Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
РОМАНОВА Юлия Романовна
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ИНФЕКЦИОННОСТИ ВИРУСА ГРИППА И ИММУНОГЕННОСТИ ПРОТИВОГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН
03.02.02 - Вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в Компании AVIR Green Hills Biotechnology У, Австрия
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор, академик РАМН Киселев Олег Иванович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Каверин Николай Вениаминович доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Ершов Феликс Иванович доктор биологических наук Харченко Евгений Петрович
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится 20 марта 2012 г. в л____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.043.01 при ФГБУ Научно-исследовательский институт гриппа Минздравсоцразвития России (197376, Санкт-Петербург, ул.
профессора Попова, 15/17)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития России.
Автореферат разослан _______ февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.043.кандидат медицинских наук Суховецкая Вера Федотовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Многообразие вирусов гриппа - генетически детерминированный признак.
Сегментированная организация генома вируса гриппа, состоящего из (-)РНК, способствует обмену генетической информацией между штаммами при смешанной инфекции за счет реассортации. Отсутствие корректирующей активности у вирусной полимеразы приводит к высокой частоте мутаций в генах вируса гриппа, ответственных за регулярное появление вариантов с новыми антигенными свойствами.
В 1997 году птичий вирус подтипа А(H5N1), не изменяя рецепторную специфичность, инфицировал 18 человек, 6 из них со смертельным исходом (Matrosovich et al., 1999). Вирусы гриппа птиц обычно не инфицируют людей, так как существует межвидовой барьер, обусловленный различной специфичностью рецепторов, присутствующих на поверхности восприимчивых клеток. Рецепторы отличаются по химической структуре и пространственной конфигурации. Однако, при определенных обстоятельствах вирус может преодолеть межвидовой барьер.
Описанные случаи заражения, в основном, происходили при близком контакте с инфицированными птицами, что обеспечивало высокую заражающую дозу вируса.
Хотя у людей полностью отсутствует иммунитет к вирусу подтипа А(H5N1), трансмиссибильность вируса оказалась очень низкой и до настоящего времени не привела к его широкому распространению среди людей (Katz et al., 1999). Случаи передачи вирусов от человека к человеку отмечались только при тесном контакте с больными, а эффективное распространение вируса от человека к человеку так и не было зафиксировано (Tran et al., 2004; Ungchusak et al., 2005). Однако, высокая патогенность этих штаммов и беспрецедентное распространение среди птиц создали опасность возникновения нового пандемического штамма. Эта угроза вызывает необходимость усовершенствования существующих противогриппозных вакцин и противовирусных препаратов.
Для предотвращения пандемии вируса А(H5N1) с помощью существующих инактивированных вакцин необходимо сначала определить доминирующий пандемический штамм и затем произвести вакцину в количестве, необходимом для вакцинации всего населения. Инактивированная вакцина не может быть произведена заранее, поскольку в случае несовпадения вакцинного и пандемического штаммов по антигенным свойствам защита не будет эффективной.
Следующая сложность связана с патогенностью данного вируса для куриных эмбрионов - основного субстрата для производства современных вакцин.
Суммируя результаты проведенных клинических испытаний с вакцинами против вирусов гриппа сероподтипа H5N1, можно заключить, что инактивированные вакцины оказались недостаточно иммуногенны. Одна стандартная иммунизация, содержащая 15 мкг НА не вызывала у вакцинируемых защитный титр антител.
Только двукратная иммунизация с двойным количеством антигена обеспечивала у привитых протективный иммунитет. При такой эффективности в случае пандемии потребуется в 4 раза больше вакцины, чем обычно и, следовательно, больше времени для ее производства и полноценной защиты населения. Повышение эффективности инактивированных вакцин было показано также при использовании адъювантов (Keitel et al., 2008; Nolan et al., 2008).
Альтернативой куриным эмбрионам для производства вирусной массы являются тканевые культуры. Такое производство независимо от поставщиков эмбрионов и может быть начато в любой момент, как только готов вакцинный штамм. Кроме того, вакцинный штамм, культивируемый на клетках млекопитающих может вызывать выработку антител, обладающих большей перекрестной реактивностью и обеспечивающих лучшую защиту, чем штаммы, выращенные на эмбрионах (Alymova et al., 1998). Две клеточные линии, а именно, MDCK и Vero уже лицензированы в отдельных странах для производства инактивированных гриппозных вакцин.
Вакцинация живыми вакцинами, в отличие от инактивированных, вызывает более длительную и кроссреактивную защиту (Belshe et al., 2000; Liang et al., 1994;
Meitin, Bender, and Small, 1991). Кроме того, живая вакцина также эффективна при вакцинации детей уже после однократной иммунизации (Александрова Г.И., Климов А.И., 1994); (Ashkenazi et al., 2006; Jefferson et al., 2008; Vesikari et al., 2006). Эти преимущества обеспечивают возможность значительно быстрее защитить население в случае пандемии с помощью живых вакцин. Существенным недостатком живых вакцин является длительная репродукция отдельных вакцинных штаммов в респираторном тракте людей, которая может привести к нежелательному распространению вакцинного вируса или его генетического материала в популяции людей. Кроме того, аттенуированные вакцины могут быть реактогенны для детей раннего возраста (Belshe et al., 2007).
Результаты испытаний живых холодоадаптированных вакцин, приготовленных из вирусов гриппа сероподтипа Н5, дали противоречивые результаты. Вакцинные кандидаты, полученные на основе донора A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) (США), содержащие поверхностные антигены от вирусов сероподтипа (H5N1) A/Vietnam/1203/04 или A/Hong Kong/213/03 почти не репродуцировались в респираторном тракте привитых и вызывали очень слабый иммунный ответ (Karron et al., 2009). Холодоадаптированная вакцина, приготовленная на основе донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Россия), содержащая НА низкопатогенного для птиц штамма A/duck/Potsdam/86/92 (H5N2), интенсивно реплицировалась в верхнем отделе респираторного тракта привитых и вызывала прирост антител у 31% вакцинируемых (Desheva et al., 2006; Rudenko et al., 2008). Причины таких различий до настоящего момента не выяснены.
В данной работе был использован новый подход к созданию живой аттенуированной вакцины, объединяющий сильные стороны живого и инактивированного препаратов. Этот метод основан на создании аттенуированных штаммов, дефектных по репродукции в ИФН компетентных клетках, за счет удаления неструктурного белка вируса гриппа NS1 (Egorov et al., 1998). Белок NS1 - один из факторов патогенности вируса гриппа, ответственный за подавление врожденного иммунитета хозяина и позволяющий вирусу гриппа успешно реплицироваться на фоне подавленной системы ИФНов (Fernandez-Sesma, 2007;
Krug et al., 2003). Эта функция NS1 белка необходима в первые часы инфекции и поэтому определяет ранний и обильный его синтез (Krug et al., 2003). Удаление белка NS1 или повреждение его функции ведет к абортивной репликации вируса изза индукции и активации широкого круга противовирусных белков, таких как PKR и OAS, ведущих к формированию противовирусного статуса в инфицированной и соседних клетках (Egorov et al., 1998; Ferko et al., 2004; Garcia-Sastre and Biron, 2006).
Такой вирус не способен противостоять реакции врожденного иммунитета вакцинируемого. Врожденный иммунитет активируется почти немедленно после инфицирования и предотвращает дальнейшее распространение инфекции в организме. Этот механизм включает активацию фагоцитов, дендритных клеток и макрофагов, а также инициацию провоспалительного ответа за счет выделения широкого спектра цитокинов, хемокинов и других антимикробных факторов (Takeuchi and Akira, 2008; Vercammen, Staal, and Beyaert, 2008). Таким образом, иммунизацию вирусами с удаленным NS1 белком (NS1 вирусы) можно сравнить с иммунизацией вирусоподобными частицами (Bright et al., 2008). В то же время NS1 мутантные врусы инфекционны для клеток верхнего отдела респираторного тракта и могут индуцировать белковые синтезы и презентацию вирусных антигенов аналогично живой аттенуированной вакцине (Ferko et al., 2004).
Эффективность интраназальной живой вакцины в значительной степени зависит от того, как вакцинный вирус инфицирует клетки верхнего респираторного тракта. Известно, что вирусы гриппа человека предпочтительнее прикрепляются к клеткам реснитчатого эпителия в трахее, бронхах и бронхеолях, тогда как H5Nвирусы гриппа птиц предпочитают клетки нижнего респираторного тракта, а именно альвеолы. Этот феномен связан с повышенной афинностью Н5 НА к рецепторам типа Sia2-3Gal, доминирующим на поверхности клеток нижнего респираторного тракта, а не к Sia2-6Gal, преобладающим в трахее человека (Shinya et al., 2006;
Suzuki, 2005). Однако, несмотря на эти различия, вирусы серотипа H5N1 способны инфицировать ex vivo культуры, полученные из аденоидных, назофарингеальных и тонзиллярных тканей (Nicholls et al., 2007). Эти данные согласуются с фактом активной репродукции в верхнем отделе респираторного тракта людей вакцинного штамма, содержащего НА вируса гриппа птиц A/duck/Potsdam/86/92 (H5N2) (Desheva et al., 2006; Rudenko et al., 2008). Поэтому, рецепторная специфичность НА вируса гриппа, по-видимому, не единственный фактор, ограничивающий низкую инфекционность вирусов гриппа птиц для людей.
Поверхность эпителиальных клеток дыхательных путей человека представляет существенный барьер для вирусной инфекции. Этот барьер включает мукозную систему очистки клеток, вязкий мукозный слой и макрофаги, которые предотвращают доступ вируса к клеткам. Кроме того, клетки дыхательных путей в ответ на воспаление или раздражение начинают выделять протоны, что может привести к снижению кислотности носовой полости человека до pH 5,2 (England et al., 1999; Hehar et al., 1999; McShane et al., 2003; Washington et al., 2000). Известно, что кислый pH, нагревание и химические денатуранты вызывают одно и то же необратимое конформационное изменение НА, аналогичное тому, которое происходит в эндосомах и вызывает слияние вирусной и эндосомальной мембран (Carr, Chaudhry, and Kim, 1997). Если данное конформационное изменение происходит до попадания вируса в эндосомы, то вирус теряет инфекционность.
Поэтому, чтобы преодолеть мукозный барьер, НА вируса гриппа должен обладать определенной стабильностью в отношении упомянутых инактивирующих факторов.
Вирусы гриппа человека и низкопатогенные вирусы гриппа птиц относительно устойчивы к кислому pH, поскольку пограничное рН конформационного изменения НА этих вирусов лежит в интервале 5,1 - 5,4 (Skehel and Wiley, 2000). НА высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц изменяет конформацию при более высоких значениях pH, а именно 5,6 - 6,0, поэтому эти вирусы менее стабильны (Scholtissek, 1985). Показано, что путем введения мутаций в НА высокопатогенного вируса птиц с помощью сайт индуцированного мутагенеза можно снизить pH активации НА и повысить стабильность этого вируса к факторам окружающей среды (Reed et al., 2009a). Эта модификация приводила к снижению вирулентности и трансмиссибильности вируса для диких водоплавающих уток. Мы предположили, что низкая инфекционность высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц для млекопитающих и, как следствие, низкая эффективность живых аттенуированных вакцин, полученных на их основе, обусловленна высоким пограничным рН активации НА, приводящим к низкой стабильности НА этих вирусов.
Цель работы: выявление генетических детерминант инфекционности вируса гриппа для млекопитающих и иммуногенности противогриппозных вакцин; поиск путей повышения прививочных свойств кандидатов в вакцинные штаммы живой интраназальной вакцины на модели вирусов, аттенуированных за счет удаления NS1 гена.
Задачи исследования:
1. Получение вакцинного кандидата, аттенуированного путем модификации NS гена и содержащего поверхностные антигены высокопатогенного штамма вируса гриппа птиц сероподтипа А(H5N1) методом обратной генетики.
2. Разработка условий культивирования полученного вакцинного кандидата в тканевой культуре Vero.
3. Изучение безвредности, иммуногенности и защитных свойств вакцинного кандидата в доклинических исследованиях на цыплятах, мышах, хорьках и обезьянах.
4. Введение мутации в ген НА высокопатогенного штамма вируса гриппа H5N1, снижающей пограничное рН конформационного изменения белка НА и получение вакцинного кандидата, содержащего мутантный НА, методом обратной генетики.
5. Изучение свойств вакцинного кандидата, содержащего введенную мутацию, in vitro и инфекционности, иммуногенности и протективной эффективности in vivo на мышиной модели.
6. Изучение роли мутаций, возникающих в НА вирусов гриппа человека при пассировании в тканевой культуре Vero, на стабильность вирусов к повышенной температуре и кислому рН и иммуногенность вакцинных кандидатов для хорьков.
7. Поиск путей предотвращения появления адаптационных мутаций за счет изменения условий культивирования вирусов в тканевой культуре Vero.
8. Изучение влияния адаптационных мутаций, снижающих стабильность вирусов, на урожайность и иммуногенность инактивированных противогриппозных вакцин.
Научная новизна.
В работе впервые показано, что инфекционность и иммуногенность вирусов гриппа для млекопитающих определяется пограничным значением рН при котором происходит конформационное изменение основного поверхностного белка вируса гриппа - НА. Впервые продемонстрировано, что высокое значение рН активации НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц является причиной их cниженной инфекционности для млекопитающих. А введение мутации в НА2 субъединицу высокопатогенного вируса гриппа сероподтипа H5N1 птиц приводит к повышению его ифекционности для млекопитающих. Впервые обнаружено, что мутации, возникающие при адаптации штаммов вируса гриппа человека к росту в тканевых культурах, приводящие к снижению стабильности НА вирусов к кислой среде и повышенной температуре, ведут к снижению иммуногенности живых интраназальных вакцин. Впервые предложены условия культивирования штаммов вируса гриппа человека в тканевой культуре, позволяющие предотвратить появление дестабилизирующих адаптационных мутаций. Впервые показано, что применение данных условий при культивировании вирусов гриппа человека в тканевых культурах позволяет повысить урожайность инактивированных противогриппозных вакцин.
Теоретическая значимость проведенных исследований.
Полученные результаты имеют фундаментальное значение, поскольку впервые демонстрируют, что инфекционность штаммов вируса гриппа для млекопитающих, а следовательно и эффективность полученных на основе этих штаммов живых вакцин определяется пограничным значением рН, при котором происходит конформационное изменение НА вируса гриппа, ответственное за слияние вирусной и эндосомальной мембран. Показана возможность аттенуации высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц сероподтипа H5N1 путем удаления NS1 гена в сочетании с модификацией сайта расщепления HA с целью создания вакцин нового типа, а именно, живых интраназальных не реплицирующихся в верхнем отделе респираторного тракта вакцинируемых. Установлена роль мутаций, возникающих в НА при культивировании вирусов в тканевых культурах и снижающих иммуногенность вакцинных штаммов живых противогриппозных вакцин.
Практическая значимость работы.
Разработаны новые условия культивирования вакцинных кандидатов в тканевой культуре Vero, позволяющие предотвратить появление адаптационных дестабилизирующих мутаций в НА, что сохраняет инфекционность исходных штаммов вируса гриппа человека и повышает иммуногенность полученных на их основе вакцинных штаммов живых вакцин для интраназального применения.
Получен высоко иммуногенный вакцинный штамм для живой противогриппозной вакцины, инициирующий кроссреактивную защиту. Полученные результаты послужили основой для проведения клинических испытаний вакцинного штамма сероподтипа А(Н5N1).
Применение новых условий культивирования при производстве вирусной массы для инактивированных вакцин приводит к повышению эффективности производства.
Положения, выносимые на защиту.
1. Удаление гена, кодирующего NS1 белок вируса гриппа сероподтипа H5N1 в комбинации с модификацией сайта расщепления НА - эффективный метод аттенуации высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц.
2. Интраназальная иммунизация NS1 вакцинным кандидатом сероподтипа H5N1 вызывает кроссреактивный и протективный иммунитет при отсутствии вирусной репродукции.
3. Высокий уровень рН активации НА (5,8 - 6,0) высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц сероподтипа H5N1 - главный фактор низкой инфекционности и иммуногенности этих вирусов для млекопитающих.
4. Адаптация сезонных штаммов вируса гриппа человека к росту в тканевых культурах при стандартных условиях приводит к появлению дестабилизирующих мутаций в НА, вызывающих снижение иммуногености полученных на их основе вакцинных штаммов живых интраназальных вакцин.
5. Культивирование вирусов в тканевой культуре при пониженной кислотности среды предотвращает появление адаптационных мутаций в НА вируса гриппа и позволяет улучшить урожайность и иммуногенность производимых по данной технологии вакцинных штаммов для живых и инактивированных вакцин.
Внедрение результатов работы.
По теме работы получен один международный патент US 7,494,659B2 Live attenuated influenza vaccine и подана одна заявка на международный патент US 2010/0172934 A1 Method for production of pH stable enveloped viruses.
В данной работе методом обратной генетики впервые получен вакцинный штамм, содержащий поверхностные антигены высокопатогенного штамма вируса гриппа сероподтипа H5N1, аттенуированный путем модификации NS гена. Аттенуация полученного вакцинного штамма показана на цыплятах и трех видах лабораторных животных, а именно: мышах, хорьках и приматах (macaca mulatta). Изучены иммуногенные свойства полученного вакцинного кандидата в доклинических исследованиях. Полученные данные создали базу для проведения клинических испытаний NS вакцин на людях.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы докладывались на Международной конференции по проблемам птичьего гриппа (Бангкок, Тайланд, 2007), Международной конференции по проблемам птичьего гриппа (Париж, 2007), 6-й Международной конференции ДOptions for influenza control and preventionУ (Торонто, Канада, 2007; Гонконг, 2010), Международной конференции ДNegative Strand VirusesУ (Берген, Бельгия, 2010), Конференции ВОЗ по вопросам подготовки к пандемии (Женева, Швейцария, 2008), Конференции ВОЗ Вакцины, вызывающие иммунитет широкого спектра (Женева, Швейцария, 2011).
ичный вклад автора.
Гипотеза, о роли стабильности НА для инфекционности и иммуногенности штаммов вируса гриппа птиц для млекопитающих, проверка которой явилась предметом данного исследования, принадлежит автору. Работа по получению всех рекомбинантных вирусов и изучению их свойств in vitro проводилась в группе, под руководством и с участием автора. Эксперименты на животных были спланированы с участием автора и проводились в лабораториях, имеющих условия для работы с соответствующими животными, а именно: опыты на цыплятах проводились в Клинике Птиц (Вена, Ветеринарный университет); исследования на мышах осуществлялись в Институте Гриппа (Ст.Петербург) и в Ветеринарном Университете (Вена, Австрия); опыты на хорьках и приматах проводились в Компаниях Biotest (Коноровицы, Чешская Республика) и Retroscreen (Лондон, Англия). Все полученные от животных пробы анализировались в лаборатории, руководимой автором. Изучение вирусов методом атомно силовой микроскопии проводилось в сотрудничестве с Институтом Физической Химии и Биохимии (Москва, Россия) и Институтом Биофизики (Линц, Австрия). Все материалы, представленные в диссертационной работе обобщены и проанализированы автором лично.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вирусы. Эпидемические вирусы гриппа человека A/Solomon Island/3/06 (H1N1) (SL/03/06), A/Brisbane/59/07 (H1N1) (BN/59/07), A/Uruguay/716/07 (H3N2) и реассортант NYMC X-161B (реассортант вируса A/Wisconsin/67/05, H3N2) были получены из Национального института Биологических Стандартов и Контроля (NIBSC, Англия). Первичные изоляты A/Vienna/25/07 (H3N2) (VI/25/07) (MDCK), A/Vienna/28/06 (MDCK) были получены из Австрийского национального Центра по Гриппу (Вена). Изолят A/Thueringen/2202/08 H3N2 (MDCK) получен из Германcкого Национального центра по Гриппу (Берлин). Изолят A/Ст.Петербург/14/10 H1N1v (SP/14/10) был выделен в Институте Гриппа на MDCK (Ст.Петербург, Россия).
Яичные вирусы накапливали в аллантоисной полости 9 -11 дневных куриных эмбрионов при 37C. Тканевые изоляты пассировали на клетках MDCK в бессывороточной среде Opti-pro с добавлением 5 мкг/мл свиного трипсина (Sigma) при 37C и 5% CO2. Работа с высокопатогенными H5N1 вирусами гриппа птиц A/Vietnam/1203/04 (А/VN/1203/04) и A/Thailand/01/04 (TH/01/04) проводилась в Институте Медицинской вирусологии Университета им.Гете (Франкфурт, Германия).
Вирусы пассировали на культуре клеток MDCK в лаборатории 3-го уровня биологической безопасности.
Тканевые культуры. Тканевая культура Vero, полученная из Европейской коллекции клеточных культур была адаптирована к росту в бессывороточной среде Opti-pro (Invitrogen). Культура клеток культивировалась при 37С и 5% CO2 с добавлением 4 мM L-глютамина (Invitrogen). Тканевая культура MDCK культивировалась также при 37C и 5% CO2 в среде DMEM (Invitrogen), содержащей 2% сыворотки новорожденного теленка (FBS, Invitrogen) и 2 мM L-глютамина.
Конструирование вирусов методом обратной генетики. Все рекомбинантные вирусы, использованные в работе, были получены методом обратной генетики.
Вакцинный кандидат H5N1 был получен как 5:3 реассортант, в котором HA, NA и M гены унаследованы от вируса гриппа A/VN/1203/04 (H5N1), а все остальные гены от вакцинного штамма для инактивированной вакцины IVR-116, адаптированного к Vero. H5N1 сегменты HA (No. AY818135), NA (No. AY818141) и M (No. AY818144) вируса A/VN/1203/04 были синтезированы согласно сиквенсу, опубликованному в GenBank. Сайт расщепления HA высоко патогенного штамма был заменен на трипсин зависимый сайт. Синтезированные сегменты были клонированы в бинаправленные плазмиды pHW2006, включая сиквенс промоторов Pol I и Pol II и сигнал полиаденилирования для трансляции и транскрипции генов вируса гриппа согласно Hoffmann с соавторами (Hoffmann et al., 2000). В результате были получены плазмиды, кодирующие все гены. Структура плазмид показана на Рис.1. Открытая рамка считывания NS1 гена была удалена, как описано ранее (Garcia-Sastre et al., 1998). Вирусы получали трансфекцией плазмид в клетках Vero, используя нуклеофектаминовую технологию согласно инструкции производителя (Amaxa).
Через 72 ч супернатанты собирали и использовали для следующего пассажа.
Полученный вакцинный кандидат H5N1, содержащий поверхностные антигены вируса гриппа A/VN/1203/04 в комбинации с удаленным NS1 геном был назван VN1203NS1. Аналогично были получены плазмиды, содержащие гены, кодирующие белки НА и NA вирусов A/Indonesia/05/05 и A/Hong Kong/213/03. Этим же методом были сконструированы 6:2 реассортанты с функциональным NS1 геном, названные соответственно VN1203, IND05, HK213 и использованные в работе для изучения защищенности на животных.
Рис.1 Карта плазмид, содержащих вирусные фрагменты.
Аналогично VN1203NS1 был сконструирован вирус VN1203NS1-K58I, отличающийся от предыдущего одиночной мутацией в субъединице HA2 58KI, введенной путем сайт индуцированного мутагенеза (Stratagene). Кроме того, была получена пара вирусов VN1203wtNS и VN1203wtNS-K58I (5:3 реассортанты), содержащих HA с модифицированным сайтом расщепления в комбинации с полноразмерным NS геном и отличающихся только наличием мутации HA2 58KI.
Для изучения защитных свойств вакцинного кандидата на хорьках путем пассирования реассортанта IND05 через легкие хорьков был получен вирус IND05_FA. Дополнительных мутаций в гене HA этого вируса не было обнаружено.
Методом обратной генетики также получали вакцинные кандидаты (6:2) сезонных вирусов гриппа A/Vie/28/06 (Н3N2) и A/Thu/2202/08 (Н3N2).
Патогенность, иммуногенность и протективная эффективность вирусов для лабораторных животных. Все опыты на животных выполнялись с соблюдением требований Хельсинской декларации.
Цыплятам вакцинный штамм VN1203NS1 вводили в дозе 7,1 log10 ТСД50 в объеме 0,2 мл внутривенно (i.v.) или интраназально (i.n.). Птиц наблюдали ежедневно в течение 14 дней; появление клинических симптомов регистрировалось. В орофарингеальных смывах и смывах клоаки наличие вируса проверяли на 3-й день после вакцинации титрованием ТСД50 на Vero клетках.
Для определения иммуногенности и защищенности беспородных мышей иммунизировали i.n. под наркозом одно- или двукратно вирусом VN1203NS1, взятым в дозе 5,3 log10 ТСД50 с интервалом в 3 недели. Через три недели после каждой иммунизации 6 мышей из каждой группы забивали, собирали сыворотки и анализировали в РТГА и ИФА. Оставшихся животных заражали под наркозом в объеме 50 мкл вирусами VN1203 (3,3 log10 ТСД50), HK213 (3,2 log10 ТСД50/мышь), IND05 (2,2 log10 ТСД50) или A/duck/Singapore/1/97 H5N3 (Dk/Sing/97 4,2 log10 ТСД50).
На 3 и 5 день после заражения мышей забивали и определяли наличие вируса в 10% суспензии тканевых гомогенатов. Количество вируса определяли методом титрования ТСД50 на Vero (для вирусов VN1203, HK213, IND05) или на MDCK (для вируса dk/Sing/97). Для определения инфекционности вирусов беспородных мышей инфицировали i.n. без наркоза вирусом в дозе 4,5; 3,5 или 2,5 log10 ТСД50 в объеме 20 мкл. Через 60 ч после заражения животных забивали и собирали пробы носовой ткани, готовили 10% суспензию и определяли содержание вируса титрованием на Vero клетках. 50%-ную мышиную инфекционную дозу (MID50) подсчитывали методом Kerber, и выражали в ТСД50 соответствующих 1 MID50 (Lorenz and Bogel, 1973). Для гистологической оценки инфекционности группы BALB/c мышей иммунизировали i.n.
под наркозом вирусами VN1203NS1 или VN1203NS1-K58I в дозе 6 log10 ТСД50 в объеме 50 мкл. Через 12 ч после инфицирования мышей забивали. Из органов респираторного тракта (слизистая носовой полости, трахея и легкие) готовили препараты, фиксированные 7% формалином и парафином. Клетки, инфицированные вирусом гриппа, красили моноклональными антителами против вирусного NP по стандартному протоколу с последующим контрастированием и фотографированием. Для получения носовых секретов мышам вводили 0,1 мг пилокарпина (Sigma). Выделяющийся секрет собирали на пористый носитель и элюировали в 50 мкл стерильного PBS на льду в течение 4 ч. Секреты, полученные от индивидуальных животных объединяли и анализировали на наличие IgA антител в ИФА.
Хорьков (Biotest, Чешская республика) иммунизировали дважды i.n. вирусом VN1203NS1 в дозе 7,8 log10 ТСД50 с интервалом в 4 недели. Вирусная суспензия представляла очищенный вирус в буфере SPGN (6% сахароза, 3,8 мM KH2PO4, 7,мM K2HPO4, 4,9 мM L- глютамата и 75 мM NaCl). Животных осматривали ежедневно на наличие симптомов. Перед иммунизацией и через 3 недели после каждого введения собирали сыворотки крови. На 3-й день после иммунизации 10 животных из опытной группы и 6 из контрольной забивали, собирали пробы легких, носовой полости, мозга, почек, кишечника, готовили 10% суспензию и анализировали на наличие вируса титрованием на клетках Vero. Антитела в сыворотках определяли методом РТГА и МНТ. Изучение протективной эффетивности вирусов проводили в компании Retroscreen Virology Ltd., (UK). Хорьков иммунизировали под легкой анестезией i.n. с интервалом в 18 дней вирусом VN1203NS1, в дозе 8,1 log10ТСД50.
Контрольные животные получали PBS. Через 14 дней после иммунизации животных заражали под наркозом вирусом IND05-FA, в дозе 6,3 log10ТСД50. После заражения животных осматривали ежедневно на наличие следующих симптомов: изменение веса, активность, чихание, одышка. Носовые смывы получали промыванием носовой полости хорьков раствором PBS. Носовые смывы собирали перед иммунизацией, дней после и на 1, 3, 5 и 7 день после заражения реплицирующимся штаммом.
Наличие вируса в смывах определяли титрованием на Vero.
Макакам вирус VN1203NS1 вводили интраназально под наркозом в дозе 7,log10ТСД50 однократно в виде спрея. (Biotest, Чешская Республика). Животных наблюдали на наличие клинических симптомов и взвешивали. Сыворотки крови собирали до иммунизации и через 4 недели после иммунизации. Носовые смывы собирали до и через 2 дня после иммунизации. Наличие вируса в смывах определяли титрованием ТСД50 на Vero.
Статистическая обработка данных. При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартное отклонение (M). Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы с использованием t-теста Стьюдента или U - теста Mann- Whitney.
Различия считались достоверными при р<0,05.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение H5N1 вакцинного кандидата путем модификации NS гена и изучение его свойств Конструирование вакцинного кандидата Вакцинный кандидат был получен методом обратной генетики, а именно трансфекцией 8 плазмид, кодирующих все вирусные гены и белки в клетки Vero. В качестве донора поверхностных антигенов был выбран штамм А/VN/1203/04 (H5N1), изолированный от пациента, погибшего от инфекции вирусом птичьего гриппа. Сайт расщепления НА высокопатогенного вируса был модифицирован путем замещения оригинального сайта (RERRRKKR/GLF) на сиквенс TETR/GLF, встречающийся у низко патогенных птичьих вирусов и известный как более генетически стабильный, чем используемый другими авторами сайт RETR/GLF (Horimoto et al., 2006).
Вирус был сконструирован как 5:3 реассортант, в котором гены, кодирующие HA, NA и M белки были заимствованы от А/VN/1203/04, а все остальные гены от вакцинного штамма IVR- 116. IVR-116 - это вакцинный штамм для инактивированной противогриппозной вакцины, полученный из NIBSC, являющийся реассортантом, содержащим HA и NA гены от вируса гриппа A/New Caledonia/20/99 (H1N1), PB1 ген от A/Texas/1/77 (H3N2), и остальные гены от вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8).
Вирус IVR-116 был предварительно адаптирован к росту на клетках Vero, что привело к появлению мутаций в белках: PA (N10S, P275L, D682N), NP (S287N), M(A146T) и M2 (A27T). Ген NS вируса IVR-116 был модифицирован путем удаления рамки считывания NS1 белка (Рис.2).
A A B B NSNSNSРис.2 Структура и модификация NS гена (А) Схематическое изображение NS гена и NS- специфической мРНК вируса дикого типа.
(B) Трансфектант NS1 вируса гриппа.
Геномный РНК фрагмент (белый сегмент), включающий две некодирующие области (черные сегменты) и NS- специфическая мРНК, включающая кэп структуру (черный круг) и поли- А конец.
Серым окрашена область открытой рамки считывания NS1 белка. Заштрихованный сегмент - рамка считывания NEP белка. NEP мРНК - результат сплайсинга двух частей.
В результате, в геном вакцинного кандидата было введено 2 аттенуирующих фактора, а именно: замена фуринового сайта расщепления НА высокопатогенного штамма вируса гриппа птиц на зависимый от трипсина сайт и делеция гена, кодирующего NS1 белок. Полученный путем трансфекции клеток Vero соответствующими плазмидами вирус был назван VN1203NS1 (H5N1). Вирус VN1203NS1 репродуцировался в клетках Vero до титра 8,5 log10ТСД50/мл.
Дальнейшее пассирование этого вируса на клетках Vero не приводило к возникновению дополнительных мутаций в генах HA, NA или M. По данным Medical Research Council, (London, UK) вакцинный кандидат VN1203NS1 соответствовал по антигенным свойствам референс штамму A/Vietnam/1203/04. Вирус VN1203NSобразовывал четкие бляшки в культуре Vero в присутствии трипсина и не образовывал бляшек без трипсина, что подтвердило стабильность произведенной модификации сайта расщепления НА.
Аттенуация, иммуногенность и протективная эффективность вакцинного кандидата VN1203NS1 в доклинических испытаниях В первую очередь была проверена аттенуация полученного вакцинного кандидата на цыплятах. Для этого птиц заражали i.v или i.n. вирусом VN1203NS1 в дозе 7,1 или 6,8 log10ТСД50 соответственно. Ни у одной из инфицированных птиц не было выявлено признаков болезни или патологических повреждений. Анализ орофарингеальных смывов или смывов, взятых из клоаки на третий день после i.v.
или i.n. иммунизации показал полное отсутствие инфекционного вируса и подтвердил нереплицирующийся фенотип вакцинного кандидата в тканях птиц после иммунизации.
Далее иммуногенность и протективная эффективность вакцинного кандидата была проверена на мышах. Мышей иммунизировали i.n. однократно вирусом VN1203NS1 в дозе 5,3 log10 ТСД50. На второй день после инфицирования животных забивали и определяли наличие вакцинного вируса в органах путем титрования на тканевой культуре Vero. Инфекционный вирус не был обнаружен ни в одном из изученных органов, а именно: в слизистой носовой полости, в легких, мозге и в селезенке. Титры антител в крови мышей через 3 недели после иммунизации не определялись в РТГА, однако в ИФА титры IgG антител были обнаружены уже после первой иммунизации. Среднегеометрический титр (СГТ) антител после первой иммунизации составил 2940. После второй иммунизации титр вырос до 17828.
Следующим этапом доклинических исследований было изучение протективных свойств данного вакцинного штамма. Для заражения вакцинированных животных были использованы 6:2 реассортанты с функциональным NS1 геном, реплицирующиеся в легких животных. Эти вирусы также содержали модифицированный сайт расщепления НА. Вакцинированных животных через недели после первой или второй иммунизации заражали реассортантами VN1203, HK213, IND05, а также низкопатогенным для птиц вирусом dk/Sing/97 (H5N3). Все вирусы реплицировались в легких контрольных мышей до 4,0Ц5,0 log10 ТСД50/мл.
Титрование легких вакцинированных животных, взятых на 3-й день после заражения показало, что однократная иммунизация приводила к ускоренной элиминации вируса из легких по сравнению с контролем (p0.05). На 5-й день после заражения вирус практически отсутствовал в легких большинства животных, независимо от типа вируса, используемого для заражения. Двукратная иммунизация приводила к полной защите животных, которая проявлялась в полном отсутствии вируса в легких, взятых на 3-й или 5-й день после заражения. Таким образом, даже при отсутствии антител, определяемых в РТГА, иммунизация мышей вакцинным кандидатом VN1204NSзащищала животных от заражения реплицирующимися штаммами сероподтпа H5N1.
Для получения более детальной информации о безвредности и иммуногенности вакцинного кандидата VN1203NS1 было проведено изучение прививочных свойств на хорьках, как наиболее адекватной модели для изучения живых противогриппозных вакцин.
Сначала была изучена безвредность вакцинного кандидата. Животных иммунизировали i.n. в дозе 7,8 log10 ТСД50 дважды с интервалом в 4 недели.
Наблюдение осуществляли в течение 7 недель после иммунизации. У животных не было выявлено клинических симптомов, а именно: потери веса или температурных реакций. Также не было обнаружено вируса в носовых смывах, взятых на день после иммунизации. Анализ органов, взятых также на 3 день после иммунизации, показал полное отсутствие вируса в легких, мозге (включая церебрум, мозжечек и мост), кишечнике и почках. Инфекционный вирус был изолирован у 2 из 10 животных (в следовых количествах) только в пробах носовых гомогенатов и представляет остатки введенного вакцинного вируса.
Далее у иммунизированных животных были проверены титры антител после первой и второй иммунизации в РТГА и МНТ. Учитывая результаты низкой иммуногенности H5N1 вирусов в РТГА в экспериментах на мышах были модернизированы антигены, используемые для определения титров антител в РТГА в соответствии с наблюдением, сделанным Hoffmann с соавторами (Hoffmann et al., 2005). Авторы обнаружили, что замена S на N в положении 223 НА приводила к ослаблению связи с рецептором и, следовательно, к повышению титров в РТГА, поскольку меньшее количество атител было достаточно для разрушения этой связи.
Эта замена была введена в НА вируса A/VN/1203/04 и методом обратной генетики был получен мутант, который позволил повысить чувствительность РТГА с куриными эритроцитами в 4 раза. Введенная мутация повысила чувствительность теста с вирусом A/VN/1203/04 до уровня, наблюдаемого в реакции с лошадиными эритроцитами (протокол ВОЗ для повышения чувствительности). Введение этой же мутации в НА вируса A/Indonesia/5/05 (H5N1) не имело такого эффекта, поэтому в этом случае использовали РТГА, модифицированную согласно протоколу ВОЗ.
Определение иммунного ответа показало, что однократная иммунизация животных вызвала повышение титров антител в сыворотках хорьков в РТГА с куриными эритроцитами (СГА= 36) против гомологичного штамма А/VN/1203/04.
Повторная иммунизация привела к удвоению титров (СГТ = 84). Антитела к гетерологичному антигену А/Indonesia/5/05 отмечались только у половины животных (РТГА с лошадиными эритроцитами). Более высокие титры антител наблюдались в МНТ. Статистически достоверное увеличение титров антител в МНТ отмечалось после однократной иммунизации к гомологичному (СГТ = 545) и гетерологичному (СГТ = 93) антигенам со значительным увеличением титров после повторной иммунизации, СГТ= 1351 и СГТ= 181, соответственно (Рис. 3).
В отдельном эксперименте была проверена защищенность животных от повторной инфекции гетерологичным штаммом. Для этого животных иммунизировали интраназально однократно или двукратно вирусом VN1203NS1 в дозе 8,1 log10 ТСД50 с интервалом в 18 дней, а затем заражали вирусом IND05_FA (6,3 log10ТСД50). Измерение антител в крови вакцинированных хорьков показало, что, также, как и в первом эксперименте, сывороточные антитела в РТГА и МНТ к гетерологичному штамму IND05 выявлялись только после двукратной иммунизации.
Рис.3 Сывороточные антитела в крови хорьков после одной или двух иммунизаций Хорьки получили две i.n. дозы по 7,8 log10 ТСД50/животное вируса VN1203NS1 с интервалом в недели. Сыворотки собирали через 29 дней после первой и 21 день после второй иммунизации.
Антитела выявляли как к гомологичному (VN1203) так и к гетерологичному (IND05) штаммам в РТГА (A, B) с куриными и лошадиными эритроцитами и в реакции MНТ (C, D). Горизонтальные линии представляют СГТ. Негативный титр антител в РТГА был равен 8; Негативный титр антител в МНТ был равен 16;* p0.0001.**p0.05, Student t-тест Вирус IND05_FA не вызывал симптомов заболевания у контрольных хорьков, однако реплицировался в носовой полости животных до титра 3.3 log10 ТСД50/мл на третий день после заражения (Рис. 4). Результат опыта показал, что все животные были защищены как после одно- так и двукратной иммунизации.
Рис.4 Репликация гетерологичного штамма в респираторном тракте иммунизированных животных Животным вводили PBS и/или одну/две дозы вируса VN1203NS1, равные 8.1 log10 ТСД50. Через недели после иммунизации животных заражали вирусом IND05_FA, в дозе 6,3 log10ТСД50.
Инфекционный титр вируса определяли титрованием носовых смывов, взятых на 3-й день, на клетках Vero. Предел титрования составил 2 log10ТСД50/мл.
Репродукция IND05_FA штамма в верхнем отделе респираторного тракта полностью предотвращалась, несмотря на относительно низкие титры антител в в крови мышей.
Частично полную защищенность животных можно объяснить наличием местных IgA антител, обнаруженных в носовых смывах хорьков. Антитела IgA определялись в носовых смывах 2 из 7 животных после однократной иммунизации и у всех животных после повторного введения вакцинного вируса (Рис.5).
Рис.5 Выявление вирусспецифических IgA антител в носовых смывах иммунизированных хорьков Животных иммунизировали PBS (6 животных) или вакцинным вирусом VN1203NS1 однократно (животных) или двукратно (8 животных) в дозе 8,1 lg10ТСД50. До иммунизации и через 2 недели после получали носовые смывы и определяли специфические IgA антитела. Нормализацию антител проводили на основе общего количества IgA антител в каждой пробе и выражали как отношение вирусспецифических антител на общее количество антител (IgA RFU/100 AU общих антител IgA, AU- произвольные единицы). Среднее значение обозначено горизонтальной линией, стандартная ошибка обозначена вертикальной линией. 2,5- кратный прирост антител после иммунизации считался достоверным. Цифрами обозначено число ответивших/общее число животных.
Поскольку было показано, что макаки являются адекватной моделью для изучения патогенеза H5N1 гриппозной инфекции, то далее мы проверили аттенуированность и иммуногенность штамма VN1203NS1 на обезьянах makaka mulata (Rimmelzwaan et al., 2001). Взрослые макаки в возрасте 2,5-4 года были иммунизированы i.n. вирусом VN1203NS1 в дозе 7,8 log10 ТСД50. Животных иммунизировали без наркоза, обеспечивая попадание вируса только в верхние дыхательные пути, аналогично вакцинации людей.
Вакцинация не вызвала у животных подъем температуры или респираторные симптомы, подтверждая безвредность данного штамма для приматов. Титрование носовых смывов животных, взятых на 2 и 4 дни после иммунизации не выявило инфекционного вируса, подтверждая в очередной раз дефектность репродукции данного штамма в ИФН компетентных системах. Несмотря на отсутствие репродукции, повышенный уровень интерликинов IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-4, IL-12pи других цитокинов как ИФН, TNF и GM CSF был определен в носовых секретах, взятых на 2-й день после вакцинации, хотя статистически достоверное повышение было показано только для IL-1, ИФНc, TNF и GM CSF. Спектр выявленных цитокинов свидетельствует о вовлеченности эпителиальных клеток и клеток иммунной системы аналогично процессам, выявленным у людей при инфекции эпидемическим вирусом гриппа (Hayden et al., 1998).
Изучение иммуногенности показало, что однократная иммунизация макак вирусом VN1203NS1 индуцировала выработку гомологичных сывороточных антител (СГТ=64, РТГА тест, сRBC) и нейтрализующих (СГT = 362) антител в крови животных (Рис.6).
8 * 8 * A A * * pre 1 dose pre 1 dose prea 1 dosea pre 1 dose pre 1 dose prea 1 dosea до 1 доза до 1 доза доa 1 дозаa до 1 доза до 1 доза доa 1 дозаa VN1203 INDVN1203 INDB 10 * B 10 * pre 1 dose pre 1 dose pre 1 dose pre 1 dose до 1 доза до 1 доза до 1 доза до 1 доза VN1203 INDVN1203 INDРис.6 Прирост сывороточных антител в крови макак после однократной иммунизации Группу из 4 макак иммунизировали интраназально вирусом VN1203NS1 в дозе 7,8 log10ТСД50.
Сыворотки собирали через 4 недели после иммунизации и определяли титр антител в РТГА или МНТ с гомологичным VN1203 (куриные эритроциты -.cRBC) или гетерологичным IND05 вирусами (Данные РТГА представлены с cRBC и с эритроцитами лошади (hRBC), обозначенные буквой a). Нижняя граница титрования в РТГА была равна титру 1: 8, в МНТ соответствовала титру1:16. *p0.05, MannWhitney U-тест.
Таким образом, вакцинный кандидат VN1203NS1 оказался иммуногенным для приматов, индуцируя образование гомологичных антител в крови уже после однократной иммунизации. Важно отметить, что антитела определялись в крови животных даже через 6 месяцев после иммунизации, при этом титр снижался в раза. Прирост антител против гетерологичного штамма IND05 определялся только в РТГА с эритроцитами лошади (СГТ = 45), но не в МНТ(СГT = 16).
РТГА титр РТГА титр Log HAI titer Log HAI titer МНТ титр МНТ титр Log MNA titer Log MNA titer Повышение инфекционности и иммуногенности H5N1 вакцинного кандидата VN1203NS Суммируя результаты доклинических испытаний вакцинного кандидата VN1203NS1, можно сделать вывод, что H5N1 вакцинный штамм, полученный модификацией NS гена и сайта расщепления НА абсолютно безвреден для лабораторных животных, не вызывая никаких побочных реакций и не размножаясь в тканях носовой полости привитых животных. Отсутствие репродукции в слизистой носовой полости и других органах было показано на цыплятах и трех видах лабораторных животных, а именно: мышах, хорьках и макаках. Иммуногенная активность вакцины, приготовленной из вируса H5N1 уступала иммуногенности сезонных штаммов по данным РТГА. Однако, антитела выявлялись регулярно в МНТ и ИФА. Кроме того, было показано образование местных секреторных IgA антител в носовых смывах. Вакцинный штамм также стимулировал протективный иммунитет, защищая животных от реинфекции реплицирующимися гомологичным или гетерологичным штаммами. Сниженная иммуногенность в РТГА отмечалась практически для всех вакцин, приготовленных из высокопатогенных штаммов сероподтипа H5N1. Поэтому важной задачей было выяснение причин этого снижения и поиск путей ее повышения.
Известно, что эпителиальные клетки респираторного тракта человека в ответ на раздражение или воспаление выделяют протоны (Н+ ), которые приводят к закислению поверхности эпителиальных клеток и, в результате, pH в носовой полости может снизиться до 5,2 (Fischer, Widdicombe, and Illek, 2002; Washington et al., 2000). Следовательно, чтобы заразить клетки респираторного тракта, вирусы должны помимо высокой афинности к клеточным рецепторам обладать и определенным уровнем стабильности к кислой среде.
В первую очередь, мы сравнили инфекционность эпидимических вирусов гриппа человека разных подтипов и высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц сероподтипа (H5N1) на эпителиальных клетках человека (HNEp) in vitro при различном значении pH среды. Для исследования использовали эпидемические вирусы гриппа человека BN/59/07 (H1N1), VI/25/07 (H3N2), SP/14/10 (H1N1v) и высоко патогенные вирусы гриппа птиц A/VN/1203/04 (H5N1) и TH/01/04 (H5N1) не адаптированные к росту в куриных эмбрионах или тканевой культуре. Для большинства вирусов сиквенс НА в используемом препарате был идентичен сиквенсу вируса в исходном клиническом материале. Исключение составлял вирус BN/59/07, выделенный на куриных эмбрионах и полученный из NIBSC. Необходимо отметить, что при выделении эпидемических вирусов на куриных эмбрионах для рекомендации их производителям вакцин соответствие сиквенса гена НА выделенного вируса сиквенсу в клиническом материале не производится до настоящего момента.
Для проведения эксперимента вирусы смешивали с кислым (pH 5,4 и/или 5,6) или нейтральным (pH 7,4) буфером и наносили на монослой HNEp клеток. После инкубирования в течение 30 мин и последующего удаления инокулята клетки инкубировали в нейтральной среде 5 ч без трипсина. Затем клетки фиксировали и оценивали эффективность инфекции окрашиванием белка NP вируса гриппа с помощью моноклональных антител (Рис.7).
Оказалось, что вирусы гриппа человека BN/59/07 (H1N1), VI/25/07 (H3N2) и недавно появившийся пандемический вирус SP/14/10 сероподтипа H1N1v, независимо от сероподтипа, заражали HNEp клетки при pH 5,4 - 5,6 почти также эффективно, как и в нейтральной среде. (Рис.7А). Однако, оба высокопатогенных H5N1 штамма А/VN/1203/04 и TH/01/04 эффективно инфицировали эпителиальные клетки человека в нейтральной среде, но полностью теряли инфекционность при закислении до pH 5,6 (Рис.7В). Аналогичная зависимость инфекционности вирусов от pH среды для исследованных вирусов наблюдалась также на клетках Vero.
Поэтому в дальнейшем для дискриминации вирусов была использована эта тканевая культура.
Рис. 7 Инфекционность вирусов гриппа человека и птиц на клетках HNEp при различном значении pH Клетки HNEp инфицировали вирусами гриппа человека (A) BN/59/07 (H1N1), VI/25/07 (H3N2), SP/14/(H1N1v) или высокопатогенными вирусами гриппа птиц (B) А/VN/1203/04 (H5N1) и TH/01/04 (H5N1) при указанных pH. Эффективность инфекции оценивали иммунофлуоресцентным окрашиванием белка NP вируса гриппа после 5 ч инкубирования без трипсина.
Таким образом, вирусы гриппа человека, в отличие от высокопатогенных вирусов гриппа птиц, относительно устойчивы к кислому pH. Этот эффект можно объяснить тем, что НА вирусов гриппа птиц и человека изменяет конформацию при разном значении рН. Известно, что для эпидемических вирусов конформационное изменение НА, ответственное за слияние вирусной и эндосомальной мембран, происходит при pH 5,1 - 5,4 (Skehel and Wiley, 2000), а для высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц уже при pH 5,6 - 6,0 (Scholtissek, 1985).
Поэтому далее была предпринята попытка повысить стабильность вирусов гриппа птиц H5N1 путем снижения pH конформационного изменения НА до уровня, известного для вирусов гриппа человека, модификацией НА вакцинного кандидата VN1203NS1.
Ранее было показано, что введение замен во вторую субединицу НА высокопатогенных вирусов гриппа может приводить к снижению pH конформационного изменения на 0,5 - 0,7 единиц (Reed et al., 2009b), (Steinhauer et al., 1991). Так, введение замены 58 KI в НА2 повышало стабильность вируса А/VN/1203/04 к воздействию факторов окружающей среды.
Методом сайт индуцированного мутагенеза была введена мутация 58 K I в плазмиду, кодирующую ген НА и, трансфицируя клетки Vero 8 плазмидами, был сконструирован реассортант, отличающийся от полученного ранее VN1203NSвируса наличием только одной мутации HA2 58KI (Рис.8). Полученный вирус был назван VN1203NS1-K58I. Оба вируса содержали трипсин зависимый модифицированный сайт расщепления НА и удаленную рамку считывания белка NS1. Попытка сконструировать еще один вирус, содержащий мутацию HA2 23GC, имевшую аналогичный эффект для вируса птиц сероподтипа H7N7, не увенчалась успехом (Ilyushina et al., 2007). Этот вирус спасти не удалось.
Дополнительно была сконструирована аналогичная пара вирусов, содержащих полноценный NS сегмент и названа VN1203wtNS и VN1203wtNS-K58I, соответственно.
Рис.8 Положение мутации HA2 K58I на трехмерной структуре НА Чтобы проверить роль введенной в НА2 субъединицу мутации, оба реассортанта VN1203NS1 и VN1203NS1-K58I были изучены в тесте гемолиза с эритроцитами человека. Полученные данные показали, что исходный реассортант VN1203NS1 вызывал слияние вирусной мембраны с мембраной эритроцитов при значении pH 5,6, тогда как мутантный вирус VN1203NS1-K58I догтигал этого же уровня только при pH 5,3 (Рис. 9). Необходимо отметить, что мутантный вирус VN1203NS1-K58I по профилю активации НА был похож на сезонный штамм вируса гриппа человека SL/03/06 (H1N1).
Рис.9 Зависимость гемолитической активности вирусов от pH Вирусы гриппа H5N1 VN1203NS1, VN1203NS1-K58I и сезонный вирус A/SL/03/06 (H1N1) стандартизованные по НА активности (128 НА единиц) смешивали с 1% суспензией эритроцитов человека и инкубировали при 0C и pH 7,4 в течение 1 ч. Далее буфер заменяли на MES с различными значениями pH и инкубировали при 37C еще 1 ч. Степень гемолиза эритроцитов, отражающую способность вирусного НА лизировать мембрану эритроцитов замеряли спектрофотометрически при 405 нм. Вертикальные линии представляют стандартное отклонение, подсчитанное для трех повторов.
Далее сравнили стабильность обоих вирусов при повышенной температуре. Для этого вирусы VN1203NS1 и VN1203NS1-K58I инкубировали при температуре от 46C до 58C в течение 30 мин. По истечении инкубации определяли остаточную инфекционную и НА активность. Оказалось, что вирус VN1203NS1 терял более log10ТСД50/мл инфекционной активности уже при 50C, тогда как аналогичная обработка не изменяла инфекционную активность мутантного вируса.
Инкубирование при 52C приводило к полной потере инфекционной активности вируса VN1203NS1 и к снижению активности мутантного вируса VN1203NS1-K58I на 1,0 log10/мл. Аналогичные результаты были получены при измерении НА активности вирусов.
Инфекционность полученных реассортантов VN1203NS1 и VN1203NS1-K58I сравнили на клетках Vero в кислой среде при pH 5,4, 5,6, 5,8 или нейтральной при pH 7,4. В качестве контроля использовали стабильный эпидемический вирус гриппа человека BN/59/07 (Н1N1). Результаты эксперимента показали, что мутантный вирус VN1203NS1-K58I оказался более стабильным к кислой среде, инфицируя клетки Vero при pH 5,6, тогда как для вируса VN1203NS1 предел инфицирования был отмечен при pH 5,8 (Рис.10А). Эти данные были подтверждены на клетках MDCK в аналогичном опыте. Инфицированные MDCK клетки подсчитывали методом проточной цитометрии (Рис.10В).
Как и ожидалось, эпидемический вирус гриппа человека BN/59/07 (H1N1) проявлял стабильность на клетках Vero при pH 5.4 и инфицировал 32% клеток MDCK даже при pH 5,2 (Рис.10C). Таким образом, путем замены одной аминокислоты в НАсубъединице НА H5N1 вакцинного кандидата нам удалось повысить его инфекционность в кислой среде, хотя степень стабильности не достигала, уровня, отмеченного для вирусов гриппа человека.
Рис.10 Зависимость инфекционности вирусов в тканевой культуре от pH (A) Вирус VN1203NS1 или VN1203NS1-K58I смешивали с MES буфером при указанных значениях pH и использовали для заражения Vero клеток с множественностью инфекции 2. Через 5 ч инкубирования вирусный NP выявляли окрашиванием моноклональными антителами. (B) MDCK клетки инфицировали вирусом VN1203NS1 или VN1203NS1-K58I аналогично при указанных значениях pH. Количество инфицированных клеток определяли после окраски вирусного NP (5 ч после инфицирования) методом проточной цитометрии. Процент инфицированных клеток обозначен цифрами. (C) Vero или MDCK клетки инфицировали сезонным вирусом гриппа человека BN/59/(H1N1) при указанных значениях pH.
Вирусы гриппа птиц, в отличие от штаммов вируса гриппа человека более резистентны к ингибиции закисления эндосом с помощью таких лизосомотропных агентов как хлоракин или NH4Cl (Di Trani et al., 2007). Поэтому мы сравнили инфекционность VN1203NS1 и VN1203NS1-K58I вирусов в присутствии хлоракина или NH4Cl (Рис. 11). В качестве контроля был использован сезонный штамм вируса гриппа BN/59/07 (H1N1). Оказалось, что инфекция Vero клеток вирусом VN1203NS1-K58I в присутствии 10 мкM хлоракина была снижена и полностью подавлялась при использовании этого реагента в концентрации 50 мкM. Однако, рост исходного штамма лишь незначительно снижался при добавлении 50 мкM хлоракина. Вирус BN/59/07 (H1N1) был наиболее чувствителен к хлоракину, так как его инфекционность существенно снижалась уже при использовании 1 мкM хлоракина. Эти результаты были подтверждены с помощью другого лизосомотропного агента (1 мМ NH4Cl), использование которого приводило к почти полному подавлению инфекционности вирусов VN1203NS1-K58I и BN/59/07 (H1N1) и не влияло на вирус VN1203NS1.
Рис.11 Чувствительность вирусов к лизосомотропным агентам хлоракину и NH4Cl Клетки Vero, обработанные предварительно лизосомотропным агентом инфицировали вирусом VN1203NS1, VN1203NS1-K58I или сезонным штаммом BN/59/07 (H1N1) с множественностью инфекции 5 в среде с добавлением хлоракина или NH4Cl при указанных концентрациях.
Эффективность инфекции оценивали окрашиванием вирусного белка NP через 5 ч после заражения.
Таким образом, введением мутации HA2 58KI удалось изменить фенотип вируса гриппа птиц, сделав его более стабильным к кислой среде, повышенной температуре и более чувствительным к лизосомотроптым агентам, то есть более похожим фенотипически на вирусы гриппа человека.
Далее представлял интерес вопрос, влияет ли измененная стабильность НА на репродукционную активность вируса в тканевых культурах. Поскольку вирусы с удаленным NS1 геном (NS1) не растут в иммунокомпетентных системах, в опыте были использованы два аналогичных вируса VN1203wtNS и VN1203wtNS-K58I экспрессирующих полноценный NS1 белок. Стабильности этих вирусов к кислому pH и повышенной температуре оказалась аналогичной NS1 вирусам. Кривые роста в клетках Vero, MDCK, A549 (карцинома легких) и HBE (эпителиальные бронхиальные клетки) показали, что интродуцированная мутация HA2 58KI снизила репродукционную активность вируса VN1203wtNS-K58I в клетках HBE приблизительно в 150 раз по сравнению с вирусом VN1203wtNS. Аналогичная тенденция наблюдалась на клетках Vero, MDCK и A549, хотя разница не была статистически достоверной. Таким образом, введение мутации, снижающей пограничное значение pH при котором происходит конформационное изменение вирусного H5N1 НА может снижать рост вирусов в тканевых культурах.
Для того, чтобы оценить значение полученных in vitro наблюдений для интраназальной иммунизации мы сравнили инфекционность полученных вирусов in vivo на мышиной модели. На первом этапе для VN1203wtNS и VN1203wtNS-K58I вирусов мы сравнили дозу, вызывающую инфицирование мышей (MID50) при интраназальном введении. Мышей иммунизировали интраназально вирусами в дозе от 2,5 до 4,5 log10ТСД50. Через 60 ч после интраназального заражения собирали тканевые пробы из верхних дыхательных путей, готовили гомогенаты и определяли в них наличие инфекционного вируса титрованием на тканекой культуре Vero.
Результаты показали, что MID50 для мутантного вируса VN1203wtNS-K58I (MID50 2,log10) была в 25-раз ниже дозы, полученной для исходного вируса VN1203wtNS (MID50 4,3 log10). На Рис.12 представлены результаты одного из двух аналогичных экспериментов.
VN1203NSVN1203NS4.4.VN1203NS1-K58I VN1203NS1-K58I 5/5/5/4.4.4/4/4/5/5/5/3.3.3/3/3/3.3.2.2.2.2.0/0/0/0/0/0/ 1.1.1.1.4.5 3.5 2.4.5 3.5 2.Доза заражения Доза заражения [log10 ТЦД /мышь] [log10 ТЦД /мышь] Рис.12 Сравнительная оценка инфекционности (MID50) вирусов в верхнем отделе респираторного тракта мышей Мышей инфицировали интраназально в дозе 2,5, 3,5 или 4,5 log10ТСД50 вирусами VN1203wtNS или VN1203wtNS-K58I. Наличие вируса определяли в 10% суспензии ткани носовой полости, определением ТЦД50 титра через 60 ч после инфицирования. Предел титрования составил 1,log10 ТЦД50/мл (обозначен пунктирной линией). Цифрами указано число инфицированных животных/общее число зараженных животных. Вертикальные линии преддставляют стандартное отклонение.
Для сравнения инфекционности вирусов в пределах одного цикла репродукции был проведен второй эксперимент, в котором мышей инфицировали вакцинными кандидатами VN1203NS1 и VN1203NS1 - дефектными по репродукции в ИФН компетентных клетках. Оба вируса были взяты в дозе 6,0 log10 ТСД50. Качественную оценку инфекционности проводили сравнением инфекционных очагов в назальной слизистой, трахее и легких методом иммуногистохимии путем выявления вирусного белка NP с помощью моноклональных антител. Оказалось, что мутантый вирус VN1203NS1-K58I приводил к значительно большему количеству очагов во всех анализируемых тканях. Этот эффект наблюдался для всех 5 иммунизированных животных при сравнении их с животными, иммунизированными исходным вирусом VN1203NS1 (Рис. 13). Таким образом, введение мутации K58I, ведущее к повышению стабильности НА вакцинного кандидата VN1203NS1 сероподтипа H5N1, приводило к повышению инфекционности вируса в респираторном тракте мышей.
При оценке иммуногенности вируса VN1203NS1 для мышей, в отличие от данных, полученных для хорьков и макак, не было обнаружено антител в РТГА, несмотря на то, что животные были защищены от повторного заражения репродуцирующимся штаммом. Представлял интерес вопрос, будет ли мутантный вирус VN1203NS1-K58I, который характеризуется повышенной инфекционностью в респираторном тракте мышей вызывать образование более высоких титров антител, определяемых в РТГА.
Титр вируса Титр вируса [log ТЦД / мл ] [log ТЦД / мл ] Рис.13 Инфекционность вирусов в респираторном тракте мышей по данным иммуногистохимии Мышей инфицировали интраназально вирусами VN1203NS1 или VN1203NS1-K58I взятыми в дозе 6,0 log10 ТСД50. Контрольным мышам вводили PBS. Пробы носовой полости, трахеи и легких анализировали через 12 ч после инфицирования окрашиванием вирусного белка NP.
Результаты проведенного опыта показали, что однократная интраназальная иммунизация мышей вирусом VN1203NS1 вызывала выработку антител только у из 6 животных (GMT= 6,3), тогда как введение мутантного вируса VN1203NS1-K58I вызывало выработку антител у 5 животных (GMT= 25,4) (Рис.14A). Более высокие титры антител были выявлены также в МНТ после иммунизации мутантным вирусом VN1203NS1-K58I (GMT = 57) при сравнении с иммунизацией исходным вирусом VN1203NS1 (GMT = 27,9) (Рис.14B). Более высокая иммуногенность вируса VN1203NS1-K58I (СГТ 8127) оцененная по IgG специфическим титрам антител была показана также методом ИФА при сравнении с таковой вируса VN1203NS(СГT = 3225) (Рис.14C). Мутантный вирус вызывал также в 4 раза больше специфических противогриппозных секреторных IgA антител в пуле носовых смывов животных (Рис. 14D).
Таким образом, однократная иммунизация мышей вирусом VN1203NS1-K58I, содержащим НА улучшенной стабильности, приводила к существенному повышению системного и секреторного антительного иммунного ответа. Несмотря на полученные различия в иммуногенности оба вируса VN1203NS1 и VN1203NS1K58I статистически не отличались по протективной эффективности, предотвращая полностью рост вируса VN1203wtNS в легких 3/5 и 4/5 животных соответственно взятых на третий день после реинфицирования.
D D Рис.14 Иммуногенность вирусов после однократной иммунизации мышей Мышей вакцинировали интраназально вирусами VN1203NS1 или VN1203NS1-K58I в дозе log10 ТСД50. Сыворотки, собранные через 4 недели после иммунизации, анализировали в РТГА (A), нейтрализации (B) и ИФА для оценки суммарных антител IgG (C) и секреторных IgA (D). Титры индивидуальных животных обозначены символами, СГТ обозначен горизонтальной линией. За отрицательный титр антител в РТГА принимали 1 : 4, в МНТ титр 1 : 8. Антитела IgA определяли в пулах носовых смывов, собранных через 4 недели после иммунизации.
* p < 0.05, t-Student тест.
Следовательно, можно заключить, что повышение стабильности НА вируса сероподтипа Н5N1 за счет снижения пограничного значения pH, при котором происходит активация НА, приводит к повышению инфекционности вируса в респираторном тракте млекопитающих и, соответственно, иммуногенности интраназально вводимого вакцинного кандидата.
Стабильность НА как фактор иммуногенности сезонных живых противогриппозных вакцин В литературе неоднократно отмечалось, что при адаптации вирусов гриппа человека к росту в тканевых культурах возникают мутации, приводящие к повышению пограничного pH конформационного изменения НА (Lin et al., 1997).
Представлял интерес вопрос, снижают ли эти мутации инфекционность вирусов гриппа человека и, следовательно, как влияют эти мутации на иммуногенность живых вакцин, производимых из этих вирусов.
Поэтому следующей задачей было изучение влияния адаптационных мутаций, возникающих при адаптации сезонных штаммов вируса гриппа человека к росту в тканевых культурах или куриных эмбрионах, на иммуногенность вакцинных штаммов живых противогриппозных вакцин. Изучение проводилось также на модели вакцинных кандидатов, аттенуированных за счет удаления NS1 белка (NSвирусы).
МНТ, log МНТ, log РТГА, log РТГА, log IgG log IgG log Спец. IgA/ общие IgA Спец. IgA/ общие IgA Получение NS1 вакцинных кандидатов сероподтипа H3NВ работе было использовано два рекомбинантных штамма сероподтипа H3N2.
Для получения вакцинных кандидатов HA и NA гены первичных изолятов A/Vie/28/[антигенно аналогичен вирусу A/Wisconsin/67/05 (H3N2)] или A/Thu/2202/[антигенно аналогичен вирусу A/Brisbane/10/07 (H3N2)] секвенировали, клонировали в плазмиды и трансфицировали в клетки Vero вместе с плазмидами, кодирующими все остальные вирусные гены вируса IVR-116. Ген NS содержал удаленную рамку считывания белка NS1, как аттенуирующий фактор. Вакцинные кандидаты содержали только HA и NA гены от эпидемических вирусов (6:2 композиция генома).
Полученные вирусы, названные соответственно Vie и Thu, были пассированы несколько раз в тканевой культуре Vero для улучшения параметров роста.
Сравнение сиквенсов генов HA и NA адаптированных вирусов с аналогичными сиквенсами исходных вирусов показало, что в результате пассирования вирусы приобрели мутации в гене НА (Табл.1).
Табл.1 Свойства исходных эпидемических вирусов и полученных реассортантов.
Пограничное Пограничная Происхождение Пограничное Вирус Мутацииa pH инфекци- темп. НА.pH слиянияc HA и NA онностиb активности.d Исх. вирус - 5,4 5,8 65C A/Vie/28/Vie - 5,4 5,8 65C Vie-G75R HA2 G75R 5,8 6,2 60C Исх. вирус - 5,4 5,8 65C A/Thu/2202/Thu - 5,6 5,8 65C Thu-L194P HA1 L194P 5,8 6,3 60C a Аминокислотные замены в НА гене b Самое низкое значение pH при котором происходит инфицирование клеток c Самое высокое значение pH, вызывающее гемолиз эритроцитов d Самая низкая температура, ингибирующая HA активность Так реассортант вируса A/Vie/28/06 содержал мутацию G75R в субъединице HA2 и поэтому был назван Vie-G75R. Эта мутация находится в районе взаимодействия двух спиралей ножки НА, влияющем на стабильность HA тримера (Bullough et al., 1994; Ha et al., 2002). В реассортанте Thu появилась мутация в HAсубъединице L194P, и поэтому вирус был назван Thu-L194P (Рис.15). Данная мутация является частью рецептор - связывающего сайта НА и, как было описано ранее, может влиять на антигенные и иммуногенные свойства вирусов гриппа. В NA обоих вирусов после адаптации к росту в клеточной культуре Vero мутаций обнаружено не было.
Рис. 15 Положение мутаций, возникших при адаптации, на трехмерной структуре НА Влияние адаптационных мутаций в НА на стабильность вакцинных кандидатов сероподтипа H3NКак известно, НА вируса гриппа человека претерпевает конформационное изменение, вызывающее слияние мембран при pH 5,1 - 5,4 (Skehel and Wiley, 2000).
Обнаруженные мутации G75R и L194P могут потенциально изменить пограничное pH конформационного изменения НА (Bullough et al., 1994; Daniels et al., 1987;
Daniels et al., 1985; Ha et al., 2002; Rachakonda et al., 2007). Поэтому, в первую очередь, сравнили значения pH активации НА для первичных изолятов A/Vie/28/06 и A/Thu/2202/08 и полученных на их основе реассортантов Vie-G75R и Thu-L194P.
Полученные результаты свидетельствуют, что мутации G75R и L194P привели к повышению pH активации НА вирусов Vie-G75R и Thu-L194P на 0,4 и 0,5 единиц, соответственно по сравнению с исходными вирусами (Рис. 16; Табл.1).
Поскольку известно, что повышенная температура вызывает конформационное изменение HA, аналогичное тому, которое вызывает кислая среда, мы сравнили устойчивость вирусов при нагревании (Carr and Kim, 1994). Для этого вирусы инкубировали при температуре от 35C до 70C в течение 30 мин, после чего измеряли изменение НА титра. Оказалось, что оба первичных изолята после инкубирования при 60C сохраняли НА активность, тогда как реассортанты, содержащие мутантный НА почти полностью теряли НА активность уже при температуре 55С (Табл.1).
Рис. 16 Сравнение pH активации НА первичных изолятов и полученных на их основе реассортантов Клетки Vero инфицировали при moi 2 первичными изолятами или соответствующими реассортантами. HA, экспрессированный на инфицированных клетках с адсорбированными эритроцицитами меченными 2 мM октадецил хлоридом родамина B (реагент R18) обрабатывали буферами с указанным рH. Разрушение эритроцитов в результате слияния мембран вируса и эритроцитов приводило к проникновению R18 в клетку. Результат оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа.
Затем сравнили инфекционность вирусов при кислом pH в тканевой культуре.
Для этого вирусы, имеющие одинаковую множественность инфекции смешивали с соответствующим буфером (pH 5,2 - 7,5) и инфицировали клетки Vero. После инкубирования и последующего удаления инокулята вирусы культивировали в нейтральной среде. Результат оценивали окрашиванием вирусного нуклеопротеина NP в клетках через 5 ч культивирования (Рис.17А). Эксперимент показал, что оба первичных изолята инфицировали клетки в кислой среде до pH 5,4, тогда как оба реассортанта, содержащие мутантный НА, а именно Vie-G75R и Thu-L194P были инфекционны только при pH 5,8.
Суммируя полученные данные, можно заключить, что мутации HA2 G75R и HAL194P, возникшие в результате адаптации вирусов к росту в тканевой культуре Vero, снизили устойчивость НА к кислой среде и повышенной температуре, а значит снизили и общую стабильность вирусов.
Анализ опыта по сравнению инфекционности вирусов при различном значении рН, показал, что первичные изоляты проявили более высокую инфекционность при pH 5,6 - 5,8 при сравнении с нейтральным pH 7.5 (Рис.17).
Рис. 17 Инфекционность вирусов при пониженном pH на клетках Vero Клетки Vero инфицировали вирусами с множественностью инфекции 5, разведенными в буфере с соответствующим pH. Инфекционность оценивали окрашиванием вирусного NP через 5 ч после инфицирования с помощью флуоресцентного микроскопа.
Это наблюдение позволило предположить, что стандартные условия культивирования вирусов на Vero при нейтральном pH не являются оптимальными для роста H3N2 вирусов. Поэтому далее была предпринята попытка культивирования вирусов при пониженном рН среды.
Пассирование H3N2 вакцинных кандидатов в тканевой культуре Vero при пониженном рН среды Полученные трансфекцией клеток Vero вирусы Vie и Thu адаптировали к росту только в условиях пониженного рН (инфицирование при рН 5,6;
культивирование при рН 6,5). Полученные таким образом реассортанты сравнили с первичными изолятами A/Vie/28/06 A/Thu/2202/08 по первичнму сиквенсу НА, антигенным свойствам, pH конформационного изменения НА, а также инфекционности при пониженном pH и стабильности при повышенной температуре.
Результаты сравнения представлены в Табл.1. Оказалось, что данный метод пассирования позволил избежать появления мутаций в НА реассортантов.
Сравнение антигенных свойств первичных изолятов с обоими соответствующими реассортантами в реакции с постинфекционными сыворотками хорьков не выявило антигенных различий между вирусами. Кроме того, реассортанты Vie и Thu сохранили термо- и pH стабильность соответствующих первичных изолятов.
Реассортанты Thu и Vie проявили почти такую же инфекционность на клетках Vero как и вирусы A/Thu/2202/08 и A/Vie/28/06 при пониженном рН (pH 5,4) (Рис.17).
Таким образом, селективное давление в виде пониженного рН среды при культивировании вирусов в клетках Vero предотвратило появление адаптационных мутаций в НА и сохранило стабильный фенотип вирусов, присутствующий у первичных изолятов.
Дестабилизирующие мутации в НА H3N2 вакцинных кандидатов снижают иммуногенность вирусов для хорьков Далее стоял вопрос, влияют ли мутации, снижающие стабильность вирусов, на иммуногенность сезонных вакцинных кандидатов при интраназальном применении.
Для сравнения иммуногенности группы из 5 хорьков были иммунизированы интраназально парами вирусов Vie или Vie-G75R и Thu или Thu-L194P, взятыми в дозе 6 log10ТСД50.
У животных не было обнаружено никаких клинических симптомов после иммунизации, что подтвердило аттенуированность вакцинных штаммов. Для подтверждения нереплицирующегося фенотипа NS вакцинных кандидатов на 1, 3 и 5 день после иммунизации собирали носовые смывы животных и проверяли в них наличие вируса. Вирус не был обнаружен ни в одной из проб, подтверждая нереплицирующийся фенотип вакцинных кандидатов.
Сыворотки крови собирали до и на 28-й день после иммунизации и определяли в них антитела в РТГА и МНТ. Оказалось, что иммунизация вирусом Vie, содержащим исходный НА приводила у 100% животных к индукции антител со СГТ равным 121 в РТГА и 588 в МНТ (Рис.18А, В).
Рис. 18 Иммунный ответ после однократной иммунизации хорьков Группы из 5 хороьков иммунизировали интраназально вирусами Vie или Vie-G75R (A и B) и Thu или Thu-L194P (C и D), в дозе 6.0 log10ТСД50. Уровень антител в сыворотках определяли до (pre) и после (post) иммунизации (на 28 день) в РТГА (A и C) и МНТ (B и D). Символы отражают индивидуальные титры животных. Горизонтальная линия соответствует СГТ. * p < 0.05.
Иммунизация мутантным вариантом Vie-G75R вызывала значительно более низкие СГТ, а именно, 28 в РТГА и 76 в МНТ. Эта же закономерность была отмечена и для второй пары вирусов Thu и Thu-L194P (Рис.28 C, D). В группе хорьков, иммунизированных вирусом Thu прирост антител был отмечен у 4 из 5 животных со СГТ антител 56 в РТГА и 256 в МНТ. Однако, ни одно из животных не ответило на иммунизацию вирусом Thu-L194P по данным РТГА и МНТ.
Таким образом, вакцинные кандидаты, содержащие НА, идентичный по сиквенсу первичным изолятам и определяющий стабильный фенотип, оказались более иммуногенны для хорьков при интраназальной иммунизации. Пассирование вирусов в закисленной среде позволило предотвратить появление адаптационных мутаций в НА.
Влияние стабильности НА на урожайность инактивированных противогриппозных вакцин Стабильность молекулы НА, определяемая первичной структурой гена, оказывает прямое действие на инфекционность и иммуногенность вакцинных штаммов для живой противогриппозной вакцины. Большинство производимых в мире в настоящее время противогриппозных препаратов - инактивированные вакцины, культивируемые на куриных эмбрионах. Выделяемые от больных гриппом вирусы часто не обладают параметрами роста в куриных эмбрионах, удовлетворяющими требованиям производителей вакцин. Например, вирусы сероподтипа H3N2 часто совсем не растут в куриных эмбрионах. Поэтому, для производства вируссодержащей массы часто используются адаптированные мутантные вирусы. Представлял интерес вопрос, связаны ли мутации, появляющиеся при адаптации, с потерей стабильности НА и влияют ли они на качество производимых из этих вирусов инактивированных вакцин? Стабильность вирусов, рекомендованных ВОЗ для производства вакцин В 2008 г был рекомендован для производства вакцины вирус A/Brisbane/10/(BN/10/07) H3N2. Однако, урожай этого вируса в куриных эмбрионах был достаточно низким для производства. Поэтому был выбран другой кандидат A/Uruguay/716/(UR/716/07), полученный путем изоляции на первичных клетках почки цыпленка и растущий значительно лучше в куриных эмбрионах. При сравнении сиквенса НА вирусов BN/10/07 и UR/716/07 была выявлена одна аминокислотная замена в позиции HA1 138 AS (номера сиквенсов генов НА в банке данных EU716429 и EU716426 соответственно). Сравнение сиквенсов гена НА вирусов, UR/716/07, BN/10/07 и IVR147 (реассортант BN/10/07 с вирусом PR8, рекомендованный для производства) с сиквенсом НА первичных изолятов этой же антигенной разновидности, но не имеющих адаптационных мутаций, показал, что клинические изоляты отличаются от всех рекомендованных вирусов, имея в позиции НА1 194 L. У адаптированных вирусов в этом положении находится 194Р. Согласно нашим данным и данным литературы, замена в положении 194 LP приводит с книжению стабильности вирусов и их иммуногенности при интраназальном введении хорькам.
Поэтому вирусы UR/716/07, BN/10/07 и IVR147 сравнили с первичными изолятами A/Нижний Новгород/668/08 (NN/668/08) и A/Aстрахань/10/07 (AH/10/07) по параметрам рН активации НА, стабильности к повышенной температуре и кислой среде. Вирусы NN/668/08 и AH/10/07 были выделены на тканевой культуре MDCK и прошли ограниченное число пассажей на Vero. Сиквенс НА этих вирусов был идентичен сиквенсу НА в клиническом материале.
Сравнение рН активации НА вирусов методом гемолиза показало, что это значение было наименьшим (рН 5,6) для первичных изолятов NN/668/08 и AH/10/07. Для вируса BN/10/07 оно было 5,8, а для вирусов UR/716/07 и IVR1даже 6,1 (Рис. 19).
pH 6.3 pH 6.2 pH 5.8 pH 5.pH 6.4 pH 6.BN/10/UR/716/IVR1AH/10/NN/ 668/Рис.19 Сравнение рН активации НА Н3N2 вирусов с разной историей пассажей Тканевую культуру Vero инфицировали вирусами с множественностью инфекции 2.
Экспрессированный на поверхности клеток НА обрабатывали эритроцитами, меченными R18 и после инкубации добавляли буфер с соответствующим рН. Слияние клеточной мембраны с мембраной эритроцитов оценивали по появлению R18 внутри клетки.
Аналогичные результаты были получены при сравнении инфекционности вирусов в тканевой культуре в кислой среде (Рис. 20).
pH 6.1 pH 6.0 pH 5.8 pH 5.pH 5.pH 5.BN/10/UR/716/UR/716/acidic IVR1AH/10/NN/668/Рис.20 Инфекционность вирусов при пониженном pH на клетках Vero Клетки Vero инфицировали вирусами с множественностью инфекции 5, предварительно разведенными в буфере с соответствующим рН. Инфекционность оценивали окрашиванием NP вируса гриппа через 5 ч инкубирования.
Вирусы NN/668/08 и AH/10/07 были инфекционны при pH 5,6 и pH 5,соответственно, тогда как IVR147 и UR/716/07 оказались инфекционны только при pH 6,1. Вирус BN/10/07 занимал промежуточное значение, сохраняя инфекционность при pH 5,8.
Результаты изучения стабильности вирусов при повышенной температуре подтвердили данные стабильности в кислой среде. Так, оба первичных изолята NN/668/08 и AH/10/07 теряли НА активность при температуре на 5C выше, чем вирус BN/10/07 и 10C выше, чем вирусы UR/716/07 и IVR147.
Повышение стабильности вируса, путем пассирования в клетках с пониженным рН среды Учитывая полученные результаты культивирования вирусов при пониженном рН, была предпринята попытка повысить стабильность вируса UR/716/07 путем его пассирования в подкисленной среде (рН 6,5). Параллельно вирус UR/716/пассировали в нейтральной среде. После нескольких пассажей сравнили параметры стабильности обоих вирусов (Табл.2). Оказалось, что вирус UR/716/07_neutral, пассированный в нейтральной среде, не изменил фенотип и не приобрел дополнительных мутаций и был идентичен вирусу UR/716/07. Однако, после пассажей в кислой среде вирус, названный UR/716/07_acid, приобрел 2 мутации в НА. Первая замена 194P L в НА1 субединице, представляет первостепенный интерес, поскольку L в позиции 194 была обнаружена у первичных изолятов.
Поэтому эта мутация может рассматриваться, как реверсия в дикий тип. Вторая мутация произошла в HA2 субединице в положении 45 I T, в области НА, известной, как влияющей на стабильность.
Изучение свойств полученного вируса показало, что UR/716/07_аcid характеризовался более низкой рН активации НА, повышенной стабильностью при инфицировании в кисой среде (pH 5.6) и более высокой устойчивостью к повышенной температуре, чем исходный штамм UR/716/07 (Табл.2).
Табл. 2: Свойства вирусов с различной историей пассажей на клетках Vero Мутации pH pH Темп.
HA1 HA2 Инфекци- Актива- стабильВирусы онностиa цииНАb ностьc 53 138 173 194 BN/10/07 D A K P I 5,8 6,0 60C UR/716/07 D S K P I 6,1 6,3 55C UR/716/07_acid D S K L T 5,6 5,6 65C IVR-147 D A K P I 6,1 6,2 55C AH/10/07 D A K L I 5,4 5,6 65C NN/668/08 N A N L I 5,6 5,8 65C a Нижняя граница pH, при которой происходит инфицирование клеток b Верхняя граница pH, вызывающая активацию HA c Нижняя граница температуры, при которой вирус теряет НА активность Для того, чтобы изучить влияние стабильности вируса на качество препарата инактивированной вакцины были произведены две серии из соответственно более и менее стабильного вирусов в 32 л ферментерах. Обе серии были очищены методом градиентного центрифугирования в сахарозе и инактивированы формальдегидом согласно процедуре, применяемой для тканевой инактивированной вакцины (Ehrlich et al., 2008). Полученные препараты сравнили по ряду параметров, котролируемых для инактивированных вакцин (Табл.3).
Табл.3 Сравнение вакцинных препаратов, полученных при разных условиях культивирования Препарат Параметры вируса SRD / Vero белок / Общий HA HA / общий общий SRD белок [мкг /мл] белок белок [мкг/мл] UR/716/07_ 1,44 0,05 122 319 0,acid UR/716/07_ 0,48 0,06 134 327 0,neutral Результаты измерений показали, что урожайность, которая является главным параметром инактивированых вакцин и измеряется в тесте радиальной иммунодиффузии (SRD) оказалась в три раза выше для вируса UR07_acid при сравнении с вирусом UR/716/07_neutral. Для остальных параметров, включающих общий белок и белок Vero клеток не было выявлено статистически достоверных различий.
Оба препарата были проверены на способность индуцировать антитела при парентеральном введении мышам. Вводимые вирусы были уравнены по параметру SRD и разведены до соответствующих концентраций HA (от 4,75 мкг до 30 нг).
Результат показал, что оба препарата оказались в одинаковой степени иммуногенны для мышей с небольшим преимуществом UR07_acid достоверным при использовании дозы 0,95 мкг HA (Рис.21).
UR/716/07_acid UR/716/07_acid UR/716/07_acid UR07 sour UR07 sour 10 * 10 * * UR/716/07_neutral UR/716/07_neutral UR/716/07_neutral UR07 neutral UR07 neutral 5 4 3 2 1 5 4 3 2 1 Мкг НА/доза Мкг НА/доза dose Мкг НА/доза dose g HA / g HA / Рис.21 Иммуногенность препаратов UR07_acid и UR07_neutral для мышей Сыворотки крови мышей собирали через 21 день после иммунизации и определяли в них уровень антител в РТГА.
log2 HAI titre log2 HAI titre Log РТГА титр Log РТГА титр Log РТГА титр Таким образом, культивирование вируса на тканевой культуре Vero в среде с пониженным рН позволило получить более стабильный вирус. Производство более стабильного вируса культивированием в ферментере при стандартных условиях привело к получению в 3 раза большего урожая НА, при сравнении с вирусом, культивируемым в нейтральной среде. В конечном счете модификация условий культивирования вируса привела к увеличению в три раза числа произведенных доз препарата инактивированной вакцины.
ВЫВОДЫ 1. Удаление гена, кодирующего NS1 белок в сочетании с модификацией сайта расщепления НА и реассортацией генов, кодирующих внутренние белки, приводит к аттенуации высокопатогенного вируса гриппа птиц сероподтипа Н5N1 и позволяет создать вакцинный кандидат, аттенуированный для лабораторных животных при интраназальном введении.
2. Интраназальное введение H5N1 NS1 вакцинного кандидата не вызывает побочных реакций у цыплят, хорьков и макак и не сопровождается репликацией вируса в респираторном тракте и других органах лабораторных животных, подтверждая нереплицирующийся фенотип вируса в интерферон компетентных клетках.
3. Интраназальная иммунизация H5N1 NS1 вакцинным кандидатом индуцирует нейтрализующие и секреторные антитела, вызывая кроссреактивный в пределах подтипа протективный иммунитет, показанный на трех моделях лабораторных животных.
4. Введение мутации K58I в НА2 субъединицу Н5 НА снижает рН активации НА и повышает устойчивость вакцинного кандидата к повышенной температуре и кислой среде.
5. Повышение стабильности НА H5N1 вакцинного кандидата обусловливает его более высокую инфекционность в респираторном тракте млекопитающих, повышающую иммуногенность вируса при интраназальном введении.
6. Адаптация вирусов гриппа человека к росту в тканевых культурах приводит к появлению дестабилизирующих мутаций в НА (L194P; G75I), приводящих к снижению иммуногенности вакцинных штаммов живых интраназальных вакцин.
7. Культивирование вирусов в тканевых культурах при пониженном рН среды предотвращает появление дестабилизирующих мутаций в НА и позволяет повысить иммуногенность вакцинных кандидатов живых вакцин и урожайность инактивированных противогриппозных вакцин.
Список сокращений АСМ - атомно силовая микроскопия ВОЗ - всемирная организация здравоохранения ВПЧ - вирусоподобные частицы ИФН - интерферон ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота МНТ - микронейтрализация ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота РТГА - реакции торможения гемагглютинации ТЦД50 - тканевая цитопатическая доза FCS - fetal calf serum (сыворотка новорожденного теленка) IL - интерлейкин i.n. - интраназально i.v. - внутривенно Gal - галактоза GM-CSF - granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор) НА - гемагглютинин HBE - human broncheal epithelial (бронхиальные эпителиальные клетки человека) MDCK - Madin Darby Canine kidney (клетки почки собаки) MID50 - mouse infectious dose (доза, вызывающая инфицирование мышей) moi - multiplicity of infection (множественность заражения) NA - нейраминидаза NHEp - nasal human epithelial (эпителиальные клетки носовой полости человека) NP - нуклеопротеин NS1 - неструктурный белок NEP - nuclear export protein (белок экспорта из ядра) OAS - олигоаденилатсинтетаза PBS - phosphate buffered saline (фосфатный буфер) PKR - proteinkinase R (протеинкиназа R RBC - red blood cells (красные кровяные клетки) RDE - receptor destroying enzyme (фермент разрушающий рецепторы) RFU - relative fluorescent units (относительные флуоресцентные единицы) RLU - relative light units (относительные единицы свечения) SFM - serum free medium (бессывороточная среда) Sia - sialic acid (сиаловая кислота) SPF - specific pathogen free (свободные от специфических патогенов) SRD - single radial immunodiffusion (единичная радиальная диффузия) TNF - tumor necrosis factor (фактора некроза опухолей) WT - wild type (дикий тип) СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Патенты 1. US 2010/0172934 A1 Method for production of pH stable enveloped viruses. Krenn B., Wolschek M., Romanova J., Egorov A., Nakowitsch S. (Заявка подана) 2. US 7,494,659B2 Live attenuated influenza vaccine. Katinger H., Egorov A., Ferko B., Romanova J., Katinger D.
Научные обзоры Romanova J. The fight against new types of influenza virus. Biotechnol J. 2006;
1(12):1381-92.
Статьи в реферируемых журналах 1. Romanova, J. R., T. A. Ermachenko, G. I. Alexandrova, and G. A. Tannock.
Interference between cold-adapted (ca) influenza A and B vaccine reassortants or between ca reassortants and wild-type strains in eggs and mice. Vaccine., 1994;
12:23-27.
2. Tannock, G. A., J. R. Romanova, and J. A. Paul. The immunogenicity of reassortants of the cold-adapted influenza A master strain A/Ann Arbor/6/60 is determined by both the genes for cold- adaptation and the haemagglutinin gene.
Arch Virol., 1995; 140:201-209.
3. Romanova, J. R., G. A. Tannock, and G. I. Alexandrova. Protective responses in mice to vaccination with multiply administered cold-adapted influenza vaccine reassortants and wild-type viruses. Vaccine., 1997; 15:653-658.
4. Ferko, B., D. Katinger, A. Grassauer, A. Egorov, J. Romanova, B. Niebler, H.
Katinger, and T. Muster. Chimeric influenza virus replicating predominantly in the murine upper respiratory tract induces local immune responses against human immunodeficiency virus type 1 in the genital tract. J Infect Dis., 1998; 178:13591368.
5. Egorov, A., S. Brandt, S. Sereinig, J. Romanova, B. Ferko, D. Katinger, A.
Grassauer, G. Alexandrova, H. Katinger, and T. Muster. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J Virol., 1998; 72: 6437-6441.
6. Grassauer, A., A. Y. Egorov, B. Ferko, I. Romanova, H. Katinger, and T. Muster. A host restriction-based selection system for influenza haemagglutinin transfectant viruses. J. Gen Virol., 1998; 79:1405-1409.
7. Ferko B, Stasakova J, Sereinig S, Romanova J, Katinger D, Niebler B, Katinger H, Egorov A. Hyperattenuated recombinant influenza A virus nonstructural - protein - encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nef-specific systemic and mucosal immune responses in mice. J Virol., 2001; 75(19): 8899908.
8. Romanova J, Katinger D, Ferko B, Voglauer R, Mochalova L, Bovin N, Lim W, Katinger H, Egorov A. Distinct host range of influenza H3N2 virus isolates in Vero and MDCK cells is determined by cell specific glycosylation pattern. Virology., 2003; 307(1): 90-7.
9. Mochalova L, Gambaryan A, Romanova J, Tuzikov A, Chinarev A, Katinger D, Katinger H, Egorov A, Bovin N. Receptor-binding properties of modern human influenza viruses primarily isolated in Vero and MDCK cells and chicken embryonated eggs. Virology., 2003; 313(2): 473-80.
10. Katinger D, Romanova J, Ferko B, Fekete H, Egorov A. Effect of a single mutation in neuraminidase on the properties of Influenza B virus isolates. Arch Virol., 2004;
149(1): 173-81.
11. Kittel C, Sereinig S, Ferko B, Stasakova J, Romanova J, Wolkerstorfer A, Katinger H, Egorov A. Rescue of influenza virus expressing GFP from the NS1 reading frame. Virology., 2004; 324(1): 67-73.
12. Romanova J, Katinger D, Ferko B, Vcelar B, Sereinig S, Kuznetsov O, Stukova M, Erofeeva M, Kiselev O, Katinger H, Egorov A. Live cold-adapted influenza A vaccine produced in Vero cell line. Virus Res., 2004; 103(1-2): 187-93.
13. Katinger D, Mochalova L, Chinarev A, Bovin N, Romanova J. Specificity of neuraminidase activity from influenza viruses isolated in different hosts tested with novel substrates. Arch Virol., 2004; 149(11): 2131-40.
14. Stasakova J, Ferko B, Kittel C, Sereinig S, Romanova J, Katinger H, Egorov A.
Influenza A mutant viruses with altered NS1 protein function provoke caspase-activation in primary human macrophages, resulting in fast apoptosis and release of high levels of interleukins 1beta and 18. J Gen Virol., 2005; 86(Pt 1): 185-95.
15. Kittel C, Ferko B, Kurz M, Voglauer R, Sereinig S, Romanova J, Stiegler G, Katinger H, Egorov A. Generation of an influenza A virus vector expressing biologically active human interleukin-2 from the NS gene segment. J Virol., 2005;
79(16): 10672-7.
16. E.M.Rapoport, L.V.Mochalova, H.-J.Gabius, J.Romanova, N.V.Bovin. Search for additional influenza virus to cell interactions. Glycoconj.J., 2006; 23: 115-125.
17. Ferko B, Kittel C, Romanova J, Sereinig S, Katinger H, Egorov A. Live attenuated influenza virus expressing human interleukin-2 reveals increased immunogenic potential in young and aged hosts. J Virol., 2006; 80(23): 11621-7.
18. Wressnigg N, Voss D, Wolff T, Romanova J, Ruthsatz T, Mayerhofer I, Reiter M, Nakowitsch S, Humer J, Morokutti A, Muster T, Egorov A, Kittel C. Development of a live-attenuated influenza B DeltaNS1 intranasal vaccine candidate. Vaccine., 2009; 27(21): 2851-7.
19. Romanova J, Krenn BM, Wolschek M, Ferko B, Romanovskaja-Romanko E, Morokutti A, Shurygina AP, Nakowitsch S, Ruthsatz T, Kiefmann B, Knig U, Bergmann M, Sachet M, Balasingam S, Mann A, Oxford J, Slais M, Kiselev O, Muster T, Egorov A. Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNS1 H5N1 influenza vaccine. PLoS One., 2009; 4(6): e5984.
20. Wacheck V, Egorov A, Groiss F, Pfeiffer A, Fuereder T, Hoeflmayer D, Kundi M, Popow-Kraupp T, Redlberger-Fritz M, Mueller CA, Cinatl J, Michaelis M, Geiler J, Bergmann M, Romanova J, Roethl E, Morokutti A, Wolschek M, Ferko B, Seipelt J, Dick-Gudenus R, Muster T. A novel type of influenza vaccine: safety and immunogenicity of replication-deficient influenza virus created by deletion of the interferon antagonist NS1 J Infect Dis., 2010; 201(3): 354-62.
21. Krenn BM, Egorov A, Romanovskaya-Romanko E, Wolschek M, Nakowitsch S, Ruthsatz T, Kiefmann B, Morokutti A, Humer J, Geiler J, Cinatl J, Michaelis M, Wressnigg N, Sturlan S, Ferko B, Batishchev OV, Indenbom AV, Zhu R, Kastner M, Hinterdorfer P, Kiselev O, Muster T, Romanova J. Single HA2 mutation increases the infectivity and immunogenicity of a live attenuated H5N1 intranasal influenza vaccine candidate lacking NS1. PLoS One., 2011; 6(4): e18577.
22. Nakowitsch S, Wolschek M, Morokutti A, Ruthsatz T, Krenn BM, Ferko B, Ferstl N, Triendl A, Muster T, Egorov A, Romanova J. Mutations affecting the stability of the haemagglutinin molecule impair the immunogenicity of live attenuated H3Nintranasal influenza vaccine candidates lacking NS1. Vaccine., 2011; 29(19): 351724.
23. Roethl E, Gassner M, Krenn B.M., Romanovskaya-Romanko E.A., Seper H, Romanova J, Nakowitsch S, Sturlan S, Wolschek M, Sirotkin A, Kiselev O, Muster T, Egorov A. Antimycotic-antibiotic amphotericin B promotes influenza virus replication in cell culture. J Virol., 2011; 85(21): 11139-45.