Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Андрющенко Сергей Валерьевич
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ СЕКРЕТИРУЕМЫХ ИНГИБИТОРОВ ЛИЗОЦИМА В АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
03.02.03 - Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Оренбург - 2012
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждени науки Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук.
Научный консультант:
кандидат медицинских наук, доцент Перунова Наталья Борисовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО Оренбургская государствен- ная медицинская академия Минздрава России Чайникова Ирина Николаевна доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО Башкирский государствен- ный медицинский университет Минздрава России Туйгунов Марсель Маратович
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Челябинский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится л20 декабря 2012 г. в _10_ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03. при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, в конференц-зале (аудитория №205), телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, Email: orgma_dsl@esoo.ru, Официальный сайт:
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА Автореферат разослан л___ ____________ 20__ г., автореферат и текст объявления размещен на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Немцева Наталия Вячеславовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В настоящее время у бактерий различных таксономических групп выявлены как специфические, так и неспецифические механизмы, обеспечивающие либо пассивную устойчивость к лизоциму, либо активное ингибирование его гидролитического эффекта (Callewaert L. et al., 2008).
Антилизоцимная активность, являясь одним из ключевых фенотипических маркеров персистентного профиля бактерий, отражает главным образом способность клетки к продукции экскретируемых соединений, обеспечивающих инактивацию лизоцима в питательной среде (Бухарин О.В., 1999). В ходе работ по выявлению механизмов антилизоцимной активности на примере как грамположительных бактерий рода Bacillus (Кириллов Д.А., Кириллов В.А., 2004), так и энтеробактерий (Бондаренко В.М. и др., 1994) было установлено, что генетические детерминанты данного признака имеют плазмидную локализацию.
Вместе с тем, в зарубежной литературе рассматривается феномен устойчивости к лизоциму штаммов-продуцентов, кодирующийся у энтеробактерий двумя семействами генов: ivyC и pliC/mliC (Deckers D. et al., 2008). Функционально-полноценные гомологи гена ivyС среди гамма-протеобактерий распространены достаточно широко и встречаются в хромосомах ряда условнопатогенных представителей родов Escherichia/Shigella, Erwinia, Klebsiella, Yersinia и Pseudomonas. Однако у бактерий рода Salmonella гомологи данного гена не выявлены (Abergel, C., V. Monchois et al., 2007). Второе семейство белков-ингибиторов, существующее у микроорганизмов рода Salmonella было обнаружено несколько позже: PliC/MliC, периплазматический вариант которого кодируется также в хромосомах представителей родов Salmonella и Pseudomonas (Callewaert L. et al., 2008).
Известно, что продукт гена mliC является мембраносвязанным белком, тогда как у белков PliC и IvyС показана периплазматическая локализация (Callewaert L. et al., 2008). Не смотря на то, что не исключена возможность выхода молекул двух последних типов белков за пределы наружной мембраны грамотрицательной клетки-продуцента, где их ингибирующий эффект и может быть реализован в виде антилизоцимной активности, в существующих исследованиях данных белков дистантный аспект их ингибирующего эффекта не анализируется.
После завершения проектов по секвенированию геномов патогенных вариантов K. pneumoniae (Wu K.M. et al., 2011), одна из открытых рамок считывания в нуклеотидных последовательностях плазмид вирулентности была аннотирована как гомолог pliC. Этот факт открыл новый путь к объединению существующих подходов по исследованию механизмов как лизоцимрезистентности, так и антилизоцимной активности микроорганизмов.
Цель и задачи исследования. Цель исследования - определение связи генетических детерминант ингибиторов лизоцима с фенотипическим проявлением антилизоцимной активности энтеробактерий.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Провести анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов энтеробактерий, кодирующих секретируемые ингибиторы лизоцима.
2. Оценить распространенность известных генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима у микроорганизмов видов E. coli, K. pneumoniae, S. enterica и определить плазмидный профиль исследуемых штаммов энтеробактерий.
3. Изучить антилизоцимную активность микроорганизмов видов E. coli, K. pneumoniae, S. enterica с разным профилем генов ингибиторов лизоцима.
4. Выявить изменение уровня антилизоцимной активности энтеробактерий, различающихся по плазмидному профилю под воздействием неспецифических модификаторов антилизоцимной активности.
Новизна исследования. Проведенный филогенетический анализ внутри- и межвидового распространения генов секретируемых ингибиторов лизоцима pliC и ivyC среди условно-патогенных и патогенных энтеробактерий показал высокую частоту случаев горизонтального пути переноса данных генов среди известных геномов различных сероваров E. coli, S. enterica и K. pneumoniae.
Выявлено наличие хромосомных генетических детерминант исследуемых секретируемых ингибиторов лизоцима среди большинства исследованных штаммов E. coli и S. enterica, а также вариабельность встречаемости хромосомного гена ivyC и плазмидного гомолога гена pliC у K. pneumoniae.
Наличие генов, кодирующих ингибиторы лизоцима семейств ivyC и pliC, коррелировало с уровнем антилизоцимной активности исследуемых штаммов энтеробактерий. Выявлены различия во вкладе данных генов в общий уровень антилизоцимной активности бактерий, проявляющиеся в преобладающем влиянии гена pliC на уровень секреторной антилизоцимной активности микроорганизмов.
Определено, что уровень лизоцимрезистентности энтеробактерий является преимущественно видовой характеристикой и определяется главным образом несекретируемыми механизмами.
Суббактериостатические концентрации хлорамфеникола вызывают повышение уровня антилизоцимной активности энтеробактерий при наличии генетических детерминант ингибиторов лизоцима семейства pliC, и, в меньшей степени, ivyC, как плазмидной, так и хромосомной локализации. Напротив, культивирование исследуемых штаммов энтеробактерий в присутствии акридоновых соединений акридинового оранжевого и акридонуксусной кислоты в субингибиторных концентрациях приводит к значительному снижению антилизоцимной активности.
Установлено, что наличие в среде культивирования акридонуксусной кислоты не оказывало влияния на копийность плазмидной ДНК энтеробактерий при выраженном подавлении антилизоцимной активности по сравнению с акридиновым оранжевым.
Культивирование энтеробактерий в условиях пептидогликанового стресса субингибиторными концентрациями -лактамного антибиотика не приводило к значительному повышению антилизоцимной активности микроорганизмов, что свидетельствует об отсутствии существенного влияния регуляторной системы Rсs на фенотипическое проявление данного признака.
Практическая ценность работы. Выявленные консервативные фрагменты нуклеотидных последовательностей генов ингибиторов лизоцима позволили создать олигонуклеотидные зонды и праймеры широкой специфичности, на основе которых разработана экспериментальная ПЦР тест-система для скрининга генов секретируемых ингибиторов лизоцима с учетом возможной функциональной полноценности и вариабельности выявляемых последовательностей.
Предложена методика неспецифической стимуляции экспрессии данных генетических детерминант при помощи хлорамфеникола для определения функционального резерва антилизоцимной активности микроорганизмов, что может быть использовано для выявления потенциала антилизоцимной активности у бактерий.
Положения, выносимые на защиту:
1. Антилизоцимная активность энтеробактерий - часть общего механизма лизоцимрезистентности микроорганизмов, обусловленная генами экскретируемых ингибиторов лизоцима.
2. Молекулярно-генетический подход в виде разработанной экспериментальной тест-системы на основе метода ПЦР выявляет гены секретируемых ингибиторов лизоцима в скрининговом режиме.
3. Высокий уровень антилизоцимной активности энтеробактерий сопряжен с наличием гена pliC, тогда как у носителей гена ivyC выявляются низкие значения данного признака.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учных Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии (Пермь, 2011); VII Всероссийской конференции Персистенция микроорганизмов (Оренбург, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий отечественных и 90 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 4 таблицами и 30 рисунками.
Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН в рамках научно-исследовательской темы открытого плана НИР ИКВС УрО РАН Изучение механизмов взаимоотношений симбионтов и их регуляции в различных биологических системах (№ гос. регистрации 0120.02 600145); фрагменты диссертационной работы выполнены и включены в отчеты по теме Лекарственная регуляция персистентного потенциала микроорганизмов (№ гос. регистрации 0120.0 853339); Программы фундаментальных исследований Президиума РАН Фундаментальные науки - медицине (проект № 09-П-4-1007).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования Материалом для исследования послужили 150 штаммов энтеробактерий:
по 50 культур негемолитических E. coli, K. pneumoniae, изолированных из испражнений пациентов с I - II степенью дисбиоза кишечника и S. enterica, выделенных от больных острой кишечной инфекцией и реконвалесцентных сальмонеллезных бактерионосителей. Полученные штаммы были идентифицированы по морфологическим, тинкториальным и биохимическим признакам с использованием коммерческих тест-систем ЭНТЕРО-тест24 (лLaСhema, Чехия).
Антибиотикорезистентность исследуемых штаммов бактерий определялась методом серийных разведений согласно стандарту CLSI в отношении ампициллина, канамицина, стрептомицина, тетрациклина и хлорамфеникола.
У всех исследуемых штаммов был определен уровень антилизоцимной активности чашечным и фотометрическим методом (Бухарин О.В., 1999).
Сорбционный компонент данного признака выявлялся по методу В.Ю. Соколова и А.П. Луда в модификации (Черкасов С.В., 2011). Конечная концентрация раствора лизоцима для обоих методов составила 5 мкг/мл.
Устойчивость энтеробактерий к лизоциму (0,2 мг/мл) определялась в комбинированной среде на основе LB-бульона с добавлением 10 mM трилона Б, использованным для повышения проницаемости наружной мембраны грамотрицательных бактерий в отношении лизоцима (Deckers D. et al., 2004).
С целью создания экспериментальной тест-системы скринингового выявления генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима методом ПЦР был произведен поиск наиболее консервативных участков нуклеотидных последовательностей из базы данных GenBank (лNational Library of Medicine, США) и осуществлен подбор праймеров видоспецифичного диапазона для выявления генов pliC и ivyC. Верификация секретируемого характера предполагаемого продукта трансляции плазмидного гомолога pliC была произведена с применением сервиса SignalIP 4.0 (лCenter for Biological Sequence Analysis at Technical University of Denmark, Дания). Филогенетический анализ распространения изучаемых генов выполнен с использованием пакета программного обеспечения Lasergene 7.1 (лDNASTAR, Inc., США). Верификация специфичности полученных олигонуклеотидов производилась с помощью сервиса Standard Nucleotide BLAST (лNational Library of Medicine, США).
Выделение матричной ДНК каждого исследуемого штамма для ПЦР проводилось с использованием 0,1 мл смеси реагентов ДНК-Экспресс (НПФ Литех, Россия). Полученный супернатант вносился в подготовленную реакционную смесь для ПЦР в объеме 5 мкл.
Реакционная смесь для ПЦР в объеме 15 мкл приготовлялась из набора праймеров и реагентов ООО Синтол. Реакция проводилась в ДНКамплификаторе Терцик МС-2 (ДНК-технология, Россия).
Получаемые ампликоны подвергались агарозному гель-электрофорезу (Маниатис Т. Фрич Э. Сэмбрук Дж., 1984). Визуализация результатов разделения нуклеиновых кислот проводилась в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 312 нм на установке гель-документирования Vilber Lourmat.
Для оценки размера и количества плазмид использовался линейный маркер л100 bp (ООО Лаборатория Медиген, Россия) в количестве 1,5 мкг.
С целью контроля специфичности ПЦР-анализа были использованы модельные штаммы E. coli K-12 MG1655 и E. coli XL1-Blue, имеющие ген ivyC и с отсутствием генов pliC, eatA и espP.
Для изучения различий в динамике фенотипических проявлений генов секретируемых ингибиторов лизоцима, имеющих различную локализацию, было проведено исследование влияния хлорамфеникола и акридоновых соединений на число копий пДНК и уровень АЛА плазмидосодержащих штаммов, и бесплазмидных вариантов клебсиелл и сальмонелл в качестве контроля.
В работе был использован акридиновый оранжевый (Диа-М, ч.д.а., Россия), водный раствор 25 мг/мл, применявшийся в 0,5 и 1-кратной начальной ингибирующей концентрации (37,5 и 75 мкг/мл соответственно) по T.J. Tomas с соавт. и акридонуксусная кислота в виде препарата Циклоферон (Полисан, Россия), раствор для инъекций 125 мг/мл, взятый в конечной концентрации мг/мл LB-бульона, так как антимикробный эффект препарата не был выявлен.
Для амплификации числа копий плазмид и стимуляции антилизоцимной активности применялся хлорамфеникол (лPanreac, pharm grade, Испания).
Культивирование и инкубация исследуемых штаммов в среде с указанными соединениями проводились по методике неспецифической амплификации плазмидной ДНК в богатой среде с хлорамфениколом (Маниатис Т. Фрич Э. Сэмбрук Дж., 1984) В качестве контроля использовалась среда LB без добавления антибиотика.
Выделение плазмидной ДНК проводилось с помощью стандартных наборов Plas/mini Isolation Kit XL (лAppliChem, Германия).
Полученные растворы плазмидной ДНК анализировались с помощью агарозного гель-электрофореза по вышеприведенной методике.
Определение числа копий плазмид, выделенных из клеток нормированных бактериальных культур исследуемых штаммов осуществлялось путем сравнения интенсивности полос люминесценции маркерных и опытных проб ДНК с использованием программного обеспечения TotalLab 2.01 (Nonlinear Dynamics, Ltd, Великобритания).
Выявление случаев возможной полной утраты плазмид проведено путем рассева микробиологической петлей бульонной культуры микроорганизмов в поздней логарифмической фазе на 1,5% LB-агар с последующим анализом получаемых клонов на наличие выделяемых плазмид.
С целью выявления роли стресс-регуляторной системы Rcs в экспрессии антилизоцимной активности производилось культивирование энтеробактерий в условиях пептидогликанового стресса, вызываемого -лактамным антибиотиком (Laubacher, M. E., and S. E. Ades. 2008).
Результаты исследования и их обсуждение Для проведения филогенетического анализа и конструирования праймеров для выявления рассматриваемых в работе генов методом ПЦР, в базах данных GenBank нами был отобран 31 гомолог гена ivyC у разных подвидов и сероваров Echerichia coli, 4 гомолога гена ivyC среди секвенированных штаммов K. pneumoniae и 1 последовательность ivyC у K. variicola. Аналогичный поиск в отношении гомологов гена pliC позволил отобрать 12 записей искомых последовательностей среди представителей вида S. enterica, все выявленные последовательности имели хромосомную локализацию.
Вместе с тем, были найдены две идентичные последовательности, аннотированные как гомологи pliC, но локализованные в мегаплазмидах вирулентности у бактерий вида K. pneumoniae, экспериментальной верификации функции белкового продукта которых до настоящего времени не проводилось.
Аминокислотная последовательность гена pliC плазмидной локализации была представлена для автоматического анализа с помощью сервиса SignalP 4.0. В результате анализа было установлено наличие сигнального пептида, отщепляющегося между 21 и 22 аминокислотными остатками, что свидетельствовало о секретируемом характере синтезируемого белка.
Филогенетический анализ в виде дендрограмм выровненных по методу ClustalW нуклеотидных последовательностей известных гомологов гена pliC, распространенных среди подвидов и сероваров S. enterica (рис.1B), и гена ivyC, выявляемого в геномах сероваров E. coli (рис. 2D) показал существенно отличающийся вариант ветвления по сравнению с полногеномными дендрограммами данных штаммов (рис. 1A, рис. 2C), причем в геноме серовариантов Paratyphi C гомолог гена pliC отсутствовал. Это указывает на высокую частоту случаев невертикального пути переноса данного гена между сероварами данных видов. Аналогичная картина, демонстрирующая высокую частоту случаев горизонтального обмена геном ivyC, была выявлена между видами K. pneumoniae и K. variicola.
Проведенный нами ПЦР-скрининг генов секретируемых ингибиторов лизоцима, отдельные результаты которого представлены в виде фореграмм на рис. 3, позволил выявить ivyC-негативные штаммы E. coli 243, 251 и 254 (рис.
3A), варианты K. pneumoniae, демонстрирующие негативный результат при выявлении обоих генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима (штаммы №№ 261, 270, 271) и ivyC-pliC-позитивные варианты (штаммы №№ 275, 276, 277, 278) (рис. 3D). Критерием присутствия у штамма искомых генов явилось наличие специфических ампликонов соответствующего размера, детектируемых на приведенных фореграммах в виде полос люминесценции соответствующей массы.
Рис. 1. Полногеномная дендрограмма сероваров S. enterica (A) и филогенетическое дерево гомологов гена pliC (B).
Рис. 2. Полногеномная дендрограмма E. coli (C), и филогенетическое дерево гомологов гена ivyC (D).
A B C D Рис. 3. Фореграммы результатов ПЦР-анализа наличия генов ivyC E. coli (A), pliC S.enterica (B), ivyC K. pneumoniae (C), pliC K. pneumoniae (D) у ряда исследуемых штаммов. Наличие полос люминесценции - положительный результат ПЦР с препаратом ДНК исследуемого штамма, индекс которого указан в верхней части дорожек. Подчеркнуты индексы штаммов, использованных в качестве контролей. Указатель л100 bp соответствует маркеру молекулярных масс.
В результате анализа полученных в эксперименте фореграмм установлено различие в распространенности генов ivyC и pliC (табл. 1) и показано, что встречаемость хромосомных генов: как ivyC у негемолитических E. coli, выделенных у обследуемых c I-II степенью дисбиоза кишечника, так и pliC у S. enterica - возбудителей сальмонеллеза превышает 90% (943% у E. coli и 923,5% у S. enterica).
Представители условно-патогенных бактерий, выявляемых при дисбиозе кишечника - K. pneumoniae - характеризовались наличием гена ivyC только в 815,5% случаев и гена pliC в 195,5% случаев.
В целях сопоставления получаемых данных с работами других авторов (Кириллов Д.А., Кириллов В.А., 2004) нами было проведено сравнение наличия генов ингибиторов лизоцима с плазмидным профилем и исследуемыми фенотипическими параметрами: профилем антибиотикорезистентности и уровнем АЛА. Среди исследуемых штаммов энтеробактерий плазмиды в диапазоне до 30 тысяч н.п. значительно чаще выделялись у полиантибиотикорезистентных штаммов E. coli, которые показали наибольшее разнообразие резистоваров, тогда как все исследуемые штаммы клебсиелл имели устойчивость только к ампициллину, а сальмонеллы наличия антибиотикорезистентности не демонстрировали. В то же время корреляция наличия искомых генов с наличием малых плазмид и устойчивостью к антибиотикам не отмечена.
Табл. 1. Профиль распределения генетических детерминант ингибиторов лизоцима, эписом, антибиотикорезистентности и антилизоциманой активности среди исследуемых видов энтеробактерий.
Гены секретируемых Фенотипические Плазмидный профиль ингибиторов лизоцима показатели Виды Семейство и Частота Диапазон Частота Резисто- АЛА, локализация выделения,% длин, т.п.н. выделения,% профиль мкг/мл*ОП Нерезис963 10 - 30 326,тентные АмпицилivyC, E. coli 936 5,5 - 10 246 линрезис- 1,90,хромосома тентные Полирезис 809 1,7 - 8 97-тентные ivyC, 815,5 1,5 - 3 258 3,40,хромосома АмпицилivyC, K. pneumoniae ~200 линрезисхромосома;
195,5 (pliC+-мега- 195,5 тентные 3,80,pliC, плазмида) плазмида pliC, НерезисS. enterica 923,5 1,5 - 2,5 306,5 4,00,хромосома тентные С целью выявления вклада секретируемых ингибиторов в общий уровень антилизоцимной активности, было проведено определение выраженности АЛА у групп штаммов энтеробактерий с различным профилем генов как стандартным чашечным так и фотометрическим методом, и осуществлен анализ сорбционного компонента АЛА.
Так, при использовании чашечного метода (рис. 4A) оказалось, что ivyCнегативные штаммы E. coli показали наиболее низкий уровень антилизоцимной активности (0,30,25 мкг/мл), который достоверно не отличался от уровня АЛА у ivyC-положительных штаммов E. coli (10,7 мкг/мл). В случае оппозитных по наличию гена ivyC клебсиелл наблюдалась обратная картина, также не выявляющая достоверных отличий между группой ivyC-негативных K. pneumoniae (2,70,9 мкг/мл) и ivyC-позитивных штаммов (1,40,6 мкг/мл).
Напротив, штаммы K. pneumoniae, несущие плазмидный гомолог гена pliC, а также сальмонеллы, обладающие геном pliC хромосомной локализации продемонстрировали значительно более высокий уровень исследуемого признака: 5,60,9 мкг/мл.
При использовании фотометрического метода определения антилизоцимной активности в супернатанте исследуемых культур (рис. 4B) выявлена сходная картина, однако разница значений определяемого признака была несколько ниже: антилизоцимная активность изученных штаммов E. coli не зависимо от наличия гена ivyC не превышала значения 2 мкг/мл*ОП, тогда как средние значения данного показателя в случае штаммов клебсиелл и сальмонелл колебался в пределах от 3,4 до 4,5 мкг/мл*ОП, что может свидетельствовать о наличии в супернатанте культур исследуемых видов энтеробактерий ряда неспецифических факторов, влияющих на ферментативную активность лизоцима (Петровский А.С., 2009). Тем не менее, наиболее высокий уровень АЛА также наблюдался у S. enterica (40,35 мкг/мл*ОП).
Таким образом, наличие гена ivyC у исследованных штаммов не было сопряжено с высокими значениями АЛА, тогда как наличие плазмидного гена pliC у клебсиелл и сальмонелл соотносилось с высоким уровнем антилизоцимной активности исследуемых микроорганизмов.
Выявленные различия в уровне антилизоцимной активности штаммов, отличающихся по наличию гена pliC плазмидной локализации и отсутствие существенного снижения данного фенотипического признака среди ivyC- отрицательных штаммов E. coli и K. pneumoniae подтверждает предположение о ведущей роли гена pliC в дистантном ингибировании лизоцима, особенно если A * * E. coli ivyC- E. coli ivyC+ K. K. K. S. enterica S. enterica pneumoniae pneumoniae pneumoniae pliС- pliС+ ivyC- pliC- ivyC+ pliC- pliC+ ivyC+ B 4,* * 3,2,1,0,E. coli ivyС- E. coli ivyС+ K. K. K. S. enterica S. enterica pneumoniae pneumoniae pneumoniae pliC- pliC+ ivyС- pliС- ivyС+ pliС- pliC+ ivyC+ Рис. 4. Уровни антилизоцимной активности исследуемых вариантов энтеробактерий, измеренные чашечным (A) и фотометрическим (B) методом.
По оси ординат: уровень антилизоцимной активности.
По оси абсцисс, справа налево:
ivyC-негативные штаммы E. coli, ivyC-позитивные штаммы E. coli, ivyC-негативные штаммы K. pneumoniae (без плазмидного гена pliC), ivyC-позитивные штаммы K. pneumoniae (без плазмидного гена pliC), ivyC и pliC-позитивные штаммы K. pneumoniae, pliC-позитивные штаммы S. enterica * - достоверное отличие значений АЛА у штаммов-носителей генов ivyC или от значений, полученных для ivyC/pliC-негативных вариантов того же вида (p<0,05).
мкг / мл мкг/мл*ОП принять во внимание тот факт, что молекулярная масса белка PliC, кодируемого плазмидой вирулентности K. pneumoniae, более чем в 1,5 раза меньше (9,кДа), чем у IvуC а, следовательно, увеличивается возможность к выходу белка PliC в межклеточную среду из периплазматического пространства и более свободной диффузии в ней, где его наличие и фиксируется существующими методами как антилизоцимная активность.
Анализ сорбционного компонента антилизоцимной активности был осуществлен с целью верификации того факта, что значения АЛА, определенные чашечным методом обнаруживают секретируемый компонент данного признака. Существенных изменений активности лизоцима после соинкубирования его с бактериальной массой исследуемых штаммов с помощью данного метода не выявлено.
В результате скрининга лизоцимрезистентности в комбинированной среде установлено, что МПК лизоцима у исследуемых штаммов энтеробактерий не зависела от наличия генов секретируемых ингибиторов лизоцима и наблюдалась только у штаммов, принадлежащих к виду Klebsiella pneumoniae.
Изучение динамики антилизоцимной активности исследуемых видов энтеробактерий с различным профилем генов секретируемых ингибиторов лизоцима (рис. 5A) выявило наиболее существенное изменение признака под воздействием данных препаратов у штаммов S. enterica и K. pneumoniae, содержащих гомологи гена pliC и менее выраженную динамику исходных значений антилизоцимной активности энтеробактерий, содержащих в генотипе только гомологи гена ivyC.
Проведенное на заключительном этапе работы исследование динамики копийности плазмид и антилизоцимной активности в присутствии вышеуказанных плазмид-ассоциированных регуляторных факторов у штаммов E. coli 252 и K. pneumoniae 278 и 275 (рис. 5B) показало нарастание числа копий пДНК с увеличением концентрации хлорамфеникола до бактериостатической в 1,3 раза.
Исследование динамики показателя у указанных штаммов под воздействием акридинового оранжевого выявило снижение копийности плазмид вплоть до полного отсутствия регистрируемых количеств пДНК уже при достижении начальной ингибиторной концентрации препарата.
A B pKP2pKP21x НИК АО 0,5x НИК АО КОНТРОЛЬ 0,5x МПК ХФ 1x МПК ХФ Рис. 5. Влияние субингибиторных конценттраций акридинового оранжевого и (АО) хлорамфеникола (ХФ) на уровень антилизоцимной активности исследуемых энтеробактерий(A) и копийность плазмид штаммов K. pneumoniae 275 и 278 (B).
По оси ординат: удельное количество плазмид на бактериальную клетку (A) и уровень антилизоцимной активности (B); По оси абсцисс, справа налево значения параметров после культивирования в среде с добавлением:
1-кратной НИК акридинового оранжевого (1x НИК АО) 0,5-кратной НИК акридинового оранжевого (0,5x НИК АО) без добавления препаратов (контроль) 0,5-кратной МПК хлорамфеникола (0,5x МПК ХФ) 1-кратной МПК хлорамфеникола (1x МПК ХФ) плазмид / клетку Однако вторичное исследование получаемых клонов показывало сохранность плазмид в бактериальных клетках, что свидетельствовало об адаптированности штамма бактерии-хозяина к наличию плазмид с ослабленным контролем репликации (Bouma J.E., Lenski R.E., 1988).
Внесение в среду культивирования акридонуксусной кислоты в виде препарата Циклоферон в концентрации до 5 мг/мл не вызывало значимого изменения количества плазмид.
Определение динамики антилизоцимной активности исследуемого штамма при действии акридинового оранжевого выявило сходную картину: при повышении концентрации акридинового оранжевого до уровня начальной ингибирующей концентрации происходило уменьшение уровня антилизоцимной активности до нулевых значений. Под действием препарата Циклоферон также наблюдалось снижение значений антилизоцимного признака вплоть до полного его отсутствия.
Ингибирование числа копий плазмидной ДНК и уровня антилизоцимной активности под действием акридинового оранжевого и повышение данных показателей после воздействия хлорамфеникола у исследованных штаммов не зависимо от видовой принадлежности и плазмидного профиля, а также при наличии генов секретируемых ингибиторов лизоцима любого из двух известных типов подводит к выводу о комплексном характере действия исследуемых препаратов на различные анаболические системы бактериальной клетки, которое реализуется, возможно, через неспецифическое изменение интенсивности синтеза и деградации нуклеиновых кислот трансляционной машины (J Midgley., W.Gray, 1971; V. Shen, H. Bremer, 1977).
Уменьшение уровня антилизоцимной активности под действием Циклоферона при отсутствии влияния его на копийность плазмид показывает, что механизм регуляции персистентных свойств препаратом Циклоферон находится не на уровне генотипа и не может быть обусловлен уменьшением дозы генов, локализующихся в плазмидах с нестрогим контролем репликации.
Попытка стимуляции секреции внеклеточных ингибиторов лизоцима методом пептидогликанового стресса, вызванного Цлактамным антибиотиком, не привела к достоверному изменению выраженности антилизоцимного признака, что согласуется с данными как ранних работ по священных регуляции антилизоцимного фенотипа (В.Ю. Соколов, 1990, О.В. Бухарин, 1999), так и с точки зрения характеристики конкретных секретируемых ингибиторов семейства ivyC, основной пул которого локализуется в периплазматическом пространстве энтеробактерии, и семейства pliC, зависимость продукции которого от стрессрегуляторной системы Rcs до настоящего момента не показана.
Таким образом, результаты проведнной работы позволили выделить три основных момента:
Антилизоцимная активность энтеробактерий является частью общего механизма лизоцимрезистентности микроорганизмов и определяется наличием генов секретируемых ингибиторов лизоцима.
Применение молекулярно-генетического подхода в виде разработанной экспериментальной тест-системы на основе метода ПЦР позволяет выявлять гены секретируемых ингибиторов лизоцима в скрининговом режиме.
Проведенный анализ демонстрирует, что наличие гена ivyC у исследованных штаммов энтеробактерий не сопряжено с высоким уровнем АЛА, тогда как наличие гена pliC (как хромосомной, так и плазмидной локализации) соотносилось с высоким уровнем антилизоцимной активности исследуемых микроорганизмов.
ВЫВОДЫ:
1. Филогенетический анализ генов ivyC и pliC среди известных геномов протеобактерий указывает на высокую долю горизонтального пути распространения его гомологов на субвидовом уровне.
2. Выявлены консервативные фрагменты последовательностей генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима и осуществлен подбор праймеров видоспецифичного диапазона для выявления генов pliC и ivyC.
3. Хромосомные гены ivyC E.coli и pliC S.enterica имеют высокую пенетрантность (св. 90%). Распространенность данных генов среди вида K. pneumoniae высоковариабельна.
4. Исходно высокий уровень АЛА стабильно проявляется у штаммов, имеющих ген pliC как хромосомной, так и плазмидной локализации.
5. pliC-позитивные штаммы показали более выраженное изменение антилизоцимного признака под действием хлорамфеникола и акридинового оранжевого.
6. Лизоцимрезистентность энтеробактерий является преимущественно видовым признаком и определяется несекретируемыми механизмами.
Список публикаций:
1. Андрющенко С.В. Увеличение копийности плазмидной ДНК как возможный механизм усиления антилизоцимного признака бактерий под действием хлорамфеникола / С.В. Андрющенко, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, О.В. Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2011. №6.
Ц С. 8Ц13.
2. Андрющенко С.В. Действие неспецифических модификаторов копийности плазмидной ДНК на антилизоцимную активность E. coli / С.В. Андрющенко // Вестник уральской медицинской академической науки, 2011. №4/1 - С. 3. Андрющенко С.В. Действие соединений акридонового ряда на уровень антилизоцимной активности и копийность плазмидной ДНК штамма E. coli 252. / С.В. Андрющенко, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, О.В. Бухарин // Медицинская наука и образование Урала, 2012. №1. - С. 45Ц47.
4. Перунова Н.Б. Генетические детерминанты секретируемых ингибиторов лизоцима и антилизоцимный фенотип энтеробактерий / Н.Б. Перунова, С.В.
Андрющенко, О.В. Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2012. №6. - С. 8Ц13.
Список сокращений:
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute (Институт клинической и лабораторной стандартизации) ivyC - inhibitor of vertebrate lysozyme type C (ингибитор лизоцима позвоночных типа C) pliC - periplasmic inhibitor of c-type lysozyme (периплазматический ингибитор лизоцима типа C) mliC - membrane bound inhibitor of c-type lysozyme (мембраносвязанный ингибитор лизоцима типа C) АЛА - антилизоцимная активность АЛфА - антилактоферриновая активность МПК - минимальная подавляющая концентрация НИК - начальная ингибирующая концентрация пДНК - плазмидная ДНК ПМО - показатель микробной обсеменнности УПМ - условно-патогенные микроорганизмы Андрющенко Сергей Валерьевич Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук ____________________________________________________________________ Оригинал-макет подготовлен в программе Microsoft Office Word 20Подписано в печать ___________ Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная.
Бумага офсетная. Гарнитура Times.
Тираж 100 экз.