстрой детекции штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing, его основных филогенетических линий и клонального варианта В0/Beijing на основе использования инвертированной IS6110-ПЦР и VNTR типирования.

Разработана минимальная схема на основе семи локусов VNTR для первичного скринингового типирования штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing, циркулирующих в России.

Показана высокая информативность сочетанного применения методов IS6110-RFLP и VNTR типирования для дифференциации штаммов M. tuberculosis при эпидемиологических исследованиях.

Предложен способ определения генетического расстояния между географическими популяциями клональных видов бактерий.

Разработан способ экспрессного определения основных мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину и изониазиду, в генах rpoB (кодоны 516, 526, 531) и katG315 на основе методологии мультиплексной аллель-специфической ПЦР.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Генетическое разнообразие M. tuberculosis сформировалось в результате миграций населения. Генотип Beijing M. tuberculosis возник на территории северного Китая более 2000 лет назад; его проникновение в другие регионы мира было опосредовано миграциями из Юго-Восточной Азии.

2. Генотип Beijing M. tuberculosis включает две крупные филогенетические линии - древнюю и современную - с различной структурой генома и эволюционным потенциалом. Быстрая детекция этих линий возможна на основе инвертированной IS6110-ПЦР.

3. Вариант Beijing/В0, выявляемый в 25% российских штаммов генотипа Beijing, является луспешным вариантом, для которого характерен существенно более быстрый популяционный рост в сравнении с общей популяцией Beijing в России.

4. Первичное скрининговое типирование штаммов Beijing в России возможно на основе анализа семи локусов VNTR. Использование методов IS6110-RFLP и VNTR необходимо для детального генотипирования M. tuberculosis.

5. Разработанный метод мультиплексной аллель-специфической ПЦР для анализа основных мутаций резистентности в генах rpoB и katG эффективен для выявления большинства штаммов M. tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду. Наличие мутации в embB306 недостаточно для развития устойчивости M. tuberculosis к этамбутолу.

Апробация  работы

Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на российских и международных семинарах, конгрессах и конференциях в 2001-2009 гг.: 3rd International Conference УInfectious diseases in the Barents regionФ (Архангельск, Россия, 09.2001); Meeting of IAEA Multicenter Project (Дели, Индия, 03.2001); Meeting of Mycobacteria and Tuberculosis Study Group of Pasteur Institutes (Алжир, Алжир, 02.2001); International Conference УTuberculosis: old problem in new millenniumФ (Новосибирск, Россия, 07.2002); 4th Nordic Baltic Congress on Infectious Diseases (С.-Петербург, Россия, 05.2002); 12th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Милан, Италия, 04.2002); 4th International Conference УInfectious diseases in the Barents regionФ (Петрозаводск, Россия, 2003); 24th Congress of European Society of Mycobacteriology (Тарту, Эстония, 07.2003); Annual Scientific Symposium of the International Network of Pasteur Institutes (Тегеран, Иран, 17-19.11.2004); 10th International Workshop on virus evolution and molecular epidemiology (Хельсинки, Финляндия, 30.08.-05.09.2004); 25th Congress of European Society of Mycobacteriology (Альгеро, Италия, 27-30.06.2004); Meeting of Mycobacteria and Tuberculosis Study Group of Pasteur Institutes (Париж, Франция, 16-18.02.2004); VI Всероссийский конгресс по молекулярной диагностике (Москва, 28-30.11.2007). 30th Congress of European Society of Mycobacteriology (Порту, Португалия, 5-8.07.2009).

По теме диссертации опубликовано 54 статьи в рекомендованных ВАК РФ журналах и 5 глав в трех монографиях.

Внедрение результатов исследования в практику

На основе результатов работы подготовлены следующие документы:

1. Патент на изобретение №2287586 (Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Нарвская О.В., Вишневский Б.И., Способ экспрессного определения устойчивости к рифампицину у микобактерий туберкулеза). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20.11.2006. Приоритет: 27.05.2003.

2. Патент на изобретение №2339040 (Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Нарвская О.В., Вишневский Б.И., Способ экспрессного определения устойчивости к изониазиду у микобактерий туберкулеза). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20.11.2008. Приоритет: 08.02.2006.

3. Заявка на патент (Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Вязовая А.А., Вишневский Б.И., Нарвская О.В. Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа Beijing). Рег. №2008118836, приоритет от 12.05.2008

Результаты исследований внедрены в практическую деятельность ФГУ Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии Росмедтехнологий.

ичное участие автора в получении результатов

Основные результаты получены лично автором. Выделение штаммов и определение их чувствительности к противотуберкулезным препаратам было проведено в ФГУ Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи в лаборатории микробиологии туберкулеза при участии д.м.н. профессора Б.И. Вишневского, д.м.н. Т.Ф. Оттен и к.б.н. О.А. Маничевой. Молекулярно-генетические исследования, компьютерный и статистический анализ данных были проведены автором в лаборатории молекулярной микробиологии ФГУН Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 228 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, 3 главы результатов собственных исследований, обсуждение результатов), выводов и приложения. Иллюстративный материал включает 14 таблиц и 48 рисунков. Список литературы содержит 349 наименований, из них 31 отечественный и 318 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе были использованы препараты ДНК штаммов M. tuberculosis, выделенных в лаборатории микробиологии туберкулеза Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии в основном от постоянных жителей Северо-Запада РФ. В исследование были также включены ДНК штаммов M. tuberculosis, выделенных в Китае (n=122 [Пульмонологическая больница Пекина]), Вьетнаме (n=117 [Национальный институт гигиены и эпидемиологии, Ханой]), Болгарии (n=133 [Институт микробиологии БАН, София]), Белоруссии (n=165 [Витебский государственный медицинский университет]), Казахстане (n=144 [Национальный медицинский университет им. Асфендиярова, Алматы]), и Киргизии (n=56 [Институт молекулярной генетики и медицины, Бишкек]). Все штаммы, включенные в исследование, были выделены от взрослых (возраст более 15 лет), эпидемиологически несвязанных больных туберкулезом легких.

Определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам проводили методом абсолютных концентраций согласно приказу Минздрава РФ № 109 от 21 марта 2003 г.

Определение мутаций устойчивости к ПТП проводили с использованием методов мультиплексной аллель-специфической ПЦР (МАС-ПЦР (гены rpoB [кодоны 516, 526, 531], katG315, embB306) и ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктаз MspI (katG315)  и NlaIII / HaeIII (embB306) (Табл. 1)

Таблица 1. Последовательности праймеров, сконструированных в данной работе и

использованных для анализа генов резистентности.

Ген

Праймер, зонд

Последовательность (5Т-)

katG

katG1F

AGCTCGTATGGCACCGGAAC

katG4RB

AACGGGTCCGGGATGGTG

katg0F

GCAGATGGGGCTGATCTACG

katg4R

AACGGGTCCGGGATGGTG

katg5R

ATACGACCTCGATGCCGC

rpoB

ROF

GTCGCCGCGATCAAGGA

RIR

TGACCCGCGCGTACAC

R516B

GCTGAGCCAATTCATGGA

R526B

GTCGGGGTTGACCCA

R531B

ACAAGCGCCGACTGTC

embB

EmbF

ATTCGGCTTCCTGCTCTGG

EmbR

GAACCAGCGGAAATAGTTGG

Emb1F

GGGCGGGGCTCAATTGCC

Emb2R

GCGCATCCACAGACTGGCGTC

Emb306A

GACGACGGCTACATCCTGGGCA

Emb306B

GGTCGGCGACTCGGGCC

Геномная дактилоскопия штаммов M. tuberculosis.

Сполиготипирование было использовано для анализа полиморфизма DR-локуса (наличие или отсутствие 43 спейсеров) по Kamerbeek et al. (1997). Профили сполиготипирования сравнивали с международной базой сполиготипов SpolDB4 (Brudey et al., 2006).

Анализ дополнительных 25 спейсеров локуса DR проводили по Sebban et al. (2002). Для право-левого сполиготипирования (left-right (L-R) spoligotyping (Filliol et al., 2000)) использовали праймеры Ris1, Ris2 и DRa. Продукты ПЦР гибридизовали по стандартной технологии сполиготипирования  с мембранами, содержащими 43 и 25 спейсерные пробы. Это позволило выявить специфические участки в DR локусе (повторы или спейсеры), содержащие элемент IS6110 и определить его положение относительно локуса DR.

IS6110-RFLP-типирование проводили по van Embden et al. (1993). Профили обрабатывали пакетами GelCompar 4.1 (Applied Maths, Бельгия) и Taxotron (Grimont, 2003) для построения дендрограмм по алгоритму UPGMA.

Анализ 27 локусов VNTR - 24 локусов Supply et al. (2006) и 3 гипервариабельных локусов Iwamoto et al. (2007) - проводили, как описано ранее. Пакеты PAUP 4.0 (Swofford, 2003) и PHYLIP 3.6 (Felsenstein, 2004) были использованы для построения наиболее парсимонной дендрограммы и минимально охватывающего дерева, соответственно; при этом аллели локусов VNTR рассматривали как дискретные переменные. Подход на основе статистики Байеса был использован для датировки времени коалесценции аллелей VNTR как описано ранее (Wirth et al., 2008) с использованием программ MSVAR (Baumont, 1999) и Tracer 1.4.1 (Rambaut, Drummond, 2008). Анализ каждой популяции включал проведение 5 независимых симуляций Монте-Карло на основе 20000 шагов цепи Маркова.

Инвертированную IS6110-ПЦР проводили с использованием праймеров Ris1 и Ris2 (Ross, Dwyer, 1993), расположенных на 3Т- и 5Т-концах элемента IS6110 и амплифицирующих фрагменты между близкорасположенными (до 2 тпн) копиями IS6110.

Для рестрикционного анализа элемента IS1547 и возможных инсерций в нем IS6110 проводили ПЦР с различными комбинациями праймеров на последовательности IS6110 и IS1547. Для рестрикционного анализа продуктов ПЦР и картирования их сайтов узнавания использовали рестриктазы AluI, RsaI, PvuII, PstI и MboII.

Гибридизационный анализ по Саузерну профилей IS1547-RFLP был проведен с использованием фрагмента длиной 1,32 тпн, включающего весь элемент IS1547, и системы ECL для мечения и детекции нуклеиновых кислот (Amersham Pharmacia Biotech) с использованием тех же блотов, содержащих тотальную ДНК, обработанную PvuII, и использовавшихся для анализа IS6110-RFLP.

ПЦР-анализ длины гена Rv3135 и наличия и количества инсерций IS6110 в локусе NTF проводили как описано ранее (Musser et al., 2000, Vera-Cabrera et al., 2001, Plikaytis et al., 1994).

Сбор данных по VNTR локусам и создание глобальной базы данных VNTR штаммов Beijing. Поиск опубликованных данных по 11 локусам MIRU-VNTR ## 2, 4, 10, 16, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40 (Supply et al., 2001) штаммов Beijing выявил 1302 штамма1, включая и штаммы генотипированные в нашей лаборатории. Профили из 11 цифр (соответствующих 11 локусам MIRU-VNTR) были внесены в файл Excel и, после автоматической сортировки, штаммы были разделены на типы с уникальными профилями. Популяции и суб-популяции, включенные в анализ, представляли Россию, Китай, Сингапур, Вьетнам, Японию, Бангладеш, Южную Африку и Австралию.

Индекс Хантера-Гастона (Hunter-Gaston Index, HGI) был использован для оценки генетического разнообразия (Hunter, Gaston, 1988). Тест 2x2 2 был использован для оценки значимых различий между двумя группами штаммов; значения 2 с корректировкой по Ятсу, p и соотношение шансов OR рассчитывали с 95% доверительным интервалом с помощью программы EpiCalc 2000 1.02 (Gilman, Myatt, 1998).

Расчет наблюдаемого расстояния OD (observed distance) между географическими популяциями проводили по предложенной нами фоомуле:

,

где N есть общее число вариантов (типов), выявляемых в объединенной коллекции популяций А и B, Ai и Bi - частоты i-того типа в этих популяциях. Полученную матрицу генетических расстояний между географическими популяциями M. tuberculosis Beijing, рассчитанную на основании частот встречаемости их VNTR-типов, применили для многомерного масштабирования с использованием программы  PROXSCAL пакета SPSS 11.5 для Windows (SPSS, Чикаго, США).

Поиск информации об исторических связях между странами и регионами, включенными в данное исследование, проводили с использованием Интернет-ресурсов и поисковых систем Google ( Entrez Pubmed ( и History Cooperative (

operative.org/).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

АНАЛИЗ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ IS- И PPE-ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Более 1130 штаммов M. tuberculosis, выделенных в Санкт-Петербургском НИИ фтизиопульмунологии, было изучено методами IS6110-RFLP и сполиготипирования в лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ имени Пастера в 1996-2007 гг. Эта коллекция ДНК (профилей генотипирования) послужила для формирования выборок, соответствующих задачам исследования.

Около половины (52%) всех изученных штаммов принадлежали к генетическому семейству Beijing и имели характерный профиль сполиготипирования из девяти (с 35 по 43) сигналов гибридизации (Рис. 1). Профили IS6110-RFLP большинства (~95%) из этих штаммов имели от 14 до 19 фрагментов и были близкородственны (более 85% сходства). Визуально эти профили были сходны с опубликованными профилями штаммов Beijing из Восточной Азии и других регионов мира (Bifani et al., 2002). Мы определили эти штаммы как типичные штаммы Beijing (Рис. 1). Пять процентов штаммов имели сполиготип, характерный для семейства Beijing, но профили IS6110-RFLP с меньшим количеством фрагментов, и сходные только на 60-70% (Рис. 1). Мы определили эти штаммы как латипичные штаммы Beijing. В дальнейшее углубленное исследование были включены 4 атипичных (2 основных профиля) и 24 типичных (12 разнообразных профилей) штамма Beijing.

Рис. 1. Дендрограмма профилей IS6110-RFLP M. tuberculosis и примеры сполигопрофилей Beijing, H37Rv и BCG.

Для получения целостного представления о структуре локуса DR штаммов, помимо стандартного набора из 43 спейсеров, мы провели анализ 25 новых спейсеров (van Embden et al., 2000), который выявил  наличие 6 новых спейсеров (№№ 48, 49, 50, 66, 67, 68) у всех штаммов Beijing (Рис. 2). Применение право-левого сполиготипирования выявило upstream-расположенную инвертированную копию элемента IS6110 у всех штаммов (Рис. 2). Не исключено, что присутствие этой копии IS6110 может быть связано с рекомбинационными событиями, приведшими к делетированию большинства спейсеров в локусе DR генотипа Beijing.

Рис. 2. Структура локуса DR большинства штаммов Beijing.

Для оценки родства репрезентативных штаммов семейства Beijing был проведен филогенетический анализ на основе сравнения их профилей гибридизации IS6110-RFLP. Профили были визуально сравнены и переведены в бинарный формат для расчета матрицы расстояний и ее анализа. Применение алгоритмов Neighbor-Joining (NJ) (Рис. 3) и максимального правдоподобия (Quartet-Puzzling) дало сходные результаты и показало, что оба атипичных профиля имели наибольшую длину ветвей.

Рис. 3. Дендрограмма репрезентативных профилей IS6110-RFLP штаммов Beijing, построенная с использованием алгоритма NJ. Жирным шрифтом выделены атипичные штаммы.

Дальнейший анализ потенциально полиморфных локусов IS1547 (Fang et al., 2001) и Rv3135 (Musser et al., 2000) имел целью оценить их пригодность для межштаммовой дифференциации внутри генотипа Beijing.

ПЦР, рестрикционный и гибридизационный анализ наличия и взаиморасположения копий элементов IS6110 и IS1547 показал, что большинство штаммов Beijing (типичные профили IS6110-RFLP) содержат две копии элемента IS1547 (локусы iplA и iplB), одна из которых (iplB) разделена вставкой IS6110, а другая (iplA) остается интактной (Рис. 4b). При этом  IS1547/iplA был единственным интактным локусом у атипичных штаммов Beijing (Рис. 4а), которые, очевидно, представляют более древнюю ветвь семейства Beijing. Дупликация первоначальной копии IS1547/iplA могла представлять единое и уникальное событие во всех линиях M. tuberculosis или только в предшественнике генотипа Beijing и, учитывая что оба локуса iplA и iplB расположены в 1 и 4 квадрантах хромосомы рядом с oriC (Рис. 4), могла произойти в результате X-инверсии вокруг oriC (Eisen et al., 2000).

Рис. 4. Схематическое положение локусов IS1547 (iplA, iplB) у атипичных (a) и типичных (b) штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing.

Анализ полиморфизма гена Rv3135-PPE.

ПЦР-анализ гена Rv3135-PPE, выявил два варианта длины данного гена - 1.02 тпн у типичных и 1.97 тпн у атипичных штаммов Beijing. Штамм H37Rv, использованный в качестве контроля, имел фрагмент ПЦР ожидаемого размера (0.63 тпн). Тридцать штаммов других генотипов, относящихся к 2 или 3 генетическим группам, имели фрагменты длиной от 0.31 до 0.63 тпн. В отличие от некоторых изученных геномных локусов, чей полиморфизм существенно или частично связан с мобильным элементом IS6110 (IS1547, mtp40, DR-локус), полиморфизм гена Rv3135 обусловлен другими механизмами. Этот ген относится к семейству, кодирующему протеины PPE (Pro-Pro-Glu), имеющие отношение к антигенной вариабельности M. tuberculosis (Cole et al., 1998). 68 генов этого семейства рассеяны по хромосоме штамма H37Rv и содержат как консервативные, так и вариабельные участки. Ранее Мюссер и соавт. (2000) предположили, что каждый выявленный вариант Rv3135 связан с другими вариантами путем редкой однонаправленной делеции, и таким образом, вариант 1,02 тпн наиболее вероятно произошел из предкового варианта 1,97 тпн. Поскольку оба выявленных нами аллеля являются наибольшими по размеру вариантами, мы полагаем, что все российские штаммы Beijing являются эволюционно достаточно старыми. Также эти данные указывают на то, что атипичные штаммы представляют эволюционно наиболее древнюю ветвь и предшествовали типичным штаммам Beijing, с которыми они имели общего предка.

Анализ локуса NTF

окус NTF является филогенетическим маркером, специфическим для семейства Beijing. Выделяют три варианта штаммов Beijing в зависимости от наличия и количества инсерций IS6110 в этом локусе (Рис. 5). Клональная популяционная структура вида M. tuberculosis определяет однонаправленный эволюционный сценарий локуса NTF Beijing при котором интактный локус является наиболее древним вариантом. Проведенный нами анализ установил, что атипичные штаммы имели интактный локус NTF и, таким образом, относились к древней ветви внутри генотипа Beijing. Типичные штаммы содержали одну прямую инсерцию IS6110 в правом плече локуса NTF и относились к современной линии генотипа Beijing, определенной нами как вариант NTF::IS6110.

Рис. 5. Схема и эволюционный сценарий локуса NTF штаммов Beijing M. tuberculosis (на основе обобщения данных Plikaytis et al., 1994; Kurepina et al., 1998). Треугольники и тонкие стрелки показывают инсерции IS6110 и их ориентацию.

Генотипирование штаммов M. tuberculosis, выделенных в Пекине, Китай.

Генотип Beijing был впервые идентифицирован в штаммах, выделенных в регионе Пекина (англ. Beijing). В этой связи, мы дополнительно включили в наше исследование выборку ДНК 123 штаммов M. tuberculosis, выделенных в Пекине в 2003-2005 гг. Эти штаммы включали 40 чувствительных и 83 лекарственно-устойчивых штамма, большинство из которых (n=56) были мультирезистентными.

Все штаммы были подвергнуты сполиготипированию, которое разделило их на 14 сполиготипов. Сравнение с международной базой данных SpolDB4 (Brudey et al., 2006) позволило отнести большинство штаммов к известным типам и (под)семействам. Наибольший кластер включал штаммы с полным профилем Beijing из девяти сигналов с 35 по 43. Кроме того, 8 штаммов (6 типов) представляли усеченные производные генотипа Beijing, в которых отсутствовали отдельные спейсеры; по принятой классификации (Brudey et al., 2006) эти профили были определены как Beijing-подобные. Таким образом, 113 (91,9%) из 123 китайских штаммов принадлежали к генотипам семейства Beijing. Интересно отметить, что в 1992-1994 гг. штаммы Beijing также преобладали (89.4%) в пекинской популяции M. tuberculosis (van Soolingen et al., 1995).

Дальнейшее разделение 113 китайских штаммов Beijing на типичные и атипичные (современные и древние, соответственно) было проведено путем анализа локуса NTF. Этот анализ выявил, что 27 (24%) штаммов имели интактный участок NTF и относились к древней линии внутри генотипа Beijing, в то время как 86 штаммов имели прямую инсерцию IS6110 в правом плече локуса NTF и относились к современной линии генотипа Beijing. Данные по лекарственной устойчивости изученных китайских штаммов в целом и в зависимости от генотипа/линии приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Устойчивость к отдельным препаратам китайских штаммов

M. tuberculosis древней и современной линий внутри генотипа Beijing.

екарственная устойчивость *

Штаммы древней линии генотипа Beijing (n=27), количество и %

Штаммы современной линии генотипа Beijing (n=86), количество и %

p

OR, 95% CI

S (1944)

9 (33,3)

32 (37,2)

0,7

0,84 [0,34; 2,10]

H (1952)

17 (63,0)

47 (54,7)

0,5

1,41 [0,58; 3,43]

R (1970)

21 (77,8)

47 (54,7)

0,03

2,90 [1,07; 7,91]

E (1960)

9 (10,5)

Z (1980)

6 (22,2)

8 (9,3)

0,08

2,79 [0,87; 8,91]

Устойчивость к любому препарату

21 (77,8)

56 (65,1)

0,2

1,88 [0,68; 5,15]

MDR

17 (63,0)

38 (44,2)

0,09

2,15 [0,88; 5,23]

* В скобках - год начала применения препарата для противотуберкулезной химиотерапии (Iseman, 2002). S, стрептомицин, H, изониазид, R, рифампицин, E, этамбутол, Z, пиразинамид. MDR, устойчивость к по крайней мере рифампицину и изониазиду.

Древние и современные штаммы Beijing: концепция, эволюция и диагностика

Суммируя вышеизложенное, применение нескольких независимых генетических маркеров позволило разделить изученные российские штаммы Beijing на две неравные группы. Первая (95%, типичные штаммы) характеризовалась сходными многофрагментными профилями IS6110-RFLP, наличием гена Rv3135 длиной 1,02 тпн и двух копий IS1547 (iplA и iplB, вторая из которых содержала инсерцию IS6110). Вторая группа (5%, латипичные штаммы) характеризовалась профилями IS6110-RFLP с меньшим количеством фрагментов, наличием Rv3135 длиной 1,97 тпн и одной интактной копией IS1547 (iplA). По нашему мнению, все атипичные штаммы имели общего предка с типичными штаммами, но являются эволюционно более древними, что также иллюстрируется NJ-филограммой на основе анализа профилей IS6110-RFLP (Рис. 3). Сравнение полученных результатов анализа инсерций IS1547 и гена Rv3135 с результатами анализа локуса NTF показало, что атипичные штаммы имели интактный локсус NTF, в то время как вариант NTF::IS6110 был характерен для типичных штаммов. Доминирующие типичные штаммы Beijing, которые мы предлагаем называть современными, вероятно имеют монофилетическое происхождение, а их широкое распространение началось исторически сравнительно недавно, т.к. эти штаммы различаются по быстро меняющимся профилям IS6110-RFLP, но имеют идентичную структуру других полиморфных, но более консервативных локусов.

Древние штаммы составляют слишком малую долю в российской популяции Beijing (5%) для достижения статистической значимости при их сравнении с современной группой. В то же время анализ китайских штаммов Beijing, среди которых доля древних штаммов была более заметна (24%), выявил интересные тенденции их различия и не только по нейтральным локусам генома (например, NTF).

Сравнение профилей лекарственной устойчивости китайских штаммов Beijing выявило, что устойчивость к рифампицину и пиразинамиду, а также профили устойчивости MDR и HRZ были ассоциированы с древней группой Beijing (Табл. 2). В случае изониазида эта ассоциация была статистически незначима, в то время как устойчивость к стрептомицину была очень слабо связана с современной группой. Похожие наблюдения о связи с мультирезистентностью и устойчивостью к стрептомицину и изониазиду были сделаны Кремер и соавт. на штаммах Beijing, выделенных в Гонконге и Вьетнаме (Kremer et al., 2009). Противотуберкулезная химиотерапия была введена в медицинскую практику только 60 лет назад (Iseman, 2002), и до этого ни древние, ни современные штаммы Beijing не подвергались селективному давлению антибиотиков. Сравнение с порядком начала использования отдельных препаратов для лечения туберкулеза (Iseman, 2002) и значений P, отражающих статистическую значимость, выявило интересную полуколичественную тенденцию: устойчивость к исторически недавно введенным в противотуберкулезную терапию препаратам (рифампицину и пиразинамиду) была ассоциирована с древними штаммами, причем особенно заметно - с самым недавним (пиразинамидом). С другой стороны, это различие между древними и современными штаммами сглажено или даже обращено для более старых изониазида и стрептомицина, соответственно (Табл. 2).

Cреди российских штаммов Beijing древние штаммы составили 5%. Ранее было показано, что их доля составила 14% в Гонконге  и 25% во Вьетнаме (Kremer et al., 2009). Согласно  нашей гипотезе, которая обсуждается и развивается ниже, первичное распространение штаммов Beijing имело место в Китае более 2000 лет назад, в то время как проникновение этих штаммов в Северную Евразию было исторически недавним и могло быть связано с расширением Монгольской империи в 13-15 веках. В этой связи, представляется, что соотношение субпопуляций древних/современных штаммов Beijing является характерной чертой, которая отражает древность локальной популяции этого генотипа, присутствующей на конкретной территории, и, в то же время, находится под определенным влиянием исторически недавних мер по борьбе с туберкулезом.

Применение инвертированной IS6110-ПЦР для генотипирования M. tuberculosis и детекции генотипа Beijing выявило, что штаммы Beijing имеют одинаковый профиль из трех (260, 290 и 490 пн - типичные штаммы) или двух (290 и 490 пн - атипичные штаммы) фрагментов (Рис. 6). В этой связи, мы оценили этот метод не для дифференциации штаммов, а в качестве альтернативного сполиготипированию метода для простой ПЦР-детекции генотипа Beijing.

Анализ 865 проб ДНК штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных в 1997-2007 гг. в России (N=575), Китае (N=117), Вьетнаме (N=122), Болгарии (N=51) был проведен методами сполиготипирования в качестве золотого стандарта идентификации генотипа Beijing и методом инвертированной IS6110-ПЦР (Рис. 6). В результате, 408 штаммов было определено как относящиеся к генотипу Beijing. Дополнительно, 61 штамм Beijing был определен как относящийся к атипичным штаммам (лдревнему варианту этого генотипа), при этом результаты анализа локуса NTF и инвертированной IS6110-ПЦР совпали.

Для оценки пригодности предлагаемого метода для быстрого анализа клеточных лизатов с низкой концентрацией ДНК был проведен анализ выборки из 144 клеточных лизатов штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных в Казахстане, и 56 образцов ДНК, выделенных из мокроты больных туберкулезом легких в Киргизии. Для большинства (125 из 144) лизатов и всех 56 проб ДНК из мокроты были получены интерпретабельные ПЦР-профили, из которых 112 было определено как соответствующие генотипу Beijing. Сравнение с последующими результатами сполиготипирования подтвердило результат инвертированной IS6110-ПЦР. Отсутствие амплификации для некоторых лизатов может быть связано с ингибированием ПЦР и/или недостаточным количеством ДНК, поэтому эффективность метода применительно к клеточным лизатам составила 90.8%.

Рис. 6. Примеры профилей инвертированной IS6110-ПЦР штаммов M. tuberculosis, выделенных в Китае (a.), Вьетнаме (b.), Болгарии (c.) и России (d.).

Стрелки указывают фрагменты специфичные для штаммов Beijing. Bj - генотип Beijing. * - древний вариант генотипа Beijing.

Учитывая клиническую значимость генотипа Beijing, наличие простого метода его детекции насущно необходимо. Сполиготипирование является, по определению, золотым стандартом для определения принадлежности штамма к этому генотипу. Простой метод на основе обычной ПЦР - метод инвертированной IS6110-ПЦР, предложенный нами, может служить полезным дополнением к классическим методам генотипирования M. tuberculosis, IS6110-RFLP и сполиготипирования. Дополнительными достоинствами метода являются: возможность выявления древних и современных штаммов Beijing, неограниченность генотипом Beijing и пригодность для первичного скрининга при эпидемиологическом типировании M. tuberculosis. В нашем исследовании метод был апробирован на представительной коллекции штаммов Beijing из основных эндемичных зон этого генотипа - России, Китая и Вьетнама; в дальнейшем было бы интересно его тестирование и на штаммах из вторичных регионов распространения, например, США, Южной Америки и Южной Африки.

M. tuberculosis может адаптироваться к селективному давлению антибиотиков посредством точечных мутаций, возникновение и закрепление которых представляет собой форму микроэволюции генома. Разработка методологии МАС-ПЦР для детекции мутаций устойчивости к основным противотуберкулезным препаратом и анализ распределения этих мутаций в основных филогенетических линиях M. tuberculosis стали еще одним из практических приложений настоящего исследования.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ И ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Разработанный нами метод детекции мутаций устойчивости к ПТП у M. tuberculosis на основе аллель-специфической ПЦР, основан на необходимости точной гомологии праймера по его 3Т-концу с ДНК-мишенью для эффективной элонгации полимеразой. Специфический внутренний праймер сконструирован на основе аллеля дикого типа исследуемого кодона: 3Т-конец праймера соответствует основанию в котором предполагается наличие мутации. В случае дикого типа аллеля, внутренний алелль-специфический и один из внешних консервативных праймеров амплифицируют специфический индикаторный фрагмент. В случае мутации, аллель-специфический праймер не отжигается и индикаторный фрагмент не амплифицируется, что указывает на резистентный фенотип. Пример использования метода для детекции мутаций в кодоне rpoB531 показан на Рис. 7.

Рис. 7. Определение мутаций в кодоне rpoB531 методом МАС-ПЦР. Короткие стрелки показывают праймеры, длинные двусторонние стрелки - фрагменты ПЦР. (а) фрагмент гена rpoB (b) гель-электрофорез продуктов МАС-ПЦР; дор. 2 - штамм с мутацией в rpoB531.

Анализ мутаций в горячем участке rpoB (кодоны  516, 526, 531)

Условия обоих вариантов предлагаемого метода МАС-ПЦР (одношаговый и гнездный) были оптимизированы для достижения максимальной специфичности на 36 образцах ДНК (любезно предоставленных Я. Ван Эмбденом), имевших следующее распределение аллелей rpoB: дикий тип - 13, 531TTG - 7, 531TGG - 2, 516GTC - 4, 516TAC - 3, 516GGC - 1, 522CAG - 1, 526TAC - 2, 526GAC - 3, 526CTC - 1.

Анализ 233 проб ДНК RIF-устойчивых штаммов, выделенных от эпидемиологически несвязанных больных в 1997-2005 гг. (Санкт-Петербург, Ленинградская и Новгородская области), был проведен методом простой одношаговой МАС-ПЦР. Мутации в одном из трех изученных кодонов rpoB 516б 526 или 531 были выявлены у 192 (82,4%) штаммов. Таким образом, метод обеспечивает достаточно высокую чувствительность определения устойчивости МБТ к рифампицину. Анализ методом МАС-ПЦР выявил мутации в rpoB у 2 из 97 RIF-чувствительных штаммов; таким образом, специфичность метода составила 97,9%.

Анализ проб из 27 клеточных лизатов был проведен методом гнездной аллель-специфической ПЦР. Во всех случаях, результаты анализа лизатов и очищенной ДНК из тех же штаммов совпадали.

Анализ мутаций в katG315

Условия разработанного метода МАС-ПЦР были отработаны на 45 штаммах, имевших следующее распределение аллелей katG315: дикий тип (AGC) - 23, ACC - 22, как было установлено ранее методом ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктазы MspI.

Дальнейший анализ 204 ДНК INH-устойчивых штаммов, выделенных от эпидемиологически несвязанных больных в 1997-2005 гг. (Санкт-Петербург, Ленинградская и Новгородская области) выявил мутации в katG315 у 191 (93,6%) штамма.

Анализ проб неочищенной ДНК был проведен на выборке из 25 клеточных лизатов. Во всех случаях результаты МАС-ПЦР анализа katG315 для лизатов и очищенной ДНК тех же штаммов совпадали.

Штамм W, вызвавший эпидемию мультирезистентного туберкулеза в Нью-Йорке в начале 1990-х гг. (Bifani et al., 1999), устойчив к изониазиду вследствие редкой двойной мутации в katG315 AGCаACA. Применение метода МАС-ПЦР позволило успешно определить ее наличие в образце ДНК штамма W (любезно предоставленном П. Смоллом, Стэнфордский университет, США), т.к. эта мутация приводит к еще более существенному неспариванию по двум основаниям на 3Т-конце праймера.

Можно отметить ряд полезных особенностей разработанных нами методов для анализа генов katG и rpoB. Анализ методом МАС-ПЦР гена rpoB обеспечивает расширенный мутационный анализ кодонов 516 и 526, поскольку, как мы установили, метод выявляет мутации не только во второй позиции этих кодонов (которая точно соответствуют 3Т-концу праймеров), но и мутации в первой позиции кодонов, которые находятся в -1 позиции по отношению к 3Т-концу аллель-специфических праймеров. Анализ методом МАС-ПЦР гена katG позволяет определить две наиболее важные мутации устойчивости в этом гене, связанные с устойчивостью к изониазиду. Вариант katG 315-ACC является наиболее частым в мире, особенно в регионах с высоким уровнем циркуляции резистентных штаммов, а вариант 315-ACA характерен для штамма W, вызвавшего эпидемию мультирезистентного туберкулеза в штате Нью-Йорк в 1990-е годы и распространенного в США (Bifani et al., 1999).

Анализ мутаций в embB306

Всего было исследовано 29 штаммов фенотипически устойчивых к этамбутолу, 26 из них были устойчивы к рифампицину и изониазиду, т.е., были мультирезистентными. Было выявлено следующее распределение аллелей embB306: ATG (дикий тип) - 15, BTG - 10 , ATH - 4 штамма (согласно вырожденному генетическому коду, B обозначает G, C, или T, а H обозначает A, C, или T). Исходя из опубликованного распределения мутаций в embB306 (Ramaswamy, Musser, 1998; Martin, Portaels, 2007), наиболее вероятно, что ATH представляет ATA (Ile), а BTG - GTG (Val) или CTG (Leu). Наш результат анализа мутаций в embB306 у EMB-устойчивых штаммов в целом не отличался от опубликованных данных (Ramaswamy, Musser, 1998). Неожиданным было выявление мутаций в embB306 в существенном проценте EMB-чувствительных штаммов.

Таблица 3. Распределение аллелей embB306 среди этамбутол-чувствительных штаммов M. tuberculosis с различными профилями резистентности.

Фенотип a

embB306 b

Чувствит.

S

H

R

SH

SR

SHR

Всего

ATG-Met (wt)

43

14

1

3

11

5

29

104

BTG-Val/Leu

-

-

-

-

1

-

23

24

ATH-Ile

-

1

1

-

5

-

17

24

Всего

43

15

2

3

17

5

69

154

a S, стрептомицин, H, изониазид, R, рифампицин. embB306 аллели: wt Цдикий тип (wild type).

Анализ выборки 154 EMB-чувствительных штаммов с различными профилями устойчивости к другим препаратам выявил расхождение между результатами генотипического и фенотипического тестов для 47 (30,5%) из 154 штаммов, которые были чувствительны к этамбутолу, но имели мутацию в embB306. Повторение экспериментов подтвердило результаты обоих методов. Более того, это расхождение между результатами фенотипического и генотипического тестов было ограничено только штаммами, устойчивыми к другим препаратам, прежде всего, мультирезистентными штаммами (Табл. 3). Так, 35 из 64 EMB-чувствительных штаммов, устойчивых к стрептомицину, рифампицину и изониазиду, имели мутацию в embB306. Напротив, такие мутации не были выявлены ни в одном из 39 полностью чувствительных штаммов. На наш взгляд, впервые обнаруженное нами необычное явление можно объяснить наличием другой мишени для этамбутола в микробной клетке помимо арабинозилтрансферазы EmbB. Не исключено, что комбинированное действие ПТП запускает такой дополнительный механизм чувствительности к этамбутолу, несмотря на возможное возникновение и закрепление мутаций в embB306. Практически, наши результаты показывают ограниченную применимость мутации в embB306 как маркера устойчивости к этамбутолу.

В различных регионах мира отмечена географическая вариабельность распределения специфических мутаций устойчивости. Это определяет необходимость предварительного анализа молекулярной основы лекарственной устойчивости локально циркулирующих штаммов до внедрения молекулярных методов в широкую практику. Метод МАС-ПЦР позволяет осуществить быстрый, эффективный, в т.ч., ретроспективный, анализ больших коллекций ДНК, полученных в предшествующие годы, для оценки мутационных профилей katG315 и rpoB и применимости метода в конкретном регионе. Анализ распределения наиболее часто встречающихся мутаций устойчивости в кодонах katG315 и rpoB531 среди основных генотипов M. tuberculosis выявил их высокую частоту у штаммов генотипа Beijing в сравнении со штаммами других генотипов (для краткости называемых не-Beijing). Мутация S315T в гене katG была выявлена у 96,7% INH-устойчивых штаммов Beijing против 89,0%, INH-устойчивых штаммов не-Beijing (OR 3,6; 95% CI 1,0-14,6). Представляется, что выявление только мутации katG S315T позволяет выявить высокую долю INH-устойчивых штаммов, циркулирующих в России.

Мутация в кодоне rpoB531 была выявлена существенно чаще у RIF-устойчивых штаммов Beijing, нежели не-Beijing: 77,3% против 28,0% (OR 8,78; CI 95% 4,82-16,00). Следует отметить, что кодон rpoB531 является наиболее часто мутирующим в любом регионе мира (30-50% RIF-устойчивых штаммов) (van Rie et al., 2001; Marttila et al., 2008), однако обращает на себя внимание столь высокий процент этой мутации среди штаммов Beijing в России, что было показано не только нами, но и в большинстве других исследований (Генерозов и др., 2000; Toungoussova et al., 2002; Lipin et al., 2007).

В целом, в глобальном контексте, штаммы Beijing не представляются неизбежно ассоциированными с мультирезистентностью (Tuyen et al., 2000; Prodinger et al., 2001). В нашем исследовании 25.6% тотально чувствительных штаммов и 40% STR-монорезистентных штаммов принадлежали к генотипу Beijing. В то же время, наши данные показывают, что эти штаммы, циркулирующие в России, высокотрансмиссибельны и мультирезистентны, и чаще, чем другие генотипы, приобретает мутации в наиболее часто мутирующих кодонах генов резистентности katG315 и rpoB531.

Помимо прямого использования для детекции устойчивости, мутации, связанные (rpoB RRDR, katG315) или условно связанные (embB306) с резистентностью, могут служить дополнительными эпидемиологическими маркерами для дискриминации близкородственных, но уже начавших процесс дивергенции штаммов (учитывая более высокую скорость развития устойчивости, чем скорость изменения профилей IS6110-RFLP). Например, штаммы с идентичными профилями IS6110-RFLP, выделенные от эпидемиологически несвязанных больных, могли быть дифференцированы на основе аллельного полиморфизма embB306. Ранее мы и другие исследователи показали пригодность использования таких мутаций в embB306 и rpoB при эпидемиологическом обследовании очагов (Chaves et al., 2000; Narvskaya et al., 2002b).

В отличие от генов резистентности, изменения в локусах VNTR в целом нейтральны, что определяет их пригодность для решения задач филогенетического и эпидемиологического анализа, результаты которого представлены ниже.

ПРИМЕНЕНИЕ ЛОКУСОВ VNTR ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ЭВОЛЮЦИИ M. TUBERCULOSIS.

Оценка нового поколения VNTR маркеров для высокоразрешающего генотипирования

Анализ штаммов с различными профилями IS6110-RFLP. В результате анализа дендрограммы всех профилей IS6110-RFLP штаммов Beijing базы данных лаборатории молекулярной микробиологии СПб НИИЭМ им. Пастера было отобрано 48 репрезентативных профилей (65-95% сходства [Рис. 8]). Эти штаммы послужили для оценки дискриминирующей способности VNTR типирования, основанного на анализе отдельных локусов VNTR и их различных комбинаций (Табл. 4), при этом метод IS6110-RFLP рассматривали в качестве золотого стандарта, т.е. наиболее дискриминирующего метода. Всего было оценено 27 локусов VNTR, аллельное разнообразие которых в нашей выборке различалось значительно (Табл. 5).

Далее мы проанализировали дискриминирующие способности различных комбинаций VNTR локусов с целью найти комбинацию, наиболее дискриминирующую штаммы Beijing, но основанную на ограниченном количестве локусов. Критериями составления комбинаций служили количество аллелей и аллельное разнообразие локусов (Табл. 4). В результате, представляется, что комбинация В, состоящая из семи локусов, обеспечивает разумный баланс между ограниченным количеством локусов и достаточно высоким индексом дискриминации, близким к таковому VNTR-схемы 15+3. Следует отметить, что при всех комбинациях включение трех гипервариабельных локусов играло критическую роль (Табл. 4).

Рис. 8. Дендрограмма UPGMA на основе профилей 27 локусов VNTR 48 штаммов M. tuberculosis Beijing с преимущественно различными профилями IS6110-RFLP.  Кластер B0 (B0 и сходные профили RFLP) показан серым фоном. Профили А0 и В0 выделены жирным шрифтом.

Таблица 4. Дискриминирующая сила методов генотипирования российских штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing *

Метод**

К-во типов

Количество уникальных изолятов

Количество кластеризованных изолятов

Количество кластеров

Размер кластеров

HGI

IS6110-RFLP

44

40

8

4

2

0.996

12 локусов MIRU

12

7

41

5

2-23

0.723

15 локусов VNTR

23

15

33

8

2-13

0.905

24 локуса VNTR

24

16

32

8

2-13

0.906

15 локусов + 3 гипервариабельных локуса

34

25

23

9

2-7

0.974

Редуцированная схема A (11 локусов)

34

25

23

9

2-7

0.974

Редуцированная схема  В (7 локусов)

29

18

30

11

2-8

0.963

Редуцированная схема С (5 локусов)

25

14

34

11

2-10

0.941

*выборка 48 штаммов с преимущественно различными профилями IS6110-RFLP.

** Форматы из 12 локусов (Supply et al. 2001); 15 и 24 локусов (Supply et al., 2006); три гипервариабельных локуса (Iwamoto et al., 2007). Редуцированная схема A (HGI>0.1): QUB-11b, Mtub21, QUB-26, MIRU26, ETR-A, MIRU40, MIRU31, MIRU20, QUB-3232, VNTR-3820, VNTR-4120. Редуцированная схема B (HGI>0.1, количество аллелей >3): QUB-11b, Mtub21, QUB-26, MIRU26, QUB-3232, VNTR-3820, VNTR-4120. Редуцированная схема C (HGI>0.5 или количество аллелей >3): QUB-26, MIRU26, QUB-3232, VNTR-3820, VNTR-4120.

Сравнение дискриминирующих возможностей 27-VNTR и IS6110-RFLP методов (Рис. 8, Табл. 4) показало, что IS6110-RFLP метод лучше дифференцировал штаммы, дополнительно разделяя VNTR-кластеры, например, крупный VNTR-кластер, который включал сходные штаммы с характерным двойным фрагментом в верхней части профиля (показано серым фоном на Рис. 8). Один из этих штаммов имел профиль В0 (27% в нашей базе данных (Нарвская, 2003)) и в данном исследовании мы определили этот кластер штамма В0 и родственных штаммов как В0-кластер.

Таблица 5. Аллельное разнообразие 27 локусов VNTR российских штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing *

Формат VNTR локусов

VNTR локус

Другое название VNTR локуса

К-во аллелей

К-во копий

Аллельное разнообразие (HGI)

Дискриминирующий, 15 локусов

2163b

QUB-11b

4

4-7

0.205

1955

Mtub21

4

3-6

0.330

4052

QUB-26

4

6-9

0.636

4156

QUB-4156

2

2-4

0.082

2996

MIRU 26

4

3-7

0.520

424

Mtub04

1

4

0

2165

ETR A

3

2-4

0.158

802

MIRU 40

3

1-4

0.122

3690

Mtub39

1

3

0

3192

MIRU 31; ETR E

3

4-6

0.160

960

MIRU 10

2

1-3

0.082

580

MIRU 4; ETR D

1

2

0

577

ETR C

2

2-4

0.042

1644

MIRU 16

2

1-3

0.082

2401

Mtub30

2

3-4

0.042

Дополнительные  9 локусов

2347

Mtub29

2

2-4

0.087

4348

MIRU 39

1

3

0

3007

MIRU 27; QUB-5

1

3

0

2461

ETR B

1

2

0

3171

Mtub34

1

3

0

2531

MIRU 23

1

5

0

2059

MIRU 20

2

1-2

0.120

154

MIRU 2

1

2

0

2687

MIRU 24

1

1

0

Гипервар. локус

QUB-3232

9

5-19

0.729

Гипервар. локус

VNTR-3820

6

10-16

0.542

Гипервар. локус

VNTR-4120

6

5-16

0.370

*выборка 48 штаммов с преимущественно различными профилями IS6110-RFLP.

VNTR генотипирование преобладающих IS6110-RFLP кластеров штаммов Beijing

Как было упомянуто выше, два профиля IS6110-RFLP, А0 и В0, были выявлены у значительной доли штаммов Beijing, циркулирующих на северо-западе России (27% и 23% в нашей коллекции) и в целом по стране (Нарвская, 2003, Bifani et al., 2002; Surikova et al., 2005). 72 штамма, представляющие эти профили (38 штаммов А0 и 34 штамма В0), были исследованы методом VNTR-типирования, при этом в исследование были включены 17 немономорфных локусов, отобранных на основе анализа выборки 48 штаммов Beijing с различными профилями IS6110-RFLP (см. выше). В целом, VNTR-типирование выявило как внутри-, так и межкластерную дифференциацию. В частности, 34 штамма В0 было разделено на 11 типов; 26 штаммов входили в кластеры, из которых самый крупный кластер включал 22 штамма (HGI=0.585). С другой стороны, штаммы А0, среди которых не было выявлено доминирующего VNTR-кластера, были разделены на 12 типов (33 кластеризованных штамма, HGI=0.860).

Рис. 9. Дендрограмма UPGMA профилей 17 локусов VNTR объединенной выборки 120 российских штаммов M. tuberculosis Beijing.

Кластер B0 (B0 и сходные профили RFLP) показан серым фоном. Количество штаммов показано если >1.

Кластерный анализ профилей VNTR 120 штаммов Beijing с идентичными (А0 и В0) и различными профилями IS6110-RFLP, позволил разделить штаммы на 53 генотипа, для оценки степени родства которых была построена дендрограмма на основе 17 локусов (Рис. 9). Интересно отметить, что штаммы с профилем А0 были равномерно распределены в различных ветвях VNTR-дендрограммы (Рис. 9), что может отражать или повышенную стабильность этого профиля IS6110-RFLP, или конвергентную эволюцию IS6110. В отличие от профиля А0, 44 штамма В0-кластера были сгруппированы и на VNTR-дендрограмме (Рис. 9).

В0, иначе называемый W148, наиболее часто встречаемый российский вариант Beijing, который широко циркулирует на территории постсоветсткого пространства и доминирует в США и Германии среди штаммов, выделенных от иммигрантов из бывшего СССР (Нарвская и др., 1999, 2002; Черноусова и др., 2001; Шемякин и др., 2003; Bifani et al., 2002; Kruuner et al., 2001; Kubica et al., 2004). Близкое расположение на VNTR-дендрограмме этих штаммов, выделенных от больных из разных регионов северо-запада России в различные годы,  подчеркивает их истинную клональность. В то же время, звездная VNTR-филогения штаммов В0-кластера, при которой центральный крупный тип связан короткими лучами с его однолокусными производными (Рис. 10), свидетельствует о взрывной диссеминации штаммов этого кластера, который действительно может представлять луспешный клон, широко и исторически недавно распространившийся по всей России, благодаря своим особым патогенным свойствам. Проведенное нами компьютерное моделирование эволюции и коалесценции 17 полиморфных локусов VNTR российских штаммов Beijing с использованием Байесовой статистики позволило оценить темпы роста популяций кластера B0 и российской популяции Beijing в целом. Полученные результаты показывают существенно более быстрый (в 10.6 раза) рост субпопуляции В0 в сравнении с популяцией Beijing в целом и, в свою очередь, подтверждают луспешность этого клонального варианта M. tuberculosis в России.

Рис. 10. Минимальное дерево штаммов В0-кластера на основе профилей VNTR. Размер круга приблизительно пропорционален количеству штаммов.

Ввиду высокой трансмиссивности и вероятной гипервирулентности варианта В0/W148 (Вишневский и др.. 2002; Нарвская, 2003) наличие простого ПЦР теста для его быстрой детекции представляется полезным и своевременным. Почти все штаммы этого кластера (42 из 44) имели характерное сочетание аллелей локусов MIRU26 и QUB26 (по 7 копий в каждом), которое не наблюдалось у других штаммов. В то же время, применение полного филогенетического анализа позволило корректно идентифицировать все 44 штамма В0-кластера (Рис. 9).

Суммируя вышеизложенное, группа близкородственных штаммов Beijing (кластер В0), очевидно, представляет луспешный клон M. tuberculosis широко и недавно распространившийся в России. VNTR типирование на основе редуцированной схемы из семи полиморфных локусов и IS6110-RFLP типирование критически дополняют друг друга при высокоразрешающем эпидемиологическом типировании штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing, циркулирующих в или импортируемых из России.

Следует отметить, что классический формат 12 локусов VNTR показал свою явную недостаточность для тонкого эпидемиологического типирования M. tuberculosis (Табл. 3). В то же время, данные по различным регионам мира, накопленные за последние годы, имеют большую ценность для анализа глобального генетического разнообразия, результаты которого представлены в следующем разделе.

Глобальная база данных MIRU-VNTR и филогеографический анализ генотипа Beijing

Сравнение профилей 11 локусов MIRU-VNTR 1302 штаммов Beijing позволило разделить штаммы на 204 типа c идентичными профилями по 11 локусам. Четыре наиболее крупные типа - М11, М2, М28 и М33 - включали большинство (50.5%) штаммов. Оценка индекса разнообразия HGI показала, что наиболее однородными были 4 российские популяции (HGI<0.7), а наиболее гетерогенными - восточно-азиатские популяции и Австралия (Рис. 11). Рис. 11 также показывает географическое распределение 10 основных типов (58.6% штаммов), принимая во внимание различную долю штаммов Beijing в локальных популяциях M. tuberculosis. Рис. 12 показывает филогенетические отношения для 48 глобально или локально доминирующих типов. Как видно, наиболее крупный тип М11 находится в центральной позиции, в то время как большинство других типов напрямую происходит от типа М11 путем изменения одного из локусов (Рис. 12). Центральное положение и наибольший размер типа М11 указывают на его предковое положение. Этот тип включает большинство штаммов, превалирует в Евразии, но отсутствует в Австралии и Южной Африке. Другой достаточно крупный тип М2 более специфичен для и доминирует в России но также, хотя и в меньших пропорциях, встречается и в Восточной Азии. Другие относительно крупные типы преобладают в отдельных регионах, например, М12 - в Японии, М8 - в Вухане, М33 - в Шанхае и Вьетнаме, хотя присутствуют и в других регионах (Рис. 11).

Рис. 11. Географическое распределение основных MIRU-типов генотипа Beijing M. tuberculosis.

Размер диаграмм приблизительно пропорционален % штаммов Beijing в общей популяции M. tuberculosis. Значения индекса разнообразия HGI для отдельных регионов основаны на комбинации 12 локусов MIRU.

Более внимательное рассмотрение распределения типов/популяций в пределах минимальной филогенетической сети показывает, что китайские штаммы расположены по всей сети, как во внутренних, так и во внешних и терминальных узлах (Рис. 12). Вместе с наибольшим разнообразием китайских популяций, это отражает их наибольшую древность. Япония и Вьетнам представляют промежуточный случай, т.к. их штаммы представлены в центральном типе М11, но обнаруживаются несколько реже, чем китайские штаммы, в других типах. С другой стороны, штаммы из Австралии и Южной Африки находятся только в терминальных типах и представляют, вероятно, наиболее молодые популяции. Наконец, большинство российских штаммов расположено в центральных типах М11 и М2, но при этом демонстрирует наибольшую однородность (HGI), что может отражать их относительно давнее проникновение, но лишь недавнюю диссеминацию на территории России.

Рис. 12. Наиболее парсимонная филогенетическая сеть (минимальное охватывающее дерево) 48 основных типов MIRU-VNTR внутри генотипа Beijing M. tuberculosis, представляющих различные географические регионы. Каждая ветвь представляет одно событие (одно изменение в одном локусе). Пунктирные линии обозначают возможные альтернативы.

Высокая гетерогенность популяции может отражать ее длительную эволюцию, т.е. древность. Особый случай представляет Сингапур, гетерогенность популяции которого может отражать множественные проникновения различных вариантов Beijing из географически отдаленных частей Азии в течение сравнительно короткого периода времени. Учитывая положение Сингапура как важнейшего торгового перекрестка, начиная со второй половины 19 и особенно в 20 веках, это предположение представляется правдоподобным.

Для оценки географического компонента генетического разнообразия штаммов Beijing и реконструкции путей его исторического распространения мы сравнили локальные популяции штаммов Beijing. Рис. 11 и Рис. 12 показывают распределение основных типов, которые представляют большинство, но не все профили. Поэтому мы исследовали разнообразие штаммов Beijing на основе информации о всех VNTR профилях в нашей базе данных. Генетические расстояния между географическими популяциями были рассчитаны по предложенной нами формуле и полученная матрица расстояний была использована для многомерного масштабирования (multidimensional scaling, MDS), которое было проведено путем последовательного исключения удаленных популяций (Рис. 13).

Рис. 13. Отношения географических популяций M. tuberculosis генотипа Beijing, представленные в виде графа MDS на основе матрицы расстояний VNTR-OD.

Все популяции (a.), евразийские популяции (b. и c.), китайские популяции (d.).

Сокращения: П, Пекин; Ш, Шанхай; Ву, Вухань; ГК, Гонконг; Син, Сингапур; СВ, северный Вьетнам; ЮВ, южный Вьетнам; Я, Япония; СЗР, северо-западная Россия; ЦР, центральная Россия; Ур, Урал; ВС, восточная Сибирь.

Филогеография генотипа Beijing в контексте коэволюции H. sapiens и M. tuberculosis

Большие водные пространства между континентами были наиболее эффективным генератором генетической дивергенции между человеческими популяциями (Cavalli-Sforza et al., 1996). Такая же ситуация наблюдается и для возбудителя туберкулеза, чей общий паттерн генетического разнообразия поразительно напоминает таковой H. sapiens. Внимательное рассмотрение географического распределения VNTR-генотипов Beijing (Рис. 11) выявило ряд географических градиентов. Представляется, что наиболее значительный эффект оказали большие водные, но не наземные пространства, что видно на примере Австралии и Южной Африки, где регион-специфические и другие типы составили большинство их популяций Beijing (Рис. 11). На филогенетической сети видно, что австралийские и южно-африканские VNTR-типы не перекрываются, но образуют собственные субкластеры, тем не менее, соединенные с остальной сетью через центральный и очевидно предковый тип М11 (Рис. 12). В свою очередь, на MDS-графе Австралия и Южная Африка представляют далеко расположенные outliers, что, в частности, несколько затрудняет анализ отношений между остальными тесно расположенными евразийскими популяциями (Рис. 13а). Тем не менее, даже на общем графе всех изученных популяций можно ясно выделить субкластер четырех российских популяций, более диспергированное положение китайских популяций и относительно дистальное положение японской популяции (Рис. 13а). На наш взгляд, это свидетельствует о корректности проведенного анализа в целом и одновременно подкрепляет менее очевидные аффинитеты между географическими отдаленными популяциями M. tuberculosis, вероятно, отражающие скрытые или менее известные паттерны миграций человека, сформировавшие разнообразие возбудителя туберкулеза. Например, удивительна и неожиданна некоторая близость популяций Гонконга и южного Вьетнама (Рис. 13а), северо-западной России и Восточной Сибири (Рис. 13с).

Сравнение доли штаммов Beijing в общей популяции штаммов M. tuberculosis (см. различный диаметр диаграмм на Рис. 11) показало наибольшее распространение этого генотипа в северно-центральном и северо-восточном Китае. Учитывая наиболее высокий процент первоначального и наиболее древнего MIRU-типа М11 в Пекинском регионе Китая, все эти данные указывают на этот регион как место происхождения генотипа Beijing. Низкое и сходное, судя по значениям HGI, разнообразие всех географически отдаленных российских популяций указывает на исторически недавнее широкое распространение штаммов этого генотипа в России, вероятно в 20-м веке. Ограниченное распространение этих штаммов в России до 19-го века может быть связано с холодными климатическими условиями и крайне низкой плотностью населения в доиндустриальный период (Климанов и др., 1995), в отличие, например, от аналогичных показателей в Южной Африке (ср. более высокий индекс HGI южноафриканской (Кейптаун) популяции Beijing). С другой стороны, высокий процент древнего типа М11 среди российских штаммов подразумевает исторически отдаленное время его первоначального проникновения в Россию. Поскольку Beijing не является эндемичным для Европы, опубликованный анализ главных компонент разнообразия европейских человеческих популяций (Cavalli-Sforza, 1996, 2001) позволяет исключить миграции, которые в равной степени затрагивали Россию и Европу, как источник исключительного проникновения штаммов Beijing в Россию. К таковым относятся финно-угорская, скифская, и гуннская экспансии (Christian, 1998; Cavalli-Sforza, 2001). Рассмотрев различные эпизоды человеческой истории, в конечном итоге, нам представляется, что проникновение штаммов Beijing в Россию могло быть связано с евразийской экспансией монгольской империи Чингизхана в 13-15 веках. Средневековая монгольская империя впервые в истории тесно связала отдаленные части евразийского суперконтинента и создала единую экономическую и культурную систему, охватывавшую огромное пространство Евразии (McNeill, 1976; Christian, 2002). Это был также и период значительного межэтнического смешения, т.к. монгольская армия увеличивалась путем поглощения армий завоеванных наций, включая и ханьцев, основного китайского субэтноса (Christian, 1998). Монгольские завоевания также объединили Евразию и эпидемиологически, усилив циркуляцию носителей возбудителей различных болезней (McNeill, 1976). Действительно, Чингизхан дошел до центра Европы, но на очень короткое время, что было достаточно для диссеминации исключительно контагиозных штаммов Y. pestis, но не возбудителя туберкулеза. Даже если азиатские генотипы M. tuberculosis и были занесены в Европу в то время, их редкие носители были уничтожены последующей эпидемией чумы. В то же время, взаимопроникающее взаимодействие Руси и Орды было тесным и длительным, и вполне возможно, что монгольское вторжение и последующее длительное их сосуществование стали причиной проникновения и закрепления генотипа Beijing в северной Евразии (современной России).

Возвращаясь к вопросу о происхождении генотипа Beijing, допуская гипотезу его проникновения в Россию в 13-15 веках, его возникновение в Северно-центральном Китае, очевидно, имело место до этого периода. Проведенный нами предварительный анализ профилей MIRU-VNTR штаммов Beijing из региона его происхождения (Пекина) определил время их коалесценции в ~2000 лет, что, вероятно, и является консервативной (минимальной) оценкой возраста генотипа Beijing.

Генотип Beijing в Евразии. На Рис. 13bс отношения между евразийскими популяциями показаны в различных проекциях координат, которые позволяют наблюдать разные компоненты их генетического разнообразия. Рис. 13b наиболее ярко отражает географическую вариабельность. В частности, центрально-китайские популяции расположены в центральной части графа, а обе вьетнамские популяции близки друг к другу и находятся несколько в стороне от других популяций. Япония представляется outlierТом, что объясняется как географическими, так и политическими причинами (Cheow, 2006; Наконец, российские популяции находятся в нижней правой части графа дистально от других популяций. Как можно ожидать, северо-западная и центральная российские популяции наиболее близки друг к другу. С другой стороны, близкое положение уральской относительно центрально-китайских популяций (Пекин, Вухань) (Рис. 13b) и Японии (Рис. 13с) весьма неожиданно. Как уже можно было видеть на более сжатом графе (Рис. 13а),  китайские популяции генотипа Beijing рассеяны в центральной части графа. Это может отражать их более длительную, чем российских популяций, дивергенцию и, в целом, предковое положение. Другие координаты (Рис. 13с) выявляют менее очевидные, чем явно географические, аффинитеты, которые также трудно объяснить и доступным историческим и лингвистическим знанием. В то же время, в верхней части графа на Рис. 13с явно присутствует кластер прибрежных популяций Юго-Восточной Азии - Гонконга, Вьетнама, Сингапура, и, в меньшей степени, Шанхая, что может, действительно, отражать их длительное взаимодействие вследствие морской торговли.

Интересно отметить некоторый аффинитет сингапурской и гонконгской популяции M. tuberculosis (Рис. 13а), что логично следует из их общего китайского происхождения (Conference on Chinese population, 2002). В то же время, они ясно различаются между собой по причине различных источников происхождения (соответствующих китайских миграций). В Гонконге 96% населения говорит на кантонском диалекте, т.е. лингвистически они близки к соседней южнокитайской провинции Гуандун (Harrison, So, 1996). В то же время источники китайского населения в Сингапуре были существенно более разнообразны и только 6% являются носителями кантонского диалекта (Singapore Department of Statistics, 2001).

Ранее, на примере других видов микроорганизмов (H. pylori, вирус JC) было показано, что неожиданное географическое распределение их генотипов может отражать скрытые или менее очевидные паттерны миграций человека (Wirth et al., 2004; Pavesi, 2005; Takasaka et al., 2006). Аналогично, загадочное родство отдаленных популяций M. tuberculosis Пекина и Гонконга (Рис. 5.7d) может отражать пока неизвестные эпидемиологические связи между этими китайскими регионами.

Проникновение штаммов Beijing в Южную Африку вероятно произошло исторически недавно. Наиболее вероятно, что генотип Beijing был завезен в Южную Африку по морскому торговому пути из Юго-Восточной Азии в течение последних 400 лет. В 17-18 веках в результате деятельности Голландской Ост-Индской компании, голландские колонисты мыса Доброй Надежды (нынешний регион Кейптауна) в больших количествах завозили рабов из голландских колоний в Африке и Азии, включая Индонезию (Vink, 2003). Потомки этих рабов, известные как капские малайцы, в настоящее время составляют большинство населения Западной Капской провинции (Vink, 2003; com/encyclopedia/South-Africa). Таким образом, штаммы Beijing попали в Южную Африку исторически недавно и не непосредственно из региона их исторического происхождения (Китая), а из вторичного очага (Индонезии). Исторические данные подтверждаются и генетическими: на филогенетической сети штаммов Beijing все основные южноафриканские VNTR-типы расположены терминально и, таким образом, являются эволюционно наиболее молодыми (Рис. 12). С другой стороны, следует отметить, что крупнейший южноафриканский тип М28 также присутствует и в Гонконге, Сингапуре и Вьетнаме и, в меньшей степени, в Шанхае (Рис. 11, 12); все они являются прибрежными регионами. Таким образом, наблюдаемый градиент распределения типа М28 отражает другой и более недавний путь попадания штаммов Beijing в Южную Африку, а именно, морской торговый путь из портов Юго-Восточной Азии. При этом, исключительное положение Шанхая объясняется его закрытостью для внешних контактов до середины 19 века (Liu, 2005). В любом случае, терминальное положение Южной Африки на MDS-графе отражает лэффект основателя первоначально небольшой популяции генотипа Beijing M. tuberculosis, занесенной из Восточной Азии и адаптировавшейся к местной человеческой популяции в течение нескольких последующих столетий.

Генотип Beijing в Австралии. Начиная с 19 века, в связи с открытием золота, имела место существенная и стабильная миграция из южного Китая в Австралию (Jones, 2005; Morgan, 2006; Hugo, 2007). Однако азиатская (в том числе и китайская) иммиграция в Австралию была фактически прекращена в начале 20 века официальным введением Политики Белой Австралии, которая продолжалась до 1970 года (Hugo, 2007). С другой стороны, следует обратить внимание на то, что большинство штаммов M. tuberculosis в нашей базе данных VNTR имеет две копии в локусе MIRU4, в то время как все австралийские штаммы имеют три копии в этом локусе. На филогенетической сети основной австралийский тип М198 отличается от центрального типа-предшественника М11 только по одному локусу (MIRU4) (Рис. 12). Следовательно, не исключено, что австралийские штаммы Beijing эволюционировали из типа М198, привнесенного из юго-восточной Азии. Поскольку разнообразие австралийской коллекции достаточно высоко (HGI 0.9), этот процесс, вероятно, начался не несколько десятилетий назад а, скорее, в конце 19 века.

Коэволюция биологических видов, в том числе, H. sapiens и патогенных микроорганизмов, развивается через взаимоформирование/взаимоотражение их популяционных структур. Тридцать лет назад Уильям Мак-Нил показал влияние локальных и глобальных эпидемий на человеческую историю, наиболее известным и исторически недавним примером которых является Черная смерть средневековья (McNeill, 1976). В настоящем исследовании рассмотрена обратная гипотеза: популяционная структура микроорганизмов, в том числе и возбудителя туберкулеза, формируется в процессе сосуществования с популяцией хозяина, и датировка ключевых событий в эволюции микробных популяций в последние 100 тыс. лет возможна при сравнении с историей миграций человеческих популяций.

Проведенный сравнительный анализ выявил строгую географическую специфичность локальных вариантов M. tuberculosis. В частности, близость российских субпопуляций может отражать недавнее распространение штаммов Beijing, усиленное массовыми миграциями населения в России 20 века. Напротив, некоторые слабые и менее ожидаемые аффинитеты отдаленных популяций Beijing (северный Вьетнам и Южная Африка, северо-западная Россия и Восточная Сибирь, Пекин и Гонконг) могут отражать скрытые паттерны человеческих миграций или еще неизвестные эпидемиологические связи отдаленных регионов, что требует дальнейшего, в том числе, и палеомикробиологического, исследования. Накопление новых данных по VNTR локусам и другим маркерам, таким как SNPs и делеции, в том числе и из новых регионов мира, включая также и архивные и палеомикробиологические образцы, позволят провести более точную филогеографическую реконструкцию для M. tuberculosis и прольют новый свет на его эволюционную историю, тесно переплетенную с историей H. sapiens.

ВЫВОДЫ

1. Современная глобальная популяция M. tuberculosis генотипа Beijing характеризуется генетической неоднородностью и, в целом, сформировалась в результате человеческих миграций. Генотип Beijing возник на территории северного Китая более 2000 лет назад и проник в другие регионы мира из Юго-Восточной Азии: в Россию - в средние века, в Южную Африку с 17 века и в Австралию в конце 19 века.

2. Генотип Beijing включает две крупные филогенетические линии (лдревние и современные штаммы), которые различаются по структуре локусов NTF, IS6110, IS1547 и Rv3135-PPE и особенностям развития лекарственной устойчивости.

3. Субпопуляция варианта В0/Beijing отличается существенно более быстрым (в 10,6 раза) ростом в сравнении с популяцией Beijing в целом, что показывает луспешный характер этого клонального варианта M. tuberculosis, распространенного в России.

4. Метод инвертированной IS6110-ПЦР пригоден для детекции штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing и его двух основных филогенетических линий, а VNTR-типирование - для детекции и дифференциации штаммов кластера В0.

5. Разработанная минимальная схема VNTR-типирования на основе 7 локусов (QUB-11b, Mtub21, QUB-26, MIRU26, QUB-3232, VNTR-3820, VNTR-4120) эффективна для скринингового анализа штаммов M. tuberculosis Beijing. Сочетанное применение методов VNTR и IS6110-RFLP необходимо для высокоразрешающего типирования M. tuberculosis.

6. Разработанный метод мультиплексной аллель-специфической ПЦР для анализа основных мутаций резистентности в генах rpoB и katG эффективен для выявления большинства мультирезистентных штаммов M. tuberculosis, циркулирующих в России и других странах с высоким уровнем заболеваемости туберкулезом.

7. Мутации резистентности в katG315, embB306, и rpoB531 наиболее часто встречаются у штаммов генотипа Beijing в сравнении со штаммами других генотипов.

8. Мутации в гене embB306, выявленные у 30% штаммов M. tuberculosis, чувствительных к этамбутолу, не могут служить маркером устойчивости к этамбутолу.

9. Разработанные методологические подходы на основе применения комплекса информативных молекулярных маркеров могут быть использованы для проведения филогенетических и филогеографических исследований, эффективного мониторинга и диагностики лекарственной устойчивости циркулирующих штаммов M. tuberculosis.

Список публикаций по теме диссертации

Главы в монографиях:

1. Mokrousov I., T. Otten, B. Vishnevsky, O. Narvskaya. Molecular basis of anti-tuberculosis drug resistance and its genotypic detection in Russia // Trends in DNA fingerprinting research (ed. M.M. Read) - Nova Science Publishers. NY, USA. - 2005. - P. 83-109.

2. Narvskaya O., Mokrousov I., Otten T., Vishnevsky B.. Molecular markers: application for studies of Mycobacterium tuberculosis population in Russia // Trends in DNA fingerprinting research (ed. M.M. Read). Nova Science Publishers. NY, USA. - 2005. - P. 111-125.

3. Valcheva V., Mokrousov I., Narvskaya O., Rastogi N., Markova N. Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis population in Bulgaria // Genetic Diversity (Eds. C.L. Mahoney, D.A. Springer). Nova Science Publishers. NY, USA. - 2009 - P. 70-106.

4. Mokrousov I. Molecular basis of ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis: current insights // Drug-Resistant Tuberculosis: Causes, Diagnosis and Treatments (Eds. S. Ngy, Z. K'ung). Nova Science Publishers. NY, USA. - 2009. - P. 180-204.

5. Valcheva V., Markova N., Rastogi N., Narvskaya O., Mokrousov I. Drug Resistant Tuberculosis in Bulgaria: Molecular Insights // Drug-Resistant Tuberculosis: Causes, Diagnosis and Treatments (Eds: S. Ngy, Z. K'ung). Nova Science Publishers. NY, USA. - 2009. - P. 206-229.

Статьи в рекомендованных ВАК РФ журналах:

1. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Вишневский Б.И. Генетическое маркирование полирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных на Северо-Западе России // Пробл. Туберк. - 1999. - №3. - С. 39-41.

2. Sola C., Filliol I., Legrand E., Mokrousov I., Rastogi N. Mycobacterium tuberculosis phylogeny reconstruction based on combined numerical analysis with IS1081, IS6110, VNTR and DR-based spoligotyping suggests the existence of two new phylogeographical clades // J. Mol. Evol. - 2001. - Vol. 53. - P. 680-689.

3. Sola C., Filliol I., Gutierrez M.C., Mokrousov I., Vincent V., Rastogi N. Spoligotype database of Mycobacterium tuberculosis: biogeographic distribution of shared types and epidemiologic and phylogenetic perspectives // Emerg. Infect. Dis. - 2001. - Vol. 7. - P. 390-396.

4. Sebban M., Mokrousov I., Rastogi N., Sola C. A data-mining approach to spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis // Bioinformatics - 2002. - Vol. 18. ЦP. 235Ц243.

5. Mokrousov I., Narvskaya O., Limeschenko E., Otten T., Vyshnevskiy B. Novel IS6110 insertion sites in the direct repeat locus of Mycobacterium tuberculosis clinical strains from the St. Petersburg area of Russia and evolutionary and epidemiological considerations // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40. - P. 1504-1507.

6. Mokrousov I., Narvskaya O., Otten T., Limeschenko E., Steklova L., Vyshnevskiy B. High prevalence of KatG Ser315Thr substitution among isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from northwestern Russia, 1996 to 2001 // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46. - P. 1417-1424.

7. Нарвская О.В., Вишневский Б.И., Елькин А.В., Мокроусов И.В., Лимещенко Е.В., Оттен Т.Ф., Осташко О.М., Ариэль Б.М. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных, оперированных по поводу туберкулеза легких // Пробл. Туберк. - 2002. - №3. - С. 50-53.

8. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Лимещенко Е.В., Стеклова Л.Н., Оттен Т.Ф., Вишневский Б.И. Характеристика циркулирующих на Северо-Западе России штаммов Mycobacterium tuberculosis с использованием сполиготипирования // Пробл. Туберк. - 2002. - №4. - С. 44-48.

9. Mokrousov I., Narvskaya O., Limeschenko E., Otten T., Vyshnevskiy B. Detection of ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by multiplex allele-specific PCR assay targeting embB306 mutations // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40. - P. 1617-1620.

10. Mokrousov I., Filliol I., Legrand E., Sola C., Otten T., Vyshnevskaya E., Limeschenko E., Vyshnevskiy B., Narvskaya O., Rastogi N. Molecular characterization of multiple-drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from northwestern Russia and analysis of rifampin resistance using RNA/RNA mismatch analysis as compared to the line probe assay and sequencing of the rpoB gene // Res. Microbiol. - 2002. - Vol. 153. - P. 213-219.

11. Mokrousov I., Otten T., Filipenko M., Vyazovaya A., Chrapov E., Limeschenko E., Steklova L., Vyshnevskiy B., Narvskaya O. Detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by a multiplex allele-specific PCR assay targeting katG codon 315 variation // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40. - P. 2509-2512.

12. Narvskaya O., Otten T., Limeschenko E., Sapozhnikova N., Graschenkova O., Steklova L., Nikonova A., Filipenko M., Mokrousov I., Vyshnevskiy B. Nosocomial outbreak of multidrug-resistant tuberculosis caused by a strain of Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family in St. Petersburg, Russia // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2002. - Vol. 21. - Vol. 596-602.

13. Вишневский Б.И., Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Истомин Е.А., Оттен Т.Ф. Чувствительность к левофлоксацину штаммов штаммов Mycobacterium tuberculosis с различным генотипом, выделенных от больных с впервые выявленным и хроническим туберкулезным процессом // Антибиот. Химиотер. - 2002. - Т.47. - №6 - С. 31-33.

14. Mokrousov I., Otten T., Vyshnevskiy B., Narvskaya O. Detection of embB306 mutations in ethambutol-susceptible clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Northwestern Russia: implications for genotypic resistance testing // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40. - P. 3810-3813.

15. Mokrousov I., Narvskaya O., Otten T., Vyazovaya A., Limeschenko E., Steklova L., Vyshnevskyi B. Phylogenetic reconstruction within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in northwestern Russia // Res. Microbiol. - 2002. - Vol. 153. - P. 629-637.

16. Filliol I., Driscoll J.R., Van Soolingen D., Kreiswirth B.N., Kremer K., Valetudie G., Anh D.D., Barlow R., Banerjee D., Bifani P.J., Brudey K., Cataldi A., Cooksey RC, Cousins DV, Dale JW, Dellagostin OA, Drobniewski F, Engelmann G, Ferdinand S, Gascoyne-Binzi D, Gordon M, Gutierrez MC, Haas WH, Heersma H, Kallenius G, Kassa-Kelembho E, Koivula T, Ly HM, Makristathis A, Mammina C, Martin G, Mostrom P., Mokrousov I., et al. Global distribution of Mycobacterium tuberculosis spoligotypes // Emerg. Infect. Dis. - 2002. - Vol. 8. - P. 1347-1349.

17. Вишневский Б.И., Нарвская О.В., Васильева С.Н., Сапожникова Н.В., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф. Вирулентность микобактерий туберкулеза // Пробл. Туберк. - 2002. - №10. - С. 33-36.

18. Mokrousov I., Otten T., Vyshnevskiy B., Narvskaya O. Allele-specific rpoB PCR assays for detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears // Antimicrob. Agents Chemother. - 2003. ЦVol 47. - P. 2231-2235.

19. Mokrousov I., Otten T., Vyazovaya A., Limeschenko E., Filipenko M., Sola C., Rastogi N., Steklova L., Vyshnevskiy B., Narvskaya O. PCR-based methodology for detecting multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis Beijing family circulating in Russia // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 22. - P. 342-348.

20. Filliol I., Driscoll J.R., van Soolingen D, Kreiswirth BN, Kremer K, Valetudie G, Dang DA, Barlow R, Banerjee D, Bifani P, Brudey K, Cataldi A, Cooksey RC, Cousins D, Dale J, Dellagostin OA, Drobniewski F, Engelmann G, Ferdinand S, Gascoyne-Binzi D, Gordon M, Gutierrez MC, Haas WH, Heersma H, Kassa-Kelembho E, Ho M, Makristathis A, Mammina C, Martin G, Mostrom P, Mokrousov I., et al. Snapshot of moving and expanding clones of Mycobacterium tuberculosis and their global distribution assessed by spoligotyping in an international study // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41. - P. 1963-1970.

21. Оттен Т.Ф., Нарвская О.В., Олейник В.В., Мокроусов И.В., Лимещенко Е.В., Вязовая А.А., Вишневский Б.И. Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных полиорганным и генерализованным туберкулезом // Пробл. Туберк. Болезн. Легк. - 2003. - №10. - С. 44-47.

22. Сапожникова Н.В., Скворцова Л.А., Павлова М.В., Вишневский Б.И., Оттен Т.Ф., Васильева С.Н., Маничева О.А., Мокроусов И.В., Нарвская О.В. Туберкулез легких, вызванный Mycobacterium tuberculosis различных генотипов // Пробл. Туберк. Болезн. Легк. - 2003. - №10. - С. 13-15.

23. Норкина О.В., Киншт В.Н., Мокроусов И.В., Курунов Ю.Н., Краснов В.А., Филиппенко М.Л. Генетическое разнообразие Mycobacterium tuberculosis и оценка факторов риска распространения заболевания туберкулезом в Сибирском регионе России методами молекулярной эпидемиологии // Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. - 2003. - №3. - С. 9-18.

24. Матракшин А.Г., Месько Е.М., Белякова Н.К., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., Мокроусов И.В., Поспелов Л.Е. Генотипическая характеристика штаммов Mycobacterium tubercolosis из Республики Тыва // Пробл. Туберк. Болезн. Легк. - 2004. - №3. - С. 37-40.

25. Mokrousov I. Multiple rpoB mutants of Mycobacterium tuberculosis and second-order selection // Emerg. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 10. - P. 1337-1338.

26. Mokrousov I., Narvskaya O., Limeschenko E., Vyazovaya A., Otten T., Vyshnevskiy B. Analysis of the allelic diversity of the mycobacterial interspersed repetitive units in Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing family: practical implications and evolutionary considerations // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol. 42. - P. 2438-2444.

27. Mokrousov I., Bhanu N.V., Suffys P.N., Kadival G.V., Yap S.F., Cho S.N., Jordaan A.M., Narvskaya O., Singh U.B., Gomes H.M., Lee H., Kulkarni S.P., Lim K.C., Khan B.K., van Soolingen D., Victor T.C., Schouls L.M. Multicenter evaluation of reverse line blot assay for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // J. Microbiol. Methods. - 2004. - Vol. 57. - P. 323-335.

28. Оттен Т.Ф., Мокроусов И.В., Нарвская О.В., Вишневский Б.И. Возможности и перспективы микробиологической диагностики туберкулеза // Пробл. Туберк. Болезн. Легк. - 2004. - №5. - С. 32-35.

29. Сурикова О.В., Войтих Д.В., Кузьмичева Г.А., Татьков С.И., Мокроусов И.В., Нарвская О.В., Филипенко М.Л. Дифференциация микобактерий туберкулеза семейства W-Beijing, распространенных на территории Российской Федерации, на основе VNTR-типирования // Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. - 2005. - №3. - С. 22-29.

30. Surikova O.V., Voitech D.S., Kuzmicheva G., Tatkov S.I., Mokrousov I.V., Narvskaya O.V., Rot M.A., van Soolingen D., Filipenko M.L. Efficient differentiation of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing family from Russia using highly polymorphic VNTR loci // Eur. J. Epidemiol. - 2005. - Vol. 20. - P. 963-974.

31. Mokrousov I., Ly H.M., Otten T., Lan N.N., Vyshnevskyi B., Hoffner S., Narvskaya O. Origin and primary dispersal of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: clues from human phylogeography // Genome Res. - 2005. - Vol. 15. - P. 1357-1364.

32. Mokrousov I., Narvskaya O., Limeschenko E., Vyazovaya A. Efficient discrimination within a Corynebacterium diphtheriae epidemic clonal group by a novel macroarray-based method // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43. - P. 1662-1668.

33. Mokrousov I., Jiao W.W., Sun G.Z., Liu J.W., Li M., Narvskaya O., Shen A.D. Evaluation of the rpoB macroarray assay to detect rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in Beijing, China // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 25. - P. 703-710.

34. Mokrousov I., Jiao W.W., Sun G.Z., Liu J.W., Valcheva V., Li M., Narvskaya O., Shen A.D. Evolution of drug resistance in different sub-lineages within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype // Antimicrob. Agents Chemother. - 2006. - Vol. 50. - P. 2820-2823.

35. Mokrousov I., Jiao W.W., Valcheva V., Vyazovaya A., Otten T., Ly H.M., Lan N.N., Limeschenko E., Markova N., Vyshnevskiy B., Shen A.D., Narvskaya O. Rapid detection of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype and its ancient and modern sub-lineages by IS6110-based inverse PCR // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44. - P. 2851-2856.

36. Mokrousov I. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype and mycobacterial interspersed repetitive unit typing // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44. - P. 1614.

37. Brudey K., Driscoll J.R., Rigouts L, Prodinger WM, Gori A, Al-Hajoj SA, Allix C, Aristimuno L, Arora J, Baumanis V, Binder L, Cafrune P, Cataldi A, Cheong S, Diel R, Ellermeier C, Evans JT, Fauville-Dufaux M, Ferdinand S, Garcia de Viedma D, Ly HM, Martin C, Martin C, Mokrousov I., et al.. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for>

38. Мельникова Н.Н., Мокроусов И.В. Исследование резистентности к рифампицину L-форм микобактерий туберкулеза на основе анализа мутаций в гене rpoB //. Пробл. Туберк. Болезн. Легк. - 2006. - №11. - С. 22-24.

39. Mokrousov I., Narvskaya O. Designation of major MIRU types within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype // J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol. 45. - P. 4092-4093.

40. Mokrousov I. Towards a quantitative perception of human-microbial co-evolution // Front. Biosci. - 2007. - Vol. 12. - P. 4818-4825.

41. Mokrousov I., Narvskaya O., Limeschenko E., Vyazovaya A. Corynebacterium diphtheriae spoligotyping based on combined use of two CRISPR loci // Biotechnol. J. -2007. - Vol. 2. - P. 901-906.

42. Jiao W.W., Mokrousov I., Sun G.Z., Li M., Liu J.W., Narvskaya O., Shen A.D. Molecular characteristics of rifampin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Beijing, China // Chin. Med. J. (Engl.) - 2007. - Vol. 120. - P. 814-819.

43. Valcheva V., Mokrousov I., Rastogi N., Narvskaya O., Markova N. Molecular characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from different regions of Bulgaria // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - P. 1014-1018.

44. Jiao W.W., Mokrousov I., Sun G.Z., Guo Y.J., Vyazovaya A., Narvskaya O., Shen A.D. Evaluation of new variable-number tandem-repeat systems for typing Mycobacterium tuberculosis with Beijing genotype isolates from Beijing, China // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - P. 1045-1049.

45. Mokrousov I., Sapozhnikova N., Narvskaya O. Mycobacterium tuberculosis co-existence with humans: making an imprint on the macrophage P2X7 receptor gene? // J. Med. Microbiol. - 2008. - Vol. 57. - P. 581-584.

46. Mokrousov I., Otten T., Manicheva O., Potapova Y., Vishnevsky B., Narvskaya O., Rastogi N. Molecular characterization of ofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Russia // Antimicrob. Agents Chemother. - 2008. - Vol. 52. - P. 2937-2939.

47. Mokrousov I., Narvskaya O., Vyazovaya A., Millet J., Otten T., Vishnevsky B., Rastogi N. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in Russia: in search of informative VNTR loci // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - P. 3576-3584.

48. Маничева О.А., Ласунская Е.Б., Журавлев В.Ю., Оттен Т.Ф., Мокроусов И.В., Вишневский Б.И., Нарвская О.В. Лекарственная чувствительность Mycobacterium tuberculosis в сопоставлении с их жизнеспособностью, цитотоксичностью, генотипом и течением процесса у больных туберкулезом органов дыхания // Пробл. Туберк. Болезн. Легк. - 2008. - №12. - С.18-22.

49. Valcheva V., Mokrousov I., Narvskaya O., Rastogi N., Markova N. Utility of new 24-locus variable-number tandem-repeat typing for discriminating Mycobacterium tuberculosis clinical isolates collected in Bulgaria // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - P. 3005-3011.

50. Mokrousov I. Genetic geography of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multifacet mirror of human history? // Infect. Genet. Evol. - 2008. - Vol. 8. - P. 777-785.

51. Valcheva V., Mokrousov I., Narvskaya O., Rastogi N., Markova N. Molecular snapshot of drug-resistant and drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis strains circulating in Bulgaria // Infect. Genet. Evol. - 2008. - Vol. 8. - P. 657-663.

52. Xiao J., Sun L., Jiao W., Li Z., Zhao S., Li H., Jin J., Jiao A., Guo Y., Jiang Z., Mokrousov I., Shen A. Lack of association between polymorphisms in the P2X7 gene and tuberculosis in a Chinese Han population // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2009. - Vol. 55. - P. 107-111.

53. Mokrousov I., Otten T., Zozio T., Turkin E., Nazemtseva V., Sheremet A., Vishnevsky B., Narvskaya O., Rastogi N. At Baltic crossroads: a molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population diversity in Kaliningrad, Russia // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2009. - Vol. 55. - P. 13-22.

54. Mokrousov I., Valcheva V., Sovhozova N., Aldashev A., Rastogi N., Isakova J. Penitentiary population of Mycobacterium tuberculosis in Kyrgyzstan: Exceptionally high prevalence of the Beijing genotype and its Russia-specific subtype // Infect. Genet. Evol. - 2009 Aug 6. [Epub ahead of print] doi:10.1016/j.meegid.2009.07.007.

Список сокращений

МАС-ПЦР - мультиплексная аллель-специфическая ПЦР

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

пн - пар нуклеотидов

ПТП - противотуберкулезные препараты

ПЦР - полимеразная цепная реакция

DR - direct repeat (англ. прямой повтор)

EMB  - этамбутол

INH - изониазид

MCMC - Markov chain Monte-Carlo (построение цепи Маркова по алгоритму Монте-Карло)

MDR - multidrug resistant (англ. множественно-лекарственноустойчивый)

MDS - multidimensional scaling (англ. многомерное масштабирование)

MIRU - mycobacterial interspersed repeat units (англ. микобактериальные рассеянные повторы)

RFLP - restriction fragment length polymorphism (англ. полиморфизм длины рестрикционных фрагментов)

RIF -рифампицин

UPGMA - unweighted pair-group method of arithmetic averages (англ. невзвешенный попарный метод арифметических средних)

VNTR - variable number of tandem repeats (англ. вариабельное количество тандемных повторов)

1 База данных постоянно обновляется и 30 мая 2009 г. включала профили 1853 штаммов.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии