Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

ПОЛУЭКТОВА

ЕЛЕНА  УЛЬРИХОВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И СТРУКТУРА ПЛАЗМИД

ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ BACILLUS SUBTILIS

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва

2010

Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов

Учреждения Российской академии наук

Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

  Александр Александрович Прозоров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

  Элеонора Суреновна Пирузян

доктор биологических наук, профессор

Юлия Михайловна Романова

доктор биологических наук

Ирина Владимировна Еланская

Ведущая организация : Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (г.Москва)

Защита диссертации состоится л20_____мая____2010 года в____час.____мин.

на заседании диссертационного Совета (Д 002.214.01) при Учреждении Российской  академии  наук  Институте  общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН

по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул.Губкина, 3, факс (499)132-89-62, E-mail: aspirantura@vigg.ru

C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН

Автореферат разослан л_____________________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета,

кандидат биологических наук  Т.А.Синельщикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Bacillus subtilis является вторым по значимости (после E.coli) объектом бактериальной генетики и физиологии и наиболее изученным видом грам-положительных бактерий. Ряд свойств B. subtilis делают ее перспективным объектом генетической инженерии. B.subtilis экологически безопасна: она исходно непатогенна, и организм человека не является для нее постоянным хозяином. B.subtilis не требовательна к условиям роста. Как и другие бациллы, B.subtilis  секретирует белки в культуральную среду и служит важным промышленным объектом для получения различных ферментов. Одной из старейших областей применения B.subtilis является использование ее для ферментация соевых бобов; получаемые пищевые продукты широко распространены в странах юго-восточной Азии. Штаммы B.subtilis используются и в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных ДНК и продукции в их клетках чужеродных  белков. В  сельском хозяйстве используется также способность штаммов B.subtilis подавлять рост патогенов растений.

Для лабораторного штамма B.subtilis 168 была определена полная нуклеотидная последовательность генома (Kunst et al., 1997). Дальнейшее изучение генетики  этой бактерии требует определения нуклеотидных последовательностей и исследования функциональной активности внехромосомных компонентов генома - плазмид и фагов, а также изучения особенностей строения геномов других штаммов B.subtilis, используемых в промышленном производстве и выделяемых из природных источников.

абораторный штамм B.subtilis 168  не содержит плазмид. Долгое время в качестве векторов для клеток B.subtilis использовались плазмиды других грам-положительных микроорганизмов - стафилококков и стрептококков. Позже плазмиды были обнаружены в клетках некоторых природных и промышленных штаммов B.subtilis;  подавляющее их большинство не влияет на проявление каких-либо заметных свойств бактериальной клетки, т.е. плазмиды являются криптическими.

Многие крупные плазмиды различных микроорганизмов несут гены, определяющие способность бактериальных клеток к конъюгации. До недавнего времени считалось, что основными способами горизонтального переноса генов у B.subtilis являются трансформация и трансдукция. К началу нашей работы была описана лишь одна  конъюгативная  плазмида из штамма B.subtilis (natto); конъюгация происходила с низкой частотой и осталась практически неисследованной. Таким образом, существовало несоответствие между изученностью и востребованностью B.subtilis и отсутствием  сведений о плазмидах этого микроорганизма, а также их участия в процессе конъюгации.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение структуры и функций криптических плазмид из коллекций природных штаммов B. subtilis, выделенных из почв Москвы, Московской области и различных районов Белоруссии. Особое внимание было уделено поиску и изучению конъюгативных плазмид B.subtilis.

В задачи исследования входило:

1.Поиск и характеристика криптических плазмид из природных штаммов B.subtilis, относящихся к московской и белорусской коллекциям.

2.Определение нуклеотидной последовательности некоторых мелких плазмид и их фрагментов.

3.Рестрикционный и гибридологический анализ мелких плазмид, позволяющий установить степень их родства и наличие у них тех или иных генов.

4.Поиск в природных штаммах B.subtilis крупных плазмид, способных осуществлять конъюгативный перенос ДНК.

5.Характеристика процесса конъюгации, осуществляемого плазмидами из природных штаммов B.subtilis.

6.Определение нуклеотидной последовательности и изучение строения генов tra-района конъюгативных плазмид из природных штаммов B.subtilis.

Научная новизна. С использованием методов рестрикционного анализа, гибридизации, секвенирования впервые проведено широкомасштабное исследование большого числа мелких криптических плазмид из природных штаммов B.subtilis; охарактеризованы гены плазмид и относительные частоты их встречаемости. У плазмид B.subtilis впервые идентифицированы новые ген (hsp, ген белка теплового шока) и IS-элемент (ISBsu2 семейства  IS256).

В природных штаммах B.subtilis обнаружены две плазмиды, способные к конъюгативному переносу ДНК. Одна из обнаруженных конъюгативных плазмид, р19, осуществляет с высокой частотой как мобилизацию мелких плазмид, так и самоперенос  в клетки различных видов бацилл; эти особенности плазмиды являются уникальными и делают ее удобным инструментом для дальнейших исследований в области генетики B.subtilis и других бацилл.

Впервые у B.subtilis определена нуклеотидная последовательность части (33,5 тпн из 95 тпн) крупной конъюгативной плазмиды (р19), в том числе значительная часть tra-района (19,9 тпн).  Оказалось, что tra-район плазмиды р19 имеет сходство с tra-районами различных грам-положительных микроорганизмов (Clostridium, Bacillus, Listeria, Exiguobacterium), однако отличается от них.

Благодаря полученным в работе данным удалось впервые показать, что  конъюгация играет существенную роль в горизонтальном переносе генов у штаммов B.subtilis.

Научно-практическая значимость. Полученные в работе данные о распространении и строении плазмид, содержащихся в штаммах бацилл,  могут быть рекомендованы к использованию в работах по генетике, экологии и эволюции микроорганизмов, а также генной инженерии. Данные о распространении ISBsu2 среди штаммов бацилл могут быть использованы для маркирования природных и промышленных штаммов этого микроорганизма. Обнаруженная и исследованная в работе высокоэффективная система конъюгации, определяемая плазмидой р19, может быть использована в лабораторной практике и биотехнологических работах для осуществления переноса плазмидных и хромосомных генов.

Положения, выносимые на защиту.

1.Значительное количество природных штаммов B.subtilis содержит плазмиды, преимущественно мелкие. Мелкие  плазмиды имеют генетические модули mob, hsp, rap; частота распространения модулей различна. Мелкие плазмиды, выделенные из различных штаммов, достаточно однородны.

2.В геноме ряда природных штаммов B.subtilis присутствует новый IS-элемент ISBsu2 (семейства IS256).

3.Крупная плазмида р19 из почвенного штамма B.subtilis обусловливает конъюгативный перенос мелких плазмид и самоперенос с высокой частотой в клетки различных видов бацилл.

4.tra-район плазмиды р19 имеет сходство с tra-районами грам-положительных бактерий различных видов, однако  отличается от них.

5.Конъюгация играет значительную роль в процессах горизонтального переноса генов у B.subtilis и близких к ней видов бацилл .

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на 12-ом европейском совещании по переносу и экспрессии бактериальных генов (Сиена, Италия, 1996); международном конференции по бациллам (Осака, Япония, 1998); 13-ом европейском совещании по трансформации (Кайзерслаутерн, Германия, 1999); международном симпозиуме Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология (Москва, 2001);  III Съезде ВОГИС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004); международной школе-конференции Генетика микроорганизмов и биотехнология, посвященной 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна (Москва-Пущино, 2006); международной научной конференции Микроорганизмы и биосфера (Москва, 2007); международной научной конференции Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты (Минск, 2008); съезде генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Ч.Дарвина, и V съезде ВОГиС (Москва, 2009); научном семинаре отдела генетических основ биотехнологии ИОГен РАН (2009).

По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ.

Благодарности. Я приношу свою искреннюю благодарность сотрудникам и аспирантам лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН, заведующему лабораторией д.б.н., профессору В.Н.Даниленко, моему научному консультанту д.б.н., профессору А.А.Прозорову за помощь и плодотворное сотрудничество; П.Б.Торстеду (Университет г.Бирмингема, Великобритания), С.Брону и С.Хольсаппелю (Университет г.Гронингена, Нидерланды) за совместную работу по определению нуклеотидной последовательности мелких плазмид; сотрудникам ИППИ РАН М.С.Гельфанду и С.А.Родионовой за помощь в анализе нуклеотидных последовательностей. Работа была поддержана грантами INTAS (№ 97-1464); РФФИ  (01-04-49497а; 04-04-48078а; 07-04-00911а); РФФИ-БеРФФИ (04-04-81021-Бел2004).

ичный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в разработке плана экспериментов, их осуществлении, анализе и обобщении полученных результатов. Суммарный личный вклад автора в  данном исследовании составляет около 80%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 218 страницах, содержит 43 рисунка и 31 таблицу и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,  результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы (включающего 327 источников) и двух приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.Использованные в работе коллекции природных штаммов B.subtilis.

В нашем распоряжении были две коллекции природных штаммов B.subtilis. В лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН Ю.Е.Козловским были выделены из почв Москвы и Московской области 129 штаммов почвенных бацилл, близких к типовому лабораторному штамму B.subtilis 168 (Козловский, Прозоров, 1981). Эти штаммы составили т.н. московскую коллекцию штаммов B.subtilis. 32 штамма коллекции были ранее проверены на наличие плазмидной ДНК; в 19 штаммах были обнаружены мелкие плазмиды. Все исследованные штаммы были чувствительны к 6 антибиотикам (Ap, Сm, Em, Km, Rif, Tc); вероятно, обнаруженные плазмиды являются криптическими  (Незаметдинова и др., 1992). Детальное изучение этих плазмид из 19 штаммов московской коллекции составляет предмет данной работы.

  Нами были проверены еще 42 штамма московской коллекции. В лизатах клеток 24 штаммов с помощью электрофореза в агарозном геле также были обнаружены 19 мелких и 9 крупных плазмид. Они составили еще одну группу изученных в работе плазмид.

В образцах почв, собранных в разных районах Белоруссии, М.А.Титок (Белорусский Государственный Университет) нашла 55 штаммов природных бацилл, близких к B. subtilis. В 11-ти штаммах были обнаружены криптические плазмиды (Titok et al., 2003). 10 штаммов из белорусской коллекции, содержащие 10 мелких и 8 крупных плазмид,  также были исследованы в данной работе.

Штаммы с плазмидами составляют 20% исследованных штаммов для белорусской коллекции и 58% для московской коллекции. Всего в нашем распоряжении было 51 мелкая и 18 тяжелых плазмид. Столь широкий анализ плазмид из природных штаммов B.subtilis был осуществлен впервые. Анализ мелких и крупных плазмид был проведен раздельно.

2.Изучение структуры  мелких плазмид.

2.1.Рестрикционный анализ и классификация мелких плазмид.

Для характеристики плазмид мы использовали число BamHI и HindIII сайтов рестрикции, а также размер плазмид и их рестрикционных фрагментов (судя по подвижности при электрофорезе нативной и рестрицированной плазмидной ДНК).

Результаты анализа мелких плазмид из 19 штаммов московской

Таблица 1. Классификация мелких плазмид из природных штаммов B.subtilis.  *  по данным сиквенса; ** фрагмент, возможно, дуплицирован.

М - московская коллекция, Б - белорусская коллекция.

Номер груп-пы	Штамм, содержа-щий плазмиды	Кол-лек-ция	Плазмида	Число сайтов		Размер HindIII-фрагментов, тпн	Размер плазмиды, тпн
				BamHI	HindIII
1	1315	М	p1315	0	5	3.7, 1.6, 1.5, 1.1, 0.53	8.43
2	1385	М	p1385	1	6	1.6, 1.5, 1.2, 1.1, 0.65, 0.53	6.58
3	1414 1434 1801	М М М	p1414 p1434 p1801	1	6	1.8, 1.6, 1.5, 1.4, 0.65, 0.48	7.26/7.95*
4	1387 1410 1437 1570 1668 1674 1698 1776 1870 1878 BSЧк31	М М М М М М М М М М Б	p1387-1 p1410 p1437 p1570 p1668 p1674 p1698 p1776 p1870 p1878 pЧк31	1	5	2.1, 1.6, 1.5, 0.65, 0.43	6.28
5	1516 1525 1553	М М М	p1516S p1525 p1553	1	>6	1.8, 1.6, 1.5, 1.4**, 1.1, 0.53	9.4/9.88*
6	1546	М	p1546-1	1	5	3.0, 1.8, 1.2, 0.65, 0.43	7.08
7	1546	М	p1546-2	0	4	2.6, 2.1, 1.4, 1.0	7.10
8	1387	М	p1387-2	1	> 9	2.8, 1.65, 1.37, 0.9, 0.73Е..	8.5
9	BS8 BS57 BS2 BS1 BS15 19 BS4 BSN-1	Б Б Б Б Б Б Б Б	p8 p57 p2 p1 p15 pV p4 pN-1	1	7	2.3, 1.6, 1.5, 1.2, 0.65, 0.56, 0.3	8.11
10	BS21Z	Б	p21Z	1	5	2.3, 1.6, 1.5, 0.65, 0.56	6.61

коллекции  и  10 штаммов  белорусской  коллекции  представлены в табл.1. 17  штаммов содержали по одной плазмиде. Величина плазмид колебалась от 6,3 до 9,9 тпн.  По  выбранным  нами критериям  плазмиды были разделены на 10 групп. Плазмиды разных  групп проявляли сходство друг с другом. Наиболее сходны плазмиды групп 3 и 5, а также 9 и 10 - они имеют 4-5 одинаковых HindIII-фрагмента. Плазмиды из московской  коллекции принадлежали к группам 1-8. Большая часть плазмид белорусской коллекции принадлежала группам  9-10; одна плазмида, рЧк31, принадлежала группе 4. Эта группа была самой обширной. Плазмиды этой группы по использованным нами критериям были идентичны плазмиде рТА1020, выделенной японскими  авторами из промышленного штамма B.subtilis (natto) (Uozumi et al, 1980). Возникал вопрос, не  являются  ли плазмиды каждой группы идентичными уже потому,  что они находятся в одних и тех же штаммах почвенных бацилл, ошибочно получивших при выделении разные номера (т.е. в сибсах). По-видимому, это не так, поскольку бациллы выделялись из географически удаленных образцов почвы и, кроме того, штаммы московской коллекции и по другим признакам (способность к генетической трансформации; разные системы рестрикции-модификации;  продукция  -амилазы;  различия в  изозимном  спектре ферментов) отличались друг от друга (Козловский, Прозоров, 1983; Стукалин и др., 1984; Чан Кам Ван и др., 1985; Лукин и др., 1994).

Два штамма - 1387 и 1546 - содержали больше одной плазмиды. В штамме 1387 мы обнаружили три плазмиды (р1387-1, р1387-2, р1387-3, величиной 6,28 тпн; 8,5 тпн; 36 тпн соответственно). Плазмиды р1387-1 и р1387-2 были гомологичны друг другу по данным ДНК-ДНК гибридизации на фильтрах. В штамме 1546 мы обнаружили две плазмиды (р1546-1 и р1546-2, величиной  7,08 тпн и 7,1 тпн соответственно), не гомологичные друг другу. Клетки штамма 1516 несли либо S (small), либо  L (large) варианты плазмиды р1516; величина этих вариантов плазмид 9,4 тпн и 10,7 тпн соответственно. Рестриктные карты плазмид p1516S и р1516L были идентичны, плазмиды отличались только величиной одного из EcoRI-HindIII - фрагментов. В этом EcoRI-HindIII - фрагменте р1516L была локализована инсерция величиной 1,3 тпн. Как оказалось, эта инсерция содержит IS-элемент (см.раздел 2.4).

2.2.Определение нуклеотидной последовательности мелких плазмид.

Все имевшиеся в нашем распоряжении  плазмиды являлись криптическими. Поэтому единственным способом изучения строения этих плазмид могло быть определение их нуклеотидной последовательности.  Для этой цели были выбраны две плазмиды, принадлежащие, по нашей классификации, к разным группам: р1414 (группа 3) и р1516S (группа 5). Кроме того, была определена нуклеотидная последовательность вставки, отличавшей плазмиду p1516L от p1516S.

Нуклеотидная последовательность плазмиды р1414 была определена в  университете г.Бирмингема (Великобритания). Плазмида р1414 была кольцевой, имела размер 7949 пн и ГЦ-состав  38,3%. Плазмида была депонирована в GenBank (AF091592). На плазмиде были идентифицированы 10 ORF и специфические функционально активные участки ДНК - dso и  sso (ориджины вегативной репликации типа катящегося кольца),  oriT (ориджин конъюгативного переноса)  (рис.1 ). Гипотетические продукты  двух  ORF были гомологичны известным ранее белкам мелких плазмид B.subtilis: Rep (инициатор репликации) и Mob (необходим для мобилизационного переноса плазмиды). Рядом с геном mob находилась небольшая ORF, считываемая в противоположном  направлении.  Было высказано предположение,  что белки, гомологичные продукту данной ORF, репрессируют действие Мob-белков (Meijer et al., 1998). Мы предложили для этих генов название ptr - putative regulatory gene.  Белки Rep, Mob, Ptr имеют много гомологов в базах данных.

Белки, соответствующие ORF2, ORF3, ORF4, ORF6, ORF9 имеют гомологи  в базе данных, однако функции  их  неизвестны.  Белок, соответствующий ОRF10, гомологов  в GenBank  не  имеет. Нужно отметить, что ORF2 окружена дуплицированными участками ДНК (156 пн); один из них расположен в конце ORF1, другой - между ORF2 и ORF3.

Наиболее интересной оказалась ORF5. Соответствующий ей белок имел 145  аминокислотных  остатков  и альфа-кристаллический  домен. Перед геном

Рисунок 1. Генетическая карта р1414 и гомология р1414 с другими плазмидами. А Цвеличина карты в пн. Б - Рестриктная карта. E - EcoRI, H - HindIII сайты рестрикции. Цифрами обозначены HindIII фрагменты р1414. Жирной линией выделены фрагменты р1414, использованные в гибридизации в качестве зондов. В - ORF. Г - функционально активные  районы ДНК. Столбиком с утолщением на конце обозначены промоторы. Д, Е, Ж - участки р1414, гомологичные ДНК плазмид pBS608 (Д), рLS30 (Е), рТА1060 (Ж).

находился промотор  А-типа; скорее всего, ген являлся функционально активным. В 1999г., когда была определена нуклеотидная последовательность р1414, гомологов этого белка у бацилл известно не было, однако они были обнаружены у других организмов - бактерий, дрожжей, растений; это были гомологи белков стрессового ответа на тепловой шок. Они составляли целое семейство. По аналогии с соответствующими генами других организмов, ген был назван hsp - heat shock protein. В настоящее время подобные белки и соответствующие им гены обнаружены у многих бацилл - как на плазмидах, так и в составе хромосомы.

Функционально активные участки ДНК р1414 были в значительной степени гомологичны соответствующим участкам плазмид рТА1015 и рТА1060. Вероятно, sso р1414 принадлежит  sso T1 типа (Meijer et al., 1995; 1998).

В то время, когда была определена нуклеотидная последовательность р1414 и р1516, была известна нуклеотидная последовательность только шести RCR-плазмид B.subtilis. В настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность для 17 мелких плазмид B.subtilis и близких ей бацилл; для 20 подобных плазмид известна часть нуклеотидной последовательности. Плазмида р1414 является одной из типовых плазмид при описании RCR-плазмид B.subtilis (Sakaya et al., 2006; Guglielmetti et al., 2007). В целом р1414 в

значительной степени гомологична плазмидам B.subtilis pBS608 (гомологию имеет 75% ДНК р1414), pLS30 (74%), pPL1 (64%) (нуклеотидная последовательность этих плазмид была определена позже, чем у р1414) и, в меньшей степени, плазмидам рТА1015 и рТА1060 (52-53%).

Нуклеотидная последовательность плазмиды р1516S, как и EcoRI-HindIII фрагмента p1516L, была определена в лаборатории молекулярной генетики университета г. Гронингена (Нидерланды). Удалось получить почти полную картину нуклеотидной последовательности этой плазмиды. Не секвенированными остались 3 участка общим размером около 750 пн, находящиеся  внутри областей, гомологичных нуклеотидным последовательностям плазмид р1414 и рТА1060. Поэтому мы смогли охарактеризовать нуклеотидную  последовательность р1516 целиком, считая непрочитанные  нуклеотидные  последовательности  идентичными соответствующим участкам рТА1060 и р1414. Однако из-за неполного определения нуклеотидной последовательности р1516 она не была депонирована в GenBank. Исходя из указанного допущения, полная нуклеотидная последовательность кольцевой плазмиды р1516S составляет 9881 пн. GC-состав плазмиды - 38,1%. На плазмиде были найдены oriT, dso, sso сайты, а также 13  ОRF  (рис.2).  Значительная  часть плазмиды  (72%)  оказалась гомологична плазмиде р1414 (92-98% идентичности нуклеотидов). Как и р1414, р1516S содержала гены rep,  hsp,  mob,  ptr,  функционально

Рисунок 2. Генетическая карта р1516S и гомология р1516S с другими плазмидами. А Ц величина карты в пн. Б - рестриктная карта. E - EcoRI, H - HindIII, Ha - HaeIII, P - PvuI, K - KpnI, EV - EcoRV, B - BamHI cайты рестрикции. В - ORF. Г - функционально активные районы ДНК. Столбиком с утолщением на конце обозначены промоторы. Д, Е - участки р1516S, гомологичные ДНК плазмид р1414 (Д) и рТА1060 (Е).

активные участки dso, sso, oriT, а также гены-гомологи ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 и ORF9 р1414. Как и у р1414, у1516 ген ORF2 был окружен дуплицированными участками ДНК по 156 пн. В отличие от р1414, р1516 содержала rap-модуль (гены  rap и phr), гомологичный rap-модулю плазмиды рТА1060 (Meijer et al., 1998). Белок Rap - аспартатфосфатаза регуляторного ответа, Phr - его антагонист, регулятор фосфатазы. Эти белки являются компонентами регуляторной системы, контролирующей реакцию клетки на различные изменения внешней среды.

2.3.Поиск гомологов плазмидных генов среди плазмид из штаммов бактериальных коллекций

Далее мы хотели выяснить, насколько широко распространены идентифицированные нами гены мелких плазмид в ДНК  плазмид различных природных  штаммов B.subtilis.  Для этого мы использовали метод блот-гибридизации в жестких условиях с зондами - фрагментами плазмидных генов. Известно, что rep-гены RCR-плазмид B.subtilis составляют достаточно однородную группу (Meijer et al., 1998). Поэтому мы использовали в качестве  зондов  фрагменты других генов плазмид р1414 (hsp, mob, ptr) (рис.1Б), рТА1040 (rap), pTA1050 (rap, par).  Модуль par состоит из трех генов и предположительно является системой токсин-антитоксин, обусловливающей стабильное наследование плазмид (Gleave et al., 1990).

В этой части работы мы использовали для гибридизации как  плазмиды 1ой-10ой групп, описанные ранее, так и 19 мелких плазмид из московской коллекции, обнаруженные нами и не разделенные на группы. Результаты гибридизации представлены в табл.2. mob- и ptr-зонды гибридизовались со всеми исследованными плазмидами,  кроме  одной;  mob-модуль  необходим  для горизонтального  переноса плазмид посредством конъюгации (остальные гены конъюгативного переноса обычно локализованы на крупных конъюгативных плазмидах). Частая встречаемость этого модуля является косвенным  подтверждением  наличия конъюгативного переноса у B.subtilis. hsp-зонд гибридизовался с  подавляющим большинством исследованных плазмид; rap- и par-зонды гибридизации не давали.  Определение нуклеотидной последовательности плазмид не обнаружило в них par- и rap-локусов,  но  плазмида  p1516 несла rap-модуль  по данным сиквенса (см.выше). Однако гомология между ДНК-зондами rap-pTA1040, rap-pTA1050 и rap-геном р1516 составляла соответственно  63-45%, что значительно ниже порога обнаружения сигнала (80-85%) в жестких условиях гибридизации. Из проверенных плазмид  только  одна, р1516-2,  не проявляла  гомологии  ни с

Таблица 2. Результаты гибридизации плазмид с зондами  Ц фрагментами генов. + - наличие сигнала гибридизации; - отсутствие сигнала гибридизации.

Зонд	hsp	mob	ptr	par	rap1050	rap1040
Число проверен-ных плазмид	20+, 8-	27+, 1-	27+, 1-	29-	6-	21-

одним из зондов.Таким образом, мелкие плазмиды штаммов B.subtilis из московской и белорусской коллеций  частично гомологичны друг другу. Подавляющее большинство исследованных плазмид содержат высокогомологичные (>80%) модули mob и hsp.

2.4.Определение нуклеотидной последовательности EcoR1-HindIII фрагмента плазмиды р1516L.

Как уже упоминалось выше, в штамме 1516 было обнаружено две плазмиды, р1516S и p1516L, отличавшиеся друг от друга лишь величиной одного  EcoRI-HindIII-фрагмента (рис.2Б). Нам показалось интересным сравнить нуклеотидные последовательности этих фрагментов. EcoRI-HindIII-фрагмент р1516S был секвенирован в составе плазмиды р1516S. EcoRI-HindIII-фрагмент р1516L был получен с помощью ПЦР, а затем определена его нуклеотидная последовательность.

  EcoRI-HindIII - фрагменты р1516L и р1516S отличались друг от друга наличием у плазмиды р1516L участка ДНК величиной 1383 пн. GC-состав этого участка ДНК - 38,7%, что незначительно отличается от GC-состава плазмиды р1516S (38,1%). Вставка располагалась внутри mob-гена, на расстоянии 18 пн от его 3Т-конца (после нуклеотида 5932) (рис.2Б).На концах вставки были найдены: 1) прямые повторы, причем первый прямой повтор находился на последовательности вставки, а другой - на последовательности собственно плазмиды, непосредственно на границе ДНК плазмиды и вставки; 2) два совершенных инвертированных 10-членных повтора.

По данным на 2002г., нуклеотидная последовательность вставки имела большое сходство (70% гомологии) с фрагментами геномов Enterococcus faecalis (TIGR_1351/gef_11370) и Enteroroccus faecium (DOE_1352/Contig 7190). Аминокислотная последовательность, соответствующая нуклеотидной последовательности вставки, имела, по данным программы BlastX ( значительное сходство с белками многих микроорганизмов; это были либо транспозазы, либо предполагаемые транспозазы. Размер этих белков - около 400 аминокислотных остатков. Однако участки гомологии располагались на различных рамках считывания и не совпадали с какой-либо одной из возможных ORF. Создавалось впечатление, что на последовательности вставки произошел сдвиг(и) рамки считывания, что нарушило нормальное строение гена.

Наличие прямых и инвертированных повторов по краям вставки и гомология центральной части вставки с транспозазами различных микроорганизмов позволила предположить, что  вставка в p1516L является IS-элементом. Вероятно, ген описываемой нами транспозазы являлся дефектным, т.е. псевдогеном. Наличие в клетках штамма B.subtilis 1516 плазмид как с IS-элементом, так и без него, являлось косвенным свидетельством транслокации элемента. Возможно, функционально активные его копии находились на хромосоме. Мы назвали обнаруженную нами IS-последовательность ISBsu2. Cудя по характеру гомологии транспозазы ISBsu2 с транспозазами известных IS-элементов, ISBsu2 принадлежит к семейству IS256. Некоторые представители этого семейства имеют не одну пару инвертированных повторов, как подавляющее большинство IS-элементов, а две (Mahillon, Chandler, 1998). Эту же особенность мы отметили для ISBsu2. ISBsu2 была депонирована в 2003г. в GenBank (№ AY099458).

Возникал вопрос, присутствует ли мобильный элемент ISBsu2 в хромосоме штамма 1516, несущего соответствующую плазмиду, а также в хромосомах других штаммов B.subtilis и  некоторых других бацилл. Для проверки этого предположения мы попытались обнаружить данную последовательность в хромосомной ДНК различных бацилл с помощью блот-гибридизации. Последовательность ISBsu2 была амплифицирована на плазмиде p1516L посредством ПЦР с использованием специфических праймеров, помечена 32Р-дАТФ и использована в качестве зонда в блот-гибридизации по Саузерну  с хромосомной ДНК бацилл. Хромосомная ДНК при этом обрабатывалась рестриктазой EcoRV. Мобильный элемент ISBsu2 имеет один сайт узнавания для EcoRV, расположенный приблизительно в его средней части; на ДНК собственно плазмиды р1516 сайтов узнавания для EcoRV нет.

  При гибридизации с хромосомной ДНК штамма, несущего плазмиду p1516S, обнаружилось 18-20 полос гибридизации разной интенсивности (рис.3). Плазмида p1516S не содержит ISBsu2, поэтому возможная примесь плазмидной ДНК не могла повлиять на результат гибридизации. Поскольку рестриктаза EcoRV разрезает ISBsu2 на две части, любая нуклеотидная последовательность на хромосоме, гомологичная ей, также разрезается при соответствующей обработке и должна дать две полосы гибридизации. Таким образом, число участков гомологии с ISBsu2 на хромосоме (т.е.копий ISBsu2) должно быть в два раза меньше числа полос гибридизации - в данном случае 9-10. При гибридизации с хромосомной ДНК штаммов B.subtilis, содержавших плазмиды

Рисунок 3. Результаты блот-гибридизации хромосомной ДНК из различных штаммов B.subtilis с меченной 32Р-дАТФ ДНК ISBsu2.

а Ц электрофореграмма EcoRV фрагментов хромосомной и плазмидной ДНК и EcoRI-HindIII фрагментов ДНК фага ; б - результаты блот-гибридизации этих фрагментов с радиоактивным зондом. 1 - p1516L; 5 - , EcoRI-HindIII; остальные пробы - хромосомная ДНК из штаммов B.subtilis , рестрицированная EcoRV:  2 - 1516 (p1516S); 3 - 1516 (p1516L); 4 - 1414 (p1414); 6 - 168; 7 - IFO3022 (pTA1060); 8 - 1315 (p1315); 9 - 1385 (p1385); 10 - 1513. Цифры слева - величина EcoRI-HindIII фрагментов ДНК фага в тпн.

p1414, p1315, p1385  и pTA1060, для которых была определена полная нуклеотидная последовательность и  было известно, что ни одна из них  не содержит IS-элементов (Mejer et al., 1998; Bron, личное сообщение), также обнаружились полосы гибридизации, от двух до шестнадцати. Много полос гибридизации обнаруживалось  и при гибридизации с хромосомной ДНК штамма р1516L (возможно, что одна из полос соответствовала примеси ДНК плазмиды р1516L). Мы провели также гибридизацию с хромосомной ДНК штамма  B.subtilis  19,  несущего  крупную  конъюгативную  плазмиду  р19  и мелкую криптическую плазмиду рV; с ДНК типового лабораторного бесплазмидного штамма B.subtilis 168; с ДНК почвенных штаммов  B.subtilis

604, 1356, 1431, 1513, не несущих плазмид, и с ДНК других бацилл, близких к B.subtilis 168 (B.subtilis W23, B.aterrimus ВКМВ-922, B.licheniformis В-993, B.pumilus ВКМВ-508). Была взята также ДНК Е.coli DH5α. Ни в одном случае,

кроме ДНК штамма 1513, мы не обнаружили полос гибридизации. На рисунке не приведены многочисленные пустые дорожки с ДНК штаммов, не давших полос гибридизации (кроме ДНК B.subtilis 168).

У B.subtilis известно крайне мало IS-элементов. ISBsu2 была вторым IS-элементом, обнаруженным у B.subtilis [первый IS-элемент, обнаруженный у B.subtilis (natto), - IS4Bsu1 - негомологичен ISBsu2 и принадлежит семейству IS4 - Nagai et al., 2000] и первым, локализованным на плазмиде. В 2007г. была опубликована в GenBank нуклеотидная последовательность еще одного, третьего, IS-элемента, IS256Bsu1 из штамма B.subtilis (natto); величина последовательности составляла 1369 пн. IS256Bsu1 содержала ген транспозазы (1248 пн), окруженный парой инвертированных 26-членных повторов. IS256Bsu1 и ее ген транспозазы на 97% оказались идентичными ISBsu2 и ее предполагаемому гену транспозазы  (Kimura, Itoh, 2007).  Таким образом, гомологи ISBsu2 присутствуют в различном количестве копий в хромосомной и плазмидной ДНК ряда почвенных и промышленных штаммов B.subtilis.

3.Анализ крупных плазмид.

3.1.Поиск крупных плазмид в штаммах B.subtilis и определение их способности к конъюгации

Имевшаяся в нашем распоряжении коллекция природных штаммов B.subtilis, выделенных из почв Москвы и Московской области, была использована также для поиска крупных плазмид. Было проверено 42 штамма коллекции, в 9 из них были обнаружены плазмиды размером более 36 тпн. Пять штаммов содержали только крупную плазмиду, другие, кроме крупной, несли также мелкие плазмиды. Еще одна крупная плазмида, р1387-3, была обнаружена ранее (см.выше). По сумме длин рестриктных фрагментов был определен размер крупных плазмид из штаммов 1899 (данные В.З.Незаметдиновой), 544 и 1387. Он составил 60 тпн, 65,1 тпн и 36 тпн соответственно.

Изучение генетики крупных плазмид бацилл мы решили начать с поиска у них способности к конъюгативному переносу. Как было сказано выше, гены mob, необходимые для переноса мелких плазмид с помощью конъюгативного аппарата крупных плазмид, широко распространены среди RCR-плазмид B.subtilis. Однако способность к конъюгации была показана до сих пор только для одной плазмиды B.subtilis (natto) - pLS20 (Koehler, Torne, 1987). При этом ни особенности самого процесса конъюгации, ни участвующие в нем гены описаны не были.

Ни один из штаммов B.subtilis московской коллекции не проявлял какой-либо устойчивости к антибиотикам. Плазмиды не имели заметных фенотипических проявлений, т.е. были криптическими. Следовательно, мы не могли наблюдать непосредственно перенос крупных плазмид. Мы ввели посредством трансформации протопластов в четыре штамма B.subtilis, имевших крупные плазмиды (1387, 1420, 1440, 1899), мелкую плазмиду pUB110, несущую маркер устойчивости к канамицину и определяющую KmR фенотип клеток. Тот факт, что данные штаммы получили pUB110, был подтвержден результатами электрофореза. В наших опытах к мобилизации pUB110 оказалась способной лишь плазмида р1387-3 из штамма B.subtilis 1387. Мобилизация шла только на поверхности фильтров и при условии, что реципиентом был штамм B.subtilis RM125 c нарушенной системой рестрикции-модификации. Частота конъюгативного переноса для р1387-3 была низкой (10-7). Конъюгация с р1387-3 шла нерегулярно. Были опыты, в которых на чашках вырастало лишь несколько колоний конъюгантов или их не было вовсе.

Таким образом, проверенные крупные плазмиды из московской коллекции были неспособны к мобилизации, или она шла у них с предельно низкой частотой. В поисках удобной модели конъюгативного переноса для B.subtilis мы обратились к белорусской коллекции природных штаммов B.subtilis. Наши коллеги из Белорусского Государственного Университета обнаружили в этой коллекции  штаммы с крупными плазмидами  (Titok et al., 2003). Мы использовали для поиска конъюгативного переноса штамм B.subtilis 19, несущий крупную плазмиду р19. Плазмида р19 оказалась способной к мобилизации мелких плазмид и к самопереносу с высокой частотой. Как оказалось позже, другие крупные плазмиды этой коллекции очень схожи друг с другом по способности к конъюгации. Изучению закономерности этих процессов посвящен следующий раздел работы.

Штамм B.subtilis 19 был выделен из лесной почвы Белоруссии. Он содержит две плазмиды: крупную р19 с тета-типом репликации (Titok et al., 2003) и мелкую, pV, реплицирующуюся по сигма- (RC-) типу. Размер р19 был определен В.З.Незаметдиновой по сумме фрагментов рестрикции EcoRI и KpnI и составил более 97 тпн. Размер pV был определен нами также по сумме фрагментов рестрикции и составил 8,5 тпн (табл.1). Обе плазмиды были криптическими. В клетки штамма B.subtilis 19 посредством трансформации лизоцимных протопластов была введена плазмида pUB110. Были получены производные штамма B.subtilis 19, лишенные pV (они возникали спонтанно) или р19 [при выращивании штамма 19 (р19 pV pUB110) на средах, содержащих высокие концентрации канамицина] (Лотарева и др., 2002). Получить производные штамма 19, полностью лишенные плазмид, нам не удалось.

3.2.Изучение мобилизационного переноса, осуществляемого плазмидой р19 из почвенного штамма B.subtilis.

Изучение особенностей конъюгативной мобилизации  проводилось с использованием в качестве донора штамма 19 (p19 pV pUB110). В качестве реципиента был взят хорошо изученный лабораторный штамм B.subtilis 168 с хромосомным геном устойчивости к хлорамфениколу (ВD170 CmR). В скрещиваниях B.subtilis 19 (p19 pV pUB110) x ВD170 CmR трансконъюганты, устойчивые к канамицину, стабильно появлялись с частотой около 10Ц3 на клетку реципиента (в отдельных опытах частота достигала 10-2)  (табл.3). Конъюгация шла с одинаковой частотой на твердой и в жидкой средах. При электрофорезе плазмидной ДНК, выделенной из клонов трансконъюгантов, были видны полосы, соответствующие ДНК pUB110. Однако необходимо было исключить возможность получения реципиентом мелкой плазмиды за счет спонтанной трансформации ДНК, к которой способны клетки B.subtilis. Для этого в среду со смешанной культурой клеток штаммов-партнеров добавлялась ДНКаза I до конечной концентрации 100 мкг/мл. На количество возникающих трансконъюгантов обработка ДНКазой I  не влияла. Чтобы исключить возможность переноса pUB110 за счет трансдукции, вместо культуры донора в скрещиваниях использовался ее фильтрат (фильтр Millipor 0,22μm). Трансконъюгантов и в этом случае обнаружено не было. Конъюгативный перенос, осуществляемый некоторыми крупными плазмидами, чувствителен к действию протеиназы (Andrup et al.,1993). Мы проверили, влияет ли обработка протеиназой  К на  частоту мобилизационного переноса, осуществляемого p19. Результаты опытов показали, что частота мобилизации pUB110 при обработке клеток штаммов-партнеров протеиназой К (1 мг/мл;  30 мин.) снижалась не более чем в 2 раза.

Выше упоминалось, что при выращивании на средах с высокой концентрацией канамицина бактерии теряли плазмидцу р19; при этом они утрачивали способность к мобилизационному переносу. Чтобы окончательно доказать, что способность к мобилизации pUB110 связана с наличием в  клетке крупной конъюгативной плазмиды, была проведена блот-гибридизация плазмидной ДНК, выделенной из разных производных  штамма 19, полученных в ходе работы, как способных, так и неспособных  к конъюгации.  В качестве  зонда  был  использован  минирепликон р19 из плазмиды pMTLBS19.  И в этих опытах способность к конъюгативному переносу pUB110  коррелировала с наличием в клонах крупной плазмиды р19. Потеря плазмиды pV  не влияла на способность к мобилизационному переносу  мелких плазмид (табл.3, скрещивания 2, 3).  Таким образом,  для конъюгативного переноса мелкой плазмиды из штамма-донора B.subtilis 19 требуется наличие в штамме именно крупной плазмиды р19.

Способность p19 осуществлять мобилизацию в жидкой среде позволила определить такие параметры мобилизации, как кинетика переноса плазмид и ее зависимость от температуры.  Было показано, что нарастание числа трансконюгантов в зависимости от времени контакта клеток было одинаковым

Таблица 3. Конъюгативный (мобилизационный) перенос мелких плазмид из клеток штаммов, несущих крупную плазмиду р19

№	Штаммы-доноры	Штаммы-реципиенты	Частота мобилизации на клетку-реципиент
1	B.subtilis 19 (p19 pV pUB110)	B.subtilis 19 (pV) StrR	2,01,21 x 10-3
2	B.subtilis 19 (p19 pV pBC16)	B.subtilis 19 (pV) StrR	1,030,50 x 10-3
3	B.subtilis 19 (p19 pBC16)	B.subtilis 19 (pV) StrR	4,253,75 x 10-3
4	B.subtilis 19 (p19 pBC16invEcoRI)	B.subtilis 19 (pV) StrR	1,050,05 x 10-7
5	B.subtilis 19 (p19 pV pBC16invEcoRI)	B.subtilis 19 (pV) StrR	0,880,21 x 10-5
6	B.subtilis 19 (p19 pV pC194)	B.subtilis 19 (pV) StrR	< 10-7
7	B.subtilis 19 (p19 pC194)	B.subtilis 19 (pV) StrR	< 10-7
8	B.subtilis 19 (p19 pCB20)	B.subtilis 19 (pV) StrR	3,550,15 x 10-7
9	B.subtilis 19 (p19 pCB20)	B.subtilis BD170 StrR	3,371,21 x 10-7

при температуре 30 и 37С; через 80 мин. оно замедлялось, и кривые выходили на плато. Конъюгация была  возможна  и  при  комнатной  температуре  (21С). Трансконъюганты  в этом случае обнаруживались значительно позже; к 180 мин. количество их было максимальным, но все же примерно в 50 раз меньшим, чем при 30 и 37С.

Мы использовали в качестве доноров и реципиентов производные штаммов B.subtilis 19 и 168, в том числе штамм 168 RM125 R- M -, лишенный системы рестрикции-модификации RI (см.далее табл.5, скрещивания 2-6). Во всех случаях частота мобилизационной передачи pUB110 оставалась постоянной и составляла 10-3. Исключением является скрещивание 5, где и донором, и реципиентом были штаммы B.subtilis 168. В этом случае частота передачи pUB110 падала  более чем на два порядка и составляла 6,8х10-6.

Нас интересовало, способны ли в данной конъюгационной системе передаваться другие мелкие плазмиды. С этой целью в штамм B.subtilis 19 вводились разные плазмиды с сигма-типом репликации: природная плазмида B.cereus рВС16 (4630 пн; TcR), ее вариант с инверсией  крупного  участка  гена

mob pBC16invEcoRI и плазмида S.aureus pC194 (2910 пн; CmR), у которой отсутствует ген mob. Все они способны реплицироваться в клетках B.subtilis.

Было показано, что рВС16 передавалась клеткам-реципиентам примерно с той же частотой, что и pUB110 - около 10-3. В тех случаях, когда донор нес производную рВС16 с инверсией части гена mob, частота мобилизации падала на четыре порядка. Однако, если в клетках донора, помимо р19 и рВС16invEcoRI, содержалась мелкая природная плазмида pV, также имеющая ген mob, частота переноса плазмиды с поврежденным геном снижалась лишь на два порядка (табл.3, скрещивания 4,5). Плазмида рС194, лишенная и гена mob, и участка oriT, была абсолютна неспособна к мобилизационному переносу (табл.3, скрещивания 6, 7). Таким образом, для переноса необходимо наличие на мобилизуемой плазмиде oriT и неповрежденного гена mob. Мобилизация мелких плазмид у B.subtilis в описанной системе, вероятно, осуществляется по механизму  донации. Изменений молекулярной массы плазмид, как мелких, так и крупных, выделенных из клеток трансконъюгантов (что характерно для процесса  кондукции), никогда не наблюдалось.

Мы проверили, существует ли возможность  конъюгативной мобилизации pUB110 из клеток B.subtilis 19 (p19 pV pUB110) в клетки реципиентов, принадлежащих к другим видам. При изучении межвидового конъюгативного переноса pUB110 (гетероконъюгации) в качестве реципиентов были использованы штаммы грам-положительных  микроорганизмов: 12 разных видов рода Bacillus, а также штамм Staphylococcus aureus. Для всех штаммов-реципиентов предварительно были получены спонтанные мутанты, устойчивые к стрептомицину. Результаты представлены в табл. 4. Мобилизация шла с разной частотой. В опытах, где реципиентами были штаммы B.subtilis (natto), B. megaterium, B. polymixa, перенос мелкой плазмиды шел с  достаточно большой эффективностью. В то же время клетки других видов бацилл при скрещиваниях получали pUB110 с заметно меньшей частотой: 10-4 в случае реципиента B. licheniformis ; 10Ц6  в случае реципиентов B. sphaericus, B. pumilus, B. niger, B. globigii и B thuringiensis. В скрещиваниях B.subtilis 19 со штаммами B. mesentericus и S. aureus трансконъюгантов не возникало.

Таблица 4. Частота мобилизации pUB110 при скрещиваниях

B.subtilis 19 (p19 pV pUB110) с другими видами бактерий.

Бактерии-реципиенты	Частота возникновения трансконъюгантов
B.subtilis BD 170 StrR	6,21,24 x 10-3
B.megatherium StrR	1,71,21 x 10-2
B.mesentericus MB74 StrR	< 10-7
B.aterrimus BKMB-922 StrR	1,240,92 x 10-3
B.sphaericus 2362-F StrR	8,71,0 x 10-6
B.licheniformis RUB 503-1 StrR	2,40,48 x 10-4
B.subtilis (natto) B3364 StrR	1,00,46 x 10-2
B.amyloliquefaciens SK52 StrR	3,00,70 x 10-3
B.pumilus BD2002 StrR	1,00,43 x 10-6
B.polymixa BKMB-514 StrR	1,00,30 x 10-2
B.niger PB3264 StrR	1,131,30 x 10-6
B.globigii PB512 StrR	1,681,05 x 10-6
B.thuringiensis 40 StrR	7,40,31 x 10-6
Staphylococcus aureus Wood 46 StrR	< 10-7

Возможность мобилизации плазмид при температуре 21Cа, обычной для летних  месяцев в средней полосе России, способность  к  межвидовому переносу, наличие у большинства изученных мелких бациллярных плазмид природных штаммов генов mob и ptr, необходимых для конъюгативной мобилизации, - все это позволяет предполагать, что конъюгативный перенос

плазмид с участием р19 активно происходит в природных условиях и может играть значительную роль в процессах генетического обмена между штаммами B.subtilis и даже между представителями разных видов бацилл.

3.3.Изучение конъюгативного переноса собственно крупной плазмиды p19

Все описанные выше эксперименты были поставлены с целью изучения мобилизации мелких плазмид. Между тем, очень важно было исследовать особенности переноса собственно крупной конъюгативной плазмиды. Плазмида p19 является криптической, что затрудняет исследование ее собственного переноса при конъюгации. Зафиксировать передачу р19 можно было, лишь проверяя на способность к мобилизации трансконъюганты, получившие мелкую плазмиду, а также по данным гибридизации, используя клонированный репликон р19 в качестве зонда. И то, и другое - процедура достаточно трудоемкая и дает возможность проверить лишь несколько десятков клонов. Поэтому  для изучения закономерностей самопереноса p19  в данную плазмиду с помощью инсерционного мутагенеза был введен ген хлорамфениколацетилтрансферазы (cat), определяющий устойчивость к хлорамфениколу. В качестве источника гена cat была использована плазмида р3 (рис.4). р3 представляет собой плазмиду E.coli pUC19 с встроенным в полилинкер геном cat из плазмиды pC194; р3 не способна реплицироваться в клетках B.subtilis. На плазмиде p19 имеется более 20 сайтов рестрикции EcoRI; р3 несет только один сайт узнавания этой рестриктазы. ДНК плазмид р3 и р19 была обработана рестриктазой EcoRI, а затем смесь фрагментов лигировали. Полученной лигированной смесью трансформировали клетки штамма B.subtilis 19 (p19). Отбирались клоны, устойчивые к хлорамфениколу, которые несли p19 со встроившимся за счет гомологичной рекомбинации геном cat. Интеграция р3 могла сопровождаться делецией части генов р19. Было получено несколько десятков клонов B.subtilis 19 (р19::р3) CmR, которые были проверены на способность к конъюгативному переносу р19::р3. Около половины из них (31 клон) оказалась неспособной к конъюгации (эти клоны были в дальнейшем использованы для клонирования учатков tra-района р19); другие клоны передавали р19::р3 с различной частотой. Был отобран клон, обозначенный как B.subtilis 19 (р19cat), способный передавать р19::р3 в ходе конъюгации с максимальной  частотой  и  стабильно сохранявший CmR-фенотип при росте в

Рисунок 4. Маркирование плазмиды р19 с помощью плазмиды р3 и клонирование фрагментов ДНК р19, прилегающих к вставке р3.

неселективных условиях. При скрещивании этого штамма с реципиентом B.subtilis 19 (pV pUB110), был получен штамм B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110) CmR KmR, используя который в качестве донора при конъюгации, можно было проследить  как  передачу реципиенту крупной плазмиды p19cat, так и мобилизацию pUB110. Этот клон был использован в дальнейшей работе.

Чтобы определить частоту и параметры конъюгативного переноса p19, был  проведен  ряд  скрещиваний  (табл.5). Как и при изучении

мобилизационного переноса pUB110, для  предотвращения возможной

спонтанной трансформации в конъюгационные пробы добавлялась ДНКаза I до концентрации 100 мкг/мл. Чтобы исключить возможность переноса маркера за счет трансдукции, были проведены скрещивания с использованием вместо культуры донора ее фильтрата (фильтр Millipore 0,22μm). Трансконъюгантов в этом случае обнаружено не было. Плазмидный состав клонов трансконъюгантов был подтвержден результатами электрофореза плазмидной ДНК, выделенной из клеток донорного штамма и трансконъюгантов.

Как  показали результаты, крупная плазмида  передавалась  с  очень высокой частотой при использовании в качестве партнеров штаммов B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110) и  19 (pV) StrR - около  70% клеток реципиента получали p19cat (в некоторых опытах  частота конъюгации достигала 1). Когда же в качестве реципиента  использовался лабораторный штамм B.subtilis 168  39-22 StrR, частота переноса p19cat была более чем на два порядка ниже (табл.5, скрещивание 3). Возможно, у штаммов B.subtilis 19 и 168 имелись различные системы рестрикции-модификации. Чтобы проверить это предположение, были поставлены опыты, где реципиентом был штамм 168 RM 125, лишенный системы рестрикции-модификации RI. Частота конъюгативного переноса p19cat в таких скрещиваниях достигала 2,5х10-1 (табл.5, скрещивание 4). Штамм B.subtilis 168, получивший p19cat, также оказался способен быть донором (табл.5, скрещивание 5), хотя и со сниженной эффективностью. В скрещиваниях, где в качестве реципиента был взят вариант лабораторного штамма B.subtilis168 AMT EmR, p19cat передавалась  клеткам с частотой

Таблица 5. Конъюгативный перенос плазмид при использовании в качестве партнеров при конъюгации различных штаммов B.subtilis.

№ скрещивания	Штаммы-доноры	Штаммы-реципиенты	Частота переноса p19cat	Частота мобилизации pUB110
1	B.subtilis 19  (p19cat)	B.subtilis 19 (pV) StrR	7,7 0,5x10-1	-
2	B.subtilis19  (p19cat pV pUB110)	B.subtilis 19 (pV) StrR	6,2 0,9x10-1	1,5 0,7x10-3
3	B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110)	B.subtilis 168 39-22 StrR	3,3 2,3x10-3	4,3 3,4x10-3
4	B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110)	B.subtilis 168 RM125 StrR	2,5 0,5x10-1	1,4 0,7x10-3
5	B.subtilis 168 39-22 (p19cat pUB110)	B.subtilis 168 AMT EmR	3,2 2,0x10-2	6,8 4,0x10-6
6	B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110)	B.subtilis 19 (p19) StrR	3,0 0,1x10-2	2,5 0,4x10-3
7	B.subtilis 19 (pV pUB110)	B.subtilis 19 (pV) StrR	-	< 10-7

около  3х10-2.  Таким образом, кроме предполагаемого действия систем рестрикции-модификации, на частоту переноса, безусловно, влияют и другие, еще неизвестные факторы. Возможно, причинами снижения частоты конъюгации и, особенно, мобилизации (почти на 3 порядка) в случае, если и донором, и реципиентом являются производные лабораторного штамма B.subtilis 168, могут быть меньшая частота образования пар клеток донора и реципиента или недостаточно эффективный перенос плазмидной ДНК между конъюгирующими клетками из-за каких-то особенностей строения клеточной стенки.

Присутствие плазмиды p19 в штамме-реципиенте B.subtilis 19 приводило к снижению частоты переноса крупной плазмиды в 20 раз по сравнению с опытами, в которых использовался утративший такую плазмиду реципиент (табл.5, скрещивания 2,6). Снижение эффективности конъюгативного переноса, если клетка-реципиент уже несет родственную плазмиду, описано для различных конъюгативных плазмид. Этот так называемый феномен поверхностного исключения (surface exclusion) хорошо изучен у E.coli и других бактерий кишечной группы (Garcillan-Barcia, de la Cruz, 2008). Однако частота мобилизации pUB110 в подобных опытах не изменялась; вероятно, на частоту переноса в случае p19 влияли скорее другие факторы, например, несовместимость плазмид, связанная с репликацией.

Было изучено влияние соотношения клеток донора и реципиента на частоту переноса p19cat в скрещиваниях B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110) x B.subtilis 19 (pV) StrR. Перенос происходил с одинаково большой частотой (10-1) в широком диапазоне соотношений клеток донора и реципиента (от 103 клеток донора на 1 клетку реципиента до 1 клетки донора на 102 клеток реципиента). Частота переноса снижалась, лишь если на клетку донора приходилось 103 и более клеток реципиента.

Чтобы выяснить, через какое время после контакта клеток донора и реципиента начинается перенос p19, мы определяли число трансконъюгантов в скрещивании B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110) x B.subtilis 19 (pV) StrR в опытах с последовательным прерыванием конъюгации. Чтобы свести к минимуму конъюгацию на твердой среде, начальное соотношение числа клеток донора и реципиента было взято как 1: 10000. Для этого в момент времени "0"смешивали 0,8 мл среды LB, 0,1мл культуры реципиента (107клеток) и 0,1мл культуры донора (103 клеток). Результаты представлены на графике (рис.5). Передача p19cat начиналась непосредственно сразу после смешивания клеток штаммов- партнеров и достигала максимума через  3 часа.  Перенос  мелкой плазмиды начинался лишь через 60 минут после начала контакта клеток донора и реципиента.

Была изучена возможность конъюгативной передачи р19 из клеток B.subtilis в клетки других видов бацилл. Для определения частоты переноса р19 в качестве донора мы использовали штамм B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110).  Реципиентами служили штаммы 6 других видов рода Bacillus. Передача р19 шла с различной частотой  (табл. 6). Наиболее эффективно р19 передавалась в клетки B.subtilis 19. Менее эффективно передача р19 происходила в клетки других видов (B.amiloliquefaciens, B.megaterium, B.pumilus, B.polymyxa); частота

Рисунок 5. Динамика конъюгативной передачи плазмид р19cat и pUB110 в зависимости от продолжительности контакта клеток. В скрещиваниях использовали штамм B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110) в качестве донора и штамм B.subtilis 19 (pV) StrR в качестве реципиента.

Таблица 6. Эффективность конъюгативного переноса р19cat в клетки других видов бацилл. В качестве донора был использован штамм B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110).

Штаммы-реципиенты	Частота конъюгативной передачи  p19cat
B.subtilis 19 Strr	8,02,0х10-1
B.amiloliquefaciens SK-52 Strr	1,91,0х10-2
B.megaterium Strr	2,21,0х10-4
B.pumilus BD 2002 Strr	4,02,010-3
B.polymyxa BКМВ 514 Strr	3,71,510-5
B.subtilis (natto) B3364 Strr	<10-7
B.aterrimus BKMB-922 Strr	<10-7

переноса в этих скрещиваниях была снижена на 1 - 4 порядка. В клетки B.subtilis (natto) и B.aterrimus p19cat не передавалась. Таким  образом, плазмида р19 определяет способность к конъюгативному переносу как мелких плазмид, так и самой себя в клетки различных видов бацилл.

3.4.Клонирование, определение нуклеотидной последовательности и анализ секвенированных фрагментов ДНК плазмиды р19.

Как было указано выше, конъюгативный перенос у грам-положительных микроорганизмов мало изучен; это полностью относится и к  B.subtilis.  Не известна и нуклеотидная последовательность ни одной из конъюгативных плазмид B.subtilis. На следующем этапе работы мы попытались клонировать фрагменты tra-района плазмиды р19 B.subtilis и определить их нуклеотидную последовательность. Секвенирование фрагментов плазмиды р19 было проведено в центре ДНК-диагностики ИОГен РАН.

  Как уже упоминалось, мы получили 31 клон B.subtilis 19 (p19::p3) CmR Tra-, в которых плазмида р19 была помечена геном cat; эти клоны были не способны служить донорами при  конъюгации.  Мы использовали эти производные р19 для клонирования и последующего секвенирования фрагментов tra-района плазмиды (рис.4). Для этого плазмидная ДНК клонов обрабатывалась рестриктазой ClaI с последующим лигированием и трансформацией клеток E.coli DH5(). Селекция велась по маркерам CmR и ApR. На плазмиде р3 нет сайтов узнавания для рестриктазы ClaI;  на р19 их около 20. Мы ожидали получить гибридные плазмиды р3-19, состоящие из вектора р3 и двух EcoRI-ClaI фрагментов ДНК р19; в исходной плазмиде р19 эти два фрагмента, скорее всего, не граничили друг с другом. Предполагалось, что клонированные фрагменты р19 должны содержать ген(ы), повреждение которых приводит к неспособности плазмид р19::р3 осуществлять конъюгацию.

Для 11 плазмид серии р3-19 были построены рестриктные карты и определены нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК, непосредственно прилегающих к р3, с помощью стандартного праймера pUC/M13F и  праймера cat, синтезированного по известной нуклеотидной последовательности гена cat. Это позволило определить, что четыре плазмиды идентичны; для дальнейшей работы была использована одна из них. Остальные

плазмиды отличались друг от друга, хотя некоторые из них несли как  разные, так и одинаковые фрагменты ДНК р19. Эти 8 плазмид были использованы для определения нуклеотидных последовательностей клонированных на них фрагментов ДНК р19. Кроме того, для определения нуклеотидной последовательности была использована плазмида pBluescript-6 из библиотеки фрагментов ДНК р19, клонированных по EcoRI сайту в клетках E.coli XL1 Blue. Она была обнаружена при гибридизации библиотеки клонов с зондом - фрагментом ДНК одной из плазмид серии р3-19.

Для определения нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК р19 мы, во-первых, секвенировали плазмиды серии р3-19 со стандартных праймеров (pUC/M13F и cat), что позволило определить нуклеотидные последовательности концевых участков плазмид р3-19. Во-вторых,  проводили  субклонирование плазмид  серии р3-19.  Всего  было получено 22 плазмидных субклона, строение которых подтверждено рестриктным  анализом.  Все они были секвенированы с использованием стандартных праймеров (pUC/M13F, pUC/M13R, cat), что позволило определить нуклеотидные последовательности концевых участков.  Затем на основе полученных нуклеотидных последовательностей создавали специфические праймеры. Всего их было синтезировано 87. Определение нуклеотидной последовательности ДНК со специфическими праймерами проводили на матрицах плазмид р3-19 и плазмидных субклонах.

Клонированные на данных плазмидах фрагменты ДНК р19 соответствовали пяти контигам (рис.6). Эти контиги депонированы в GenBank : 2021 пн  (№ FJ434455),  4518 пн (EF506609),  22728 пн (№ FJ434456), 739 пн (№ FJ434457), 2932 пн (EF506610). Идентификация ORF на секвенированных фрагментах, поиск в базах данных гомологов белковых продуктов, соответствующих этим ORF, и сравнение с белками tra-районов других  плазмид грам-положительных  бактерий (см.далее) позволили предположить,

Рисунок 6.  Расположение секвенированных контигов на плазмиде р19. Цифрами указаны величины фрагментов в пн. Буквами обозначены сайты рестрикции ферментов ClaI (C) и EcoRI  (Е). Положение фрагментов 739 пн и 2932 пн относительно других контигов неизвестно.

что фрагменты ДНК р19 величиной 2021 пн, 4518 пн и 22728 пн находятся в исходной плазмиде именно в таком порядке, как они изображены на рис.6, и близко друг от друга. Используя праймеры, синтезированные по конечному участку ДНК фрагмента 4518 пн и начальному - фрагмента 22728 пн, мы получили посредством  реакции ПЦР фрагмент ДНК. После определения нуклеотидной последовательности  его размер оказался равен 568 пн. Таким образом, нам удалось соединить контиги 4518 пн и 22728 пн. Это позволило уточнить величины ORF5 и ORF10 по сравнению с определенными ранее (GenBank № EF506609 и № JF434456). В конечном счете, мы определили нуклеотидную последовательность четырех контигов р19: 2021 пн; 27814 пн; 739 пн; 2932 пн; их суммарный размер - 33506 пн (рис.6). 

На секвенированных фрагментах ДНК плазмиды р19 идентифицировано 39 ORF. Из них 33 соответствуют целым ORF, четыре (ORF1, ORF 9, ORF35, ORF38) - 3'-концу генов, две (ORF34, ORF39) - 5'-концу генов. Подавляющее большинство ORF транскрибировалось в одном направлении, кроме двух ORF из контига 2932 пн. Это может быть косвенным свидетельством однонаправленной репликации плазмидной ДНК. 89,6% нуклеотидной последовательности было занято собственно ORF, таким образом некодирующие участки занимают малую часть секвенированной последовательности. Расстояния между концом одной ORF и началом следующей ORF в основном были невелики (0-50 пн); в некоторых случаях начало одной ORF и конец другой накладывались друг на друга. Вероятно, гены плазмиды организованы в опероны. В нескольких случаях межгенное расстояние составляло несколько сот пн. В таких участках были идентифицированы промоторы и ориджины - как репликации, так  и конъюгативного переноса. Величина гипотетических белков, соответствующих ORF, колебалась от 50 аа (меньшие белки не идентифицировали) до 843 аа. ГЦ состав фрагментов ДНК составлял 30-34%;  для отдельных  ORF он колебался от 29% до 39%. Перед всеми ORF, имеющими 5'-конец, идентифицированы сайты связывания с рибосомами.  Перед ORF2, ORF7, ORF8, ORF11, ORF22, ORF31, ORF34 идентифицированы -35 и -10 районы промоторов. Белковые продукты, соответствующие 26 ORF, имеют гомологи в базах данных. Продуктам десяти  ORF на основании этой гомологии можно приписать определенные функции (рис.7).

Чтобы подтвердить конъюгативные функции обнаруженных ORF, мы проводили их инактивацию посредством инсерционного мутагенеза. Для этого клонировали фрагменты генов (расположенные не на концах, а в середине генов) величиной от 0,23 до 0,9 тпн  на векторных плазмидах pMTL21C  и р3. Эти плазмиды не способны реплицироваться в клетках B. subtilis, но несут экспрессирующийся в них селективный маркер, ген cat (обусловливающий CmR фенотип). Чтобы удостовериться в том, что клонированные фрагменты действительно соответствуют нужным ORF, определяли их нуклеотидные последовательности в соответствующей гибридной плазмиде со стандартных праймеров pUC/M13F, pUC/M13R и cat. Полученными  гибридными плазмидами проводили трансформацию клеток штамма B.subtilis 19 (р19). Отбор трансформантов осуществляли по CmR-фенотипу. Гибридные плазмиды, вероятно, встраивались в участки тех ORF, фрагменты которых были на них клонированы, посредством гомологичной рекомбинации, тем самым нарушая функциональную целостность соответствующих ORF. Полученные трансформанты B. subtilis 19 (p19::pMTL21C)CmR и B. subtilis 19 (p19::p3)CmR были проверены на способность к конъюгативной передаче р19 в скрещиваниях

Рисунок 7. Генетическая карта четырех секвенированных контигов плазмиды р19. Горизонтальные стрелки обозначают ORF, направление стрелок - направление транскрипции ORF, цифры над стрелками соответствуют номерам ORF. Вертикальные стрелки обозначают ориджины конъюгационного переноса (oriT) и вегетативной репликации (oriV). Вертикальными линиями с утолщениями обозначены идентифицированные промоторы. + и Ц отмечают ORF, инактивация которых, соответственно, приводит к снижению способности р19 к конъюгативному переносу или не влияет на него. Заштрихованный участок ДНК принадлежит tra-району р19.

с реципиентами B. subtilis 19 (pV)StrR и B. subtilis19 (pV)TetR. В качестве положительного контроля использовался штамм-донор B. subtilis 19 (p19cat) CmRTra+, частота конъюгации которого составляла до 1 на  клетку реципиента. Таким образом нами было проверено 10 ORF. Как оказалось, инактивация ORF1, 4, 10, 12, 17 и 35 приводит к снижению частоты передачи р19 на 3-5 порядков  в  сравнении с контролем, что  указывает  на участие продуктов данных ORF в конъюгативном переносе плазмиды. Нарушение структуры ORF 6, 24, 25 и 32 не влияло на конъюгативные свойства плазмиды, и частота конъюгации не отличалась от контроля (рис.7). Вероятно, продукты данных ORF не участвуют в процессе конъюгативного переноса р19. Мы не выясняли, почему повреждение ORF вызывает значительное снижение, но не полное подавление конъюгации. Скорее всего, это связано с тем, что число копий плазмиды р19 может быть больше 1 на клетку, и наряду с мутантными, в клетках могла присутствовать нормальная плазмида.

Большая часть контига 2932 пн оказалась полностью гомологичной rep-району плазмиды  pBS72. Эта крупная плазмида, как и р19, выделена в Белоруссии из природного штамма B.subtilis (Titok et al., 2003). Район гомологии содержит две целые ORF р19 (ORF8, соответствующую  repA гену, и ORF7), конец ORF9, а также ориджин репликации (oriV) (рис.8). Для того, чтобы подтвердить наличие на данном фрагменте функционально активных генов,  необходимых  для  репликации,  мы сконструировали  гибридную

Рисунок 8. Сопоставление EcoRI-фрагмента р19 (2932 пн), клонированного на pBluescript-6, и гомологичного ему BglII-фрагмента  pBS72 (3081 пн), клонированного на pMTLBS72.

плазмиду p6cat. Она состояла из фрагмента ДНК р19 величиной 2932 пн,  вектора E.coli pBluescript и кассеты с геном cat. Полученная плазмида p6cat была способна трансформировать клетки B.subtilis и реплицироваться в них. Вероятно, фрагмент ДНК р19 величиной 2932 пн действительно несет функционально активный rep-район р19. На контиге 2932 пн слева от rep-района на участке ДНК, который не был секвенирован у  pBS72, располагалась  еще  одна  ORF - ORF 6.  Она соответствует небольшому белку (129 аа), содержащему HTH (helix-turn-helix) мотив, свойственный ДНК-связывающим белкам. Инактивация этой ORF не влияла на способность р19 к конъюгативному переносу. Таким образом, ORF 6 не является необходимым геном конъюгации, однако нельзя исключить какого-то (необязательного) участия продукта этого гена в конъюгативном процессе.

Контиги 2021 пн и 27814 пн содержали ORF, белковые продукты которых были гомологичны белкам конъюгации различных грам-положительных микроорганизмов. Характеризуя предполагаемые функции белковых продуктов ORF р19, которые могут быть вовлечены в процесс конъюгации, мы старались сравнивать их с компонентами VirB-VirD системы A. tumefaciens, являющейся модельной для описания системы секреции 4 типа (T4SS) и ее частного случая - mating pair formation (mpf) комплекса конъюгации (Christie, 2001; Schroder, Lanka, 2005). Ниже приведен перечень белковых продуктов идентифицированных ORF контигов 2021 пн и 27814 пн,  для которых можно предположить  определенные функции.

1. Продукты  ORF4, ORF10, ORF15 - гомологи VirD4-, VirB11-, VirB4-подобных белков. Это крупные белки, имеющие АТФ-связывающий и АТФ-азный домены. Они функционируют в виде гомомультимеров и являются лэнергетическими моторами конъюгации (Atmakiri et al., 2004). Эти белки являются универсальными для различных систем конъюгации - они обнаружены и у грам-отрицательных, и у грам-положительных микроорганизмов, хотя в некоторых системах конъюгации у грам-положительных бактерий VirB11-подобные белки могут  отсутствовать (Grohman et al., 2003). Инактивация ORF4 и ORF10 подавляет способность р19 к конъюгации, что подтверждает необходимость соответствующих белков для этого процесса.

2.Продукт ORF26 также имеет гомологию с VirD4-подобными белками. Однако его величина (200 аа вместо обычных для гомологов этого белка 700-800 аа), отсутствие  свойственных VirD4-подобным белкам консервативных доменов и гомология с VirD4-подобными белками не только продукта самой ORF26, но и аминокислотной последовательности, которая может быть транслирована с ДНК межгенного района  ORF26 -  ORF27, позволяют предположить, что  ORF26  является псевдогеном. Возможно, ORF26 является продуктом дупликации ORF4 и последующих делеций и других перестроек гена.

3. По нашим данным, ORF1 необходима для процесса конъюгации. Продукт ORF1 имеет небольшую гомологию (около 30% идентичных аминокислот) с несколькими белками грам-положительных микроорганизмов, содержащими TOPRIM-домен, характерный, в том числе,  для DnaG-праймаз и  топоизомераз. Однако сам белок, соответствующий ORF1, такого домена не имеет - возможно потому, что мы определили лишь часть нуклеотидной последовательность гена, без его начала. Нельзя исключить возможности  того, что  данный белок имеет топоизомеразную активность.

4.Продукт ORF12 - крупный белок, также необходимый для конъюгации р19; на N-конце он имеет множественные трансмембранные домены (5 по данным программы TMHMM2.0 и 7 - по данным программы InterProScan). Эта особенность белка позволяет предполагать, что он, возможно, является функциональным аналогом конъюгативного белка TcpH плазмиды pCW3 C.perfringens, который, в свою очередь, содержит VirB6-подобный домен (Teng et al., 2008). Белок VirB6 является образующим белком конъюгативного канала и взаимодействует как с передаваемой нитью ДНК, так и с другими VirB-белками (Schroder, Lanka, 2005).

  5.Продукт  ORF17 - лизоцим-подобный белок, имеющий трансгликозилазный и NLP/P60 домены. Вероятно, он является функциональным аналогом VirВ1-подобных  белков и вызывает частичное разрушение клеточной стенки.

  6.Продукт ORF21 - гомолог продукта ORF34 плазмиды pHTbeta E.faecium, который, вероятно, является релаксазой (Tomita, Ike, 2005). Релаксаза - важнейший и универсальный компонент различных систем конъюгации; этот фермент осуществляет одноцепочечный разрыв в передаваемой нити ДНК в специфическом участке, т.н. nic-сайте oriT, и ковалетно связывается с 5'-концом ДНК. Это событие инициирует процесс конъюгативного переноса ДНК. Как и продукт ORF34 pHTbeta,  белок, соответствующий ORF21 р19, имеет свойственные релаксазам-никазам четыре  аминокислотных мотива. Он может рассматриваться как функциональный аналог VirD2 белка плазмиды Ti. Белки, гомологичные продукту ORF21 р19, встречаются у различных грам-положительных микроорганизмов, в том числе у плазмид  pAW63 и pFR55 B.thuringiensis, pXO2 B.anthracis,  и, вероятно, составляет новую группу релаксаз, отличную от описанных (Francia et al., 2005; Garcillan-Barcia et al., 2009).

7.Продукт ORF32 является ДНК-топоизомеразой I/III типа. Активность этого гена не является необходимой для осуществления конъюгативного переноса. Однако,  ДНК-топоизомеразы являются компонентами многих конъюгативных систем (Zehner et al., 2000).

Белковые продукты ORF13, ORF14, ORF18, ORF20 имеют много гомологов в базах данных среди грам-положительных микроорганизмов, хотя их функции неизвестны

Вблизи от гена релаксазы (ORF 21), между ORF18 и  ORF19, расположен протяженный некодирующий район (271 пн), содержащий прямые и инвертированные повторы; в одном из плечей инвертированного повтора  можно выделить  последовательность нуклеотидов, характерную для nic-сайта  oriT мобилизуемых плазмид суперсемейства pMV158 (ANNNTG) (Francia et al., 2005). Мы полагаем, что в данном районе находится oriT плазмиды р19.

Исходя из результатов  инактивации различных ORF р19 и сведений о гомологии белковых продуктов этих ORF с белками баз данных, мы полагаем, что к tra-району плазмиды р19 могут быть отнесены контиг 2021пн и часть (17893 пн; ORF1 - ORF21) контига 27814пн. Это составляет 19914 пн и соответствует 20 ORF (рис.7). Правомерность такого разделения контига 27814 пн на две части подтверждает тот факт, что между ORF21 и ORF22 находится промотор. Особенностью белков tra-района является то, что они часто имеют трансмембранные районы: 12 из 18 белков tra-района р19 имеют сигнальные последовательности или трансмембранные участки; подобные участки имеют только 4 из 17 белков, не отнесенных нами к tra-району (здесь учтены белки, для которых известен N-конец).

По данным анализа нуклеотидных последовательностей конъюгативных плазмид, tra-район составляет несколько меньше половины величины плазмиды (Grohmann et el., 2003; Van der Auwera et al., 2005). Так как величина р19 составляет около 97 тпн, то можно предположить, что tra-район р19 имеет величину около 45 тпн. Следовательно, мы определили нуклеотидную последовательность  ДНК примерно половины tra-района р19. Таким образом, использованный нами метод (маркирование плазмиды р19 с помощью гена cat, отбор CmRTra- вариантов штамма B.subtilis 19 и клонирование прилежащих к гену cat фрагментов ДНК р19) позволил определить нуклеотидную последовательность значительной части tra-района р19.

3.5.Поиск у других микроорганизмов систем конъюгации, гомологичных системе конъюгации р19.

Представляло интерес выяcнить, существуют ли гомологи не только отдельных генов конъюгации р19, а всей их совокупности, т.е. существует ли какая-либо система конъюгации,  родственная таковой р19. Результаты поиска в GenBank представлены в  табл. 7. По числу гомологичных белковых продуктов, соответствующих ORF tra-района р19 (16 из 20), наиболее близка р19 система конъюгации штамма B.thuringiensis IBL200. Однако порядок расположения генов в tra-районах р19 и штамма IBL200 различен. Возможно, отчасти это связано с тем, что определение нуклеотидной последовательности ДНК штамма IBL200 не закончено и находится в стадии draft assembly. Кроме того, еще  10 организмов  Ц  все они  грам-положительные - имеют каждый от 9

Таблица 30. Результаты поиска в GenBank систем конъюгации, гомологичных системе конъюгации плазмиды р19.

Микроорганизм.	Плазмида	Количество гипотетических белковых продуктов, гомологичных белковым продуктам 20 ORF tra-района р19
B.thuringiensis IBL200	-	16
B.pseudomycoides DSM 12442	-	12
B. thuringiensis INTA-FR7-4	pRF55	11
L. monocytogenes str. 4b H7858	pLM80	11
C. perfringens D str. JGS 1721	-	11
C. perfringens E str. JGS 1987	-	11
C. perfringens B str. ATCC 3626	-	10
C. botulinum B str. Eklund 1713	pCLL	10
C. perfringens C str. JGS 1495	-	10
C. perfringens str. 13	pCP13	10
Exiguobacterium arabatum	pEspB	9
B. thuringiensis ser. israelensis ATCC 35646	-	8
B.thuringiensis s.konkukian 97-27	pBT9727	8
E.faecium	pHTbeta	8
B.thuringiensis s.kurstaki HD73	pAW63	6
B.anthracis str.Pasteur	pXO2	6

до 12 белков, гомологичных гипотетическим белкам tra-района р19. Меньшее число белков-гомологов tra-района р19 есть и у других грам-положительных микроорганизмов, в том числе  у плазмиды рХО2 B.anthracis.  При этом  и расположение генов, кодирующих гомологичные tra-белки, очень сходно с таковыми у р19; особенно это относится к расположению соответствующих генов у плазмид pFR55 B.thuringiensis, pCP13 C.perfringens, pCLL C.botulinum B и штамма JGS 1495 C.perfringens C. Это позволило расположить фрагменты 2021 пн, 4518 пн и 22728 пн на карте р19 в определенном порядке (рис. 6). Для некоторых микроорганизмов, фигурирующих в табл.7,  показано, что гены tra-района расположены на плазмидах (pRF55, pCLL, pCP13, pEspВ, pLM80); в остальных случаях они, возможно, расположены на хромосомах и являются частью либо интегрированных в хромосомы плазмид, либо конъюгативных элементов (ICE). Гомологи комплекса белков tra-района р19 встречаются среди грам-положительных микроорганизмов различных видов и родов, это несомненно свидетельствует о наличии межвидового и межродового горизонтального переноса подобных генов.  Однако ни один из указанных микроорганизмов не имеет гомологов всех белков tra-района р19; идентичность аминокислотных остатков в сравниваемых белках максимально составляет  61%, а для подавляющего большинства белков не превышает 40%. Различная степень гомологии белков позволяет предположить мозаичное строение tra-района р19. Следовательно, система конъюгации, определяемая плазмидой р19 имеет существенные отличия от уже описанных систем,  хотя и сходна с некоторыми из них. Нужно отметить, что для белков ни одного микроорганизма из табл 7 не обнаружена гомология с белками, кодируемыми rep-районом р19. Видимо, tra- и rep-районы р19 имеют различное происхождение, что еще раз подтверждает модульное строение плазмид.

Мы проверили, способны ли к мобилизационному переносу другие крупные плазмиды из белорусской коллекции. Для этого в клетки семи штаммов из белорусской коллекции, содержащих крупные плазмиды, была введена путем трансформации мелкая неконъюгативная плазмида pUB110, несущая маркер устойчивости к канамицину. Эти штаммы были использованы в  качестве доноров;  реципиентом  служил  штамм  19  (pV)  StrR.  Все

проверенные штаммы из белорусской коллекции были способны к мобилизационному переносу pUB110. Частота переноса была довольно  высока и колебалась от 10-3  (что равно частоте переноса pUB110, осуществляемого плазмидой р19) до 10-5. 

Мы хотели также проверить наличие на других крупных плазмидах из природных штаммов B.subtilis генов, гомологичных генам  конъюгации плазмиды р19. Для этого использовали  реакцию ПЦР с праймерами, созданными для генов конъюгации р19 ORF15 (гомолог virB4) и ORF10 (гомолог virB11). Были проверены девять штаммов B.subtilis из московской коллекции, несущие крупные плазмиды, и один такой штамм из белорусской коллекции. Только один из проверенных штаммов - BS15 из белорусской коллекции - дал результаты ПЦР, идентичные таковым для штамма B.subtilis 19. Таким образом, судя по нашим данным, из проверенных крупных плазмид только pBS15 несет гены virB4 и virB11, гомологичные генам плазмиды р19. Эти данные подтверждают предположение о том, что крупные плазмиды, выделенные из почвенных штаммов B.subtilis в разных местах Белоруссии, несут гомологичные системы конъюгации, существенно отличающиеся от таковых у других крупных плазмид грам-положительных микроорганизмов. Кроме того, уникальны и rep-районы этих плазмид. Таким образом, крупные плазмиды из белорусской коллекции, выделенные из разных штаммов в разных местах Белоруссии, очень сходны друг с другом. Это весьма необычный факт. Возможно, он может быть объяснен именно способностью плазмид к эффективному конъюгативному самопереносу.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ плазмид из природных штаммов B.subtilis, выделенных в Москве и Московской области (московская коллекция) и различных районах Белоруссии (белорусская коллекция). В 24 из 42 штаммов московской коллекции обнаружены плазмиды. Охарактеризованы 32 мелкие плазмиды из 29 штаммов обеих коллекций. Определена нуклеотидная последовательность двух плазмид: р1414 (7949 пн) и  p1516S (9881 пн). По величине, характеру рестрикции и гомологии ДНК исследованные мелкие плазмиды составляют однородную группу.
2. На основании данных сиквенса и гибридизации установлено, что у изученных мелких плазмид имеются следующие модули и входящие в них гены: mob (гомологичные гены, присутствуют у всех проверенных плазмид, кроме одной); hsp (гомологичные гены, встречаются у большинства плазмид), rap (имеются у некоторых плазмид и обладают не столь выраженной гомологией). Гены модуля par не обнаружены ни у одной плазмиды. Ген hsp, кодирующий белок - гомолог белков теплового шока, обнаружен нами в составе мелких плазмид впервые.
3. В клетках B.subtilis впервые обнаружен и полностью секвенирован IS-элемент - ISBsu2 (1383 пн), находящийся на плазмиде. Установлено, что гомологи данного IS-элемента присутствуют в геноме различных штаммов B.subtilis.
4. Обнаружено, что плазмида р19 (97 тпн) из штамма B.subtilis 19  белорусской коллекции способна эффективно осуществлять конъюгативный  перенос ДНК. Эффективность переноса значительно превосходит таковую для единственной известной конъюгативной плазмиды B.subtilis (natto) - pLS20. С помощью инсерционного мутагенеза плазмида р19 была маркирована геном устойчивости к хлорамфениколу, что позволило изучать различные виды и свойства конъюгативного переноса.
5. Изучены параметры самопереноса р19 и мобилизационного переноса pUB110. Перенос идет  как на твердой, так и в жидкой средах и может осуществляться в клетки других видов бацилл. Частота самопереноса достигает 1, частота мобилизационного переноса на два порядка ниже. Перенос р19 начинается сразу после контакта клеток-партнеров; мобилизационный перенос начинается лишь через 60 минут. Частота самопереноса мало зависит от изменения количественного соотношения клеток донора и реципиента и существенно зависит от того, какие штаммы используются в качестве партнеров. Мобилизационный перенос происходит в широком диапазоне температур (210-370С). Мобилизация осуществляется, вероятно, по механизму донации.
6. Впервые для крупных плазмид B.subtilis определена нуклеотидная последовательность ДНК значительной части конъюгативной плазмиды  р19 (33506 пн). На этой последовательности идентифицировано 39 открытых рамок считывания (ORF). Идентифицирован rep-район плазмиды р19, обусловливающий репликацию плазмиды и состоящий из гена rep (ORF8) и ориджина репликации. 20 ORF (19914 пн) могут быть отнесены к tra-району, обусловливающему конъюгативный перенос ДНК. Идентифицированы ORF, кодирующие белки-гомологи релаксазы, лизоцим-подобного белка, VirD4-, VirB4-, VirB11-подобных белков плазмиды pTi A. tumefaciens; идентифицирован ориджин конъюгативного переноса.
7. Судя по результатам компьютерного анализа предполагаемых продуктов ORF, принадлежащих к tra-району р19, конъюгативная система этой плазмиды имеет  частичное сходство с конъюгативными системами ряда грам-положительных микроорганизмов (роды Bacillus, Clostridium, Exiguobacterium, Listeria), хотя и отличается от них.
8. Крупные плазмиды из штаммов белорусской коллекции составляют однородную группу, отличающуюся от других известных крупных плазмид грам-положительных микроорганизмов по строению rep- и  tra-районов.
9. Конъюгативный перенос ДНК достаточно широко распространен у природных штаммов B.subtilis и может играть существенную роль в горизонтальном распространении генов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Полуэктова Е.У., Карандашова И.В., Сапогова Е.Ю., Прозоров А.А. Изучение гомологии природных криптических плазмид Bacillus subtilis.  Генетика. 1996. Т.32. № 11. С.1498-1503.
2. Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Гагарина Е.Ю., Прозоров А.А. Одновременное присутствие трех криптических плазмид разной величины в почвенном штамме Bacillus subtilis. Генетика. 1999. Т.35. № 1. С.46-49.
3. Thorsted P.B., Thomas C.M., Poluektova E.U., Prozorov A.A. Complete sequence of Bacillus subtilis plasmid p1414 and comparison with seven other plasmid types found in Russian soil isolates of Bacillus subtilis. Plasmid. 1999. V.41. P.274-281.
4. Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Прозоров А.А. Крупная конъюгативная плазмида из почвенного штамма Bacillus subtilis. Генетика. 2000. Т.36. № 7. С.1000-1002.
5. отарева О.В., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров А.А. Крупная плазмида из почвенного штамма Bacillus subtilis, осуществляющая конъюгативную мобилизацию с высокой частотой. ДАН. 2001. Т.379. № 1. С.130-131.
6. отарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров А.А. Конъюгативная мобилизация, осуществляемая с высокой частотой природным штаммом Bacillus subtilis, несущим крупную плазмиду. Генетика. 2002. Т.37. № 12. С.1598-1603.
7. Полуэктова Е.У., Хольсаппель С., Гагарина Е.Ю., Гельфанд М.С., Брон С., Прозоров А.А. Наличие генетического мобильного элемента ISBsu2 из криптической плазмиды в хромосоме ряда штаммов Bacillus subtilis. ДАН. 2002. Т.386. № 4. С.552-554.
8. Полуэктова Е.У., Хольсаппель С., Гагарина Е.Ю., Брон С., Прозоров А.А. Присутствие мобильного генетического элемента ISBsu2 в  плазмиде почвенного штамма Bacillus subtilis и в хромосомах ряда штаммов этой бактерии. Генетика. 2002. Т.38. № 12. С.1719-1722.
9. отарева О.В., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров А.А. Почвенный штамм Bacillus subtilis с крупной плазмидой, осуществляющей с высокой частотой конъюгативную мобилизацию. Микробиология. 2002. Т.71. № 2. С.254-257.
10. отарева О.В., Полуэктова Е.У., Федорина Е.А., Незаметдинова В.З., Прозоров А.А. Межвидовой  и внутривидовой конъюгативный перенос различных плазмид у бацилл. Генетика. 2003. Т.39. № 8. С.1141-1144.
11. Хольсаппель С., Гагарина Е.Ю., Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Гельфанд М.С., Прозоров А.А., Брон С. Структура мобильного генетического элемнта ISBsu2 из криптической плазмиды р1516 почвенного штамма Bacillus subtilis и наличие гомологов этого элемента в хромосомах различных штаммов Bacillus subtilis. Микробиология. 2003. Т.72. № 1. С.70-75.
12. Poluektova E.U., Fedorina E.A., Lotareva O.V., Prozorov A.A. Plasmid transfer in bacilli by a self-transmissible plasmid p19 from a Bacillus subtilis soil strain. Plasmid. 2004. V.52. 212-217.
13. Полуэктова Е.У., Федорина Е.А., Прозоров А.А. Конъюгативный перенос крупной плазмиды р19 у различных штаммов Bacillus subtilis. Генетика. 2005. Т.41. № 5. С.601-606.
14. Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров А.А. Способность к конъюгации и сравнительная характеристика крупных плазмид, содержащихся в природных штаммах Bacillus subtilis из разных регионов Восточно-Европейской равнины. Микробиология. 2007. Т.77. № 2. С.219-224.
15. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Шиловский И.П., Федорина Е.А., Незаметдинова В.З., Родионова С.А., Прозоров А.А. Молекулярный анализ некоторых генов плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19, участвующих в процессе конъюгации. Генетика. 2008. Т.44. № 5. С.623-630.
16. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Незаметдинова В.З., Шиловский И.П., Родионова С.А., Прозоров А.А. Характеристика определяющего конъюгативный перенос tra-района плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis. Генетика. Т.45. 2010. № 1.

Тезисы

1. Nezametdinova V., Poluektova E., Kanapina A., Kanapin A., Sapogova E., Prozorov A. Properties of cryptic plasmids from the soil Bacillus subtilis strains. 12th European meeting on bacterial gene transfer and expression. Siena, Italy, 1996. P.121.
2. Poluektova E.U., Thorsted P.B., Nezametdinova V.Z., Lotareva O.V., Gagarina E.J., Thomas C.M., Prozorov A.A. Bacillus subtilis cryptic plasmids, and their possible transfer in natural habitats. 13th European meeting on bacterial transformation and 5th European meeting on the molecular biology of the Pneumococcus. Kaiserslautern, Germany, 1999. B.3.
3. Poluektova E.U., Thorsted P.B., Nezametdinova V.Z., Lotareva O.V., Thomas C.M., Prozorov A.A. Cryptic plasmids found in the Bacillus subtilis strains from the Moscow region soils. International conference on bacilli. Senri-Chuo, Osaka, Japan, 1998. P.74.
4. Полуэктова Е.У., Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Титок М.А., Прозоров А.А. Крупные плазмиды из почвенных штаммов Bacillus subtilis и осуществляемая ими конъюгативная мобилизация. Международный симпозиум Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология. Москва, 2001. С.132.
5. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Хольсаппель С., Тимакова Н.В., Прозоров А.А. Мелкие и крупные плазмиды в природных штаммах Bacillus subtilis. Тезисы III съезда ВОГиС Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития. Москва, 2004. С.344.
6. Шиловский И.П., Полуэктова Е.У. Идентификация генов конъюгации плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis. Тезисы международной школы-конференции Генетика микроорганизмов и биотехнология, посвященной 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна. Москва-Пущино, 2006. С.178-179.
7. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Шиловский И.П., Прозоров А.А. Различные классы плазмид, обнаруженные в штаммах Bacillus subtilis из почв некоторых регионов Восточно-Европейской равнины: свойства, молекулярная характеристика, возможная роль в биоценозах. Тезисы международной научной конференции Микроорганизмы и биосфера. Москва, 2007г. С.102.
8. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Незаметдинова В.З., Шиловский И.П., Прозоров А.А. Характеристика tra-района конъюгативной плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19. Тезисы международной научной конференции Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты. Минск, 2008г. С.26-27.
9. Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Шиловский И.П., Прозоров А.А. Строение tra-района конъюгативной плазмиды р19 из почвенного штамма  Bacillus subtilis. Тезисы съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина,  и V съезда ВОГиС. Москва, 2009г. С.42.

   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии