Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ДУДНИКОВ Максим Васильевич
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ЯРОВОЙ ТРИТИКАЛЕ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К ПАТОГЕННОМУ КОМПЛЕКСУ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФУЗАРИОЗА КОЛОСА В УСЛОВИЯХ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ
Специальность: 03.02.07 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва 2012
Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Соловьев Александр Александрович
Официальные оппоненты:
Джалилов Февзи Сеид-Умерович доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, лаборатория защиты растений, заведующий лабораторией Одинцова Татьяна Игоревна доктор биологических наук, доцент, ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, группа молекулярно-генетических основ иммунитета растений, руководитель группы, ведущий научный сотрудник
Ведущая организация: ГНУ Московский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Немчиновка Российской академии сельскохозяйственных наук
Защита состоится л19 декабря 2012 г. в 14-30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел./факс (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автореферат разослан л16 ноября 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Тритикале, будучи сравнительно новой зерновой культурой, сочетает в одном гибридном организме высокий потенциал продуктивности пшеницы и высокую устойчивость к экологическим стрессам и болезням ржи. Однако все чаще появляется информация о сильном поражении тритикале рядом болезней (ржавчина, фузариозы, мучнистая роса), ранее отсутствовавшими в посевах (Miedaner, 1997, Гагкаева, 2011). Одной из наиболее опасных и вредоносных из них является фузариоз колоса. Впервые заболевание описано Н.А. Пальчевским в 1891 г., а далее детально изучено М.В. Ворониным в 1892 г. Работы А.А. Ячевского (1904), Н.А. Наумова (1913) и И.И. Абрамова показали, что это заболевание является одним из наиболее распространённых у пшеницы, ржи, овса, ячменя в условиях теплого и влажного климата (Miedaner, 2002, Иващенко, 2004). Болезнь вызывает серьезные потери урожая и ухудшает хлебопекарные и кормовые качества.
Фузариозы зерновых культур относятся к числу наиболее опасных заболеваний растений. Главная особенность грибов рода Fusarium заключается в их способности накапливать продукты жизнедеятельности, большинство из которых токсичны для теплокровных. Микотоксины образуются при заражении зерновых культур грибами в поле, в собранном урожае, при хранении, а также при переработке зерна. Среди них такие опасные для человека и животных трихотеценовые токсины, как дезоксиниваленол (ДОН), ниваленол, Т-2, НТ-2, диацетоксисцирпинол (ДАС), зеараленон, монилиформин, фумонизины и др.
Интоксикация трихотеценовыми микотоксинами сопровождается поражением желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой и нервной систем (DТMello et al. 1995, Bottalico 1998, Foroud, 2011). Лабораторные исследования на клеточных тканях животных показали, что низкие концентрации этой группы токсинов обладают мутагенным действием, индуцируют хромосомные изменения, влияют на биосинтез белка (Тутельян, 1985, Ward et al, 2008).
Иммунных к фузариозу сортов зерновых культур нет, наблюдаются различия только по степени устойчивости растений к патогенам (Snijders, 1990). Поскольку устойчивость в значительной мере зависит от условий окружающей среды, то этот признак рассматривается как относительный показатель. Устойчивость растений зерновых культур к фузариозу колоса является неспецифической, т.е. устойчивость к одному виду патогена, вызывающему фузариоз колоса, проявляется и к другим видам Fusarium (F. graminearum, F. culmorum, F. avenaceum, F. sporotrichioides, F. poae, F. sambucinum, F. moniliforme). Выявлено также отсутствие специфических взаимодействий генотипа штамма с генотипом растения-хозяина и, как следствие, отсутствие рас у грибов, вызывающих фузариоз колоса (Miedaner, 1997). Существуют несколько типов физиологической устойчивости зерновых к фузариозу, которые не всегда связаны друг с другом: I - устойчивость к проникновению патогена; II - к распространению патогена по колосу; III - устойчивость зерен к заражению патогеном; IV - толератность; V - способность к аккумуляции и/или деградации микотоксинов (Mesterhazy, 1997).
Моносомный анализ показал участие в контроле устойчивости у пшеницы не менее 9 хромосом (6D, 6В, 5A, 1B, 2В, ЗВ, 4В, 4D, 7А). На основе оценки наследуемости устойчивости, авторы пришли к выводу о преимущественном проявлении аддитивных эффектов генов и к необходимости отбора генотипа по фенотипу. При этом выявлен полигенный тип наследования устойчивости и наличие трансгрессии по изучаемым признакам, в том числе и устойчивости к болезни (Miedaner, 2002, Иващенко, 2004, Liu et al., 2009, Buerstmayr et al., 2009, Rutkoski et al., 2012).
Селекция на устойчивость к фузариозу колоса затруднена вследствие большого числа возбудителей, особенностей их биологи и отсутствием эффективных доноров устойчивости. Особое значение приобретают начальные этапы селекционного процесса, на которых очень важно идентифицировать местные популяции патогенов и провести оценку селекционных образцов по устойчивости к фузариозу колоса. Выведение устойчивых сортов является наиболее оптимальным решением проблемы фузариозов (Miedaner, 2010, Аблова, 2010). Однако устойчивость к фузариозу колоса, будучи комплексным признаком, часто ассоциируется с нежелательными агрономическими признаками.
Цели и задачи работы. Цель работы - выявить полиморфизм яровой тритикале по устойчивости к патогенному комплексу возбудителей фузариоза колоса в условиях Московской области.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучить состав и структуру патогенного комплекса возбудителей фузариоза колоса в условиях Московской области.
2. Оценить патогенность и токсичность выделенных видов Fusarium ssp.
3. Подобрать и охарактеризовать оптимальный штамм для создания инфекционного фона фузариоза колоса.
4. Оценить сортообразцы на наличие внутренней инфекции (фузариоз зерна).
5. Оценить сортообразцы на естественном и искусственном инфекционных фонах по устойчивости к фузариозу колоса.
6. Подобрать оптимальные маркеры для отбора устойчивого материала к фузариозу колоса.
7. Изучить вредоносность фузариоза колоса яровой тритикале.
8. Оценить возможность передачи устойчивости к фузариозу от доноров на озимой пшенице.
9. Провести генетический анализ наследования устойчивости к фузариозу колоса.
Научная новизна.
Впервые показана необходимость видоспецифичной селекции яровой тритикале на устойчивость к фузариозу колоса к определенному возбудителю из группы Fusarium.
Изучена видовая и внутривидовая структура популяций возбудителей фузариоза колоса в условиях Московской области и изменчивость патогенных свойств грибов группы Fusarium sp.; теоретически обоснован состав искусственных инфекционных фонов; выделены патогенные виды и штаммы.
Показано, что для яровой тритикале наиболее информативной оценкой устойчивости к фузариозу колоса является искусственное заражение патогенными штаммами. Использование распространенных на пшенице показателей, ассоциированных с устойчивостью, таких как высота растения, визуальная оценка пораженности зерна на исследуемых образцах яровой тритикале не возможно.
Впервые на тритикале проведен анализ характера наследования устойчивости к фузариозу колоса на примере расщепления в гибридной комбинации Dublet Legalo. Показано, что различия между этими сортами по устойчивости к фузариозу колоса при инокуляции штаммом С99 F.culmorum обусловлены действием минимум двух генов.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Генетический полиморфизм яровой тритикале по устойчивости к фузариозу колоса.
2. Видовая и внутривидовая структура популяций возбудителей фузариоза колоса.
3. Видоспецифичность селекции яровой тритикале на устойчивость к фузариозу колоса.
4. Генетический контроль устойчивости к фузариозу колоса.
Практическая значимость. Результаты исследований имеют значение для целенаправленного поиска устойчивого исходного материала и создания эффективных источников и высокоурожайных, устойчивых к фузариозным болезням сортов; проведения диагностики фузариозов яровой тритикале.
Выделены сортообразцы яровой тритикале, обладающие полевой устойчивостью и толерантностью к фузариозным болезням, и предложена программа включения их в селекционный процесс.
Достоверность результатов. Эксперименты проведены в соответствии с общепринятыми методическими принципами. Достоверность выводов основывается на статистической обработке данных.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева (Москва, 2011), XII молодежной научной конференции, секция Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии в ГНУ ВНИИСБ Россельхозакадемии (Москва, 2012), Международной научно-практической конференции "Генетические основы селекции, растениеводства и биотехнологии (Киев, 2012), международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 125-летию академика Н.И. Вавилова (Москва, 2012), Международной летней школе Биотехнология в сельском хозяйстве (AgroBioTech-12) в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ и подана 1 заявка на селекционное достижение.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 135 страницах машинописного текста и включают 15 рисунков, 21 таблицу, приложение. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, заключения, списка литературы, списка иллюстративного материала и приложения. Список литературы включает 158 источников, из них 120 иностранных.
УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика погодных условий 2010-2012 гг.
Метеорологические условия 2010-2012 гг. в сравнении со среднемноголетними значениями характеризовались более высокими значениями температуры и меньшим количеством осадков (рис. 1).
35 2010 г.
2010 г.
2011 г.
2011 г.
2012 г.
2012 г.
Средне-многолет.
20 Средне-многолет м а й и ю н ь и ю л ь а в г у с т м ай июнь июль август апрель апрель май июнь июль август Рис. 1. Метеорологические условия 2010-2012 гг.
Объекты исследования. Материалом для изучения послужили образцов яровой гексаплоидной тритикале, а также 2 образца октаплоидной тритикале и 2 мягкой пшеницы. На фоне с искусственной инокуляцией F. culmorum протестирована популяция F3 растений, полученная от скрещивания сорта яровой гескаплоидной тритикале Dublet (обладает высокой полевой устойчивостью) с сортом яровой гескаплоидной тритикале Legalo (восприимчив на фоне с искусственной инокуляцией F. culmorum ). Кроме того, исследован материал озимой пшеницы, любезно предоставленный Л.А. Беспаловой и А.В. Васильевым (Краснодарский НИИСХ имени П.П. Лукьяненко), полученный с участием образца Sumai 3, несущего локус устойчивости к фузариозу Fhb1, и сортов Дельта и Дея (обладающие неспецифической устойчивостью к фузариозу колоса), так же сорта твердой пшеницы Карат и Леукурум 21 (поражаются в сильной степени).
Определение внутренней инфекции проводили по ГОСТ 12044-93.
Микологическую идентификацию грибов рода Fusarium spp.
осуществляли в соответствии с определителем (Билай, 1977) по Осадки, мм Температура воздуха, С морфологическим признакам. Молекулярно-генетическую идентификацию генотипов гриба осуществляли с использованием видоспецифических праймеров (Turner, 1998; Jurado, 2005).
Размножение мицелия для искусственной инокуляции проводили выращиванием культуры на стерильном зерне и на картофельно-глюкозном агаре.
Инокуляцию растений спорами грибов рода Fusarium проводили в фазу полного цветения методом распыления суспензии микроспор в поле.
Инокулюм готовили за несколько часов до заражения путем смыва инфекционного начала. Суспензию готовили из расчета 3Е5х106 пропагул гриба в 1 мл.
Оценку пораженности фузариозом проводили по поражению визуально согласно Miedaner с соавт. (2003) в баллах и по пораженности зерна при визуальном выявлении и подсчете пораженных и непораженных зерен.
Выделение тотальной ДНК из мицелия фузариума проводили по методике Mller с соавт. (1992) с модификациями.
Выделение ДНК осуществляли из молодых листьев и корешков по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.
Патогенность и фитотоксичность оценивали по ингибированию культуральным фильтратом роста корней и проростков растений по формуле:
Т = 100 % - ( Lon / Lk *100 ) Генетический анализ устойчивости к фузариозу осуществляли на расщепляющихся семьях F3, по проявлению фузариоза при искусственной инокуляции.
Статистический анализ результатов осуществляли с помощью пакетов программ MS Excell и AGROS2.11 (автор С.П. Мартынов).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Внутренняя инфекция зерна яровой тритикале в 2009Ц2011 гг.
Зараженность - это истинная инфицированность зерна, в том числе условно патогенными грибами, если были условия, благоприятствующие их проникновению внутрь через плодовую оболочку.
Оценка фузариоза зерна (ФЗ) среди всех изученных образцов коллекции яровой тритикале урожаев 2009-2011 гг. за указанные годы составила 4,95%, что находится на уровне экономически и биологически значимого порога в 5% (Гагкаева, 2011). Однако на суммарный показатель существенное влияние оказали погодно-климатические условия 2010 г. в котором средняя зараженность составила всего 2,67%, в то время как показатели 2009 и 2011 гг.
(6,51% и 5,67%) превосходили порог вредоносности, такая же тенденция отмечена и по встречаемости образцов с фузариозной инфекцией 35% в 2010 г.
и 86% и 78% в 2009 и 2010 гг. соответственно. Во многом различия в показателях зараженности по годам объясняются экстремальными погодными условиями в период вегетации растений в 2010 г. Так же на относительно невысокую среднюю зараженность, при почти 100% встречаемости образцов с фузариозной инфекцией, повлияла высокая зараженность семян грибом Alternaria alternata.
Образцы по степени зараженности фузариозом зерна были разделены на три группы: 0-5%, 6-10%, свыше 10%. В группу с незначительной зараженностью (табл. 1) за три исследуемых года попали 24 образца, зерно с их посевов можно использовать на семенные и продовольственные цели, однако, среди них нет ни одного районированного в нашей зоне сорта, что делает необходимой селекцию на устойчивость к фузариозным болезням.
Таблица Образцы яровой тритикале с фузариозом зерна ниже 5% Среднее за № п/п Сорт/образец 2009 г. 2010 г. 2011 г.
три года 1 Арта 59 3,0 1,0 4,0 2,2 Лена 1270 5,0 4,0 5,0 4,3 Dublet 0,0 0,0 0,0 0,4 Grego 5,0 3,0 5,0 4,5 popw 9 5,0 2,0 5,0 4,6 ПРАО-1 4,0 1,0 3,0 2,7 ПРАГ 418 3,0 1,0 3,0 2,8 ПРАГ 500/1 4,0 2,0 5,0 3,9 ПРАГ 511 4,0 2,0 4,0 3,10 ПРАГ 518 3,0 1,0 3,0 2,11 ПРАГ 553/2 4,0 3,0 5,0 4,12 ПРАГ 554 2,0 1,0 2,0 1,13 Л 12 4,0 1,0 3,0 2,14 Л 15 5,0 3,0 5,0 4,15 Л 22 4,0 2,0 4,0 3,16 Л 8-3 5,0 2,0 5,0 4,17 Л 8645 4,0 1,0 2,0 2,18 к - 1068 2,0 1,0 2,0 1,19 к - 1715 4,0 1,0 4,0 3,20 C 169 5,0 2,0 5,0 4,21 C 198 4,0 3,0 4,0 3,22 PI429082 3,0 2,0 3,0 2,23 PI520484 5,0 2,0 4,0 3,24 Amigo 5,0 2,0 3,0 3,Партии зерна с 10% поражением семян скрытой формой фузариоза для пищевых и семенных целей непригодны и могут использоваться только на фуражные цели после обеззараживания (Гагкаева, 2011). Причем скрытая инфекция, при высоком содержании токсинов, может сохраняться в зерне до 3 лет. В изученном нами генофонде только у образцов Legalo (Польша) и PI 429160 фузариоз зерна за исследуемый период был равен 10%. Большая часть коллекции - 74 образца попала в группу с низким накоплением внутренней инфекции (6-10%).
Видовой состав патогенного комплекса возбудителей фузариозов В результате проведенных исследований с зерна яровой тритикале в 20092011 гг. выделено 5559 штаммов грибов рода Fusarium ssp. (табл. 2).
Патогенный комплекс был представлен следующими видами - F. avenaceum, F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrichioides. F. poae. Преимущественное положение в комплексе занимал вид F. culmorum (61,22%), на втором месте, неизменно располагался F. graminearum (20%) именно эти виды считаются основными возбудителями фузариоза колоса и зерна в ЦентральноНечерноземной зоне. Они сходны по требованиям к теплу и влажности воздуха.
Таблица Виды Fusarium ssp., выделенные из зерна яровой тритикале в 2009-2011 гг.
№ Вид 2009 г. 2010 г. 2011 г. Всего 1 176* 92 156 4F. avenaceum 7,11%** 9,59% 7,34% 7,63% 2 460 190 462 11F. graminearum 18,58% 19,81 21,75% 20,00% 3 1696 449 1258 34F. culmorum 68,50% 46,82% 59,23% 61,22% 4 100 148 188 4F. sporotrichioides 4,04% 15,43% 8,85% 7,84% 5 44 80 60 1F. poae 1,78% 8,34% 2,82% 3,31% 6 Всего 2476 959 2124 55* выделено штаммов, шт.; ** процент от общего числа штаммов.
2009 и 2011 гг. характеризовались сходными погодными условиями (рис. 1) и структурой патогенного комплекса (табл. 2). В 2010 г. в период цветения-созревания яровой тритикале стояла сухая и жаркая погода, что отрицательно сказалось на развитии грибов рода Fusarium, поэтому было выделено на 62% и 55% меньше изолятов, чем 2009 и 2011 гг. соответственно.
Кроме того, существенно поменялась структура патогенного комплекса, снизилась доля F. culmorum (46,82%), а доля F. poae и F. sporotrichioides возрасла до 8,34% и 15,43%. Это объсняется тем, что F. poae и F. sporotrichioides относительно малотребовательны к теплу и влажности (Brennan et al., 2003; Doohan et al., 2003).
Патогенность и фитотоксичность штаммов группы Fusarium На пригодность создания инфекционного фона были протестированы, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов, следующие культуры мицелиальных грибов: Fusarium avenaceum штамм BKM F-2307, Fusarium culmorum штамм BKM F-844, Fusarium graminearum штамм BKM F1668, Fusarium poae штамм BKM F-1606, Fusarium sporotrichiodes штамм BKM F - 1667, а также штамм Fusarium culmorum C99, выделенный нами с зерна сортообразца яровой тритикале С 99 в 2009 г.
По токсиногенности штаммы возбудителей дифференцируют на группы:
Х нетоксичные - ингибирование роста растений 0Ц30%, Х слаботоксичные - ингибирование роста растений 31Ц50%, Х умеренно-токсичные - ингибирование роста растений 51Ц70%, Х токсичные - ингибирование роста растений свыше 70%.
Все исследуемые штаммы попали в группу нетоксичных, показатель токсичности (Т), изменялся от 0% у F. poae до 24,8% у F. culmorum штамм C(табл. 3).
Таблица Оценка токсичности штаммов грибов рода Fusarium на проростках яровой тритикале сортообразца 131/F.
F. F.
F. culmorum F.
Контроль culmorum F. poae avenaceum (BKM F-844) graminearum sporotrichioides (C 99) - 10,3 20,5 24,8 12,0 0,0 13,Генетический анализ исследуемых видов Fusarium Генетические и биохимические исследования, выполненные на ряде видов Fusarium, позволили идентифицировать ряд гомологичных генов вовлеченных в биосинтез трихотеценов.
Генетические различия по присутствию генов служат в основе идентификации отдельных видов. Разработаны видоспецифические праймеры, позволяющие проводить молекулярно-генетическую идентификацию видов. На примере, представленном на рисунке 2, показаны результаты ПЦР-реакции с изучаемыми штаммами гриба, позволяющие надежно производить видовую идентификацию. Для генетически близких видов F. сulmorum и F. graminearum необходимо использовать перекрестные тесты.
Морфолого-культуральная характеристика штамма C99 F. culmorum Морфолого-культуральные типы колоний гриба изучали на картофельноглюкозном агаре. С этой целью культуру высевали в тридцатикратной повторности в чашки Петри на картофельно-глюкозном агаре и выращивали в течение двух недель при температуре 22-24С. Оценку морфологокультуральных признаков (МКП) колоний грибов проводили по цвету и топографии воздушного и субстратного мицелиев, спорулирующей активности на 12-14 день роста колоний (табл. 4). Для получения суспензии спор каждую колонию гриба смывали 30 мл дистиллированной стерильной воды. Для отделения конидий от мицелия суспензию тщательно встряхивали в течение 10 мин на качалке при режиме 200 оборотов в минуту. В камере Горяева под микроскопом подсчитывали количество конидий.
Спорулирующую способность колоний гриба рассчитывали по формуле:
С = 7,5 * n / 25 = 0.3 * n, где: С - споруляция гриба (млн.кон./чашку Петри);
n - количество конидий в 25 клетках камеры Горяева;
7,5 - переводной коэффициент;
25 - количество, просмотренных клеток камеры Горяева.
Рис. 2. Электрофорез продуктов амплификации ПЦР-реакции с видоспецифическими праймерами. Верхний ряд: 1-10 - реакция с праймерами на F. culmorum, 12-17 - реакция с праймерами на F. sporotrichioides, 18-24 реакция с праймерами на F. рoae: 1, 2 - F. culmorum; 3, 4 - F. culmorum; 5, 6 - F. рoae; 7, 8 - F. culmorum; 9, 10 - F.graminearum;11 - М - 100-bp ladder; 12, 13 - F. sporotrichioides; 14, 15 - F. avenaceum; 16, 17 - F. culmorum; 18, 19 - F. poae; 20, 21 - F. sporotrichioides; 22, 23 - F. graminearum; 24, 25 - F. avenaceum.
Нижний ряд: 1-15 - реакция с праймерами на F. graminearum 17-24 - реакция с праймерами на F.avenaceum: 1, 2, 3 - F. sporotrichioides; 4, 5 - F. poae; 6, 7 - F. сulmorum; 8, 9 - F. avenaceum; 10, 11 ЦF. poae; 12, 13 - F. culmorum; 14, 15 - F. graminearum; 16 - М - 100bp ladder; 17, 18 - F.avenaceum; 19, 20 - F. graminearum; 21, 22 - F. сulmorum; 23, 24 - F. sporotrichioides.
Таблица Морфолого-культуральные признаки штамма F. culmorum C Описание МКП Споруляция Размер воздушный субстратный (млн.кон./чашка макроконидий Петри) с 5 перегородками мицелий мицелий Ватообразный, сливяный 5 - 180 5Ц8 30Ц45 мкм рыхлый или густой, светло- розовый, иногда цвета расположены концентическими кольцами Выбор штамма для создания инфекционного фона Среди достаточно большого количества видов, вызывающих фузариоз колоса, наибольшее распространение имеют F. culmorum и F. graminearum.
Сравнение показателей - поражения колоса (FHB), снижения продуктивности (FDK) и поражения зерна при искусственном заражении штаммами этих видов показала наибольшую эффективность использования штамма С99 вида F. culmorum (табл. 5).
Таблица Диапазон изменения иммунологических показателей для 17 генотипов яровой тритикале после искусственной иннокуляции F. culmorum и F. graminearum F. culmorum С99 F. graminearum Признак min max среднее min max среднее FHB, % 0,0 45,6 6,8 0,0 10,0 1,FDK, % 21,4 49,5 43,8 33,4 49,3 45,ФЗ,% 0,0 14,0 5,3 0,0 14,0 2,Оценка по 0,0 5,0 1,8 0,0 5,0 1,зерну, балл Тесная корреляция, обнаруженная между поражением зерна, снижением продуктивности и искусственной инокуляцией F. culmorum штаммом C99, обеспечивает возможность отбора одновременно на два типа устойчивости (табл. 6).
Таблица Взаимосвязь иммунологических показателей для 17 генотипов яровой тритикале после искусственной иннокуляции F. culmorum и F. graminearum FDK, % ФЗ,% FHB, % F. F. F.
F. F. F.
culmorum culmorum culmorum graminearum graminearum graminearum С99 С99 СФЗ,% -0,35 -0,21 - - - - FHB, % -0,62* 0,20 -0,02 0,01 - - Оценка по зерну, балл -0,75** 0,01 0,52* 0,01 0,35 0,Различия в коэффициентах корреляции по типам устойчивости у разных видов фузариума делает необходимым отбор устойчивых генотипов не только на разные типы устойчивости, но и к разным видам.
Оценка устойчивости образцов яровой тритикале на естественном инфекционном фоне Изучение анализируемого генофонда яровой тритикале на естественном фоне не показало большой дифференциации по устойчивости. У изученных образцов, лишь у 33 было выявлено незначительное поражение (не более 10% растений), развитие болезни не превышало 4-х баллов (поражено до 30% колоса), однако была обнаружена закономерность - наличие опушения колоса повышает вероятность заражения. У всех 33 сортообразцов, имевших признаки поражения, колос был опушен и, чем, сильнее был выражен данный признак, тем выше процент поражения. Для более точного разделения имеющихся образцов по уровню устойчивости была проведена инокуляция.
Изучение характера и уровня вредоносности фузариоза колоса яровой тритикале Фузариоз колоса снижает все показатели продуктивности и высоту растений яровой тритикале по мере увеличения степени поражения растений фузариозом колоса (рис. 2).
Поражение, балл Поражение, балл Поражение, балл Поражение, балл Рис. 3. Снижение показателей продуктивности растений яровой тритикале сортообразца 131/Негативное влияние болезни проявилось в снижении озерненности колоса на 77% у сильно восприимчивых растений (9 баллов), что сказалось на продуктивности. По мере увеличения пораженности снижалась выполненность зерна, оно формировалось сильнопленчатое, что обеспечило снижение массы зерна с колоса с 1,93 г до 0,14 г (на 93%). Растения с симптомами фузариоза колоса достоверно отличались по высоте от здоровых (ниже на 13%). Это во многом объясняется микроклиматическими особенностями внутри посева - чем ближе к почве, тем оптимальнее условия для развития патогена (дольше сохраняется роса, прохладнее днем и т.д.).
Проявление устойчивости образцов яровой тритикале по годам исследования (на основе FHB-индекса) В отличие от естественного фона оценка в условиях искусственного заражения показала изменение поражения фузариозом колоса от 0 до 100%, а уровень развития достигал 100%, что характеризует искусственный инфекционный фон как жесткий. Это позволило объективно оценить исходный материал по устойчивости к фузариозу колоса.
Был рассчитан индекс для каждого генотипа (FHB-индекс), на основе средневзвешенного значения за три года, с использованием поправочных коэффициентов, полученных на основе изучения стандартов (Snijders, 1990):
FHB-индекс,%=(0,44*FHB2010 + 0,97*FHB2011 + 1,59*FHB2012)/Коэффициенты перед показателями каждого года рассчитывали на основе показателей поражения 6 сортов-стандартов - Укро, Ярило, Abaco, Лана, 131/7, Ульяна (табл. 7). Изучение стандартов показало, что в 2011 и 2012 гг. болезнь развивалась существенно сильнее, чем в 2010 г. Среднее значение поражения фузариозом колоса у 6 стандартов было 10,40%, 22,96%, 37,68% для 2010, 20и 2012 гг., соответственно, со средним значением за три года 23,68%.
99 испытуемых генотипа яровой тритикале по устойчивости к фузариозу колоса на основе FHB-индекса разделены на 4 группы:
1. Устойчивые 0-5%, R - 8 образцов;
2. Среднеустойчивые6-15%, MR - 24 образца;
3. Средневосприимчивые 16-65%, MS - 64 образцов 4. Восприимчивые 66-100%, S - 3 образца.
Устойчивые и восприимчивые образцы приведены в таблице 8.
Таблица Поражение сортов-стандартов фузариозом колоса в 2010-2012 гг.
2012 г. 2011 г. 2010 г.
Сорт FHB, % FHB, % FHB, % Укро 43,5 17,9 45,Ярило 10,5 6,5 0,Abaco 42,3 59,4 5,Лана 79,0 25,1 11,131/7 18,3 23,2 0,Ульяна 32,5 5,7 0,Среднее 37,7 23,0 10,значение Таблица Устойчивые и восприимчивые к фузариозу колоса коллекционные образцы яровой тритикале Устойчивые 0-5%, R Dublet, PI429157, 131/7188, PI429251, PI428835, Presto/Tesmo, 25АД20, к-12Восприимчивые 66-100%, S Л 8-3, к-3256, Л 81Оценка коллекции сортообразцов яровой тритикале по признакам поражения фузариозом Kolb и Boze (2003) предложили использовать в дополнение к FHBиндексу, индекс ISK учитывающий несколько показателей поражения фузариозом колоса: I - поражение фузариозом, S - развитие болезни на колосе (FHB-индекс), и K - снижение продуктивности (FDK). Для расчета ISK используются поправочные коэффициенты 0,3, 0,3 и 0,4 (для I, S K соответственно).
ISK= (0,3 Inc(%)) + (0,3 Sev(%)) + (0,4 FDK(%)) На основе расчета индекса выделены наиболее перспективные источники устойчивости, которые могут быть включены в селекционные программы:
PI429157, Dublet, 131/7188, С 169, ПРАГ 511, PI520484, к-1200, Grego, PI429251, Presto/Tesmo. Эти сортообразцы имели значение показателя до 25% (табл. 9, выделены серой заливкой).
Таблица Характеристика коллекционных образцов яровой тритикале по ISK-индексу Сорт/ сортобразец ISK Сорт/ сортобразец ISK PI429157 17,39 Legalo 52,Dublet 18,00 Abaco 52,131/7188 19,10 Popw9 53,С 169 19,44 ПРАГ 554/2 53,ПРАГ 511 20,88 Лана 54,PI520484 21,01 к-3256 54,к-1200 21,08 Л 12 54,Grego 22,75 Укро 56,PI429251 24,36 PI587279 56,Presto/Tesmo 24,51 С 198 58,ПРАГ 518 25,75 Лена 1270 58,Арта 59 26,44 Л 8112 59,PI429160 26,61 Л 13 60,PI428835 26,65 Л 8-3 60,С 17 26,90 Л 8120 60,Е Е С 99 63,Взаимосвязи между изучаемыми признаками поражения фузариозом Считается, что в эколого-генетической экспрессии устойчивости могут участвовать и другие наследуемые признаки, определяющие конституционный иммунитет растений. Есть сведения о связи устойчивости к фузариозу колоса с высотой растений и скороспелостью, являющимися, при определенных условиях, важными элементами защиты (Ablova, Slusarenko, 1996).
В наших исследованиях достоверные взаимосвязи отмечены только между поражением колоса и поражением зерна и только для 2010 и 2011 гг. (табл. 10).
Эти данные существенно разнятся с результатами других авторов, полученными на пшенице. Возможно, это обусловлено сложившимися погодно-климатическими условиями и биологическими особенностями яровой тритикале, среди которых могут быть открытый тип и продолжительность цветения.
Таблица Взаимосвязь между признаками поражения фузариозом и высотой растения Признак FDK Поражение зерна Высота растения FHB2010 0,08 0,52* -0,FHB2011 -0,11 0,63* -0,FHB2012 -0,31 0,08 0,FDK2010 - 0,04 0,FDK2011 - 0,10 -0,FDK2012 - -0,26 0,Поражение зерна 2010 0,04 - -0,Поражение зерна 2011 0,10 - 0,Поражение зерна 2012 -0,26 - -0,Генетический анализ устойчивости яровой тритикале к фузариозу колоса Устойчивость к фузариозу колоса - полигенный признак, однако для пшеницы выделены несколько локусов, определяющих изменчивость данного признака. Для тритикале практически отсутствуют данные по генетическому контролю устойчивости к фузариозу колоса. Первоначальный отбор различающихся по проявлению устойчивости сортообразцов тритикале основывался на оценке поражения колоса и зерна. В соответствии с результатами оценок отобраны наиболее устойчивые и поражаемые сортообразцы, которые были включены в скрещивания. Для гибридологического анализа была взята комбинация скрещивания между сортообразцами из Польши Dublet и Legalo, в дополнение характеризующиеся высокой продуктивностью в наших условиях.
Анализ расщепления, выполненный на семьях поколения F3, показал различия в генетическом контроле признака устойчивости к фузариозу колоса у изученных сортов по двум генам. У одного из этих генов наблюдается неполное доминирование и доминантная гомозигота по нему является супрессором по отношению к другому гену, что дает соотношение фенотипов 7:6:3. Проверка этой гипотезы, выполненной в целом по семьям с использованием 2, а также внутри семей среднеустойчивых растений F3, подтвердила данную гипотезу (табл. 11).
Таблица Наследование устойчивости к фузариозу колоса у яровой тритикале Реакция по устойчивости к фузариозу колоса Комбинация скрещивания, средне- воспри(для 7:6:3) устойчивые всего поколение устойчивые имчивые Dublet Legalo, F2 39 32 10 81 2,Среднеустойчивые 16 10 6 32 0,семьи FМаркирование локуса устойчивости к фузариозу колоса Fhb Для повышения качества зерна тритикале широко используются скрещивания тритикале с сортами пшеницы, характеризующимися высокими показателями качества. К продовольственному зерну предъявляются более высокие требования, в том числе и по поражению и контаминации микотоксинами. В качестве основных доноров устойчивости к фузариозу колоса в мире используются несколько сортов-доноров пшеницы, в частности Sumai 3, Nobeokabozu komugi, Frontana, Ringo Star, Arina и их производные. В ходе наших исследований с помощью молекулярного маркера Wms493, локализованного в QTL-локусе Fhb1, была проведена оценка 19 линий гибридного происхождения (5-7 поколения) Краснодарского НИИСХ имени П.П. Лукьяненко, полученные с участием образца Sumai 3, несущего данный локус (QTLfhs.3BS), а также сортов Дельта и Дея. Сопоставление результатов их оценки по поражению в условиях Краснодарского края и наличием маркера не позволило обнаружить достоверной корреляции между устойчивостью и маркером.
Это может быть объяснено сочетанием неспецифической устойчивости к фузариозу колоса у сортов Дельта и Дея со специфической устойчивостью от Sumai 3. Использование этого маркера на мягкой пшенице позволило выделить из этого набора 4 линии (170 f 12, 170 f 4, 170 f 3, 13-04 f 10), сочетающие в себе два типа устойчивости и их использование в селекции на создание устойчивых к фузариозу сортов более приоритетно.
Изучение другой группы линий - сортообразцов твердой пшеницы, полученных от скрещивания Sumai 3 с сортами Карат и Леукурум 21 показало, что они все поражаются фузариозом в сильной степени, несмотря на присутствие в одной из линий локуса Fhb1. В целом, полученные на пшенице результаты использования маркера Wms493 показали эффективность его применения на мягкой пшенице, тогда как на исследованном наборе линий твердой пшеницы не возможно сделать однозначные выводы о его применимости.
Рис. 4. Электрофорез продуктов амплификации ПЦР-реакции маркера Wms4на тритикале и пшенице (1, 2 - Dublet; 3, 4 - Legalo; 5, 6 - 131/7; 7, 8 - С169; 9, 10 - С99; м - маркер молекулярного размера; 12, 13 - пшеница Sumai 3; 14, 15 - Лана; 16, 17 - Укро; 18 - 20 - Лена 1270).
Изучаемые сортообразцы яровой тритикале имеют различное происхождение и были выведены в разное время, что предполагает вероятность присутствия локуса Fhb1. Применение маркера Wms493 на изучаемой коллекции не выявило присутствия аллеля, сцепленного с устойчивостью к фузариозу, как у устойчивых, так и у неустойчивых сортообразцов (рис. 4).
Передача признака устойчивости к фузариозу колоса в яровую тритикале от доноров озимой пшеницы сопровождается дополнительными проблемами, связанными с расщеплением по типу развития, а также нарушениями в мейозе у отдаленного гибрида. Однако, по нашему мнению, применение данного маркера может облегчить данный перенос.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе впервые выполненных комплексных исследований яровой тритикале на устойчивость к фузариозу колоса выявлен патогенный комплекс фузариоза, из которого на основе сравнительного анализа был выделен наиболее агрессивный штамм С99 F. culmorum для создания инфекционного фона.
Установлено, что образцы тритикале различаются по степени поражения фузариозом колоса. На основе оценок признаков поражения фузариозом дана характеристика сортообразцов по степени устойчивости. Выделены перспективные образцы для включения в селекционно-генетические исследования устойчивости к фузариозу колоса яровой тритикале. Проведен генетический анализ наследования признака устойчивости, который показал наличие олигогенного контроля устойчивости в комбинации скрещивания Legalo Dublet, генетические различия между которыми могут быть объяснены действием двух генов. Показано, что молекулярный маркер Wms493, локализованный в локусе количественного признака QTLfhs.3BS, который эффективен для озимой мягкой пшеницы, не может быть использован для оценки исследуемой коллекции яровой тритикале.
ВЫВОДЫ 1. Установлен полиморфизм яровой тритикале по проявлению устойчивости к фузариозу колоса на естественном фоне. Среди изученных образцов у 33 было выявлено незначительное поражение (не более 10% растений), развитие болезни не превышало 4-х баллов (поражено до 30% колоса).
2. Патогенный комплекс фузариоза яровой тритикале представлен видами F. avenaceum, F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrichioides. F. poae.
С зерна яровой тритикале в 2009-2011 гг. выделено 5559 штаммов грибов рода Fusarium ssp. Преимущественное положение в комплексе занимал вид F. culmorum (61,2%).
3. Все исследуемые штаммы попали в группу нетоксичных, показатель токсичности изменялся от 0% у F. poae. Наиболее токсичным оказался у F. culmorum штамм C99, для которого токсичность составила 24,8%.
4. Для яровой тритикале необходимо производить отбор устойчивых генотипов не только на разные типы устойчивости, но и к разным видам, о чем свидетельствуют тесная корреляция между визуальной оценкой поражения зерна, снижением продуктивности (FDK) и искусственной иннокуляцией F. culmorum штаммом C 99.
5. Установлено, что по степени зараженности фузариозом зерна группируются на три группы - до 5%, 6-10%, свыше 10%. В группу с незначительной зараженностью за три исследуемых года попали 24 образца (одна четвертая часть коллекции), зерно с таких посевов можно использовать на семенные и продовольственные цели, однако среди них нет ни одного районированного в Московской области сорта, что делает необходимой селекцию на устойчивость к фузариозным болезням.
6. Установлен характер наследования устойчивости яровой тритикале к фузариозу колоса, вызываемого F. culmorum, на примере комбинации скрещивания Dublet Legalo, генетические различия между которыми обусловлены минимум двумя генами.
7. Выделены образцы с высокой устойчивостью: Dublet, PI429157, 131/7188, PI429251, PI428835, Presto/Tesmo, 25АД20, к-1200, которые мы рекомендуем к включению в программу скрещиваний при создании сортов яровой тритикале устойчивых к фузариозу колоса. Практическим иммунитетом к болезни в полевых условиях обладал только сорт Dublet (Польша).
8. На основе изучения яровой тритикале сортообразцы PI429157, Dublet, 131/7188, С169, ПРАГ 511, PI520484, к-1200, Grego, PI429251, Presto/Tesmo могут быть рекомендованы в исследованиях устойчивости к фузариозу колоса. Из отечественных сортов наименьший уровень поражения имеет сорт Ярило. Данный сорт мы рекомендуем использовать в годы, когда прогнозируется высокий уровень развития фузариоза колоса.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1. Дудников М.В., Шанин М.С. Оценка коллекции яровой тритикале по наличию скрытого заражения грибами рода Fusarium ssp. // Международная научная конференция молодых ученых и специалистов: Сборник статей. М.:
Изд-во РГАУ-МСХА, 2012.- Т. 1.- С. 24-27.
2. Дудников М.В., Шанин М.С., Васильев А.В., Дивашук М.Г.
Характеристика образцов озимой пшеницы по наличию локуса FHB1 и устойчивости к фузариозу колоса// Сборник тезисов участников XII молодежной научной конференции Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии, посвященной памяти академика РАСХН Георгия Сергеевича Муромцева.- Москва, 2012.- С. 23-34.
3. Дудников М.В., Шанин М.С., Соловьев А.А. Оценка образцов яровой тритикале по устойчивости к фузариозу колоса (Fusarium ssp.)// Збiрка тез доповедей учасникiв Мiжнародноi науково-практичноi конференцii "Генетiчнi основи селекцii, насiнництва i бiщтехнологiй: наука, освiта, практика".- Киев, 2012.- С. 62-63.
4. Беспалова Л.А., Васильев А.В., Аблова И.Б., Филобок В.А., Худокормова Ж.Н., Давоян Р.О., Давоян Э.Р., Карлов Г.И., Соловьев А.А., Дивашук М.Г., Майер Н.К., Дудников М.В., Мироненко Н.В., Баранова О.А.
Применение молекулярных маркеров в селекции пшеницы в Краснодарском НИИСХ им. П.П. Лукьяненко // Вавиловский журнал генетики и селекции, 2012.- Т. 16, № 1.- C. 37-43.
5. Bespalova L.A., Vasilyev A.V., Ablova I.B., Filobok V.A., Khudokormova Zh.N., Davoyan R O., Davoyan E.R., Karlov G.I., Soloviev A.A., Divashuk M.G., Mayer N.K., Dudnikov M.V., Mironenko N.V., and Baranova O.A.
The Use of Molecular Markers in Wheat Breeding at the Lukyanenko Agricultural Research Institute (Применение молекулярных маркеров в селекции пшеницы в Краснодарском НИИСХ им. П.П. Лукьяненко) // Russian Journal of Genetics:
Applied Research, 2012.- Vol. 2, No. 4.- Р. 286-290.
6. Соловьев А.А., Дудников М.В., Шанин М.С. Полиморфизм яровой тритикале по устойчивости к фузариозу колоса // Вестник СГАУ, 2012.- № 11.- С. 23-29.
7. Соловьев А.А., Дудников М.В., Рубан А.С., Гущин А.В., Князев А.Н. Заявка на выдачу патента на селекционное достижение №58651/87556от 01.08.2012.